CN1206921C - 包含氧化还原酶和n－羟基－n－酰基苯胺型增强剂的抗微生物组合物 - Google Patents

包含氧化还原酶和n－羟基－n－酰基苯胺型增强剂的抗微生物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能杀死或抑制存在于例如洗衣、硬表面、水系统、皮肤、牙齿或粘膜上的微生物细胞或微生物体的酶组合物，所述组合物包含酚氧化酶系统和式(I)增强剂。本发明还涉及所述酶组合物在保存食品、化妆品、涂料、涂盖层等中的应用。

Description

包含氧化还原酶和N-羟基-N-酰基苯胺型 增强剂的抗微生物组合物
                    发明领域
本发明涉及能杀死或抑制存在于例如洗衣、硬表面、水系统、皮肤、牙齿或粘膜上的微生物细胞或微生物体的酶组合物。本发明还涉及所述酶组合物在保存食品、化妆品、颜料、涂料等中的应用。
                    发明背景
有多种抗微生物酶组合物在本领域内是已知的。例如，WO94/04127公开了能产生抗微生物有效浓度的次硫氰酸根离子(hypothiocyanite ion)的稳定的牙粉组合物。该组合物含有能产生过氧化氢的氧化还原酶和能将通常存在于唾液中的硫氰酸根离子氧化成具有抗微生物作用的次硫氰酸根离子的过氧化物酶。合适的过氧化物酶包括乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、唾液过氧化物酶、和氯过氧化物酶(chloroperoxidase)。
EP-A-0500387中公开了包含卤过氧化物酶(haloperoxidase)例如髓过氧化物酶、嗜酸性细胞氧化酶(eosinophil oxidase)、乳过氧化物酶和氯过氧化物酶的抗微生物酶组合物，在过氧化物和卤化物存在下这些酶能选择性地结合和抑制靶微生物的生长。
WO 95/27046公开了包含钒氯过氧化物酶、卤化物离子、和过氧化氢或过氧化氢生成剂的抗微生物组合物。
WO 96/38548公开了包含卤过氧化物酶、卤化物离子、过氧化物生成离子和氨基酸的抗微生物组合物。
WO 97/42825公开了包含过氧化物酶、过氧化氢源、和吩噻嗪型或乙酰丁香酸(acetosyringate)型增强剂的抗微生物组合物。
本发明的目的是提供杀死或抑制微生物细胞的组合物。
                    发明简述
依据本发明已经发现，包含酚氧化酶系统和含有-CO-NOH-基团的增强剂的抗微生物组合物能非常有效地杀死或抑制微生物细胞。
因此，基于这些发现，本发明在第一个方面提供了：
包含酚氧化酶系统和下式所示增强剂的抗微生物酶组合物：
其中A和B分别独立地为：
Figure C9981311100102
或者B是H或C1-16-烷基，所述烷基可包含羟基、醚基或酯基，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-12-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、C1-6-CO-NOH-A、CO-NOH-A、COR12、苯基-CO-NOH-A、OR7、NR8R9、COOR10、或NOH-CO-R11，其中R7、R8、R9、R10、R11和R12是C1-12-烷基或酰基。
另一方面，本发明涉及杀死或抑制在例如洗衣、化妆品或硬表面中的微生物细胞的方法。
另一方面，本发明涉及抗微生物酶组合物在清洗隐形眼镜、清洁水系统、保存颜料、和就地清洗系统中的应用。
                    附图简述
通过附图来进一步阐述本发明，其中：
附图1表示的是灰盖鬼伞(C.cinereus)过氧化物酶抗荧光假单胞菌(P.fluorescens)的活性(过氧化物酶：3POXU/ml，增强剂：200μM N-羟基-N-乙酰苯胺；见实施例1)。■＝pH 8；□＝pH6；----＝全部杀死。
附图2表示的是与多孔菌属(Polyporus)漆酶(rPpL)联合使用的N-羟基-N-乙酰苯胺在pH6、20分钟和40℃的剂量反应曲线(见实施例2)。—□—＝粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；--○--＝铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；…△…＝产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。
附图3表示的是与鬼伞属(Coprinus)漆酶(rCcL)联合使用的N-羟基-N-乙酰苯胺在pH 6、20分钟和40℃的剂量反应曲线(见实施例2)。—□—＝粪肠球菌；--○--＝铜绿假单胞菌；…△…＝产气肠杆菌。
                        发明详述
在本发明上下文中，术语“抗微生物”是指杀细菌和/或抑细菌和/或杀真菌和/或抑制真菌作用和/或杀病毒作用和/或杀孢子作用，其中
术语“杀细菌”是指能杀死细菌细胞。
杀细菌活性以活细胞数目或菌落形成单位/ml(CFU/ml)的对数减少(log减少)测量的，例如，1个log减少相当于大肠杆菌(Escherichia coli)DSM1576或粪肠球菌DSM2570的活细胞数目从Y×10XCFU/M(CFU：菌落形成单位；M：ml或g)减至Y×10X-1CFU/M，其中X可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，Y可以是0-10的任何数字。活细胞数目确定为分别可在胰胨大豆琼脂(#CM129，Oxoid，England)平板上于30℃生长的大肠杆菌或粪肠球菌的数目。
术语“抑细菌”是指能抑制细菌生长，即抑制生长的细菌细胞。
术语“杀真菌”是指能杀死真菌细胞。
术语“抑制真菌”是指能抑制真菌生长，即抑制生长的真菌细胞。
术语“杀病毒”是指能灭活病毒。
术语“杀孢子”是指能灭活孢子。
术语“微生物细胞”是指细菌或真菌细胞，术语“微生物体”是指真菌(包括酵母)或细菌。
在本发明上下文中，术语“抑制微生物细胞生长”是表示细胞处于非生长状态，即细胞不能增殖。
“酚氧化酶系统”是指与过氧化氢源在一起的具有过氧化物酶活性的酶，或者与氧在一起的漆酶或漆酶相关酶。
本文所用术语“硬表面”是指基本上不能被微生物体渗透的任何表面。硬表面的实例是由金属例如不锈钢、塑料、橡胶、纸板、玻璃、木材、纸、纺织品、混凝土、岩石、大理石、石膏、和陶瓷材料制成的表面，这些表面可任选包被有例如颜料、珐琅等。硬表面还可以是工艺设备例如冷却塔、渗透膜、水处理设备、乳品加工设备、食品加工设备、化学品或药物加工设备。因此，本发明组合物可用于常规的就地清洗(cleaning-in-place，C-I-P)系统。
增强剂
本发明涉及下式所示包含-CO-NOH-基团的增强剂：
其中A和B分别独立地为：
Figure C9981311100122
或者B是H或C1-16-烷基，所述烷基可包含羟基、酯基或醚基(例如其中醚上的氧直接连在A-N(OH)C＝O-上，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-12-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、C1-6-CO-NOH-A、CO-NOH-A、COR12、苯基-CO-NOH-A、OR7、NR8R9、COOR10、或NOH-CO-R11，其中R7、R8、R9、R10、R11和R12是C1-12-烷基或酰基。
