JP4222094B2

JP4222094B2 - 膜上固相化物の抽出方法及び装置

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Publication number: JP4222094B2
Application number: JP2003130940A
Authority: JP
Inventors: 信博花房
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2003-05-09
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2023-05-09
Also published as: JP2004333343A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はタンパク質やペプチドなどの生体分子が展開して固相化された媒体からその生体分子を抽出して分析装置の試料として供するための抽出方法とその装置に関するものである。
このような生体分子の分析は、化学、工業、臨床、バイオ分野その他の分野で広く利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
電気泳動、薄層クロマトグラフィーなどの分析方法によりゲルに展開されたタンパク質などの生体分子は、目的とする領域をゲルごと切り出し、消化液により消化して分析装置の試料としている（特許文献１参照。）。しかし、ゲルを切り出すには少なくとも数ミリメートル程度の大きさが必要であるため、更に小さい領域について分析を行うことができない。
【０００３】
そこで、ゲルに展開された試料分子をメンブレンに転写して固相化し、そのメンブレン上の分析しようとする領域に消化液を微量吐出して消化した後、その位置にマトリクス溶液を吐出し、ＭＡＬＤＩ（マトリクス支援レーザーイオン化）−ＭＳ（質量分析）により直接に質量分析することが行なわれている。これをケミカルプリンター方式と呼んでいる。
【０００４】
【特許文献１】
特表２００１−５０４９３８号公報
【特許文献２】
ＷＯ９８／４７００６号公開公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ケミカルプリンター方式によれば、メンブレンの表面上に保持されているタンパク質などの生体分子はＭＡＬＤＩ−ＭＳにより検出することができるが、膜の内部に保持された試料分子はイオン化するためのレーザー光が膜の内部までは当らないため、イオン化しにくく、質量分析では検出することができない。また、仮にイオン化できたとしても、表面に保持されている試料分子と内部に保持されている試料分子とでは検出器に到達する時間にずれが生じ、質量数にずれが生じて正確な測定が困難になる。
【０００６】
また、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）−ＭＳ分析という方法もあるが、この場合にはメンブレンに保持された試料分子をメンブレンとともに切り取り、溶液状態の試料とする必要がある。
【０００７】
そこで、本発明はＭＡＬＤＩ−ＭＳやＥＳＩ−ＭＳなどの分析装置の試料として溶液状態で得ることができるようにするとともに、生体分子の試料を保持した媒体を切り取ることを不要にし、微小な領域の試料でも抽出できるようにすることを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の抽出方法は、膜上に固相化された目的生体分子を抽出する方法であり、
（Ａ）生体分子の固相化物を保持した媒体上で抽出しようとする固相化物領域を指定する工程、
（Ｂ）先端に使い捨て可能なディスポーサブルチップが取り付けられた分注器のノズル先端の前記媒体に対する平面内方向及び垂直方向の位置をそれぞれ光センサーにより検出してそのノズル先端位置を補正する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で補正されたノズル先端位置を基にしてそのノズルを工程（Ａ）で指定した固相化物領域に移動する工程、及び
