DD245491A1 - PHASE-SENSITIVE FLUORESCENT DETECTOR FOR SHORT-TERM SPECTROSCOPY - Google Patents
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Abstract
Ziel der Erfindung ist es, unverfaelschte phasenempfindliche Fluoreszenzmessungen mit hoher Nachweisempfindlichkeit an Proben mit Fluoreszenzlebensdauern im Picosekundenbereich durchfuehren zu koennen. Die Aufgabe besteht darin, einen Fluoreszenzdetektor anzugeben, in dem unter Verwendung hochempfindlicher Photodetektoren Modulationsfrequenzen bis in den Gigahertzbereich verarbeitet werden koennen, und wellenlaengenabhaengige Lichtlaufzeiten im Monochromator keinen Einfluss auf das Messergebnis haben. Die Probe wird mit einer periodisch intensitaetsmodulierten Lichtquelle angeregt. Zum Fluoreszenznachweis dient ein hochempfindlicher Photodetektor mit nachgeschaltetem Lock-in-Verstaerker. Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes ist ein Intensitaetsmodulator angeordnet, der sinusfoermig mit der Modulationsfrequenz der Anregungslichtquelle angesteuert wird, wobei zusaetzlich eine Tastung der Modulationsspannung erfolgt. Der mit der Tastung synchronisierte Lock-in-Verstaerker misst den zeitlich gemittelten Fluoreszenz-Photostrom in Abhaengigkeit von der Phasenlage der Intensitaetsmodulation bezueglich der Anregungsmodulation. Da der Monochromator des Fluoreszenzdetektors im Strahlengang hinter dem Intensitaetsmodulator angeordnet ist, wirken sich wellenlaengenabhaengige Lichtlaufzeiten nicht aus. Der Fluoreszenzdetektor dient zum lebensdauer-selektiven Fluoreszenznachweis, zur Fluoreszenzsignal-Unterdrueckung in der Ramanspektroskopie sowie zur Bestimmung von Fluoreszenzlebensdauern. FigurThe aim of the invention is to be able to carry out unaltered phase-sensitive fluorescence measurements with high detection sensitivity on samples having fluorescence lifetimes in the picosecond range. The object is to provide a fluorescence detector in which modulation frequencies can be processed down to the gigahertz range using highly sensitive photodetectors, and wavelength-dependent light propagation times in the monochromator have no influence on the measurement result. The sample is excited with a periodically intensity modulated light source. For fluorescence detection, a highly sensitive photodetector with a downstream lock-in amplifier is used. In the beam path of the fluorescent light intensity modulator is arranged, which is sinusoidally driven with the modulation frequency of the excitation light source, wherein additionally a keying of the modulation voltage. The keying synchronized lock-in amplifier measures the time-averaged fluorescence photocurrent as a function of the phase position of the intensity modulation with respect to the excitation modulation. Since the monochromator of the fluorescence detector is arranged in the beam path behind the intensity modulator, wave length-dependent light propagation times do not have any effect. The fluorescence detector is used for life-time-selective fluorescence detection, for fluorescence signal suppression in Raman spectroscopy as well as for the determination of fluorescence lifetimes. figure
Description
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der zeitaufgelösten Fluoreszenzspektroskopie im Picosekunden- und Nanosekundenbereich sowie auf das Gebiet der Ramanspektroskopie. Die Anwendung ist in phasenempfindlichen Fluoreszenzspektrometern und Ramanspektrometern möglich und zweckmäßig.The invention relates to the field of time-resolved fluorescence spectroscopy in the picosecond and nanosecond range as well as to the field of Raman spectroscopy. The application is possible and expedient in phase-sensitive fluorescence spectrometers and Raman spectrometers.