A上的R2、R3、R4、R5和R6优选为H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1- 3-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、COR12、OR7、NR8R9、COOR10、或NOH-CO-R11，其中R7、R8和R9是C1-3-烷基或酰基，且R10、R11和R12是C1-3-烷基；A上的R2、R3、R4、R5和R6更优选为H、OH、NH2、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、CO-NOH-苯基、COCH3、OR7、NR8R9、或COOCH3，其中R7、R8和R9是CH3或COCH3；A上的R2、R3、R4、R5和R6甚至更优选为H、OH、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CO-NOH-苯基、OCH3、COCH3、或COOCH3；A上的R2、R3、R4、R5和R6特别为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH- 苯基、或OCH3。
B上的R2、R3、R4、R5和R6优选为H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1- 3-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、COR12、OR7、NR8R9、COOR10、或NOH-CO-R11，其中R7、R8和R9是C1-3-烷基或酰基，且R10、R11和R12是C1-3-烷基；B上的R2、R3、R4、R5和R6更优选为H、OH、NH2、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、CO-NOH-苯基、COCH3、OR7、NR8R9、或COOCH3，其中R7、R8和R9是CH3或COCH3；B上的R2、R3、R4、R5和R6甚至更优选为H、OH、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CO-NOH-苯基、OCH3、COCH3、或COOCH3；B上的R2、R3、R4、R5和R6特别为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3。
B优选为H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基、酯基或醚基；所述烷基可优选包含酯基或醚基；所述烷基可更优选包含醚基。
在一个实施方案中，A和B分别独立地为：
Figure C9981311100141
或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基、酯基或醚基(例如其中醚上的氧直接连在A-N(OH)C＝O-上，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、NH2、COOH、SO3H、C1-3-烷基、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、NOH-CO-苯基、CO-NOH-苯基、COR12、OR7、NR8R9、COOR10、或NOH-CO-R11，其中R7、R8和R9是C1-3-烷基或酰基，且R10、R11和R12是C1-3-烷基。
在另一实施方案中，A和B分别独立地为：
或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基或醚基(例如其中醚上的氧直接连在A-N(OH)C＝O-上，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、NH2、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CF3、CO-NOH-苯基、COCH3、OR7、NR8R9、或COOCH3，其中R7、R8和R9是CH3或COCH3。
在另一实施方案中，A和B分别独立地为：
Figure C9981311100143
或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可包含羟基或醚基(例如其中醚上的氧直接连在A-N(OH)C＝O-上，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、酰基、NO2、CN、Cl、Br、F、CO-NOH-苯基、OCH3、COCH3、或COOCH3。
在另一实施方案中，A和B分别独立地为：
或者B是C1-3-烷基，所述烷基可包含醚基(例如其中醚上的氧直接连在A-N(OH)C＝O-上，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3。
本文所用的其中n可以为2-16的术语“C1-n-烷基”代表具有一个到指定数目碳原子的支链或直链烷基。典型的C1-6-烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。
本文所用术语“酰基”是指包含C1-6-烷基的经由羰基连接的单价取代基；例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、新戊酰基、戊酰基等。
在一个实施方案中，A的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有一个是H，优选A的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有两个是H，更优选A的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有三个是H；最优选A的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有四个是H，特别是A的R2、R3、R4、R5和R6全部是H。
在另一实施方案中，B的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有一个是H，优选B的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有两个是H，更优选B的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有三个是H；最优选B的取代基R2、R3、R4、R5和R6当中至少有四个是H，特别是B的R2、R3、R4、R5和R6全部是H。
在本发明特别的实施方案中，增强剂选自：
N-4-硝基苯甲酰-N-羟基酰苯胺；
N-4-甲氧基苯甲酰-N-羟基酰苯胺；
N，N′-二羟基-N，N′-二苯基对苯二甲酰胺；
N-癸酰-N-羟基苯胺；
N-羟基-4-氰基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-4-乙酰基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-4-羟基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-3-(N′-羟基乙酰胺)-N-乙酰苯胺；
N-4-氰基苯甲酰-N-羟基苯胺；
N-羟基-4-硝基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸异丙酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸甲酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸苯酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸乙酯；和
N-羟基-N-(4-氰基苯基)氨基甲酸甲酯。
本发明增强剂可以以1-1000μM、优选5-500μM、更优选10-200μM的浓度存在。
制备增强剂
在本申请中描述的增强剂可用本领域技术人员众所周知的方法制备；某些增强剂还可商购获得。
依据制备N-羟基-N-乙酰苯胺的一般方法(参见OrganicSyntheses 67，1989，p.187-192)合成、然后通过标准纯化方法纯化来制备所用化合物。
