JP4501426B2 - 殺虫性糸状菌製剤 - Google Patents
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Description
本発明は、殺虫性糸状菌製剤等に関するものである。
化学合成化合物を有効成分として使用しない害虫防除方法のひとつとして、殺虫性糸状菌の利用が注目されており、いくつかの殺虫性糸状菌を利用した殺虫性糸状菌製剤が知られている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
殺虫性糸状菌製剤の有効成分である殺虫性糸状菌は、生きている菌体が害虫に付着、感染することによって殺虫活性を発現することから、殺虫性糸状菌製剤には、製剤中に含有される殺虫性糸状菌が生きた状態で保持されていること、即ち生存安定性が高いことが要求される。
しかしながら、殺虫性糸状菌は単独では生存安定性の高くないものがあり、このような殺虫性糸状菌を用いた殺虫性糸状菌製剤の場合必ずしも十分な生存安定性を有していないことが多かった。そのため、製剤中における殺虫性糸状菌の生存安定性を向上させた製剤が求められていた。
しかしながら、殺虫性糸状菌は単独では生存安定性の高くないものがあり、このような殺虫性糸状菌を用いた殺虫性糸状菌製剤の場合必ずしも十分な生存安定性を有していないことが多かった。そのため、製剤中における殺虫性糸状菌の生存安定性を向上させた製剤が求められていた。
本発明者らは、鋭意検討した結果、殺虫性糸状菌に特定の界面活性剤及び水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンを含有させることによって、製剤中における殺虫性糸状菌の生存安定性、さらには製剤の沈降性が向上することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する殺虫性糸状菌、ポリカルボン酸型界面活性剤、及び、水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンを含有することを特徴とする殺虫性糸状菌製剤（以下、本発明製剤と記すこともある。）；
２．製剤の全重量に対して、ポリカルボン酸型界面活性剤を５重量％以上３０重量％以下、及び、水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンを２０重量％以上６５重量％未満含有することを特徴とする前項１記載の殺虫性糸状菌製剤；
３．殺虫性糸状菌が下記のいずれかの糸状菌であることを特徴とする前項１記載の殺虫性糸状菌製剤
（１）核の５．８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号１で示される塩基配列を有し、かつ、核の２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号２で示される塩基配列を有する糸状菌
（２）ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）に属する糸状菌
（３）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８６１として寄託されているペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株である糸状菌
４．ポリカルボン酸型界面活性剤が、(a)イソブチレン若しくはジイソブチレンと(b)マレイン酸との共重合物又はその塩からなるポリカルボン酸型界面活性剤であることを特徴とする前項１〜３のいずれか記載の殺虫性糸状菌製剤；
５．前項１〜３のいずれか記載の製剤を、害虫、害虫の生育場所又は害虫から保護するべき植物に施用することを特徴とする殺虫方法；
６．ポリカルボン酸型界面活性剤及び水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンと、ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する殺虫性糸状菌とを混合する工程を有することを特徴とする殺虫性糸状菌製剤の製造方法；
等を提供するものである。
即ち、本発明は、
１．ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する殺虫性糸状菌、ポリカルボン酸型界面活性剤、及び、水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンを含有することを特徴とする殺虫性糸状菌製剤（以下、本発明製剤と記すこともある。）；
２．製剤の全重量に対して、ポリカルボン酸型界面活性剤を５重量％以上３０重量％以下、及び、水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンを２０重量％以上６５重量％未満含有することを特徴とする前項１記載の殺虫性糸状菌製剤；
３．殺虫性糸状菌が下記のいずれかの糸状菌であることを特徴とする前項１記載の殺虫性糸状菌製剤
（１）核の５．８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号１で示される塩基配列を有し、かつ、核の２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号２で示される塩基配列を有する糸状菌
（２）ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）に属する糸状菌
（３）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８６１として寄託されているペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株である糸状菌
４．ポリカルボン酸型界面活性剤が、(a)イソブチレン若しくはジイソブチレンと(b)マレイン酸との共重合物又はその塩からなるポリカルボン酸型界面活性剤であることを特徴とする前項１〜３のいずれか記載の殺虫性糸状菌製剤；
５．前項１〜３のいずれか記載の製剤を、害虫、害虫の生育場所又は害虫から保護するべき植物に施用することを特徴とする殺虫方法；
６．ポリカルボン酸型界面活性剤及び水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンと、ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する殺虫性糸状菌とを混合する工程を有することを特徴とする殺虫性糸状菌製剤の製造方法；
等を提供するものである。
本発明によれば、製剤中におけるペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌の生存安定性、さらには製剤の沈降性を向上させることができ、当該方法により得られる殺虫性糸状菌の生存安定性及び製剤の沈降性に優れた殺虫性糸状菌製剤及び当該殺虫性糸状菌製剤を用いた殺虫方法等を提供することができる。
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明製剤において用いられる殺虫性糸状菌は、ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する糸状菌であり、例えば、ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）に属する糸状菌、ペーシロマイセス・フモソロセウス（Paecilomyces fumosoroseus）に属する糸状菌、ペーシロマイセス・ファリノーサス（Paecilomyces farinosus）に属する糸状菌等を挙げることができ、具体的にはペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株、ペーシロマイセス・テヌイペス ＡＴＣＣ４４８１８、ペーシロマイセス・フモソロセウス ＡＴＣＣ２０８７４、ペーシロマイセス・フモソロセウス ＡＴＣＣ４２１８８、ペーシロマイセス・フモソロセウス ＮＲＢＣ８５５５等を挙げることができる。
