JP7448993B2 - ルシフェリン誘導体及びその合成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ルシフェリン誘導体及びルシフェリン誘導体の合成方法に関する。より具体的には、ルシフェリン誘導体はまた、６００～７００ｎｍの発光波長を有する。
ルシフェリンはホタルに見受けられる天然物質である。ルシフェリンは生物発光反応の基質となる。反応により放射される光は、通常黄緑色であり、また可視される。ルシフェリンとホタルルシフェラーゼとの特殊な反応の結果として、生物発光を、生物医学研究、検出デバイス、及び食品産業などの種々の分野において利用することができる。
現在、一般にホタルに見受けられるルシフェリンは、化学プロセスによって合成可能である。しかしながら、これは十分ではなく、研究者の要求、特に医学及び医薬研究における要求を満足させるものではない。これらの研究には、がん、脳疾患、及び遺伝障害などを含む多数の疾患を診断するためモデルとしての実験動物に使用するなど、複雑な医学研究に使用するための新しいルシフェリン誘導体が要求されている。その要求は、６００ｎｍを超える波長で発光するように、ホタルルシフェラーゼと反応させたときに発光活性を有して、レッドシフトした発光波長をもたらす、新しいルシフェリン誘導体を求めるものである。赤色光を得るため、ルシフェリン誘導体とホタルルシフェラーゼとの反応の特異性を生じさせるようにルシフェラーゼの内部構造を同時に変えるために、ルシフェリン誘導体の合成とホタルルシフェラーゼの酵素工学的改変とが必要とされる。現在、ルシフェリン誘導体の合成は、遷移金属触媒及び高価な基質を使用した化学反応をなおも必要とする一方、処理条件は厳しく、環境に良いものではない。さらに、生成物収率は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ；２００４；２０１４、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ；２０１７にて報告されているほど多いものではない。結果として、このルシフェリン誘導体の合成は、産業及び商業利用に限定されている。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ＪＡＣＳ；２０１７は、生物医学研究のための新しいルシフェリン誘導体を生成する化学プロセスを報告している。しかしながら、この化学プロセスは、強力な環境に良くない化学薬剤を使用するだけでなく、生成収率が極めて低いものである。さらに、上述のプロセスは、ルシフェリン誘導体とホタルルシフェラーゼとの特異的反応を生じさせるように酵素の内部構造を同時に変えることによるホタルルシフェラーゼの酵素工学的改変を必要とする。したがって、これは、ルシフェリン誘導体の実用的使用を限定するものとなる。
これまでに記載した問題及び欠点から、産業規模においてルシフェリン誘導体生成を高めることができるルシフェリン誘導体の合成方法を開発する取り組みがある。その結果、上述の方法は、化学産業の廃棄物などのさほど高価でない基質を使用することによって産業レベルで適用可能である。また、上述の合成方法は複雑ではなく、危険な化学物質の使用を減らすものである。さらに、新しいルシフェリン誘導体は、種々の医学的用途及び検出に求められている。そうした合成手順を本明細書において提供する。
本開示は、ルシフェリン誘導体及びルシフェリン誘導体の合成方法を提供することを対象とする。
ルシフェリン誘導体は、図１に示すように種々の構造からなり、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の１つ又は組合せが、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基によって置換される。
ルシフェリン誘導体の一態様において、ルシフェリン誘導体群のハロゲン基は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素の１つから選択される。さらに、ルシフェリン誘導体は、６００～７００ｎｍの発光波長を有する。
ルシフェリン誘導体の合成方法は、ベンゾキノンを得るため、熱安定性デハロゲナーゼ、ラジカル捕捉酵素群、ポリフェノールオキシダーゼ群、及びＦＡＤＨ２生成システムを使用することによってバッファー溶液中においてフェノール誘導体基質との間の第１の反応を行うステップ、並びにルシフェリン誘導体を得るためベンゾキノンとＤ－システインとの間の第２の反応を行うステップを含む。
