JP5184735B2 - 高比重リポタンパク質コレステロール定量化のための乾式分析要素 - Google Patents

Description

本発明は、流動体サンプル中の高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬＣ）の定量化に使用される乾式分析要素に関する。より特に、本発明は、他のリポタンパク質の存在下、ＨＤＬＣの量に関するシングル・ステップ、乾式スライド・アッセイを開発するためにＨＤＬＣ選択性を改善する特有の試薬層を含む支持体に関する。

リポタンパク質は、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、又はカイロミクロン（ＣＭ）に分類されうる。ＨＤＬＣは、動脈壁を含む組織からのコレステロール蓄積の除去と関係することが知られている。従って、ＨＤＬＣは、冠状動脈硬化症のような様々なタイプの動脈硬化症の否定的なリスク因子として計測される。血中ＨＤＬＣレベルは、動脈硬化症の予知のための有用な指数である。

体液中に存在する化学的及び生物学的な物質の迅速、かつ、正確な測定に対する、医療行為及び医学研究における、そして分析的、診断上の手順における必要性が引き続きある。特に、血清又は血漿中のＨＤＬＣの量は、心疾患又は病気の危険因子の診断、モニタリング及び治療のために迅速に、かつ、正確に測定されなければならない。

ＨＤＬＣ定量化のためのいくつかの従来法は、ＨＤＬ画分中に含まれるコレステロールの定量化が後に続く、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭを含む非高比重リポタンパク質（非ＨＤＬｓ）からＨＤＬを分離するための様々な技術に依存する。そのような例の１つが、非ＨＤＬをデキストラン硫酸塩と一緒に沈澱させ、そして遠心沈澱若しくは磁気分離によって取り除くＶＩＴＲＯＳ ＨＤＬＣアッセイである。その後、上清中のＨＤＬＣがコレステロール乾式分析要素を使って定量化される。

ごく最近、直接のＨＤＬＣ溶液アッセイの方法が開発された。直接の高比重リポタンパク質コレステロール・アッセイは、非高比重リポタンパク質に優先するＨＤＬに対する優先的な選択性を利用する。非ＨＤＬ沈澱法（１，２，３，４，５）、免疫学的阻害（６，７）、選択的な界面活性剤（８，９，１０，１１）、カタラーゼ除去（１２）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で架橋されたコレステロール・エステラーゼ（ＣＥＨ）（１３）を含む、多くの周知の溶液法が、ＨＤＬＣに対するアッセイの特異性を改善するために示された。

残念ながら、前記溶液法は、複数の試薬の添加か、又は全てを含めた、シングル・ステップ乾式スライド・アッセイに沿わない分離ステップを一般に使用する。しかも、沈澱法及び選択的な界面活性剤法単独では、乾式、多層スライド・フォーマットにおいて十分なＨＤＬＣ選択性をもたらさない。どの周知のＨＤＬＣ法も、ＨＤＬＣ量の迅速で、正確な診断のために望ましいであろうこのフォーマットにおいて十分な選択性をに応じるか又はそれをもたらすことはない。シングル・ステップの乾式スライド・アッセイを開発する必要性を考慮して、上記アッセイのＨＤＬＣ選択性を改善するために新規な方法が必要とされる。

本発明の概要
本発明は、高比重リポタンパク質コレステロールの迅速で、正確な定量化のために設計された乾式分析要素のフォーマットを提供する。前記アッセイは、サンプル適用の前に非ＨＤＬリポタンパク質を取り除くためのサンプルの前処理を必要としない。前記要素は、第１の酵素である、コレステロール・エステルを加水分解するためのコレステロール・エステル加水分解酵素、第２の酵素である、コレステロールから過酸化水素を放出するためのコレステロール・オキシダーゼ、及び第３の酵素である、６７０ｎｍで読まれるロイコ色素を酸化させるための西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを含む支持体を含む。前記ＨＤＬＣ選択性は、１）展開層における非ＨＤＬリポタンパク質の沈澱と捕獲、２）展開層における独特の界面活性剤による非ＨＤＬ−ポリアニオン複合体をそのまま維持しながらのＨＤＬの選択的な可溶化、そして３）重合体レセプター層における独特な選択的コレステロール・エステル加水分解酵素（ＣＥＨ）によるエステル結合の選択的な加水分解から生じる。改善された精度は、ＣＥＨ含有層のマトリックスとしてのポリエチレングリコールの使用によって得ることができる。溶血患者サンプルからの顕著な干渉は、色素含有層における重合体マトリックスの選定によって除かれた。

