CN1649499A - 用于杀死孢子的方法和组合物 - Google Patents

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S·丹尼尔森
B·E·克里斯腾森
P·施奈德
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Abstract

本发明提供了包含漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂的杀孢子组合物。也公开了杀死或灭活孢子的方法和净化已经暴露于孢子的区域的方法。

Description

用于杀死孢子的方法和组合物
发明领域
本发明涉及用于杀死或灭活微生物孢子的酶方法。
发明背景
已知孢子形成于好氧的芽孢杆菌、厌氧的梭状芽孢杆菌、经选择的八叠球菌和一些放线菌。孢子类似于某些植物种子，因为它们不进行任何代谢反应。在这点上，它们尤其适于抵抗严峻的环境胁迫，并且已知它们在长时间暴露于热、干燥、辐射和有毒化学物质后仍能存活。这些特性使得孢子在像活组织或接触活组织的物体的环境中尤其难杀死，而活组织会受到极端条件的不利影响。
真菌、病毒和病原菌的营养细胞在70℃数分钟内被灭菌；许多孢子在100℃被灭菌。然而，一些腐生菌的孢子能在煮沸数小时后仍存活。目前加热是确保孢子灭菌的最常用方法。
一个特别难的问题涉及对蜡状芽孢杆菌这样的细菌性产孢子微生物的杀微生物处理。
蜡状芽孢杆菌种群的微生物包括蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。这些微生物共享许多表型特性，具有高度的染色体序列相似性，且是已知的肠毒素产生者。
虽然对所有产孢子的微生物进行杀微生物处理存在困难，因为它们形成孢子，但是蜡状芽孢杆菌是最难处理的之一，因为蜡状芽孢杆菌已被确认为对用作净化环境表面的杀菌化学物质具有增强的抗性。
蜡状芽孢杆菌是非常确实的肠毒素产生者和食物传染病原体。该生物体通常被诊断为引起胃肠紊乱的原因并已被提出为几种食物传染病发作的致因。该生物体在自然界中普遍存在，因而在动物饲料和草料中存在。由于该生物体具有快速形成孢子的能力，该生物体在环境中容易存活并能在母牛的肠道中存活。该生物体能通过粪便和土壤污染鲜奶，且蜡状芽孢杆菌易于在巴氏消毒处理后存活。
本发明提供用于杀死或灭活孢子的改良酶方法。
发明概述
第一个方面，本发明提供杀孢子组合物，该组合物包含漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂。
第二个方面，提供用于杀死或灭活孢子的方法，该方法包含用本发明的杀孢子组合物与孢子接触。
第三个方面，提供净化已暴露于孢子的区域的方法，该方法包含用本发明的组合物与孢子接触。
第四个方面，提供包含本发明组合物的容器，其中组合物的组分被包装在一个或多个分隔室或分隔层中。
第五个方面，提供包含本发明组合物的现成可用的杀孢子配方。
在实施方案中，碘化物源可以是一种或多种碘化物的盐，比如碘化钠或碘化钾或它们的混合物。
在其它实施方案中，本发明的杀孢子组合物还包含表面活性剂。
发明详述
漆酶和显示漆酶活性的化合物
显示漆酶活性的化合物可以是包括于生物化学和分子生物学国际联合会命名委员会(the Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology，IUBMB))提出的EC 1.10.3.2酶类的任一种漆酶，或者是显示漆酶活性的任何由漆酶衍生的片段，或表现相似活性的化合物，比如邻苯二酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶和/或显示漆酶活性的化合物是微生物源的酶。酶可以来源于植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来源于真菌的合适的例子包括来自曲霉属(Aspergillus)，链孢霉属(Neurospora)如粗糙脉孢菌(N.crassa)，柄孢壳属(Podospora)，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香茹属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)如T.villosa和变色栓菌(T.versicolor)，丝核菌属(Rhizoctonia)如立枯丝核菌(R.solani)，鬼伞属(Coprins)如灰盖鬼伞(C.cinereu)、毛头鬼伞(C.comatus)、费赖斯鬼伞(C.friesii)和褶纹鬼伞(C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)如黄盖小脆柄菇(P.condelleana)，斑褶菇属(Panaeolus)如蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毁丝霉属(Myceliophthora)如嗜热毁丝霉(M.thermophila)，柱顶孢属(Scytalidium)如嗜热柱顶孢(S.thermophilum)，多孔菌属(Polyporus)如筛孔多孔菌(P.pinsitus)，射脉菌属(Phlebia)如射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)，或革盖菌属(Coriolus)如毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2-238885)菌株的漆酶。
来源于细菌的合适的例子包括来自芽孢杆菌属菌株的漆酶。
优选来自鬼伞属、毁丝霉属、多孔菌属、柱顶孢属或丝核菌属的漆酶；特别是来自灰盖鬼伞、嗜热毁丝霉、筛孔多孔菌、嗜热柱顶孢或立枯丝核菌的漆酶。
漆酶或漆酶相关酶还可以是可通过下列方法产生的酶，该方法包括在允许漆酶表达的条件下于培养基中培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，该重组DNA载体携带编码所述漆酶的DNA序列以及允许编码漆酶的DNA序列表达的DNA序列编码功能，以及从培养基中回收漆酶。
漆酶活性(LACU)的测定
漆酶活性(尤其适用于多孔菌属漆酶)可通过在有氧条件下通过氧化丁香醛连氮而测定。产生的紫色在530纳米比色测定。分析条件是19mM丁香醛连氮，23mM醋酸缓冲液，pH 5.5，30℃，反应时间1分钟。
1个漆酶单位(LACU)是在这些条件下每分钟催化1.0毫摩尔丁香醛连氮转化所需的酶量。
漆酶活性(LAMU)的测定
漆酶活性可在有氧条件下通过氧化丁香醛连氮而测定。产生的紫色在530纳米测定。分析条件是19mM丁香醛连氮，23mMTris/马来酸缓冲液，pH 7.5，30℃，反应时间1分钟。
1个漆酶单位(LAMU)是在这些条件下每分钟催化1.0毫摩尔丁香醛连氮转化所需的酶量。
氧源
漆酶或显示漆酶活性的化合物所需的氧源可以是来源于大气的氧气或来源于用作原位产生氧的前体。来源于大气的氧气通常以充足的量存在。如果需要更多的氧气，可加入额外的氧气，如作为压缩空气或作为纯的压缩氧气。
碘离子源
根据本发明，与漆酶反应所需的碘离子源可通过许多不同的途径获得，例如通过添加一种或多种碘化物的盐。在一种优选实施方案中，碘化物的盐是碘化钠或碘化钾或它们的混合物。
碘离子源的浓度一般相当于0.01mM至1000mM，优选从0.05mM至500mM，和更优选从0.1mM至100mM的碘离子浓度。
增强剂
增强剂可选自包含＞N-OH组分的脂肪族的、脂环族的、杂环的或芳香族的化合物。在本发明的一个优选实施方案中，增强剂是通式I的化合物：
Figure A0380930800061
其中R1、R2、R3、R4分别选自于氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基以及它们的盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基以及它们的盐和酯，其中R1、R2、R3、R4可用R5取代，其中R5代表氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基以及它们的盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基以及它们的盐和酯。