本発明製剤において用いられる殺虫性糸状菌は、ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する糸状菌であり、例えば、ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）に属する糸状菌、ペーシロマイセス・フモソロセウス（Paecilomyces fumosoroseus）に属する糸状菌、ペーシロマイセス・ファリノーサス（Paecilomyces farinosus）に属する糸状菌等を挙げることができ、具体的にはペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株、ペーシロマイセス・テヌイペス ＡＴＣＣ４４８１８、ペーシロマイセス・フモソロセウス ＡＴＣＣ２０８７４、ペーシロマイセス・フモソロセウス ＡＴＣＣ４２１８８、ペーシロマイセス・フモソロセウス ＮＲＢＣ８５５５等を挙げることができる。
これらは、天然から分離してもよいし、菌株保存機関等から購入してもよい。
天然から分離する場合には、まず、体が硬化し、体からキノコ状のものが生えている死亡虫を野外から採取する。当該死亡虫に形成されている分生子を白金耳で触れ、SDY培地（組成：ペプトン 1％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス 1％（Ｗ／Ｖ）、ブドウ糖 2％（Ｗ／Ｖ）、寒天 1.5％（Ｗ／Ｖ））やＣｚａｐｅｋ培地（組成：NaNO3 0.3％（Ｗ／Ｖ）、K2HPO4 0.1％（Ｗ／Ｖ）、MgSO4・7H2O 0.05％（Ｗ／Ｖ）、KCl 0.05％（Ｗ／Ｖ）、FeSO4・7H2O 0.001％（Ｗ／Ｖ）、ショ糖 3％（Ｗ／Ｖ）、寒天 1.5％（Ｗ／Ｖ））等の固体培地に線を引くように擦りつける。２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しいSDY培地やＣｚａｐｅｋ培地等の固体培地に移植し、さらに２５℃で培養する。生育してきた菌について、植物防疫特別増刊号Ｎｏ．２天敵微生物の研究手法（社団法人日本植物防疫協会発行）記載の方法等に従って、ペーシロマイセス属に属する糸状菌であるか同定を行い、ペーシロマイセス属に属する糸状菌を選抜すればよい。
つぎに、選抜されたペーシロマイセス属に属する糸状菌の殺虫活性の有無を確認する。選抜されたペーシロマイセス属に属する糸状菌をSDY培地やＣｚａｐｅｋ培地等の固体培地で２５℃で培養し、形成された分生子を１×１０８cfu／mlとなるように滅菌水に懸濁し、分離源となった死亡虫と同種の昆虫１０頭を懸濁液に３０秒間浸漬する。浸漬した昆虫を２５℃、湿度１００％の条件下で飼育し、接種後６日後に死亡虫が観察される菌株を、ペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌として選抜することができる。
天然から分離する場合には、まず、体が硬化し、体からキノコ状のものが生えている死亡虫を野外から採取する。当該死亡虫に形成されている分生子を白金耳で触れ、SDY培地（組成：ペプトン 1％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス 1％（Ｗ／Ｖ）、ブドウ糖 2％（Ｗ／Ｖ）、寒天 1.5％（Ｗ／Ｖ））やＣｚａｐｅｋ培地（組成：NaNO3 0.3％（Ｗ／Ｖ）、K2HPO4 0.1％（Ｗ／Ｖ）、MgSO4・7H2O 0.05％（Ｗ／Ｖ）、KCl 0.05％（Ｗ／Ｖ）、FeSO4・7H2O 0.001％（Ｗ／Ｖ）、ショ糖 3％（Ｗ／Ｖ）、寒天 1.5％（Ｗ／Ｖ））等の固体培地に線を引くように擦りつける。２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しいSDY培地やＣｚａｐｅｋ培地等の固体培地に移植し、さらに２５℃で培養する。生育してきた菌について、植物防疫特別増刊号Ｎｏ．２天敵微生物の研究手法（社団法人日本植物防疫協会発行）記載の方法等に従って、ペーシロマイセス属に属する糸状菌であるか同定を行い、ペーシロマイセス属に属する糸状菌を選抜すればよい。
つぎに、選抜されたペーシロマイセス属に属する糸状菌の殺虫活性の有無を確認する。選抜されたペーシロマイセス属に属する糸状菌をSDY培地やＣｚａｐｅｋ培地等の固体培地で２５℃で培養し、形成された分生子を１×１０８cfu／mlとなるように滅菌水に懸濁し、分離源となった死亡虫と同種の昆虫１０頭を懸濁液に３０秒間浸漬する。浸漬した昆虫を２５℃、湿度１００％の条件下で飼育し、接種後６日後に死亡虫が観察される菌株を、ペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌として選抜することができる。
尚、ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−７８６１（旧FERM P18487）の寄託番号が付与されている。菌学的性状は次のとおり。
（１）生育速度（２５℃、７日間）
集落の直径：２５〜３０ｍｍ（２％マルトエキス寒天平板培地）、２５〜３０ｍｍ（オートミール寒天平板培地）
（２）集落表面の色調
白色（２％マルトエキス寒天平板培地）、白色（オートミール寒天平板培地）
（３）集落裏面の色調
白色（２％マルトエキス寒天平板培地）、白色〜明るい黄色（オートミール寒天平板培地）
（４）集落表面の組織
羊毛状〜綿毛状
（５）分生子柄
滑面、分岐して不規則な輪生となる。
（６）分生胞子
滑面、楕円形〜円筒形、連鎖する、約４μｍ×約２μｍ
（７）厚膜胞子
形成せず（２５℃、９日間）
（８）核の５．８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列及び核の２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
核の５．８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、核の２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
（１）生育速度（２５℃、７日間）
集落の直径：２５〜３０ｍｍ（２％マルトエキス寒天平板培地）、２５〜３０ｍｍ（オートミール寒天平板培地）
（２）集落表面の色調
白色（２％マルトエキス寒天平板培地）、白色（オートミール寒天平板培地）
（３）集落裏面の色調
白色（２％マルトエキス寒天平板培地）、白色〜明るい黄色（オートミール寒天平板培地）
（４）集落表面の組織
羊毛状〜綿毛状
（５）分生子柄
滑面、分岐して不規則な輪生となる。
（６）分生胞子
滑面、楕円形〜円筒形、連鎖する、約４μｍ×約２μｍ
（７）厚膜胞子
形成せず（２５℃、９日間）
（８）核の５．８ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列及び核の２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
核の５．８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、核の２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
本発明製剤に用いられる殺虫性糸状菌は、液体培地又は固体培地を用いて培養することにより調製することができる。
当該菌の培養に用いられる液体培地又は固体培地は当該菌が増殖するものであれば特に限定されるものではなく、微生物培養に通常使用される炭素源、窒素源、有機塩及び無機塩等を適宜含む培地が用いられる。