本開示は、酵素反応（又は生物学的触媒）を使用してルシフェリン誘導体を合成することを狙いとする。フェノール基又はフェノール誘導体基質は、除草剤として雑草を除去するために通常使用され、また産業上（染工場、花火や爆竹の工場、家具工場などからのものなど）得られる毒性薬剤であり、それぞれ、農業製品の消費者に対する有害性、及び環境の汚染をもたらす。したがって、高価値のルシフェリン誘導体を得るためにこれらの基質を使用することは、毒性化学物質を除去する優れた方法となる。加えて、本合成方法は複雑ではなく、高酸性度又は高温などの厳しい条件を必要としない。さらに、このルシフェリン誘導体は、いずれの酵素工学的改変も必要とせず野生型ホタルルシフェラーゼと共に直接使用可能な単純な構造を有し、種々の有用な用途につながる。
以下に記載するように、本開示は、本発明の代表的な又は好ましい実施形態において、添付の説明及び図面を参照して記載する。しかしながら、そうした実施形態に対応する説明及び図面が、明確にするためかつ理解を助けるためのものであることが理解され、当業者が、添付の特許請求の範囲に規定する本発明の範囲から逸脱することなく種々の変形を考案し得るということが想定される。
本明細書において使用するように、「フェノール物質」又は「フェノールファミリー物質」又は「フェノール誘導体」という用語は、互換的に使用可能であり、オルト位又は２位、メタ位又は３位、パラ位又は４位の１つ以上においてハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基などの１つ以上の置換基を有するハロゲン化フェノール、ニトロフェノール、及びフェノールを広く指す（例えば、図２に示すような、ｐ－クロロフェノール（４－クロロフェノール）、ｐ－ブロモフェノール（４－ブロモフェノール）、ｐ－ヨードフェノール（４－ヨードフェノール）、ｐ－フルオロフェノール（４－フルオロフェノール）、ｐ－ニトロフェノール（４－ニトロフェノール）、ｍ－フルオロ－ｐ－ニトロフェノール、（３－フルオロ－４－ニトロフェノール）、ｏ－アミノ－ｐ－ニトロフェノール（２－アミノ－４－ニトロフェノール）、及び２，５－ジフルオロ－４－ニトロフェノール）。
本開示にわたって本明細書に使用する「ルシフェリン誘導体」という用語は、ルシフェリンの炭素位４’、５’、７’においてハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基の１つ以上などの置換基を有するルシフェリン及び／又はルシフェリン誘導体及び／又はルシフェリン物質を広く指す。
本詳細な説明にわたって本明細書に使用する「ＦＡＤＨ２生成システム」という用語は、ＦＡＤＨ２を生成又は産生することができるシステムを指し、該システムは、直接的な反応のためＦＡＤＨ２を含む、又はＦＡＤＨ２を生成若しくは産生可能な他の反応を含む。例えば、上述のシステムは、ＦＡＤＨ２を産生するためＮＡＤＨ、ＦＡＤ、及びフラビンレダクターゼ群を含み、該システムは、後にＦＡＤＨ２を産生するためＧ－６－ＰＤ、グルコース－６－ホスフェート、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、該システムは、ＦＡＤＨ２を産生するためＧＤＨ、グルコース、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、該システムは、ＦＡＤＨ２を産生するためＦＤＨ、ギ酸又はホルマート、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含む。
本明細書に使用する「熱安定性デハロゲナーゼ」という用語は、再改変又は修飾した、特に野生型デハロゲナーゼ又はＨａｄＡの表面において修飾した、デハロゲナーゼ又はＨａｄＡを指す。熱安定性ＨａｄＡ又はＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔと呼ばれる再改変又は修飾したデハロゲナーゼ又はＨａｄＡは、温度安定性において改善されている。熱安定性ＨａｄＡ又はＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔの触媒性能は、２５～５０℃の広範囲の温度で得られる。さらに、野生型デハロゲナーゼ又はＨａｄＡは、ニトロフェノール基質及びハロゲン化フェノール基質からのニトロ基及びハライド基（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）の除去を触媒することができる脱塩素化モノオキシゲナーゼである。野生型ＨａｄＡは、２５℃で２４時間反応を触媒することができる。反応はより高い温度である（＞３０℃）が、野生型ＨａｄＡの半減期は２０分間で著しく減少する。
