JP4507067B2 - ジアルコキシフェノール2量体の製造方法 - Google Patents
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「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)」、1992年、第267巻、第33号、p.23688−23695
しかし、マンガンペルオキシダーゼを用いた反応系において、フェノール類2量体で反応を停止させる手段は見出されておらず、フェノール類2量体の合成へのマンガンペルオキシダーゼの適用は、従来行われていなかった。
すなわち、本発明のジアルコキシフェノール2量体の製造方法は、水性媒質中で、炭素数1〜4のアルコキシ基を有するジアルコキシフェノールと、マンガンペルオキシダーゼと、過酸化水素と、二価のマンガンイオンとを反応させてジアルコキシキノン2量体を含む第一生成物を得る第一工程と、前記第一工程に引き続いて該第一生成物に還元剤を添加する第二工程とを有し、前記第二工程を、0℃以上25℃以下で行うことを特徴とする
前記第一工程において、前記水性媒質中に有機酸を含有させることが好ましい。
前記第一工程において、反応が開始したときの前記水性媒質中でのマンガンペルオキシダーゼ濃度を5nmol/L以上、ジアルコキシフェノール濃度を0.2mmol/L以下とすることが好ましい。
前記ジアルコキシフェノールは、2,6‐ジアルコキシフェノールであることが好ましい。
前記アルコキシ基は、メトキシ基であることが好ましい。
さらに酵素濃度および基質濃度を制御することで、高収率をもってジアルコキシフェノール2量体を提供することができる。
第一工程は、例えば、マンガンペルオキシダーゼと、ジアルコキシフェノールと、マンガンの酸化数が+2であるマンガン化合物とを、水性媒質中に溶解あるいは分散させた反応液を調製し、該反応液に酸化剤を添加することで開始することができる。なお、マンガンペルオキシダーゼ、ジアルコキシフェノール等を有機溶媒に溶解させた溶液を、水性媒質中に分散させてもよい。この場合、後述の水性媒質における有機溶媒含有率が10%以下であればよい。
pH緩衝液としては、例えば、マロン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、等が挙げられる。
水性媒質が水と有機溶媒の混合溶液である場合、有機溶媒の割合は10%以下、好ましくは5%以下である。ここで、利用しうる有機溶媒の代表的な例としては、ヘキサン、トリクロロメタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メタノール、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(THF)、ギ酸ジメチルホルムアミドメチル、アセトン、n−プロパノール、イソプロパノール、t−ブチルアルコール等が挙げられる。
特に、pH緩衝液として酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等を用いる場合は、上記の好ましい有機酸を用いることが望ましい。
ジアルコキシフェノールのアルコキシ基を構成するアルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。このような炭素数1〜4のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、n−ブチル基、tert−ブチル基が挙げられるが、メチル基であることが好ましい。式(1)におけるR1とR2は、同じでも異なっていてもよい。
また、2,6−ジアルコキシフェノールの中でも、下式(2)に示す2,6−ジメトキシフェノールが特に好ましく用いられる。これは、得られるジアルコキシフェノール2量体の実用性という点で有利なためである。
マンガンペルオキシダーゼの中でも、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)」、1992年、第267巻、第33号の「MATERIALS AND METHODS」の項に記載されている、担子菌であるファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)の培養菌床から単離精製されたマンガンペルオキシダーゼが、ジアルコキシフェノールから後述のジアルコキシキノン2量体を生成する反応の反応触媒活性が高いため好ましい。
さらには、基質濃度を0.05mmol/L以下とし、かつ酵素濃度を5nmol/L以上とすることで、99%超という非常に高い収率でジアルコキシフェノール2量体を得ることができる。
酸化剤の配合量は適宜調整されうる。例えば酸化剤として過酸化水素を用いる場合、上記反応液に添加された際の過酸化水素終濃度を10 mmol/L以下とすることが好ましく、特にマンガンペルオキシダーゼの安定性を考慮して、0.01〜0.1 mmol/Lとすることが特に好ましい。