液体培地は、通常水に炭素源、窒素源、有機塩、無機塩、ビタミン類等を適宜混合することにより調製できる。
液体培地に用いられる炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール類、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動植物油及び糖蜜等が挙げられる。培地に含まれる炭素源の量は、通常０．１〜２０％（ｗ／ｖ）である。
液体培地に用いられる窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩や硝酸塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、尿素及びアミノ酸類が挙げられる。培地に含まれる窒素源の量は、通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）である。
液体培地に用いられる有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、リン酸塩が挙げられ、具体的には例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸一水素カリウム及びリン酸ニ水素カリウムが挙げられる。培地に含まれる無機塩や有機塩の量は、通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）である。
ビタミン類としては、チアミン等が挙げられる。
固体培地としては、例えば、米類、麦類等の主穀類、トウモロコシ、栗、稗、コーリャン、蕎麦等の雑穀類、オガ粉、バガス、籾殻、フスマ、莢、藁、コ−ンコブ、綿実粕、オカラ、寒天、ゼラチン等を挙げることができる。また、これらの２種以上を混合して使用することもでき、さらに、前記液体培地に使用される炭素源、窒素源、有機塩、無機塩、ビタミン等を適宜混合したものが挙げられる。
当該菌の培養に用いられる液体培地又は固体培地は当該菌が増殖するものであれば特に限定されるものではなく、微生物培養に通常使用される炭素源、窒素源、有機塩及び無機塩等を適宜含む培地が用いられる。
液体培地は、通常水に炭素源、窒素源、有機塩、無機塩、ビタミン類等を適宜混合することにより調製できる。
液体培地に用いられる炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール類、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動植物油及び糖蜜等が挙げられる。培地に含まれる炭素源の量は、通常０．１〜２０％（ｗ／ｖ）である。
液体培地に用いられる窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩や硝酸塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、尿素及びアミノ酸類が挙げられる。培地に含まれる窒素源の量は、通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）である。
液体培地に用いられる有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、リン酸塩が挙げられ、具体的には例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸一水素カリウム及びリン酸ニ水素カリウムが挙げられる。培地に含まれる無機塩や有機塩の量は、通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）である。
ビタミン類としては、チアミン等が挙げられる。
固体培地としては、例えば、米類、麦類等の主穀類、トウモロコシ、栗、稗、コーリャン、蕎麦等の雑穀類、オガ粉、バガス、籾殻、フスマ、莢、藁、コ−ンコブ、綿実粕、オカラ、寒天、ゼラチン等を挙げることができる。また、これらの２種以上を混合して使用することもでき、さらに、前記液体培地に使用される炭素源、窒素源、有機塩、無機塩、ビタミン等を適宜混合したものが挙げられる。
殺虫性糸状菌の培養に用いられる培地の具体的例としては、液体培地として、２％マルトエキス液体培地、オートミール液体培地、ポテトデキストロース液体培地、サブロー液体培地及びＬ−ｂｒｏｔｈ液体培地等が挙げられ、固体培地として、米、大麦、フスマ、寒天培地（２％マルトエキス寒天培地、オートミール寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地、サブロー寒天培地及びＬ−ｂｒｏｔｈ寒天培地等）等が挙げられる。
当該菌の培養は、微生物の培養に通常使用される方法を用いて行うことができる。
即ち、液体培地を用いて培養する方法としては、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター培養及びタンク培養が挙げられ、固体培地を用いて培養する方法としては、例えば、静置培養が挙げられ、必要に応じ切り返しを加えてもよい。
培養温度は、当該菌が生育可能な範囲で適宜変更することができるが、通常１５℃〜３５℃の範囲であり、培地のｐＨは通常約５〜７の範囲である。培養時間は培養条件により異なるが、通常約１日間〜約２ヶ月間の範囲である。
当該菌は、当該菌を培養した培養液を遠心分離する方法、当該菌を培養した固体培地上に蒸留水等を加えて表面から菌体をかきとる方法や、固体培地を乾燥させ粉砕した後、篩により分画する方法等により得ることができる。
即ち、液体培地を用いて培養する方法としては、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター培養及びタンク培養が挙げられ、固体培地を用いて培養する方法としては、例えば、静置培養が挙げられ、必要に応じ切り返しを加えてもよい。
培養温度は、当該菌が生育可能な範囲で適宜変更することができるが、通常１５℃〜３５℃の範囲であり、培地のｐＨは通常約５〜７の範囲である。培養時間は培養条件により異なるが、通常約１日間〜約２ヶ月間の範囲である。
当該菌は、当該菌を培養した培養液を遠心分離する方法、当該菌を培養した固体培地上に蒸留水等を加えて表面から菌体をかきとる方法や、固体培地を乾燥させ粉砕した後、篩により分画する方法等により得ることができる。
本発明製剤に含まれる殺虫性糸状菌の配合量は、施用した場合に必要な効力が得られるように調製する限り特に限定されないが、本発明製剤１ｇあたり当該菌を通常１０3〜１０15 ＣＦＵ（ＣＦＵ：コロニー形成単位）含有させればよい。
本発明製剤において用いられるポリカルボン酸型界面活性剤とは、高分子中にカルボキシル基を有する化合物又はその塩を指し、通常、繰り返し単位中に平均0.2残基以上、好ましくは平均1残基以上のカルボキシル基を有する高分子化合物又はその塩を意味する。ポリカルボン酸型界面活性剤としては、例えば、アクリル酸とマレイン酸との共重合物、(a)イソブチレン若しくはジイソブチレンと(b)マレイン酸との共重合物、アクリル酸とイタコン酸との共重合物、メタアクリル酸とイタコン酸との共重合物、マレイン酸とスチレンとの共重合物、マレイン酸とスチレンスルホン酸との共重合物等、或いはこれらの塩が挙げられ、好ましくは、(a)イソブチレン若しくはジイソブチレンと(b)マレイン酸との共重合物、或いはその塩を挙げることができる。ポリカルボン酸型界面活性剤としては、具体的には例えば、パナカヤクＣＰ（日本化薬製）、ＡＱＵＰＥＣ ＨＶ−５０１、ＡＱＵＰＥＣ ＨＶ−５０４、ＡＱＵＰＥＣ ＨＶ−５０５（以上、住友精化製）、ジュリマーＡＣ−１０ＮＰ（日本純薬製）、Ｓ−ＳＭＡ３０００、Ｓ−ＳＭＡ１０００、Ｓ−ＳＭＡ１４４０Ｈ（以上、ＡＲＣＯ ＣＨＥＭＩＣＡＬ製）、ポリスターＯＭＰ、ポリスターＯＭＡ、ポリスターＳＭＸ、ポリスターＳＭ−１０１５、ポリスターＡ−１０６０（以上、日本油脂製）、ソカランＣＰ−5、ソカランＣＰ−７、ソカランＣＰ−９、ソカランＣＰ−10（以上、ＢＡＳＦ製）、ＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６、ＧＥＲＯＰＯＮ ＴＡ／７２、ＧＥＲＯＰＯＮ ＳＣ／２１３（以上、ローディア日華製）、デモールＥＰ（花王製）、トキサノンＧＲ−３０、トキサノンＧＲ−３１Ａ（以上、三洋化成製）等が挙げられ、好ましくは、ＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６、ＧＥＲＯＰＯＮ ＳＣ／２１３、デモールＥＰ等を挙げることができる。
