DD245491A1

DD245491A1 - Phasenempfindlicher fluoreszenzdetektor fuer die kurzzeitspektroskopie

Info

Publication number: DD245491A1
Application number: DD28573485A
Authority: DD
Inventors: Klaus Berndt
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-12-30
Filing date: 1985-12-30
Publication date: 1987-05-06

Abstract

Ziel der Erfindung ist es, unverfaelschte phasenempfindliche Fluoreszenzmessungen mit hoher Nachweisempfindlichkeit an Proben mit Fluoreszenzlebensdauern im Picosekundenbereich durchfuehren zu koennen. Die Aufgabe besteht darin, einen Fluoreszenzdetektor anzugeben, in dem unter Verwendung hochempfindlicher Photodetektoren Modulationsfrequenzen bis in den Gigahertzbereich verarbeitet werden koennen, und wellenlaengenabhaengige Lichtlaufzeiten im Monochromator keinen Einfluss auf das Messergebnis haben. Die Probe wird mit einer periodisch intensitaetsmodulierten Lichtquelle angeregt. Zum Fluoreszenznachweis dient ein hochempfindlicher Photodetektor mit nachgeschaltetem Lock-in-Verstaerker. Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes ist ein Intensitaetsmodulator angeordnet, der sinusfoermig mit der Modulationsfrequenz der Anregungslichtquelle angesteuert wird, wobei zusaetzlich eine Tastung der Modulationsspannung erfolgt. Der mit der Tastung synchronisierte Lock-in-Verstaerker misst den zeitlich gemittelten Fluoreszenz-Photostrom in Abhaengigkeit von der Phasenlage der Intensitaetsmodulation bezueglich der Anregungsmodulation. Da der Monochromator des Fluoreszenzdetektors im Strahlengang hinter dem Intensitaetsmodulator angeordnet ist, wirken sich wellenlaengenabhaengige Lichtlaufzeiten nicht aus. Der Fluoreszenzdetektor dient zum lebensdauer-selektiven Fluoreszenznachweis, zur Fluoreszenzsignal-Unterdrueckung in der Ramanspektroskopie sowie zur Bestimmung von Fluoreszenzlebensdauern. Figur

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der zeitaufgelösten Fluoreszenzspektroskopie im Picosekunden- und Nanosekundenbereich sowie auf das Gebiet der Ramanspektroskopie. Die Anwendung ist in phasenempfindlichen Fluoreszenzspektrometern und Ramanspektrometern möglich und zweckmäßig.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

In der biologischen, medizinischen und photochemischen Forschung gewinnt die Fluoreszenzspektroskopie zunehmend an Bedeutung. Häufig stammt die Fluoreszenzstrahlung von mehreren emittierenden Komponenten, deren Einzelspektren sich vollständig oder teilweise überlappen. Die Spektren der einzelnen Komponenten können durch Anwendung der phasenempfindlichen Fluoreszenzspektroskopie gewonnen werden. Bei dieser Methode wird die fluoreszierende Probe durch eine sinusförmig intensitätsmodulierte Lichtquelle bestrahlt. Jede Komponente erzeugt eine sinusförmig modulierte Emission, die gegenüber der Anregungsstrahlung um einen Winkel Gi phasenverschoben ist. Der Phasenwinkel Θ-, hängt eng mit der Fluoreszenzlebensdauer τ, der entsprechenden Komponente zusammen. Die Fluoreszenzstrahlung wird mittels eines phasenempfindlichen Photodetektors gemessen. In diesem Fall ist das partielle Ausgangssignal der i-ten Komponente proportional zu cos(Gd-G,), wobei Gd den Detektor-Phasenwinkel bedeutet. Durch Wahl von Gd gemäß G_d = Gi ± π/2 kann das Signal der i-ten Komponente vollständig unterdrück! werden. In der Regel unterscheiden sich die Komponenten hinsichtlich ihrer Fluoreszenzlebensdauer. Daher ist es möglich, nacheinander das Signal jeder an der Gesamtstrahlung beteiligten Komponente zu unterdrücken und aus den so erhaltenen Teilspektren der Einzelspektren der Komponenten zu ermitteln. Moderne phasenempfindliche Spektralfluorometer arbeiten auf der Basis von Photomultipliern (Mattheis, J. R. u. a., New Directions in Molecular Luminescence, D. Eastwood, Ed., ASTM, STP 822,50, [1983]). Die anwendbaren Modulationsfrequenzen sind daher auf den Bereich 1... 160 MHz beschränkt. Es ist jedoch bekannt, daß zur Auflösung der Spektren von Komponenten mit Subnanosekunden-Fluoreszenzlebensdauern Modulationsfrequenzen im Bereich 100... 1 000MHz vorteilhaft sind. Daher wurden bereits Avalanche-Photodioden anstelle von Photomultipliern in der phasenempfindlichen Fluoreszenzspektroskopie eingesetzt (Berndt, K., Optics Comm. 56, 30 [1985]). Dieser Lösung haftet der Nachteil an, daß in Avalanche-Photodioden die nutzbare Verstärkung um ca. 4 Größenordnungen unter der von Photomultipliern liegt. Die Nachweisempfindlichkeit ist daher erheblich schlechter, was sich im Falle schwacher Fluoreszenzstrahlung ungünstig auswirkt.