乾式分析要素は、支持体上にコートされた１以上の層を含む。前記１以上の層は、非高比重リポタンパク質沈澱剤であるリンタングステン酸、高比重リポタンパク質選択性界面活性剤、及び高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素を含む。前記高比重リポタンパク質選択性界面活性剤は、好ましくはＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６又はＥＭＵＬＧＥＮ Ａ−９０（ポリアルキレン誘導体）である。前記高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素は、好ましくはカンジダ・ルゴサ由来リパーゼである。１以上の追加の層が、精度を改善するためにポリエチレングリコール及びジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）をさらに含む。前記支持体は、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、及びセルロース・エステルから成る群からの透明な材料を含む。

１の態様において、先の乾式分析要素は、支持体に向かって上から下に以下の順序：
（ｉ）非高比重リポタンパク質沈澱剤である、リンタングステン酸を含むウォッシュコート層、
（ｉｉ）高比重リポタンパク質選択性界面活性剤を含む透過性展開層、
（ｉｉｉ）接着層、
（ｉｖ）高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素を含む重合体レセプター層、
（ｖ）重合体を含む色素副層、及び
（ｖｉ）結合剤材料を含むゲル層、
でコートされた複数の層をもつ支持体を含む。

前記高比重リポタンパク質選択性界面活性剤は、好ましくはＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６又はＥＭＵＬＧＥＮ Ａ−９０（ポリアルキレン誘導体）である。前記高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素は、好ましくはカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）由来リパーゼである。前記重合体レセプター領域は、ポリエチレングリコールを含む。前記色素副層は、ポリエチレングリコール又はポリアクリルアミド共重合体を含む。前記レセプター層は、ジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）を含む。前記支持体は、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、及びセルロース・エステルから成る群からの透明な材料を含む。前記色素層又はゲル層は、ロイコ色素（２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾールを含む。前記ゲル層は、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを含む。前記重合体レセプター層は、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）由来のコレステロール・オキシダーゼを含む。

本発明の詳細な説明
本発明は、乾式分析要素を使ったＨＤＬＣの定量のためのアッセイを開示する。液体のアッセイに有用な乾式分析要素は、米国特許番号第３，９９２，１５８号（１４）及び同第４，３５７，３６３号（１５）の教示に従って準備できてる。前記文献の内容を本明細書中に援用する。

簡単に記載された、本願発明の分析要素は、好適な支持体（表１、２及び３）上にコートされた１以上の層を含む。好ましくは、前記試薬は、表１３に示すように異なる試薬層としてコートされる。

前記支持体は、あらゆる好適な大きさが安定してる材料、そして好ましくは無孔の、かつ、約２００ｎｍ〜約９００ｎｍの波長の光を伝達する透明な材料でもあるかもしれない。有用な支持体材料は、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、及びセルロース・エステル（例えば、酢酸セルロース）を含むが、しかし、これは全てを含めたリストではなくて、他の好適な材料が使用されうる。

前記支持体上にコートされた試薬層は、検出及び定量化システムの要素を含む。これらの要素を、１以上の合成又は天然の結合剤材料、例えばゼラチン又は他の天然コロイド、並びに様々な合成親水性重合体、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、上記のものの共重合体、及び架橋可能な単量体が加えられた重合体又は共重合体中に分散させる。

前記試薬層は、バッファーを含むかもしれない。前記バッファーは、一部又は全ての要素の層の中に存在するか、あるいは他の試薬が存在しない別個の層の中に存在するかもしれない。種々のバッファーが、要素の別個の層の中で使用される。

いくつかの界面活性剤、例えばＯＬＩＮ−１０Ｇ及びＺＯＮＹＬ ＦＳＮが、１以上の試薬層中に場合により含まれうる。同様に、いくつかの種々の架橋剤、例えばビスビニルスルファニルメタン、グルタルアルデヒドなどが自由に選択できる。