[X]代表选自(-N＝N-)、(-N＝CR6-)m、(CR6＝N-)m、(-CR7＝CR8-)m、(-CR6＝N-NR7-)、(-N＝N-CHR6-)、(-N＝CR6-NR7-)、(-N＝CR6-CHR7-)、(-CR6＝N-CHR7)、(-CR6＝CR7-NR8-)和(CR6＝CR7-CHR8-)的基团，其中R6、R7和R8彼此独立地选自于H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-6-烷基、NO2、CN、Cl、Br、F、CH2OCH3、OCH3和COOCH3；且m是1或2。
如这里使用的术语“C1-n-烷基”，其中n可以是从2至12，代表具有一至特定数目碳原子的有分支的或直链烷基。一般C1-6-烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。
在本发明的一个更优选实施方案中，增强剂是通式II的化合物：
其中R1、R2、R3、R4分别选自氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基以及它们的盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基以及它们的盐和酯，其中R1，R2，R3，R4可用R5取代，其中R5代表氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基和它们的盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基以及它们的盐和酯。
增强剂也可以是分子式I或II的盐或酯。
更优选的增强剂为杂环化合物的氧代衍生物和N-羟基衍生物以及杂环化合物的氧代和甲酰基衍生物的肟，所述杂环化合物包括五元含氮杂环，特别是吡咯、吡唑和咪唑以及它们的氢化对应物(如吡咯烷)以及三唑，比如1，2，4-三唑；六元含氮杂环，特别是单-，二-和三azinane(比如哌啶和哌嗪)、吗啉和它们的不饱和对应物(如吡啶和嘧啶)；和含有上述杂环作为亚结构的稠合杂环如吲哚、苯并噻唑、喹啉和苯并氮杂。
从这些类化合物中优选的增强剂例子有吡啶醛肟；N-羟基吡咯烷二酮，如N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基苯邻二甲酰亚胺；3，4-二氢-3-羟基苯并[1，2，3]三嗪-4-酮；甲醛肟三聚体(N，N′，N″-三羟基-1，3，5-三azinane)；和紫尿酸(1，3-二azinane-2，4，5，6-四酮-5-肟)。
可应用于本发明的其它增强剂包括芳香族化合物的氧代-和甲酰基-衍生物的肟，如苯醌二肟和水杨醛肟(2-羟基苯甲醛肟)以及N-羟基酰胺和N-羟基苯胺，比如N-羟基乙酰苯胺。
优选的增强剂选自于1-羟基苯并三唑；1-羟基苯并三唑水合物；1-羟基苯并三唑的钠盐；1-羟基苯并三唑的钾盐；1-羟基苯并三唑的锂盐；1-羟基苯并三唑的铵盐；1-羟基苯并三唑的钙盐；1-羟基苯并三唑的镁盐；和1-羟基苯并三唑-6-磺酸。
特别优选的增强剂是1-羟基苯并三唑。
上述N-羟基化合物的所有说明理解为包括互变异构形式比如任何相关的N-氧化物。
增强剂的另一优选基团包含-CO-NOH-基团且具有通式III：
Figure A0380930800081
其中A是：
且B和A一样；或者B是H或C1-12-烷基，所述烷基可包含羟基、酯或醚基团(如其中，醚氧直接连到A-N(OH)C＝O-上，因而包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6彼此独立地是H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-8-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、C1-6-CO-NOH-A、CO-NOH-A、COR12、苯基-CO-NOH-A、OR7、NR8R9、COOR10或NOH-CO-R11，其中R7，R8，R9，R10，R11和R12是C1-12-烷基或酰基。
A的R2、R3、R4、R5和R6优选H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-3-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、COR12、OR7、NR8R9、COOR10或NOH-CO-R11，其中R7，R8和R9是C1-3-烷基或酰基，而R10、R11和R12是C1-3-烷基；更优选地A的R2、R3、R4、R5和R6是H、OH、NH2、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、CO-NOH-苯基、COCH3、OR7、NR8R9或COOCH3，其中R7、R8和R9是CH3或COCH3；更优选地A的R2、R3、R4、R5和R6是H、OH、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CO-NOH-苯基、OCH3、COCH3或COOCH3；且特别地A的R2、R3、R4、R5和R6是H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基或OCH3。
B的R2、R3、R4、R5和R6优选H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-3-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、COR12、OR7、NR8R9、COOR10或NOH-CO-R11，其中R7、R8和R9是C1-3-烷基或酰基，而R10、R11和R12是C1-3-烷基；更优选地B的R2、R3、R4、R5和R6是H、OH、NH2、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、CO-NOH-苯基、COCH3、OR7、NR8R9或COOCH3，其中R7、R8和R9是CH3或COCH3；更优选地B的R2、R3、R4、R5和R6是H、OH、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CO-NOH-苯基、OCH3、COCH3或COOCH3；且特别地B的R2、R3、R4、R5和R6是H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基或OCH3。
B优选H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基、酯或醚基团；优选的所述烷基可包含酯或醚基团；更优选的所述烷基可包含醚基团。
在一种优选实施方案中，A和B彼此独立地是：
或B是H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基、酯或醚基团(如其中醚氧直接连到A-N(OH)C＝O-上，因而包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6彼此独立地是H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-3-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、COR12、OR7、NR8R9、COOR10或NOH-CO-R11，其中R7、R8和R9是C1-3-烷基或酰基，而R10、R11和R12是C1-3-烷基。
在另一实施方案中，A和B彼此独立地是：
或B是H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基或醚基团(如其中，醚氧直接连到A-N(OH)C＝O-上，因而包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、
R4、R5和R6彼此独立地是H、OH、NH2、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、CO-NOH-苯基、COCH3、OR7、NR8R9或COOCH3，其中R7、R8和R9是CH3或COCH3。
在另一实施方案中，A和B彼此独立地是：
或B是H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基或醚基团(如其中，醚氧直接连到A-N(OH)C＝O-上，因而包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6彼此独立地是H、OH、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CO-NOH-苯基、OCH3、COCH3或COOCH3。