本発明製剤に含まれるポリカルボン酸型界面活性剤の配合量は、本発明製剤の全重量に対して、通常０．５重量％以上５０重量％以下、好ましくは１重量％以上３０重量％以下、より好ましくは５重量％以上３０重量％以下である。
本発明製剤において用いられる水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンとしては、例えば、α化デンプン、デキストリン、アミロース及びアミロペクチンの分解物、酸化デンプン及び酸処理デンプン等の加工デンプンを挙げることができ、具体的には例えば、マツノリン５００、マツノリンＭ、マツノリンＭ−２２（以上、松谷化学工業製）、アミコールＮｏ．１、アミコールＷ、キプロガムＦ−５００、ペトロサイズJ（以上、日澱化学製）等が挙げられる。
本発明製剤に含まれるポリカルボン酸型界面活性剤の配合量は、本発明製剤の全重量に対して、通常０．５重量％以上５０重量％以下、好ましくは１重量％以上３０重量％以下、より好ましくは５重量％以上３０重量％以下である。
本発明製剤において用いられる水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンとしては、例えば、α化デンプン、デキストリン、アミロース及びアミロペクチンの分解物、酸化デンプン及び酸処理デンプン等の加工デンプンを挙げることができ、具体的には例えば、マツノリン５００、マツノリンＭ、マツノリンＭ−２２（以上、松谷化学工業製）、アミコールＮｏ．１、アミコールＷ、キプロガムＦ−５００、ペトロサイズJ（以上、日澱化学製）等が挙げられる。
本発明製剤中の水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンの配合量は、本発明製剤の全重量に対して、通常０．５重量％以上９０重量％以下、好ましくは２０重量％以上６５重量％未満である。
本発明製剤は、上記構成成分のほかに、さらに必要に応じて他構成成分若しくは残部として、本発明で用いられる殺虫性糸状菌の殺虫活性を喪失させない範囲において、通常農薬に使用される副資材、例えば、固体担体、液体担体、液性調整剤（ｐＨ調整剤等）、拡展剤、展着剤、湿潤剤、安定化剤（防腐剤、乾燥剤、凍結防止剤、固結防止剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤）、ドリフト防止剤等を添加することができる。
これらの副資材を添加する場合、その添加量は合計で、本発明製剤の全重量に対して、通常０．１重量％以上９０重量％以下、好ましくは０．５重量％以上７５重量％以下である。
これらの副資材を添加する場合、その添加量は合計で、本発明製剤の全重量に対して、通常０．１重量％以上９０重量％以下、好ましくは０．５重量％以上７５重量％以下である。
本発明製剤の剤型としては、粉剤、水和剤等の粉末製剤、粒剤、顆粒水和剤、錠剤等の造粒型製剤を挙げることができる。
本発明製剤の製造方法には、通常の農薬製剤の製造方法を適用することができる。本発明製剤が粉末製剤の場合には、例えば、前述の方法により得られた殺虫性糸状菌と、ポリカルボン酸型界面活性剤及び水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンとを、さらに必要に応じて他構成成分若しくは残部として、副資材を、混合することにより製造することができる。混合の際には、乳鉢・乳棒、薬さじ等を用いて混合することもできるし、例えば、リボンミキサー、ナウタミキサー等の混合機を用いて混合することもできる。
本発明製剤が造粒型製剤の場合には、例えば、乾式造粒法、湿式押し出し造粒法、噴霧乾燥法、流動層造粒法等の通常の造粒方法で製造することができる。
本発明製剤の製造方法には、通常の農薬製剤の製造方法を適用することができる。本発明製剤が粉末製剤の場合には、例えば、前述の方法により得られた殺虫性糸状菌と、ポリカルボン酸型界面活性剤及び水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンとを、さらに必要に応じて他構成成分若しくは残部として、副資材を、混合することにより製造することができる。混合の際には、乳鉢・乳棒、薬さじ等を用いて混合することもできるし、例えば、リボンミキサー、ナウタミキサー等の混合機を用いて混合することもできる。
本発明製剤が造粒型製剤の場合には、例えば、乾式造粒法、湿式押し出し造粒法、噴霧乾燥法、流動層造粒法等の通常の造粒方法で製造することができる。
本発明製剤が殺虫性効力を有する害虫としては、例えば、以下の害虫が挙げられる。
鱗翅目害虫：ニカメイガ（Chilo suppressalis）、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）等のメイガ類、ヨトウガ（Mamestra brasicae）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）、タマナギンウワバ（Autographa nigrisigna）等のヤガ類、モンシロチョウ（Pieris rapae）等のシロチョウ類、コナガ（Plutella xylostella）等のスガ類、ドクガ（Euproctis taiwana）、マイマイガ（Lymantria dispar）、モンシロドクガ（Euproctis similis）等のドクガ類、ヒメクロイラガ（Scopelodes contracus）等のイラガ類、マツカレハ（Dendrolimus spectabilis）等のカレハガ類
半翅目害虫：ワタアブラムシ（Aphis gossypii）、モモアカアブラムシ（Myzus persicae）、ニセダイコンアブラムシ（Lipaphis pserudobrassicae）等のアブラムシ類、オンシツコナジラミ（Trialeurodes vaporariorum）、タバココナジラミ（Bemisia tabaci）、シルバーリーフコナジラミ（Bemisia argentifolli）等のコナジラミ類等
双翅目害虫：イエバエ（Musca domestica）等のイエバエ類、アカイエカ（Culex pipiens pallens）等のイエカ類等
アザミウマ目害虫：ミナミキイロアザミウマ（Thrips palmi）、ミカンキイロアザミウマ（Frankliniella occidentalis）等
シロアリ目害虫：ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）、イエシロアリ（Coptotermes formosanus）等。
鱗翅目害虫：ニカメイガ（Chilo suppressalis）、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）等のメイガ類、ヨトウガ（Mamestra brasicae）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）、タマナギンウワバ（Autographa nigrisigna）等のヤガ類、モンシロチョウ（Pieris rapae）等のシロチョウ類、コナガ（Plutella xylostella）等のスガ類、ドクガ（Euproctis taiwana）、マイマイガ（Lymantria dispar）、モンシロドクガ（Euproctis similis）等のドクガ類、ヒメクロイラガ（Scopelodes contracus）等のイラガ類、マツカレハ（Dendrolimus spectabilis）等のカレハガ類
