DE19709377A1 - Verfahren zur Messung von lumineszierenden Substanzen mittels UV-Licht emittierender Leuchtdioden - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Messung der Abkling­ zeit von lumineszierenden Substanzen mittels zeitlich modulierter Anregung.

Die Abklingzeiten lumineszierender Substanzen variieren über mehr als 12 Größen­ ordnungen: von mehr als 10 Sekunden bei phosphoreszierenden Substanzen bis zu Pikosekunden (ps) bei fluoreszierenden Verbindungen. Je nach Abklingzeit werden verschiedene Meßverfahren eingesetzt, die sich generell in Verfahren mit gepulster Anregung und in Modulationsverfahren einteilen lassen.

Bei gepulster Anregung wird die Probe durch einen Lichtblitz einer bestimmten Wellenlänge angeregt. Nachdem der Anregungspuls abgeklungen ist, kann dann das Abklingen der Lumineszenz beobachtet werden. Zur Messung von langen Abkling­ zeiten, d. h. von ca. 10 µs bis einige Sekunden, werden meist Xe-Blitzlampen benutzt. Diese Lampen haben eine FWHM (Full-Width-Half-Maximum, entspricht der Breite der Intensitätskurve, bei der die Intensität auf die Hälfte des Maximums abgesunken ist) von ca. 2 µs, jedoch ein Nachleuchten von über 20 µs.

In diesem Zeitbereich wird normalerweise die Pulsform der abklingenden Lumines­ zenz abgetastet und mit einer oder mehreren Exponentialfunktionen angenähert. Die Abklingzeit bzw. die Abklingzeiten ergeben sich dann direkt aus den Parametern der Exponentialfunktionen (Zeitkonstante, Amplitude).

Mittlere Abklingzeiten, d. h. von ca. 1 µs bis 10 µs, sind mit Xe-Blitzlampen wegen des starken Nachleuchtens nicht gut zu messen. Hier wird meist mit Verfahren gear­ beitet, die für kürzere Abklingzeiten besser geeignet sind.

Für kurze Abklingzeiten unterhalb von 1 µs ist in erster Linie das "time-correlated single photon counting" zu nennen. Dabei wird die Probe mit einem sehr kurzen (ns bis ps) und schwachen Lichtpuls beleuchtet. Dieser Puls startet einen Zeit-zu-Ampli­ tuden Konverter. Das erste Fluoreszenzphoton, das nachgewiesen wird, stoppt den Konverter, dessen Wert dann ausgelesen wird. Bei diesem Verfahren muß darauf geachtet werden, daß nicht mehrere Photonen in einem Meßintervall nachgewiesen werden, da hierdurch die Genauigkeit der Zeitmessung beeinträchtigt wird. Am einfachsten ist dies durch eine Reduktion der Anregungsintensität zu erzielen, wobei dann bei weniger als 5% der Anregungspulse ein Fluoreszenzphoton nachgewiesen wird.

Die aufgezeichnete Abklingkurve wird gegebenenfalls mit dem Anregungspuls ent­ faltet. Dann werden, wie oben schon erwähnt, eine oder mehrere Exponentialfunk­ tionen zur Annäherung an die Abklingkurve benutzt, deren Parameter dann die Abklingzeiten liefern.

Als Lichtquellen werden für das "time-correlated single photon counting" meistens Nanosekunden-Blitzlampen mit einer FWHM von weniger als 2,5 ns eingesetzt. Diese Lampen können allerdings höchstens mit 10 kHz Wiederholfrequenz betrieben werden, was der begrenzende Faktor für die Schnelligkeit der Messung ist. Wegen der hohen Betriebsspannungen von einigen kV und der hohen Pulsraten sind sorg­ fältige Abschirmmaßnahmen notwendig, um das Einkoppeln von Störungen in die empfindliche Nachweiselektronik zu vermeiden.

Laser werden ebenfalls als Lichtquellen eingesetzt, wenn schwach lumineszierende Proben eine höhere Anregungsintensität verlangen. Mode-lockes Laser haben eine Wiederholfrequenz von vielen MHz, was für die meisten Fälle zu hoch ist. Um zu Wiederholraten von 20 kHz bis zu 1 MHz zu kommen, werden einzelne Pulse mittels Pockelszellen isoliert. Auch hierbei sind sorgfältige Abschirmungen gegen Störungen erforderlich. Die Verwendung von Lasern als Lichtquelle ist darüber hinaus eine sehr teure und, je nach Anregungswellenlänge, platzaufwendige Lösung.