在另一实施方案中，A和B彼此独立地是：
或B是C1-3-烷基，所述烷基可包含醚基团(如其中，醚氧直接连到A-N(OH)C＝O-上，因而包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6彼此独立地是H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基或OCH3。
如这里使用的术语“C1-n-烷基”，其中n可从2至12，代表具有一至特定数目个碳原子的有分支的或直链烷基。一般C1-6-烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。
如这里使用的术语“酰基”是指包含和羰基连接的C1-6-烷基的一价取代基；比如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、新戊酰基、戊酰基等。
在一种实施方案中，A的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少一个是H，优选A的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少两个是H，更优选A的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少三个是H，最优选A的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少四个是H，特别地A的R2、R3、R4、R5和R6取代基都是H。
在另一实施方案中，B的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少一个是H，优选B的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少两个是H，更优选B的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少三个是H，最优选B的R2、R3、R4、R5和R6取代基中至少四个是H，特别地B的R2、R3、R4、R5和R6取代基都是H。
在根据本发明的特别的实施方案中，增强剂选自于4-硝基苯甲酸-N-羟基苯胺；4-甲氧基苯甲酸-N-羟基苯胺；N，N′-二羟基-N，N′-二苯基对苯二酰胺；癸酸-N-羟基苯胺；N-羟基-4-氰基乙酰苯胺；N-羟基-4-乙酰乙酰苯胺；N-羟基-4-羟基乙酰苯胺；N-羟基-3-(N′-羟基乙酰胺)乙酰苯胺；4-氰基苯甲酸-N-羟基苯胺；N-羟基-4-硝基乙酰苯胺；N-羟基乙酰苯胺；N-羟基-N-苯基-氨基甲酸异丙酯；N-羟基-N-苯基-氨基甲酸甲酯；N-羟基-N-苯基-氨基甲酸苯酯；N-羟基-N-苯基-氨基甲酸乙酯；和N-羟基-N-(4-氰基苯基)-氨基甲酸甲酯。
另一组优选的增强剂是通式IV的酚化合物(丁香酸烷基酯类)：
Figure A0380930800121
其中，在所述分子式中的字母A表示基团比如-D、-CH＝CH-D、-CH＝CHCH＝CH-D、-CH＝N-D、-N＝N-D或-N＝CH-D，其中D选自于-CO-E、-SO2-E、-N-XY和-N+-XYZ，其中E可以是-H、-OH、-R或-OR，且X和Y和Z可以是相同的或不同的并选自于-H和-R；R是C1-C16烷基，优选C1-C8烷基，该烷基可以是饱和的或不饱和的，有分支的或没有分支的并任选地用羧基、磺基或氨基取代；而B和C可以是相同或不同的并选自于CmH2m+1，其中m＝1、2、3、4或5。
在上述提到的通式IV中，A可被放在羟基的间位而不是如上显示放在对位。
在本发明的特别的实施方案中，增强剂选自于具有通式V的组：
Figure A0380930800131
其中A是这样的基团，比如-H、-OH、-CH3、-OCH3、-O(CH2)nCH3，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8。
然而另一组优选的增强剂是如描述在VI中的化合物：
Figure A0380930800132
其中通式A代表单键或下列基团之一：(-CH2-)、(-CH＝CH-)、(-NR11-)、(-CH＝N-)、(-N＝N-)、(-CH＝N-N＝CH-)或(＞C＝O)；且在通式中，取代基R1-R11可以是相同或不同的，独立代表下列任一基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基以及它们的酯和盐，氨基甲酰基、磺基以及它们的酯和盐，氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基、C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基和氨基还可以不被取代或者用取代基R12一次或二次取代；C1-8-烷基可以是饱和的或不饱和的，有分支的或无分支的，且还可以不被取代或者用取代基R12一次或多次取代；其中取代基R12代表下列任一基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基以及它们的酯和盐，氨基甲酰基、磺基以及它们的酯和盐，氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基和氨基还可以不被取代或者用羟基或甲基一次或二次取代。并且在通式中，R5和R6可以一起构成基团-B-，其中B代表单键、基团(-CH2-)、(-CH＝CH-)、(-CH＝N-)之一；或者B代表硫或氧。
在本发明的特别的实施方案中，增强剂选自于具有通式VII的组：
通式中X代表单键、氧或硫；并且在通式中，取代基R1-R9可以是相同的或不同的，独立代表下列任一基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基以及它们的酯和盐，氨基甲酰基、磺基以及它们的酯和盐，氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基、C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基和氨基还可以不被取代或者用取代基R10一次或二次取代；且其中C1-8-烷基可以是饱和的或不饱和的，有分支的或无分支的，且还可以不被取代或者用取代基R10一次或多次取代；其中取代基R10代表下列任一基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基以及它们的酯和盐，氨基甲酰基、磺基以及它们的酯和盐，氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基和氨基还可以不被取代或者用羟基或甲基一次或二次取代。
根据本发明，增强剂存在于组合物中的浓度范围可以从0.01mM至1000mM，优选从0.05mM至500mM，更优选从0.1mM至100mM，和最优选从0.1mM至50mM。
孢子
与本发明方法中的漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂接触的孢子包含各种孢子。
在一种实施方案中，孢子是内生孢子，比如所有梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)孢子，短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)孢子和芽孢杆菌(Bacillus sp.)孢子，如来自于炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Bacillus putida和短小芽孢杆菌(Bacillus pumila)的孢子。
在另一实施方案中，孢子是外生孢子，比如放线菌目(Actinomycetales)孢子，如来自于某种放线菌(Actinomyces sp.)、某种链霉菌(Streptomycessp.)、某种高温放线菌(Thermoactinomyces)、某种糖单孢菌(Saccharomonospora)和某种糖多孢菌(Saccharopylospora)的孢子。
在另一实施方案中，孢子是细菌孢子。细菌孢子的例子包括但不限于上面提到的所有梭状芽孢杆菌孢子和芽孢杆菌孢子。
然而在另一实施方案中，孢子是真菌孢子。真菌孢子的例子包括(除了上面提到的那些外)但不限于分生孢子，比如来自于某种曲霉菌和某种青霉菌(Penicillium sp.)的孢子。
表面活性剂
