JP4191253B2 - バイオフィルムの酵素的処理方法 - Google Patents
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Description
本発明は、バイオフィルム層で覆われた表面を洗浄及び消毒する方法、及び、その方法に用いる洗浄及び／又は消毒用組成物に関する。
発明の背景
栄養が限られた生物環境では、細菌が表面に吸着し、バイオフィルムを形成し始める傾向が強い。バイオフィルムとは、表面に吸着し、有機高分子マトリックス内に入り込んだ微生物の群落である。栄養が限られた天然及び産業上の生物環境では、バイオフィルムの細胞が優勢になり、水道管及び船底での流体の摩擦抵抗（付着物）が増える、熱交換器からの熱の移動が減る、金属基盤が腐食する、そして食品及び生物技術産業で汚染が起こるなどの問題を引き起こす。バイオフィルムは、医療の研究及び産業においても、歯垢、内視鏡及びコンタクトレンズの汚染、人工装具上のコロニー形成、並びに医用移植物上のバイオフィルム形成などの深刻な問題を引き起こす。
バイオフィルムマトリックスとは、水流路と生物群を含んでいる微小コロニー、並びに細胞外ポリマー（多糖、糖タンパク質、タンパク質）の集まりである。細菌の細胞外多糖は、特にグルコース、フコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ピルビン酸、マンヌロン酸又はグルクロン酸を基にした複合体のホモ又はヘテロ多糖から成る。糖間の異なった結合から、多数の異なった多糖、例えばレバン、ポリマンノース、デキストラン、セルロース、アミロペクチン、グリコーゲン及びアルギン酸塩ができる。
バイオフィルム内で増殖した細菌は、浮遊性の細胞に比べて、抗生物質及び殺菌剤に対する耐性がより強く、そしてこの耐性は、バイオフィルムの経過年齢に連れて強くなる。細菌性のバイオフィルムは、乾燥、極端な温度、及び光に対する物理的耐性も強い。前記載通りに、バイオフィルム形成は、産業、環境及び医療上の問題を引き起こし、そして薬品による細菌性バイオフィルムの洗浄及び消毒が困難であることは、多くの産業において、主要な関心事項である。更に、より穏和な消毒及び洗浄用組成物を求める傾向が流行しているので、バイオフィルムに覆われている表面の不十分な洗浄が増加していると思われる。
本発明の目的は、表面上に存在するバイオフィルム及び生きている細菌細胞を除去する効率及び環境安全性の高い方法を提供することである。
本発明の要約
驚くことに、表面からバイオフィルムを除去するか、又は遊離させること、及び生きている微生物細胞を殺すことが、各々できる少なくとも２つの異なる酵素を用いて酵素処理することで、表面上に存在するバイオフィルムを除去及び消毒できることが判った。
従って、本発明は、少なくとも部分的にバイオフィルム層で覆われた表面を洗浄及び消毒する方法であって、
ａ．その表面からバイオフィルム層を、完全又は部分的に除去するか、又は遊離させる効果がある量の１つ以上のヒドロラーゼを含んでいる洗浄用組成物に、そのバイオフィルムを接触させる過程；及び、
ｂ．そのバイオフィルムに存在する生きている細菌細胞を殺す効果がある量のオキシドレダクターゼを含んでいる殺菌性消毒用組成物に、そのバイオフィルムを接触させる過程、
を連続的に、又は同時に含んで成る前記方法に関する。
更に、本発明は、洗浄及び／又は消毒用酵素組成物、並びに、バイオフィルム被覆表面を洗浄又は消毒するために、前記組成物を用いることに関する。
非常に効率良く洗浄及び消毒することができ、同時に、非攻撃性、非有害性、非毒性、及び環境親和性を示すことから、純粋に酵素的な本発明の方法は有利である。
発明の詳細な説明
本明細書の「洗浄」とは、希望しない物質、例えばバイオフィルム、を完全又は部分的に除去することを意味する。この除去は、酵素の触媒作用によるバイオフィルムの部分又は完全分解を介して起こる。
本明細書の「消毒」とは、生きている微生物細胞、すなわち細菌、真菌又は酵母細胞を殺す能力を意味する。
本明細書の「殺菌性」とは、細菌細胞を殺す能力を意味する。
「表面」
本明細書の「表面」は、バイオフィルム層によって覆われ得る任意の表面を意味する。表面の例には、任意の硬質な表面、例えば金属、プラスティック、ゴム、板、ガラス、木材、コンクリート、岩、大理石、石膏及びセラミック、又は場合によって塗料、エナメルでコーティングされた前記物質；任意の軟質な表面、例えば任意の種類の線維（糸、布地、食物線維、ロックウール、髪など）；有孔性の表面；人間又は動物の皮膚；ケラチン性物質（爪など）がある。前記の硬質な表面は、冷却塔、水処理施設、乳製品又は食物加工工場、化学薬品又は医薬品工場の処理装置に存在する。前記の有孔性の表面は、フィルター、例えば膜フィルターに存在する。従って、本発明の組成物及び方法は、従来の現場洗浄（cleaning-in-place，C-I-P）系においても有用である。
「バイオフィルム」
バイオフィルムは、多数の異なる微生物を含んでいるか、又は、特定の微生物を優勢な微生物として含んでいる。
本発明の好ましい実施形態としては、処理するバイオフィルムは、望ましくない細胞、好ましくはシュードモナス属、スタフィロコッカス属、アエロモナス属の細菌、又は腸内細菌科の細菌（例えば大腸菌）の中から選択された生きた細菌が優勢であるか、又は特徴である。
「酵素」
本発明の好ましい実施形態としては、使用するヒドロラーゼは、グルコシダーゼ、すなわち、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、βグルコシダーゼ）、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、ペクチナーゼ（アラビナナーゼ、αアラビノフラノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ）、アミラーゼ；プロテアーゼ；及びリパーゼの群中から選択される。
使用するヒドロラーゼは、もし既知であれば、除去する特定のバイオフィルムの特性に従って、選択されるか、あるいは異なった酵素活性を有する複数のヒドロラーゼの組み合わせを用いることもできる。
バイオフィルムを分解する特定の酵素の例には、1,2-1,3-α-D-マンナン マンノヒドロラーゼ、1,3-β-D-キシラン キシラノヒドロラーゼ、1,3-β-D-グルカン グルカノヒドロラーゼ、1,3（1,3;1,4）-α-D-グルカン 3-グルカノヒドロラーゼ、1,3（1,3;1,4）-β-D-グルカン 3（4）-グルカノヒドロラーゼ、1,3-1,4-α-D-グルカン 4-グルカノヒドロラーゼ、1,4-α-D-グルカン グルカノヒドロラーゼ、1,4-α-D-グルカン グルコヒドロラーゼ、1,4-（1,3；1,4）-β-D-グルカン 4-グルカノヒドロラーゼ、1,4-β-D-グルカン グルコヒドロラーゼ、1,4-β-D-キシラン キシラノヒドロラーゼ、1,4-β-D-マンナン マンナノヒドロラーゼ、1,5-α-L-アラビナン 1,5-α-L-アラビナノヒドロラーゼ、1,4-α-D-グルカン マルトヒドロラーゼ、1,6-α-D-グルカン 6-グルカノヒドロラーゼ、2,6-β-D-フルクタン フルクタノヒドロラーゼ、α-デキストリン 6-グルカノヒドロラーゼ、α-D-ガラクトシド ガラクトヒドロラーゼ、α-D-グルコシド グルコヒドロラーゼ、α-D-マンノシド マンノヒドロラーゼ、アシルニューラミニル ヒドロラーゼ、アエロバクタの多糖包 ガラクトヒドロラーゼ、β-D-フルクトフラノシド フルクトヒドロラーゼ、β-D-フコシド フコヒドロラーゼ、β-D-フルクタン フルクトヒドロラーゼ、β-D-ガラクトシド ガラクトヒドロラーゼ、β-D-グルコシド グルコヒドロラーゼ、β-D-グルクロノシド グルクロノソヒドロラーゼ、β-D-マンノシド マンノヒドロラーゼ、β-N-アセチル-D-ヘキソサミニド N-アセチルヘキソサミノヒドロラーゼ、セルロース-スルフェート スルホヒドロラーゼ、コラゲナーゼ、デキストリン 6-α-D-グルカノヒドロラーゼ、グリコプロテイン-ホスファチジルイノシトール ホスファチドヒドロラーゼ、ヒアルロネート 4-グリカノヒドロラーゼ、ヒアルロノグルクロニダーゼ、ペクチン ペクチルヒドロラーゼ、ペプチドグリカン N-アセチルムラモイルヒドロラーゼ、ホスファチジルコリン 2-アシルヒドロラーゼ、ホスファチジルコリン 1-アシルヒドロラーゼ、ポリ（1,4-α-D-ガラクツロニド）、ポリ（1,4-（N-アセチル-β-D-グルコサミニド））-グリカノヒドロラーゼ、プロテアーゼ、スクロース α-グルコシダーゼ、トリアシルグリセロール アシルヒドロラーゼ、トリアシルグリセロール プロテイン-アシルヒドロラーゼがある。
本発明の方法に有効な加水分解酵素は、実際の使用条件においてタンパク質分解活性を有する任意の酵素である。従って、本酵素には、植物に由来するタンパク質分解酵素、例えばパパイン、ブロメライン、フィシン；動物に由来するタンパク質分解酵素、例えばトリプシン及びキモトリプシン；あるいは、微生物、すなわち細菌、真菌又は酵母に由来するタンパク質分解酵素がある。本発明の方法では、多種類のタンパク質分解酵素の混合物を用いることができる。
本発明の好ましい実施形態としては、前記タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、又はアスパラギン酸プロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素で、その活性部位にセリン残基が必須である。これは、ジイソプロピルフルオロリン酸で阻害されるが、メタロプロテアーゼとは異なり、エチレンジアミノ四酢酸（EDTA）には耐性を示す（しかし、これは、高温でカルシウムイオンによって安定化する）。これは、単純な末端エステルを加水分解し、その活性は、セリンプロテアーゼである真核生物のキモトリプシンに似ている。より狭い意味の用語で、サブグループを表す「アルカリ性プロテアーゼ」は、至適pHが高い、pH9.0-11.0であるセリンプロテアーゼを意味する。セリンプロテアーゼは、一般に、アルカリ性のpH範囲で、最大のタンパク質加水分解活性を示すが、メタロプロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼは、普通、各々、中性及び酸性のpH範囲で、最大のタンパク質加水分解活性を示す。
セリンプロテアーゼのサブグループの１つにスブチリシンがある。スブチリシンは、グラム陽性細菌又は酵母が生産するセリンプロテアーゼである。多くのスブチリシンのアミノ酸配列が決定されている。これには、バチルス属の株に由来する少なくとも６つのスブチリシン、すなわちスブチリシン168、スブチリシンBPN、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシン・アミロサッカリチカス、及びメセンテリコ（mesenterico）ペプチダーゼ；放線菌類由来のスブチリシン、サーモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）由来のサーミターゼ（thermitase）；並びに、真菌由来のスブチリシン、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテイナーゼKがある。スブチリシンの更なるサブグループとして、スブチラーゼが最近認められた。スブチラーゼは、高度にアルカリ性のスブチリシンのことであり、これには、スブチリシンPB92（MAXACAL▲Ｒ▼,Gist-Brocades NV）、スブチリシン309（SAVINASE▲Ｒ▼,Novo Nordisk A/S）、及びスブチリシン124（ESPERASE▲Ｒ▼,Novo Nordisk A/S）がある。
本発明の記載では、スブチリシン変異体、又は変異スブチリシンプロテアーゼとは、起源となる親遺伝子を有し、その親酵素を生産する親微生物に由来する変異遺伝子であって、適当な宿主で発現させた時に、変異スブチリシンプロテアーゼが生産される様に親遺伝子を変異させた変異遺伝子を発現する生物によって生産されるスブチリシンを意味する。前記のスブチリシン及びこれの変異体は、本発明の方法に有効なプロテアーゼのクラスとして好ましい。有効なスブチリシン変異体の例には、195番目のグリシンがフェニルアラニンに置換された（G195F，195Gly to 195Phe）スブチリシン309（SAVINASE▲Ｒ▼）の変異体がある。
都合が良いことに、従来の発酵で生産された市販プロテアーゼが有効である。この市販プロテアーゼの例には、Alcalase▲Ｒ▼（バチルス・リシェニホルミス（B.licheniformis）の菌体の液体発酵による）、Rennilase▲Ｒ▼（ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）の非病原性菌体の液体発酵による）、Savinase▲Ｒ▼（遺伝子修飾したバチルス属菌体の液体発酵による）、例えば国際特許出願WO92/19729で開示された変異体、及びDurazym▲Ｒ▼（タンパク質工学的に修飾したSavinase▲Ｒ▼の変異体）がある。前記の全市販プロテアーゼは、Novo Nordisk A/S（DK-2880 Bagsvaerd,Denmark）によって生産及び販売されている。他の好ましいセリンプロテアーゼは、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）属、アスペルギルス属、リゾプス（Rhizopus）属、バチルス・アルカロフィルス（B.alcalophilus）、B.セレウス（B.cereus）、N.ナット（N.natto）、B.ブルガツス（B.vulgatus）、B.ミコイデ（B.mycoide）由来のプロテアーゼ、並びにバチルス属由来のスブチリン、特に、ノカルジオプシス属の菌種及びノカルジオプシス・ダソンビレイ（N.dassonvillei）由来のプロテアーゼ、例えば国際特許出願公報WO88/03947に開示されたもの、特に、ノカルジオプシス属の菌種NRRL18262、及びN.ダソンビレイNRRL18133由来のプロテアーゼである。更に他の好ましいプロテアーゼは、国際特許出願PCT/DK89/00002及び国際特許出願公報WO91/00345に開示されたバチルス属のスブチリンの変異体に由来するセリンプロテアーゼ、並びにEP415296に開示されたプロテアーゼである。
別の好ましいプロテアーゼのクラスは、微生物由来のメタロプロテアーゼである。都合が良いことに、従来の発酵で生産された市販プロテアーゼが有効である。この市販プロテアーゼの例は、Neutrase▲Ｒ▼（Zn）（バチルス・スブチリスの菌体の液体発酵による）であり、これはNovo Nordisk A/S（DK-2880 Bagsvaerd,Denmark）によって生産及び販売されている。
他の有効な市販プロテアーゼ製品には、Bactosol▲Ｒ▼WO及びBactosol▲Ｒ▼SI（Sandoz AG，Basle,Switzerland）；Toyozyme▲Ｒ▼（Toyo Boseki Co.Ltd.,Japan）；及び、プロテイナーゼK▲Ｒ▼（Kao Co.Ltd.,Japan）（バチルス属菌種KSM-K16の液体発酵による）がある。