Bei allen bekannten Lösungen befindet sich darüber hinaus der zur spektralen Auflösung erforderliche Monochromator im Strahlengang vor dem photoelektrischen Phasenanalysator. Die bekannte Wellenlängenabhängigkeit der Laufzeit des Lichtes innerhalb des Monochromators führt daher zu Verfälschungen der Einzelspektren für Proben mit Picosekunden-Fluoreszenzlebensdauem.

Ziel der Erfindung '

Ziel der Erfindung ist es, unverfälschte phasenempfindliche Fluoreszenzmessungen mit hoher Nachweisempfindlichkeit an Proben mit Fluoreszenzlebensdauern im Picosekundenbereich durchführen zu können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektor anzugeben, in dem unter Verwendung hochempfindlicher Photodetektoren Modulationsfr.equenzen bjs in den Gigahertzbereich· verarbeitet werden, und wellenlängenabhängige Lichtlaufzeiten im Monochromator keinen Einfluß auf das Meßergebnis haben. Die Aufgabe wird gelöst durch eine Detektor-Anordnung mit einer im Strahlengang der Anregungslichtquelle befindlichen fluoreszierenden Probe, deren Fluoreszenzlicht auf einen Monochromator mit dahinter angeordnetem hochempfindlichen Photodetektor gelangt, sowie mit einem im Strahlengang der Anregungslichtquelle vor der fluoreszierenden Probe befindlichen Strahlteiler zur Ablenkung eines Anteils der Strahlung auf einen Hilfsphotodetektor mit nachgeschalteter variabler elektrischer Verzögerungseinheit, und die erfindungsgemäß in nachfolgend beschriebener Weise ausgebildet ist. Die Anregungslichtquelle weist eine beliebige periodische Intensitätsmodulation auf. Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe sind nacheinander eine erste Linse, eine Lochblende, eine zweite Linse, ein drehbarer Intensitätsmodulator sowie eine dritte Linse vor dem Monochromator angeordnet. Der Signalausgang des hochempfindlichen Photodetektors ist mit dem Signaleingang eines Lock-in-Verstärkers verbunden, an dessen Ausgang der Y-Kanal eines XY-Recorders angeschlossen ist. Der Signalausgang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit ist über einen elektronischen Schalter zu einem frequenzselektiven Verstärker geführt, dessen Ausgang mit dem Intensitätsmodulator verbunden ist, wobei außerdem eine Gleichspannungsquelle an den Intensitätsmodulator angeschlossen ist. Der elektronische Schalter besitzt einen Referenzausgang, der zum Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers geführt ist. Die variable elektrische Verzögerungseinheit verfügt über einen separaten Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung, der über einen Umschalter zum X-Kanal des XY-Recorders geführt ist. Der Monochromator besitzt ebenfalls einen separaten elektrischen Ausgang mit einer zur Wellenlänge proportionalen Gleichspannung, der an denselben Umschalter angeschlossen ist. Mögliche Ausführungsformen der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß entweder die Anregungslichtquelle eine sinusförmige Intensitätsmodulation aufweist, oder daß als periodisch intensitätsmodulierte Anregungslichtquelle ein modensynchronisierter cw-Laser vorhanden ist. Es ist auch möglich, daß im Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem Hiffsphotodetektor eine variable optische Verzögerungseinheit angeordnet ist, die über einen separaten elektrischen Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung verfügt, der zum Umschalter geführt ist. In diesem Fall kann die elektrische Verzögerungseinheit entfallen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem Hilfsphotodetektor ein Chopper angeordnet ist, dessen Referenzausgang mit dem Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers verbunden ist. Hier kann der elektronische Schalter entfallen. Enthält die Anregungslichtquelle einen optischen Modulator, so kann ein separater Ausgang am Signalgenerator dieses Modulators zum Eingang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit geführt werden. In diesem Fall sind der Strahlteiler und der Hilfsphotodetektor nicht erforderlich.