适于掺入杀孢子组合物中的表面活性剂可以是非离子的(包括半极性的)、阴离子的、阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂优选阴离子的或非离子的。表面活性剂一般存在于杀孢子组合物中的浓度从0.01％至10％重量。
当包含在所述杀孢子组合物中时，通常包含从约0.01％至约10％，优选约0.05％至约5％，和更优选约0.1％至约1％重量的阴离子表面活性剂，比如直链烷基苯磺酸酯、α-烯属磺酸酯、烷基硫酸酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲链烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。
当包含在所述杀孢子组合物中时，通常包含从约0.01％至约10％，优选约0.05％至约5％，和更优选约0.1％至约1％重量的非离子表面活性剂，比如乙氧基化脂肪醇、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
组合物
本发明提供包含漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂的组合物。
漆酶或显示漆酶活性的化合物，碘离子源和增强剂可被配制为液体(如水溶液)、固体、凝胶、糊状或干燥产品配方。干燥产品配方随后可重新与水结合形成在本发明的方法中可用的活性液体或半液体配方。
当漆酶或显示漆酶活性的化合物、碘离子源和增强剂被配制成干燥配方时，其中安放在分别的分隔层中或被分开包装的组分可被混合。
当被配制成固体时，所有组分可被混合在一起，如作为粉末、颗粒或胶状产品。
当使用非干燥形式的组合物以及即使使用干燥形式组合物时，优选使用有两组分(two-part)的配方体系，其中酶与其它组合物成分分开。
本发明的组合物还可包含助剂，比如润湿剂、增稠剂、缓冲剂、稳定剂、香料、着色剂、填充剂等。
有用的润湿剂是表面活性剂，即非离子的，阴离子的，两性的或两性离子的表面活性剂。表面活性剂在上文被进一步描述。
本发明的组合物可以是浓缩产品或现成可用的产品。在使用中，浓缩产品一般用水稀释以提供具有有效的杀孢子活性的介质，被应用到待清洁或消毒的物体，并使得与存在的孢子反应。
组合物水溶液的pH在pH 2至11范围内，优选在pH 3至10.5范围内，更优选在pH 4至10范围内，最优选在pH 5至9范围内，并特别地在pH 6至8范围内。
方法和用途
本发明提供用于杀死或灭活孢子的酶方法，该方法包含用漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂与孢子接触。
在本发明上下文中，术语“杀死或灭活孢子”意指至少99％的孢子不能转变(萌发)成营养细胞。优选99.9％(更优选99.99％和最优选99.999％)的孢子不能转变成营养细胞。
孢子可与本发明组合物接触，在0和90摄氏度温度之间，优选在5和80摄氏度之间，更优选在10和70摄氏度之间，甚至更优选在15和60摄氏度之间，最优选在18和50摄氏度之间，且特别地在20和40摄氏度之间接触。
本发明组合物适于用作杀死或灭活在多种环境中的孢子。本发明组合物可令人满意地被用在任何环境中以减少孢子污染，比如卫生保健业(如动物医院，人的医院，动物诊所，人的诊所，疗养院、孩子或老人的日托机构等)，食品业(如饭店、食品加工厂、食品贮藏室、杂货店等)，招待业(如旅馆、汽车旅馆、度假胜地、游轮等)，教育业(如学院和大学)等。
本发明组合物可合意地被用在任何环境中以减少孢子污染，比如通常房屋中的表面(如地面、墙壁、顶棚、家具外表等)，特殊设备的表面(如硬表面、制造设备、加工设备等)，纺织品(如棉纱，绒，丝绸，合成纤维织物如聚酯、聚烯烃和丙烯酸树脂，混合纤维如棉聚酯(cottonpolyester)等)，基于木材和纤维素的体系(如纸张)，土壤，动物尸体(如兽皮、兽肉、毛发、羽毛等)，食品(如水果、蔬菜、坚果、肉等)和水。
在一种实施方案中，本发明的方法被用于纺织品的杀孢子处理。蜡状芽孢杆菌种群的孢子已被确认为纺织品洗后的主要污染物。因此，用本发明组合物对纺织品的处理对于杀孢子活性以抗纺织品污染物特别有用。
可用本发明组合物处理的纺织品的例子包括但不限于私人物品(如衬衫、短裤、长袜、内衣等)，公共物品(如毛巾、实验服、长袍、围裙等)，招待用物品(如毛巾、餐巾、桌布等)。
用本发明组合物对纺织品的杀孢子处理可包括用本发明组合物接触纺织品。这种接触可在洗烫纺织品前进行。备选地，这种接触可在洗烫纺织品期间进行以提供杀孢子活性和任选地提供清洁活性以从纺织品上去除或减少土、污点等。
用本发明组合物接触的孢子可被置于下列任何表面上，其包括但不限于用在如奶制品的加工设备表面、化学的或药物加工厂、实验设备、水卫生系统、油加工厂、纸浆加工厂、水处理厂或冷却塔。本发明组合物应该按一定的量使用，该量对于杀死或灭活所讨论的表面上的孢子是有效的。
孢子可与本发明组合物接触，通过将孢子浸没在组合物的水配方中(如洗烫过程)，通过喷涂组合物到孢子上，通过利用布或利用其它任何由技术人员验证过的方法将组合物应用于孢子。将组合物应用于孢子的导致杀死或灭活孢子的任一种方法，是应用中可接受的方法。
本发明的方法对于净化已经暴露于孢子的区域也是有用的(如病原孢子)，比如生物战争试剂，如能引起炭疽热的炭疽芽孢杆菌的孢子。这样的区域包括但不限于衣服(比如军用服装)、车辆的内外部件、建筑物内外部位、任一种军用设备以及上面提到的任一种环境。
本发明在下面的实施例中被进一步描述，该实施例不应被认作限制本
发明的范围。
实施例
用作缓冲液和底物的化学品至少是试剂级的商业产品。
实施例1
孢子的产生
用新鲜培养的苏云金芽孢杆菌(苏云金芽孢杆菌型菌株ATCC10792)在胰蛋白胨Blod Agar Base(TBAB)平板上划线。培养基在30摄氏度温育过夜。
来自于TBAB平板的一菌环量的纯苏云金芽孢杆菌细胞悬浮于2毫升无菌水中。2×SG平板分别用100微升细胞悬浮液接种。2×SG的组合物如下：16克/升Difco细菌用营养肉汤，0.5克/升MgSO4·7H2O，2.0克/升KCl，1.0毫升/100毫升的10％的葡萄糖，0.1毫升/100毫升的1M Ca(NO3)2，0.1毫升/100毫升的0.1M MnSO4，10微升/100毫升的0.01M FeSO4和1％Difco细菌用琼脂。
平板在30摄氏度温育48-72小时。孢子形成用相差显微镜术检测。孢子是相界明亮的(phase-bright)。
当孢子形成率接近100％时，细胞菌苔用水收获，并将细胞通过充分涡旋悬浮。细胞通过在4摄氏度6000G离心5-10分钟收集，并用冰冷的水洗涤三次。沉淀含有营养细胞和孢子。
应用密度梯度从营养细胞中分离孢子。为每个洗涤过的沉淀物准备一个含有30毫升43％Urographin_的离心管。制备3毫升细胞孢子混合物于Urographin中以便于最终Urographin浓度为20％。将20％的Urographin细胞/孢子混合物轻轻装到含有43％Urographin的离心管的上层。
离心管于室温以10000G离心30分钟。将上清液轻轻移去。纯的孢子沉淀悬浮在1毫升冰冷的水中并被转移到微离心管中。于4摄氏度以最大转速继续离心1-2分钟，然后将沉淀用冰冷的水洗涤两次以上。
用相差显微镜术和血细胞计数器检测纯度和每毫升中孢子的数量。将孢子悬浮于水中于零下20摄氏度贮藏。
按照如上概述的同样步骤制备球芽孢杆菌(Bacillus globigii)孢子。
实施例2
孢子的杀死
准备下列试剂：
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.5；用DMG缓冲液重新悬浮苏云金芽孢杆菌孢子以形成每毫升2×109个孢子的密度；
用DMG缓冲液将嗜热毁丝霉的漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；并可获自Novozymes A/S)稀释至200微克/毫升；
用DMG缓冲液将筛孔多孔菌漆酶(如在WO 96/00290中公开的，图1，SEQ ID NO：1；并可获自Novozymes A/S)稀释至200微克/毫升；
200mM碘化钾(KI)水溶液；
1mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，Sigma S40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCl，
加水到1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
将孢子悬浮液转移到微量滴定板A排的加样孔中。其它试剂按下面的表1指示的加入。反应在加入漆酶溶液开始。
表1.
