JP4468144B2 - ５’−リボヌクレオチド高含有酵母エキスおよびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、５’−リボヌクレオチド高含有酵母エキスおよびその製造方法に関する。

酵母エキスは天然調味料として広く利用されており、呈味性を向上させるために、５’−リボヌクレオチドの含量を高めた５’−リボヌクレオチド高含有酵母エキスやその製造方法が種々提案されている。例えば、特許文献１には、核酸含量の高い酵母菌体を用い、予め酵母菌体のリボヌクレアーゼを加熱失活させた後、ＲＮＡおよびエキス分をｐＨ８〜１２の範囲で抽出し、ついで５’−ホスフォジエステラーゼおよび５’−アデニル酸デアミナーゼを作用させ５’−ヌクレオチドを合わせて１４重量％以上含有させる方法が開示されている。特許文献２には、酵母懸濁液をＲＮＡが抽出され易いアルカリ条件で、ＲＮＡが非呈味性ヌクレオチドに分解されない温度で、尚且つ他成分の抽出を抑えるために短時間で抽出工程を終了させた後、５’−ホスフォジエステラーゼおよび５’−アデニル酸デアミナーゼを作用させ、５’−グアニル酸および５’−イノシン酸を各々８重量％以上、且つペプチドおよび遊離アミノ酸をあわせて１６重量％以上含有させる方法が開示されている。また、特許文献３には、酸性水溶液で処理（ｐＨ２〜５、３０〜９０℃、１０〜６０分間）した酵母菌体を水中に懸濁し、ＲＮＡおよびエキス分を抽出した後、５’−ホスフォジエステラーゼおよびデアミナーゼを作用させる、５’−グアニル酸、５’−イノシン酸、５’−シチジル酸、５’−ウリジル酸をそれぞれ１０重量％以上含有した、５’−ヌクレオチド高含有酵母エキスの製造方法が開示されている。
特公平７−９３８７１号公報 特許第２６０４３０６号明細書 特開２００２−１０１８４６号公報

本発明は、５’−リボヌクレオチドとアミノ酸含量を従来のものよりもさらに高めた、呈味性のより向上した酵母エキスおよびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、酵母エキスの５’−リボヌクレオチドとアミノ酸含量を高めるために鋭意検討を重ねた結果、食用酵母の酸性水溶液処理と、遠心分離後の沈殿物の水洗浄、放線菌産生酵素類での処理を組み合わせることにより、従来の酵母エキスよりも、５’−リボヌクレオチドおよびアミノ酸含量を遥かに高めた高品質の酵母エキスを得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）５’−イノシン酸と５’−グアニル酸を合わせて２４重量％以上（ナトリウム塩水和物として）、ペプチドを２０重量％以上、およびペプチドと遊離アミノ酸を合わせて２８重量％以上含有することを特徴とする５’−リボヌクレオチド高含有酵母エキス、
（２）５’−イノシン酸および５’−グアニル酸を各々１２重量％以上（ナトリウム塩水和物として）含有する上記（１）記載の酵母エキス、
（３）食用酵母を酸性水溶液で処理し、遠心分離し、得られた沈殿物を水で洗浄した後、放線菌産生酵素と接触させることを特徴とする上記（１）記載の５’−リボヌクレオチド高含有酵母エキスの製造方法、
（４）酸性水溶液の処理を、ｐＨ１．０〜２．０、５０〜９０℃にて、１０〜６０分間行なう上記（３）記載の製造方法、
（５）水での洗浄処理を、ｐＨ４．０〜６．０、５０〜９０℃にて、１０〜６０分間行なう上記（３）記載の製造方法、
（６）酵素反応前に、７０〜１００℃にて、１０〜６０分間加熱し、ｐＨ６．０〜８．０で放線菌産生酵素と接触させる上記（３）記載の製造方法、および
（７）得られた５´−リボヌクレオチド高含有酵母エキスを濃縮し、得られた濃縮液を５０℃以上で加温して噴霧乾燥する上記（３）記載の製造方法を提供するものである。