（Ｄ）その固相化物領域に抽出液を分注し、抽出液に溶解した生体分子を抽出液とともにそのノズルにより吸引する工程を備え、
工程（Ｄ）での抽出液分注と抽出液吸引をノズル先端と前記媒体とが抽出液の液滴を介して接触する状態で行なうとともに、そのノズル位置の状態において同じ抽出液による吐出と吸引を複数回繰り返す抽出方法である。
【０００９】
ここで、本発明が対象とする生体分子とは、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、糖、脂質など生体高分子を意味している。
本発明では、固相化物を抽出液により溶解して吸引するので、生体分子の試料を保持した媒体を切り取る必要がなく、溶液状態で得ることができる。その抽出液は媒体上に分注しノズルにより吸引するので、微小な領域の試料でも抽出できる。
【００１０】
抽出液の分注位置精度としては、媒体に対して平面内のＸ方向、ｙ方向、及び高さ方向のＺ方向に対してそれぞれ数十μｍ以下が要求されることがある。本発明では、分注器のノズル先端位置をセンサーにより検出してそのノズル先端位置を補正するようにしているので、必要な分注位置精度を満たすのが容易になる。
【００１１】
この方法を実施するために、本発明の膜上固相化物抽出装置は、生体分子の固相化物を保持した媒体を支持する保持台と、前記媒体上での固相化物領域の位置を特定する読取り装置と、先端に使い捨て可能なディスポーサブルチップを取り付ける形式のノズルを備え、そのノズルにより、前記媒体上に抽出液を分注するとともに、分注された抽出液を吸引する分注・吸引機構と、前記ノズルの先端の前記媒体に対する平面内方向及び垂直方向の位置の基準位置をそれぞれ検出する光センサーと、前記媒体に対するノズルの位置決めを行う位置決め機構と、前記読取り装置により位置が特定された固相化物領域を指定することができ、前記光センサーにより検出された基準位置を基にして、指定された固相化物領域への前記ノズルの位置決めを制御するとともに、前記分注・吸引機構による抽出液分注動作と抽出液吸引動作を制御する制御装置とを備えている。制御装置はノズル先端と前記媒体とが抽出液の液滴を介して接触するようにノズルを位置決めした状態において同じ抽出液による分注と吸引を複数回繰り返すように分注・吸引機構による抽出液分注動作と抽出液吸引動作を制御する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
工程（Ｄ）の抽出液吐出と抽出液吸引をノズル先端と媒体とが抽出液の液滴を介して接触する状態で行なうようにすれば、操作が簡単で正確に抽出できるようになる。抽出液の吐出と吸引を複数回繰り返すことにより、短時間で抽出を行なうことができるようになる。
【００１３】
目的とする生体分子がタンパク質のような巨大高分子で、その構造解析を目的としているような場合には、その生体分子をそのままで抽出するよりも消化してペプチドやアミノ酸に分解したものを試料とする方が好都合な場合がある。そのような場合には、工程（Ｄ）の抽出液分注に先立って、抽出しようとする生体分子を消化するために、媒体上の指定した領域に消化液を分注する工程を設けることが好ましい。
【００１４】
また、媒体が疎水性である場合には、指定した領域の媒体中に抽出液や消化液が浸透していくのを容易にするために、工程（Ｄ）の抽出液分注に先立って、又は抽出液分注に先立って消化液を分注する場合にはその消化液分注に先立って、指定した領域の媒体上にに界面活性剤を分注する工程を設けることが好ましい。
【００１５】
抽出しようとする目的生体分子間の汚染を防ぐためには、ノズルは先端に使い捨て可能なディスポーザブルチップを取り付ける形式のものであることが好ましい。ディスポーザブルチップを取り付けたノズル先端の位置精度は、媒体に対して平面内のＸ方向、Ｙ方向、及び高さ方向のＺ方向に対してそれぞれ数百μｍと大きくずれることがある。しかし、本発明ではディスポーザブルチップを取り付けたノズルであっても、ディスポーザブルチップを取り付けた状態のノズル先端位置をセンサーにより検出してそのノズル先端位置を補正するので、必要な分注位置精度を満たすのが容易になる。
