CN105021579B - 磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用磷光量子点Mn:ZnS检测溶液中谷胱甘肽的方法。该方法在检测时不需要加入除氧剂和诱导剂，并且能够避免本底荧光和散射光的干扰。同时在检测中，不需要复杂的样品预处理过程。特别应用于检测生物体液和酒中的谷胱甘肽。本发明所制备的Mn‑ZnS磷光量子点水溶性、稳定性好，在溶液或水样等检测方面有很好的应用前景。
Description
本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095、全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023、天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700和天津市“131”创新型人才培养工程第一层次项目ZX110185的资助。
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，涉及水相合成的Mn掺杂ZnS量子点室温磷光检测谷胱甘肽及在生物体液和酒中的检测应用。
背景技术
早期，量子点的光学特性在生物传感、标记和成像领域的应用的焦点集中在在荧光量子点，但生物流体的自体荧光和基体散射光会带来不可忽视误差，在选择性方面也有所欠缺。为了提高其选择性，势必要消除来自其它荧光物质的干扰。如果在量子点的合成过程中加入一定的金属杂质，就可以得到具有分析潜力的磷光量子点。磷光的发光寿命较荧光长，具有适当的延迟时间，基于磷光量子点的室温磷光分析（Room-TemperaturePhosphorescence，RTP）生物传感器可以克服背景荧光的干扰。同时，磷光相较于荧光更为少见，检测的选择性也有所提高。由于以上的优势，近年来，磷光量子点的应用也逐渐引起研究者的关注。
在磷光量子点的研究领域，Mn掺杂的ZnS量子点已经吸引了相当多的研究者的关注。掺杂的锰离子可以作为激发电子和空轨道的复合中心，从而获得较强的较长波长的特征发光。它在约590 nm处有一个特征发射峰，这是由硫化锌与猛掺杂物形成带隙和锰离子从三重态过渡到基态的二价锰离子的过程中，硫化锌主晶格的能量转移产生的。通过测量其发光寿命，能够从样本的背景荧光中简单辨别出Mn:ZnS量子点。此外，相对于常用的CdSe或CdS量子点，Mn:ZnS量子点当中没有Cd2+这样的有毒离子释放，使量子点的毒性最小化，这在对生物活性物质的分析研究实验中是尤为重要的。这些优势使锰掺杂的硫化锌量子点在纳米生物成像和传感领域成为备受瞩目的标记物。研究伊始，表面修饰Mn2+的ZnS量子点被用来根据其磷光猝灭情况检测生物流体中的氟喹诺酮类抗生素依诺沙星。在此后的研究中，它在检测必需营养素抗坏血酸（VC）、结合葡萄糖氧化酶（COD）测定葡萄糖、鉴别蛋白质的多维传感装置等方面得到了很大的发展。
发明内容
本发明通过简便的化学氧化还原方法来调控磷光量子点的表面化学性质，从而实现在室温下对量子点磷光的调控。据此，发展了一种新型的基于量子点的磷光“开关”探针，并应用于选择性检测生物体液和酒中的谷胱甘肽。在本发明中，谷胱甘肽作为目标分析物，使用氧化剂高锰酸钾作为猝灭剂使Mn:ZnS量子点磷光猝灭，再向该体系中加入谷胱甘肽能够使量子点的磷光恢复。通过量子点的磷光变化情况，可以选择性地检测器谷胱甘肽。该方法在检测时能够避免本底荧光和散射光的干扰。同时也避免了复杂的样品预处理过程。
本发明所采用的磷光量子点（Mn:ZnS）的合成方法与之前申请的专利合成方法相同，具体的合成方法见专利申请号201410140175.2。
为实现上述目的，本发明公开了一种采用磷光量子点Mn:ZnS检测溶液中GSH（谷胱甘肽）的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）Mn掺杂ZnS量子点母液的配制：称量0.0040 g Mn掺杂ZnS量子点，容于40 mL水中；
（2）0.1 mol/L，25 ºC Tris-HCl缓冲液的配制：
称取1.2114 g（Mr=121.14）Tris和0.0576 g NaCl，溶于50 mL水中；用盐酸调节溶液的pH值至7.4后，用高纯水把它定容在100 mL容量瓶中，低温保存。
（3）谷胱甘肽（GSH）溶液的配制：
称取0.0049 g谷胱甘肽，把它溶于4 mL水中配成浓度为4 mM的GSH溶液；将4 mM的GSH溶液分别稀释5倍、10倍、50倍和100倍，配成800 μΜ、400 μΜ、80 μΜ和40 μΜ的溶液。
（4）KMnO4溶液的配制
称取0.0025 g高锰酸钾，溶于4 mL水中，配成浓度为4 mM的KMnO4溶液；将4 mM的KMnO4溶液分别稀释5倍、10倍、50倍和100倍，配成800 μΜ、400 μΜ、80 μΜ和40 μΜ的溶液。
（5）用磷光量子点检测谷胱甘肽
①向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度(0.3 μΜ-280 μΜ)的谷胱甘肽（GSH）溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
②向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度(1 μΜ-40 μΜ)的高锰酸钾溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
③向离心管中按比例加入0.01 mL-0.17 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入不同浓度(0.3 μΜ-280 μΜ)的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
本发明进一步公开了磷光量子点Mn:ZnS检测谷胱甘肽的方法在生物体液和酒中的应用。其检测过程为：
(1)向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL两种尿液样品，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
(2)向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL三种血清样品，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（3）向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL酒（白酒、啤酒、葡萄酒），加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实验结果显示：