本発明によれば、従来のものよりも５’−リボヌクレオチドおよびアミノ酸含量が非常に高められ、呈味性が著しく改善された高品質の酵母エキスを得ることができる。

本発明の酵母エキスの原料として用いる酵母は、食用酵母であれば特に限定するものではなく、生酵母、自体公知の方法で適宜乾燥した乾燥酵母いずれでもよく、例えば、ワイン酵母、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母等が使用できる。特に、ＲＮＡ含量の高いトルラ酵母（Candida utilis）が好ましく、工業的生産性から乾燥酵母として使用することが好ましい。
本発明の酵母エキスは、ナトリウム塩水和物として、５’−イノシン酸と５’−グアニル酸を合わせて２４重量％以上、ペプチドを２０重量％以上、およびペプチドと遊離アミノ酸を合わせて２８重量％以上含有することを特徴とする。特に、５’−イノシン酸および５’−グアニル酸を各々１２重量％以上含有することが好ましい。
ここに、ペプチドは、全アミノ酸量から遊離アミノ酸量を引いた値であり、５’−リボヌクレオチド含量、全アミノ酸量、遊離アミノ酸量は後に示す方法で測定した値である。
本発明の酵母エキスは、粉末、液体、ペースト等いずれの形態でもよく、後に示す方法で測定した溶解色が１．０以下の淡色であり、粉末の場合、粗比容が２．０以下、安息角が４０度以下の流動性のよいものが好ましい。

本発明の酵母エキスは、食用酵母を酸性水溶液で処理し、遠心分離し、得られた沈殿物を水で洗浄した後、放線菌産生酵素を接触させることにより製造できる。
酵母を酸性水溶液で処理するには、原料酵母として、例えば、乾燥酵母を使用する場合、通常、５〜３０重量％、好ましくは、１０〜２０重量％の濃度で、酵母を水（例えば、イオン交換水等）に懸濁する。懸濁液の濃度が低すぎる場合は生産性の低下を招き、また、濃度が高すぎる場合は、粘度が高くなりすぎ、撹拌等が困難となる。この懸濁液を、塩酸等の酸によりｐＨ１．０〜２．０に調整し、５０〜９０℃にて、１０〜６０分間、加熱、攪拌することにより酸性水溶液処理を行なう。
ついで、常法により遠心分離してＲＮＡを含む酵母菌体の沈殿物を採取する。

得られた沈殿物を、例えば、１〜３０重量％の濃度で、再度水に懸濁し、水酸化ナトリウム等のアルカリによりｐＨ４．０〜６．０に調整し、５０〜９０℃にて、１０〜６０分間加熱、攪拌して洗浄し、再度遠心分離する。この洗浄により、５’−リボヌクレオチドが高含有化する。洗浄時の固形分濃度は低いほど効果的に高含有化できる。ここで得られた沈殿物を放線菌産生酵素と接触させて酵素処理する。