【００１６】
抽出装置に、制御装置が、媒体の種類、面積、抽出液の分注量、抽出液の液性、及び抽出液分注時のノズル先端と媒体との距離のうち、少なくとも１つを含む抽出条件を保持するデータベースを備え、そのデータベースに保持された抽出条件に基づいて分注・吸引機構の位置決め、分注・吸引機構による抽出液分注動作及び抽出液吸引動作を制御するものとすれば、操作性が向上する。
【００１７】
抽出液の分注に先立って消化液を分注できるようにするためには、好ましい態様の抽出装置は、媒体上に消化液を分注する消化液分注機構をさらに備え、制御装置は媒体に対する消化液分注機構の位置決めと消化液分注動作も制御するものとすることができる。
【００１８】
以下に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
図１は一実施例の抽出装置を概略的に表したものである。
２は保持台で、その上に生体分子の固相化物を保持した媒体であるメンブレン４を固定して支持する。メンブレン４への試料の固相化は、ゲルその他の泳動媒体に試料を展開させた後、メンブレン４に転写することにより行なうことができる。このような固相化に使用されるメンブレンの材質としては、ＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）、ニトロセルロース、ナイロン（登録商標）又はその派生物等を挙げることができる。いま、例えば、メンブレン４上に生体試料としてタンパク質スポットが電気泳動ゲルから転写されて固相化され、色素により染色されて可視化されているものとする。
【００１９】
保持台２上のメンブレン４上で可視化されたタンパク質スポットの位置を特定するために、保持台２の上方には読取り装置としてＣＣＤカメラ６が設置されている。ＣＣＤカメラ６に替えてスキャナなど、他の読取り装置を設置してもよい。ＣＣＤカメラ６により読み取られたメンブレン４上の画像データは、制御部であるパーソナルコンピュータ（ＰＣ）８に取り込まれ、そのモニターに表示される。モニターへの表示画面の一例は、図２に示すようなものであり、取り込まれたタンパク質スポットの画像がモニター画面１０中に表示される。パーソナルコンピュータ８ではそのモニター画面１０上に表示されたスポットＡ上にカーソルを移動し、入力することにより抽出しようとするタンパク質スポットを指定することができる。
【００２０】
媒体４上に消化液を分注するために、消化液分注機構の吐出ヘッド１２が保持台２の上方に配置されている。吐出ヘッド１２としては、ピエゾ素子を備えたヘッドで微量の液を吐出できる機構を備えたものを使用し（特許文献２参照。）、微量の消化液をメンブレン４上に吐出することができるようになっている。吐出ヘッド１２はメンブレン４上方で水平面内のＸ，Ｙ方向に移動して位置決めすることができるように、位置決め機構（図示略）に支持されており、８により制御されてメンブレン４上の指定されたスポット位置に位置決めされる。１４はヘッド１２からの消化液の吐出を制御する消化液分注制御部であり、パーソナルコンピュータ８により指定されたタンパク質スポットに所定量の消化液を分注する。
【００２１】
メンブレン４上の指定されたタンパク質スポット上に抽出液を分注し、分注した抽出液を再び吸引するために分注・吸引機構のノズルを備えたプローブ１６が保持台２の上方に設置されている。プローブ１６は抽出液の分注機構と吸引機構を兼ねたものである。プローブ１６のノズルの先端には使い捨て可能なディスポーザブルチップ１８が着脱可能に装着される。ディスポーザブルチップ１８としては、チップ内部にフィルタや担体を保持したものであってもよく、そのような部材を保持していないものであってもよい。プローブ１６は位置決め機構に支持されており、その位置決め機構はＰＣ８により制御されてプローブ１６をメンブレン４上方で水平面内のＸ，Ｙ方向に移動させてメンブレン４上の指定されたスポット位置に位置決めする機構（図示略）と、プローブ１６を上下方向（Ｚ軸方向）に移動させてプローブ１６から所定の高さの位置に位置決めするＺ軸方向位置決め機構を備えている。Ｚ軸方向位置決め機構は駆動モーター２０を備え、Ｚ軸制御部２２により駆動モーター２０の駆動が制御されて高さ方向の位置決めがなされる。