本発明の方法に有効な別の加水分解酵素は、微生物のリパーゼである。このリパーゼには、カンジダ（Candida）などの酵母のリパーゼ、シュードモナス又はバチルスなどの細菌のリパーゼ、あるいはヒュミコラ（Humicora）又はリゾムコール（Rhizomucor）などの真菌のリパーゼがある。より詳しく記載すると、適当なリパーゼには、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ（EP238023の記載通りに調製される）、サーモミセス・ラヌギノサ（Thermomyces lanuginosa）のリパーゼ（EP305216の記載通りに調製され、商品名LipolaseTMとしてNovo Nordiskから市販されている）、ヒュミコラ・インソレンス（H.insolens）のリパーゼ、シュードモナス・スツトゼリ（P.stutzeri）のリパーゼ、シュードモナス・セパキア（P.cepacia）のリパーゼ、カンジダ・アンタルクチカ（C.antarctica）のリパーゼA又はB、あるいは、rGPL、アブシジア・ブラケスレエナ（Absidia blakesleena）、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、ペニシリウム・シクロピウム（Penicillum cyclopium）、ペニシリウム・クルストスム（Penicillum crustosum）、ペニシリウム・エクソパンスム（Penicillum expansum）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、チアロスポレラ・ファセオリナ（Thiarosporella phaseolina）、リゾプス・ミクロスポルス（Rhizopus microsporus）、スポロボロミセス・シバタヌス（Sporobolomyces shibatanus）、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、ジオトリクム・ペニシラツム（Geotricum penicillatum）、ラクトバチルス・クルバツス（Lactobacillus curvatus）、ブロコトリクス・サーモソハタ（Brochothrix thermosohata）、コプリヌス・シネリウス（Coprinus cinerius）、トリコデルマ・ハルザニウム（Trichoderma harzanium）、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）、リゾプス・ヤポニクス（Rhizopus japonicus）またはシュードモナス・プランタリ（Pseudomonas plantari）からのリパーゼがある。適当なリパーゼの他の例には、例えばWO92/05249又はWO93/11254に記載されている様に、前記リパーゼの変異体がある。
本発明の方法に有効なアミラーゼの例には、バチルス属のアミラーゼ、例えば、B.ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）、B.アミロリクエフェイシェンス（B.amyloliquefaciens）、B.スブチリス（subtilis）、又はB.リシェニホルミス（B.licheniformis）のアミラーゼ（例えば、商品名TermamylとしてNovo Nordiskから市販されている）、あるいは、アスペルギルス属のアミラーゼ、例えば、A.ニガー（A.niger）又はA.オリザエ（A.oryzae）のアミラーゼがある。適当なアミラーゼの他の例には、例えば、US5093257，EP252666，WO91/00353，FR2676456，EP285123，EP525610，PCT/DK93/00230に記載されている様に、前記アミラーゼの変異体がある。
別の有効な加水分解酵素は、セルラーゼ又はセルロース分解酵素であり、これは、セルロースからグルコース、セロビオース、トリオース及び他のセロ−オリゴ糖への分解を触媒する酵素を意味する。セルラーゼは、好ましくは、エンドグルカナーゼであり、より好ましくは、微生物のエンドグルカナーゼであり、特に、細菌又は真菌のエンドグルカナーゼである。細菌のエンドグルカナーゼの例は、シュードモナス属の細菌、又はバチルス・ラウツス（B.lautus）に由来するか、又はそれらで生産され得るエンドグルカナーゼである。
前記セルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、酸性、中性又はアルカリ性域で、各々最大のセルロース分解活性を示す酸性、中性又はアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼである。従って、有効なセルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、酸性条件で実質的なセルロース分解活性を示す酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、好ましくは、真菌の酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、より好ましくは、トリコデルマ（Trichoderma）、アクチノミセス、ミロテキウム（Myrothecium）、アスペルギルス、及びボトリチス（Botrytis）属に属する真菌に由来するか、又はそれらで生産され得る真菌の酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼである。
好ましい有効な酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、トリコデルマ・ビリデ（T.viride）、トリコデルマ・レセイ（T.reesei）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（T.longibrachiatum）、ミロテキウム・ベルカリア（M.verrucaria）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、及びボトリチス・シネレア（B.cinerea）の菌種の中の真菌に由来するか、又はそれらで生産され得るものである。
他の有効なセルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、中性又はアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、好ましくは、真菌の中性又はアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、より好ましくは、アスペルギルス、ペニシリウム、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ヒュミコラ、イルペクス（Irpex）、フサリウム（Fusarium）、スタチボトリス（Stachybotrys）、スコプラリオプシス（Scopulariopsis）、チャエトミウム（Chaetomium）、ミコゴネ（Mycogone）、ベルチキリウム（Verticillium）、ミロテキウム（Myrothecium）、パプロスポラ（Papulospora）、グリオクラジウム（Gliocladium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）及びアクレモニウム（Acremonium）属の中の真菌に由来するか、又はそれらで生産され、アルカリ性条件で実質的なセルロース分解活性を示すアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼである。
好ましいアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、ヒュミコラ・インソレンス、フサリウム・オキシスポルム（F.oxysporum）、ミセリオフトラ・サーモフィル（M.thermophile）、又はセファロスポリウムの菌種の中の真菌、好ましくは、ヒュミコラ・インソレンスDSM1800、フサリウム・オキシスポルムDSM2672、ミセリオフトラ・サーモフィルCBS117.65、又はセファロスポリウム菌種RYM-202の菌種の中の真菌に由来するか、又はそれらで生産され得るものである。
本発明の方法に有効なキシラナーゼの例には、ヒュミコラ・インソレンス（WO92/17573）、アスペルギルス・アクレアツス（A.aculeatus）（アスペルギルス・アクレアツスCBS101.43から精製されたキシラナーゼに対する抗体と免疫反応する、キシラナーゼ活性を有する酵素、WO94/21785）、バチルス・プミルス（B.pumilus）（WO92/03540）、バチルス・ステアロサーモフィルス（WO91/18976，WO91/10724）、バチルス菌種AC13（特に菌体NCIMB40482，WO94/01532）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム及びチャイニア菌種（EP0353342A1）、トリコデルマ・アウランチアクス（T.aurantiacus）（US4966850）、トリコデルマ・ハルジアヌム（T.harzianum）及びトリコデルマ・レセイ（US4725544）、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）（EP0373107A2）、サーモミセス・ラヌギノサス（T.lanuginosus）（EP0456033A2）、バチルス・シルクランス（B.circulans）（WO91/18978）、アスペルギルス・オリゼ（SU4610007）、サーモモノスポラ・フスカ（Thermomonospora fusca）（EP0473545A2）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）（WO93/03155）、ストレプトミセス・ビリドスポルス（S.viridosporus）（EP496671A1）、バチルス・リシェニホルミス（JP9213868）、並びに、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（W.J.J. van den Tweel et al.（Eds.）,”Stability of Enzymes”,Proceedings of an International Symposium heeled in Maastricht，The Netherlands,22-25 November 1992，Fisk.R.S. and Simpson，pp.323-328）の菌種の中から；あるいは、サーモトガ（Thermotoga）（WO93/19171）、ロドサームス（Rhodothermus）（WO93/08275）、ジクチオグロムス（Dictyoglomus）（WO92/18612）及びストレプトミセス（US5116746）の属の中から、選択される菌体によって生産されるか、又は生産され得るキシラン分解（xylanolytic）酵素活性を有する酵素がある。適当なキシラナーゼの他の例には、キシラン分解酵素活性を有する前記酵素の変異体（誘導体又は相同体）がある。
有効なペクチナーゼには、ポリガラクツロナーゼ（EC3.2.1.15）、ペクチンエステラーゼ（EC3.2.1.11）、ペクチンリアーゼ（EC4.2.2.10）及びヘミセルラーゼ、例えばエンド-1,3-b-キシロシダーゼ（EC3.2.1.32）、キシラン-1,4-b-キシロシダーゼ（EC3.2.1.37）及びa-L-アラビノフラノシダーゼ（EC3.2.1.55）の酵素分類に属する酵素がある。ペクチナーゼの起源生物は、アスペルギルス・ニガーが好ましい。
好ましい実施形態としては、本洗浄用組成物は、真菌アスペルギルス・アクレアツスの菌体、好ましくはアスペルギルス・アクレアツスCBS101.43によって生産される加水分解酵素混合物を含んでいる。この菌体は、ペクトース分解性（pectolytic）、及び広範囲のヘミセルロース分解性の酵素活性を含んでいる酵素混合物を生産することが知られている。
本ヒドロラーゼは、本洗浄用組成物中に、約0.01〜約5000μgタンパク質／ml組成物の量で、好ましくは約１〜約500μgタンパク質／ml組成物の量で存在する。
本明細書で使われる用語「オキシドレダクターゼ」は、酵素命名法（1992）に従ってEC1.に分類される酵素、すなわち、EC1.1（供与体のCH-OH基に作用する）、EC1.2（供与体のアルデヒド又はオキソ基に作用する）、EC1.3（供与体のCH-CH基に作用する）、EC1.4（供与体のCH-NH2基に作用する）、EC1.5（供与体のCH-NH基に作用する）、EC1.6（NADH又はNADPHに作用する）、EC1.7（供与体としての他の含窒素化合物に作用する）、EC1.8（供与体のイオウ基に作用する）、EC1.9（供与体のヘム基に作用する）、EC1.10（供与体としてのジフェノール又は関連物質に作用する）、EC1.11（受容体としてのペルオキシドに作用する）、EC1.12（供与体としての水素に作用する）、EC1.13（酸素分子を有する単一供与体に作用する、オキシゲナーゼ）、EC1.14（酸素分子を有する対供与体に作用する）、EC1.15（受容体としてのスーパーオキシドラジカルに作用する）、EC1.16（金属イオンを酸化する）、EC1.17（供与体-CH2-の基に作用する）、EC1.18（供与体としてのフェレドキシンに作用する）、EC1.19（供与体としての還元型フラボドキシンに作用する）、EC1.97（その他のオキシドレダクターゼ）に分類される任意の酵素を意味する。
好ましくは、本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びラッカーゼの中から、好ましくは、グルコースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、コプリヌス（Coprinus）のペルオキシダーゼ、及びハロペルオキシダーゼの中から選択される。
ラッカーゼは、酸素で基質を酸化する反応を触媒する酵素であり、微生物、植物及び動物に由来するものが知られている。より詳しくは、ラッカーゼ（EC1.10.3.2）は、電子受容体としての酸素分子と共に機能するオキシドレダクターゼである。大気からの酸素分子は、通常十分な量で存在しているので、普通は、反応媒体に余分な酸素を追加する必要はない。本発明の組成物に有効なラッカーゼ酵素の例には、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）の菌体IFO 30116由来のラッカーゼ、又はコプリヌス・シネレウスIFO 30116由来のラッカーゼと免疫特性が同一なラッカーゼ；あるいは、ミセリオフトラ・サーモフィルの菌体由来のラッカーゼ（WO91/05839）がある。