種々の実施形態において、本開示は、ルシフェリン誘導体及びルシフェリン誘導体の合成方法に関する。
［ルシフェリン誘導体］
ルシフェリン誘導体は、以下の構造からなり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の１つ又は組合せが、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基によって置換される（図１に示す）。
ルシフェリン誘導体は、以下の構造からなり、
ルシフェリン誘導体の一態様において、ルシフェリン誘導体のハロゲン基は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素の１つから選択される。さらに、ルシフェリン誘導体は、６００～７００ｎｍの発光波長を有する。
ルシフェリン誘導体の態様において、Ｒ１位又はＲ２位又はＲ３位を、ハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基によって置換することができる。
ルシフェリン誘導体の他の態様において、Ｒ１位及びＲ２位、又はＲ１位及びＲ３位、又はＲ２位及びＲ３位を、ハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基によって置換することができる。
ルシフェリン誘導体のさらなる態様において、Ｒ１位、Ｒ２位及びＲ３位の３つすべてを、ハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基によって置換することができる。
図２は、ルシフェリン誘導体を合成するためＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔの基質として使用されるフェノール誘導体の構造を示し、該フェノール誘導体は、オルト（２）位、メタ（３）位、パラ（４）位の１つ以上においてハロゲン基（例えば、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）、ニトロ基、アミノ基、メチル基、エチル基、及びメトキシ基などの１つ以上の置換基を含み、例えば、ｐ－クロロフェノール、ｐ－ブロモフェノール、ｐ－ヨードフェノール、ｐ－フルオロフェノール、ｐ－ニトロフェノール、ｍ－フルオロ－ｐ－ニトロフェノール、ｍ－アミノ－ｐ－ニトロフェノール、及び２，５－ジフルオロ－４－ニトロフェノールである。
［ルシフェリン誘導体の合成方法］
ルシフェリン誘導体の合成方法は、
ベンゾキノンを得るため、熱安定性デハロゲナーゼ、ラジカル捕捉酵素群、ポリフェノールオキシダーゼ群、及びＦＡＤＨ２生成システムを使用することによってバッファー溶液中においてフェノール誘導体基質との間の第１の反応を行い、
該ＦＡＤＨ２生成システムは、熱安定性デハロゲナーゼのＦＡＤＨ２基質を提供するステップ、並びにルシフェリン誘導体を得るためベンゾキノンとＤ－システインとの間の第２の反応を行うステップを含む。
ルシフェリン誘導体の合成方法は、
ベンゾキノンを得るため、熱安定性デハロゲナーゼ、ラジカル捕捉酵素群、ポリフェノールオキシダーゼ群、及びＦＡＤＨ２生成システムを使用することによってバッファー溶液中においてフェノール誘導体基質との間の第１の反応を行い、
該ＦＡＤＨ２生成システムは、熱安定性デハロゲナーゼのＦＡＤＨ２基質を提供するステップ、並びにルシフェリン誘導体を得るためベンゾキノンとＤ－システインとの間の第２の反応を行うステップを含む。
第１及び第２の反応は、７．０～９．０のｐＨ、及び２０～５０℃の温度範囲において行うことができ、この条件は高酸性度及び／又は高温度のいずれも必要としない。
多くの実施形態において、ベンゾキノンを得るため、熱安定性デハロゲナーゼ、ラジカル捕捉酵素群、ポリフェノールオキシダーゼ群、及びＦＡＤＨ２生成システムを使用することでバッファー溶液中においてフェノール誘導体基質との間の第１の反応を行い、該ＦＡＤＨ２生成システムは、熱安定性デハロゲナーゼのＦＡＤＨ２基質を提供するステップが存在する。フェノール誘導体、例えば、ｐ－クロロフェノール、ｐ－ブロモフェノール、ｐ－ヨードフェノール、ｐ－フルオロフェノール、ｐ－ニトロフェノール、ｍ－フルオロ－ｐ－ニトロフェノール、ｍ－アミノ－ｐ－ニトロフェノールは、０．０５～１００ミリモル（ｍＭ）の範囲で使用することに適している。