In der biologischen, medizinischen und photochemischen Forschung gewinnt die Fluoreszenzspektroskopie zunehmend an Bedeutung. Häufig stammt die Fluoreszenzstrahlung von mehreren emittierenden Komponenten, deren Einzelspektren sich vollständig oder teilweise überlappen. Die Spektren der einzelnen Komponenten können durch Anwendung der phasenempfindlichen Fluoreszenzspektroskopie gewonnen werden. Bei dieser Methode wird die fluoreszierende Probe durch eine sinusförmig intensitätsmodulierte Lichtquelle bestrahlt. Jede Komponente erzeugt eine sinusförmig modulierte Emission, die gegenüber der Anregungsstrahlung um einen Winkel Gi phasenverschoben ist. Der Phasenwinkel Θ-, hängt eng mit der Fluoreszenzlebensdauer τ, der entsprechenden Komponente zusammen. Die Fluoreszenzstrahlung wird mittels eines phasenempfindlichen Photodetektors gemessen. In diesem Fall ist das partielle Ausgangssignal der i-ten Komponente proportional zu cos(Gd-G,), wobei Gd den Detektor-Phasenwinkel bedeutet. Durch Wahl von Gd gemäß Gd = Gi ± π/2 kann das Signal der i-ten Komponente vollständig unterdrück! werden. In der Regel unterscheiden sich die Komponenten hinsichtlich ihrer Fluoreszenzlebensdauer. Daher ist es möglich, nacheinander das Signal jeder an der Gesamtstrahlung beteiligten Komponente zu unterdrücken und aus den so erhaltenen Teilspektren der Einzelspektren der Komponenten zu ermitteln. Moderne phasenempfindliche Spektralfluorometer arbeiten auf der Basis von Photomultipliern (Mattheis, J. R. u. a., New Directions in Molecular Luminescence, D. Eastwood, Ed., ASTM, STP 822,50, [1983]). Die anwendbaren Modulationsfrequenzen sind daher auf den Bereich 1... 160 MHz beschränkt. Es ist jedoch bekannt, daß zur Auflösung der Spektren von Komponenten mit Subnanosekunden-Fluoreszenzlebensdauern Modulationsfrequenzen im Bereich 100... 1 000MHz vorteilhaft sind. Daher wurden bereits Avalanche-Photodioden anstelle von Photomultipliern in der phasenempfindlichen Fluoreszenzspektroskopie eingesetzt (Berndt, K., Optics Comm. 56, 30 [1985]). Dieser Lösung haftet der Nachteil an, daß in Avalanche-Photodioden die nutzbare Verstärkung um ca. 4 Größenordnungen unter der von Photomultipliern liegt. Die Nachweisempfindlichkeit ist daher erheblich schlechter, was sich im Falle schwacher Fluoreszenzstrahlung ungünstig auswirkt.Fluorescence spectroscopy is becoming increasingly important in biological, medical and photochemical research. Frequently, the fluorescence radiation originates from several emitting components whose individual spectra completely or partially overlap. The spectra of the individual components can be obtained by using phase-sensitive fluorescence spectroscopy. In this method, the fluorescent sample is irradiated by a sinusoidal intensity-modulated light source. Each component generates a sinusoidally modulated emission, which is phase shifted with respect to the excitation radiation by an angle Gi. The phase angle Θ-, is closely related to the fluorescence lifetime τ, the corresponding component. The fluorescence radiation is measured by means of a phase-sensitive photodetector. In this case, the partial output of the i-th component is proportional to cos (Gd-G,), where Gd is the detector phase angle. By selecting Gd according to G d = Gi ± π / 2, the signal of the ith component can be completely suppressed! become. In general, the components differ in terms of their fluorescence lifetime. Therefore, it is possible to successively suppress the signal of each component involved in the total radiation and to determine from the thus obtained partial spectra of the individual spectra of the components. Modern phase-sensitive spectrofluorometers operate on the basis of photomultipliers (Mattheis, JR et al., New Directions in Molecular Luminescence, D. Eastwood, Ed., ASTM, STP 822.50, [1983]). The applicable modulation frequencies are therefore limited to the range 1 ... 160 MHz. However, it is known that to resolve the spectra of components with subnanosecond fluorescence lifetimes modulation frequencies in the range 100 ... 1000 MHz are advantageous. Therefore, avalanche photodiodes have been used instead of photomultipliers in phase-sensitive fluorescence spectroscopy (Berndt, K., Optics Comm. 56, 30 [1985]). This solution has the disadvantage that in avalanche photodiodes the usable gain is about 4 orders of magnitude below that of photomultipliers. The detection sensitivity is therefore considerably worse, which has an unfavorable effect in the case of weak fluorescence radiation.
