JP4569030B2 - 外部光下で計測可能な蛍光検出方法、および装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料に含まれる特定物質からの蛍光信号を検出し、検出された蛍光信号量からその定量を行う蛍光検出装置に関し、特に、酵素反応など所定温度でのインキュベーションを必要とする臨床診断分野において、多数の試料についてリアルタイムモニタリング（蛍光信号量の経時変化の追跡）をする場合に有用な蛍光検出装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酵素反応による蛍光性反応生成物の生成の様子をリアルタイムモニタリングする場合等では、所定温度で試料（反応液）をインキュベーションしつつ、蛍光検出を行う必要がある。しかも臨床診断等の分野では、同時に多数の試料を迅速に処理する必要もある。
【０００３】
このような目的のために発明された装置として、特願平１０−２５４９１３、特願平１１−１８０５４、および、特願平１１−２６８８９３のスキャナー型蛍光検出装置がある。
【０００４】
特願平１０−２５４９１３のスキャナー型蛍光検出装置は、図５に図示したように、試料容器を円弧状に展開配列し、仕切り板を挟んでリング型ライトガイドのリング部を対向して近接静置し、仕切り板には励起光用光学手段と蛍光用光学手段を固定装備して一体的に回転させ、これにより個別採取された蛍光信号をリング型ライトガイドで光センサーに伝達するというものである。
【０００５】
また、特願平１１−１８０５４のスキャナー型蛍光検出装置は、図６に図示したように、試料容器を複数の円弧状に展開配列し、仕切り板を挟んでリング型ライトガイドを静置し、仕切り板には励起光用光学手段と少なくとも１本のライトガイドを含んだ蛍光用光学手段を固定装備して一体的に回転させ、これにより個別採取された蛍光信号をリング型ライトガイドで光センサーに伝達するというものである。
【０００６】
さらに、特願平１１−２６８８９３のスキャナー型蛍光検出装置は、図７に図示したように、試料容器を円弧状に展開配列し、仕切り板に小型の励起光源、励起光用光学手段、蛍光用光学手段を固定装備して一体的に回転させ、蛍光用光学手段のライトガイドの蛍光出射端を回転中心軸上に光センサーと対向して配置することで、試料からの蛍光を個別採取し検出するというものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来の蛍光検出装置を用い、所定温度で試料をインキュベーションしつつ、試料に含まれる特定物質からの蛍光信号の経時的変化をリアルタイムモニタリングするには、以下のような課題がある。
【０００８】
特願平１０−２５４９１３や特願平１１−１８０５４のスキャナー型蛍光検出装置では、装置全体をさらに小型化するために小型・低出力の励起光源を使用した場合に蛍光信号が極微弱となり、光電子増倍管のような高感度光センサーを用いても感度不足となることがある。この原因は、蛍光信号の伝達に使用しているリング型ライトガイドの入射口が通常数百μｍと狭く、蛍光信号の伝達効率が低いことにある。特に、特願平１１−１８０５４のスキャナー型蛍光検出装置では、静置するリング型ライトガイドの他に、回転運動する第二ライトガイドを直列に設け、両者間での信号伝達を仲介しているために、極微弱の蛍光に対する感度不足に陥りやすい。アルゴンイオンレーザーなどの高出力の励起光源を使用すれば感度不足は解消するのだが、制御電源と合わせれば大きなスペースを必要とし、装置小型化の障害となる。
【０００９】
また、特願平１１−２６８８９３のスキャナー型蛍光検出装置は、小型化の課題は解決できるものの、同時に検出すべき試料の数が多い場合には別の課題が生じる。この課題は、以下のことに起因している。つまり、用意した多数の試料に順次試薬を添加して蛍光検出装置にセットしていくのであるが、従来の蛍光検出装置では、外光の侵入を防止するために、最後の試料のセットが終わって遮光カバーを閉じるまで蛍光検出装置を稼動させることができないことに起因している。
【００１０】
特に、インキュベーションの進行が速い場合には深刻である。すなわち、試料のインキュベーションの進行が速く、かつ、同時に検出すべき試料の数が多い場合には、蛍光検出装置を稼動させたときには最初の方にセットした試料のインキュベーションがすでに終了しており、インキュベーションのリアルタイムモニタリングを達成できない事態に至る。そのため、蛍光検出装置の同時設置試料数が、例えばｎ本と設計されていても、実質的にはｎにまったく満たない数の本数しか利用できない、という問題点が生じていた。