バッファー溶液は、無機及び有機バッファー溶液の少なくとも１つから選択され、その使用は、１～１０００ミリリットルの体積、ｐＨ５～９、及び２０～２００ｍｍｏｌ／ｌ（ｍＭ）の濃度の範囲である。さらに、無機バッファー溶液は、リン酸二水素ナトリウム溶液（ＮａＨ２ＰＯ４）、及びリン酸二水素カリウム溶液（ＫＨ２ＰＯ４）の少なくとも１つから選択され、有機バッファー溶液は、ＨＥＰＥＳ溶液、ＭＯＰＳ溶液、重炭酸アンモニウム溶液（ＮＨ４ＨＣＯ３）、及びギ酸アンモニウム溶液（ＨＣＯ２ＮＨ４）の少なくとも１つから選択される。
熱安定性デハロゲナーゼは、図８に示す配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、修飾ＨａｄＡ、特にＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ（熱安定性デハロゲナーゼＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ）である。熱安定性デハロゲナーゼ又はＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔは、２５～５０℃の温度範囲で触媒可能であり、５０℃におけるその半減期は２００分である。しかしながら、熱安定性デハロゲナーゼ又はＨａｄＡ又はＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔの濃度は、０．１～２００マイクロモル（μＭ）の範囲である。さらに、コドン最適化又は他の同様の方法のいずれかで、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の修飾、変更、変化、除去、置換、及び／又は付加が存在し得、ヌクレオチド配列及び／若しくはアミノ酸配列が各宿主細胞種に適切となる、並びに／又は宿主細胞における転写及び翻訳の効率を高めることができるということが一般に知られている。したがって、ＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔのアミノ酸配列をこの目的のため修飾することができる。さらに、熱安定性デハロゲナーゼ又はＨａｄＡ Ｇ１３Ｔのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも５０％同一とすることができる。さらに、本開示におけるＨａｄＡ Ｇ１３Ｔは、ルシフェリン及び／又はルシフェリン誘導体の両方を合成することができるということも分かっている。
ラジカル捕捉酵素群は、ベンゾキノンの安定性を破壊する酸化体及びフリーラジカルを除去するためのものである。これは、カタラーゼ、及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の１つから選択することができる。ラジカル捕捉酵素群の濃度は、０．００１～２００マイクロモル（μＭ）の範囲である。
ポリフェノールオキシダーゼ群は、金属及び酸素を使用した酸化によるヒドロキノンのベンゾキノンへの変換を担っている。ポリフェノールオキシダーゼ群は、チロシナーゼ、ラッカーゼ、及びペルオキシダーゼの１つから選択され、これらの酵素は、それぞれ酸素とともに鉄（Ｆｅ２＋）、銅（Ｃｕ２＋）、及びこれらの酵素の補助因子金属を使用して酸化によってヒドロキノンをベンゾキノンに変換することができる。また、ポリフェノールオキシダーゼ群の濃度は、０．００１～２００マイクロモル（μＭ）の範囲である。
ＦＡＤＨ２生成システムは、
直接の反応のためＦＡＤＨ２を含む、第１のＦＡＤＨ２生成システム、
ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、及びフラビンレダクターゼ群を含み、ＮＡＤＨは、ＦＡＤからＦＡＤＨ２を産生するための還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質である、第２のＦＡＤＨ２生成システム、
Ｇ－６－ＰＤ、グルコース－６－ホスフェート、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、グルコース－６－ホスフェート及びＮＡＤ＋はＮＡＤＨを産生するためのＧ－６－ＰＤの基質であり、ＮＡＤＨは後にＦＡＤＨ２を産生するための還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質である、第３のＦＡＤＨ２生成システム、