前記要素は、液体試験サンプルを前記要素上に一様に分配するために透過性の、反射性展開層が提供されうる。前記展開層は、試薬、バッファー、界面活性剤及び他の成分を含むみうる。展開層に使用するための材料は、例えば米国特許番号第４，２５８，００１号（１６）及び前述の引用特許中に開示されるような乾式分析要素を作る技術分野で周知である。有用な展開層は、繊維性材料、重合体化合物及びビーズで作製されうる。特に有用な展開層は、硫酸バリウム又は二酸化チタンを含む。

他の任意の層、例えば下塗り層が、所望であれば含まれうる。前記の要素の層は、界面活性剤、増粘剤、バッファー、硬化剤、酸化防止剤、静菌剤、カプラー溶剤及び当該技術分野で知られる他の材料を含む、種々の所望の、しかし任意の成分を含むことができる。

前記要素の変更は、例えば米国特許番号第３，９９２，１５８号（１４）及び同第４，３５７，３６３（１５）号に開示される一般に知られている手順を使った好適な分光学的装置によって検出されうる。

材料及び条件
本明細書中に使用されるとき、下記の条件を以下の実施例に適用する。以下の実施例は説明することを意図しており、本発明を制限しない。

バッファーを、５．５〜７．５の好ましいｐＨ範囲のために、２〜１６ｇ／ｍ²の濃度で使用した。バッファーの例は、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、及びリン酸塩を含む。

色素を、０．１〜１．０ｇ／ｍ²の濃度で使用した。色素の例は、ロイコ色素（２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾール）である。

安定化剤を、０．０５〜５．５ｇ／ｍ²の濃度で使用した。安定化剤の例は、ジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）である。

界面活性剤の濃度は、０．５〜８．０ｇ／ｍ²の範囲内であった。界面活性剤の例は、ＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６（ＫＡＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手可能なポリオキシアルキレン誘導体）及びＥＭＵＬＧＥＮ Ａ−９０（ＫＡＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手可能なポリオキシアルキレン誘導体）を含む。

リンタングステン酸（ＰＴＡ）の濃度は、１〜５ｇ／ｍ²の範囲内であった。例は、リンタングステン酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ製のＰ６３９５）である。二価金属の濃度は、０〜２．３ｇ／ｍ²の範囲内である。二価金属の例は、ＭｇＣｌ₂を含む。

ポリエチレングリコールを、１〜１０ｇ／ｍ²の濃度で使用した。ポリエチレングリコールの例は、ＭＷ３，４００（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製の２０２４４４）、ＭＷ８，０００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製のＰ４４６３又はＰ２１３９）及びＭＷ２０，０００（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製の８１３００３）を含む。
ポリ（アクリルアミド）共重合体（ＩＭｎＡｇ）を、０．２〜０．８ｇ／ｍ²の濃度で使用した。

ＣＯＤ−コレステロール・オキシダーゼを、４〜１６ｋＵ／ｍ²の濃度で使用した。例は、微生物、セルロモナス由来のものである（Ａｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ製のＣＯＮ−ＩＩ）。

ＣＥＨ−コレステロール・エステラーゼを、２〜２８ｋＵ／ｍ²の濃度範囲で使用した。例は、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ製のＬｉｐａｓｅ ＩＩ）及びコレステロール・エステル加水分解酵素（Ｄｅｎｋａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む。

ＡＡＯ−アスコルビン酸オキシダーゼを、２〜８ｋＵ／ｍ²の濃度で使用した。例は、ズッキーニ・スカッシュ・アスコルビン酸オキシダーゼ（Ｃａｌｚｙｍｅ）である。

ＰＯＤ−ペルオキシダーゼを、５〜５５ｋＵ／ｍ²の濃度範囲で使用した。この酵素は西洋ワサビに由来する。

３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを、０．１〜１０ｇ／ｍ²の濃度範囲で使用した。例は、ＨＣＩ塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製のＡ８０５６）及びＨＣＩ塩（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製のＡ８，１６０−９）を含む。