【００１１】
この問題点は、蛍光検出装置への外部光の侵入を防止する手段として蛍光検出装置の多くが採用している装置全体、または、すべての測定試料を一度に覆う遮光カバーをなくすか、開放状態で蛍光計測ができるようにすれば解決する。以後、このような装置全体、または、すべての測定試料を一度に覆う遮光カバーのない状態で蛍光計測する手段を、便宜上「オープン蛍光計測」と呼ぶことにする。
オープン蛍光計測の一手段は、個々の試料容器を覆う遮光蓋を試料容器の数だけ設置することである。しかし、多数サンプルを測定する蛍光検出装置に個々の試料容器を覆う遮光蓋を設置することは、大型化や高コスト化など別の問題点を生じる。
【００１２】
このように、蛍光信号のリアルタイムモニタリング、とりわけ試料を所定温度でインキュベーションしつつリアルタイムモニタリングするための蛍光検出装置には、（ａ）高精度な温度調節、（ｂ）多数試料の迅速処理、（ｃ）高感度、（ｄ）高信頼性（断線や可動部品の動作不良等に代表される機械的トラブルの低減、蛍光検出の再現性の向上、キャリーオーバーの危険性の低減）、（ｅ）低コスト（装置構成の単純化、データ処理等において高価な部品を使用しないこと）、（ｆ）装置の小型化、などの要求を満たすことが必要であり、さらに、インキュベーション時間の短時間化に伴う課題として、（ｇ）オープン蛍光計測、を実現することが必要である。
【００１３】
そこで本発明は、かかる要求を満たす蛍光の検出方法と蛍光検出装置の提供、特に、多数の試料の迅速なインキュベーションを順次リアルタイムモニタリングをする場合に有用で、小型で高感度な蛍光分析の光学系を用いたオープン蛍光計測の可能な蛍光検出装置とその方法の提供を目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本願請求項１項の蛍光検出方法は、光透明性または光半透明性の試料容器に収容された液体試料からの蛍光を検出する方法であって、試料容器は、試料容器の挿入口と励起光の入射口と蛍光の出射口を除いて光不透明なサンプルホルダーに設置し、液体試料に、該液体試料と混合しない遮光性液体を重層することで、試料容器の挿入口からの外光の侵入を防止し、励起光は、遮光性液体を照射する前に液体試料を照射できる方向から入射し、蛍光は、遮光性液体で吸収されない方向に放射した蛍光を検出することを特徴とする。
【００１５】
また、前記目的を達成するために成された本願請求項２項の蛍光検出方法は、遮光性液体が遮光剤が添加されたオイルであることを特徴とする、請求項１の蛍光検出方法である。
【００１６】
また、前記目的を達成するために成された本願請求項３項の蛍光検出方法は、遮光剤がカーボンブラックであることを特徴とする、請求項２記載の蛍光検出方法である。
【００１７】
また、前記目的を達成するために成された本願請求項４項の蛍光検出装置は、収容する試料容器を円弧上に展開して固定保持するサンプルホルダー、該円弧中心を中心として回転可能な駆動手段に連結された仕切り板、該仕切り板に固定装備されて一体的に回転する励起光源と励起光用光学手段と蛍光用光学手段、そして該回転可能な駆動手段と機械的に断絶して固定配置された光センサーを装備した蛍光検出装置であって、
（ａ）前期励起光源からの励起光強度は一定の周波数で変調されており、
（ｂ）前記励起光用光学手段は、励起光源からの励起光を試料容器に導いて、１個の試料容器を選択的に励起するよう配置され、
（ｃ）前記蛍光用光学手段は、試料容器からの蛍光信号を光センサーに伝達するためのライトガイドを含み、その入射端は蛍光信号を採取できるよう励起光が導かれた試料容器に対向可能に配置され、出射端は前記駆動手段の回転中心軸上に前記光センサーに対向可能に配置されており、
（ｄ）仕切り板の回転によって、円弧上に展開された各試料容器に順次励起光を導きつつ、同時に、ライトガイドを含む蛍光用光学手段を介在して蛍光を光センサーに導き、
（ｅ）光センサーから出力される電気信号を励起光強度の変調周波数で位相検波することを特徴とする、蛍光検出装置である。
【００１８】