ＧＤＨ、グルコース、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、グルコース及びＮＡＤ＋はＮＡＤＨを産生するためのＧＤＨの基質であり、さらに、還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質であるＮＡＤＨは、ＦＡＤをＦＡＤＨ２に変換する、第４のＦＡＤＨ２生成システム、
ＦＤＨ、ギ酸又はホルマート、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、ギ酸及びＮＡＤ＋はＮＡＤＨを産生するためのＦＤＨの基質であり、そして、還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質であるＮＡＤＨは、フラビンレダクターゼの反応によってＦＡＤをＦＡＤＨ２に変換する、第５のＦＡＤＨ２生成システム、のシステムのいずれか１つから選択される。
直接の反応のためＦＡＤＨ２を含む、第１のＦＡＤＨ２生成システム、
ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、及びフラビンレダクターゼ群を含み、ＮＡＤＨは、ＦＡＤからＦＡＤＨ２を産生するための還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質である、第２のＦＡＤＨ２生成システム、
Ｇ－６－ＰＤ、グルコース－６－ホスフェート、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、グルコース－６－ホスフェート及びＮＡＤ＋はＮＡＤＨを産生するためのＧ－６－ＰＤの基質であり、ＮＡＤＨは後にＦＡＤＨ２を産生するための還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質である、第３のＦＡＤＨ２生成システム、
ＧＤＨ、グルコース、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、グルコース及びＮＡＤ＋はＮＡＤＨを産生するためのＧＤＨの基質であり、さらに、還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質であるＮＡＤＨは、ＦＡＤをＦＡＤＨ２に変換する、第４のＦＡＤＨ２生成システム、
ＦＤＨ、ギ酸又はホルマート、ＮＡＤ＋、フラビンレダクターゼ群、及びＦＡＤを含み、ギ酸及びＮＡＤ＋はＮＡＤＨを産生するためのＦＤＨの基質であり、そして、還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質であるＮＡＤＨは、フラビンレダクターゼの反応によってＦＡＤをＦＡＤＨ２に変換する、第５のＦＡＤＨ２生成システム、のシステムのいずれか１つから選択される。
フラビン依存性レダクターゼは、Ｃ１、ＨａｄＸ、及びその変異体の少なくとも１つから選択され、フラビンレダクターゼ群の濃度は、０．０１～１００マイクロモル（μＭ）の範囲である。
ルシフェリン誘導体の本合成方法は、ＦＡＤＨ２を、熱安定性デハロゲナーゼ又はＨａｄＡ又はＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔの基質として使用することができる。したがって、図３に示すように、ＦＡＤＨ２を直接加える、又はＦＡＤＨ２を産生するため反応性物質を加えるなど、種々の形態におけるＦＡＤＨ２生成システム又は産生システムを必要とし得る。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド群はＮＡＤ＋又はＮＡＤＨからなり、適切な量は１マイクロモル（μＭ）～２０ミリモル（ｍＭ）である。
フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）では、使用する量は、１～１００マイクロモル（μＭ）の範囲である。
グルコース、グルコース－６－ホスフェート、及びギ酸又はホルマートでは、反応に使用する量は、０．０５ミリモル（ｍＭ）～２モル（Ｍ）である。
グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ又はＧ－６－ＰＤ、グルコース、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、及びホルマートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）などのデヒドロゲナーゼ群では、反応に使用する量は、ミリリットルにつき０．１～２０ユニット（Ｕ／ｍｌ）の範囲である。