実施例１
薄膜要素フォーマットの実施例
この評価で使用した３種類の薄膜要素フォーマットの実施例を、表１、２及び３に示す。酵素及び他の反応成分の位置は、薄膜要素の層内に様々な他の位置で配置されうる。しかし、本発明の好ましい態様は、非ＨＤＬ沈澱剤（ＰＴＡ）、ＨＤＬ選択性界面活性剤、及びＨＤＬ選択性ＣＥＨを含む。薄膜要素の各々のフォーマットは、様々な模式的な配列によって表される個々の層を含む。配列の言及において、「−０１」が最下部のゲル層を表した状態で、各々の層を数的に規定する。（６層配列において）ウォッシュコート（最上部の層）を「−０６」と規定した状態で、一連の数字が各々の追加の層を表す。

実施例２
リンタングステン酸
沈澱剤が超遠心分離を必要としないＨＤＬＣアッセイの開発を可能にするために、選択的に非ＨＤＬを除去するのに使用されうることは、数十年（１７、１８、１９）前から知られていた。これらの沈澱剤は、液体アッセイのために開発された。同様に、乾式スライド要素におけるそれらの使用が調べられた。３種類の最も一般的な非ＨＤＬ沈澱剤である、デキストラン硫酸塩（ＤＳ）、リンタングステン酸（ＰＴＡ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を薄膜スライドにおいて評価した。それらが前記スライドの表面上に存在し、そして前記薄膜要素における沈澱のためにできる限り長い相互作用時間となるようにする初期の時間枠内で、上記スライド上にスポットされた非ＨＤＬリポタンパク質が相互作用するように、前記沈澱剤を最後のパス・ウォッシュコート層（フォーマットにより「−０５」か「−０６」）中に加えた。４ｇ／ｍ²の濃度を上限とするＤＳを有し、かつ、１０ｇ／ｍ²を上限とするＰＥＧを有する初期の試みは、薄膜要素において不調であることが分かった。しかし、ＰＴＡは、２ｇ／ｍ²のウォッシュコート濃度においていくらか特異性増強を示した。

ＰＴＡ／ＭｇＣｌ₂によるＨＤＬ選択性に対する貢献を、ＰＴＡ／ＭｇＣｌ₂ウォッシュコートのありとなしの最適化コーティングによって評価することができる。ＨＤＬ選択性を、方程式１に規定した「ＬＤＬ交差反応性（％）」に関して計測できる。前記方程式中、［Ｐｒｅｄ＿ＨＤＬＣ］は、ＨＤＬＣ薄膜アッセイが不正確にＨＤＬＣとして予測するＬＤＬ被分析物のサンプル中濃度であり、そして［ＬＤＬＣ＿Ｃｏｎｃ］は、サンプル中に含まれている真のヒトＬＤＬコレステロール被分析物の濃度である。「−０１」色素及び「−０３」ＰＥＧ重合体（表４）から成る説明されたフォーマットを、ウォッシュコート中にＰＴＡ／ＭｇＣｌ₂（ＰＴＡ）を含む第１サンプル、及びウォッシュコート中にＰＴＡ／ＭｇＣｌ₂を含まない（ＰＴＡなし）第２サンプルを用いて試験した。ヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液両者の総合的な反応性は、ＰＴＡウォッシュコートなしの処方でより高かった。相対的なＨＤＬＣ選択性は、ＰＴＡウォッシュコートの処方で増強された。表４のデータは、このフォーマットにおけるＨＤＬＣ選択性に対するＰＴＡの貢献が約２２％（３２．３％−１０．４％）であることを示す。

同様の結果を、−０２及び−０３層中にＰＥＧを用いたフォーマットにおいて得た（表３）。ＨＤＬＣ選択性に対するＰＴＡ貢献は、２４．５％（表５（２６．３％−１．８％））であると分かった。わずかに異なるフォーマットを使用したが、これらの試験のどちらもが、全ての他の既知の起源から提供された選択性と比べて、ＰＴＡがＨＤＬＣ選択性における約２３％の増強に貢献することを一貫して示した。