また、前記目的を達成するために成された本願請求項５項の蛍光検出装置は、励起光用光学手段は、励起光源からの励起光を下方から上方に向かって試料容器に導いて、１個の試料容器を選択的に励起するよう仕切り板に固定配置され、蛍光用光学手段は、試料容器から仕切り板の回転中心に概略水平方向に向かった蛍光信号を採取するように、仕切り板に固定配置されていることを特徴とする、請求項４記載の蛍光検出装置である。
【００１９】
また、前記目的を達成するために成された本願請求項６項の蛍光検出装置は、試料を所定温度に制御するための温度調節手段を装備することを特徴とする、請求項４または５記載の蛍光検出装置である。
【００２０】
以下、本発明の蛍光検出装置を、図面に基づき詳細に説明する。
【００２１】
図１は、オープン蛍光計測を可能とする蛍光の検出方法で、請求項１から３記載の一実施形態の概要を示したものである。
【００２２】
光透明性または光半透明性の試料容器に収容された液体試料を、光不透明なサンプルホルダーに設置し、液体試料に、該液体試料と混合しない遮光性液体を重層することで、試料容器の挿入口からの外部光の侵入を防止し、オープン計測を可能とする蛍光の検出方法である。
【００２３】
サンプルホルダーは、試料容器の挿入口と励起光の入射口と蛍光の出射口を除いて光不透明な材料で構成される。例えば、アルミ合金で成形し、その表面を黒色のアルマイト処理をするなどの方法が考えられる。試料容器の挿入口は試料容器を挿入できる大きさで、かつ、試料容器の場所が常に一定となるよう固定保持できる形状であれば良い。
【００２４】
励起光の入射口は、励起光が遮光性液体を照射する前に液体試料を照射できる位置と方向にあれば良い。また、蛍光の出射口は、蛍光が遮光性液体で吸収されない方向に放射した蛍光を取り出すことができる位置と方向であれば良い。この条件さえ満たすならば、励起光の入射方向と蛍光の取り出し方向は実質同軸上でも良いのだが、好ましくは、励起光の入射方向と蛍光の取り出し方向が互いに９０°に近い角度をなすようにすれば良い。例えば、励起光の入射方向と蛍光の取り出し方向の一方を液体試料の下方向とし、他方を液体試料の水平方向とすることなどが考えられる。
【００２５】
遮光性液体は、蛍光計測を妨害する外部光のすべての波長の光を吸収し、かつ、液体試料と混合しないものであれば良い。遮光性液体自体が外部光を吸収しても良いし、適当な液体に別の遮光剤を添加して調整しても良い。また、液体試料は水系であることが多いが、その場合、液体試料と混合しない液体としては、オイル系を使用することが考えられる。例えば、遮光性液体は、カーボンブラックをミネラルオイルに添加して調整することが考えられる。特に、レーザープリンタやコピー機に採用されているトナーは、カーボンブラックにポリエチレン系やポリスチレン系の樹脂でコーティングされており、オイル層では程好く分散するが、水層に移行することはない。その他、遮光剤としては、塗料、顔料、磁性流体などが考えられる。
【００２６】
さらに、図２は、固定静置された多数の試料のリアルタイムモニタリングをオープン蛍光計測する場合に有用で、小型で高感度な蛍光分析の光学系を用いた蛍光検出装置であり、請求項４乃至５記載の一実施形態の概要を示したものである。
【００２７】
サンプルホルダー（４）は、円弧上に試料容器の外部形状に適合した保持孔を備え、試料を収容した試料容器を円弧上に展開した状態に固定保持する。それぞれの円弧における試料容器の展開は、図に示したような均一間隔の展開に制限されず、不均一間隔の展開であっても良い。また、サンプルホルダーに固定保持する試料容器の数に制限はなく、円弧の長さと試料容器の外径等から決定すれば良い。さらに、サンプルホルダー上面形態は円に制限されず、四角形等の多角形とすることもできる。
【００２８】
試料容器は、励起光及び蛍光を透過し得、収容する試料に対して化学的に安定な材料で構成されたものであれば特に制限はなく、蛍光検出に供する試料量等を勘案して適宜選択使用することができる。特に、いわゆるＰＣＲやＮＡＳＢＡ等において、酵素的に核酸を増幅しつつ反応の様子をモニターする場合において、増幅核酸の飛散を防止する目的では密閉栓を有する試料容器を用いることが好ましい。
【００２９】
固定配置されたサンプルホルダーの下方には、仕切り板（３）が、駆動手段（７）と連結されて前記円弧上に展開された試料容器の該円弧中心を中心として回転可能に配置されている。さらに、この仕切り板には、励起光源（８）と励起光用光学手段（５）と蛍光用光学手段（６）が固定装備され、駆動手段（７）の作用により、これらが一体的に回転する。
【００３０】