本发明公开的磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽方面的应用与现有技术相比所具有的积极效果：
（1）本发明采用的以Mn 掺杂ZnS 磷光量子点为原料的磷光检测方法不需要加入除氧剂和诱导剂，免除繁琐的样品预处理过程，可以避免自体荧光和散射光的干扰；并且磷光相对于荧光是一种更为少见的现象，因此检测时的选择性得到进一步的增强。
（2）该方法用于溶液中的谷胱甘肽，利用了氧化还原反应进行识别，避免了常用的基于能量转移作用的探针中所需要的复杂的修饰或固定化作用，发展了一种更加经济、灵敏、简便的检测方法。
（3）本发明发展的检测谷胱甘肽的方法具有很好的分析特征量，其中检测范围为0.3 μΜ-280 μΜ，检出限为74 nM。此方法相比较于其他方法检出限低，灵敏度高，线性范围广，实用性强，具体的方法对比见实施例10。
（4）本发明发展的检测谷胱甘肽的方法具有很好的实用性，可以成功检测生物体液中和酒中的谷胱甘肽，具体的检测结果见表一和表二。
附图说明
图1磷光量子点的光学性质图：(a)为磷光量子点紫外吸收光谱，吸收峰在316 nm处，(b)为磷光量子点磷光光谱图，磷光发射峰在590 nm左右，(c)为磷光量子点磷光寿命图，其磷光寿命约为2 ms；
图2为向磷光量子点溶液中加入GSH后的磷光光谱图；
图3为向磷光量子点溶液中加入KMnO4后的磷光光谱图；
图4为向加有KMnO4的磷光量子点溶液中加入GSH后的磷光光谱图。
具体实施方式
通过下面结合附图对其示例性实施例进行的描述，本发明上述特征和优点将会变得更加清晰和容易理解。下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明。
本发明所述的高纯水购买于哇哈哈纯净水，所述的MPA(3-巯基丙酸)购买于北京百灵威科技有限公司，Zn（CH3COOH）2,Na2S,Mn（CH3COOH）2购买于天津市光复精细化工研究所，无水乙醇购买于天津市基准化学试剂有限公司，GSH（谷胱甘肽）购买于北京鼎国生物技术有限责任公司，高锰酸钾购买于天津市化学试剂一厂，其他的无机试剂都是购于天津市科威有限公司。
实施例1
1、Mn:ZnS的磷光量子点的合成
向反应器中依次加入MPA、Zn（CH3COOH）2和Mn（CH3COOH）2，其中MPA:Zn（CH3COOH）2 ：Mn（CH3COOH） 的摩尔比为4:1:0.1。用NaOH调节溶液的pH值到11，以上混合溶液经氮气保护，室温搅拌30 min，将Na2S与Zn（CH3COOH）2的摩尔比以1:1的Na2S溶液迅速注射到溶液中，继续室温搅拌20 min，然后在空气中采用恒温搅拌器加热至50 ℃陈化2小时，加入无水乙醇、离心，经真空干燥得到Mn掺杂ZnS量子点产品。
实施例2
1、 合成方法参照实施例1
2、 磷光量子点Mn:ZnS用于溶液中谷胱甘肽的检测
（1）向离心管中按比例加入0.01mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入0.3 μΜ的谷胱甘肽（GSH）溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（2）向离心管中按比例加入0.05mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度1 μΜ的高锰酸钾溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（3）向离心管中按比例加入0.01 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入1 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入不同浓度0.3 μΜ的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例3
1、合成方法参照实施例1
2、磷光量子点Mn:ZnS用于溶液中谷胱甘肽的检测
（1）向离心管中按比例加入0.05mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入10 μΜ的谷胱甘肽（GSH）溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（2）向离心管中按比例加入0.1mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度5 μΜ的高锰酸钾溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（3）向离心管中按比例加入0.05 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入5 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入不同浓度10 μΜ的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例4
1、合成方法参照实施例1
2、磷光量子点Mn:ZnS用于溶液中谷胱甘肽的检测
（1）向离心管中按比例加入0.1 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入50 μΜ的谷胱甘肽（GSH）溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（2）向离心管中按比例加入0.15mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度10 μΜ的高锰酸钾溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（3）向离心管中按比例加入0.1 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入10 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入不同浓度50 μΜ的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例5
1、 合成方法参照实施例1
2、磷光量子点Mn:ZnS用于溶液中谷胱甘肽的检测