过氧化氢/氧
如果酚氧化酶需要过氧化氢源，该来源可以是过氧化氢或者在原位生成过氧化氢的过氧化氢前体，例如过碳酸盐或过硼酸盐，或产生过氧化氢的酶系统(例如与氧化酶底物在一起的氧化酶，如与合适的氨基酸在一起的氨基酸氧化酶)，或过羧酸或其盐。可在过程开始时或期间加入过氧化氢，过氧化氢的加入量一般相当于0.001-25mM的水平、优选0.005-5mM的水平、特别是0.01-1mM的水平。
如果酚氧化酶需要氧分子，则空气中的氧分子通常以足量存在。如果需要更多的O2，则可以加入额外的氧。
酚氧化酶
在本发明上下文中，酚氧化酶的酶可以是具有过氧化物酶活性的酶或漆酶或漆酶相关酶。
本发明酶一般可以以1-10000μg酶蛋白/升水溶液、优选5-2000μg酶蛋白/升水溶液、更优选5-1000μg酶蛋白/升水溶液、最优选1-500μg酶蛋白/升水溶液的浓度存在。
过氧化物酶和具有过氧化物酶活性的化合物
具有过氧化物酶活性的化合物可以是分在酶分类(EC1.11.1.7)中的任何过氧化物酶、或表现出过氧化物酶活性的由其衍生的任何片段。
本发明过氧化物酶优选可由植物生成(例如辣根或大豆过氧化物酶)或者由微生物例如真菌或细菌生成。
一些优选的真菌包括属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，例如镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Tricoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝孢属(Verticillum)、Arthromyces、卡尔黑霉属(Caldariomyces)、Ulocladium、Embellisia、枝孢属(Cladosporium)、或Dreschlera的菌株，特别是尖镰孢(Fusarium oxysporum)(DSM 2672)、Humicola insolens、Trichoderma resii、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)(IFO 6113)、棉黄萎轮枝孢(Verticillum alboatrum)、大丽花轮枝孢(Verticillum dahlie)、Arthromyces ramosus(FERMP-7754)、烟色卡尔黑霉(Caldariomyces fumago)、Ulocladiumchartarum、Embellisia alli、或Dreschlera halodes。
优选的其它真菌包括属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，担子菌纲(Basidiomycetes)，例如鬼伞属(Coprinus)、Phanerochaete、革盖菌属(Coriolus)或栓菌属(Trametes)的菌株，特别是Coprinus cinereus f.microsporus(IFO 8371)、长根鬼伞(Coprinus macrorhizus)、Phanerochaetechrysosporium(例如NA-12)或栓菌属(Trametes)(以前称为多孔菌属)例如变色栓菌(T.versicolor)(例如PR428-A)。
还优选的真菌包括属于接合菌亚门(Zygomycotina)，Mycoraceae纲，例如根霉属(Rhizopus)或毛霉属(Mucor)的菌株，特别是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。
一些优选的细菌包括放线菌目(Actinomycetales)的菌株，例如类球形链霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)、热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)、或轮丝链轮丝菌(Streptoverticillum vericillium ssp.verticillium)。
其它优选的细菌包括类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、Rhodomonas palustri、乳链球菌(Streptococcus lactis)、Pseudomonas purrocinia(ATCC15958)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)、和芽孢杆菌属(Bacillus)菌株例如短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)(ATCC 12905)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。
还优选的细菌包括属于粘球菌属(Myxococcus)的菌株，例如变绿粘球菌(M.virescens)。
过氧化物酶还可以是可通过下述方法制得的酶：将用重组DNA载体转化的宿主细胞在培养基中在容许表达过氧化物酶的条件下培养，并从培养物中收集过氧化物酶，其中所述重组DNA载体携带编码所述过氧化物酶的DNA序列和编码容许该编码过氧化物酶的DNA序列表达的功能的DNA序列。
重组产生的过氧化物酶特别是依据WO 92/16634的来源于鬼伞属之种(Coprinus sp.)、尤其是长根鬼伞(C.macrorhizus)或灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶。
在本发明上下文中，具有过氧化物酶活性的复合物包括过氧化物酶和来源于细胞色素、血红蛋白或过氧化物酶的过氧化物酶活性片段。
测定过氧化物酶活性(POXU)
一个过氧化物酶单位(POXU)是在下述条件下每分钟催化1μmol过氧化氢转化所需酶的量：
0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.0
0.88mM过氧化氢
1.67mM 2，2′-连氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)
30℃
通过在418nm测定吸光度改变，监控该反应60秒(混合后15秒)，其中吸光度改变应当介于0.15-0.30之间。
为了计算活性，使用36mM-1cm-1的被氧化ABTS的吸收系数和化学计量的1μmol转化的H2O2/每2μmol被氧化的ABTS。
漆酶和漆酶相关酶
在本发明上下文中，漆酶和漆酶相关酶包括分在酶分类(EC1.10.3.2)中的任何漆酶，分在酶分类(EC 1.10.3.1)中的任何儿茶酚氧化酶，分在酶分类(EC 1.3.3.5)中的任何胆红素氧化酶，或分在酶分类(EC 1.14.18.1)中的任何单酚单加氧酶。
上述酶可以来源于微生物例如细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，或者可以来源于植物。
来源于真菌的漆酶的合适实例包括来源于下述菌株的漆酶：曲霉属(Aspergillus)，链孢霉属(Neurospora)例如粗糙链孢酶(N.crassa)，柄孢壳属(Podospora)，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)例如Trametes villosa和变色栓菌，丝核菌属(Rhizoctonia)例如立枯丝核菌(R.solani)，鬼伞属例如灰盖鬼伞、毛头鬼伞(C.comatus)、费赖斯鬼伞(C.friesii)、和褶纹鬼伞(C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)例如P.condelleana，斑褶菇属(Panaeolus)例如蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毁丝霉属(Myceliophthora)例如M.thermophila，Schytalidium例如S.thermophilum，多孔菌属例如P.pinsitus，密孔菌属(Pycnoporus)例如朱红密孔菌(P.cinnabarinus)，射脉菌属(Phlebia)例如辐射射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)，或革盖菌属例如毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2-238885)。