Bei allen bekannten Lösungen befindet sich darüber hinaus der zur spektralen Auflösung erforderliche Monochromator im Strahlengang vor dem photoelektrischen Phasenanalysator. Die bekannte Wellenlängenabhängigkeit der Laufzeit des Lichtes innerhalb des Monochromators führt daher zu Verfälschungen der Einzelspektren für Proben mit Picosekunden-Fluoreszenzlebensdauem.In all known solutions is also required for spectral resolution monochromator in the beam path in front of the photoelectric phase analyzer. The known wavelength dependence of the transit time of the light within the monochromator therefore leads to distortions of the individual spectra for samples with picosecond fluorescence lifetime.
Ziel der Erfindung 'Object of the invention
Ziel der Erfindung ist es, unverfälschte phasenempfindliche Fluoreszenzmessungen mit hoher Nachweisempfindlichkeit an Proben mit Fluoreszenzlebensdauern im Picosekundenbereich durchführen zu können.The aim of the invention is to be able to carry out unaltered phase-sensitive fluorescence measurements with high detection sensitivity on samples with fluorescence lifetimes in the picosecond range.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektor anzugeben, in dem unter Verwendung hochempfindlicher Photodetektoren Modulationsfr.equenzen bjs in den Gigahertzbereich· verarbeitet werden, und wellenlängenabhängige Lichtlaufzeiten im Monochromator keinen Einfluß auf das Meßergebnis haben. Die Aufgabe wird gelöst durch eine Detektor-Anordnung mit einer im Strahlengang der Anregungslichtquelle befindlichen fluoreszierenden Probe, deren Fluoreszenzlicht auf einen Monochromator mit dahinter angeordnetem hochempfindlichen Photodetektor gelangt, sowie mit einem im Strahlengang der Anregungslichtquelle vor der fluoreszierenden Probe befindlichen Strahlteiler zur Ablenkung eines Anteils der Strahlung auf einen Hilfsphotodetektor mit nachgeschalteter variabler elektrischer Verzögerungseinheit, und die erfindungsgemäß in nachfolgend beschriebener Weise ausgebildet ist. Die Anregungslichtquelle weist eine beliebige periodische Intensitätsmodulation auf. Im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe sind nacheinander eine erste Linse, eine Lochblende, eine zweite Linse, ein drehbarer Intensitätsmodulator sowie eine dritte Linse vor dem Monochromator angeordnet. Der Signalausgang des hochempfindlichen Photodetektors ist mit dem Signaleingang eines Lock-in-Verstärkers verbunden, an dessen Ausgang der Y-Kanal eines XY-Recorders angeschlossen ist. Der Signalausgang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit ist über einen elektronischen Schalter zu einem frequenzselektiven Verstärker geführt, dessen Ausgang mit dem Intensitätsmodulator verbunden ist, wobei außerdem eine Gleichspannungsquelle an den Intensitätsmodulator angeschlossen ist. Der elektronische Schalter besitzt einen Referenzausgang, der zum Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers geführt ist. Die variable elektrische Verzögerungseinheit verfügt über einen separaten Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung, der über einen Umschalter zum X-Kanal des XY-Recorders geführt ist. Der Monochromator besitzt ebenfalls einen separaten elektrischen Ausgang mit einer zur Wellenlänge proportionalen Gleichspannung, der an denselben Umschalter angeschlossen ist. Mögliche Ausführungsformen der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß entweder die Anregungslichtquelle eine sinusförmige Intensitätsmodulation aufweist, oder daß als periodisch intensitätsmodulierte Anregungslichtquelle ein modensynchronisierter cw-Laser vorhanden ist. Es ist auch möglich, daß im Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem Hiffsphotodetektor eine variable optische Verzögerungseinheit angeordnet ist, die über einen separaten