Im Gegensatz zu den Verfahren mit gepulster Anregung arbeitet das Modulations­ verfahren mit einer kontinuierlichen Anregung, die aber sinusförmig amplituden­ moduliert wird. Die Abklingzeit wird aus der Phasenverschiebung zwischen Anre­ gungs- und Fluoreszenzlicht bestimmt.

Aus S. Nakamura, T. Mukai, M. Senoh, Jpn. J. Appl. Phys. 35, L74 1996, S. Nakamura, Jpn. J. Appl. Phys. 35, L74 1996, p 217 und G. Fasol, Science vol. 272, 1996 sind Leuchtdioden (LEDs) und Laser-Dioden (LDs) auf Basis von GaN Mate­ rial, welche im Bereich von 370 nm bis 550 emittieren (je nach Indiumdotierung), bekannt. Insbesondere ist daraus die Herstellung von GaN Leuchtdioden mit guter Lichtausbeute bekannt.

Die Halbwertsbreite der Emissionsbande dieser LED's ist kleiner als 20 nm, sie hat jedoch einen Ausläufer in die langwellige Region (s. Fig. 2). Die Emission dieser LEDs ist durch den Strom elektrisch modulierbar. Da die Betriebsspannungen im Bereich von 2,5 V bis ca. 10 V liegen, genügen hierzu Standardbausteine. Die Abklingzeit der Emission wird durch die elektrische Zeitkonstante des Systems bestimmt und kann bei geeigneter Beschaltung in den ns-Bereich gedrückt werden.

Das einfachste Modulationsverfahren für die Emission der LEDs ist der Betrieb mit Rechteckpulsen von geeigneter Pulsbreite, Pulshöhe und Wiederholfrequenz. Eine Modulation mit anderen Pulsformen, wie z. B. Sinuswellen, ist ebenfalls möglich.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbessertes Verfahren zum Nachweis und zur Messung der Abklingzeit von lumineszierenden Substanzen zu schaffen.

Die Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, daß zur Anregung der lumineszie­ renden Substanzen eine UV-Licht emittierende Diode vorgesehen ist.

Im Gegensatz zu den oben vorgestellten Lösungen bietet eine Abklingzeitmessung mit UV-LEDs als Anregungsquelle die Möglichkeit, mit einer Lichtquelle den gesamten Zeitbereich von Sekunden bis zu Nanosekunden abzudecken, da die LED sich in weiten Frequenzbereichen elektrisch modulieren läßt. Bei geeigneter Beschal­ tung können sowohl Pulse mit einer Breite im Nanosekundenbereich (ns) mit Wie­ derholfrequenzen von mehreren MHz als auch Pulse im µs-Bereich mit Wiederhol­ frequenzen von kHz erzeugt werden. Außerdem ist generell auch eine sinusförmige Modulation der Diodenemission möglich.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird anhand von Zeichnungen nachfolgend beschrieben und erläutert. Dabei zeigen

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Anordnung zur Messung von Abklingzeiten und

Fig. 2 den qualitativen spektralen Verlauf der Intensität des emittierten Lichtes einer GaN-Leuchtdiode.

Ein universelles System zur Messung von Abklingzeiten mit UV-LEDs ist in Fig. 1 gezeigt. Eine UV-LED wird über einen Pulsgenerator mit variabler Frequenz und Pulsbreite angesteuert. Das Licht wird bei geringen Ansprüchen an die spektrale Reinheit mit einem einfachen Cut-Off Filter gefiltert, um die längerwelligen Anteile des Spektrums abzutrennen, und auf die Probe fokussiert. Wenn eine hohe spektrale Reinheit gefordert ist, kann der Filter durch einen Monochromator ersetzt werden. Durch Wechsel der LEDs kann der gesamte Wellenlängenbereich von 360 nm bis 1000 nm abgedeckt werden.

Das Lumineszenzlicht wird über eine Optik auf einen Filter oder einen Monochro­ mator abgebildet und in einem Detektor (Photomultiplier oder Photodiode) in elek­ trische Signale umgewandelt. Um den gesamten Bereich der Abklingzeiten abzu­ decken, sind zwei verschiedene Meßverfahren vorgesehen: die Pulsformabtastung für längere und das "time-correlated single photon counting" mit Zeit-zu-Amplitu­ den Konverter für kürzere Abklingzeiten.