来源于细菌的漆酶的合适实例包括来源于芽孢杆菌属菌株的漆酶。
来源于鬼伞属、毁丝霉属、多孔菌属、密孔菌属、Scytalidium或丝核菌属的漆酶是优选的；特别是来源于灰盖鬼伞、Myceliophthora thermophila、Polyporus pinsitus、朱红密孔菌、Scytalidium thermophilum或立枯丝核菌的漆酶。
漆酶或漆酶相关酶还可以是可通过下述方法制得的酶：将用重组DNA载体转化的宿主细胞在培养基中在容许表达漆酶的条件下培养，并从培养物中收集漆酶，其中所述重组DNA载体携带编码所述漆酶的DNA序列和编码容许该编码漆酶的DNA序列表达的功能的DNA序列。
测定漆酶活性(LACU)
在需氧条件下通过丁香醛连氮(syringaldazin)的氧化测定漆酶活性。在530nm用光度计测定生成的紫色。分析条件为19mM丁香醛连氮，23mM乙酸盐缓冲液，pH 5.5，30℃，1分钟反应时间。
1个漆酶单位(LACU)是在这些条件下每分钟催化1.0μmol丁香醛连氮的转化所需酶的量。
测定漆酶活性(LAMU)
在需氧条件下通过丁香醛连氮的氧化测定漆酶活性。在530nm用光度计测定生成的紫色。分析条件为19mM丁香醛连氮，23mMTris/马来酸盐缓冲液，pH 7.5，30℃，1分钟反应时间。
1个漆酶单位(LAMU)是在这些条件下每分钟催化1.0μmol丁香醛连氮的转化所需酶的量。
组合物
本发明抗微生物组合物可配制成固体或液体。
当配制成液体时，本发明组合物一般是含水组合物。
当配制成固体时，本发明组合物一般是粉末、颗粒、糊状或胶凝产品。
当需要过氧化氢时，优选使用两部分制剂系统，由此过氧化氢与其它组分是分开的。
本发明组合物还可包含辅助剂例如湿润剂、增稠剂、缓冲剂、稳定剂、香料、着色剂、填充剂等。
适用的湿润剂是表面活性剂，例如非离子、阴离子、两性或两性离子表面活性剂。
本发明组合物可以是浓缩产品或即用产品。在使用时，一般用水将浓缩产品稀释来提供具有有效抗微生物活性、施用到欲消毒或保存的物体上、并与存在的微生物体反应的介质。
本发明含水组合物的最佳pH通常是使得酶具有最佳稳定性和最佳活性的折中值。在本发明一个方面，pH介于3-10.5之间，在本发明另一方面，pH介于5-9之间。
方法
本发明还提供了杀死或抑制微生物细胞的方法，包括用本发明组合物处理所述微生物细胞。所述处理可用有效量的所述组合物进行。
“有效量”是指在所选应用中适于获得所需抗微生物效果的量；例如将活细胞数目降至10％、1％或低于1％；或者在12小时、1天、5天、30天或30天以上期间内阻止活细胞的数目加倍。
应用
本发明组合物可掺入到通常含有其它类型酶(见下文)的洗涤剂或清洗组合物中。
本发明组合物还可用于抑制在衣物中存在的微生物体，包括用包含有效量本发明组合物的浸泡、洗涤或漂洗液处理衣物。
当用于保存颜料、食品、饮料、化妆品例如洗液(例如洗眼液)、液体、膏霜、凝胶、糊剂、软膏(如眼用膏)、肥皂、香波、护理剂、防汗剂、除臭剂、漱口水、鼻喷雾剂、隐形眼镜产品、酶制剂、或食品组分时，可将在本发明方法中使用的组合物以能有效杀死或抑制微生物细胞生长的量掺入到例如以水为基质的涂料、未保存的食品、饮料、化妆品、隐形眼镜产品、食品组分或抗炎产品中。
本发明组合物可特别作为防腐剂或消毒剂用在以水为基质的涂料(参见下文)中。
此外，本发明组合物可作为消毒剂用于例如治疗痤疮、眼睛或口腔感染、皮肤感染；用在止汗剂或除臭剂中；用在洗脚盐水中；用于清洗和消毒隐形眼镜、硬表面、牙齿(口部护理)、伤口、挫伤等。
本发明组合物通常可用于清洗、消毒、或抑制任何硬表面上的微生物生长。可有利地与本发明组合物接触的表面的实例有在例如乳品厂、化学品或药品加工厂、水卫生设施系统、纸浆加工厂、水处理厂、和冷却塔中使用的加工设备的表面。本发明组合物可以以能有效地清洗、消毒、或抑制目的硬表面上微生物生长的量使用。
本发明组合物可特别用于纸张和纸浆加工厂中的微生物生长。
此外，预计本发明组合物可有利地用于就地清洗(C.I.P)系统以清洗任何种类的加工设备。
本发明方法还可用于在食品加工厂和制备或供应食品的任何场所例如医院、疗养院、饭店、特别是快餐店、熟食店等中清洗表面和烹饪用具。本发明组合物还可作为抗微生物剂用于食品中，尤其可用作乳酪、水果、和蔬菜以及色拉吧食品的表面抗微生物剂。
本发明组合物还可用于水线的微生物控制，用于水的消毒，特别是工业水的消毒。
保护/保存涂料
在本领域中，罐装涂料产品的保存是通过向涂料中加入非酶类有机杀生物剂来实现的。在本发明上下文中，涂料是指包含溶于或分散在液体载体例如水、有机溶剂和/或油中的固体着色物的材料，当将其铺在表面上时，干燥后会留下薄的有色、装饰性和/或保护性涂层。通常是将异噻唑啉酮类物质例如5-氯-2-甲基-4-噻唑啉-3-酮作为杀生物剂加到涂料中来抑制/阻止涂料中的微生物生长。然而，本发明方法适于应用于该领域，以通过用环境相容性酶代替这些毒性杀生物剂来解决目前使用毒性有机杀生物剂所造成的环境生物危害。因此，本发明提供了保存涂料的方法，包括使所述涂料与本发明的酚氧化酶和增强剂接触。本发明还提供了包含如本发明所述的酚氧化酶和增强剂的涂料组合物。
涂料优选是以水为基质的涂料，即涂料的固体分散在水溶液中。涂料可含有0-20％、优选0-10％例如0-5％有机溶剂。
酶可以以0.0001-100mg活性酶蛋白/升涂料、优选0.001-10mg活性酶蛋白/升涂料、例如0.01-5mg活性酶蛋白/升涂料的量加到涂料中，增强剂可以以10-500μM、优选25-250μM例如100μM的量加入，其中所述浓度是占涂料组合物的浓度。
洗涤剂组合物
可将本发明抗微生物组合物加到洗涤剂组合物中，这样其就成为洗涤剂组合物的组分。
本发明洗涤剂组合物可例如配制成手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适于预处理染污的织物的洗衣添加组合物，和漂洗加入的织物软化剂组合物，或者配制成一般用于家庭硬表面清洗操作的洗涤剂组合物，或配制成用于手洗或机洗餐具洗涤操作的洗涤剂组合物。
在一个具体方面，本发明提供了包含本发明抗微生物组合物的洗涤剂添加剂。本发明洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可包含一种或多种其它酶例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般情况下，所选酶的特征应当与所选洗涤剂相容(即pH-最优化，与其它酶和非酶组分相配伍)，并且酶应当以有效量存在。
蛋白酶：
合适的蛋白酶包括来源于动物、植物或微生物的蛋白酶。微生物来源是优选的。包括通过化学改性或蛋白工程得到的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例有枯草杆菌蛋白酶，尤其是来源于芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述在WO 89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例有胰蛋白酶(例如来源于猪或牛的胰蛋白酶)和描述于WO 89/06270和WO 94/25583中的镰孢属蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO98/20116、和WO 98/34946中描述的变体，尤其是在一个或多个下述位点发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的市售蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM、和FN3TM(Genencor InternationalInc.)。