elektrischen Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung verfügt, der zum Umschalter geführt ist. In diesem Fall kann die elektrische Verzögerungseinheit entfallen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem Hilfsphotodetektor ein Chopper angeordnet ist, dessen Referenzausgang mit dem Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers verbunden ist. Hier kann der elektronische Schalter entfallen. Enthält die Anregungslichtquelle einen optischen Modulator, so kann ein separater Ausgang am Signalgenerator dieses Modulators zum Eingang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit geführt werden. In diesem Fall sind der Strahlteiler und der Hilfsphotodetektor nicht erforderlich.The object of the invention is to specify a phase-sensitive fluorescence detector in which modulation frequencies bjs in the gigahertz range are processed using high-sensitivity photodetectors, and wavelength-dependent light propagation times in the monochromator have no influence on the measurement result. The object is achieved by a detector arrangement with a fluorescent sample located in the beam path of the excitation light source, the fluorescent light of which reaches a monochromator with a high-sensitivity photodetector arranged behind it, and with a beam splitter located in front of the fluorescent sample in the beam path of the excitation light source for deflecting a portion of the radiation to an auxiliary photodetector with a downstream variable electrical delay unit, and which is formed according to the invention in the manner described below. The excitation light source has any periodic intensity modulation. In the beam path of the fluorescent light of the sample, a first lens, a pinhole, a second lens, a rotatable intensity modulator and a third lens are arranged in succession in front of the monochromator. The signal output of the high-sensitivity photodetector is connected to the signal input of a lock-in amplifier, at the output of which the Y channel of an XY recorder is connected. The signal output of the variable electrical delay unit is fed via an electronic switch to a frequency-selective amplifier whose output is connected to the intensity modulator, wherein in addition a DC voltage source is connected to the intensity modulator. The electronic switch has a reference output, which is routed to the reference input of the lock-in amplifier. The variable electrical delay unit has a separate output with a DC proportional to the delay, which is guided via a switch to the X channel of the XY recorder. The monochromator also has a separate electrical output with a DC proportional to the wavelength, which is connected to the same switch. Possible embodiments of the invention are characterized in that either the excitation light source has a sinusoidal intensity modulation, or that a mode-synchronized cw laser is present as the periodically intensity-modulated excitation light source. It is also possible that in the beam path between the beam splitter and the Hiffsphotodetektor a variable optical delay unit is arranged, which has a separate electrical output with a DC proportional to the delay, which is guided to the switch. In this case, the electrical delay unit can be omitted. A further embodiment of the invention is characterized in that a chopper is arranged in the beam path between the beam splitter and the auxiliary photodetector, whose reference output is connected to the reference input of the lock-in amplifier. Here, the electronic switch can be omitted. If the excitation light source contains an optical modulator, then a separate output on the signal generator of this modulator can be led to the input of the variable electrical delay unit. In this case, the beam splitter and the auxiliary photodetector are not required.