Im Betrieb erzeugt jede Komponente der fluoreszierenden Probe bei sinusförmig modulierter Anregungsstrahlung ein Fluoreszenzlicht, das ebenfalls sinusförmig moduliert und um den Phasenwinkel Θ-, verzögert ist. Ist F₀ die mittlere Fluoreszenzintensität und nrif der Modulationsgrad, so ergibt sich für die zeitabhängige Fluoreszenzintensität

F(t) = F₀[I + m,cosM - Θι)]. (1)

Die zeitabhängige Transmission des Intensitätsmodulators ist für nicht zu große Modulationsgrade m, gegeben durch T(t) = T₀ [1 + m, cos(wt - e_d)]. (2)

In (2) bedeuten F₀ die mittlere Transmission und Gd den Phasenwinkel der Modulationsspannung. Mittels des hochempfindlichen Photodetektors wird der zeitlich gemittelte Wert der Fluoreszensintensität am Ausgang des Monochromators registriert, für den sich der Ausdruck

I = IrAJ/ Rt)T(t) dt (3)

ergibt. Die Größe r ist die Empfindlichkeit des Photodetektors und t_m = 2 π/οι die Periodendauer der Modulation. Berücksichtigt man, daß der Look-in-Verstärker die Stromdifferenz ΔΙ zwischen den Zuständen „Modulation EIN " bzw. „Modulation AUS" mißt, so erhält man aus (3) mit (1) und (2)

ΔΙ = (1/2) rF₀T₀m_fm, COS(Q-Gd). " (4)

Durch Wahl vs>n 0_d = Q-, ± π/2 kann somit das Signal der Komponente, deren Fluoreszenszstrahlung die Phasenverschiebung Θ; aufweist, vollkommen unterdrückt werden. Verbindet man den separaten elektrischen Ausgang des Monochromators über den Umschalter mit dem XY-Recorder, so ist es möglich, Teilspektren zu registrieren und daraus die Einzelspektren der Komponenten der floureszierenden Probe zu gewinnen.

Intensitätsmodulatoren können bis zu Frequenzen im Gigahertzbereich betrieben werden. Dadurch ist die Trennung fluoreszierender Komponenten mit Fluoreszenzlebensdauern im Picosekundengebiet möglich. Da mit dem Photodetektor nur zeitliche Mittelwerte der Fluoreszenzintensität gemessen werden, können beispielsweise Photomultiplier verwendet werden. Die Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Fluoreszenzdetektors ist aus diesem Grunde sehr hoch. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß sich der Monochromator hinter dem Phasenanalysator befindet. Auf diese Weise wirken sich wellenlängenabhängige Laufzeiten innerhalb des Monochromators nicht auf die Meßergebnisse aus.

In der Ramanspektroskopie besteht häufig das Problem, unerwünschte Fluoreszenzsignale zu unterdrücken. Für diese Aufgabe kann der erfindungsgemäße Fluoreszenzdetektor vorteilhaft eingesetzt werden. Dies gilt insbesondere für Fluoreszenszstrahlung mit einer Lebensdauer im Picosekundenbereich, da in diesem Fall die bekannten Methoden versagen. Durch geeignete Wahl von Qd ist eine vollständige Unterdrückung des störenden Fluoreszenzsignals möglich, während die durch ©Raman = 0 charakterisierte Ramanstrahlung mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden kann. Infolge der hohen Modulationsfrequenzen ist dabei ein großer Phasenwinkelunterschied zwischen der Fluoreszenzstrahlung und der Ramanstrahlung erreichbar, was eine gute Selektivität gewährleistet.