半翅目害虫：ワタアブラムシ（Aphis gossypii）、モモアカアブラムシ（Myzus persicae）、ニセダイコンアブラムシ（Lipaphis pserudobrassicae）等のアブラムシ類、オンシツコナジラミ（Trialeurodes vaporariorum）、タバココナジラミ（Bemisia tabaci）、シルバーリーフコナジラミ（Bemisia argentifolli）等のコナジラミ類等
双翅目害虫：イエバエ（Musca domestica）等のイエバエ類、アカイエカ（Culex pipiens pallens）等のイエカ類等
アザミウマ目害虫：ミナミキイロアザミウマ（Thrips palmi）、ミカンキイロアザミウマ（Frankliniella occidentalis）等
シロアリ目害虫：ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）、イエシロアリ（Coptotermes formosanus）等。
本発明製剤は、通常、害虫、害虫の生息場所又は害虫から保護すべき植物等に施用することにより使用される。害虫から保護すべき植物に施用する場合、通常、当該植物の茎葉等に対して、本発明製剤のうち水和剤、顆粒水和剤又は錠剤を水で希釈した後、当該希釈液を散布処理することにより使用することがよい。
本発明製剤を害虫、害虫の生息場所又は害虫から保護すべき植物等に施用する際、その施用量は、通常１０００ｍ2あたり本発明製剤で用いられる殺虫性糸状菌株の菌体の量として、１０5〜１０19ＣＦＵ、好ましくは１０7〜１０17ＣＦＵである。水和剤、顆粒水和剤等は通常、前記菌体の量として、その濃度が１０3〜１０12ＣＦＵ／ｍｌとなるように水で希釈して使用すればよく、粉剤、粒剤等は通常、そのままで使用すればよい。
本発明製剤を害虫、害虫の生息場所又は害虫から保護すべき植物等に施用する際、その施用量は、通常１０００ｍ2あたり本発明製剤で用いられる殺虫性糸状菌株の菌体の量として、１０5〜１０19ＣＦＵ、好ましくは１０7〜１０17ＣＦＵである。水和剤、顆粒水和剤等は通常、前記菌体の量として、その濃度が１０3〜１０12ＣＦＵ／ｍｌとなるように水で希釈して使用すればよく、粉剤、粒剤等は通常、そのままで使用すればよい。
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ （ペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌の単離）
体が硬化し、体からキノコ状のものが生えている死亡虫を野外から採取する。当該死亡虫に形成されている分生子を白金耳で触れ、ＳＤＹ培地に線を引くように擦りつける。２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しいＳＤＹ培地に移植し、さらに２５℃で培養する。
得られた菌株のうち、以下のア）〜ク）に記載された性質をもつ菌株を、ペーシロマイセス属に属する糸状菌として選抜する。
ア）栄養菌糸が隔壁を持つ
イ）有性生殖が認められない。
ウ)分生子は分生子殻と呼ばれる壺上の器官の中に作られるのではなく、外生する。
エ）分生子はフィアライド頂端にフィアロ型に形成され、乾燥し連鎖状をなす。
オ）分生子柄は先端に小のうを持たない。
カ）フィアライドは分生子柄束上に柵状に配列されない。
キ）分生子の連鎖は束をなさない。
ク）フィアライドは頸部が明瞭、不規則あるいは緩く輪生である。
選抜されたペーシロマイセス属に属する糸状菌をSDY培地で２５℃で培養し、形成された分生子を１×１０８ＣＦＵ／ｍｌとなるように滅菌水に懸濁し、分離源となった死亡虫と同種の昆虫１０頭を懸濁液に３０秒間浸漬する。浸漬した昆虫を２５℃、湿度１００％の条件下で飼育し、接種後６日後に死亡虫が観察されるものを、ペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌として選抜する。
体が硬化し、体からキノコ状のものが生えている死亡虫を野外から採取する。当該死亡虫に形成されている分生子を白金耳で触れ、ＳＤＹ培地に線を引くように擦りつける。２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しいＳＤＹ培地に移植し、さらに２５℃で培養する。
得られた菌株のうち、以下のア）〜ク）に記載された性質をもつ菌株を、ペーシロマイセス属に属する糸状菌として選抜する。
ア）栄養菌糸が隔壁を持つ
イ）有性生殖が認められない。
ウ)分生子は分生子殻と呼ばれる壺上の器官の中に作られるのではなく、外生する。
エ）分生子はフィアライド頂端にフィアロ型に形成され、乾燥し連鎖状をなす。
オ）分生子柄は先端に小のうを持たない。
カ）フィアライドは分生子柄束上に柵状に配列されない。
キ）分生子の連鎖は束をなさない。
ク）フィアライドは頸部が明瞭、不規則あるいは緩く輪生である。
選抜されたペーシロマイセス属に属する糸状菌をSDY培地で２５℃で培養し、形成された分生子を１×１０８ＣＦＵ／ｍｌとなるように滅菌水に懸濁し、分離源となった死亡虫と同種の昆虫１０頭を懸濁液に３０秒間浸漬する。浸漬した昆虫を２５℃、湿度１００％の条件下で飼育し、接種後６日後に死亡虫が観察されるものを、ペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌として選抜する。
実施例２ （殺虫性糸状菌の調製）
５００ｍｌ容フラスコに入れた１００ｍｌのポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に予めポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で培養されたペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株の菌体を接種し、２５℃で３日間振とう培養することにより、培養液を得た。滅菌水１６０ｍｌが添加された滅菌済みフスマ８０ｇに、前記培養液２０ｍｌを接種し、２５℃、湿度９０％の条件下で、光（２０００〜３０００ルクス）を間欠照射（明条件：連続１４時間／日、暗条件：連続１０時間／日）しながら１４日間培養した。培養後、菌体（分生子を多く含む）が形成されたフスマを乾燥させ、乾燥後のフスマ及び直径２０ｍｍの瑪瑙ボール５個を日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：６０メッシュのふるいを使用）に入れ、これを日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：１００、２００メッシュのふるいを使用）と重ねて、自動ふるい振とう機（ＦＲＩＴＳＣＨ社）で１０分間振とうすることにより、２００メッシュ以下の画分に前記菌株の菌体粉末２．０ｇを得た。
５００ｍｌ容フラスコに入れた１００ｍｌのポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に予めポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で培養されたペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株の菌体を接種し、２５℃で３日間振とう培養することにより、培養液を得た。滅菌水１６０ｍｌが添加された滅菌済みフスマ８０ｇに、前記培養液２０ｍｌを接種し、２５℃、湿度９０％の条件下で、光（２０００〜３０００ルクス）を間欠照射（明条件：連続１４時間／日、暗条件：連続１０時間／日）しながら１４日間培養した。培養後、菌体（分生子を多く含む）が形成されたフスマを乾燥させ、乾燥後のフスマ及び直径２０ｍｍの瑪瑙ボール５個を日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：６０メッシュのふるいを使用）に入れ、これを日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：１００、２００メッシュのふるいを使用）と重ねて、自動ふるい振とう機（ＦＲＩＴＳＣＨ社）で１０分間振とうすることにより、２００メッシュ以下の画分に前記菌株の菌体粉末２．０ｇを得た。