Die Umschaltung zwischen beiden Verfahren kann unter Kontrolle eines Rechners erfolgen. Im Gegensatz zu den oben erwähnten Lichtquellen (Xe-Blitzlampen, Nanosekunden-Blitzlampen und Lasern) bietet die gepulste Anregung durch UV-emittierende Leuchtdioden eine Reihe von wichtigen Vorteilen:

• - im Vergleich zu Blitzlampen ist die Intensität der Emission wesentlich stabiler. Bei Verfahren, die direkt die Abklingkurve messen, sind daher weniger Einzelmessungen erforderlich, um eine bestimmte Genauigkeit zu erzielen.
• - Beim "time-correlated single photon counting" sind problemlos Pulswieder­ holfrequenzen von bis zu einigen MHz möglich. Dadurch kann entweder die Meßdauer herabgesetzt oder die Empfindlichkeit erhöht werden, und zwar im Vergleich zu Nanosekunden-Blitzlampen um eine bis zwei Größenordnungen.
• - Da LEDs mit Spannungen von wenigen Volt betrieben werden, entstehen kaum elektromagnetische Störungen, wodurch aufwendige Abschirmmaßnah­ men entfallen. Insbesondere für die weniger komplexe Pulsformabtastung sind daher auch tragbare Geräte zur Vor-Ort-Analyse von Substanzen möglich.

In der Fig. 2 ist der qualitative Verlauf des Emisssionsspektrums einer Leuchtdiode auf GaN-Basis dargestellt. Dabei ist die relative Intensität ohne Einheiten über der Wellenlänge in 10^-10m (Å) aufgetragen. Die Leuchtdiode wurde dabei mit 50 mA betrieben. Das Maximum der Intensität liegt bei einer Wellenlänge von etwa 370 nm. Der spektrale Intensitätsverlauf weist zu größeren Wellenlängen hin eine breitere Ausdehnung auf.

Die kurzwellige Grenze der Emission von UV-Licht emittierenden Leuchtdioden aus GaN Material ist durch die Bandlücke des GaN bei ca. 370 nm gegeben. Die Emission dieser Leuchtdioden ist sehr leicht modulierbar, wodurch sich völlig neue Möglichkeiten zur Messung der Abklingzeit von fluoreszierenden Substanzen erge­ ben. Daher ermöglichen die oben beschriebenen Eigenschaften von UV-LEDs als Anregungslichtquellen mehrere Arten von neuen Meßgeräten:

• - Ein universelles Gerät zur Messung von Abklingzeiten, wie bereits oben beschrieben.
• - Ein empfindliches Nachweisgerät für fluoreszierende Substanzen mittels Lock-In-Technik, wobei die LED mit Sinus- oder Rechtecksignalen moduliert werden kann. Hierbei wird keine Abklingzeitmessung durchgeführt.
• - Ein empfindliches Nachweisgerät für lumineszierende Substanzen mittels Zeitfenstern, wobei der Nachweis der Fluoreszenz nur in einem Zeitfenster erfolgt, das verzögert auf den Anregungspuls folgt. Diese Technik ist beson­ ders angezeigt, wenn in der Probe Substanzen mit mehreren Abklingzeiten vorhanden sind, wobei die nachzuweisenden Substanzen die längsten Ab­ klingzeiten haben. Dazu gehört beispielsweise der Nachweis von Seltenerd-Komplexen mit Abklingzeiten von einigen hundert µs bis zu einigen ms in Anwesenheit von anderen fluoreszierenden Verbindungen. Dies ist bei der Fluoreszenz-Immunoassay-Analyse nach E.F. Gudgin Dickson et.al., J. Photochem. Photobiol. B: Biology 27, 1995, 3-19 von großer Bedeutung, da in-situ neben der Lanthanoid-markierten Verbindung eine Vielzahl von weiteren biologischen Materialien eine z. T. recht intensive, aber kurzlebige Fluoreszenz zeigen können.

Wegen des sehr geringen Aufwandes zum Betrieb der LEDs besteht die Möglich­ keit, insbesondere die Nachweisgeräte für lumineszierende Substanzen, aber auch Meßgeräte für Abklingzeiten, so zu verkleinern, daß sie tragbar werden. Damit lassen sich auch komplexere Analysen außerhalb des Labors durchführen. Kleine, tragbare Abklingzeit-Spektrometer eröffnen völlig neue Analyse-Anwendungen, z. B. im medizinischen Bereich, in der Kriminologie, Umweltanalytik etc.

Claims (1)

1. Verfahren zum Nachweis und zur Messung der Abklingzeit von lumineszierenden Substanzen mittels zeitlich modulierter Anregung, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anregung der lumineszierenden Substanzen eine UV-Licht emittierende Diode vorgesehen ist.