多くの実施形態において、ルシフェリン誘導体を得るためベンゾキノンとＤ－システインとの間の第２の反応を行うステップが存在する。
Ｄ－システインの量は０．０５ミリモル（ｍＭ）～１モル（Ｍ）の範囲である一方、ベンゾキノンとＤ－システインとの濃度比は、１：１～１０の範囲である。
図３は、ルシフェリン誘導体を得るための多サイクル反応を示す。反応は、デヒドロゲナーゼから開始し、ホルマートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）は、フラビン依存性レダクターゼ群のための還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を産生するように、ＦＤＨの基質であるギ酸又はホルマート、及びＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）と反応する。ここで、Ｃ１を使用して、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の還元型フラビンアデニンジヌクレオチド（還元形態）（ＦＡＤＨ２）への変換を触媒する。その後、熱安定性デハロゲナーゼのＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔは、還元型フラビンアデニンジヌクレオチド又はＦＡＤＨ２を受け取り、フェノール誘導体又はフェノール基（オルト（２）位、メタ（３）位、パラ（４）位の１つ以上においてハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、エチル基、及びメトキシ基の置換基を有するハロゲン化フェノール、ニトロフェノール、及びフェノール誘導体など）をベンゾキノン誘導体（ｐ－ベンゾキノン誘導体）に変換し、Ｄ－システインとの反応を得てから、ルシフェリン誘導体（図１に示す）を生成する。
図４は、熱安定性デハロゲナーゼ（ＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ）がフェノール誘導体（この実験では、３－ブロモ－４－ニトロフェノールを使用）を３００分内に完全に分解するという、４００～４１０ｎｍの波長における吸光度の低下を示すグラフである。ルシフェリン誘導体の生成収率は、フェノール誘導体の使用量と比較して、約４０～９０パーセントである。
また、ルシフェリン誘導体の合成方法は、ルシフェリン誘導体を精製するステップをさらに含む。さらに、ルシフェリン誘導体を精製する手段は、有機溶媒抽出、クロマトグラフィー、ろ過、及び蒸発の少なくとも１つから選択され、５０～９５％の純度の精製ルシフェリン誘導体を得る。
図５は、ホタルルシフェラーゼの基質として７’－ブロモルシフェリンを使用した、ルシフェラーゼとルシフェリン誘導体との間の反応によって放射される光を示すグラフである。合成及び精製方法から得た、純粋なルシフェリン及び精製したルシフェリン誘導体は、ホタルルシフェラーゼと反応させてから、発光波長を測定する。標準のルシフェリン又はこの方法から得たルシフェリンが、５６０ｎｍの最大発光波長を示す一方、７’－ブロモルシフェリンなどのルシフェリン誘導体は、レッドシフトとなる６０４ｎｍの最大発光波長を示す。この７’－ブロモルシフェリンの赤色光は、医学研究（すなわち、がん検出）に有用である。
図６は、ＮＭＲ（核磁気共鳴法）を用いる本方法から得たフェノール誘導体の構造及び確認である。７’－ヨードルシフェリン、７’－ブロモルシフェリン、及び４’，５’－ジメチルルシフェリンである、精製を含む本方法のルシフェリン誘導体を、標準のルシフェリンと比較する。標準のルシフェリンは、二重分裂として表される７．０９及び７．１１、単一分裂として表される７．３８、並びに二重分裂として表される７．９３及び７．９４において、ルシフェリンを示す１Ｈ ＮＭＲにおける３つの化学シフト値を有する。ルシフェリンの７’位においてヨウ素（Ｉ）及び臭素（Ｂｒ）のハロゲン原子によって置換したルシフェリン誘導体は、７．３８の位置に現れる化学シフトを有し、また、他の位置における１Ｈ ＮＭＲの化学シフト値が標準（又は天然）のルシフェリンとわずかに異なる。ルシフェリンの４’位及び５’位においてメチル基によって置換したルシフェリン誘導体は、７．１８の位置（単一分裂）に現れる化学シフトを有する。４’，５’－ジメチルルシフェリンの１Ｈ ＮＭＲの化学シフトは、７．３８の位置において標準のルシフェリンの１Ｈ ＮＭＲと異なる。
［本開示のルシフェリン誘導体の特性］
１．ホタルルシフェラーゼと反応させたときのルシフェリン誘導体の生物発光／発光