仕切り板（３）は、回転運動を安定化するために円盤を用いて構成することが好ましく、その大きさ（半径）は、少なくとも前記円弧中心と試料容器の離間距離より大きくして、後述する励起光源（８）、励起光用光学手段（５）、および蛍光用光学手段（６）を設置できるようにする。ただし、後述する励起光用光学手段を固定装備する場所だけは、励起光が透過できるよう、円形状の孔を設けておく。仕切り板はサンプルホルダーの下方に配置することが好ましい。なぜならば、試料量は数十μｌと少量であることが多く、その場合、試料容器の底面近傍から蛍光信号を採取することになり、励起光源、励起光要光学手段、および蛍光用光学手段を配置し易いからである。
【００３１】
励起光源（８）は、試料の励起波長を考慮した上で選択すればよいが、励起光用光学手段（５）を通して１個の試料容器に到達した励起光が充分な光量となるようなものを使用する。また、仕切り板に固定装備するため、できるだけ小型の励起光源が好ましい。より具体的には、発光ダイオードや半導体レーザーを例示できるが、図２の例では発光ダイオードを使用している。
【００３２】
仕切り板に固定装備される励起光用光学手段（５）は、励起光源（８）の光から励起光を波長選別し、その励起光を前記円弧状に展開された試料容器のうち１個のみに選択的に導くための手段である。図２の例では、波長選別手段として干渉フィルターを使用し、光学レンズにより特定の試料容器に集光できるようにしている。なお、１個の試料容器にのみ励起光を導くとは厳格な意味で使用されるものではなく、励起光を意図的に１個の試料容器に導けば十分であり、例えば当該１個の試料容器外壁における反射により、微量の励起光が他の試料容器に到達することがあっても特に支障はない。
【００３３】
仕切り板に固定装備される蛍光用光学手段（６）は、少なくとも１本のライトガイド（６ａ）を含み、前記のようにして励起光が導かれた１個の試料容器から射出される蛍光のみを、光センサー（２）に伝達するための手段である。従って、該ライトガイド（６ａ）の蛍光入射端と蛍光出射端は、それぞれ試料容器と光センサーに対向配置させる。もちろん、試料容器とライトガイドの蛍光入射端の間には、蛍光伝達効率の向上を目的とした光学レンズなどの集光手段や、蛍光波長を選別するための波長選別手段を挿入しても良い。また、ライトガイドの蛍光信号出射端と光センサーの間に、上記集光手段や波長選別手段を挿入しても良い。図２の例では、試料容器とライトガイドの蛍光入射端の間に集光手段を挿入し、ライトガイドの蛍光信号出射端と光センサーの間に集光手段と波長選別手段を挿入している。
【００３４】
なお、該ライトガイド（６ａ）の蛍光信号出射端は、前記仕切り板が連結された駆動手段（７）の回転中心軸上に配置する。これにより、仕切り板（３）や駆動手段（７）が回転しても、ライトガイドの蛍光信号出射端の位置は変化せず、同じ効率で蛍光信号を光センサーに伝達することが可能となる。ライトガイドとしては、柔軟性に富む１本の光ファイバーか、複数本の光ファイバーの両端を適当な金具で端面を揃えてバンドルして密集させたものが最適である。
【００３５】
以上のような構成を採用することにより、図２の装置では、仕切り板の回転にともなって、サンプルホルダーに固定保持された試料容器に、励起光用光学手段により１個ずつ、順次、励起光が導かれる。同時に試料容器から射出した蛍光は、ライトガイドを含む蛍光用光学手段を介在して光センサーによって検出される。従って、コンピューター等を用いて仕切り板の回転を制御しつつ、光センサーの検出結果を蓄積すれば、サンプルホルダーに保持された任意試料の間欠的な蛍光検出結果が得られ、リアルタイムモニタリングが実現できるのである。
【００３６】
さらに、オープン蛍光計測に対応するためには、図３に示したように、励起光強度の変調と蛍光信号の位相検波を併用することが好ましい。特に、検出する蛍光が微弱のため、透明性または半透明性の容器を伝播して侵入する外部光が問題となる場合があり、このような時に有効である。すなわち、励起光源の発光ダイオードをパルス発振させ、光センサーからの電気信号をその周波数でロックインアンプを用いて位相検波する。これによって、外部光を含んだ信号のなかから、蛍光信号のみを選択的に検出することができる。
【００３７】