【００２２】
プローブ１６のノズルの基準位置をディスポーザブルチップ１８が装着された状態で検出するためにセンサー３２が保持第２の近傍に配置されている。センサー３２としては、図３に示されるように、水平面内のＸ方向とＹ方向、及び高さ方向のＺ方向の３方向の位置を検出するように、３つのセンサー３２ｘ，３２ｙ及び３２ｚが配置されている。これらのセンサー３２ｘ，３２ｙ及び３２ｚの好ましい例としては、ホトインタラプタなどの光によるセンサーを用いることができる。ノズルの先端（チップ１８が装着されているときはチップ１８の先端）がセンサー３２ｘを通過することによりノズル先端のＸ軸での基準位置が検出され、センサー３２ｙを通過することによりノズル先端のＹ軸での基準位置が検出され、センサー３２ｚを通過することによりノズル先端のＺ軸での基準位置が検出される。それらのセンサー３２ｘ，３２ｙ及び３２ｚによる検出値はパーソナルコンピュータ８に取り込まれ、ノズル先端の基準位置が補正される。パーソナルコンピュータ８はその補正したノズル先端の基準位置を基にして、指定された固相化物領域へのノズルの位置決めを制御する。
【００２３】
プローブ１６から抽出液を分注し、その分注した抽出液を吸引するために、プローブ１６にはシリンジポンプ２４が接続されている。シリンジポンプ２４の駆動はシリンジ分注制御部２６によりシリンジポンプ２４のモーター２７を介して制御される。
【００２４】
２８はデータベースであり、使用するメンブレンの種類、面積、抽出液の分注量、抽出液の液性、及び抽出液分注時のノズル先端とメンブレンとの距離のうち、少なくとも１つを含む抽出条件を保持している。パーソナルコンピュータ８は、データベース２８に保持された抽出条件に基づいて、プローブ１６による抽出液分注動作及び吸引動作を制御する。
パーソナルコンピュータ８は、読取り装置６により位置が特定された固相化物領域を指定することができ、センサー３２により検出された基準位置を基にして、指定された固相化物領域へのノズルの位置決めを制御するとともに、分注・吸引機構による抽出液分注動作と抽出液吸引動作を制御する制御装置を実現している。
【００２５】
この実施例の装置で、メンブレン４に固相化された試料スポットを抽出する際には、プローブ１６が、指定されたスポットの位置に移動し、所定の距離まで下降する。このときの高さは、図４に示されるように、プローブ１６のノズルに付けられたチップ１８の先端とメンブレン４の間に抽出液の液滴３０が介在してその液滴３０を介してチップ１８とメンブレン４が接触する状態になる高さであり、例えばチップ１８の先端とメンブレン４の間の距離が１ｍｍあるいはそれ以下というような微小な間隔に保たれる。その状態で、抽出液の液滴３０をチップ１８から分注し、その液滴３０がチップ１８の先端とメンブレン４に接触した状態で抽出液の吐出と吸引の動作を複数回繰り返す。これにより抽出液に溶解したメンブレン４中の生体分子がチップ１８内に吸引される。このとき抽出する対象のメンブレン４の種類、その面積、抽出液の分注量、抽出液の液性、抽出液分注時のノズル先端とメンブレンとの距離などはパラメータとしてデータベース２８にデータベース化されて保持されており、抽出したい条件、例えばＰＶＤＦ膜に固相化された試料を抽出液１μＬ（マイクロリットル）で抽出するというように、条件を入力することによって、最適な抽出制御がなされる。チップ１８に吸引された抽出液は、質量分析用のプレートに吐出され、続いてマトリクス溶液がその抽出液状に吐出された後、乾燥させられることにより、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の試料となる。また、抽出された抽出液はＥＳＩ−ＭＳ分析の試料としても使用することができる。
【００２６】
実施例では、保持台２が固定されていて、ヘッド１２やプローブ１６が保持台２の上方でＸ，Ｙ方向に移動するようにしているが、ヘッド１２やプローブ１６のＸ，Ｙ位置を固定しておき、保持台２をＸ，Ｙ方向に移動するＸ−Ｙステージとしてもよい。
【００２７】