本発明で用いる放線菌産生酵素類としては、５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼおよびプロテアーゼを必須構成酵素とする酵素類が挙げられ、例えば、ストレプトミセス属に属する菌株を自体公知の方法により培養し、５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼおよびプロテアーゼを含有する培養物をそのまま、または培養濾液、菌体、菌体破砕物、これらの抽出液、その濃縮物、乾燥物等を使用することができ、あるいは公知の方法により５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼおよびプロテアーゼを必須構成酵素とする酵素類を採取し、粗製のまま、または精製酵素として用いることができる。
培養液は、嵩張ったり、腐敗防止のため冷凍保存等の対策が必要であったり、添加量が多くなることから生産現場での計量等が大変である等の問題があり、これらの問題のない工業的生産に適した乾燥酵素、特に、酵素力価を落とさず粉末化した酵素として用いることが望ましい。乾燥方法としては、品温が８０℃以下で、酵素を失活させない乾燥方法であれば、公知の例えば、恒温乾燥、減圧（真空）乾燥、凍結乾燥等いずれの方法でもよいが、凍結乾燥等が好ましい。
放線菌産生酵素類として、例えば、培養液の水溶性部分を乾燥した乾燥物を使用する場合、通常、酵母に対して、０．１〜３．０重量％程度使用する。この乾燥物換算の力価を基準として、培養液の水溶性部分を乾燥したものを適宜、水で希釈して使用することもでき、また、培養液そのものとして使用する場合は、通常、酵母に対して５．０〜５０．０重量％程度の割合で使用できる。
酵素処理は、例えば、上記の沈殿物を、５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％の濃度で水に懸濁し、アルカリでｐＨ６．０〜８．０に調整し、７０〜１００℃にて１０〜６０分間加熱後、３５℃〜６０℃、好ましくは３５〜４５℃の初期温度で、酵母固形分に対し０．１〜３．０重量％、好ましくは０．２〜２．０重量％の放線菌産生酵素類を添加し、３〜１０時間、好ましくは３〜８時間で６０〜７０℃に昇温させる。ついで同液を６０〜７０℃、好ましくは６２〜６８℃で、１〜８時間、好ましくは２〜５時間作用させる。酵素処理後、９０〜１００℃にて、１０〜６０分間加熱して、酵素を失活させ、ついで、約６０℃以下に冷却する。

得られた液は精密ろ過に付す。精密ろ過は、自体公知の方法に従って、例えば、平均孔径０．０５〜０．２μｍ、好ましくは０．１〜０．２μｍのアルミナセラミック膜を用いるマイクロフィルターで行なう。かかるアルミナセラミック膜は、例えば、日本ガイシ（株）や、ノリタケカンパニーリミテドから商業的に入手できる。また、ろ過温度は特に限定するものではない。
高分子膜材と比較して、アルミナセラミック材質の膜は膜面の細孔径分布が均一でシャープなため、高い濾過精度が得られ、高分子膜材質より耐熱、耐圧、耐磨耗性、耐塩や酸、アルカリおよびアルコール等有機溶媒耐性が遥かに優れ、高ろ過圧力運転、高粘性高スラリー液に有効であり、蒸気殺菌等が可能であって衛生的に好ましい。
かかる精密ろ過により、澄明で味、匂い、色等の外観等の優れた風味良好な所望の５’−リボヌクレオチド高含有酵母エキスを得ることができる。
所望により、精密ろ過後、ろ液の固形分濃度を１０〜５０重量％、好ましくは３０〜４０重量％に濃縮してもよい。濃縮方法は特に限定するものではなく、例えば、常圧加熱濃縮、減圧過熱濃縮、冷凍濃縮等の公知の濃縮方法が採用できる。さらに、公知の方法により、乾燥、粉末化してもよい。特に、５０℃以上に加温して噴霧乾燥することが、濃縮液のゲル化防止法として好ましい。

本発明の５’−リボヌクレオチド高含有酵母エキスは、公知の酵母エキスと同様に使用することができ、例えば、得られた酵母エキスを農産加工食品（野菜、果実、穀物等の加工品を含む）、水産加工食品（魚介類、海藻等の加工品を含む）、畜産加工食品（畜肉・卵・乳製品等の加工品を含む）、だし・つゆ・ソース・醤油・みそ、あらゆる合わせ調味料等に使用することができる。