実施例３
ＨＤＬＣ特異性に対する選択性ＣＥＨの効果
初期の開発試験が、様々なコレステロール・エステラーゼ（ＣＥＨ）酵素源がアッセイの総合的なＨＤＬＣ選択性に効果を与えたことを示した。一般的に知られている酵素業者からの利用可能な独特なＣＥＨ及びリパーゼ酵素源を、スクリーニング目的で入手し、そして直接のＨＤＬ薄膜要素中にコートした。最高及び最低のＣＥＨ源についてのＬＤＬ交差反応性は、未処理の動力学（図１、２、３、４を参照のこと）と、算出した交差反応性（表６）の両者における大幅なＨＤＬＣ選択性の相違を示す。このデータから、選択性ＣＥＨ単独のみのＨＤＬＣ選択性に対する総合的な貢献は、約３５％（５０．７％（ウシ膵臓）−１５．７％（カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ））であり、ＨＤＬＣ選択性に対する大きな貢献を表す。さらにこのデータは、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ酵素がＤｅｎｋａ ＣＥＨより選択的であり、そしていずれの膵臓ＣＥＨ源より著しく優れていることをも示す。他のスクリーニングされた微生物ＣＥＨ源は、これらの両極端の間のＨＤＬＣ選択性を示した。

実施例４
ＨＤＬＣ特異性に対する選択性界面活性剤の効果
２種類の別個に識別される界面活性剤、ＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６界面活性剤と、ＥＭＵＬＧＥＮ Ａ−９０界面活性剤（共にＫＡＯ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されたポリオキシアルキレン誘導体である）は、非ＨＤＬに優先してＨＤＬに高い選択性を示す。同様に、ＫＡＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の他の界面活性剤が、いくらかの中程度の選択性を示したが、好ましいＨＤＬ選択性界面活性剤より低いレベルにおいてであった。他の界面活性剤、例えばＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（ＴＸ−１００）は、ＨＤＬに対して全く特異性を欠いていた。アッセイにおけるＴＸ−１００界面活性剤の置き換えは、ＨＤＬＣ特異性の完全な喪失を引き起こした（表７）。非選択性界面活性剤への変更は、ＬＤＬ交差反応性の６８％の増強を示す。

この特徴は、沈澱した非ＨＤＬ複合体を完全に可溶性にするＴＸ−１００の能力から部分的に由来する。ＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６とＥＭＵＬＧＥＮ Ａ−９０の追加の独特な特徴は、ＰＴＡの沈澱させた非ＨＤＬと、それらとの親和性である。いずれの界面活性剤もＰＴＡ−ＭｇＣｌ₂−非ＨＤＬ複合体を再度可溶化しない。固有なＨＤＬ選択性も、ＰＴＡの沈澱させた非ＨＤＬ複合体の可溶化の欠如も、シングル・ステップの直接のＨＤＬＣ乾式スライド・アッセイにおいて必要とされる、ＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６とＥＭＵＬＧＥＮ Ａ−９０の不可欠な性質である。ところが、ＴＸ−１００界面活性剤は、直接のＨＤＬＣ乾式スライド・アッセイにおいて、ＰＴＡ沈澱から得たどんな特異性も相殺する。

従って、選択性における６８％の増強は、選択性界面活性剤からの効果、選択性ＣＥＨからの効果、及びＰＴＡの効果の間で台無しにされ得る。先に示したように、選択性に対するＣＥＨの貢献は、〜３５％であり、そしてＰＴＡの貢献は、〜２３％である。このように、選択性界面活性剤によるＨＤＬＣ選択性に対する貢献は、〜１０％（６８％−３５％−２３％）である。３つの要素の各々からの選択性への貢献（％）についての推定値を、様々な式によって計算した。表７に示した界面活性剤試験は、最適なＰＴＡより低く、そしてより正確ではないフォーマットの処方を使用した。界面活性剤の貢献貢献は、この計算で使用したＰＴＡの貢献の過剰な推定値に基づいたできる限り低い推定値である。

実施例５
ＨＤＬＣ特異性に対するＰＥＧ及びジメドンの効果
他の実施例において、他の測定された貢献物質は、ヒトＨＤＬ及びＬＤＬ試験液を使用した解析によって示されるとおり、アッセイの正確度を高める。ＰＥＧ重合体の使用及びジメドンの添加は、アッセイのＨＤＬＣ選択性を増強する。例えば、−０２層中のＰＥＧは、ＩＭｎＡｇ重合体と比べてＬＤＬの交差反応性を約５％（１７．５−１２．８）減少させる（表８）。ＰＥＧ「−０２」層の存在かにおいて、ジメドンの添加は、ＬＤＬの交差反応性を約６％（１２．８％−７．１％）減少させた。