脂肪酶：
合适的脂肪酶包括来源于细菌或真菌的脂肪酶。包括通过化学改性或蛋白工程得到的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来源于腐质霉属(与Thermomyces同义词)的脂肪酶，例如在EP 258068和EP305216中描述的来源于H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶，或如在WO 96/13580中描述的来源于H.insolens的脂肪酶，来源于假单胞菌属的脂肪酶，例如来源于产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1372034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(WO 95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，来源于芽孢杆菌属的脂肪酶，例如来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等人(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。
其它实例是脂肪酶变体，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO97/04079和WO 97/07202中描述的脂肪酶变体。
优选的市售脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NovoNordisk A/S)。
淀粉酶：
合适的淀粉酶(α和/或β)包括来源于细菌或真菌的淀粉酶。包括通过化学改性或蛋白工程得到的突变体。淀粉酶包括例如来源于芽孢杆菌属如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)一种特殊菌株的α-淀粉酶，GB1296839中对此进行了更详细描述。
有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO96/23873、和WO 97/43424中描述的变体，尤其是在下述一个或多个位点发生取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。
市售淀粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、和BANTM(Novo Nordisk A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(来自GenencorInternational Inc.)。
纤维素酶：
合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。包括通过化学改性或蛋白工程得到的突变体。合适的纤维素酶包括来源于芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属(Thielavia)、支顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如在US 4435307、US5648263、US 5691178、US 5776757和WO 89/09259中公开的从Humicola insolens、Myceliophthora thermophila和尖镰孢生产的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是在EP 0495257、EP 0531372、WO96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体例如在WO 94/07998、EP 0531315、US5457046、US 5686593、US 5763254、WO 95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的纤维素酶变体。
市售纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(Novo NordiskA/S)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(Genencor InternationalInc.)、和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：
合适的过氧化物酶/氧化酶包括来源于植物、细菌或真菌的那些。包括化学改性或蛋白工程突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来源于鬼伞属例如灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，例如在WO93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中描述的那些。
市售过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
洗涤剂酶可通过加入含有一种或多种酶的单独的添加剂、或通过加入包含所有这些酶的组合添加剂来包含在洗涤剂组合物中。本发明洗涤剂添加剂、即单独的添加剂或组合的添加剂可配制成例如颗粒、液体、浆状物等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒、尤其是无粉尘颗粒，液体、特别是稳定液体，或浆状物。
无粉尘颗粒可通过例如在US 4106991和4661452中公开的方法制得，并可任选通过本领域已知方法包衣。蜡状包衣材料的实例有平均分子量为1000-20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；其中醇含有12-20个碳原子并且包含15-80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸甘油一酯、脂肪酸甘油二酯和脂肪酸甘油三酯。GB1483591中给出了适于通过流化床技术涂敷的成膜包衣材料的实例。可例如依据已知方法通过加入多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液体酶制剂。可依据在EP 238216中公开的方法制备受保护的酶。
本发明的洗涤剂组合物可以呈任意适宜的形式，例如条、片、粉末、颗粒、糊、或液体。液体洗涤剂可以是通常含有高达70％水和0-30％有机溶剂的含水液体，或非水性液体。
洗涤剂组合物含有一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是包括半极性在内的非离子和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂一般以0.1％-60％重量的水平存在。
当包含在其中时，洗涤剂通常含有约1％-约40％阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸、链烯基琥珀酸、或皂。
当包含在其中时，洗涤剂通常含有约0.2％-约40％非离子表面活性剂例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸一乙醇酰胺、脂肪酸一乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡萄糖酰胺”)。