以下の実施例および試験例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、特に断らない限り、「％」は重量％を意味する。
以下の実施例および試験例において、固形分濃度は、食品衛生検査指針 理化学編 厚生省監修 社団法人日本食品衛生協会（１９９１年）の試験法 １．水分（３）乾燥助剤法に従って、１０５℃３時間で水分を測定し、１００から測定水分を差し引いて算出した。
食塩濃度は、衛生試験法注解 日本薬学会編 金原出版（１９９０年）（１０）塩素イオン１）モール法により測定した。
全窒素量はミクロケルダール法により測定した。また、全窒素量に６．２５を乗じてタンパク質量とした。
ＲＮＡ含量は、試料を適宜蒸留水で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、社団法人 日本化学会編、生化学実験講座２、核酸の化学Ｉ−分離精製−、６〜８頁（１９７５年、株式会社 東京化学同人発行）に記載のSchmidt-Thannhauser-Schneider法で測定した。
５’−ヌクレオチド含量は、試料を適宜蒸留水で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーＬ５０２０型で測定した。なお、カラムはDevelosil ODS-UG5（野村化学製）、検出は、２５４ｎｍで行い、移動相液は、８５％リン酸１３ｍｌとリン酸一カリウム０．３４ｇを蒸留水で溶かし１Ｌにメスアップしたものを使用した。
全アミノ酸は、試料（タンパク質５ｍｇに相当）を２０％塩酸１ｍｌと共に耐熱性ガラス容器に入れ、密栓して、１１０℃、２０時間加水分解した後、エバポレーターで塩酸を除去し、以下の遊離アミノ酸の測定と同様にして測定した。
遊離アミノ酸は、試料を適宜蒸留水で希釈し、最終希釈はpＨ２のクエン酸緩衝液で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μm）で濾過して調製した検液を、島津製作所製高速液体クロマトグラフィーＬＣ−１０アミノ酸分析システムを使用して測定した。
溶解色は、試料を固形分１％水溶液となるように蒸留水で希釈し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、分光光度計で測定波長４４０ｎｍ、１ｃｍセルにて測定した。
比容は、試料をメスシリンダーに漏斗で静かに投入し、投入した試料の重量および容積を測定し、単位重量当たりの容積で表した。

トルラ酵母（Candida utilis）（ＲＮＡ１１％）の１０％懸濁液を３６％塩酸でｐＨ１．７に調整し、６０℃で１０分間加熱した。これを遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物に水を加えて８％懸濁液とし、３０％ＮａＯＨでｐＨ５．０に調整し、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物の１０％懸濁液を９０℃で１０分間加熱後、３０％ＮａＯＨでｐＨ７．７に調整し、放線菌産生酵素類乾燥粉末を加え、４０℃から６５℃で１２時間保持した。反応終了後、９０℃で１０分間加熱し、６０℃に冷却した。反応終了液をろ過し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮液を６０℃に保温して、噴霧乾燥機で乾燥し、粉末を得た。
得られた酵母エキスの成分分析値を表１に示す。

トルラ酵母（Candida utilis）（ＲＮＡ１１％）の１０％懸濁液を３６％塩酸でｐＨ１．７に調整し、６０℃で１０分間加熱した。これを遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物に水を加えて２％懸濁液とし、３０％ＮａＯＨでｐＨ５．０に調整し、９０℃で３０分間加熱した後、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物の１０％懸濁液を３０％ＮａＯＨでｐＨ７．７に調整し、放線菌産生酵素類乾燥粉末を加え、４０℃から６５℃で１２時間保持した。反応終了後、９０℃で１０分間加熱し、６０℃に冷却した。反応終了液をろ過し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮液を６０℃に保温して、噴霧乾燥機で乾燥し、粉末を得た。
得られた酵母エキスの成分分析値を表２に示す。

試験例１

５’−リボヌクレオチド含有酵母エキスの洗浄処理条件の検討（１）
トルラ酵母（Candida utilis）（ＲＮＡ１１％）の１０％懸濁液を３６％塩酸でｐＨ１．７に調整し、６０℃で１０分間加熱した。これを遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物に水を加えて、２％懸濁液としたもの（試験区Ａ）、２％懸濁液とした後、９０℃で３０分間加熱したもの（試験区Ｂ）、および２％懸濁液とした後、ｐＨ５．０に調整し、９０℃で３０分間加熱したもの（試験区Ｃ）をそれぞれ遠心分離して沈殿物を得た。これら沈殿物の１０％懸濁液を調製し、試験区Ａのみ９０℃で１０分間加熱した。各試験区の１０％懸濁液を３０％ＮａＯＨでｐＨ７．７に調整し、放線菌産生酵素類乾燥粉末を加え、４０℃から６５℃で１２時間保持した。反応終了後、９０℃で１０分間加熱し、６０℃に冷却した。反応終了液を遠心分離して得られた上清中の固形あたりの５’−リボヌクレオチド含量を測定した結果、表３のとおりであった。沈殿物の２％懸濁液をｐＨ調整、加熱処理した試験区Ｃが最も５’−リボヌクレオチド含量が高かった。