加样孔  DMG缓冲液(微升)    孢子(微升)    漆酶(微升)   碘化钾(微升) 丁香酸甲酯(微升)
  A1-A2     115     50     20     5     10
  A3-A4     120     50     20     0     10
  A5-A6     125     50     20     5     0
  A7-A8     145     50     0     5     0
  A9-A10     130     50     20     0     0
  A11-A12     150     50     0     0     0
微量滴定板在室温(24摄氏度)温育一小时。
将180微升TBB生长培养基加到微量滴定板的B排至H排的所有加样孔中。通过从A排转移20微升到B排，然后从B排转移20微升到C排，然后从C排转移20微升到D排等等直到H排，达到连续10倍的稀释。
微量滴定板在30摄氏度温育20-24小时以使孢子萌发和生长。生长通过微量培养板读数仪评价，并通过将5微升3mM MTT加到每个加样孔中以“显示生长”而目测评价。紫色甲_的形成显示细菌生长并因此显示孢子的灭活程度。在表中，生长用“+”号表示。
表2.对用嗜热毁丝霉漆酶处理的孢子生长进行评价的结果
  1  2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   -  -   +   +   +   +   +   +   +   +   -   +
  C   -  -   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  D   -  -   +   +   +   +   +   +   +   +   -   +
  E   -  -   +   +   +   +   +   +   +   +   -   +
  F   -  -   +   +   +   +   +   +   +   +   -   +
  G   -  -   +   +   +   +   +   +   +   +   -   +
  H   -  -   -   -   -   -   -   -   +   +   -   -
表3.用筛孔多孔菌漆酶处理的孢子生长进行评价的结果
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   -   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  C   -   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  D   -   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   +   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  H   -   -   -   -   -   -   +   -   +   +   -   +
表2和表3中的结果显示只有加到包含漆酶、碘化钾和增强剂(丁香酸甲酯)的A1-A2孔中的配方能灭活孢子。
实施例3
在5-60℃杀死孢子
配制下列试剂：
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.5；苏云金芽孢杆菌孢子被重新悬浮于DMG缓冲液形成每毫升2×109个孢子的密度；
嗜热毁丝霉漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
灰盖鬼伞漆酶(如在WO 97/08325中公开的，图1，SEQ ID NO：27；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
立枯丝核菌漆酶(如在WO 95/07988中公开的，图4，SEQ ID NO：14；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
筛孔多孔菌漆酶(如在WO 96/00290中公开的，图1，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
200mM碘化钾(KI)水溶液；
1mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，Sigma S40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCI，
加水到1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
将孢子悬浮液转移到微量滴定板A排的加样孔中。其它试剂按下面的表4指示的加入。反应在加入漆酶溶液开始。然后在特定温度温育微量滴定板1小时。
将180微升TBB生长培养基加到微量滴定板的B排至H排的所有加样孔中。
通过从A排转移20微升到B排，然后从B排转移20微升到C排，然后从C排转移20微升到D排等等直到H排，达到连续10倍的稀释。
表4.微量滴定板设置--每块平板被用于测试在同一温度的两种漆酶
加样孔  DMG缓冲液(微升)    孢子(微升)    漆酶(微升)  碘化钾(微升)  丁香酸甲酯(微升)
  A1-A3     166     50     15   6.25     12.5
  A4-A6     200     50     0   0     0
  A7-A9     166     50     15   6.25     12.5
  A10-A12     200     50     0   0     0
微量滴定板在30摄氏度温育20-24小时以使孢子萌发和生长。生长通过微量培养板读数仪评价，并通过将5微升3mM MTT加到每个加样孔中以“显示生长”而目测评价。紫色甲_的形成显示细菌生长并因此显示孢子的灭活程度。杀孢子能力被评价为在对照组和含漆酶/碘化物/丁香酸甲酯加样孔间具有细菌生长的稀释步骤次数间的差异。杀孢子能力用log单位(log U)衡量—一个log单位等于如描述在实施例2中的一步10倍稀释步骤的生长间差异。
在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60摄氏度测试四种漆酶的结果总结在表5、6、7和8中。
            表5.在5-60摄氏度时灰盖鬼伞漆酶的杀孢子效果
   温度(摄氏度)  5  10  15  20  25  30  35  40  45  50  55  60
杀死，logU  1  1  1  4  4.5  4  4  4.5  4  3.5  3.5  2
            表6.5-60摄氏度时嗜热毁丝霉漆酶的杀孢子效果。
   温度(摄氏度)  5  10  15  20  25  30  35  40  45  50  55  60
杀死，logU  0  3  3  3  5  5.5  5  5  5  3.5  3  3
            表7.在5-60摄氏度时筛孔多孔菌漆酶的杀孢子效果。
   温度(摄氏度)  5  10  15  20  25  30  35  40  45  50  55  60
杀死，logU  3  3.5  6  6.5  7  7  7  7  6  6  5  5
           表8.在5-60摄氏度时立枯丝核菌漆酶的杀孢子效果
   温度(摄氏度)  5  10  15  20  25  30  35  40  45  50  55  60
杀死，logU  1  1.5  3  3  3  3  3  3  2  2  2  2
显示在表5-8中的结果表明所有四种漆酶表现杀孢子活性且最佳杀孢子效能在15-45摄氏度的温度范围内实现。
实施例4
在pH 6.0-pH 8.0时对孢子的杀死
配制下列试剂：
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0；
苏云金芽孢杆菌孢子被重新悬浮于DMG缓冲液形成每毫升2×109个孢子的密度；
嗜热毁丝霉漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
灰盖鬼伞漆酶(如在WO 97/08325中公开的，图1，SEQ ID NO：27；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
立枯丝核菌漆酶(如在WO 95/07988中公开的，图4，SEQ ID NO：14；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
筛孔多孔菌漆酶(如在WO 96/00290中公开的，图1，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至500微克/毫升DMG缓冲液；
200mM碘化钾(KI)水溶液；
1mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，Sigma S40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCI，
加水到1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
将孢子悬浮液转移到微量滴定板A排的加样孔中。其它试剂按下面的表9指示的加入。反应通过加入漆酶溶液开始。微量滴定板然后在30℃温育1小时。
将180微升TBB生长培养基加到微量滴定板的B排至H排的所有加样孔中。
通过从A排转移20微升到B排，然后从B排转移20微升到C排，然后从C排转移20微升到D排等等直到H排，达到连续10倍的稀释。