本開示のルシフェリン誘導体とホタルルシフェラーゼとの反応によって光を放射することができる。発光波長は、分光蛍光光度計を生物発光モードで使用して、ルシフェリン誘導体がホタルルシフェラーゼの基質となることができるか否かについて生物発光特性を証明するため測定することができる。
１．ホタルルシフェラーゼと反応させたときのルシフェリン誘導体の生物発光／発光
本開示のルシフェリン誘導体とホタルルシフェラーゼとの反応によって光を放射することができる。発光波長は、分光蛍光光度計を生物発光モードで使用して、ルシフェリン誘導体がホタルルシフェラーゼの基質となることができるか否かについて生物発光特性を証明するため測定することができる。
実験は、標準のルシフェリン及びルシフェリン誘導体（すなわち、７’－ブロモルシフェリン）が、それぞれ５６０ｎｍ及び６０４ｎｍの波長を放射することによってホタルルシフェラーゼの基質となることができるということを示す。
２．ＱＴＯＦ質量分析計を使用する分子質量分析
ＱＴＯＦ質量分析計を使用することから、合成したルシフェリン誘導体である７’－ヨードルシフェリン（Ｃ１１Ｈ７ＩＮ２Ｏ３Ｓ２）、４，７’－ジフルオロルシフェリン（Ｃ１１Ｈ６Ｆ２Ｎ２Ｏ３Ｓ２）、及び７’－ブロモルシフェリン（Ｃ１１Ｈ７ＢｒＮ２Ｏ３Ｓ２）、及び４’，５’－ジメチルルシフェリン（Ｃ１３Ｈ１２Ｎ２Ｏ３Ｓ２）の分子質量はそれぞれ、４０６．９１１６、３１６．９９７９、３５８．９１４３、及び３０９．０３７４であり、これらは、図７に示す予想される化合物の分子質量を示す。
ＱＴＯＦ質量分析計を使用することから、合成したルシフェリン誘導体である７’－ヨードルシフェリン（Ｃ１１Ｈ７ＩＮ２Ｏ３Ｓ２）、４，７’－ジフルオロルシフェリン（Ｃ１１Ｈ６Ｆ２Ｎ２Ｏ３Ｓ２）、及び７’－ブロモルシフェリン（Ｃ１１Ｈ７ＢｒＮ２Ｏ３Ｓ２）、及び４’，５’－ジメチルルシフェリン（Ｃ１３Ｈ１２Ｎ２Ｏ３Ｓ２）の分子質量はそれぞれ、４０６．９１１６、３１６．９９７９、３５８．９１４３、及び３０９．０３７４であり、これらは、図７に示す予想される化合物の分子質量を示す。
［実施例１：３－ブロモ－４－ニトロフェノールからの７’－ブロモルシフェリンの合成］
ルシフェリン誘導体である７’－ブロモルシフェリンの合成のための基質は、
－ ０．２ミリモルの３－ブロモ－４－ニトロフェノール
－ １００ミリモルのＨＥＰＥＳバッファー溶液
－ ５０マイクロモルの熱安定性デハロゲナーゼ（ＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ）
－ ２．０マイクロモルのＳＯＤ
－ ２．０マイクロモルのラッカーゼ
－ ２．０マイクロモルのＦＤＨ、２０ミリモルのギ酸、１０．０マイクロモルのＮＡＤ＋、２．０マイクロモルのＣ１である実施例１で使用するフラビン依存性レダクターゼ、及び４．０マイクロモルのＦＡＤを含む第５のＦＡＤＨ２生成システム
－ ２ミリモルのＤ－システインである。
ルシフェリン誘導体である７’－ブロモルシフェリンの合成のための基質は、
－ ０．２ミリモルの３－ブロモ－４－ニトロフェノール
－ １００ミリモルのＨＥＰＥＳバッファー溶液
－ ５０マイクロモルの熱安定性デハロゲナーゼ（ＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ）
－ ２．０マイクロモルのＳＯＤ
－ ２．０マイクロモルのラッカーゼ
－ ２．０マイクロモルのＦＤＨ、２０ミリモルのギ酸、１０．０マイクロモルのＮＡＤ＋、２．０マイクロモルのＣ１である実施例１で使用するフラビン依存性レダクターゼ、及び４．０マイクロモルのＦＡＤを含む第５のＦＡＤＨ２生成システム
－ ２ミリモルのＤ－システインである。
すべての溶液を、容器内において８．０のｐＨ、５ｍｌで共に混合し、３５℃の温度においてマグネットバーでかく拌する。熱安定性デハロゲナーゼ溶液を容器に添加すると反応が起こり、その後約２００分間で反応を完了させる。その後、ルシフェリン誘導体を、有機溶媒、すなわちエチルアセテートによる抽出と組み合わせて、１０ｋＤａのカットオフ値を有するろ過膜を通して窒素ガスによって溶液を押し出すことによって（攪拌式セル）精製する。エチルアセテートによる抽出後の溶液を純度について分析し、３２７ｎｍの波長における吸光度を追跡してＨＰＬＣによる再度の精製を行った。溶液を、溶出移動相として、０．１％ｖ／ｖのギ酸を添加した水とメタノールとの混合物を使用して、非極性カラム（逆相Ｃ１８）を介して分離させる。ルシフェリン誘導体を回収してから、凍結乾燥する。その後、精製したルシフェリン誘導体が２ミリグラム生成される。