励起光強度の変調は、周波数と波高が安定しておればどのような波形状でも良いが、好ましくは、サイン波または矩形波を利用する。蛍光強度は励起光強度に比例するため、蛍光信号の強度も励起光強度と同様に変調される。光センサーからの電気信号には、変調された蛍光信号と装置内に侵入した外部光の信号が重なっているが、所謂ロックインアンプを用いて励起光強度の変調周波数で位相検波することにより、変調された蛍光信号のみを選別して取り出すことができる。このようにして、わずかながら侵入する外部光の影響を受けることなく、蛍光信号を安定して検出できるオープン蛍光計測を実現できる。
【００３８】
また、図４は、固定静置された多数の試料についてリアルタイムモニタリングをする場合に有用で、温度コントロール手段によるインキュベーション機能を付与した蛍光検出装置であり、請求項６記載の一実施形態の概要を示したものである。すなわち、図４の蛍光検出装置は、図２で説明した蛍光分析の光学系に、試料を所定温度に制御するための温度調節手段を付与したものである。
【００３９】
試料を所定温度に制御するための温度調節手段（９）は、１個の加熱ヒーター（９ａ）と１個の温度センター（９ｂ）を使用している。サンプルホルダー（４）の上面形状を円環状とし、その外周部に加熱ヒーター（９ａ）を貼付し、サンプルホルダーの内部に温度センサー（９ｂ）を組み込んでいる。これにより、サンプルホルダーからの熱伝導により、試料を所定温度に制御することができるのである。
【００４０】
さらに、図４の例では、サンプルホルダー、仕切り板とその回転駆動手段、仕切り板に固定装備された励起光源、励起光用光学手段、蛍光用光学手段、および遮光板のほとんどを収容する断熱槽（１０）を設置している。断熱槽は、温度調節手段の作用により温度コントロールされた試料温度を外部温度と遮断し、より高精度な温度調節を可能とするために、設置することが好ましい。また、このような目的のために使用するのであるから、少なくともサンプルホルダーをその内部に収容するものでも良い。
【００４１】
もちろん、温度調節手段は上記の方法に限定されず、例えば、少なくともサンプルホルダーを一定温度の恒温槽内に収容して、空気などの対流により制御することなども可能である。さらに、温度調節手段は、ヒーターなどを使用した加熱の場合に限定されず、冷却の場合や、加熱と冷却を繰り返す熱サイクルの場合もある。冷却の場合には、ペルチェ素子や冷却ファンなどの冷却素子を加熱ヒーターに替えて使用すれば良い。また、熱サイクルの場合には、加熱ヒーターなどの加熱素子とペルチェ素子や冷却ファンなどの冷却素子を併用すれば良い。
【００４２】
このように、図２の蛍光検出の光学系と試料の温度調節手段を組み合わせることによって、多数の試料で酵素反応など所定温度でのインキュベーションを高精度に実施でき、同時に、酵素反応に伴う蛍光信号の経時変化をリアルタイムモニタリングする蛍光検出装置を提供することが可能となる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の蛍光検出装置を更に詳細に説明するため、図５〜７に基づき具体例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
オープン蛍光計測を可能とする蛍光検出装置として、図５に示した装置を製作した。本蛍光検出装置は請求項４、５および６の記載に対応する装置である。
【００４５】
図５〜７は、本発明の蛍光検出装置の詳細を説明するための図である。
【００４６】
サンプルホルダー（４）は、図７に示したように、円環状のアルミ合金製部品に、試料容器を挿入して保持する穴、励起光を通過させるための穴、および蛍光を採取するための穴を、それぞれ３２個づつ設けたものである。試料容器を挿入して保持する穴は、試料容器外径に適合する穴（最大径φ８）を直径１６０ｍｍの円弧上に、９°ピッチで等間隔となるよう展開配置した。なお、この穴の下方部は、試料容器の底を密着支持できるよう試料容器形状に適合したテーパ状に形成した。励起光を通過させるための穴（φ３．４）は、その中心軸が試料容器を挿入して保持する穴の中心軸と同一になるように、円環状のアルミ合金製部品の最下部に設けた。さらに、蛍光を採取するための穴（φ２）は、その中心軸が試料容器を挿入して保持する穴の中心軸と直交するように設けた。
【００４７】