Im Betrieb erzeugt jede Komponente der fluoreszierenden Probe bei sinusförmig modulierter Anregungsstrahlung ein Fluoreszenzlicht, das ebenfalls sinusförmig moduliert und um den Phasenwinkel Θ-, verzögert ist. Ist F0 die mittlere Fluoreszenzintensität und nrif der Modulationsgrad, so ergibt sich für die zeitabhängige FluoreszenzintensitätDuring operation, each component of the fluorescent sample generates fluorescence light with sinusoidally modulated excitation radiation, which is likewise modulated sinusoidally and delayed by the phase angle Θ- . If F 0 is the mean fluorescence intensity and nrif is the degree of modulation, then the time-dependent fluorescence intensity results
F(t) = F0[I + m,cosM - Θι)]. (1)F (t) = F 0 [I + m, cosM - ιι]]. (1)
Die zeitabhängige Transmission des Intensitätsmodulators ist für nicht zu große Modulationsgrade m, gegeben durch T(t) = T0 [1 + m, cos(wt - ed)]. (2)The time-dependent transmission of the intensity modulator is for modulations not too large m, given by T (t) = T 0 [1 + m, cos (wt - e d )]. (2)
In (2) bedeuten F0 die mittlere Transmission und Gd den Phasenwinkel der Modulationsspannung. Mittels des hochempfindlichen Photodetektors wird der zeitlich gemittelte Wert der Fluoreszensintensität am Ausgang des Monochromators registriert, für den sich der AusdruckIn (2), F 0 is the average transmission and Gd is the phase angle of the modulation voltage. By means of the highly sensitive photodetector, the time-averaged value of the fluorescence intensity is registered at the output of the monochromator, for which the expression
I = IrAJ/ Rt)T(t) dt (3)I = IrAJ / Rt) T (t) dt (3)
ergibt. Die Größe r ist die Empfindlichkeit des Photodetektors und tm = 2 π/οι die Periodendauer der Modulation. Berücksichtigt man, daß der Look-in-Verstärker die Stromdifferenz ΔΙ zwischen den Zuständen „Modulation EIN " bzw. „Modulation AUS" mißt, so erhält man aus (3) mit (1) und (2)results. The quantity r is the sensitivity of the photodetector and t m = 2 π / οι the period of the modulation. Considering that the look-in amplifier measures the current difference ΔΙ between the states "modulation ON" and "modulation OFF", one obtains from (3) with (1) and (2)
ΔΙ = (1/2) rF0T0mfm, COS(Q-Gd). " (4)ΔΙ = (1/2) rF 0 → 0 m f m, COS (Q-Gd). "(4)
Durch Wahl vs>n 0d = Q-, ± π/2 kann somit das Signal der Komponente, deren Fluoreszenszstrahlung die Phasenverschiebung Θ; aufweist, vollkommen unterdrückt werden. Verbindet man den separaten elektrischen Ausgang des Monochromators über den Umschalter mit dem XY-Recorder, so ist es möglich, Teilspektren zu registrieren und daraus die Einzelspektren der Komponenten der floureszierenden Probe zu gewinnen.By choosing vs> n 0 d = Q-, ± π / 2 , the signal of the component whose fluorescence radiation is the phase shift Θ; has to be completely suppressed. By connecting the separate electrical output of the monochromator via the switch with the XY recorder, it is possible to register partial spectra and to obtain the individual spectra of the components of the fluorescent sample.
Intensitätsmodulatoren können bis zu Frequenzen im Gigahertzbereich betrieben werden. Dadurch ist die Trennung fluoreszierender Komponenten mit Fluoreszenzlebensdauern im Picosekundengebiet möglich. Da mit dem Photodetektor nur zeitliche Mittelwerte der Fluoreszenzintensität gemessen werden, können beispielsweise Photomultiplier verwendet werden. Die Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Fluoreszenzdetektors ist aus diesem Grunde sehr hoch. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß sich der Monochromator hinter dem Phasenanalysator befindet. Auf diese Weise wirken sich wellenlängenabhängige Laufzeiten innerhalb des Monochromators nicht auf die Meßergebnisse aus.Intensity modulators can be operated up to frequencies in the gigahertz range. This makes it possible to separate fluorescent components with fluorescence lifetimes in the picosecond range. Since only temporal mean values of the fluorescence intensity are measured with the photodetector, photomultipliers can be used, for example. The detection sensitivity of the fluorescence detector according to the invention is very high for this reason. Another advantage is that the monochromator is behind the phase analyzer. In this way, wavelength-dependent propagation times within the monochromator do not affect the measurement results.