[実施例２：２，５－ジフルオロ－４－ニトロフェノールからの４’，７’－ジフルオロルシフェリンの合成]
ルシフェリン誘導体である４’，７’－ジフルオロルシフェリンの合成のための基質は、
－ １．０ミリモルの２，５－ジフルオロ－４－ニトロフェノール
－ １００ミリモルのＭＯＰＳバッファー溶液
－ ５０マイクロモルのＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ
－ ２．０マイクロモルのＳＯＤ
－ ２．０マイクロモルのラッカーゼ
－ ４．０マイクロモルのＧＤＨ、２０．０ミリモルのグルコース、１０．０マイクロモルのＮＡＤ＋、２．０マイクロモルのフラビン依存性レダクターゼ（ＨａｄＸ）、４．０マイクロモルのＦＡＤ、及び２．０ミリモルのＤ－システインを含む第４のＦＡＤＨ２生成システムである。
ルシフェリン誘導体である４’，７’－ジフルオロルシフェリンの合成のための基質は、
－ １．０ミリモルの２，５－ジフルオロ－４－ニトロフェノール
－ １００ミリモルのＭＯＰＳバッファー溶液
－ ５０マイクロモルのＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ
－ ２．０マイクロモルのＳＯＤ
－ ２．０マイクロモルのラッカーゼ
－ ４．０マイクロモルのＧＤＨ、２０．０ミリモルのグルコース、１０．０マイクロモルのＮＡＤ＋、２．０マイクロモルのフラビン依存性レダクターゼ（ＨａｄＸ）、４．０マイクロモルのＦＡＤ、及び２．０ミリモルのＤ－システインを含む第４のＦＡＤＨ２生成システムである。
すべての溶液を、容器内において８．０のｐＨ、５ｍｌで共に混合し、３５℃の温度においてマグネットバーでかく拌する。熱安定性デハロゲナーゼ溶液又はＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔを容器に添加すると反応が起こり、その後反応を完了させる。２，５－ジフルオロ－４－ニトロフェノールから調製した、ルシフェリン誘導体である４’，７’－ジフルオロルシフェリンを最後に得る。
[実施例３：２，３－ジメチル－４－ニトロフェノールからの４’，５’－ジメチルルシフェリンの合成]
ルシフェリン誘導体である４’，５’－ジメチルルシフェリンの合成のための基質は、
－ ０．５ミリモルの２，３－ジメチル－４－ニトロフェノール
－ １００ミリモルのリン酸ナトリウムバッファー溶液
－ １００マイクロモルの熱安定性デハロゲナーゼ（ＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ）
－ ５．０マイクロモルのＳＯＤ
－ ２．０マイクロモルのチロシナーゼ
－ ＮＡＤＨ及びＦＡＤを含み、ＮＡＤＨは、ＦＡＤからＦＡＤＨ２を産生するための還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質である、第２のＦＡＤＨ２生成システム
－ ５ミリモルのＤ－システインである。
ルシフェリン誘導体である４’，５’－ジメチルルシフェリンの合成のための基質は、
－ ０．５ミリモルの２，３－ジメチル－４－ニトロフェノール
－ １００ミリモルのリン酸ナトリウムバッファー溶液
－ １００マイクロモルの熱安定性デハロゲナーゼ（ＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔ）
－ ５．０マイクロモルのＳＯＤ
－ ２．０マイクロモルのチロシナーゼ
－ ＮＡＤＨ及びＦＡＤを含み、ＮＡＤＨは、ＦＡＤからＦＡＤＨ２を産生するための還元剤、かつフラビンレダクターゼ群の基質である、第２のＦＡＤＨ２生成システム
－ ５ミリモルのＤ－システインである。
すべての溶液を、容器内において７．５のｐＨ、２０ｍｌで共に混合し、３５℃の温度においてマグネットバーでかく拌する。熱安定性デハロゲナーゼ溶液又はＨａｄＡ Ｇ５１３Ｔを容器に添加すると反応が起こり、その後反応を完了させる。２，３－ジメチル－４－ニトロフェノールから調製した、ルシフェリン誘導体である４’，５’－ジメチルルシフェリンを最後に得る。
Claims (2)
- 以下の構造からなるルシフェリン誘導体であって、
式中、Ｒ１及びＲ２はＣＨ３であり且つＲ３はＨであるか、又はＲ２及びＲ３はＣＨ３若しくはＯＣＨ３であり且つＲ１はＨである、ルシフェリン誘導体。 - 前記ルシフェリン誘導体は、ホタルルシフェラーゼとの反応によって、６００～７００ｎｍのピーク発光波長で発光する、請求項１に記載のルシフェリン誘導体。
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