例えば、ジアルコキシフェノールとして2,6−ジアルコキシフェノールを用いた場合、第一工程によって、下式(I)に示すように、2,6−ジアルコキシフェノール(A)から2,6−ジアルコキシキノン2量体(2,2’,6,6’−テトラアルコキシキノン)(B)が生成する反応が起こり、2,6−ジアルコキシキノン2量体(B)を含む第一生成物が得られる。
ジアルコキシキノン2量体を含む第一生成物に、還元剤を添加することで、ジアルコキシキノン2量体が還元されてジアルコキシフェノール2量体が生成する反応が開始される。例えば、上記反応式(I)に示す2,6‐ジアルコキシキノン2量体(B)が還元されて、2,6‐ジアルコキシフェノール2量体(C)が生成する。
この第二工程を行うことで、ジアルコキシフェノール2量体を含む第二生成物が得られる。
還元剤の添加量は、第一生成物中のジアルコキシキノン2量体濃度の当量であることが好ましい。
(反応率)[%]=(第一生成物中のジアルコキシキノン2量体モル濃度)/[(1/2)×(前記基質濃度)]×100 ・・・(III)
(第一生成物中のジアルコキシキノン2量体モル濃度)[mol/L]=(当該ジアルコキシキノン2量体の最大吸収波長におけるモル吸光係数)×I0 ・・・(IV)
ジアルコキシキノン2量体の最大吸収波長は、用いるジアルコキシフェノールの種類に応じて決定される。例えば、ジアルコキシフェノールとして2,6‐ジメトキシフェノールを用いる場合、2,6‐ジメトキシキノン2量体の最大吸収波長である波長469nmで、吸光度を経時的に測定すればよい。
(収率)[%]=(第二生成物中のジアルコキシフェノール2量体モル濃度)/[(1/2)×(前記基質濃度)]×100 ・・・(V)
第二生成物中のジアルコキシフェノール2量体モル濃度は、高速液体クロマトグラフィーあるいはガスクロマトグラフィーを用いる方法で評価することができる。
なお、本発明の製造方法を用いれば、ジアルコキシキノン2量体からジアルコキシフェノール2量体への反応確率はほぼ100%となるので、上記反応率と収率とはほぼ同一の値となる。
また、マンガンペルオキシダーゼを用いること、及び第一工程に引き続き還元剤の添加を行うことにより、製造工程全体を通して反応時間を短時間とし、低温で、また酵素の使用量を低減しつつ、充分な収率を達成することができる。
その他pH等の反応条件は、マンガンペルオキシダーゼの種類等に応じて適宜調整されうるが、好ましくはpH2.5〜6.5、特に好ましくはpH4.0〜5.0とすることが好ましい。
本発明において、第一工程の反応時間は、マンガンペルオキシダーゼ、ジアルコキシフェノール、Mn2+、及び酸化剤を水性媒質中で共存させた時点、例えば上記反応液に酸化剤を添加した時点から、還元剤が添加される時点までとなる。ここで、第一工程の反応時間は、ジアルコキシフェノールが充分に消費される時間とすることが好ましい。ジアルコキシフェノールの消費は、例えば、第一生成物を一部採取して高速液体クロマトグラフィーに供し、検出波長を270nm付近としてジアルコキシフェノールの残存量を測定することによって確認可能である。
第一工程の好適な反応時間は、酵素濃度と基質濃度等により異なり得るが、例えば基質濃度0.05mmol/L、酵素濃度10nmol/Lの場合、好ましくは50秒〜250秒、さらに好ましくは100秒〜200秒である。
なお、反応率は上記式(III)より求められることから、反応率が最大に達する時点は、第一生成物の波長470 nm付近の経時測定における極大吸収点として確認することができる。
これに対し、本発明の製造方法では、前記第一工程の後、還元剤を添加する第二工程を行うことで、ジアルコキシキノン2量体からジアルコキシフェノール2量体の生成反応を安定に進行させることができる。
第二工程の反応温度は、還元反応を安定に進めるためには0℃以上とすることが好ましい。製造効率、副生物の生成抑制の面では反応温度が低い方が好ましく、25℃以下とすることが好ましい。また、反応温度は室温であってもよい。
本発明において、第二工程の反応時間は、還元剤の添加時点を起点とする。
第二工程の反応時間は、好ましくは30秒以下、さらに好ましくは5〜10秒である。
第二工程において、pH等のその他反応条件は、マンガンペルオキシダーゼの種類等に応じて適宜調整されうるが、pH2.5〜6.5、特に好ましくはpH4.0〜5.0とすることが好ましい。
本発明の製造方法により得られるジアルコキシフェノール2量体は、上記の第二生成物中に高含有率で含まれる形態で得られる。したがって、本発明の方法により得られるジアルコキシフェノール2量体を各種用途に使用する場合、第二生成物をそのまま用いてもよいし、あるいは公知の方法でジアルコキシフェノール2量体を精製して使用してもよい。
以下実施例、比較例においては、ジアルコキシフェノールとして2,6‐ジメトキシフェノール(和光純薬社製「2,6‐ジメトキシフェノール」)を用い、マンガン化合物として硫酸マンガン(MnSO4:和光純薬社製「硫酸マンガン」)を用いた。また、以下、還元剤として亜ジチオン酸ナトリウム(和光純薬社製「ハイドロサルファイトナトリウム」)を用いた。