In der Ramanspektroskopie besteht häufig das Problem, unerwünschte Fluoreszenzsignale zu unterdrücken. Für diese Aufgabe kann der erfindungsgemäße Fluoreszenzdetektor vorteilhaft eingesetzt werden. Dies gilt insbesondere für Fluoreszenszstrahlung mit einer Lebensdauer im Picosekundenbereich, da in diesem Fall die bekannten Methoden versagen. Durch geeignete Wahl von Qd ist eine vollständige Unterdrückung des störenden Fluoreszenzsignals möglich, während die durch ©Raman = 0 charakterisierte Ramanstrahlung mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden kann. Infolge der hohen Modulationsfrequenzen ist dabei ein großer Phasenwinkelunterschied zwischen der Fluoreszenzstrahlung und der Ramanstrahlung erreichbar, was eine gute Selektivität gewährleistet.In Raman spectroscopy, there is often the problem of suppressing unwanted fluorescence signals. For this task, the fluorescence detector according to the invention can be used advantageously. This is especially true for fluorescence radiation with a lifetime in the picosecond range, since in this case the known methods fail. By suitable choice of Qd, complete suppression of the interfering fluorescence signal is possible, while the Raman radiation characterized by © Raman = 0 can be measured with high sensitivity. Due to the high modulation frequencies, a large phase angle difference between the fluorescence radiation and the Raman radiation can be achieved, which ensures good selectivity.
Verbindet man den separaten Ausgang der variablen elektrischen Verzögerungseinheit über den Umschalter mit dem XY-Recorder, so können mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzdetektor auch phasen- bzw. modulationsgradfluorometrische Messungen durchgeführt werden. In diesem Fall registriert man das Ausgangssignal (4) in Abhängigkeit vom Phasenwinkel ©d während des Durchstimmens der Verzögerungseinheit. Auf diese Weise ist die Bestimmung von Fluoreszenzlebensdauern möglich.If the separate output of the variable electrical delay unit is connected to the XY recorder via the changeover switch, it is also possible to carry out phase or modulation degree fluorometric measurements with the fluorescence detector according to the invention. In this case, the output signal (4) is registered as a function of the phase angle δ d during the tuning of the delay unit. In this way, the determination of fluorescence lifetimes is possible.
Bisher wurde angenommen, daß die Anregungslichtquelle eine sinusförmige Intensitätsmodulation aufweist. Dient ein modensynchronisierter cw-Laser zu Anregung der Probe, so kann der frequenzselektive Verstärker auf die Folgefrequenz der Laserimpulse oder auf ganzzahlige Vielfache dieser Frequenz abgestimmt werden. Auch in dieser Variante der Erfindung entsteht ein zeitlich gemittelter Photostrom entsprechend dem Ausdruck (4) am Ausgang des Look-in-Verstärkers. Durch Abstimmen des frequenzselektiven Verstärkers auf unterschiedliche Vielfache der Impulsfolgefrequenz ist eine optimale Anpassung des phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektors an konkrete Meßbedingungen möglich. Entsprechendes gilt für Anregungslichtquellen mit beliebiger, aber periodischer Intensitätsmodulation.So far it has been assumed that the excitation light source has a sinusoidal intensity modulation. If a mode-synchronized cw laser is used to excite the sample, then the frequency-selective amplifier can be tuned to the repetition frequency of the laser pulses or to integer multiples of this frequency. Also in this variant of the invention, a time-averaged photocurrent corresponding to the expression (4) arises at the output of the look-in amplifier. By tuning the frequency-selective amplifier to different multiples of the pulse repetition frequency, an optimal adaptation of the phase-sensitive fluorescence detector to concrete measurement conditions is possible. The same applies to excitation light sources with arbitrary, but periodic intensity modulation.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. In der zugehörigen Zeichnung ist das Schema des phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektors dargestellt.The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment. In the accompanying drawing, the scheme of the phase-sensitive fluorescence detector is shown.