表9.在每一pH值下对四种漆酶中的每一种创建微量滴定板
加样孔   DMG缓冲液(微升)    孢子(微升)    漆酶(微升)    碘化钾(微升) 丁香酸甲酯(微升)
  A1-A2     182     50     5     6.5     6.5
  A3-A4     165.5     50     15     6.5     13
  A5-A6     188.5     50     5     6.5     0
  A7-A8     188.5     50     5     0     6.5
  A9-A10     187     50     0     6.5     6.5
  A11-A12     200     50     0     0     0
微量滴定板在30摄氏度温育20-24小时以使孢子萌发和生长。生长通过微量培养板读数仪评价，并通过将5微升3mM MTT加到每个加样孔中以“显示生长”而目测评价。紫色甲_的形成显示细菌生长并因此显示孢子的灭活程度。杀孢子能力被评价为在对照组与含漆酶/碘化物/丁香酸甲酯加样孔间(具有细菌生长的)稀释步骤次数间的差异。杀孢子能力用log单位(log U)衡量—一个log单位等于一步10倍稀释步骤的生长间的差异。在pH 6.0-pH 8.0测试四种漆酶的结果被总结在表10、11、12和13中。
        表10.在pH 6.0-8.0范围内灰盖鬼伞漆酶的杀孢子效果
    PH     6.0     6.5     7.0     7.5     8.0
杀死，logU     5     4.5     3.5     3.5     2
表11.在pH6.0-8.0范围内嗜热毁丝霉漆酶的杀孢子效果。
    pH     6.0     6.5     7.0     7.5     8.0
杀死，logU     6     4     4.5     2.5     2
表12.在pH 6.0-8.0范围内筛孔多孔菌漆酶的杀孢子效果。
    pH     6.0     6.5     7.0     7.5     8.0
杀死，logU     7     7     5.5     3     0
表13.在pH 6.0-8.0范围内立枯丝核菌漆酶的杀孢子效果。
    pH     6.0     6.5     7.0     7.5     8.0
杀死，logU     3.5     3     3     2     0.3
表10-13中的结果证明所有四种漆酶在特定的pH范围内是有活性的。
实施例5
对沉积在瓷砖I上的孢子的杀死
配制下列试剂：
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.5；
苏云金芽孢杆菌孢子被重新悬浮于DMG缓冲液形成每毫升2×109个孢子的密度；
嗜热毁丝霉漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至30毫克/毫升。
200mM碘化钾(KI)水溶液；
10mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，SigmaS40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
具有琼脂糖的TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCI，
5克/升琼脂糖
加水至1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
用水将孢子被稀释至20个孢子毫升；200个孢子毫升；2000个孢子毫升；20,000个孢子毫升和200,000个孢子毫升。
1毫升孢子悬浮液被涂到5×5厘米光滑的和不光滑的瓷砖表面上，并将瓷砖在室温下干燥过夜。
将每块分别具有20；200；2000；20,000和200,000个孢子/瓷砖的瓷砖光滑表面朝上或不光滑表面朝上置于9厘米培养皿。
将下列试剂混合：
222微升嗜热毁丝霉漆酶溶液
702微升碘化钾溶液
222微升丁香酸甲酯溶液
2769微升1，2-丙二醇
26586微升DMG缓冲液，pH 6.5
-并将1400微升该混合物转移到每块瓷砖表面并用移液管末端轻轻涂抹以覆盖瓷砖的每个角落。作为对照，接种孢子的瓷砖用1400微升对照物质处理：3毫升1，2-丙二醇与29毫升pH 6.5的DMG缓冲液的混合物。
将瓷砖置于室温(约24摄氏度)不加盖温育过夜。每块干燥瓷砖的表面用一薄层熔化的(约45摄氏度)具有琼脂糖的TBB生长培养基覆盖。当琼脂糖生长培养基凝固后，该瓷砖在湿盒(moist chamber)中于30摄氏度温育约20小时。温育后，通过逐滴滴加3mM MTT直到瓷砖的琼脂糖表面被覆盖，从而显露小菌落。1/2-2小时后，活的小菌落呈现为紫色斑点。在表14中，显示了对照组瓷砖和经处理瓷砖的对比结果。
表14.用带漆酶-碘化物-增强剂溶液净化接种有苏云金芽孢杆菌孢子的瓷砖。
            光滑表面                   不光滑表面
  沉积的孢子数 萌发的孢子数   沉积的孢子数 萌发的孢子数
对照   经处理的 对照   经处理的
   20   约20     0     20     约20     0
   200   约200     0     200     约200     0
   2000   太多而无法计数     0     2000     太多而无法计数     0
   20.000   太多而无法计数     0     20.000     太多而无法计数     0
   200.000   太多而无法计数     5     200.000     太多而无法计数     14
结果表明沉积在表面上的孢子被漆酶系统灭活。表面沉积孢子的密度约4×107/平方米。
实施例6
对沉积在瓷砖II上的孢子的杀死
配制下列试剂：
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.5；
苏云金芽孢杆菌孢子被重新悬浮于DMG缓冲液形成每毫升2×109个孢子的密度；
嗜热毁丝霉漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至30毫克/毫升。
筛孔多孔菌漆酶(如在WO 96/00290中公开的，图1，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至7，5毫克/毫升。
200mM碘化钾(KI)水溶液。
10mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，SigmaS40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
具有琼脂糖的TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCI，
5克/升琼脂糖
加水至1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
用水将孢子稀释至约5×106个孢子/毫升。
1毫升孢子悬浮液被涂到5×5厘米瓷砖的光滑和不光滑表面上，并将瓷砖置于室温干燥过夜。
将具孢子侧朝上安置瓷砖于9厘米培养皿。
通过将下列试剂加到一起制备混合物A、B、C和D：
A
5微升嗜热毁丝霉漆酶溶液
70微升碘化钾溶液
25微升丁香酸甲酯溶液
270微升1，2-丙二醇
2600微升DMG缓冲液，pH 6.5
得到具有50微克/毫升嗜热毁丝霉漆酶的混合物。
B
2.5微升嗜热毁丝霉漆酶溶液
70微升碘化钾溶液
25微升丁香酸甲酯溶液
270微升1，2-丙二醇
2600微升DMG缓冲液，pH 6.5
得到具有25微克/毫升嗜热毁丝霉漆酶的混合物。
C
20微升筛孔多孔菌漆酶溶液
70微升碘化钾溶液
25微升丁香酸甲酯溶液
270微升1，2-丙二醇
2600微升DMG缓冲液，pH 6.5
得到具有50微克/毫升筛孔多孔菌漆酶的混合物。
D
10微升筛孔多孔菌漆酶溶液
70微升碘化钾溶液
25微升丁香酸甲酯溶液
270微升1，2-丙二醇
2600微升DMG缓冲液，pH 6.5
得到具有25微克/毫升筛孔多孔菌漆酶的混合物。
将1400微升上述混合物A、B、C或D转移到每块瓷砖表面并用移液管末端轻轻涂抹以覆盖瓷砖的每个角落。
作为对照，接种孢子的瓷砖用1400微升对照物质处理：270微升1，2-丙二醇与2700微升pH 6.5的DMG缓冲液的混合物。
将瓷砖室温(约21摄氏度)不加盖温育过夜。每块干燥瓷砖的表面用一薄层熔化的(约45摄氏度)具有琼脂糖的TBB生长培养基覆盖。当琼脂糖生长培养基凝固后，瓷砖在湿盒中30摄氏度温育约20小时。温育后，通过逐滴滴加3mM MTT直到瓷砖的琼脂糖表面被覆盖，从而小菌落显露。1/2-2小时后，活的小菌落呈现为紫色斑点。在表15中显示了对照组瓷砖和经处理瓷砖的对比结果。
      表15.用减少量漆酶的漆酶-碘化物-增强剂溶液净化
               接种有苏云金芽孢杆菌孢子的瓷砖
  瓷砖表面   混合物A(菌落数)   混合物B(菌落数)  混合物C(菌落数)  混合物D(菌落数)   对照(菌落数)
  光滑表面 10 11 0 1 太多而无法计数
  不光滑表面 24 约100 2 4 太多而无法计数
结果表明沉积在表面上的孢子被具有低的(小于50毫克/升)漆酶浓度的漆酶净化体系灭活。
实施例7
对沉积在纺织品上的孢子的杀死
配制下列试剂：
孢子重新悬浮于无菌水中达到6×108/毫升的密度。
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.5；