この実施例の装置を用いて、タンパク質試料を消化した後に抽出する動作について具体的に説明するが、もちろんこれは一例にすぎず、本発明の用途を限定するものではない。ここでは、メンブレン４として疎水性のＰＶＤＦ膜を使用するため、ウエッティング液として界面活性剤をメンブレン４の所定位置に吐出する。そのための吐出ヘッドは図１には記載されていないが、消化液用の吐出ヘッド１２と同様のピエゾ素子を備えたヘッドで微量の液を吐出できる機構を備えたものを使用する。
【００２８】
（１）電気泳動によりゲルに展開したタンパク質が転写されて固相化されたＰＶＤＦ膜からなるメンブレン４を保持台２に固定する。メンブレン４上のタンパク質スポットは、Direct Blue 71色素により染色し可視化しておく。ＣＣＤカメラ６により、その可視化されたタンパク質プロットが画像として取り込まれるので、抽出しようとするタンパク質スポットをＰＣモニター部１０で指定する。
【００２９】
（２）指定されたタンパク質スポットの位置にウエッティング液用の吐出ヘッドが移動し、各タンパク質スポットにｎＬ（ナノリットル）レベルのウエッティング液を吐出する。ウエッティング液としては、５０％のメタノール水溶液にポリビニルピロリドンが１％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるように溶解した溶液を使用する。ウエッティング液用の吐出ヘッドから吐出される１つの液滴は約１００ｐＬ（ピコリットル）であり、それを同じ場所に７０滴吐出することにより、各タンパク質スポットに約７ｎＬずつのウエッティング液を吐出する。
【００３０】
（３）次に、ウエッティング液が吐出されたタンパク質スポットの位置に消化液用ヘッド１２が移動し、消化液としてトリプシン溶液を吐出する。トリプシン溶液としては、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム水溶液にトリプシンが２００μｇ／ｍＬの濃度となるように溶解した溶液を使用する。このヘッド１２による１液滴量も１００ｐＬであり、それを同じ場所に２０滴（約２ｎＬ）吐出する動作を２５回繰り返し、消化液量として約５０ｎＬを分注する。
【００３１】
（４）指定された全てのタンパク質スポットに消化液が分注された後、メンブレン４を水で湿らせたペーパータオルとともに容器に密封した湿潤条件で、３７℃で３時間インキュベートする。
【００３２】
（５）その後、そのメンブレン４を保持台２に戻し、抽出しようとするタンパク質スポットに抽出液として１μＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液をプローブ１６のノズル先端のチップ１８から分注し、図４に示した状態で吐出と吸引を複数回繰り返えす。タンパク質スポットではタンパク質が消化液により消化されてペプチドとなっており、抽出液に溶解してチップ１８に吸引される。
このとき、ノズル先端のチップ１８の位置決めを正確に行なうようにするために、チップ１８の先端の基準位置がセンサー３２で検出され、その検出値によりチップ１８の先端位置が補正される。
チップ１８に吸引した抽出液は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳターゲットプレートへ吐出する。
【００３３】
（６）そのプレート上に吐出された抽出ペプチド液に、１μＬのマトリクス溶液を添加する。マトリクス溶液としては５０％アセトニトリル水溶液にα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させ、ＴＦＡが０．０５％になるように含んだ溶液を使用する。
【００３４】
（７）抽出ペプチド液とマトリクス液を乾燥させた後、そのプレートをＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置に装着し、分析を行なう。
【００３５】
【発明の効果】