Verbindet man den separaten Ausgang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit über den Umschalter mit dem XY-Recorder, so können mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzdetektor auch phasen- bzw. modulationsgradfluorometrische Messungen durchgeführt werden. In diesem Fall registriert man das Ausgangssignal (4) in Abhängigkeit vom Phasenwinkel ©_d während des Durchstimmens der Verzögerungseinheit. Auf diese Weise ist die Bestimmung von Fluoreszenzlebensdauern möglich.

Bisher wurde angenommen, daß die Anregungslichtquelle eine sinusförmige Intensitätsmodulation aufweist. Dient ein modensynchronisierter cw-Laser zu Anregung der Probe, so kann der frequenzselektive Verstärker auf die Folgefrequenz der Laserimpulse oder auf ganzzahlige Vielfache dieser Frequenz abgestimmt werden. Auch in dieser Variante der Erfindung entsteht ein zeitlich gemittelter Photostrom entsprechend dem Ausdruck (4) am Ausgang des Look-in-Verstärkers. Durch Abstimmen des frequenzselektiven Verstärkers auf unterschiedliche Vielfache der Impulsfolgefrequenz ist eine optimale Anpassung des phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektors an konkrete Meßbedingungen möglich. Entsprechendes gilt für Anregungslichtquellen mit beliebiger, aber periodischer Intensitätsmodulation.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. In der zugehörigen Zeichnung ist das Schema des phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektors dargestellt.

Als Anregungslichtquelle ist ein modensynchronisierter cw-Laser L vorhanden, in dessen Strahlengang sich die fluoreszierende Probe P befindet. Das Fluoreszenzlicht der Probe P wird mittels einer Linse L1 auf die Lochblende.B abgebildet, hinter der sich eine Linse L2, ein drehbarer Intensitätsmodulator MOD, eine Linse L3 sowie der Monochromator MON befinden. Am Ausgang des Monochromators MON ist als hochempfindlicher Photodetektor PM zweckmäßigerweise ein Photomultiplier angeordnet, dessen Signalausgang zu einem Lock-in-Verstärker Ll geführt ist. Der Ausgang des Lock-in-Verstärkers Ll ist mit dem Y-Kanal eines XY-Recorders XY verbunden. Der Monochromator MON verfügt über einen separaten elektrischen Ausgang mit einer zur eingestellten Wellenlänge proportionalen Gleichspannung, der über den Umschalter S mit dem X-Kanal des XY-Recorders XY verbunden ist.

Im Strahlengang des modensynchronisierten cw-Lasers L ist vor der Probe P ein Strahlteiler T zur Ablenkung eines Anteils der Strahlung auf den Hilfsphotodetektor PD mit nachgeschalteter variabler elektrischer Verzögerungseinheit EV angeordnet. Die Verzögerungseinheit EV besitzt einen separaten Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung, der mit dem Umschalter S verbunden ist. Der Signalausgang der Verzögerungseinheit EV ist über einen elektronischen Schalter ES zu einem frequenzselektiven Verstärker SV geführt, dessen Ausgang mit dem Intensitätsmodulator MOD verbunden ist, wobei außerdem eine Gleichspannungsquelle GS an den Intensitätsmodulator MOD angeschlossen ist. Der elektronische Schalter ES besitzt einen Referenzausgang, der zum Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers Ll geführt ist.

Hat der modensynchronisierte cw-Laser eine Resonatorlänge von 100cm, so beträgt die Impulsfolgefrequenz 150MHz. Stimmt man den selektiven Verstärker auf die zehnte Oberwelle ab, dann ergibt sich als Modulationsfrequenz 1 500MHz. Dieser Wert ist optimal für phasenfluorometrische Messungen von Fluoreszenzlebensdauern in der Größenordnung von 100ps. Beträgt beispielsweise der Primärstrom im Photomultiplier 10 ¹⁴A, dann ergibt sich für das Signal-Rausch-Verhältnis ein Wert von 1,8 · 10²bei 1 Hz Bandbreite. Der genannte Photostrom entspricht bei einem Quantenwirkungsgrad der Photokatode von 10% ca. 4,2 -10 ³am Photomultiplier absorbierten Fluoreszenszphotonen pro Laserimpuls. Durch Drehen des Intensitätsmodulators können unterschiedlich polarisierte Fluoreszenzkomponenten selektiert werden. Dadurch ist auch die Bestimmung extrem kurzer Orientierungrelaxationszeiten möglich.