サンプルホルダーの下方には、円盤状の仕切り板（３）を配置した。本仕切り板上には、該仕切り板（３）の外周部で中心から８０ｍｍの位置に蛍光信号を通過させる孔、励起光源（８）として発光ダイオード（発光中心波長４７０ｎｍ）、励起光用光学手段（５）として波長選別用の干渉フィルター（透過中心４７０ｎｍ、半値幅１０ｎｍ）と集光用の光学レンズを固定装備した。さらに、蛍光用光学手段（６）として、蛍光集光用の集光レンズ２個、および、後述するライトガイド（６ａ）を該仕切り板（３）上に固定装備した。なお、励起光用光学手段（５）と蛍光用光学手段（６）の位置関係は、それぞれの中心軸が直交するように配置しており、これによって、励起光によって誘起された蛍光を効率良く採取できる。
【００４８】
蛍光用光学手段（６）の構成要素であり、蛍光信号を伝達するライトガイド（６ａ）として、φ２ｍｍのプラスチック製光ファイバーを使用した。ライトガイド（６ａ）の蛍光信号入射端は、集光レンズの集光点において、試料容器に対向するようにに固定装備した。さらに、下記に説明する仕切り板の回転駆動手段の回転軸内を経由し、回転中心軸上に蛍光信号出射端が位置するよう、回転中心軸（７ａ）に固定装備した。
【００４９】
更に該仕切り板（３）には、円筒状の回転軸（７ａ）、ステッピングモーター（７ｂ）、軸受（７ｃ）、回転スリット（７ｄ）、回転位置センサー（７ｅ）、タイミングプーリ（７ｆ）、タイミングベルト（７ｇ）及びカップリング（７ｈ）から構成される駆動手段（７）を連結した。これにより、仕切り板（３）とこれに固定された励起光源（８）、励起用光学手段（５）、蛍光用光学手段（６）、遮光板（１２）は、駆動手段（７）の動作に応じて一体的に回転することになる。また回転スリットと回転位置センサーを装備することにより、仕切り板の回転の状態、即ち各瞬間に蛍光検出がなされている試料容器の位置を検出することも可能となる。
【００５０】
また、ライトガイド（６ａ）の蛍光信号出射端の先方には、光学レンズを挟んでダイクロイックミラーを波長分散手段（１１）として設置し、約５６０ｎｍを境界とした波長別の光路分割を行った。ダイクロイックミラーによる反射光（５６０ｎｍ以下）の光路には、波長選択用の光学フィルター（干渉フィルター；５２０ｎｍ）と光学レンズを配置し、光センサー（光電子増倍管）を配置した。一方、ダイクロイックミラーによる透過光（５６０ｎｍ以上）の光路には、全反射ミラー、波長選択用の光学フィルター（干渉フィルター；６１０ｎｍ）と光学レンズを配置し、光センサー（光電子増倍管）を配置した。以上により、５２０ｎｍと６１０ｎｍの波長を持つ蛍光信号を同時に検出した。
【００５１】
以上の各部品は、ベース板、支持リング及び支柱などによって、それぞれの位置関係は規程されるよう設計し、組み立てを行った。
【００５２】
また、図５の電装系には、励起光源の発光ダイオードを一定の周波数でパルス発振させるための電子回路、および、光センサーからの電気信号を同じ周波数でロックインアンプを用いて位相検波するための電子回路を設置した。
【００５３】
励起光源の発光ダイオードの変調発光は、同期信号発生回路（１３）で発生する１５９０Ｈｚのサイン波を，励起光源駆動回路（１４）により電流増幅することで行った。また、前記同期信号発生回路からは，前記サイン波と同じ周波数の矩形波を発生させ，ロックインアンプ（１５）の参照信号入力とした。
【００５４】
光センサーから得た電気信号は，信号増幅回路（１２）により増幅したのち，ロックインアンプ（１５）に入力され，前記参照信号により位相検波される。これによって、外部光を含んだ信号のなかから、蛍光信号のみを選択的に検出し、わずかながら侵入する外部光の影響を除去した。位相検波された信号は，ローパス・フィルタ回路（１６）により，高調波ノイズ成分を除去した後，アナログ・デジタル変換回路（１７）により，量子化され，信号処理・制御回路（１９）により数値化される。
【００５５】
さらに、サンプルホルダーには、外周部に加熱ヒーター（９ａ）を貼付し、内部に温度センサー（９ｂ）を設置した。なお、加熱ヒーターとしてテープヒーターを、温度センサーとして白金測温抵抗体を使用した。さらに、サンプルホルダー、仕切り板と一部の回転駆動手段、励起光源、励起光用光学手段、および蛍光用光学手段を断熱槽内に収容した。断熱槽は、ポリアセタール系のプラスチックや発泡ポリエチレンなどの熱伝導率の小さい材料で形成した。以上により、外部と熱遮断した上で、試料を高精度に温度制御し、酵素反応などのインキュベーション機能を具備した。
【００５６】