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.0；
嗜热毁丝霉漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至30毫克/毫升；
200mM碘化钾(KI)水溶液；
10mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，SigmaS40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
0.1％(体积/体积)Tween
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCl，
加水至1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
漆酶-碘化物-增强剂溶液：
37微升嗜热毁丝霉漆酶溶液
115微升碘化钾溶液
37微升丁香酸甲酯溶液
500微升1，2-丙二醇
4311微升DMG缓冲液，pH 6.0
将100微升孢子悬浮液转移到三块1 1/8″×1 1/8″大小的干燥Pro-shotGun清洁棉花小片上。这些小片(小片1，小片2和对照)置于室温干燥过夜。
小片1和小片2各自置于5厘米开口的培养皿中并将2毫升漆酶-碘化物-增强剂溶液倒至小片上，将具有小片的开口培养皿置于室温(约24摄氏度)温育24小时。用500微升1，2-丙二醇溶于4500微升pH 6.5的DMG缓冲液处理的小片(对照)被用作对照。
将接近干燥的小片转移到含有10毫升0.1％(体积/体积)Tween的50毫升带螺旋盖的一次性离心管。离心管于室温浸入超声(Branson)清洗水浴30分钟。
来自于超声处理的离心管的100微升液体根据表16被转移到微量滴定板A排的加样孔中。
                          表16微量滴定板的创建
加样孔 漆酶-碘化物-增强剂小片1(微升) 漆酶-碘化物-增强剂小片2(微升)    对照(微升)
  A1-A4     100     0     0
  A5-A8     0     100     0
  A9-A12     0     0     100
将180微升TBB生长培养基加到微量滴定板的B排至H排的所有加样孔中。通过从A排转移20微升到B排，然后从B排转移20微升到C排，然后从C排转移20微升到D排等等直到H排，达到连续10倍的稀释。然后将150微升TBB转移进A排的加样孔中。
微量滴定板在30摄氏度温育12-24小时以允许孢子萌发和生长。生长通过微量培养板读数仪评价，并通过将5微升3mM MTT加到每个加样孔中以“显示生长”而目测评价。紫色甲_的形成显示细菌生长并因此显示孢子的灭活程度。
                              表17.生长的评价结果
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A   -   -   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +
  B   +   +   +   +   -   -   -   -   +   +   +   +
  C   -   -   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +
  D   -   -   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   -   -   +   +   -   -
  F   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  H   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
表17中的结果显示只有用漆酶、碘化钾和增强剂(丁香酸甲酯)处理含孢子的小片才能有效地被消毒。
实施例8
杀孢子效果的硫代硫酸盐淬灭
配置下列试剂：
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.5；
苏云金芽孢杆菌孢子被重新悬浮于DMG缓冲液形成每毫升2×109个孢子的密度；
嗜热毁丝霉漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至6000微克/毫升DMG缓冲液；
200mM碘化钾(KI)水溶液；
1mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，Sigma S40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
无菌水；
10％(W/V)硫代硫酸钠；
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCI，
加水到1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
将孢子悬浮液转移到五块微量滴定板A排的加样孔中。其它试剂按下面的表18指示的加入。反应在加入漆酶溶液开始。然后微量滴定板在30摄氏度预温育特定的时间：一块温育15分钟，一块温育30分钟，一块温育1小时，一块温育2小时和一块温育22小时。
在预温育末期，将50微升10％(重量/体积)硫代硫酸钠加到A排的每个加样孔中，并将板置于室温(约24摄氏度)再温育60分钟。
                                    表18.微量滴定板的设置
加样孔    DMG缓冲液(微升)    孢子(微升)    漆酶(微升)  碘化钾(微升)   丁香酸甲酯(微升)  硫代硫酸钠(微升)(*)     水(微升)(*)
  A1-A3     123     50     8   6.25     12.5     50     0
  A4-A6     123     50     8   6.25     12.5     0     50
  A7-A9     150     50     0   0     0     50     0
  A10-A12     150     50     0   0     0     0     50
(*)在预温育15和30分钟后和1、2和22小时后加入。
将180微升TBB生长培养基加到微量滴定板的B排至H排的所有加样孔中。通过从A排转移20微升到B排，然后从B排转移20微升到C排，然后从C排转移20微升到D排等等直到H排，达到连续10倍的稀释。
微量滴定板在30摄氏度温育20-24小时以使孢子萌发和生长。生长通过微量培养板读数仪评价，并通过将5微升3mM MTT加到每个加样孔中以“显示生长”而目测评价。紫色甲_的形成显示细菌生长并因此显示孢子的灭活程度。没有漆酶的对照组和有漆酶的杀灭混合物之间的生长差异，其中生长可被检测，以log单位直接给出杀死能力。
           表19.生长评价的结果。预温育15分钟后淬灭
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  C   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  D   +   +   +   -   -   +   +   +   +   +   +   +
  E   +   +   +   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   +   -   +   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   +   -   +   -   +   +
  H   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   +   -
                  表20.生长评价的结果。预温育1小时
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   +   +   +   +   -   -   +   +   +   +   +   +
  C   +   +   +   +   -   -   +   +   +   +   +   +
  D   -   +   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  H   -   -   -   -   -   -   -   -   +   -   -   -
                   表21.生长的评价结果。预温育2小时
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   -   +   +   +   +   -   +   +   +   +   +   +
  C   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  D   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   +   +   -   +   -   +
  H   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
                   表22.生长的评价结果。预温育4小时