有効なペルオキシダーゼは、好ましくは、植物（例えば、西洋ワサビ又はダイズのペルオキシダーゼ）、あるいは、真菌又は細菌などの微生物によって生産されるものである。好ましい真菌は、不完全菌亜門、不完全糸状菌綱に属する菌体、例えば、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、トリコデルマ（Tricoderma）、ミロテキウム（Myrothecium）、ベルチキルム（Verticillum）、アルスロミセス（Arthromyces）、カルダリオミセス（Caldariomyces）、ウロクラジウム（Ulocladium）、エムベリシア（Embellisia）、クラドスポリウム（Cladosporium）またはドレシュレラ（Dreschlera）、特に、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（DSM 2672）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマ・レシ（Trichoderma resii）、ミロテキウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）（IFO 6113）、ベルチキルム・アルボアツルム（Verticillum alboatrum）、ベルチキルム・ダリエ（Verticillum dahlie）、アルスロミセス・ラモスス（Arthromyces ramosus）（FERM P-7754）、カルダリオミセス・フマゴ（Caldariomyces fumago）、ウロクラジウム・チャータルム（Ulocladium chartarum）、エムベリシア・アリ（Embellisia alli）またはドレシュレラ・ハロデス（Dreschlera halodes）である。他の好ましい真菌は、担子菌亜門、担子菌綱に属する菌体、例えば、コプリヌス（Coprinus）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、コリオルス（Coriolus）またはトラメテス（Trametes）、特に、コプリヌス・シネレウスf.ミクロスポルス（Coprinus cinereus f.microsporus）（IFO 8371）、コプリヌス・マクロルヒズス（Coprinus macrorhizus、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）（例えば（NA-12））またはトラメテス（Trametes）（以前はポリポルス（Polyporus））、例えばT.ベルシコロル（T.versicolor）（例えばPR428-A）である。更に他の好ましい真菌は、接合菌亜門、ケカビ科に属する菌体、例えば、リゾプス又はムコール属、特にムコール・ヒエマリス（M.hiemalis）である。好ましい細菌は、放線菌目の菌体、例えば、ストレプトミセス・スフェロイド（S.spheroides）（ATCC23965）、ストレプトミセス・サーモビオラセウス（S.thermoviolaceus）（IFO12382）又はストレプトベルチキルム・ベルチキルム亜種ベルチキルム（Streptoeverticillum verticillum ssp.verticillum）である。他の好ましい細菌は、バチルス・プミルス（ATCC12905）、バチルス・ステアロサーモフィルス、ロドバクタ・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドモナス・パルストリ（Rhodomonas palustri）、ストレプトコッカス・ラクチス（S.lactis）、シュードモナス・プルロキニア（P.purrocinia）（ATCC15958）又はシュードモナス・フルオレッセンス（NRRL B-11）である。更に他の好ましい細菌は、ミクソコッカスに属する菌体、例えば、M.ビレセンス（M.virescens）である。
本発明の記載において、ペルオキシダーゼ活性を有する化合物は、ペルオキシダーゼ酵素、及び、シトクローム、ヘモグロビン又はペルオキシダーゼ酵素に由来するペルオキシダーゼ活性を有する断片、並びに、それらの合成又は半合成の誘導体、例えば、鉄ポルフィリン及び鉄フタロシアニン、更にそれらの誘導体を含んでいる。
一般に、本発明の方法に用いられる酵素は、単一成分（組換え）酵素、すなわち他のタンパク質又は酵素タンパク質が本質的に含まれない酵素でよい。当分野で標準的な方法に従って、組換え酵素をクローン化して、発現させることができる。しかし、本酵素は、酵素調製品の形で、場合によっては、主要な酵素成分として希望する酵素活性を示す酵素が豊富な酵素調製品、例えば、単一酵素の調製品の形で、用いることができる。
特に、組換えによって生産されるペルオキダーゼは、コプリヌス属の菌種、特にC.マクロルヒズス又はC.シネレウス由来のペルオキシダーゼ（WO92/16634）、あるいはその変異体、例えば、WO94/12621に記載された変異体である。しかし、コプリヌス属に属する菌体、好ましくは、C.シネレウス又はC.マクロルヒズスの菌種、より好ましくは、C.シネレウスIFO8371又はIFO30114を通常通りに発酵させて、このペルオキシダーゼを生産することもできる。
ペルオキシダーゼと組み合わせて、電子供与体として作用し得る促進剤を用いることが好ましい。この有効な促進剤の例を以下に記す。
A.水溶液中で、変換のために十分な時間及び条件で、ペルオキシダーゼに接触させると、酵素的にヨー素に変換されるヨー化物イオンの供与源。本内容では、ヨー化物イオンの好ましい供与源は、水溶性のヨー化物塩、例えば、アルカリ金属のヨー化物塩、例えば、ヨー化カリウム（KI）、ヨー化ナトリウム（NaI）又はヨー化リチウム、ヨー化アンモニウム、ヨー化カルシウムである。ヨー化ナトリウム及びヨー化カリウムが好ましい。
B.別の好ましい促進剤は、チオシアン酸塩イオン（SCN-）の供与源、例えば、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、及びその他のチオシアン酸塩であり、好ましくは、チオシアン酸ナトリウム及びチオシアン酸カリウムである。
C.別の有効な促進剤は、次式で表す化合物である：
（式中、Xは、-O-又は-S-であり；
置換基R1-R9は、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、以下の基：水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、スルファモイル、ニトロ、アミノ、フェニル、C1C14-アルキル、C1-C5-アルコキシ、カルボニル-C1-C5-アルキル、アリール-C1-C5-アルキルのいずれかであり、前記カルバモイル、スルファモイル、及びアミノ基は未置換であるか、あるいは置換基R10で１又は２回置換されてもよく、前記フェニルは未置換であるか、あるいは１個以上の置換基R10で置換されてもよく、前記C1-C14-アルキル、C1-C5-アルコキシ、カルボニル-C1-C5-アルキル、及びアリール-C1-C5-アルキル基は、飽和又は不飽和、分枝状又は非分枝状であってよく、更に未置換であるか、あるいは１個以上の置換基R10で置換されてもよく；
前記置換基R10は、以下の基：ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、スルファモイル、ニトロ、アミノ、フェニル、アミノアルキル、ピペリジノ、ピペラジニル、ピロリジン-1-イル、C1-C5-アルキル、C1-C5-アルコキシのいずれかであり、前記カルバモイル、スルファモイル、及びアミノ基は未置換であるか、あるいはヒドロキシ、C1-C5-アルキル、C1-C5-アルコキシで１又は２回置換されてもよく、前記フェニルは１個以上の以下の置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、並びにスルファモイルで置換されてもよく、前記C1-C5-アルキル、及びC1-C5-アルコキシ基は、飽和又は不飽和、分枝状又は非分枝状であってよく、更に以下の置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、並びにスルファモイルのいずれかで１又は２回置換されてもよく；
あるいは、前記式中で、置換基R1-R9の中の２つが共同に-B-基を形成してもよく、Bは、以下の基：（-CHR10-N=N-），（-CH=CH-）n，（-CH=N-）n又は（-N=CR10-NR11-）のいずれかであり、nは、１〜３の整数であり、R10は、前記定義の置換基であり、R11は、R10と同じに定義され；
前記式中に２個以上の置換基R10が含まれる場合には、それらの置換基R10は、同一であってもよく、又は異なってもよい）。
特定の実施例としては、前記促進剤は、10-メチルフェノチアジン、フェノチアジン-10-プロピオン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドフェノチアジン-10-プロピオン酸塩、10-エチルフェノチアジン-4-カルボン酸、10-エチルフェノチアジン、10-プロピルフェノチアジン、10-イソプロピルフェノチアジン、メチルフェノチアジン-10-プロピオン酸塩、10-フェニルフェノチアジン、10-アリルフェノチアジン、10-（3-（4-メチルピペラジン-1-イル）プロピル）フェノチアジン、10-（2-ピロリジン-1-イル-エチル）フェノチアジン、2-メトキシ-10-メチルフェノチアジン、1-メトキシ-10-メチルフェノチアジン、3-メトキシ-10-メチルフェノチアジン、3,10-ジメチルフェノチアジン、3,7,10-トリメチルフェノチアジン、10-（2-ヒドロキシエチル）フェノチナジン、10-（3-ヒドロキシプロピル）フェノチアジン、3-（2-ヒドロキシエチル）-10-メチルフェノチアジン、3-ヒドロキシメチル-10-メチルフェノチアジン、3,7-ジブロモフェノチアジン-10-プロピオン酸、フェノチアジン-10-プロピオンアミド、クロルプロマジン、2-クロロ-10-メチルフェノチアジン、2-アセチル-10-メチルフェノチアジン、10-メチルフェノキサジン、10-エチルフェノキサジン、フェノキサジン-10-プロピオン酸、10-（2-ヒドロキシエチル）フェノキサジンまたは4-カルボキシフェノキサジン-10-プロピオン酸である。
D.有効な促進剤の別の例は、次式で表す化合物である：
（式中、Aは、-D，-CH=CH-D，-CH=CH-CH=CH-D，-CH=N-D，-N=N-D，又は-N=CH-Dであり、Dは、-CO-E，-SO2-E，-N-XY，及び-N+-XYZの群中から選択され、Eは、-H，-OH，-R，又は-ORであり、X及びY及びZは、同一であっても、又は異なってもよく、そして-H及び-Rから選択され、Rは、C1-C16-アルキル、好ましくはC1-C8-アルキルであり、このアルキルは、飽和又は不飽和、分枝状又は非分枝状であってよく、場合によってはカルボキシ、スルホ又はアミノ基で置換されてもよく；
B及びCは、同一であっても、又は異なってもよく、そしてCmH2m+1（1≦m≦5）から選択される）。
好ましい実施形態としては、前記式のAは-CO-Eであり、このEは-H，-OH，-R，又は-ORであり、このRは、C1-R16-アルキル、好ましくはC1-C8-アルキルであり、このアルキルは、飽和又は不飽和、分枝状又は非分枝状であってよく、場合によってはカルボキシ、スルホ又はアミノ基で置換されてもよく；B及びCは、同一であっても、又は異なってもよく、そしてCmH2m+1（1≦m≦5）から選択される。
前記式において、Aは、ヒドロキシ基に対してパラの位置であるが、メタの位置であってもよい。
好ましい実施形態としては、この促進剤は、アセトシリンゴン（acetosyringone）、メチルシリンゲート（methylsyringate）、エチルシリンゲート、プロピルシリンゲート、ブチルシリンゲート、ヘキシルシリンゲート、又はオクチルシリンゲートである。
E.更に他の有効な促進剤は、次式で表すアジノ化合物である：
A=N-N=B
（式中、A及びBは、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、図２に示した置換基II，III，IV，及びVのいずれかであり、前記置換基において、X及びYは、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、炭素、窒素（この窒素は未置換であっても、又は置換基R5で置換されてもよく）、イオウ、酸素、セレン又はテルルであり、前記置換基において、置換基R1，R2，R3及びR4は、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルコキシ、ホルミル、カルボキシ、スルホ、ニトロ、C1-C5-アルキル（このアルキルは、飽和又は不飽和、分枝状又は直鎖状であってよく）、又はアミノ（このアミノは未置換であるか、あるいは置換基R5で１又は２回置換されてもよく）であり、置換基R5は、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルコキシ、C1-C5-アルキル、又はアミノである）。このペルオキシダーゼ促進剤は、遊離又は酸添加塩の形であってよい。
好ましい実施形態としては、置換基R1，R2，R3及びR4は、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルキル、又はスルホである。好ましくは、このハロゲンは、フルオロ、クロロ、又はブロモである。好ましくは、このC1-C3-アルキルは、メチル、エチル、プロピル、又はイソプロピルである。
好ましい実施形態としては、置換基R5は、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルコキシ、C1-C3-アルキル、又はアミノである。
最も好ましい実施形態としては、本発明のペルオキシダーゼの促進剤は、2,2’-アジノ-ビス（3-エチル-ベンゾチアゾリン-6-スルホネート）である。この化合物は、ABTSと略され、発色体基質であり、そして通常のペルオキシダーゼ及びフェノールオキシダーゼ検査用の試薬である。
既知の、そして前記の促進剤とは異なり、ABTSは、アルカリ性の強い条件、すなわちpH９超で、ペルオキシダーゼ促進剤として作用し得る。この特性のために、ABTSは、例えば、pH7-13、特にpH8-12、好ましくはpH9-11の範囲内にある洗剤用組成物に用いることができる。
本促進剤は、抗微生物性の本組成物中において、0.005-1000mmol/g基質（微生物細胞、バイオマス）、好ましくは、0.05-500mmol/g基質、より好ましくは、0.5-100mmol/g基質に対応する濃度で、含まれ得る。
任意の理論に限定されることなく、現在では、適当な水性媒体中で、本促進剤が形成するラジカルの半減期と、その効率との間には、正の相関があること、そして、この半減期は、p-ヒドロキシ桂皮酸、2,4-ジクロロフェノール、p-ヒドロキシベンゼンスルホネート、バニリン及びp-ヒドロキシ安息香酸（WO92/18683に開示されている促進剤）の中から選択された物質の半減期よりも有意に長いことが、考慮される。
このラジカルの半減期は、特に、水性媒体のpH、温度及び緩衝剤に依存するので、種々の促進剤のラジカルの半減期を比較する際には、それら全ての因子が同一であることが大事である。
本発明の消毒用組成物中のオキシドレダクターゼの量は、好ましくは、約0.01〜約1000μgタンパク質／ml組成物、より好ましくは、約10〜約100μgタンパク質／ml組成物である。オキシダーゼ及びペルオキシダーゼの場合、その量は、好ましくは、約0.01〜約100のオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ単位（GODU or PODU）／ml組成物であり、より好ましくは、約0.1〜約50単位／mlである。
「酵素単位の定義」
１グルコースオキシダーゼ単位（GODU）は、標準条件（pH5.6、30℃、20分間インキュベーション、酢酸塩緩衝液、及び基質としてのグルコース16.2g/1，90mM）で、１分間あたり１mmolの過酸化水素を形成させる酵素量である。この分析方法を記したホルダーAF266/1は、Novo Nordisk A/S,Denmarkから入手できる。このホルダーを引用して、本明細書に組み込む。
１ペルオキシダーゼ単位（PODU）は、以下の分析条件で、１分間あたり１mmolの過酸化水素への変換を触媒する酵素量である：0.88mM過酸化水素、1.67mM 2,2’-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホネート）、0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.0、30℃でのインキュベーション、418nmでの分光測定。