（1）向离心管中按比例加入0.15 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入100 μΜ的谷胱甘肽（GSH）溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（2）向离心管中按比例加入0.15mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度20 μΜ的高锰酸钾溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（3）向离心管中按比例加入0.15 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入不同浓度100 μΜ的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例6
1、合成方法参照实施例1
2、磷光量子点Mn:ZnS用于溶液中谷胱甘肽的检测
（1）向离心管中按比例加入0.17 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入200 μΜ的谷胱甘肽（GSH）溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（2）向离心管中按比例加入0.15mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度40 μΜ的高锰酸钾溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
（3）向离心管中按比例加入0.17 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入40 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入不同浓度200 μΜ的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例7
1、合成方法参照实施例1
2、在生物体液中检测谷胱甘肽
向离心管中按比例加入0.15 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL两种尿液样品，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例8
1、合成方法参照实施例1
2、在血液中检测谷胱甘肽
向离心管中按比例加入0.15 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL三种人体血清样品，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例9
1、合成方法参照实施例1
2、在酒中检测谷胱甘肽
向离心管中按比例加入0.15 mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL酒（白酒、啤酒、葡萄酒），加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
实施例10
此外将本发明的检测方法与其他方法进行对比，具体内容如下所示：
结论：
（1）本发明采用的检测方法成本低，时间短。
（2）本发明采用的检测方法实用性很强，可以检测生物体液和酒中的谷胱甘肽。
（3）本发明采用的检测方法检出限低，检测范围大，具有更广阔的应用前景。
Claims (4)
1.一种采用磷光量子点Mn:ZnS检测溶液中谷胱甘肽的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）Mn掺杂ZnS量子点母液的配制：称量0.0040 g Mn掺杂ZnS量子点，容于40 mL水中；
（2）0.1 mol/L，25 ºC Tris-HCl缓冲液的配制：
称取1.2114 g Tris和0.0576 g NaCl，溶于50 mL水中；用盐酸调节溶液的pH值至7.4后，用高纯水把它定容在100 mL容量瓶中，低温保存；
（3）谷胱甘肽溶液的配制：
称取0.0049 g谷胱甘肽，把它溶于4 mL水中配成浓度为4 mM的GSH溶液；将4 mM的GSH溶液分别稀释5倍、10倍、50倍和100倍，配成800 μΜ、400 μΜ、80 μΜ和40 μΜ的溶液；
（4）KMnO4溶液的配制
称取0.0025 g高锰酸钾，溶于4 mL水中，配成浓度为4 mM的KMnO4溶液；将4 mM的KMnO4溶液分别稀释5倍、10倍、50倍和100倍，配成800 μΜ、400 μΜ、80 μΜ和40 μΜ的溶液；
（5）用磷光量子点检测谷胱甘肽
①向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度0.3 μΜ-280 μΜ的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测；
②向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中分别加入不同浓度1 μΜ-40 μΜ的高锰酸钾溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测；
③向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入不同浓度0.3 μΜ-280 μΜ的谷胱甘肽溶液，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
2.权利要求1所述采用磷光量子点Mn:ZnS检测溶液中谷胱甘肽的方法在检测生物体液和酒中的应用。
3.权利要求2所述应用，其检测方法如下：
(1)向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL两种尿液样品，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测；
(2)向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL三种血清样品，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测；
（3）向离心管中按比例加入0.01mL-0.17mL磷光量子点母液、1 mL Tris-HCl缓冲溶液，向混合溶液中加入20 μΜ KMnO4，静置10分钟，待磷光量子点被充分氧化后，向该溶液中分别加入1 mL酒，加水定容至10 mL，静置10分钟后用荧光分光光度计分别进行磷光检测。
4.权利要求3所述应用，其中的酒为：白酒、啤酒或葡萄酒。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20170728 Termination date: 20180508 |