他の分析は、同じ要因（「−０２」中のＩＭｎＡｇ＆ＰＥＧ±「−０３」中のジメドン）を用いた均衡型２×２の実験計画法（ＤＯＥ）の試験を使用し、そしてジメドンがＬＤＬ交差反応性においてＰＥＧより重要な要因であるらしい以外、表８に示したのと同様の結果を得た。これらの結果を表９に示す。この分析において、ＰＥＧは、ＬＤＬの交差反応性を約２％減少させたが、一方、ジメドンは、ＬＤＬの交差反応性を約１０％減少させた。均衡型２×２ＤＯＥを利用して、ＬＤＬ交差反応性に関する主効果のプロットを判定し、そして図５に示した。この方法によって、ＨＤＬＣ特異性に対するＰＥＧの貢献は約１％であり、それは、先に示された第１の結果と一致し、そして表８の直接分析法と類似していた。ジメドンは、ＤＯＥ分析法を使用でより大きな貢献（１０％）を有し、上記貢献は、試験液法で測定された先に推定された５％の貢献よりわずかに大きい。この推定値に関係しているわずかな誤差のために、ＨＤＬＣ選択性に対するジメドン貢献は、５％〜１０％の範囲内にある。

実施例６
ＨＤＬＣ選択性の概要
本発明の好ましい態様は、薄膜フォーマットにおいてＨＤＬＣ選択性に効果を与える３種類の主要な確認された要因を含む。前記要因は、非ＨＤＬ沈澱剤（ＰＴＡ）、ＨＤＬ選択性界面活性剤、及びＨＤＬ選択性ＣＥＨである。これらの３種類の要因の存在及び不存在において異なるコーティングを評価することは、総合的なアッセイＨＤＬＣ選択性に対する各々の要因の貢献に関する評価を提供する。選択性に対する重要な貢献物質及び重要でない貢献物質からのＨＤＬＣ特異性に対する総合的な貢献を、表１０に示す。１００％に満たない戻りは、同時に全ての要因を含んだ１つの大きな実験計画法（ＤＯＥ）と比較した別々の試験からの各々の別個の成分に関する貢献の測定におけるわずかな誤差、並びに他の成分の貢献を得るための異なる処方及び異なるフォーマットの間の食い違いをおそらく示唆している。最適な及び許容範囲の乾式分析要素の正確度は、全ての好ましいＨＤＬ選択性薬剤の存在下で得られる。

実施例７
ＰＥＧはアッセイ精度とダイナミックレンジを改善する
「−０３」層中のＰＥＧは、ＨＤＬＣ特異性を高めたが、同様に重合体はアッセイにいくつかの他の利益を提供した。第１の改良は、ヒトＨＤＬ試験液の動力学に直接的に現われる（図６）。「−０３」層におけるＩＭｎＡｇによるコーティングに関して、最も高い３種類の濃度のＨＤＬ液（点線：１０５ｍｇ／ｄＬ、１２０ｍｇ／ｄＬ及び１５０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬＣ）が、最高の応答が頭打ちになるような、ほぼ同質の動力学を示す。対照的に、ＰＥＧ「−０３」層を有する処方は、これらの３種類の高濃度ＨＤＬ試験液に関して反応の増加を示す（図７）。前記の２つの処方の間のこの相違は、ＰＥＧが「−０３」層中に使用される時に、より良好な直線性、及びより高いダイナミックレンジの要求に変わる。同様に、ＤＯＥ分析による直線性評価は、「−０３」層においてＩＭｎＡｇ重合体と比べてＰＥＧによる直線性に関する大きな主効果をも示す（図８）。「−０３」層中のＰＥＧは、ＩＭｎＡｇ「−０３」層に比べて、上限ダイナミックレンジに約３０ｍｇ／ｄＬを上乗せする。