１ペクチナーゼ単位（PSU）は、ペクチン酸溶液の粘性を減少させる酵素量である。この活性は、以下の分析条件で、既知の75000PSU/gの基準と比較して測定する：酢酸塩緩衝液、40℃、pH4.0、1.43%ペクチン酸、及び反応時間30分。
１ラクトペルオキシダーゼ単位（LP）は、20秒間、pH6.0、20℃で、ピロガロールから、1.0mgのプルプロガリンを形成させる。標準的な測定方法は、Sigma Chemical Companyから得られる。
「組成物」
本発明の酵素組成物は、洗浄用組成物、すなわち表面からバイオフィルムを除去するか、又は遊離させることができる１つ以上のヒドロラーゼを含んでいる組成物；消毒用組成物、すなわちバイオフィルム中に存在する生きている微生物の細胞、好ましくは細菌の細胞を殺すことができるオキシドレダクターゼを含んでいる組成物；あるいは、それらの混合物、すなわちバイオフィルムによって完全又は部分的に覆われている表面を洗浄及び消毒するために有効な量のヒドロラーゼ及びオキシドレダクターゼを少なくとも含んでいる組成物である。
本発明の組成物は、更に従来の界面活性剤も含んでいる。
「方法」
本発明の方法は、用いる酵素が活性を示すpH又はpH範囲で、例えば、実際の酵素が、少なくとも約50%の相対活性、より好ましくは、少なくとも約80%の活性を有するpH範囲で、実行されることが好ましい。従って、洗浄用及び／又は消毒用組成物のpHは、4.5-11、好ましくは5-9、より好ましくは5.5-7.5の範囲にあることが好ましい。
本発明の方法は、用いる酵素が活性を示す温度又は温度範囲で、例えば、実際の酵素が、少なくとも約50%の相対活性、より好ましくは、少なくとも約80%の活性を有する温度範囲で、実行されることが好ましい。典型的には、本発明の方法は、10-60℃、好ましくは20-50℃、より好ましくは25-40℃の範囲にある（洗浄用及び／又は消毒用組成物の）温度で、実行される。
次の実施例を用いて本発明を説明する。
実施例１
シュードモナス・アエルギノサ（P.aeruginosa）ATCC10148、シュードモナス・フルオレッセンス菌体AH2（Gram et al.1990）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（S.epidermidis）DMS20042、及びスタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）ATCC25923を用いたモデル系において、バイオフィルムを増殖させた。増殖培地として、オキソイド（Oxoid）CM131からのトリプトンダイズブロス（TSB）を用いた。
４番仕上げ（磨き粉180）のAISI304型のステンレス鋼を、12X20mmの円盤に切り取った。ポリプロピレン製の円盤（12X20mm; Ral.7032,Dukadan A/S）を、中性洗剤（トライトン）中で磨いて洗浄し、オートクレーブ機にかける前に、水中でリンスした。前記円盤を、水で、次にクロロホルム、メタノール、最後にアセトン（各５ml）で洗浄し、そして、使用前に121℃で20分間オートクレーブ機にかけて滅菌した。
「バイオフィルムの成長」
滅菌した鋼又はポリプロピレンの円盤を、ビーカー内の滅菌した鋼製の架台に垂直に固定した。この架台には、培地に浸した際に、液体が自由に循環する様に、20枚までの円盤が配置される。
S.アウレウス、P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスを、TSB中で、24時間、26℃で前もって培養した。S.エピデルミジスを、TSB中で、24時間、30℃で前もって培養した。スタフィロコッカスの菌種をTSBに接種し、そしてシュードモナスの菌種（約103cfu/ml）を、滅菌水で1:5に希釈したTSBに接種した。それらの接種した培地を前記ビーカーに注ぎ、前記円盤を浸した。26℃（S.エピデルミジスの場合30℃）で、４日間以上少し撹拌して（200rpm）、円盤の両面にバイオフィルムを成長させた。
酵素処理する前に、全ての円盤を、滅菌リン酸塩緩衝液（67mM,pH7）中で１分間、無菌的にリンスして、浮遊細胞を取り除いた。
「抗微生物性酵素」
グルコースオキシダーゼ（Novo Nordisk A/S）を、電子供与体としての3g/LのD（+）グルコース（Sigma G-7528）と、過酸化水素へ還元される電子受容体としての酸素と共に用いた。
ラクトペルオキシダーゼ（Sigma Chemicals Co.）を、電子受容体としての過酸化水素と、電子供与体としての２mMチオシアン酸塩と共に用いた。
アスペルギルス・アクレアツスの菌体（Novo Nordisk）の発酵によって生産されたペクチナーゼは、プロテアーゼ活性、並びに、ペクチナーゼ、アラバナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、βグルカナーゼ及びキシラナーゼの活性を有する広範囲のカルボヒドラーゼを含んでいる市販品の多成分酵素調製品である。
「バイオフィルム細胞の酵素的な除去及び殺細胞」
酵素をリン酸塩緩衝液（pH7）で希釈し、滅菌濾過して、前記のバイオフィルムを有する円盤を含んでいる緩衝液に加えた。鋼及びポリプロピレン製の円盤を、酵素と共に20℃で15分間、撹拌しないでインキュベーションした。両円盤の基体に対して、コントロールとして、添加酵素を含まない滅菌緩衝液を用いた。酵素処理後に、これらの基体を、滅菌緩衝液で穏やかに１回リンスし、その後、細胞を染色してから顕微鏡観察するか、又は電導度測定して計数した。
グルコースオキシダーゼ及びラクトペルオキシダーゼの殺菌活性は、S.アウレウス、S.エピデルミジス、P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスの浮遊細胞で決定した。成長したバイオフィルムからの浮遊細胞を、67mMリン酸塩緩衝液（pH7.0）で1:9に希釈し、そして20℃で15分間、グルコースオキシダーゼ（0，5，10 GODU/ml）及びラクトペルオキシダーゼ（0，1，5 U/ml）と混合した。浮遊細胞に対する殺菌活性は、その細胞縣濁液１mlをMalthusのチューブに接種して評価した。
「バイオフィルムの評価」
蛍光顕微鏡：テトラゾリウム塩、5-シアノ-2,3-ジトリルテトラゾリウムクロリド（CTC）（Polysciences,Inc.,Warrington,PA）を、濾過滅菌した蒸留水に溶解した（10mM）。CTCを、細胞の生存性の指標として用いた。CTCの水溶液は、ほとんど無色で、蛍光がないが、それの対応するホルマザン生成物は、420nmで励起すると、約620nmの赤色範囲の蛍光を発する。DNA結合性蛍光発色団DAPI（4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Sigma D-9542）を、総細胞数の指標として用いた。バイオフィルムの細胞をCTCで染色した後に、DAPIで染色することで、同一のサンプルで、呼吸している細胞数及び総細胞数を計数することができる（30）。
酵素処理後に、バイオフィルムを有する円盤を、暗所で、45分間、20℃で、トリプトース・リン酸塩ブロス（TPB）及びCTC-テトラゾリウム塩（12.5mM）と共にインキュベーションした。このCTC染色の最後の５分間に、DAPI（3mM）を加えた。200Wの水銀バーナーが付いているOlympusのモデルBX50顕微鏡を用いて、x100の油浸蛍光対物レンズで、染色された細胞を調べた。CTCで染色された細胞を観察するために、480-550nmの励起フィルターと590nmの遮断フィルター（Olympusの立体モデルU-MSWG）を組み合わせて用いた。DAPIで染色された細胞を観察するために、330-385nmの励起フィルターと420nmの遮断フィルター（Olympusの立体モデルU-MWU）を用いた。
電導度の測定：前記の円盤基体に接着している細胞数を計数する場合、間接的なMalthusによる測定を利用した（Johnston & Jones,1995）。酵素処理後に、この円盤を、酵素処理に用いたものと同じ緩衝液でリンスして、外側チューブに３mlの培地を含み、内側チューブに0.5mlの0.1M KOHを含んでいるMalthusのチューブに移した（Dezenclos et al.1994）。P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスを検出するための培地として、TSBを用いて、S.アウレウス及びストレプトコッカス・ミュータンス（Strep.mutans）を検出するために、BHIを用いた。チューブを、Malthus2000（Malthus Flexi 2000，Malthus Instrument Ltd.）に配置して、37℃でインキュベーションした。ただし、P.フルオレッセンスのサンプルは25℃でインキュベーションした。
それらの細菌が生産した二酸化炭素がKOHに吸着されることで、電導度が変化する。電導度の変化を時間に対してプロットし、測定開始から、前記のMalthusによって急激な電導度変化が検出されるまでにかかった時間として、検出時間（DT）を決定した。このDTは、試験開始時点で存在している細胞数に、標準曲線を利用して関係付けることができる。各微生物毎に、10倍ずつ希釈した細胞をMalthusのチューブに接種することによって、この標準曲線を作成した。
「結果」
円盤基体上に存在する生細胞の正確な数の概算を、全実験において、電導度測定によって決定した。しかし、このMalthusの方法では、酵素の殺菌活性と、バイオフィルムの酵素的除去とを区別することができない。従って、基体上の生細胞の減少は、DAPI/CTC染色によって評価したバイオフィルムの除去と比較されなければならない。
ステンレス鋼上のバイオフィルム中の細菌細胞数に対する、ペクチナーゼ（pectinex ultra SP）の効果を示す（表１）。ペクチナーゼの活性は、DAPI/CTC染色によって、バイオフィルムの除去として観察されたが、前記の４種類の菌体のいずれに対しても有意な殺菌活性はなかった。
DAPIで染色された全細胞は、CTCでも染色されたことから、視認された全ての細胞は呼吸していることが判った。ペクチナーゼで処理した後に、DAPI染色から、表面上からP.アエルギノサのバイオフィルムが除去されたことが、明らかに示された。CTC染色から、残った細胞は呼吸していることが示された。これらのことから、ペクチナーゼには殺菌活性がないことが判る。
総じて、S.アウレウス及びS.エピデルミジスのバイオフィルムは、P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスのバイオフィルムに比べて、ペクチナーゼによる酵素的除去を受けやすい（表１）。S.アウレウスのバイオフィルムが、ペクチナーゼの作用を最も受けやすく、0.18PSU/mlのペクチナーゼによって、85%のバイオフィルムが除去された。P.フルオレッセンスのバイオフィルムが、最も耐性を示し、85%のバイオフィルムを除去するために、1800PSU/mlのペクチナーゼを必要とした。ペクチナーゼによるポリプロピレン上のバイオフィルムの除去は、ステンレス鋼上のバイオフィルムの除去と同程度であった。
グルコースオキシダーゼ及びラクトオキシダーゼの組み合わせは、４種類の試験バイオフィルムにおいて、活動的に呼吸している細胞の数を有意に低下させ、そして生きている細胞の数を減少させた（表２及び３）。グルコースオキシダーゼ（10GODU/ml）及びラクトオキシダーゼ（5U/ml）に露出した場合、スタフィロコッカス菌体のバイオフィルムの生存性は、１〜２対数単位ほど減少し、一方、シュードモナス菌体のバイオフィルムの生存性は、３対数単位を超えて減少した。しかし、殺菌の程度は、浮遊細胞縣濁液を用いた場合に比べて低かった。グルコースオキシダーゼ（10GODU/ml）及びラクトオキシダーゼ（5U/ml）に露出した場合、シュードモナス菌体の浮遊細胞は、約５対数単位ほど減少した（表２）。
S.アウレウスの浮遊細胞は、オキシドレダクターゼの感受性の点で、そのバイオフィルム細胞と同程度であり、グルコースオキシダーゼ（10GODU/ml）及びラクトオキシダーゼ（5U/ml）に露出した場合、S.アウレウスは、約２〜３対数単位ほど減少した。S.エピデルミジスの浮遊細胞は、そのバイオフィルム細胞に比べて有意に感受性が高く、バイオフィルム上の細胞数が１対数単位ほど減少したのに対して、生きている浮遊細胞の数は、約５対数単位ほど減少した。しかし、S.エピデルミジスのバイオフィルム中に生存している細胞の濃度は、約107cfu/disc（円盤）であり、浮遊細胞の濃度は、約106cfu/mlであった。従って、S.エピデルミジス細胞の場合、バイオフィルムと浮遊細胞系において、その細胞数とオキシドレダクターゼ濃度の比が異なっていた（表３）。
ステンレス鋼上のバイオフィルムに対するオキシドレダクターゼ系の殺菌活性は、ポリプロピレン上のバイオフィルムに対するものと比べて、有意な差はなかった。ただし、P.アエルギノサを用いた場合、グルコースオキシダーゼ（5GODU/ml）とラクトオキシダーゼ（5U/ml）との組み合わせは、ポリプロピレン上のバイオフィルム細胞の99.99%を殺菌し、これに対して、ステンレス鋼上のバイオフィルム細胞の98%を殺菌した。
Pectinex ultra中に存在する多糖類加水分解酵素の複合混合物は、モデル系であるステンレス鋼上の細菌バイオフィルムを除去することができたが、有意な殺菌活性は示さなかった。これとは反対に、オキシドレダクターゼは、バイオフィルム細胞に対して殺菌性を示したが、バイオフィルムを除去しなかった。更に、オキシドレダクターゼと多糖類加水分解酵素との組み合わせは、殺菌性を示し、且つバイオフィルムを除去した。
グルコースオキシダーゼとラクトオキシダーゼとの組み合わせは、バイオフィルム細胞に対して、殺菌性を示したが、このオキシドレダクターゼ系の殺菌活性は、浮遊細胞に対する効果に比べると、バイオフィルム細胞に対して強くはなかった。バイオフィルム細胞は、浮遊細胞に比べて、耐性がより強いことは、周知の現象である（Brown et al.1995，Khardori et al.1995）。バイオフィルム内へのチオシアン酸塩及び過酸化水素の拡散が、浮遊細胞に比べて、バイオフィルム細胞の感受性を低下させるのだろう。このことは、バイオフィルムの表面から細胞が遊離しなければ、バイオフィルムを形成している細胞は、オキシドレダクターゼの殺菌活性から逃れることを示唆する。このことが、スタフィロコッカス菌体のバイオフィルムと、その浮遊細胞において、それらの感受性の差が小さいことの理由かもしれない。なぜなら、シュードモナス菌体による厚いバイオフィルムに比べて、スタフィロコッカス菌体の薄いバイオフィルムでは、バイオフィルム細胞の防御が限られてしまうのだろう。従って、オキシドレダクターゼの殺菌活性は、バイオフィルム分解酵素を、このオキシドレダクターゼ系と組み合わせることによって、改善され得る。
発明の背景
栄養が限られた生物環境では、細菌が表面に吸着し、バイオフィルムを形成し始める傾向が強い。バイオフィルムとは、表面に吸着し、有機高分子マトリックス内に入り込んだ微生物の群落である。栄養が限られた天然及び産業上の生物環境では、バイオフィルムの細胞が優勢になり、水道管及び船底での流体の摩擦抵抗（付着物）が増える、熱交換器からの熱の移動が減る、金属基盤が腐食する、そして食品及び生物技術産業で汚染が起こるなどの問題を引き起こす。バイオフィルムは、医療の研究及び産業においても、歯垢、内視鏡及びコンタクトレンズの汚染、人工装具上のコロニー形成、並びに医用移植物上のバイオフィルム形成などの深刻な問題を引き起こす。