※: ５’−イノシン酸および５’−グアニル酸

試験例２

５’−リボヌクレオチド含有酵母エキス洗浄処理条件の検討（２）
トルラ酵母（Candida utilis）（ＲＮＡ１１％）の１０％懸濁液を３６％塩酸でｐＨ１．７に調整し、６０℃で１０分間加熱した。これを遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物に水を加えて、２％懸濁液とし、ｐＨ３〜７に調整後、加熱処理と非加熱処理を行い、それぞれ遠心分離して沈殿物を得た。これら沈殿物の１０％懸濁液を調製し、非加熱処理区のみ９０℃で１０分間加熱した。その後、各１０％懸濁液を３０％ＮａＯＨでｐＨ７．７に調整し、放線菌産生酵素類乾燥粉末を加え、４０℃から６５℃で１２時間保持した。反応終了後、９０℃で１０分間加熱し、６０℃に冷却した。
反応終了液を遠心分離して得られた上清中の固形あたりの５´−リボヌクレオチド含量を測定した。
結果を図１に示す。
図１に示すごとく、ｐＨ５および６に調整し、且つ加熱したものが最も５’−リボヌクレオチド含量（図中ＩＧ含量）が高かった。

試験例３

５’−リボヌクレオチド含有酵母エキス洗浄処理条件の検討（３）
トルラ酵母（Candida utilis）の１０％懸濁液を３６％塩酸でｐＨ１．７に調整し、６０℃で１０分間加熱した。これを遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物に水を加えて、２〜８％懸濁液とし、ｐＨ５に調整後、９０℃で３０分間加熱後、それぞれ遠心分離して沈殿物を得た。これら沈殿物の１０％懸濁液を３０％ＮａＯＨでｐＨ７．７に調整し、放線菌産生酵素類乾燥粉末を加え、４０℃から６５℃で１２時間保持した。反応終了後、９０℃で１０分間加熱し、６０℃に冷却した。
反応終了液を遠心分離して得られた上清中の固形あたりの５´−リボヌクレオチド含量を測定した。
結果を図２に示す。
図２に示すとおり、懸濁濃度が低い程、５’−リボヌクレオチド含量（図中ＩＧ含量）が高くなった。

以上記載したごとく、本発明によれば、５’−リボヌクレオチドおよびアミノ酸含量の非常に高い、呈味性の著しく改善された酵母エキスを得ることができる。

試験例２における洗浄処理ｐＨとＩＧ含量の関係を示すグラフである。 試験例３における洗浄処理における酵母懸濁濃度とＩＧ含量の関係を示すグラフである。

Claims (5)

1. 食用酵母を酸性水溶液で処理し、遠心分離し、得られた沈殿物をｐＨ４．０〜６．０の条件下で水で洗浄した後、放線菌産生酵素と接触させることを特徴とする、５’−イノシン酸と５’−グアニル酸を合わせて２４重量％以上（ナトリウム塩水和物として）、ペプチドを２０重量％以上、およびペプチドと遊離アミノ酸を合わせて２８重量％以上含有する酵母エキスの製造方法。
2. 酸性水溶液の処理を、ｐＨ１．０〜２．０、５０〜９０℃にて、１０〜６０分間行なう請求項１記載の製造方法。
3. 水での洗浄処理を、５０〜９０℃にて、１０〜６０分間行なう請求項１記載の製造方法。
4. 酵素反応前に、７０〜１００℃にて、１０〜６０分間加熱し、ｐＨ６．０〜８．０で放線菌産生酵素と接触させる請求項１記載の製造方法。
5. 得られた５´−リボヌクレオチド高含有酵母エキスを濃縮し、得られた濃縮液を５０℃以上で加温して噴霧乾燥する請求項１記載の製造方法。

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