洗涤剂可含有0-65％洗涤剂助洗剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基琥珀酸、链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或多层硅酸盐(例如得自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。其实例有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶N-氧化物、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物、和异丁烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有漂白系统，该漂白系统可包含H2O2源例如过硼酸盐或过碳酸盐，其可与形成过酸的漂白激活剂例如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐联合使用。或者，漂白系统可包含过氧酸，例如酰胺、二酰亚胺、或砜型过氧酸。
可用常规稳定剂来稳定本发明洗涤剂组合物中的酶，所述稳定剂有例如多元醇例如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物例如芳香硼酸酯，或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，并且可如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制本发明洗涤剂组合物。
本发明洗涤剂还可含有其它常规洗涤剂组分例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、防污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂、水溶助剂、晦暗抑制剂或香料。
在下述实施例中进一步举例说明本发明，但这些实施例并不是限制本发明所要求保护的范围。
实施例1
用N-羟基-N-乙酰苯胺作为电子供体的鬼伞属过氧化物酶的抗细菌活 性
通过使用N-羟基-N-乙酰苯胺作为电子供体，在pH 6和pH 8测定如WO 92/16634所述获得的重组灰盖鬼伞过氧化物酶(rCiP)的抗微生物活性。
在0.05M MES-缓冲液(Sigma M8250)(pH 6)或0.05 HEPES-缓冲液(Sigma H3375)(pH 8)中评价抗微生物活性；通过过滤灭菌将缓冲液灭菌。
测定抗荧光假单胞菌(Gram等人，1990，InternationalJournal of Food Microbiology 10：303-316)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(DSM 20042)的抗微生物活性。将细胞在胰胨大豆肉汤(Oxoid CM129)中于30℃(表皮葡萄球菌)或25℃(荧光假单胞菌)生长24小时，并在MES-缓冲液中稀释至大约106cfu/ml的终细胞浓度。将该细胞悬浮液与rCiP(3POXU/ml)、增强剂(0.2mM)和过氧化氢(0.5mM)在40℃混合20分钟。通过在Malthus中培养来测定杀细菌活性。通过校准曲线把通过Malthus仪器测定的检测时间转化成cfu/ml。当计数总的存活细胞时，采用直接或间接Malthus测量值(Malthus Flexi M2060，MalthusInstrument Limited)。对于直接测量值，通过在生长底物中的电导测量值来测定细胞代谢。对于间接测量，将3ml生长培养基转移到间接Malthus池的外室中，并将0.5ml无菌KOH(0.1M)转移到内室中。酶处理后，将细胞悬浮液转移到Malthus池的外室中。当细胞在外室中生长时，它们产生了CO2，CO2溶于内室中的KOH，因此改变了KOH的电导率。利用在酶处理中继续生存的细胞呼吸所形成的CO2的量估计活细胞的数目。当通过Malthus可测定到电导率改变时，记录检测时间(dt)。使用涉及将cfu/ml转化成dt的校准曲线把dt转化成菌落计数(Johansen等人，1995.Journal of AppliedBacteriology 78：297-303，Johansen等人，1997，Applied andEnvironmental Microbiology 63：3724-3728)。
对于N-羟基-N-乙酰苯胺或与过氧化氢组合一起的N-羟基-N-乙酰苯胺，都没有观察到任何杀细菌活性。而对于N-羟基-N-乙酰苯胺、过氧化氢和rCiP的组合系统，获得了全部杀死效果(见附图1)。革兰氏阴性菌对氧化还原酶和增强剂的组合系统的抗性通常是最强的。然而，在pH 6和8(附图1)，都获得了抗革兰氏阴性菌荧光假单胞菌的全部杀死效果，这相当于细胞减少大约106CFU/ml(菌落形成单位)。
实施例2
漆酶与N-羟基-N-乙酰苯胺的杀细菌活性
用N-羟基-N-乙酰苯胺作为增强剂，测定如WO 96/00290所述获得的Polyporus pinsitus漆酶(rPpL)与如WO 97/08325所述获得的灰盖鬼伞漆酶(rCcL)抗铜绿假单胞菌(ATCC 10145)、产气肠杆菌(ATCC 13048)和粪肠球菌(DSM 2570)的抗细菌活性。如实施例1所述测定杀细菌活性，在pH 6测定rPpL(1mg/L)的抗微生物活性，而在pH 8测定rCcL(1mg/L)的抗微生物活性。
显示了当与rPpL(附图2)或rCcL(附图3)联合使用时N-羟基-N-乙酰苯胺的剂量-反应曲线。获得了抗所有测试生物体的显著杀细菌活性，其中革兰氏阴性菌的抗药性最强。在200μM以上浓度的N-羟基-N-乙酰苯胺获得了抗铜绿假单胞菌ATCC 10145的杀细菌活性。当在pH 6使用rPpL时，在高浓度N-羟基-N-乙酰苯胺获得了对这两种革兰氏阴性细菌的全部杀死效果。
实施例3
不同酚氧化酶和增强剂的杀细菌活性
用不同增强剂，在pH 6和8(缓冲液；见实施例1)测定灰盖鬼伞过氧化物酶(rCiP)、Polyporus pinsitus漆酶(rPpL)、灰盖鬼伞漆酶(rCcL)和立枯丝核菌漆酶(rRsL)(如WO 95/07988所述)的抗细菌活性。将rCiP与0.5mM过氧化氢组合。测定rCiP和rPpL抗荧光假单胞菌的抗微生物活性(Gram等人，1990，InternationalJournal of Food Microbiology 10：303-316)，测定rCcL和rRsL抗铜绿假单胞菌(ATCC 10145)的抗微生物活性。
如实施例1所述测定杀细菌活性。不同组合以及所得结果如表1所示。以活细胞数目的减少表示结果。因此，减少4相当于活细胞的4个log减少，即从106CFU/ml减至102CFU/ml。
表1：杀细菌活性
实施例4
增强剂的实例
A)N1-羟基-N1-苯基-4-硝基苯甲酰胺，
N-4-硝基苯甲酰-N-羟基苯胺(CAS 2029-61-0)；
Figure C9981311100341
B)N1-羟基-N1-苯基-4-甲氧基苯甲酰胺，
N-4-甲氧基苯甲酰-N-羟基苯胺(CAS 13664-49-8)；
C)N，N′-二羟基-N，N′-二苯基对苯二甲酰胺(CAS 61494-26-6)；
D)N1-(4-氰基苯基)-N1-羟基乙酰胺，
N-羟基-4-氰基-N-乙酰苯胺(CAS 80584-65-2)；
E)N1-羟基-N1-苯基癸酰胺，
N-癸酰-N-羟基苯胺(CAS 25310-16-1)；
Figure C9981311100351
F)N1-羟基-N1-苯基-4-氰基苯甲酰胺，
N-4-氰基苯甲酰-N-羟基苯胺；
Figure C9981311100352
G)N1-(4-乙酰基苯基)-N1-羟基乙酰胺，
N-羟基-4-乙酰基-N-乙酰苯胺(CAS 67274-51-5)；
H)N1-羟基-N1-(3-硝基苯基)乙酰胺；
I)N1-(4-羟基苯基)-N1-羟基乙酰胺，
N-羟基-4-羟基-N-乙酰苯胺(CAS 63975-21-3)；