Bei 1 500MHz Modulationsfrequenz beträgt der Phasenwinkel Θ einer fluoreszierenden Komponente mit 100 ps Lebensdauer 43,3". Eine zweite Komponente mit 119ps Lebensdauer würde einen um 5° größeren Phasenwinkel aufweisen. Die Phasenwinkeldifferenz von 5" reicht aus, um eine effektive lebensdauer-selektive Fluoreszenzregistrierung durchzuführen. Nimmt man zum Vergleich eine übliche Modulationsfrequenz von 100MHz an, dann erhält man eine wesentlich geringere Differenz von ca. 0,6°. Diese reicht für einen selektiven Fluoreszenznachweis nicht aus.

Die mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzdetektor erzielbaren Modulationsfrequenzen ermöglichen auch in der Ramanspektroskopie eine effektive Fluoreszenzsignal-Unterdrückung.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Phasenempfindlicher Fluoreszenzdetektor für die Kurzzeitspektroskopie mit einer im Strahlengang der Anregungslichtqüelle befindlichen fluoreszierenden Probe, deren Fluoreszenzlicht auf einen Monochromator mit dahinter angeordnetem hochempfindlichem Photodetektor gelangt, sowie mit einem im Strahlengang der Anregungslichtquelle vor der fluoreszierenden Probe befindlichen Strahlteiler zur Ablenkung eines Anteils der Strahlung auf einen Hilfsphotodetektor mit nachgeschalteter variabler elektrischer Verzögerungseinheit, gekennzeichnet dadurch, daß die Anregungslichtquelle eine beliebige periodische Intensitätsmodulation aufweist, daß im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe vor dem Monochromator nacheinander eine erste Linse, eine Lochblende, eine zweite Linse, ein drehbarer Intensitätsmodulator sowie eine dritte Linse angeordnet sind, daß der.Signalausgang des hochempfindlichen Photodetektors mit dem Signaleihgang eines Lock-in-Verstärkers verbunden ist, an dessen Ausgang der Y-Kanal des XY-Recorders angeschlossen ist, und der Signalausgang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit über einen elektronischen Schalter zu einem frequenzselektiven Verstärker geführt ist, dessen Ausgang mit dem Intensitätsmodulator verbunden ist, wobei außerdem eine Gleichspannungsquelle an den Intensitätsmodulator angeschlossen ist, daß der elektronische Schalter einen Referenzausgang besitzt, der zum Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers geführt ist, und die variable elektrische Verzögerungseinheit über einen separaten Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung verfügt, der über einen Umschalter zum X-Kanal des XY-Recorders geführt ist, sowie der Monochromator ebenfalls einen separaten elektrischen Ausgang mit einer zur eingestellten Wellenlänge proportionalen Gleichspannung besitzt, der an denselben Umschalter angeschlossen ist.
2. Fluoreszenzdetektor nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Anregungslichtquelle eine sinusförmige Intensitätsmodulation aufweist.
3. Fluoreszenzdetektor nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Anregungslichtquelle mit periodischer Intensitätsmodulation ein modensynchronisierter cw-Laser vorhanden ist.
4. Fluoreszenzdetektor nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß zwischen'dem Strahlteilerund dem Hilfsphotodetektor eine variable optische Verzögerungseinheit angeordnet ist, die über einen separaten Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung verfügt, der zum Umschalter geführt ist.
5. Fluoreszenzdetektor nach Punkt 1, 2, 3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß im Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem Hilfsphotodetektor ein Chopper angeordnet ist, dessen Referenzausgang mit dem Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers verbunden ist.
6. Fluoreszenzdetektor nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß bei Vorhandensein einer Anregungslichtquelle mit optischem Modulator der Signalgenerator dieses Modulators über einen separaten Ausgang verfügt, der an den Eingang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit geführt ist.

Hierzu 1 Seite Zeichnung '