バイオフィルムマトリックスとは、水流路と生物群を含んでいる微小コロニー、並びに細胞外ポリマー（多糖、糖タンパク質、タンパク質）の集まりである。細菌の細胞外多糖は、特にグルコース、フコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ピルビン酸、マンヌロン酸又はグルクロン酸を基にした複合体のホモ又はヘテロ多糖から成る。糖間の異なった結合から、多数の異なった多糖、例えばレバン、ポリマンノース、デキストラン、セルロース、アミロペクチン、グリコーゲン及びアルギン酸塩ができる。
バイオフィルム内で増殖した細菌は、浮遊性の細胞に比べて、抗生物質及び殺菌剤に対する耐性がより強く、そしてこの耐性は、バイオフィルムの経過年齢に連れて強くなる。細菌性のバイオフィルムは、乾燥、極端な温度、及び光に対する物理的耐性も強い。前記載通りに、バイオフィルム形成は、産業、環境及び医療上の問題を引き起こし、そして薬品による細菌性バイオフィルムの洗浄及び消毒が困難であることは、多くの産業において、主要な関心事項である。更に、より穏和な消毒及び洗浄用組成物を求める傾向が流行しているので、バイオフィルムに覆われている表面の不十分な洗浄が増加していると思われる。
本発明の目的は、表面上に存在するバイオフィルム及び生きている細菌細胞を除去する効率及び環境安全性の高い方法を提供することである。
本発明の要約
驚くことに、表面からバイオフィルムを除去するか、又は遊離させること、及び生きている微生物細胞を殺すことが、各々できる少なくとも２つの異なる酵素を用いて酵素処理することで、表面上に存在するバイオフィルムを除去及び消毒できることが判った。
従って、本発明は、少なくとも部分的にバイオフィルム層で覆われた表面を洗浄及び消毒する方法であって、
ａ．その表面からバイオフィルム層を、完全又は部分的に除去するか、又は遊離させる効果がある量の１つ以上のヒドロラーゼを含んでいる洗浄用組成物に、そのバイオフィルムを接触させる過程；及び、
ｂ．そのバイオフィルムに存在する生きている細菌細胞を殺す効果がある量のオキシドレダクターゼを含んでいる殺菌性消毒用組成物に、そのバイオフィルムを接触させる過程、
を連続的に、又は同時に含んで成る前記方法に関する。
更に、本発明は、洗浄及び／又は消毒用酵素組成物、並びに、バイオフィルム被覆表面を洗浄又は消毒するために、前記組成物を用いることに関する。
非常に効率良く洗浄及び消毒することができ、同時に、非攻撃性、非有害性、非毒性、及び環境親和性を示すことから、純粋に酵素的な本発明の方法は有利である。
発明の詳細な説明
本明細書の「洗浄」とは、希望しない物質、例えばバイオフィルム、を完全又は部分的に除去することを意味する。この除去は、酵素の触媒作用によるバイオフィルムの部分又は完全分解を介して起こる。
本明細書の「消毒」とは、生きている微生物細胞、すなわち細菌、真菌又は酵母細胞を殺す能力を意味する。
本明細書の「殺菌性」とは、細菌細胞を殺す能力を意味する。
「表面」
本明細書の「表面」は、バイオフィルム層によって覆われ得る任意の表面を意味する。表面の例には、任意の硬質な表面、例えば金属、プラスティック、ゴム、板、ガラス、木材、コンクリート、岩、大理石、石膏及びセラミック、又は場合によって塗料、エナメルでコーティングされた前記物質；任意の軟質な表面、例えば任意の種類の線維（糸、布地、食物線維、ロックウール、髪など）；有孔性の表面；人間又は動物の皮膚；ケラチン性物質（爪など）がある。前記の硬質な表面は、冷却塔、水処理施設、乳製品又は食物加工工場、化学薬品又は医薬品工場の処理装置に存在する。前記の有孔性の表面は、フィルター、例えば膜フィルターに存在する。従って、本発明の組成物及び方法は、従来の現場洗浄（cleaning-in-place，C-I-P）系においても有用である。
「バイオフィルム」
バイオフィルムは、多数の異なる微生物を含んでいるか、又は、特定の微生物を優勢な微生物として含んでいる。
本発明の好ましい実施形態としては、処理するバイオフィルムは、望ましくない細胞、好ましくはシュードモナス属、スタフィロコッカス属、アエロモナス属の細菌、又は腸内細菌科の細菌（例えば大腸菌）の中から選択された生きた細菌が優勢であるか、又は特徴である。
「酵素」
本発明の好ましい実施形態としては、使用するヒドロラーゼは、グルコシダーゼ、すなわち、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、βグルコシダーゼ）、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ）、ペクチナーゼ（アラビナナーゼ、αアラビノフラノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ）、アミラーゼ；プロテアーゼ；及びリパーゼの群中から選択される。
使用するヒドロラーゼは、もし既知であれば、除去する特定のバイオフィルムの特性に従って、選択されるか、あるいは異なった酵素活性を有する複数のヒドロラーゼの組み合わせを用いることもできる。
バイオフィルムを分解する特定の酵素の例には、1,2-1,3-α-D-マンナン マンノヒドロラーゼ、1,3-β-D-キシラン キシラノヒドロラーゼ、1,3-β-D-グルカン グルカノヒドロラーゼ、1,3（1,3;1,4）-α-D-グルカン 3-グルカノヒドロラーゼ、1,3（1,3;1,4）-β-D-グルカン 3（4）-グルカノヒドロラーゼ、1,3-1,4-α-D-グルカン 4-グルカノヒドロラーゼ、1,4-α-D-グルカン グルカノヒドロラーゼ、1,4-α-D-グルカン グルコヒドロラーゼ、1,4-（1,3；1,4）-β-D-グルカン 4-グルカノヒドロラーゼ、1,4-β-D-グルカン グルコヒドロラーゼ、1,4-β-D-キシラン キシラノヒドロラーゼ、1,4-β-D-マンナン マンナノヒドロラーゼ、1,5-α-L-アラビナン 1,5-α-L-アラビナノヒドロラーゼ、1,4-α-D-グルカン マルトヒドロラーゼ、1,6-α-D-グルカン 6-グルカノヒドロラーゼ、2,6-β-D-フルクタン フルクタノヒドロラーゼ、α-デキストリン 6-グルカノヒドロラーゼ、α-D-ガラクトシド ガラクトヒドロラーゼ、α-D-グルコシド グルコヒドロラーゼ、α-D-マンノシド マンノヒドロラーゼ、アシルニューラミニル ヒドロラーゼ、アエロバクタの多糖包 ガラクトヒドロラーゼ、β-D-フルクトフラノシド フルクトヒドロラーゼ、β-D-フコシド フコヒドロラーゼ、β-D-フルクタン フルクトヒドロラーゼ、β-D-ガラクトシド ガラクトヒドロラーゼ、β-D-グルコシド グルコヒドロラーゼ、β-D-グルクロノシド グルクロノソヒドロラーゼ、β-D-マンノシド マンノヒドロラーゼ、β-N-アセチル-D-ヘキソサミニド N-アセチルヘキソサミノヒドロラーゼ、セルロース-スルフェート スルホヒドロラーゼ、コラゲナーゼ、デキストリン 6-α-D-グルカノヒドロラーゼ、グリコプロテイン-ホスファチジルイノシトール ホスファチドヒドロラーゼ、ヒアルロネート 4-グリカノヒドロラーゼ、ヒアルロノグルクロニダーゼ、ペクチン ペクチルヒドロラーゼ、ペプチドグリカン N-アセチルムラモイルヒドロラーゼ、ホスファチジルコリン 2-アシルヒドロラーゼ、ホスファチジルコリン 1-アシルヒドロラーゼ、ポリ（1,4-α-D-ガラクツロニド）、ポリ（1,4-（N-アセチル-β-D-グルコサミニド））-グリカノヒドロラーゼ、プロテアーゼ、スクロース α-グルコシダーゼ、トリアシルグリセロール アシルヒドロラーゼ、トリアシルグリセロール プロテイン-アシルヒドロラーゼがある。
本発明の方法に有効な加水分解酵素は、実際の使用条件においてタンパク質分解活性を有する任意の酵素である。従って、本酵素には、植物に由来するタンパク質分解酵素、例えばパパイン、ブロメライン、フィシン；動物に由来するタンパク質分解酵素、例えばトリプシン及びキモトリプシン；あるいは、微生物、すなわち細菌、真菌又は酵母に由来するタンパク質分解酵素がある。本発明の方法では、多種類のタンパク質分解酵素の混合物を用いることができる。
本発明の好ましい実施形態としては、前記タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、又はアスパラギン酸プロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素で、その活性部位にセリン残基が必須である。これは、ジイソプロピルフルオロリン酸で阻害されるが、メタロプロテアーゼとは異なり、エチレンジアミノ四酢酸（EDTA）には耐性を示す（しかし、これは、高温でカルシウムイオンによって安定化する）。これは、単純な末端エステルを加水分解し、その活性は、セリンプロテアーゼである真核生物のキモトリプシンに似ている。より狭い意味の用語で、サブグループを表す「アルカリ性プロテアーゼ」は、至適pHが高い、pH9.0-11.0であるセリンプロテアーゼを意味する。セリンプロテアーゼは、一般に、アルカリ性のpH範囲で、最大のタンパク質加水分解活性を示すが、メタロプロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼは、普通、各々、中性及び酸性のpH範囲で、最大のタンパク質加水分解活性を示す。
セリンプロテアーゼのサブグループの１つにスブチリシンがある。スブチリシンは、グラム陽性細菌又は酵母が生産するセリンプロテアーゼである。多くのスブチリシンのアミノ酸配列が決定されている。これには、バチルス属の株に由来する少なくとも６つのスブチリシン、すなわちスブチリシン168、スブチリシンBPN、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシン・アミロサッカリチカス、及びメセンテリコ（mesenterico）ペプチダーゼ；放線菌類由来のスブチリシン、サーモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）由来のサーミターゼ（thermitase）；並びに、真菌由来のスブチリシン、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテイナーゼKがある。スブチリシンの更なるサブグループとして、スブチラーゼが最近認められた。スブチラーゼは、高度にアルカリ性のスブチリシンのことであり、これには、スブチリシンPB92（MAXACAL▲Ｒ▼,Gist-Brocades NV）、スブチリシン309（SAVINASE▲Ｒ▼,Novo Nordisk A/S）、及びスブチリシン124（ESPERASE▲Ｒ▼,Novo Nordisk A/S）がある。
本発明の記載では、スブチリシン変異体、又は変異スブチリシンプロテアーゼとは、起源となる親遺伝子を有し、その親酵素を生産する親微生物に由来する変異遺伝子であって、適当な宿主で発現させた時に、変異スブチリシンプロテアーゼが生産される様に親遺伝子を変異させた変異遺伝子を発現する生物によって生産されるスブチリシンを意味する。前記のスブチリシン及びこれの変異体は、本発明の方法に有効なプロテアーゼのクラスとして好ましい。有効なスブチリシン変異体の例には、195番目のグリシンがフェニルアラニンに置換された（G195F，195Gly to 195Phe）スブチリシン309（SAVINASE▲Ｒ▼）の変異体がある。
都合が良いことに、従来の発酵で生産された市販プロテアーゼが有効である。この市販プロテアーゼの例には、Alcalase▲Ｒ▼（バチルス・リシェニホルミス（B.licheniformis）の菌体の液体発酵による）、Rennilase▲Ｒ▼（ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）の非病原性菌体の液体発酵による）、Savinase▲Ｒ▼（遺伝子修飾したバチルス属菌体の液体発酵による）、例えば国際特許出願WO92/19729で開示された変異体、及びDurazym▲Ｒ▼（タンパク質工学的に修飾したSavinase▲Ｒ▼の変異体）がある。前記の全市販プロテアーゼは、Novo Nordisk A/S（DK-2880 Bagsvaerd,Denmark）によって生産及び販売されている。他の好ましいセリンプロテアーゼは、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）属、アスペルギルス属、リゾプス（Rhizopus）属、バチルス・アルカロフィルス（B.alcalophilus）、B.セレウス（B.cereus）、N.ナット（N.natto）、B.ブルガツス（B.vulgatus）、B.ミコイデ（B.mycoide）由来のプロテアーゼ、並びにバチルス属由来のスブチリン、特に、ノカルジオプシス属の菌種及びノカルジオプシス・ダソンビレイ（N.dassonvillei）由来のプロテアーゼ、例えば国際特許出願公報WO88/03947に開示されたもの、特に、ノカルジオプシス属の菌種NRRL18262、及びN.ダソンビレイNRRL18133由来のプロテアーゼである。更に他の好ましいプロテアーゼは、国際特許出願PCT/DK89/00002及び国際特許出願公報WO91/00345に開示されたバチルス属のスブチリンの変異体に由来するセリンプロテアーゼ、並びにEP415296に開示されたプロテアーゼである。
別の好ましいプロテアーゼのクラスは、微生物由来のメタロプロテアーゼである。都合が良いことに、従来の発酵で生産された市販プロテアーゼが有効である。この市販プロテアーゼの例は、Neutrase▲Ｒ▼（Zn）（バチルス・スブチリスの菌体の液体発酵による）であり、これはNovo Nordisk A/S（DK-2880 Bagsvaerd,Denmark）によって生産及び販売されている。
他の有効な市販プロテアーゼ製品には、Bactosol▲Ｒ▼WO及びBactosol▲Ｒ▼SI（Sandoz AG，Basle,Switzerland）；Toyozyme▲Ｒ▼（Toyo Boseki Co.Ltd.,Japan）；及び、プロテイナーゼK▲Ｒ▼（Kao Co.Ltd.,Japan）（バチルス属菌種KSM-K16の液体発酵による）がある。
本発明の方法に有効な別の加水分解酵素は、微生物のリパーゼである。このリパーゼには、カンジダ（Candida）などの酵母のリパーゼ、シュードモナス又はバチルスなどの細菌のリパーゼ、あるいはヒュミコラ（Humicora）又はリゾムコール（Rhizomucor）などの真菌のリパーゼがある。より詳しく記載すると、適当なリパーゼには、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ（EP238023の記載通りに調製される）、サーモミセス・ラヌギノサ（Thermomyces lanuginosa）のリパーゼ（EP305216の記載通りに調製され、商品名LipolaseTMとしてNovo Nordiskから市販されている）、ヒュミコラ・インソレンス（H.insolens）のリパーゼ、シュードモナス・スツトゼリ（P.stutzeri）のリパーゼ、シュードモナス・セパキア（P.cepacia）のリパーゼ、カンジダ・アンタルクチカ（C.antarctica）のリパーゼA又はB、あるいは、rGPL、アブシジア・ブラケスレエナ（Absidia blakesleena）、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、ペニシリウム・シクロピウム（Penicillum cyclopium）、ペニシリウム・クルストスム（Penicillum crustosum）、ペニシリウム・エクソパンスム（Penicillum expansum）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、チアロスポレラ・ファセオリナ（Thiarosporella phaseolina）、リゾプス・ミクロスポルス（Rhizopus microsporus）、スポロボロミセス・シバタヌス（Sporobolomyces shibatanus）、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、ジオトリクム・ペニシラツム（Geotricum penicillatum）、ラクトバチルス・クルバツス（Lactobacillus curvatus）、ブロコトリクス・サーモソハタ（Brochothrix thermosohata）、コプリヌス・シネリウス（Coprinus cinerius）、トリコデルマ・ハルザニウム（Trichoderma harzanium）、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）、リゾプス・ヤポニクス（Rhizopus japonicus）またはシュードモナス・プランタリ（Pseudomonas plantari）からのリパーゼがある。適当なリパーゼの他の例には、例えばWO92/05249又はWO93/11254に記載されている様に、前記リパーゼの変異体がある。