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  C   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  D   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +
  H   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
表23.生长的评价结果。预温育22小时。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
 A
 B   -   -   - -  -  - + + + + + +
 C   -   -   - -  -  - + + + + + +
D - - - - - - + + + + + +
E - - - - - - + + + + + +
F - - - - - - + + + + + +
G - - - - - - - + - + + +
H - - - - - - - - - - + -
已知硫代硫酸盐十分有效地氧化碘化物。孢子灭活模式表明将孢子与漆酶体系温育超过1小时，导致不可逆转的孢子灭活。
实施例9
杀孢子效果的NaOH淬灭
配制下列试剂：
DMG缓冲液(3，3-二甲基戊二酸，Sigma D4379)，50mM，用NaOH将pH调至6.5；
苏云金芽孢杆菌孢子被重新悬浮于DMG缓冲液形成每毫升2×109个孢子/ml的密度；
嗜热毁丝霉漆酶(如在WO 95/33836中公开的，SEQ ID NO：1；且可获自Novozymes A/S)被稀释至6000微克/毫升DMG缓冲液；
200mM碘化钾(KI)水溶液；
1mM丁香酸甲酯(3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯，Sigma S40，944-8)的乙醇/DMG缓冲液(1∶1)溶液；
无菌水；
0.5M氢氧化钠(NaOH)；
0.5M盐酸(HCI)
3mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，SigmaM2128)水溶液。
TBB生长培养基：
10克/升胰蛋白胨，
3克/升牛肉提取物，
5克/升NaCI，
加水到1000毫升
最终pH 7.2+/-0.2。
将孢子悬浮液转移到微量滴定板A排的加样孔中。其它试剂按下面的表24指示的加入。反应在加入漆酶溶液开始。五块微量滴定板然后在30摄氏度预温育15分钟、30分钟、1小时、2小时和22小时。
在温育末期，将25微升0.5M氢氧化钠加到A排的特定加样孔中，参见表23。进一步温育60分钟后，所加的NaOH通过加25微升0.5M盐酸中和。
                                 表24.微量滴定板的设置。
加样孔    DMG缓冲液(微升)    孢子(微升)    漆酶(微升)      KI(微升)   丁香酸甲酯(微升)    NaOH(微升)(*)     水(微升)(*) HCl(**)
    A1-A3     123     50     8     6.25     12.5     25     0     25
    A4-A6     123     50     8     6.25     12.5     0     50     0
    A7-A9     150     50     0     0     0     25     0     25
    A10-A12     150     50     0     0     0     0     50     0
(*)在预温育15，30分钟后和1小时，2小时和22小时后加入。
(**)用NaOH温育60分钟后加入。
将180微升TBB生长培养基加到微量滴定板的B排至H排的所有加样孔中。通过从A排转移20微升到B排，然后从B排转移20微升到C排，然后从C排转移20微升到D排等等直到H排，达到连续10倍的稀释。
微量滴定板在30摄氏度温育20-24小时以允许孢子萌发和生长。生长通过微量培养板读数仪评价，并通过将5微升3mM MTT加到每个加样孔中以“显示生长”而目测评价。紫色甲_的形成显示细菌生长并因此显示孢子的灭活程度。
              表25.漆酶体系对孢子的灭活。15分钟预温育
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
B + + + + + + + + + + + +
C + + + + + + + + + + + +
D + + + + + + + + + + + +
E + + + - + - + + + + + +
F + - - - - - + + + + + +
G - - - - - - + + + + - -
H - - - - - - - - - - - -
              表26.漆酶体系对孢子的灭活。1小时预温育
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  C   +   +   +   +   -   -   +   +   +   +   +   +
  D   +   -   +   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  H   -   -   -   -   -   -   -   -   +   -   +   -
               表27.漆酶体系对孢子的灭活。2小时预温育
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   +   +   +   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  C   -   +   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  D   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
G - - - -  - - + + + + + -
H - - - -  - - + - - - - -
               表28.漆酶体系对孢子的灭活。4小时预温育
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   -   -   +   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  C   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  D   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   -
  H   -   -   -   -   -   -   +   -   +   -   -   -
              表29.漆酶体系对孢子的灭活。22小时预温育
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12
  A
  B   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  C   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  D   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  E   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  F   -   -   -   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  G   -   -   -   -   -   -   -   +   -   +   +   +
  H   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -   +   -
用碱性氢氧化物温育孢子(已用漆酶体系预温育)逆转灭活到一定程度。漆酶体系作用于孢子越久，获得的非逆转灭活越大。实际上预温育超过4小时使得孢子不能萌发。

Claims (15)

1.杀孢子组合物，其包含漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂。
2.权利要求1的组合物，其中碘离子源是一种或多种碘化物的盐。
3.权利要求1的组合物，其还包含表面活性剂。
4.用于杀死或灭活孢子的酶方法，其包括将孢子与漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂接触。
5.权利要求4的方法，其中碘离子源是一种或多种碘化物的盐。
6.权利要求4的方法，其还包括将孢子与表面活性剂接触。
7.权利要求4-6中任意一项所述的方法，其中将孢子置于表面上。
8.权利要求7的方法，其中表面是纺织品表面。
9.权利要求7的方法，其中表面是实验室或工艺设备表面。
10.净化已经暴露于孢子的区域的方法，其包括将孢子与漆酶或显示漆酶活性的化合物、氧源、碘离子源和增强剂接触。
11.权利要求10的方法，其中碘离子源是一种或多种碘化物的盐。
12.权利要求10的方法，其还包括将孢子与表面活性剂接触。
13.包含权利要求1-3中任意一项所述的组合物的容器，其中所述组合物的组分被包装在一个或多个分隔室或分隔层中。
14.现成可用的杀孢子配方，其包含权利要求1-3中任意一项所述的组合物。
15.用于杀死孢子的漆酶的用途。
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