本発明では、生体分子の固相化物を保持した媒体上で抽出しようとする固相化物領域を指定し、その指定した領域に抽出液をノズルにより分注し、抽出液に溶解した生体分子を抽出液とともにそのノズルにより吸引するようにしたので、生体分子の試料を保持した媒体を切り取る必要がなく、溶液状態で得ることができる。その際、ノズルはセンサーにより基準位置が検出されて補正され、正確に位置決めされるので、微小な領域の試料でも抽出できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】抽出装置の一実施例を示すブロック図である。
【図２】同実施例におけるモニター画面の例を示す正面図である。
【図３】同実施例におけるセンサーを示す斜視図である。
【図４】同実施例における抽出動作を示すノズル部分の正面図である。
【符号の説明】
２保持台
４メンブレン
６ＣＣＤカメラ
８パーソナルコンピュータ
１０モニター画面
１２消化液用吐出ヘッド
１４消化液分注制御部
１６プローブ
１８ディスポーザブルチップ
２２Ｚ軸制御部
２４シリンジポンプ
２６シリンジ分注制御部
２８データベース
３２，３２ｘ，３２ｙ，３２ｚセンサー

Claims

膜上に固相化された目的生体分子を抽出する方法において、
（Ａ）生体分子の固相化物を保持した媒体上で抽出しようとする固相化物領域を指定する工程、
（Ｂ）先端に使い捨て可能なディスポーサブルチップが取り付けられた分注器のノズル先端の前記媒体に対する平面内方向及び垂直方向の位置をそれぞれ光センサーにより検出してそのノズル先端位置を補正する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で補正されたノズル先端位置を基にしてそのノズルを工程（Ａ）で指定した固相化物領域に移動する工程、及び
（Ｄ）その固相化物領域に抽出液を分注し、抽出液に溶解した生体分子を抽出液とともにそのノズルにより吸引する工程を備え、
工程（Ｄ）での抽出液分注と抽出液吸引をノズル先端と前記媒体とが抽出液の液滴を介して接触する状態で行なうとともに、そのノズル位置の状態において同じ抽出液による分注と吸引を複数回繰り返すことを特徴とする抽出方法。
工程（Ｄ）の抽出液分注に先立って、抽出しようとする生体分子を消化するために、指定した前記領域に消化液を分注する請求項１に記載の抽出方法。
前記媒体が疎水性であり、工程（Ｄ）の抽出液分注に先立って、又は抽出液分注に先立って消化液を分注する場合にはその消化液分注に先立って、指定した前記領域に界面活性剤を分注する請求項１又は２に記載の抽出方法。
生体分子の固相化物を保持した媒体を支持する保持台と、
前記媒体上での固相化物領域の位置を特定する読取り装置と、
先端に使い捨て可能なディスポーサブルチップを取り付ける形式のノズルを備え、そのノズルにより、前記媒体上に抽出液を分注するとともに、分注された抽出液を吸引する分注・吸引機構と、
前記ノズルの先端の前記媒体に対する平面内方向及び垂直方向の位置の基準位置をそれぞれ検出する光センサーと、
前記媒体に対するノズルの位置決めを行う位置決め機構と、
前記読取り装置により位置が特定された固相化物領域を指定することができ、前記光センサーにより検出された基準位置を基にして、指定された固相化物領域への前記ノズルの位置決めを制御するとともに、前記分注・吸引機構による抽出液分注動作と抽出液吸引動作を制御する制御装置とを備え、
前記制御装置はノズル先端と前記媒体とが抽出液の液滴を介して接触するようにノズルを位置決めした状態において同じ抽出液による分注と吸引を複数回繰り返すように前記分注・吸引機構による抽出液分注動作と抽出液吸引動作を制御するものであることを特徴とする膜上固相化物の抽出装置。
前記制御装置は、前記媒体の種類、面積、抽出液の分注量、抽出液の液性、及び抽出液分注時の前記ノズル先端と媒体との距離のうち、少なくとも１つを含む抽出条件を保持するデータベースを備え、そのデータベースに保持された抽出条件に基づいて前記ノズルの位置決め、前記分注・吸引機構による抽出液分注動作及び抽出液吸引動作を制御するものである請求項４に記載の抽出装置。
前記媒体上に消化液を分注する消化液分注機構をさらに備え、前記制御装置は前記媒体に対する前記消化液分注機構の位置決めと消化液分注動作も制御するものである請求項４又は５に記載の抽出装置。