本発明の方法に有効なアミラーゼの例には、バチルス属のアミラーゼ、例えば、B.ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）、B.アミロリクエフェイシェンス（B.amyloliquefaciens）、B.スブチリス（subtilis）、又はB.リシェニホルミス（B.licheniformis）のアミラーゼ（例えば、商品名TermamylとしてNovo Nordiskから市販されている）、あるいは、アスペルギルス属のアミラーゼ、例えば、A.ニガー（A.niger）又はA.オリザエ（A.oryzae）のアミラーゼがある。適当なアミラーゼの他の例には、例えば、US5093257，EP252666，WO91/00353，FR2676456，EP285123，EP525610，PCT/DK93/00230に記載されている様に、前記アミラーゼの変異体がある。
別の有効な加水分解酵素は、セルラーゼ又はセルロース分解酵素であり、これは、セルロースからグルコース、セロビオース、トリオース及び他のセロ−オリゴ糖への分解を触媒する酵素を意味する。セルラーゼは、好ましくは、エンドグルカナーゼであり、より好ましくは、微生物のエンドグルカナーゼであり、特に、細菌又は真菌のエンドグルカナーゼである。細菌のエンドグルカナーゼの例は、シュードモナス属の細菌、又はバチルス・ラウツス（B.lautus）に由来するか、又はそれらで生産され得るエンドグルカナーゼである。
前記セルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、酸性、中性又はアルカリ性域で、各々最大のセルロース分解活性を示す酸性、中性又はアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼである。従って、有効なセルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、酸性条件で実質的なセルロース分解活性を示す酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、好ましくは、真菌の酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、より好ましくは、トリコデルマ（Trichoderma）、アクチノミセス、ミロテキウム（Myrothecium）、アスペルギルス、及びボトリチス（Botrytis）属に属する真菌に由来するか、又はそれらで生産され得る真菌の酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼである。
好ましい有効な酸性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、トリコデルマ・ビリデ（T.viride）、トリコデルマ・レセイ（T.reesei）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（T.longibrachiatum）、ミロテキウム・ベルカリア（M.verrucaria）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、及びボトリチス・シネレア（B.cinerea）の菌種の中の真菌に由来するか、又はそれらで生産され得るものである。
他の有効なセルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、中性又はアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、好ましくは、真菌の中性又はアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼであり、より好ましくは、アスペルギルス、ペニシリウム、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ヒュミコラ、イルペクス（Irpex）、フサリウム（Fusarium）、スタチボトリス（Stachybotrys）、スコプラリオプシス（Scopulariopsis）、チャエトミウム（Chaetomium）、ミコゴネ（Mycogone）、ベルチキリウム（Verticillium）、ミロテキウム（Myrothecium）、パプロスポラ（Papulospora）、グリオクラジウム（Gliocladium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）及びアクレモニウム（Acremonium）属の中の真菌に由来するか、又はそれらで生産され、アルカリ性条件で実質的なセルロース分解活性を示すアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼである。
好ましいアルカリ性セルラーゼ又はエンドグルカナーゼは、ヒュミコラ・インソレンス、フサリウム・オキシスポルム（F.oxysporum）、ミセリオフトラ・サーモフィル（M.thermophile）、又はセファロスポリウムの菌種の中の真菌、好ましくは、ヒュミコラ・インソレンスDSM1800、フサリウム・オキシスポルムDSM2672、ミセリオフトラ・サーモフィルCBS117.65、又はセファロスポリウム菌種RYM-202の菌種の中の真菌に由来するか、又はそれらで生産され得るものである。
本発明の方法に有効なキシラナーゼの例には、ヒュミコラ・インソレンス（WO92/17573）、アスペルギルス・アクレアツス（A.aculeatus）（アスペルギルス・アクレアツスCBS101.43から精製されたキシラナーゼに対する抗体と免疫反応する、キシラナーゼ活性を有する酵素、WO94/21785）、バチルス・プミルス（B.pumilus）（WO92/03540）、バチルス・ステアロサーモフィルス（WO91/18976，WO91/10724）、バチルス菌種AC13（特に菌体NCIMB40482，WO94/01532）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム及びチャイニア菌種（EP0353342A1）、トリコデルマ・アウランチアクス（T.aurantiacus）（US4966850）、トリコデルマ・ハルジアヌム（T.harzianum）及びトリコデルマ・レセイ（US4725544）、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）（EP0373107A2）、サーモミセス・ラヌギノサス（T.lanuginosus）（EP0456033A2）、バチルス・シルクランス（B.circulans）（WO91/18978）、アスペルギルス・オリゼ（SU4610007）、サーモモノスポラ・フスカ（Thermomonospora fusca）（EP0473545A2）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）（WO93/03155）、ストレプトミセス・ビリドスポルス（S.viridosporus）（EP496671A1）、バチルス・リシェニホルミス（JP9213868）、並びに、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（W.J.J. van den Tweel et al.（Eds.）,”Stability of Enzymes”,Proceedings of an International Symposium heeled in Maastricht，The Netherlands,22-25 November 1992，Fisk.R.S. and Simpson，pp.323-328）の菌種の中から；あるいは、サーモトガ（Thermotoga）（WO93/19171）、ロドサームス（Rhodothermus）（WO93/08275）、ジクチオグロムス（Dictyoglomus）（WO92/18612）及びストレプトミセス（US5116746）の属の中から、選択される菌体によって生産されるか、又は生産され得るキシラン分解（xylanolytic）酵素活性を有する酵素がある。適当なキシラナーゼの他の例には、キシラン分解酵素活性を有する前記酵素の変異体（誘導体又は相同体）がある。
有効なペクチナーゼには、ポリガラクツロナーゼ（EC3.2.1.15）、ペクチンエステラーゼ（EC3.2.1.11）、ペクチンリアーゼ（EC4.2.2.10）及びヘミセルラーゼ、例えばエンド-1,3-b-キシロシダーゼ（EC3.2.1.32）、キシラン-1,4-b-キシロシダーゼ（EC3.2.1.37）及びa-L-アラビノフラノシダーゼ（EC3.2.1.55）の酵素分類に属する酵素がある。ペクチナーゼの起源生物は、アスペルギルス・ニガーが好ましい。
好ましい実施形態としては、本洗浄用組成物は、真菌アスペルギルス・アクレアツスの菌体、好ましくはアスペルギルス・アクレアツスCBS101.43によって生産される加水分解酵素混合物を含んでいる。この菌体は、ペクトース分解性（pectolytic）、及び広範囲のヘミセルロース分解性の酵素活性を含んでいる酵素混合物を生産することが知られている。
本ヒドロラーゼは、本洗浄用組成物中に、約0.01〜約5000μgタンパク質／ml組成物の量で、好ましくは約１〜約500μgタンパク質／ml組成物の量で存在する。
本明細書で使われる用語「オキシドレダクターゼ」は、酵素命名法（1992）に従ってEC1.に分類される酵素、すなわち、EC1.1（供与体のCH-OH基に作用する）、EC1.2（供与体のアルデヒド又はオキソ基に作用する）、EC1.3（供与体のCH-CH基に作用する）、EC1.4（供与体のCH-NH2基に作用する）、EC1.5（供与体のCH-NH基に作用する）、EC1.6（NADH又はNADPHに作用する）、EC1.7（供与体としての他の含窒素化合物に作用する）、EC1.8（供与体のイオウ基に作用する）、EC1.9（供与体のヘム基に作用する）、EC1.10（供与体としてのジフェノール又は関連物質に作用する）、EC1.11（受容体としてのペルオキシドに作用する）、EC1.12（供与体としての水素に作用する）、EC1.13（酸素分子を有する単一供与体に作用する、オキシゲナーゼ）、EC1.14（酸素分子を有する対供与体に作用する）、EC1.15（受容体としてのスーパーオキシドラジカルに作用する）、EC1.16（金属イオンを酸化する）、EC1.17（供与体-CH2-の基に作用する）、EC1.18（供与体としてのフェレドキシンに作用する）、EC1.19（供与体としての還元型フラボドキシンに作用する）、EC1.97（その他のオキシドレダクターゼ）に分類される任意の酵素を意味する。
好ましくは、本発明に用いられるオキシドレダクターゼは、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びラッカーゼの中から、好ましくは、グルコースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、コプリヌス（Coprinus）のペルオキシダーゼ、及びハロペルオキシダーゼの中から選択される。
ラッカーゼは、酸素で基質を酸化する反応を触媒する酵素であり、微生物、植物及び動物に由来するものが知られている。より詳しくは、ラッカーゼ（EC1.10.3.2）は、電子受容体としての酸素分子と共に機能するオキシドレダクターゼである。大気からの酸素分子は、通常十分な量で存在しているので、普通は、反応媒体に余分な酸素を追加する必要はない。本発明の組成物に有効なラッカーゼ酵素の例には、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）の菌体IFO 30116由来のラッカーゼ、又はコプリヌス・シネレウスIFO 30116由来のラッカーゼと免疫特性が同一なラッカーゼ；あるいは、ミセリオフトラ・サーモフィルの菌体由来のラッカーゼ（WO91/05839）がある。
有効なペルオキシダーゼは、好ましくは、植物（例えば、西洋ワサビ又はダイズのペルオキシダーゼ）、あるいは、真菌又は細菌などの微生物によって生産されるものである。好ましい真菌は、不完全菌亜門、不完全糸状菌綱に属する菌体、例えば、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、トリコデルマ（Tricoderma）、ミロテキウム（Myrothecium）、ベルチキルム（Verticillum）、アルスロミセス（Arthromyces）、カルダリオミセス（Caldariomyces）、ウロクラジウム（Ulocladium）、エムベリシア（Embellisia）、クラドスポリウム（Cladosporium）またはドレシュレラ（Dreschlera）、特に、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（DSM 2672）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマ・レシ（Trichoderma resii）、ミロテキウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）（IFO 6113）、ベルチキルム・アルボアツルム（Verticillum alboatrum）、ベルチキルム・ダリエ（Verticillum dahlie）、アルスロミセス・ラモスス（Arthromyces ramosus）（FERM P-7754）、カルダリオミセス・フマゴ（Caldariomyces fumago）、ウロクラジウム・チャータルム（Ulocladium chartarum）、エムベリシア・アリ（Embellisia alli）またはドレシュレラ・ハロデス（Dreschlera halodes）である。他の好ましい真菌は、担子菌亜門、担子菌綱に属する菌体、例えば、コプリヌス（Coprinus）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、コリオルス（Coriolus）またはトラメテス（Trametes）、特に、コプリヌス・シネレウスf.ミクロスポルス（Coprinus cinereus f.microsporus）（IFO 8371）、コプリヌス・マクロルヒズス（Coprinus macrorhizus、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）（例えば（NA-12））またはトラメテス（Trametes）（以前はポリポルス（Polyporus））、例えばT.ベルシコロル（T.versicolor）（例えばPR428-A）である。更に他の好ましい真菌は、接合菌亜門、ケカビ科に属する菌体、例えば、リゾプス又はムコール属、特にムコール・ヒエマリス（M.hiemalis）である。好ましい細菌は、放線菌目の菌体、例えば、ストレプトミセス・スフェロイド（S.spheroides）（ATCC23965）、ストレプトミセス・サーモビオラセウス（S.thermoviolaceus）（IFO12382）又はストレプトベルチキルム・ベルチキルム亜種ベルチキルム（Streptoeverticillum verticillum ssp.verticillum）である。他の好ましい細菌は、バチルス・プミルス（ATCC12905）、バチルス・ステアロサーモフィルス、ロドバクタ・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドモナス・パルストリ（Rhodomonas palustri）、ストレプトコッカス・ラクチス（S.lactis）、シュードモナス・プルロキニア（P.purrocinia）（ATCC15958）又はシュードモナス・フルオレッセンス（NRRL B-11）である。更に他の好ましい細菌は、ミクソコッカスに属する菌体、例えば、M.ビレセンス（M.virescens）である。