K)N1-羟基-N1-(4-硝基苯基)乙酰胺，
N-羟基-4-硝基-N-乙酰苯胺(CAS 67274-52-6)；
L)N-羟基-N-乙酰苯胺(CAS 1795-83-1)；
M)N-羟基-N-苯基氨基甲酸异丙酯(CAS 4279-16-7)；
N)N-羟基-N-苯基氨基甲酸甲酯(CAS 28091-62-5)；
O)N-羟基-N-苯基氨基甲酸苯酯(CAS 4645-72-1)；
P)N-羟基-N-苯基氨基甲酸乙酯(CAS 18631-99-7)；
Q)N-羟基-N-(4-氰基苯基)氨基甲酸甲酯
所有化合物都是依据在Organic Syntheses 1989，67，187-192中描述的关于合成化合物L的一般方法合成的。在反应混合物的后处理以及产物的纯化方面对该方法进行变更。所有结构都是通过文献中记载的熔点验证的，如果可能的话，还通过用VARIAN Mercury400测定的1H-NMR进行验证。
下述化合物已经在现有技术中描述过：
A)：S.Horner，Justus Liebigs Ann.Chem.606，1957，24-28；O.Neunhoeffner，R.Gottschlich，Justus Liebigs Ann.Chem.736，1970，100-109。
B)：S.Horner，Justus Liebigs Ann.Chem.606，1957，24-28；S.Jaimins，J.Indian Chem.Soc.47，1970，247-249。
C)：N.R.Gandhi，K.N.Munshi，J.Indian Chem.Soc.59，11112，1982，1290-1295；Munshi，K.N.，Kharche，V.W.，Junejai，H.D.，Indian J.Chem.Sect.A，27，3，1988，222-224。
D)：C.Poth Brink，A.C.Crumbliss，J.Org.Chem.，47，7，1982，1171-1176。
E)：Gupta；Tandon，J.Indian Chem.Soc.，46，1969，831-833。
G)：C.Poth Brink，A.C.Crumbliss，J.Org.Chem.，47，7，1982，1171-1176。
I)：Healey；Calder，Aust.J.Chem.，32，1979，1307-1315；Gemborys，M.B.等人，J.Med.Chem.，21，1978，649-652。
K)：Matlin，S.A.等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1979，2481-2487。
M)：Baskakow；Mel′nikow，Khim.Nauka Prom-st.，3，1958，683；Chem.Abstr.，1959，7062；专利，BASF-A.G.，FR1507608，1967，Chem.Abstr.，EN，70，57386e，1969；Baskakow等人，Biol.Akt.Soedin.1968，1968，244-49。
N)：Faddeewa；Baskakow，Biol.Akt.Soedin.1968，1968，199-06。
O)：Oesper；Broker，J.Amer.Chem.Soc.，47，1925，2608；Baskakov等人，J.Org.Chem.USSR(Engl.Transl.)，3，1967，108，Zh.Org.Khim.，3，1967，112，Baskakow等人，J.Org.Chem.USSR(Engl.Transl.)，3，1967，108，Zh.Org.Khim.，3，1967，112。
P)：Bamberger，Chem.Ber.，52，1919-120；Journal，Tisue等人，Tetrahedron，24，1968，999-004。
如下所述合成化合物F)、H)、和Q)：
合成N1-羟基-N1-苯基-4-氰基苯甲酰胺(F)
按照Org.Synth.1989，67，187-192中描述的方法合成N-苯基羟基胺(1.77g，16.2mmol)在THF(30ml)中的溶液。将碳酸氢钠浆状液(2g，在2ml水中)加到该溶液中。将该混合物冷却至-2℃，并滴加4-氰基苯甲酰氯(3.23g，19.51mmol)。继续搅拌过夜，然后加入水(200ml)。将该反应混合物用二氯甲烷萃取3次。合并有机相，将溶剂真空除去。用装配有4.0×15.0cm柱体、具有SIM的Biotage Flash40i通过色谱法纯化该残余物，用AcOEt/庚烷(3∶5，v∶v)作为洗脱剂，获得了0.55g纯f)(14％)：
                     mp：146-147℃.1H NMR(400MHz，DMSO)d 10.93(s，1H)，7.93(d，2H)，7.80(d，2H)，7.62(d，2H)，7.42(dd，2H)，7.24(t，1H).13C NMR(100MHz，DMSO)d165.91，140.82，139.59，131.45，128.38，128.11，125.43，121.30，117.85，111.99.
元素分析C14H10N2O2
计算值：C，70.58；H，4.23；N，11.76
实测值：C，70.62；H，4.32；N，11.64
合成N1-羟基-N1-(3-硝基苯基)乙酰胺(H)
将水合肼(3.56g，71.11mmol)滴加到1，3-二硝基苯(6.0g，35.69mmol)和湿5％铑碳(120mg)在四氢呋喃(30ml)内的悬浮液中，同时将温度保持在15℃以下。在室温搅拌过夜后，过滤该混合物，并用少量四氢呋喃洗涤催化剂。将碳酸氢钠浆状液(6g，在5ml水中)加到该溶液中。把该混合物冷却至0℃，并滴加乙酰氯(6.17g，78.60mmol)。继续搅拌过夜，然后加入氢氧化钠溶液(5g在100ml水中)。分离出水相，加入石油醚，再分离出四氢呋喃相。合并有机相，用10％氢氧化钠水溶液萃取。合并水相，用二氯甲烷洗涤，然后用盐酸中和。用二氯甲烷萃取该混合物，合并萃取液，用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。加入石油醚，形成了浅橙色结晶，获得了4.59g纯h)(66％)：
           mp 92-94℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)d 9.41(1H)，8.36(1H)，7.96(1H)，7.91(1H)，7.46(1H)，2.28(3H).13C NMR(100MHz，CDCl3)d 149.01，130.52，127.42，121.25，116.43，23.45.
元素分析C8H8N2O4
计算值：C，48.98；H，4.11；N，14.28
实测值：C，49.55；H，4.16；N，14.21。
合成N-羟基-N-(4-氰基苯基)氨基甲酸甲酯(Q)
按照Org.Synth.1989，67，187-192中描述的关于制备N-4-苯基羟基胺的方法合成N-4-(氰基苯基)羟基胺(3.13g，21.1mmol)在THF(30ml)中的溶液。将碳酸氢钠浆状液(4.6g，在7ml水中)加到该溶液中。将该混合物冷却至0℃，并滴加氯甲酸甲酯(1.43ml，21.1mmol)。继续搅拌过夜，然后用45分钟加入NaOH(8％，30ml)。分离出水相。向THF相中加入石油醚(60ml)，再次分离水相。将有机相用8％NaOH(40ml)萃取2次。合并水相，用二氯甲烷洗涤，并用盐酸中和(在冷却下进行)。将该酸化的水相用二氯甲烷(60ml)萃取3次。合并有机相，用硫酸镁干燥，过滤，将溶剂真空除去，获得了粗产物(q)。用甲苯/庚烷将该化合物重结晶，获得了2.69g白色结晶(66％)：
mp：118-121℃.1H NMR(400MHz，CDCl3)d 7.71(d，2H)，7.63(d，2H)，3.93(s，3H).13C NMR(100MHz，CDCl3)d 154.16，143.89，132.52，119.01，118.54，107.17，54.22.