マンガンペルオキシダーゼとしては、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)の培養菌床から得られたマンガンペルオキシダーゼを用いた。このマンガンペルオキシダーゼの調製方法は以下の通りとした。
白色腐朽菌ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)ATCC34541を、Kirk液体培地(組成を表1に示す。)で37℃にて培養した。培養は2 L 三角フラスコ中で上記した培地1 Lにて培養し、37℃で3日間培養後、100 %酸素をパージし、その後毎日一回酸素パージを行った。所定時間培養した後、培養液を吸引濾過して培養濾液を得、得られた培養濾液を粗酵素溶液とした。 粗酵素溶液のpHを7.2に調整後、pH7.2のリン酸緩衝液にて膨潤後カラムに充填されたDEAE Sepharose(DEAE−セファロース)にチャージした。カラム中に充填されたDEAE Sepharose に吸着されたマンガンペルオキシダーゼを、pH 6.0のリン酸緩衝液にて流出させ、回収した。
まず、ガラスセル中で、50 mM、 pH 4.5 のマロン酸バッファ(Malonate Buffer)に、マンガンペルオキシダーゼおよび2,6‐ジメトキシフェノールを、それぞれ終濃度が表2に示す各濃度となるように添加して、反応液を調製した。さらに、硫酸マンガンを終濃度0.5 mMとなるように添加した。
さらに、酸化剤として過酸化水素を、終濃度0.1 mMとなるように添加し、温度25℃の条件で保持し、経時的に吸光度を測定した。
吸光度測定条件:2,6−ジメトキシキノン2量体(2,2’,6,6’−テトラメトキシキノン)の最大吸収波長(469nm)における吸光度を、日立社製吸光光度計「HITACHI U‐3000 spectrophotometer」を用いて測定した。
吸光度の最大が確認された、過酸化水素の添加から5分後に、還元剤を添加した。温度 25℃の条件に制御して30秒経過後、生成物を回収した。
反応率:吸光度が最大値I1となる時を反応率最大とし、この時点におけるジアルコキシキノン2量体のモル濃度C1を下式より求めた。
C1[mol/L]=46.9 mM−1cm−1×I1×100
このC1を用いて、下式により算出した反応率を表2に示す。
(反応率)[%]=C1/[(1/2)×(基質濃度)]×100
収率:なお、収率は、反応率とほぼ同一の値を示すことが確認された。また、この時の反応液を液体クロマトグラフィーで分析し、基質(2,6−ジメトキシフェノール)の残存およびキノン単量体の生成がないこと、MALDI‐TOF‐MSによる分析にて、オリゴマーの生成がないことを確認した。
酵素として、マンガンペルオキシダーゼに代わりCoprinus cinereusperoxidase(CIP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、リグニンペルオキシダーゼ(LiP)(VA(ベラトリルアルコール)有)、LiP(VA無)を用い、各酵素の濃度(表中「酵素濃度」と示す)、基質濃度を表3〜6に示す値とし、実施例と同様に行った。反応率の値(単位%)を表3〜6に示す。
一方、反応温度、反応時間を実施例と同様にし、マンガンペルオキシダーゼ以外の酵素を用いた各比較例では、基質濃度、酵素濃度が同条件の実施例と比べて、ジアルコキシキノン2量体への反応率が小さかった。したがって比較例では、ジアルコキシフェノール2量体を穏やかな反応条件で安定して得ることはできないことが示された。
Claims (5)
- 水性媒質中で、炭素数1〜4のアルコキシ基を有するジアルコキシフェノールと、マンガンペルオキシダーゼと、過酸化水素と、二価のマンガンイオンとを反応させてジアルコキシキノン2量体を含む第一生成物を得る第一工程と、
前記第一工程に引き続いて該第一生成物に還元剤を添加する第二工程とを有し、
前記第二工程を、0℃以上25℃以下で行うことを特徴とするジアルコキシフェノール2量体の製造方法。 - 前記第一工程において、前記水性媒質中に有機酸を含有させる請求項1記載のジアルコキシフェノール2量体の製造方法。
- 前記第一工程において、反応が開始したときの前記水性媒質中でのマンガンペルオキシダーゼ濃度を5nmol/L以上、ジアルコキシフェノール濃度を0.2mmol/L以下とする請求項1または2に記載のジアルコキシフェノール2量体の製造方法。
- 前記ジアルコキシフェノールは、2,6−ジアルコキシフェノールである請求項1ないし3のいずれかに記載のジアルコキシフェノール2量体の製造方法。
- 前記アルコキシ基は、メトキシ基である請求項1ないし4のいずれかに記載のジアルコキシフェノール2量体の製造方法。
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