本発明の記載において、ペルオキシダーゼ活性を有する化合物は、ペルオキシダーゼ酵素、及び、シトクローム、ヘモグロビン又はペルオキシダーゼ酵素に由来するペルオキシダーゼ活性を有する断片、並びに、それらの合成又は半合成の誘導体、例えば、鉄ポルフィリン及び鉄フタロシアニン、更にそれらの誘導体を含んでいる。
一般に、本発明の方法に用いられる酵素は、単一成分（組換え）酵素、すなわち他のタンパク質又は酵素タンパク質が本質的に含まれない酵素でよい。当分野で標準的な方法に従って、組換え酵素をクローン化して、発現させることができる。しかし、本酵素は、酵素調製品の形で、場合によっては、主要な酵素成分として希望する酵素活性を示す酵素が豊富な酵素調製品、例えば、単一酵素の調製品の形で、用いることができる。
特に、組換えによって生産されるペルオキダーゼは、コプリヌス属の菌種、特にC.マクロルヒズス又はC.シネレウス由来のペルオキシダーゼ（WO92/16634）、あるいはその変異体、例えば、WO94/12621に記載された変異体である。しかし、コプリヌス属に属する菌体、好ましくは、C.シネレウス又はC.マクロルヒズスの菌種、より好ましくは、C.シネレウスIFO8371又はIFO30114を通常通りに発酵させて、このペルオキシダーゼを生産することもできる。
ペルオキシダーゼと組み合わせて、電子供与体として作用し得る促進剤を用いることが好ましい。この有効な促進剤の例を以下に記す。
A.水溶液中で、変換のために十分な時間及び条件で、ペルオキシダーゼに接触させると、酵素的にヨー素に変換されるヨー化物イオンの供与源。本内容では、ヨー化物イオンの好ましい供与源は、水溶性のヨー化物塩、例えば、アルカリ金属のヨー化物塩、例えば、ヨー化カリウム（KI）、ヨー化ナトリウム（NaI）又はヨー化リチウム、ヨー化アンモニウム、ヨー化カルシウムである。ヨー化ナトリウム及びヨー化カリウムが好ましい。
B.別の好ましい促進剤は、チオシアン酸塩イオン（SCN-）の供与源、例えば、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、及びその他のチオシアン酸塩であり、好ましくは、チオシアン酸ナトリウム及びチオシアン酸カリウムである。
C.別の有効な促進剤は、次式で表す化合物である：
置換基R1-R9は、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、以下の基：水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、スルファモイル、ニトロ、アミノ、フェニル、C1C14-アルキル、C1-C5-アルコキシ、カルボニル-C1-C5-アルキル、アリール-C1-C5-アルキルのいずれかであり、前記カルバモイル、スルファモイル、及びアミノ基は未置換であるか、あるいは置換基R10で１又は２回置換されてもよく、前記フェニルは未置換であるか、あるいは１個以上の置換基R10で置換されてもよく、前記C1-C14-アルキル、C1-C5-アルコキシ、カルボニル-C1-C5-アルキル、及びアリール-C1-C5-アルキル基は、飽和又は不飽和、分枝状又は非分枝状であってよく、更に未置換であるか、あるいは１個以上の置換基R10で置換されてもよく；
前記置換基R10は、以下の基：ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、スルファモイル、ニトロ、アミノ、フェニル、アミノアルキル、ピペリジノ、ピペラジニル、ピロリジン-1-イル、C1-C5-アルキル、C1-C5-アルコキシのいずれかであり、前記カルバモイル、スルファモイル、及びアミノ基は未置換であるか、あるいはヒドロキシ、C1-C5-アルキル、C1-C5-アルコキシで１又は２回置換されてもよく、前記フェニルは１個以上の以下の置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、並びにスルファモイルで置換されてもよく、前記C1-C5-アルキル、及びC1-C5-アルコキシ基は、飽和又は不飽和、分枝状又は非分枝状であってよく、更に以下の置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、カルボキシ、並びにそれらのエステル及び塩、カルバモイル、スルホ、並びにそれらのエステル及び塩、並びにスルファモイルのいずれかで１又は２回置換されてもよく；
あるいは、前記式中で、置換基R1-R9の中の２つが共同に-B-基を形成してもよく、Bは、以下の基：（-CHR10-N=N-），（-CH=CH-）n，（-CH=N-）n又は（-N=CR10-NR11-）のいずれかであり、nは、１〜３の整数であり、R10は、前記定義の置換基であり、R11は、R10と同じに定義され；
前記式中に２個以上の置換基R10が含まれる場合には、それらの置換基R10は、同一であってもよく、又は異なってもよい）。
特定の実施例としては、前記促進剤は、10-メチルフェノチアジン、フェノチアジン-10-プロピオン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドフェノチアジン-10-プロピオン酸塩、10-エチルフェノチアジン-4-カルボン酸、10-エチルフェノチアジン、10-プロピルフェノチアジン、10-イソプロピルフェノチアジン、メチルフェノチアジン-10-プロピオン酸塩、10-フェニルフェノチアジン、10-アリルフェノチアジン、10-（3-（4-メチルピペラジン-1-イル）プロピル）フェノチアジン、10-（2-ピロリジン-1-イル-エチル）フェノチアジン、2-メトキシ-10-メチルフェノチアジン、1-メトキシ-10-メチルフェノチアジン、3-メトキシ-10-メチルフェノチアジン、3,10-ジメチルフェノチアジン、3,7,10-トリメチルフェノチアジン、10-（2-ヒドロキシエチル）フェノチナジン、10-（3-ヒドロキシプロピル）フェノチアジン、3-（2-ヒドロキシエチル）-10-メチルフェノチアジン、3-ヒドロキシメチル-10-メチルフェノチアジン、3,7-ジブロモフェノチアジン-10-プロピオン酸、フェノチアジン-10-プロピオンアミド、クロルプロマジン、2-クロロ-10-メチルフェノチアジン、2-アセチル-10-メチルフェノチアジン、10-メチルフェノキサジン、10-エチルフェノキサジン、フェノキサジン-10-プロピオン酸、10-（2-ヒドロキシエチル）フェノキサジンまたは4-カルボキシフェノキサジン-10-プロピオン酸である。
D.有効な促進剤の別の例は、次式で表す化合物である：
B及びCは、同一であっても、又は異なってもよく、そしてCmH2m+1（1≦m≦5）から選択される）。
好ましい実施形態としては、前記式のAは-CO-Eであり、このEは-H，-OH，-R，又は-ORであり、このRは、C1-R16-アルキル、好ましくはC1-C8-アルキルであり、このアルキルは、飽和又は不飽和、分枝状又は非分枝状であってよく、場合によってはカルボキシ、スルホ又はアミノ基で置換されてもよく；B及びCは、同一であっても、又は異なってもよく、そしてCmH2m+1（1≦m≦5）から選択される。
前記式において、Aは、ヒドロキシ基に対してパラの位置であるが、メタの位置であってもよい。
好ましい実施形態としては、この促進剤は、アセトシリンゴン（acetosyringone）、メチルシリンゲート（methylsyringate）、エチルシリンゲート、プロピルシリンゲート、ブチルシリンゲート、ヘキシルシリンゲート、又はオクチルシリンゲートである。
E.更に他の有効な促進剤は、次式で表すアジノ化合物である：
A=N-N=B
（式中、A及びBは、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、図２に示した置換基II，III，IV，及びVのいずれかであり、前記置換基において、X及びYは、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、炭素、窒素（この窒素は未置換であっても、又は置換基R5で置換されてもよく）、イオウ、酸素、セレン又はテルルであり、前記置換基において、置換基R1，R2，R3及びR4は、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルコキシ、ホルミル、カルボキシ、スルホ、ニトロ、C1-C5-アルキル（このアルキルは、飽和又は不飽和、分枝状又は直鎖状であってよく）、又はアミノ（このアミノは未置換であるか、あるいは置換基R5で１又は２回置換されてもよく）であり、置換基R5は、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルコキシ、C1-C5-アルキル、又はアミノである）。このペルオキシダーゼ促進剤は、遊離又は酸添加塩の形であってよい。
好ましい実施形態としては、置換基R1，R2，R3及びR4は、同一であってもよく、又は異なってもよく、独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルキル、又はスルホである。好ましくは、このハロゲンは、フルオロ、クロロ、又はブロモである。好ましくは、このC1-C3-アルキルは、メチル、エチル、プロピル、又はイソプロピルである。
好ましい実施形態としては、置換基R5は、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-C3-アルコキシ、C1-C3-アルキル、又はアミノである。
最も好ましい実施形態としては、本発明のペルオキシダーゼの促進剤は、2,2’-アジノ-ビス（3-エチル-ベンゾチアゾリン-6-スルホネート）である。この化合物は、ABTSと略され、発色体基質であり、そして通常のペルオキシダーゼ及びフェノールオキシダーゼ検査用の試薬である。
既知の、そして前記の促進剤とは異なり、ABTSは、アルカリ性の強い条件、すなわちpH９超で、ペルオキシダーゼ促進剤として作用し得る。この特性のために、ABTSは、例えば、pH7-13、特にpH8-12、好ましくはpH9-11の範囲内にある洗剤用組成物に用いることができる。
本促進剤は、抗微生物性の本組成物中において、0.005-1000mmol/g基質（微生物細胞、バイオマス）、好ましくは、0.05-500mmol/g基質、より好ましくは、0.5-100mmol/g基質に対応する濃度で、含まれ得る。
任意の理論に限定されることなく、現在では、適当な水性媒体中で、本促進剤が形成するラジカルの半減期と、その効率との間には、正の相関があること、そして、この半減期は、p-ヒドロキシ桂皮酸、2,4-ジクロロフェノール、p-ヒドロキシベンゼンスルホネート、バニリン及びp-ヒドロキシ安息香酸（WO92/18683に開示されている促進剤）の中から選択された物質の半減期よりも有意に長いことが、考慮される。
このラジカルの半減期は、特に、水性媒体のpH、温度及び緩衝剤に依存するので、種々の促進剤のラジカルの半減期を比較する際には、それら全ての因子が同一であることが大事である。
本発明の消毒用組成物中のオキシドレダクターゼの量は、好ましくは、約0.01〜約1000μgタンパク質／ml組成物、より好ましくは、約10〜約100μgタンパク質／ml組成物である。オキシダーゼ及びペルオキシダーゼの場合、その量は、好ましくは、約0.01〜約100のオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ単位（GODU or PODU）／ml組成物であり、より好ましくは、約0.1〜約50単位／mlである。
「酵素単位の定義」
１グルコースオキシダーゼ単位（GODU）は、標準条件（pH5.6、30℃、20分間インキュベーション、酢酸塩緩衝液、及び基質としてのグルコース16.2g/1，90mM）で、１分間あたり１mmolの過酸化水素を形成させる酵素量である。この分析方法を記したホルダーAF266/1は、Novo Nordisk A/S,Denmarkから入手できる。このホルダーを引用して、本明細書に組み込む。
１ペルオキシダーゼ単位（PODU）は、以下の分析条件で、１分間あたり１mmolの過酸化水素への変換を触媒する酵素量である：0.88mM過酸化水素、1.67mM 2,2’-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホネート）、0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.0、30℃でのインキュベーション、418nmでの分光測定。
１ペクチナーゼ単位（PSU）は、ペクチン酸溶液の粘性を減少させる酵素量である。この活性は、以下の分析条件で、既知の75000PSU/gの基準と比較して測定する：酢酸塩緩衝液、40℃、pH4.0、1.43%ペクチン酸、及び反応時間30分。
１ラクトペルオキシダーゼ単位（LP）は、20秒間、pH6.0、20℃で、ピロガロールから、1.0mgのプルプロガリンを形成させる。標準的な測定方法は、Sigma Chemical Companyから得られる。
「組成物」
本発明の酵素組成物は、洗浄用組成物、すなわち表面からバイオフィルムを除去するか、又は遊離させることができる１つ以上のヒドロラーゼを含んでいる組成物；消毒用組成物、すなわちバイオフィルム中に存在する生きている微生物の細胞、好ましくは細菌の細胞を殺すことができるオキシドレダクターゼを含んでいる組成物；あるいは、それらの混合物、すなわちバイオフィルムによって完全又は部分的に覆われている表面を洗浄及び消毒するために有効な量のヒドロラーゼ及びオキシドレダクターゼを少なくとも含んでいる組成物である。
本発明の組成物は、更に従来の界面活性剤も含んでいる。
「方法」
本発明の方法は、用いる酵素が活性を示すpH又はpH範囲で、例えば、実際の酵素が、少なくとも約50%の相対活性、より好ましくは、少なくとも約80%の活性を有するpH範囲で、実行されることが好ましい。従って、洗浄用及び／又は消毒用組成物のpHは、4.5-11、好ましくは5-9、より好ましくは5.5-7.5の範囲にあることが好ましい。