「−０３」層中のＰＥＧによるダイナミックレンジ及び直線性の改善に加えて、精度の大きな改善が、ＰＥＧを含む処方でも観察された。名目的なＩ−１００接着層（０．４４ｇ／ｍ²）の存在下、ＰＥＧを含有する処方に関して不正確さは６０％超まで減少した。同様の傾向が２×Ｉ−１００層及び添加されたＰＥＩセルロースによって観察されたが、しかし、ＰＥＧの精度改善の規模はあまり大きくなかった。全３要因のＤＯＥ分析は、ＰＥＧ「−０３」層が改善された精度のための大きな要因であることを証明するが、シンナーＩ−１００及びＰＥＩセルロースの両者の添加が改善された精度に著しく貢献しうることをも証明する（図９）。しかし、展開層中のＰＥＩセルロースは、ＬＤＬ交差反応性の望ましくない上昇を引き起こした。ＰＥＧ「−０３」層に関するこれらの試験（精度、直線性、及び動力学的終点）で観察された利益に基づいて、ＰＥＧは直接のＨＤＬ薄膜アッセイのための重合体の選択として好ましかった。

実施例８
「−０２」層中への重合体マトリックスの使用が溶血サンプルからの干渉を取り除く
「−０２」色素含有層のマトリックスとしてゼラチンを使用したフォーマットが、溶血が生じた血清サンプルからの異常に低いＨＤＬＣ値を予測することがわかった。この負の干渉は、ヘモグロビンからよりも溶解した細胞から放出されたカタラーゼによって引き起こされた。カタラーゼは、コレステロール酵素カスケードのＨ₂Ｏ₂介在色素形成ステップに干渉する。色素含有「−０２」層マトリックスの変更は、カタラーゼの干渉を取り除いた。様々な既知量の激しく溶血させた血清製剤（溶血血液）を加えた血清サンプルを、「−０２」層マトリックスとしてのＩＭｎＡｇ、ＰＥＧ又はゼラチンを含むコーティングによって評価した。表１２で詳述されるとおり、「−０２」層中のゼラチンの代わりに重合体ＩＭｎＡｇ又はＰＥＧを用いることは、５００ｍｇ／ｄＬのヘモグロビンまで溶血血液を加えたサンプルによる全ての負のカタラーゼ干渉を本質的に取り除いた。

実施例９
好ましいスライド構造
乾式要素に前述の発見を取り込むことによって、正確で、精密な、かつ、迅速なＨＤＬＣアッセイを開発した。本発明の好ましい態様は、以下の表１３に示される。

（注釈：最上部のウォッシュコート（「−０６」）層は別々に適用されるが、しかしコーティングによって前記「−０５」展開層中に吸収される）。多数の変更及び修飾が本発明の範囲及び意図から逸脱することなくその中で作り上げられうることは理解されるべきである。例えば、他の有用なフォーマットを表１４に挙げる。

実施例１０
正確度試験
ＨＤＬＣ選択性界面活性剤として７ｇ／ｍ²のＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６を使用し、ＨＤＬ選択性コレステロール・エステル加水分解酵素としてカンジダ・ルゴサ由来リパーゼ又はＤｅｎｋａ ＣＥＨを使用し、そして「−０２」マトリックスとしてＩＭｎＡｇ又はＰＥＧを使用した、先の好ましいスライド構造として記載された処方及びフォーマットを使ってＨＤＬＣ薄膜スライドを作製した。ＶＩＴＲＯＳ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＨＤＬＣ沈澱法に対する正確度、及びプールされた精度を３０点の患者サンプルを使って評価した。結果を表１５で見ることができる。前記結果は、このアッセイが許容される正確度と精度を有し、かつ、溶血させた患者サンプルからの顕著な干渉がないことを示す。