以上に説明した蛍光検出装置は、次のような作用により試料の蛍光信号を検出する。発光ダイオードから発した励起光は、励起光用光学手段を介在して、サンプルホルダーに挿入して保持された試料容器内の試料を下方から励起する。試料が発した蛍光はサンプルホルダーの側部から仕切り板の回転中心に向かって射出され、仕切り板に配置されたライトガイドなど蛍光用光学手段で伝達される。ライトガイドによって伝達された蛍光は、波長分散手段によって光路分割され、反射光と透過光のそれぞれは、５２０ｎｍと６１０ｎｍの干渉フィルターによって波長選別された後、光電子増倍管により電気信号に変換され、検出される。
【００５７】
３２個の試料容器は円弧上に固定して展開配置されているため、仕切り板の回転に従って、励起光による励起と蛍光用光学手段による蛍光収集が順次、実施されることになる。これは、多数の試料（本例の場合３２個）について、蛍光検出を容易に実現できることを意味する。また、３２個の試料の蛍光計測を終えた後、仕切り板を逆回転して回転位置を一旦元に戻し、上記の動作を繰り返すことにより、これら試料の蛍光信号の経時的変化の様子を間欠的にモニターできることになる。
【００５８】
実際に本装置を用いて蛍光検出する際には、遮光性液体を用意した。水系の試料を用いるため、オイル系の遮光性液体を調製した。具体的には、ミネラルオイルに５０ｍｇ／ｍｌのカーボンブラックを混入した。カーボンブラックとしては、レーザープリンター用のトナーを使用した。蛍光検出する際には，試料容器に液体試料を２５μｌ分注した後，前記遮光性液体を１００μｌ分注し，サンプルホルダーにセットした。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の蛍光検出装置によれば、下記のような効果が得られる。
【００６０】
複数の試料容器を保持できるサンプルホルダーは固定配置されているため、試料容器に収容された各試料に対しては高精度な温度調節が可能であり、これにより多数の試料を迅速処理できる。しかも、試料容器を固定配置して搬送しないことから、搬送中に試料間の温度格差が生じたり、搬送時の振動やゆれによりキャリーオーバーが生じる危険性も排除できる。
【００６１】
温度調節手段を装備した場合であっても、光センサーをその外部に配置することができるため、温度上昇に伴うノイズ上昇もなく、高感度な信号検出が可能である。しかも１波長につき１個の光センサーしか使用しないことからコストを低減することができ、同時に装置の小型化を図ったり、１波長につき複数の光センサーを使用する場合に必須となる各センサーの感度補正という煩雑な作業も省略することができる。更に、１波長につき１個の光センサーからの信号を処理するだけで多数試料の蛍光信号の経時的変化を知ることができるのであるから、データ処理に伴う負担も軽い。特に光センサーとして好ましく光電子倍増管を採用すれば、非常に高感度の蛍光検出装置を提供することができる。該構成によれば、微弱の蛍光信号に対しても感度は十分である。
【００６２】
ライトガイドは仕切り板に固定配置され同一形態を保って回転することから、その屈曲状態は一切変化することがない。従って光ファイバーの屈曲状態の変化に伴う光伝達効率の変化はなく、結果的に再現性の良好な信号検出が可能である。
本発明の装置では、機械的移動部分を仕切り板とそれに固定装備された部品のみに限定しており、しかも単純な回転運動のみである。そのため、機械的トラブルも最小限に抑制できる。このように本発明では、試料容器の搬送・移動は一切行わないが、仕切り板と光学手段を回転させることで多数試料のリアルタイムモニタリングを実現するものである。
【００６３】
また、特願平１０−２５４９１３や特願平１１−１８０５４のようなスキャナー型蛍光検出装置で問題となる、小型・低出力の励起光源を使用したときの感度不足の課題も、蛍光信号の伝達手段として、一本のライトガイドを使用することにより解決できる。実際に、上記に説明した実施例において、励起光源として利用した発光ダイオードの有効出力は、特願平１０−２５４９１３や特願平１１−１８０５４で利用されたアルゴンイオンレーザーに比較して、約１／４０に過ぎない。しかしながら、特願平１０−２５４９１３や特願平１１−１８０５４と同等の感度で蛍光検出を実現できる。また、リング型ライトガイドを使用しないため、低コスト化の効果もある。
【００６４】
また、特願平１１−２６８８９３を含めた従来の蛍光検出装置やそれを用いた蛍光検出の方法の課題であるオープン蛍光計測も可能となり、インキュベーションの進行が速い場合にも、多数の試料を順次リアルタイムモニタリングすることができる。
【００６５】