実施例３ （本発明製剤の調製）
プラスチックカップにＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６（ローディア日華製）１８．４重量％、マツノリン５００（松谷化学工業製）３７．６重量％、カープレックス＃８０（塩野義製薬製）８．８重量％、勝光山ＳＰクレー（勝光山鉱業所製）１２．８重量％及びプロピレングリコール（関東化学製）２．４重量％を入れ、薬さじでよく混和した。これに実施例２で得られた菌体粉末２０．０重量％を加え、さらに薬さじで混和することにより、本発明製剤１を得た。
プラスチックカップにＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６（ローディア日華製）１８．４重量％、マツノリン５００（松谷化学工業製）３７．６重量％、カープレックス＃８０（塩野義製薬製）８．８重量％、勝光山ＳＰクレー（勝光山鉱業所製）１２．８重量％及びプロピレングリコール（関東化学製）２．４重量％を入れ、薬さじでよく混和した。これに実施例２で得られた菌体粉末２０．０重量％を加え、さらに薬さじで混和することにより、本発明製剤１を得た。
実施例４〜５ （本発明製剤の調製）
ＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６に代えて、ＧＥＲＯＰＯＮ ＳＣ２１３（ローディア日華製）（本発明製剤２）又はデモールＥＰ（花王製）（本発明製剤３）を用いること以外は実施例３と同様にして調製することにより、本発明製剤２及び本発明製剤３を得た。
ＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６に代えて、ＧＥＲＯＰＯＮ ＳＣ２１３（ローディア日華製）（本発明製剤２）又はデモールＥＰ（花王製）（本発明製剤３）を用いること以外は実施例３と同様にして調製することにより、本発明製剤２及び本発明製剤３を得た。
実施例６（殺虫性糸状菌の生存安定性）
本発明製剤１〜３をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、本発明製剤１〜３をそれぞれねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で１５日間保存した。保存された本発明製剤１〜３をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存１５日後の生存率として算出した。
本発明製剤１〜３をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、本発明製剤１〜３をそれぞれねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で１５日間保存した。保存された本発明製剤１〜３をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存１５日後の生存率として算出した。
本発明製剤１〜３における保存１５日後の生存率を以下に示す。
実施例７ （殺虫性糸状菌の生存安定性）
本発明製剤１を１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、本発明製剤１をねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で２８日間保存した。保存された本発明製剤１を１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存２８日後の生存率として算出した。
本発明製剤１を１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、本発明製剤１をねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で２８日間保存した。保存された本発明製剤１を１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存２８日後の生存率として算出した。
本発明製剤１における保存２８日後の生存率を以下に示す。
比較例１ （殺虫性糸状菌の生存安定性）
ＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６に代えて、リグニンスルホン酸ナトリウム（東京化成工業製）（比較製剤１）又はソルポール５０６０（東邦化学工業製）（比較製剤２）を用いること以外は実施例３と同様にして調製することにより、比較製剤１及び比較製剤２を得た。
比較製剤１及び比較製剤２をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、比較製剤１及び比較製剤２をそれぞれねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で１５日間保存した。保存された比較製剤１及び比較製剤２をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存１５日後の生存率として算出した。
ＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６に代えて、リグニンスルホン酸ナトリウム（東京化成工業製）（比較製剤１）又はソルポール５０６０（東邦化学工業製）（比較製剤２）を用いること以外は実施例３と同様にして調製することにより、比較製剤１及び比較製剤２を得た。
比較製剤１及び比較製剤２をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、比較製剤１及び比較製剤２をそれぞれねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で１５日間保存した。保存された比較製剤１及び比較製剤２をそれぞれ１００ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存１５日後の生存率として算出した。
比較製剤１及び比較製剤２における保存１５日後の生存率を以下に示す。また、実施例６で算出した本発明製剤１における保存１５日後の生存率も併せて示す。
比較例３（製剤の沈降性）
マツノリン５００（松谷化学工業製）に代えて、馬鈴薯デンプン（和光純薬工業製）（比較製剤３）を用いること以外は実施例３と同様にして調製することにより、比較製剤３を得た。
本発明製剤１及び比較製剤３を２００ｍｇ計り取り、これを２５０ｍｌ容のメスシリンダーに入った２５０ｍｌの３度硬水に懸濁した。懸濁した直後の懸濁液の中間層から５ｍｌの懸濁液を採取し、濁度ＯＤ６６０を測定した。一方、懸濁後１０分間静置した後、最下層の１０ｍｌを残して上層の懸濁液を取り除き、沈殿物を最下層の１０ｍｌ懸濁液に懸濁して回収し、該回収液の濁度ＯＤ６６０を測定した。
マツノリン５００（松谷化学工業製）に代えて、馬鈴薯デンプン（和光純薬工業製）（比較製剤３）を用いること以外は実施例３と同様にして調製することにより、比較製剤３を得た。
本発明製剤１及び比較製剤３を２００ｍｇ計り取り、これを２５０ｍｌ容のメスシリンダーに入った２５０ｍｌの３度硬水に懸濁した。懸濁した直後の懸濁液の中間層から５ｍｌの懸濁液を採取し、濁度ＯＤ６６０を測定した。一方、懸濁後１０分間静置した後、最下層の１０ｍｌを残して上層の懸濁液を取り除き、沈殿物を最下層の１０ｍｌ懸濁液に懸濁して回収し、該回収液の濁度ＯＤ６６０を測定した。