本発明の方法は、用いる酵素が活性を示す温度又は温度範囲で、例えば、実際の酵素が、少なくとも約50%の相対活性、より好ましくは、少なくとも約80%の活性を有する温度範囲で、実行されることが好ましい。典型的には、本発明の方法は、10-60℃、好ましくは20-50℃、より好ましくは25-40℃の範囲にある（洗浄用及び／又は消毒用組成物の）温度で、実行される。
次の実施例を用いて本発明を説明する。
実施例１
シュードモナス・アエルギノサ（P.aeruginosa）ATCC10148、シュードモナス・フルオレッセンス菌体AH2（Gram et al.1990）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（S.epidermidis）DMS20042、及びスタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）ATCC25923を用いたモデル系において、バイオフィルムを増殖させた。増殖培地として、オキソイド（Oxoid）CM131からのトリプトンダイズブロス（TSB）を用いた。
４番仕上げ（磨き粉180）のAISI304型のステンレス鋼を、12X20mmの円盤に切り取った。ポリプロピレン製の円盤（12X20mm; Ral.7032,Dukadan A/S）を、中性洗剤（トライトン）中で磨いて洗浄し、オートクレーブ機にかける前に、水中でリンスした。前記円盤を、水で、次にクロロホルム、メタノール、最後にアセトン（各５ml）で洗浄し、そして、使用前に121℃で20分間オートクレーブ機にかけて滅菌した。
「バイオフィルムの成長」
滅菌した鋼又はポリプロピレンの円盤を、ビーカー内の滅菌した鋼製の架台に垂直に固定した。この架台には、培地に浸した際に、液体が自由に循環する様に、20枚までの円盤が配置される。
S.アウレウス、P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスを、TSB中で、24時間、26℃で前もって培養した。S.エピデルミジスを、TSB中で、24時間、30℃で前もって培養した。スタフィロコッカスの菌種をTSBに接種し、そしてシュードモナスの菌種（約103cfu/ml）を、滅菌水で1:5に希釈したTSBに接種した。それらの接種した培地を前記ビーカーに注ぎ、前記円盤を浸した。26℃（S.エピデルミジスの場合30℃）で、４日間以上少し撹拌して（200rpm）、円盤の両面にバイオフィルムを成長させた。
酵素処理する前に、全ての円盤を、滅菌リン酸塩緩衝液（67mM,pH7）中で１分間、無菌的にリンスして、浮遊細胞を取り除いた。
「抗微生物性酵素」
グルコースオキシダーゼ（Novo Nordisk A/S）を、電子供与体としての3g/LのD（+）グルコース（Sigma G-7528）と、過酸化水素へ還元される電子受容体としての酸素と共に用いた。
ラクトペルオキシダーゼ（Sigma Chemicals Co.）を、電子受容体としての過酸化水素と、電子供与体としての２mMチオシアン酸塩と共に用いた。
アスペルギルス・アクレアツスの菌体（Novo Nordisk）の発酵によって生産されたペクチナーゼは、プロテアーゼ活性、並びに、ペクチナーゼ、アラバナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、βグルカナーゼ及びキシラナーゼの活性を有する広範囲のカルボヒドラーゼを含んでいる市販品の多成分酵素調製品である。
「バイオフィルム細胞の酵素的な除去及び殺細胞」
酵素をリン酸塩緩衝液（pH7）で希釈し、滅菌濾過して、前記のバイオフィルムを有する円盤を含んでいる緩衝液に加えた。鋼及びポリプロピレン製の円盤を、酵素と共に20℃で15分間、撹拌しないでインキュベーションした。両円盤の基体に対して、コントロールとして、添加酵素を含まない滅菌緩衝液を用いた。酵素処理後に、これらの基体を、滅菌緩衝液で穏やかに１回リンスし、その後、細胞を染色してから顕微鏡観察するか、又は電導度測定して計数した。
グルコースオキシダーゼ及びラクトペルオキシダーゼの殺菌活性は、S.アウレウス、S.エピデルミジス、P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスの浮遊細胞で決定した。成長したバイオフィルムからの浮遊細胞を、67mMリン酸塩緩衝液（pH7.0）で1:9に希釈し、そして20℃で15分間、グルコースオキシダーゼ（0，5，10 GODU/ml）及びラクトペルオキシダーゼ（0，1，5 U/ml）と混合した。浮遊細胞に対する殺菌活性は、その細胞縣濁液１mlをMalthusのチューブに接種して評価した。
「バイオフィルムの評価」
蛍光顕微鏡：テトラゾリウム塩、5-シアノ-2,3-ジトリルテトラゾリウムクロリド（CTC）（Polysciences,Inc.,Warrington,PA）を、濾過滅菌した蒸留水に溶解した（10mM）。CTCを、細胞の生存性の指標として用いた。CTCの水溶液は、ほとんど無色で、蛍光がないが、それの対応するホルマザン生成物は、420nmで励起すると、約620nmの赤色範囲の蛍光を発する。DNA結合性蛍光発色団DAPI（4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Sigma D-9542）を、総細胞数の指標として用いた。バイオフィルムの細胞をCTCで染色した後に、DAPIで染色することで、同一のサンプルで、呼吸している細胞数及び総細胞数を計数することができる（30）。
酵素処理後に、バイオフィルムを有する円盤を、暗所で、45分間、20℃で、トリプトース・リン酸塩ブロス（TPB）及びCTC-テトラゾリウム塩（12.5mM）と共にインキュベーションした。このCTC染色の最後の５分間に、DAPI（3mM）を加えた。200Wの水銀バーナーが付いているOlympusのモデルBX50顕微鏡を用いて、x100の油浸蛍光対物レンズで、染色された細胞を調べた。CTCで染色された細胞を観察するために、480-550nmの励起フィルターと590nmの遮断フィルター（Olympusの立体モデルU-MSWG）を組み合わせて用いた。DAPIで染色された細胞を観察するために、330-385nmの励起フィルターと420nmの遮断フィルター（Olympusの立体モデルU-MWU）を用いた。
電導度の測定：前記の円盤基体に接着している細胞数を計数する場合、間接的なMalthusによる測定を利用した（Johnston & Jones,1995）。酵素処理後に、この円盤を、酵素処理に用いたものと同じ緩衝液でリンスして、外側チューブに３mlの培地を含み、内側チューブに0.5mlの0.1M KOHを含んでいるMalthusのチューブに移した（Dezenclos et al.1994）。P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスを検出するための培地として、TSBを用いて、S.アウレウス及びストレプトコッカス・ミュータンス（Strep.mutans）を検出するために、BHIを用いた。チューブを、Malthus2000（Malthus Flexi 2000，Malthus Instrument Ltd.）に配置して、37℃でインキュベーションした。ただし、P.フルオレッセンスのサンプルは25℃でインキュベーションした。
それらの細菌が生産した二酸化炭素がKOHに吸着されることで、電導度が変化する。電導度の変化を時間に対してプロットし、測定開始から、前記のMalthusによって急激な電導度変化が検出されるまでにかかった時間として、検出時間（DT）を決定した。このDTは、試験開始時点で存在している細胞数に、標準曲線を利用して関係付けることができる。各微生物毎に、10倍ずつ希釈した細胞をMalthusのチューブに接種することによって、この標準曲線を作成した。
「結果」
円盤基体上に存在する生細胞の正確な数の概算を、全実験において、電導度測定によって決定した。しかし、このMalthusの方法では、酵素の殺菌活性と、バイオフィルムの酵素的除去とを区別することができない。従って、基体上の生細胞の減少は、DAPI/CTC染色によって評価したバイオフィルムの除去と比較されなければならない。
ステンレス鋼上のバイオフィルム中の細菌細胞数に対する、ペクチナーゼ（pectinex ultra SP）の効果を示す（表１）。ペクチナーゼの活性は、DAPI/CTC染色によって、バイオフィルムの除去として観察されたが、前記の４種類の菌体のいずれに対しても有意な殺菌活性はなかった。
総じて、S.アウレウス及びS.エピデルミジスのバイオフィルムは、P.アエルギノサ及びP.フルオレッセンスのバイオフィルムに比べて、ペクチナーゼによる酵素的除去を受けやすい（表１）。S.アウレウスのバイオフィルムが、ペクチナーゼの作用を最も受けやすく、0.18PSU/mlのペクチナーゼによって、85%のバイオフィルムが除去された。P.フルオレッセンスのバイオフィルムが、最も耐性を示し、85%のバイオフィルムを除去するために、1800PSU/mlのペクチナーゼを必要とした。ペクチナーゼによるポリプロピレン上のバイオフィルムの除去は、ステンレス鋼上のバイオフィルムの除去と同程度であった。
グルコースオキシダーゼ及びラクトオキシダーゼの組み合わせは、４種類の試験バイオフィルムにおいて、活動的に呼吸している細胞の数を有意に低下させ、そして生きている細胞の数を減少させた（表２及び３）。グルコースオキシダーゼ（10GODU/ml）及びラクトオキシダーゼ（5U/ml）に露出した場合、スタフィロコッカス菌体のバイオフィルムの生存性は、１〜２対数単位ほど減少し、一方、シュードモナス菌体のバイオフィルムの生存性は、３対数単位を超えて減少した。しかし、殺菌の程度は、浮遊細胞縣濁液を用いた場合に比べて低かった。グルコースオキシダーゼ（10GODU/ml）及びラクトオキシダーゼ（5U/ml）に露出した場合、シュードモナス菌体の浮遊細胞は、約５対数単位ほど減少した（表２）。
Pectinex ultra中に存在する多糖類加水分解酵素の複合混合物は、モデル系であるステンレス鋼上の細菌バイオフィルムを除去することができたが、有意な殺菌活性は示さなかった。これとは反対に、オキシドレダクターゼは、バイオフィルム細胞に対して殺菌性を示したが、バイオフィルムを除去しなかった。更に、オキシドレダクターゼと多糖類加水分解酵素との組み合わせは、殺菌性を示し、且つバイオフィルムを除去した。
グルコースオキシダーゼとラクトオキシダーゼとの組み合わせは、バイオフィルム細胞に対して、殺菌性を示したが、このオキシドレダクターゼ系の殺菌活性は、浮遊細胞に対する効果に比べると、バイオフィルム細胞に対して強くはなかった。バイオフィルム細胞は、浮遊細胞に比べて、耐性がより強いことは、周知の現象である（Brown et al.1995，Khardori et al.1995）。バイオフィルム内へのチオシアン酸塩及び過酸化水素の拡散が、浮遊細胞に比べて、バイオフィルム細胞の感受性を低下させるのだろう。このことは、バイオフィルムの表面から細胞が遊離しなければ、バイオフィルムを形成している細胞は、オキシドレダクターゼの殺菌活性から逃れることを示唆する。このことが、スタフィロコッカス菌体のバイオフィルムと、その浮遊細胞において、それらの感受性の差が小さいことの理由かもしれない。なぜなら、シュードモナス菌体による厚いバイオフィルムに比べて、スタフィロコッカス菌体の薄いバイオフィルムでは、バイオフィルム細胞の防御が限られてしまうのだろう。従って、オキシドレダクターゼの殺菌活性は、バイオフィルム分解酵素を、このオキシドレダクターゼ系と組み合わせることによって、改善され得る。
Claims (18)
- 少なくとも部分的にバイオフィルム層で覆われた表面を洗浄及び消毒する方法であって、
ａ．0.01〜5000μgタンパク質／ml組成物の量のペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ及びプロテアーゼから成る群から選択される１つ以上のヒドロラーゼを含んでいる洗浄用組成物に、そのバイオフィルムを接触させる過程；及び、
ｂ．0.01〜1000μgタンパク質／ml組成物の量のラッカーゼ及びペルオキシダーゼから成る群から選択されるオキシドレダクターゼを含んでいる殺菌性消毒用組成物に、そのバイオフィルムを接触させる過程、を連続的に、又は同時に含んで成る前記方法。 - 前記ヘミセルラーゼがキシラナーゼ、マンナナーゼ、キシランアセチルエステラーゼであり、ペクチナーゼがアラビナナーゼ、αアラビノフラノシダーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼである、請求項１の方法。
- 前記洗浄用組成物が、真菌アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）、又はアスペルギルス・アクレアツスCBS101.43の菌体によって生産される加水分解酵素混合物を含んでいる、請求項１の方法。
- 前記洗浄用組成物中のヒドロラーゼの量が、１〜500μgタンパク質／ml組成物である、請求項２又は３の方法。
- 前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、及びハロペルオキシダーゼの中から選択される、請求項１〜４のいずれか１項の方法。
- 前記ペルオキシダーゼが、コプリヌス属（Coprinus）に属する真菌によって生産されるか、又はそれらから得られるペルオキシダーゼである、請求項１〜５のいずれか１項の方法。
- 前記真菌がコプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）又はコプリヌス・マクロルヒズス（Coprinus macrorhizus）である、請求項６の方法。
- 前記真菌がコプリヌス・シネレウスIFO8371又はIFO30114である、請求項７の方法。
- 前記消毒用組成物中のオキシドレダクターゼの量が、10〜100μgタンパク質／ml組成物である、請求項１〜８のいずれか１項の方法。
- 前記洗浄用及び／又は消毒用組成物のpHが、4.5〜11の範囲にある、請求項１〜９のいずれか１項の方法。
- 前記pHが5〜9の範囲にある、請求項１０の方法。
- 前記pHが5.5〜7.5の範囲にある、請求項１０の方法。
- 前記洗浄用及び／又は消毒用組成物の温度が、10〜60℃の範囲にある、請求項１〜１２のいずれか１項の方法。
- 前記温度が20〜50℃の範囲にある、請求項１３の方法。
- 前記温度が25〜40℃の範囲にある、請求項１３の方法。
- 前記バイオフィルム層が、シュードモナス属、スタフィロコッカス属、アエロモナス属の細菌の中から、又は腸内細菌科の細菌の中から選択された生きた細菌を含んでいる、請求項１〜１５のいずれか１項の方法。
- 前記ヒドロラーゼがペクチナーゼであり、前記オキシドレダクターゼがペルオキシダーゼである、請求項１〜１６のいずれか1項の方法。
- 0.01〜5000μgタンパク質／ml組成物の量の１つ以上のペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ又はプロテアーゼと、0.01〜1000μgタンパク質／ml組成物の量のラッカーゼ又はペルオキシダーゼと、0.005-1000mmol/gバイオフィルムの量の、ヨウ化物塩又はチオシアン酸塩である促進剤と、界面活性剤を含んでいる、バイオフィルムで覆われた表面を洗浄及び／又は消毒するための組成物。
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