Als Anregungslichtquelle ist ein modensynchronisierter cw-Laser L vorhanden, in dessen Strahlengang sich die fluoreszierende Probe P befindet. Das Fluoreszenzlicht der Probe P wird mittels einer Linse L1 auf die Lochblende.B abgebildet, hinter der sich eine Linse L2, ein drehbarer Intensitätsmodulator MOD, eine Linse L3 sowie der Monochromator MON befinden. Am Ausgang des Monochromators MON ist als hochempfindlicher Photodetektor PM zweckmäßigerweise ein Photomultiplier angeordnet, dessen Signalausgang zu einem Lock-in-Verstärker Ll geführt ist. Der Ausgang des Lock-in-Verstärkers Ll ist mit dem Y-Kanal eines XY-Recorders XY verbunden. Der Monochromator MON verfügt über einen separaten elektrischen Ausgang mit einer zur eingestellten Wellenlänge proportionalen Gleichspannung, der über den Umschalter S mit dem X-Kanal des XY-Recorders XY verbunden ist.The excitation light source is a mode-synchronized cw laser L, in the beam path of which the fluorescent sample P is located. The fluorescent light of the sample P is imaged by means of a lens L1 on the Lochblende.B behind which a lens L2, a rotatable intensity modulator MOD, a lens L3 and the monochromator MON are. At the output of the monochromator MON is expediently arranged as a highly sensitive photodetector PM, a photomultiplier whose signal output is guided to a lock-in amplifier Ll. The output of the lock-in amplifier Ll is connected to the Y channel of an XY recorder XY. The monochromator MON has a separate electrical output with a DC voltage proportional to the set wavelength, which is connected via the switch S to the X channel of the XY recorder XY.
Im Strahlengang des modensynchronisierten cw-Lasers L ist vor der Probe P ein Strahlteiler T zur Ablenkung eines Anteils der Strahlung auf den Hilfsphotodetektor PD mit nachgeschalteter variabler elektrischer Verzögerungseinheit EV angeordnet. Die Verzögerungseinheit EV besitzt einen separaten Ausgang mit einer zur Verzögerung proportionalen Gleichspannung, der mit dem Umschalter S verbunden ist. Der Signalausgang der Verzögerungseinheit EV ist über einen elektronischen Schalter ES zu einem frequenzselektiven Verstärker SV geführt, dessen Ausgang mit dem Intensitätsmodulator MOD verbunden ist, wobei außerdem eine Gleichspannungsquelle GS an den Intensitätsmodulator MOD angeschlossen ist. Der elektronische Schalter ES besitzt einen Referenzausgang, der zum Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers Ll geführt ist.In the beam path of the mode-synchronized cw laser L, a beam splitter T for deflecting a portion of the radiation onto the auxiliary photodetector PD with a downstream variable electrical delay unit EV is arranged in front of the sample P. The delay unit EV has a separate output with a DC proportional to the delay, which is connected to the switch S. The signal output of the delay unit EV is fed via an electronic switch ES to a frequency-selective amplifier SV whose output is connected to the intensity modulator MOD, wherein also a DC voltage source GS is connected to the intensity modulator MOD. The electronic switch ES has a reference output, which is led to the reference input of the lock-in amplifier Ll.