本発明製剤１及び比較製剤３における懸濁直後の採取液、静置１０分間後の回収液の濁度ＯＤ６６０を以下に示す。
実施例８ （本発明製剤の殺虫試験）
本発明製剤１を水に１０００倍（W/V）に希釈して試験液とした。シルバーリーフコナジラミの幼虫が寄生しているトマト幼苗（播種から３〜４週間経過したもの）を準備し、寄生しているシルバーリーフコナジラミの幼虫の数を計測した。当該トマト幼苗に前述の試験液１０ｍｌを噴霧し、２５℃、湿度１００％の条件下で光（２０００〜３０００ルクス）を間欠照射（明条件：連続１４時間／日、暗条件：連続１０時間／日）しながら、当該試験液が噴霧されたトマト幼苗を６日間栽培した。栽培後、トマト幼苗に寄生しているシルバーリーフコナジラミの幼虫の数を計測することにより、当該試験液の噴霧の前後の幼虫数から死虫率を算出した。その結果、死虫率は９５．０％であった。
本発明製剤１を水に１０００倍（W/V）に希釈して試験液とした。シルバーリーフコナジラミの幼虫が寄生しているトマト幼苗（播種から３〜４週間経過したもの）を準備し、寄生しているシルバーリーフコナジラミの幼虫の数を計測した。当該トマト幼苗に前述の試験液１０ｍｌを噴霧し、２５℃、湿度１００％の条件下で光（２０００〜３０００ルクス）を間欠照射（明条件：連続１４時間／日、暗条件：連続１０時間／日）しながら、当該試験液が噴霧されたトマト幼苗を６日間栽培した。栽培後、トマト幼苗に寄生しているシルバーリーフコナジラミの幼虫の数を計測することにより、当該試験液の噴霧の前後の幼虫数から死虫率を算出した。その結果、死虫率は９５．０％であった。
実施例９ （殺虫性糸状菌の調製）
５００ｍｌ容フラスコに入れた１００ｍｌのポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に予めポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で培養されたペーシロマイセス・フモソロセウス（Paecilomyces fumosoroseus ）ＮＲＢＣ８５５５株の菌体を接種し、２５℃で３日間振とう培養することにより、培養液を得た。滅菌水１６０ｍｌが添加された滅菌済みフスマ８０ｇに、前記培養液２０ｍｌを接種し、２５℃、湿度９０％の条件下で、光（２０００〜３０００ルクス）を間欠照射（明条件：連続１４時間／日、暗条件：連続１０時間／日）しながら１４日間培養した。培養後、菌体（分生子を多く含む）が形成されたフスマを乾燥させ、乾燥後のフスマ及び直径２０ｍｍの瑪瑙ボール５個を日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：６０メッシュのふるいを使用）に入れ、これを日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：１００、２００メッシュのふるいを使用）と重ねて、自動ふるい振とう機（ＦＲＩＴＳＣＨ社）で１０分間振とうすることにより、２００メッシュ以下の画分に前記菌株の菌体粉末０．６ｇを得た。
５００ｍｌ容フラスコに入れた１００ｍｌのポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に予めポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で培養されたペーシロマイセス・フモソロセウス（Paecilomyces fumosoroseus ）ＮＲＢＣ８５５５株の菌体を接種し、２５℃で３日間振とう培養することにより、培養液を得た。滅菌水１６０ｍｌが添加された滅菌済みフスマ８０ｇに、前記培養液２０ｍｌを接種し、２５℃、湿度９０％の条件下で、光（２０００〜３０００ルクス）を間欠照射（明条件：連続１４時間／日、暗条件：連続１０時間／日）しながら１４日間培養した。培養後、菌体（分生子を多く含む）が形成されたフスマを乾燥させ、乾燥後のフスマ及び直径２０ｍｍの瑪瑙ボール５個を日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：６０メッシュのふるいを使用）に入れ、これを日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：１００、２００メッシュのふるいを使用）と重ねて、自動ふるい振とう機（ＦＲＩＴＳＣＨ社）で１０分間振とうすることにより、２００メッシュ以下の画分に前記菌株の菌体粉末０．６ｇを得た。
実施例１０ （殺虫性糸状菌の調製）
予めポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で培養されたペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）ＡＴＣＣ４４８１８菌株の菌体を、直径９０ｍｍのシャーレのポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）２０枚に接種し、２５℃で１ヶ月培養した。培養後、ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）ＡＴＣＣ４４８１８菌株の菌体をスパチュラで掻き取り、掻き取った菌体及び直径２０ｍｍの瑪瑙ボール５個を日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：６０メッシュのふるいを使用）に入れ、これを日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：１００、２００メッシュのふるいを使用）と重ねて、自動ふるい振とう機（ＦＲＩＴＳＣＨ社）で１０分間振とうすることにより、２００メッシュ以下の画分に前記菌株の菌体粉末０．４ｇを得た。
予めポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で培養されたペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）ＡＴＣＣ４４８１８菌株の菌体を、直径９０ｍｍのシャーレのポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）２０枚に接種し、２５℃で１ヶ月培養した。培養後、ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）ＡＴＣＣ４４８１８菌株の菌体をスパチュラで掻き取り、掻き取った菌体及び直径２０ｍｍの瑪瑙ボール５個を日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：６０メッシュのふるいを使用）に入れ、これを日本工業規格標準ふるい（ＪＩＳ Ｚ ８８０１：１００、２００メッシュのふるいを使用）と重ねて、自動ふるい振とう機（ＦＲＩＴＳＣＨ社）で１０分間振とうすることにより、２００メッシュ以下の画分に前記菌株の菌体粉末０．４ｇを得た。
実施例１１〜１２（本発明製剤の調製）
プラスチックカップにＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６（ローディア日華製）１８．４重量％、マツノリン５００（松谷化学工業製）３７．６重量％、カープレックス＃８０（塩野義製薬製）８．８重量％、勝光山ＳＰクレー（勝光山鉱業所製）１２．８重量％及びプロピレングリコール（関東化学製）２．４重量％を入れ、薬さじでよく混和した。これに実施例９又は実施例１０で得られた菌体粉末２０．０重量％を加え、さらに薬さじで混和することにより、本発明製剤４又は本発明製剤５を得た。
プラスチックカップにＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ／３６（ローディア日華製）１８．４重量％、マツノリン５００（松谷化学工業製）３７．６重量％、カープレックス＃８０（塩野義製薬製）８．８重量％、勝光山ＳＰクレー（勝光山鉱業所製）１２．８重量％及びプロピレングリコール（関東化学製）２．４重量％を入れ、薬さじでよく混和した。これに実施例９又は実施例１０で得られた菌体粉末２０．０重量％を加え、さらに薬さじで混和することにより、本発明製剤４又は本発明製剤５を得た。
実施例１２（殺虫性糸状菌の生存安定性）
本発明製剤４及び本発明製剤５をそれぞれ１０ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの０．１％のＬ−７７（日本ユニカー製）および０．１％のＫＦ−６３０（信越化学工業製）を添加した滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、本発明製剤４又は本発明製剤５をそれぞれねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で１５日間保存した。保存された本発明製剤４又は本発明製剤５をそれぞれ１０ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの０．１％のＬ−７７（日本ユニカー製）および０．１％のＫＦ−６３０（信越化学工業製）を添加した滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存15日後の生存率として算出した。
本発明製剤４及び本発明製剤５をそれぞれ１０ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの０．１％のＬ−７７（日本ユニカー製）および０．１％のＫＦ−６３０（信越化学工業製）を添加した滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して、得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、当該製剤中の生菌数を求めた。一方、本発明製剤４又は本発明製剤５をそれぞれねじ口の付いたガラス瓶に入れ密栓した後、２５℃暗所で１５日間保存した。保存された本発明製剤４又は本発明製剤５をそれぞれ１０ｍｇ計り取り、これを１０ｍｌの０．１％のＬ−７７（日本ユニカー製）および０．１％のＫＦ−６３０（信越化学工業製）を添加した滅菌水に懸濁した。この懸濁液を適当な濃度に希釈して得られた希釈液をポテトデキストロース寒天培地に１００μｌ滴下し塗り広げ、２５℃で２日間培養した。培養後、生育したコロニー数を計測することにより、保存後の当該製剤中の生菌数を求めた。このようにして求めた保存の前後における当該製剤中の生菌数の比を保存15日後の生存率として算出した。
本発明製剤４又は本発明製剤５における保存15日後の生存率を以下に示す。
本発明によれば、製剤中におけるペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌の生存安定性、さらには製剤の沈降性を向上させることができ、当該方法により得られる殺虫性糸状菌の生存安定性及び製剤の沈降性に優れた殺虫性糸状菌製剤及び当該殺虫性糸状菌製剤を用いた殺虫方法等を提供することができる。
Claims (8)
- ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する殺虫性糸状菌、ポリカルボン酸型界面活性剤、及び、水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンを含有することを特徴とする殺虫性糸状菌製剤。
- 製剤の全重量に対して、ポリカルボン酸型界面活性剤を５重量％以上３０重量％以下、及び、水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンを２０重量％以上６５重量％未満含有することを特徴とする請求項１記載の殺虫性糸状菌製剤。
- 殺虫性糸状菌が下記のいずれかの糸状菌であることを特徴とする請求項１記載の殺虫性糸状菌製剤。
（１）核の５．８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号１で示される塩基配列を有し、かつ、核の２８ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号２で示される塩基配列を有する糸状菌。
（２）ペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）に属する糸状菌。
（３）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８６１として寄託されているペーシロマイセス・テヌイペス（Paecilomyces tenuipes）Ｔ１菌株である糸状菌。 - ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する殺虫性糸状菌が、次の〔殺虫性糸状菌確認方法〕により選抜できるペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する糸状菌である請求項１又は２記載の殺虫性糸状菌製剤。
〔殺虫性糸状菌確認方法〕
１．ペーシロマイセス属に属する糸状菌を固体培地で２５℃で培養する。
２．形成された分生子を１×１０ ８ cfu／mlとなるように滅菌水に懸濁する。
３．該ペーシロマイセス属に属する糸状菌の分離源となった死亡虫と同種の昆虫１０頭を懸濁液に３０秒間浸漬する。
４．浸漬した昆虫を２５℃、湿度１００％の条件下で飼育し、接種後６日後に死亡虫が観察される菌株を、ペーシロマイセス属に属する殺虫性糸状菌として選抜する。 - ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する糸状菌が、次の〔糸状菌選抜方法〕により選抜されるペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する糸状菌である請求項４記載の殺虫性糸状菌製剤。
〔糸状菌選抜方法〕
１．体が硬化し、体からキノコ状のものが生えている死亡虫を野外から採取する。
２．当該死亡虫に形成されている分生子を白金耳で触れ、固体培地に線を引くように擦りつける。
３．２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しい固体培地に移植し、さらに２５℃で培養する。
４．生育してきた菌について、以下のア）〜ク）に記載された性質をもつ菌株を、ペーシロマイセス属に属する糸状菌として選抜する。
ア）栄養菌糸が隔壁を持つ
イ）有性生殖が認められない。
ウ）分生子は分生子殻と呼ばれる壺上の器官の中に作られるのではなく、外生する。
エ）分生子はフィアライド頂端にフィアロ型に形成され、乾燥し連鎖状をなす。
オ）分生子柄は先端に小のうを持たない。
カ）フィアライドは分生子柄束上に柵状に配列されない。
キ）分生子の連鎖は束をなさない。
ク）フィアライドは頸部が明瞭、不規則あるいは緩く輪生である。 - ポリカルボン酸型界面活性剤が、(a)イソブチレン若しくはジイソブチレンと(b)マレイン酸との共重合物又はその塩からなるポリカルボン酸型界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の殺虫性糸状菌製剤。
- 請求項１〜６のいずれか記載の製剤を、害虫、害虫の生育場所又は害虫から保護するべき植物に施用することを特徴とする殺虫方法。
- ポリカルボン酸型界面活性剤及び水に溶解するか若しくは水により糊化するデンプンと、ペーシロマイセス（Paecilomyces）属に属する殺虫性糸状菌とを混合する工程を有することを特徴とする殺虫性糸状菌製剤の製造方法。
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