元素分析C9H8N2O3
计算值：C，56.25；H，4.20；N，14.58
实测值：C，55.51；H，4.24；N，14.73。

Claims (27)

1.一种用于非治疗目的的杀死或抑制微生物细胞的方法，该方法包括用包含漆酶与氧和下式所示增强剂的组合物处理所述微生物细胞：
Figure C998131110002C1
其中A和B分别独立地为：
或者B是C1-3-烷基，所述烷基是被羟基所取代的或未被取代，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3，其中取代基R2、R3、R4、R5和R6中的至少4个是H。
2.权利要求1的方法，其中所述增强剂选自由下述组成之组：
N-4-硝基苯甲酰-N-羟基苯胺；
N-4-甲氧基苯甲酰-N-羟基苯胺；
N，N′-二羟基-N，N′-二苯基对苯二甲酰胺；
N-癸酰-N-羟基苯胺；
N-羟基-4-氰基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-4-乙酰基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-4-羟基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-3-(N′-羟基乙酰胺)-N-乙酰苯胺；
N-4-氰基苯甲酰-N-羟基苯胺；
N-羟基-4-硝基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸异丙酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸甲酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸苯酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸乙酯；和
N-羟基-N-(4-氰基苯基)氨基甲酸甲酯。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述漆酶是微生物漆酶。
4.权利要求3的方法，其中所述漆酶来源于鬼伞属(Copriuus)、毁丝霉属(Myceliophthora)、多孔菌属(Polyporus)、密孔菌属(Pycnoporus)、Scytalidium或丝核菌属(Rhizoctonia)。
5.权利要求4的方法，其中所述漆酶来源于灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、Myceliophthora thermophila、Polyporuspinsitus、朱红密孔菌(Pyrnoporus cinnabarinus)、Scytalidiumthermophilum或立枯丝核菌(Rhizoctonia sdani)。
6.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述组合物是含水组合物。
7.权利要求6的方法，其中所述漆酶的浓度为0.001-10mg酶蛋白/升。
8.权利要求6的方法，其中所述增强剂的浓度相当于1-1000μM。
9.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述组合物是颗粒。
10.包含表面活性剂和包含漆酶与氧和下列所示增强剂的组合物的洗涤剂组合物，
其中A和B分别独立地为：
Figure C998131110004C1
或者B是C1-3-烷基，所述烷基是被羟基所取代的或未被取代，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3，其中取代基R2、R3、R4、R5和R6中的至少4个是H。
11.权利要求1的方法，其中用包含所述组合物的浸泡、洗涤或漂洗液处理衣物以抑制衣物中存在的微生物体。
12.权利要求1的方法，其中将有效量的所述组合物掺入到所述化妆品中以保存化妆品。
13.权利要求12的方法，其中所述化妆品是漱口组合物、化妆液或凝胶或糊、眼洗剂、防汗剂、除臭剂、鼻喷雾剂、眼膏、软膏或膏霜、洗脚盐水。
14.包含漆酶与氧和下列所示增强剂的组合物在清洗或消毒隐形眼镜中的应用，
Figure C998131110004C2
其中A和B分别独立地为：
Figure C998131110004C3
或者B是C1-3-烷基，所述烷基是被羟基所取代的或未被取代，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3，其中取代基R2、R3、R4、R5和R6中的至少4个是H。
15.权利要求1的方法，其中是将硬表面与所述组合物接触以清洗、消毒或抑制硬表面上微生物生长。
16.权利要求15的方法，其中所述硬表面是加工设备。
17.权利要求15的方法，其中所述硬表面是水卫生设备的表面。
18.权利要求15的方法，其中所述硬表面是纸浆加工设备的表面。
19.包含漆酶与氧和下式所示增强剂的组合物在就地清洗系统中的应用，
其中A和B分别独立地为：
或者B是C1-3-烷基，所述烷基是被羟基所取代的或未被取代，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3，其中取代基R2、R3、R4、R5和R6中的至少4个是H。
20.包含漆酶与氧和下式所示增强剂的组合物在水系统消毒中的应用，
其中A和B分别独立地为：
或者B是C1-3-烷基，所述烷基是被羟基所取代的或未被取代，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3，其中取代基R2、R3、R4、R5和R6中的至少4个是H。
21.权利要求20的应用，其中所述应用是在纸浆加工中消毒水系统的应用。
22.包含漆酶与氧和下式所示增强剂的组合物在保存涂料中的应用，
其中A和B分别独立地为：
或者B是C1-3-烷基，所述烷基是被羟基所取代的或未被取代，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3，其中取代基R2、R3、R4、R5和R6中的至少4个是H。
23.一种抗微生物酶组合物，其中包含漆酶和氧，以及下式所示增强剂：
其中A和B分别独立地为：
或者B是C1-3-烷基，所述烷基是被羟基所取代的或未被取代，且R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为H、OH、COOH、SO3H、CH3、NO2、CN、Cl、Br、CO-NOH-苯基、或OCH3，其中取代基R2、R3、R4、R5和R6中的至少4个是H。
24.权利要求23的抗微生物酶组合物，其中所述增强剂选自由下述组成之组：
N-4-硝基苯甲酰-N-羟基苯胺；
N-4-甲氧基苯甲酰-N-羟基苯胺；
N，N′-二羟基-N，N′-二苯基对苯二甲酰胺；
N-癸酰-N-羟基苯胺；
N-羟基-4-氰基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-4-乙酰基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-4-羟基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-3-(N′-羟基乙酰胺)-N-乙酰苯胺；
N-4-氰基苯甲酰-N-羟基苯胺；
N-羟基-4-硝基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-N-乙酰苯胺；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸异丙酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸甲酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸苯酯；
N-羟基-N-苯基氨基甲酸乙酯；和
N-羟基-N-(4-氰基苯基)氨基甲酸甲酯。
25.权利要求23-24中任一项的抗微生物酶组合物，其中所述漆酶是微生物漆酶。
26.权利要求25的抗微生物酶组合物，其中所述漆酶来源于鬼伞属、毁丝霉属、多孔菌属、密孔菌属、Scytalidium或丝核菌属。
27.权利要求23-24中任一项的抗微生物酶组合物，其中所述组合物是含水组合物。
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