Hat der modensynchronisierte cw-Laser eine Resonatorlänge von 100cm, so beträgt die Impulsfolgefrequenz 150MHz. Stimmt man den selektiven Verstärker auf die zehnte Oberwelle ab, dann ergibt sich als Modulationsfrequenz 1 500MHz. Dieser Wert ist optimal für phasenfluorometrische Messungen von Fluoreszenzlebensdauern in der Größenordnung von 100ps. Beträgt beispielsweise der Primärstrom im Photomultiplier 10 14A, dann ergibt sich für das Signal-Rausch-Verhältnis ein Wert von 1,8 · 102bei 1 Hz Bandbreite. Der genannte Photostrom entspricht bei einem Quantenwirkungsgrad der Photokatode von 10% ca. 4,2 -10 3am Photomultiplier absorbierten Fluoreszenszphotonen pro Laserimpuls. Durch Drehen des Intensitätsmodulators können unterschiedlich polarisierte Fluoreszenzkomponenten selektiert werden. Dadurch ist auch die Bestimmung extrem kurzer Orientierungrelaxationszeiten möglich.If the mode-locked cw laser has a resonator length of 100 cm, the pulse repetition frequency is 150 MHz. If the selective amplifier is tuned to the tenth harmonic, then the modulation frequency is 1 500 MHz. This value is optimal for phase fluorometric measurements of fluorescence lifetimes on the order of 100 ps. For example, if the primary current in the photomultiplier 10 14 A, then there is a value of 1.8 · 10 2 at 1 Hz bandwidth for the signal-to-noise ratio. The said photocurrent corresponds to a quantum efficiency of the photocathode of 10% about 4.2 -10 3 absorbed on the photomultiplier fluorescence photons per laser pulse. By rotating the intensity modulator differently polarized fluorescence components can be selected. As a result, the determination of extremely short orientation relaxation times is possible.
Bei 1 500MHz Modulationsfrequenz beträgt der Phasenwinkel Θ einer fluoreszierenden Komponente mit 100 ps Lebensdauer 43,3". Eine zweite Komponente mit 119ps Lebensdauer würde einen um 5° größeren Phasenwinkel aufweisen. Die Phasenwinkeldifferenz von 5" reicht aus, um eine effektive lebensdauer-selektive Fluoreszenzregistrierung durchzuführen. Nimmt man zum Vergleich eine übliche Modulationsfrequenz von 100MHz an, dann erhält man eine wesentlich geringere Differenz von ca. 0,6°. Diese reicht für einen selektiven Fluoreszenznachweis nicht aus.At 1 500MHz modulation frequency, the phase angle Θ of a 100ps lifetime fluorescent component is 43.3 ", a second 119ps lifetime component would have a 5 ° larger phase angle, and the 5" phase angle difference is sufficient to provide efficient lifetime-selective fluorescence registration perform. Assuming a standard modulation frequency of 100MHz for comparison, then you get a much smaller difference of about 0.6 °. This is not sufficient for a selective fluorescence detection.
Die mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzdetektor erzielbaren Modulationsfrequenzen ermöglichen auch in der Ramanspektroskopie eine effektive Fluoreszenzsignal-Unterdrückung.The modulation frequencies which can be achieved with the fluorescence detector according to the invention also enable effective fluorescence signal suppression in Raman spectroscopy.
Claims (6)
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DD28573485A DD245491A1 (en) | 1985-12-30 | 1985-12-30 | PHASE-SENSITIVE FLUORESCENT DETECTOR FOR SHORT-TERM SPECTROSCOPY |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DD28573485A DD245491A1 (en) | 1985-12-30 | 1985-12-30 | PHASE-SENSITIVE FLUORESCENT DETECTOR FOR SHORT-TERM SPECTROSCOPY |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD245491A1 true DD245491A1 (en) | 1987-05-06 |
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ID=5575509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD28573485A DD245491A1 (en) | 1985-12-30 | 1985-12-30 | PHASE-SENSITIVE FLUORESCENT DETECTOR FOR SHORT-TERM SPECTROSCOPY |
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| DD (1) | DD245491A1 (en) |
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1985
- 1985-12-30 DD DD28573485A patent/DD245491A1/en not_active IP Right Cessation
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