以上のように、本発明は、（ａ）高精度な温度調節、（ｂ）多数試料の迅速処理、（ｃ）高感度、（ｄ）高信頼性（機械的トラブルの低減、蛍光検出の再現性の向上、キャリーオーバーの危険性の低減）、（ｅ）低コスト（装置構成の単純化、データ処理等において高価な部品を使用しないこと）、そして、（ｆ）装置の小型化、等の要求を満たし、さらに、インキュベーション時間の短時間化に伴う課題である（ｇ）オープン蛍光計測も可能な蛍光検出装置とその方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光の検出方法の概略を示すための図である。
【図２】本発明の蛍光検出装置の概略を示すための図である。
【図３】本発明の蛍光検出装置のうち、励起光の変調と蛍光信号の位相検波を説明するための図である。
【図４】温度調節手段を装備した本発明の蛍光検出装置の概略を示すための図である。
【図５】本発明の蛍光検出器の一実施形態を説明するための全体図である。
【図６】図５に示した蛍光検出装置の一部分を詳細に説明するための正面図である。
【図７】図７に示した蛍光検出装置のサンプルホルダー部分と温度調節手段を詳細に説明するための断面を示す正面図および平面図である。
【符号の説明】
１ 遮光性液体、２ 光センサー、３ 仕切り板、４ サンプルホルダー、５ 励起光用光学手段、６ 蛍光用光学手段、６ａライトガイド、７ 駆動手段、７ａ 回転軸、７ｂ ステッピングモーター、７ｃ 軸受、７ｄ 回転スリット、７ｅ 回転位置センサー、７ｆ タイミングプーリー、７ｇ タイミングベルト、７ｈ カップリング、８ 光源、９ａ 加熱ヒーター、９ｂ 温度センサー、１０ 断熱槽、１１ 波長分散手段、１２ 信号増幅回路、１３ 同期信号発生回路、１４ 励起光源駆動回路、１５ロックインアンプ、１６ ローパス・フィルタ回路、１７ アナログ・デジタル変換回路、１８ 信号処理・制御回路

Claims (6)

1. 光透明性または光半透明性の試料容器に収容された液体試料からの蛍光を検出する方法であって、試料容器は、試料容器の挿入口と励起光の入射口と蛍光の出射口を除いて光不透明なサンプルホルダーに設置し、液体試料に、該液体試料と混合しない遮光性液体を重層することで、試料容器の挿入口からの外光の侵入を防止し、励起光は、遮光性液体を照射する前に液体試料を照射できる方向から入射し、蛍光は、遮光性液体で吸収されない方向に放射した蛍光を検出することを特徴とする、蛍光の検出方法。
2. 遮光性液体が遮光剤が添加されたオイルであることを特徴とする、請求項１の蛍光検出方法。
3. 遮光剤がカーボンブラックであることを特徴とする、請求項２記載の蛍光検出方法。
4. 収容する試料容器を円弧上に展開して固定保持するサンプルホルダー、該円弧中心を中心として回転可能な駆動手段に連結された仕切り板、該仕切り板に固定装備されて一体的に回転する励起光源と励起光用光学手段と蛍光用光学手段、そして該回転可能な駆動手段と機械的に断絶して固定配置された光センサーを装備した蛍光検出装置であって、
   （ａ）前期励起光源からの励起光強度は一定の周波数で変調されており、
   （ｂ）前記励起光用光学手段は、励起光源からの励起光を試料容器に導いて、１個の試料容器を選択的に励起するよう配置され、
   （ｃ）前記蛍光用光学手段は、試料容器からの蛍光信号を光センサーに伝達するためのライトガイドを含み、その入射端は蛍光信号を採取できるよう励起光が導かれた試料容器に対向可能に配置され、出射端は前記駆動手段の回転中心軸上に前記光センサーに対向可能に配置されており、
   （ｄ）仕切り板の回転によって、円弧上に展開された各試料容器に順次励起光を導きつつ、同時に、ライトガイドを含む蛍光用光学手段を介在して蛍光を光センサーに導き、
   （ｅ）光センサーから出力される電気信号を励起光強度の変調周波数で位相検波することを特徴とする、蛍光検出装置。
5. 励起光用光学手段は、励起光源からの励起光を下方から上方に向かって試料容器に導いて、１個の試料容器を選択的に励起するよう仕切り板に固定配置され、蛍光用光学手段は、試料容器から仕切り板の回転中心に概略水平方向に向かった蛍光信号を採取するように、仕切り板に固定配置されていることを特徴とする、請求項４記載の蛍光検出装置。
6. 試料を所定温度に制御するための温度調節手段を装備することを特徴とする、請求項４または５記載の蛍光検出装置。

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