ウシ膵臓コレステロール・エステラーゼ（ＣＥＨ）酵素源を用いたＨＤＬＣ及びＬＤＬＣ動力学のグラフである。ヒトＨＤＬ試験液を実線で示す。ヒトＬＤＬ試験液を点線で示す。 ブタ膵臓ＣＥＨ酵素源を用いたＨＤＬＣ及びＬＤＬＣ動力学のグラフである。ヒトＨＤＬ試験液を実線で示す。ヒトＬＤＬ試験液を点線で示す。 カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ酵素源を用いたＨＤＬＣ及びＬＤＬＣ動力学のグラフである。ヒトＨＤＬ試験液を実線で示す。ヒトＬＤＬ試験液を点線で示す。 Ｄｅｎｋａ ＣＥＨ酵素源を用いたＨＤＬＣ及びＬＤＬＣ動力学のグラフである。ヒトＨＤＬ試験液を実線で示す。ヒトＬＤＬ試験液を点線で示す。 ポリエチレングリコール及びジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）に関するＬＤＬ交差反応性に対する主効果のプロットである。 重合体レセプター層中にポリアクリルアミド共同重合体（ＩＭｎＡｇ）を用いたヒトＨＤＬ試験液動力学のグラフである。０〜７５ｍｇ／ｄＬのヒトＨＤＬ試験液を実線で示す。１０５〜１５０ｍｇ／ｄＬのヒトＨＤＬ試験液を点線で示す。 重合体レセプター層中にポリエチレングリコールを用いたヒトＨＤＬ試験液動力学のグラフである。０〜７５ｍｇ／ｄＬのヒトＨＤＬ試験液を実線で示す。１０５〜１５０ｍｇ／ｄＬのヒトＨＤＬ試験液を点線で示す。 重合体レセプター層におけるＩＭｎＡｇ対ＰＥＧを用いた直線性に関する主効果のプロットである。 ヒトＨＤＬ試験液を用いたプールされた標準偏差精度に関する主効果のプロットである。

Claims (14)

1. 以下の：
   （Ａ）支持体；並びに
   （Ｂ）以下の；
   １）非高比重リポタンパク質コレステロールを沈殿させるためのリンタングステン酸；
   ２）沈殿した非高比重リポタンパク質コレステロールを溶解しない、ＥＭＵＬＧＥＮ Ｂ−６６（ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル）及びＥＭＵＬＧＥＮ Ａ−９０（ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル）からなる群より選ばれる高比重リポタンパク質選択性界面活性剤；及び
   ３）高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素、
   を含む１以上の追加の層、
   を含む高比重リポタンパク質コレステロールの定量化のための乾式分析要素。
2. 前記高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素が、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼである、請求項１に記載の分析要素。
3. 前記の１以上の追加の層が、ポリエチレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の分析要素。
4. 前記の１以上の追加の層が、ジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）をさらに含む、請求項１に記載の分析要素。
5. 前記支持体が、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート及びセルロース・エステルから成る群から選ばれる透明な材料を含む、請求項１に記載の分析要素。
6. 前記の１以上の追加の層が、リンタングステン酸を含むウォッシュコート層、高比重リポタンパク質選択性界面活性剤を含む透過性展開層、接着層、高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素を含む重合体レセプター層、重合体を含む色素副層、及び結合剤材料を含むゲル層を更に含み、
   ここで、支持体が、支持体に向かって上から下に以下の順序：
   ａ．リンタングステン酸を含むウォッシュコート層；
   ｂ．高比重リポタンパク質選択性界面活性剤を含む透過性展開層；
   ｃ．接着層；
   ｄ．高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素を含む重合体レセプター層；
   ｅ．重合体を含む色素副層；及び
   ｆ．結合剤材料を含むゲル層、
   でコートされている、請求項１記載の分析要素。
7. 前記高比重リポタンパク質選択性コレステロール・エステル加水分解酵素が、カンジダ・ルゴサ由来リパーゼである、請求項６に記載の分析要素。
8. 前記重合体レセプター領域が、ポリエチレングリコールを含む、請求項６に記載の分析要素。
9. 前記色素副層が、ポリエチレングリコール又はポリアクリルアミド共重合体を含む、請求項６に記載の分析要素。
10. 前記重合体レセプター層が、ジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）を含む、請求項６に記載の分析要素。
11. 前記支持体が、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート及びセルロース・エステルから成る群から選ばれる透明な材料を含む、請求項６に記載の分析要素。
12. 前記色素副層又はゲル層が、ロイコ色素（２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾール）を含む、請求項６に記載の分析要素。
13. 前記ゲル層が西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを含む、請求項６に記載の分析要素。
14. 前記重合体レセプター層が、セルロモナス由来のコレステロール・オキシダーゼを含む、請求項６に記載の分析要素。

Images