ITMI20090921A1 - Composizione a base di enzimi per la rimozione di biofilm microbici e relativi usi in campo medico e alimentare - Google Patents
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Description
“Composizione a base di enzimi per la rimozione di biofilm microbici e relativi usi in campo medico e alimentare”
La presente invenzione concerne una composizione a base di enzimi per la rimozione di biofilm e relativi usi in campo medico e alimentare. L’invenzione concerne ulteriormente l’uso di tale composizione in associazione con un disinfettante.
I biofilm microbici sono aggregati di batteri o altri microrganismi su una superficie (strumento chirurgico, smalto dentale, tubazione, alimento) immersi e circondati in una matrice amorfa protettiva che agisce come schermo nei confronti degli attacchi esterni. Questa matrice amorfa, prodotta dai batteri stessi mediante la secrezione di mucopolisaccaridi, è essenzialmente costituita da polimeri extracellulari e per questo motivo denominata EPS (extracellular polymeric substances).
Tali biofilm microbici rappresentano un problema per la salute umana in campo alimentare e sanitario per via della resistenza dei batteri così aggregati ai convenzionali trattamenti di pulizia e disinfezione (i.e. mediante agenti disinfettanti, detergenti, antibiotici, trattamento al calore). Tra le patologie causate da biofilm microbici a titolo esemplificativo possono essere citate la carie dentale, le otiti, le infezioni da Candida, le infezioni sistemiche dovute alla contaminazione di strumenti chirurgici come cateteri, pacemaker, lenti a contatto, protesi.
Per ovviare a questa problematica sono stati messi a punto diversi metodi fisici e chimici per rimuovere tali biofilm dalla più svariate superfici, da quella dentale a quella industriale. Un altro problema importante è quello di ottenere una rimozione completa del biofilm, poiché gli eventuali residui possono determinare un nuovo processo di colonizzazione e di formazione del biofilm.
Tra i vari approcci a cui si è ricorso per prevenire o rimuovere biofilm microbici, l’impiego di enzimi (i.e. proteinasi piuttosto che enzimi che degradano i polisaccaridi) si è dimostrato particolarmente efficace, poiché le componenti della matrice extracellulare sono principalmente polisaccaridi, glicoproteine e proteine. Per via della eterogeneità della matrice extracellulare polisacccaridica nel biofilm, si impiegano spesso miscele di enzimi o combinazioni di enzimi e agenti antimicrobici che possono essere più efficaci per raggiungere una degradazione sufficiente del biofilm microbico.
Ad esempio, esiste in commercio un prodotto a base di β-N-acetilglucosaminidasi (DispersinB™, Kane Biotech), una pectinasi prodotta da Aggregatibacter actinomycetemcomitans, da impiegarsi per la rimozione di biofilm microbici. L’enzima idrolizza i legami glicosidici di poli-β-1, 6-N-acetilglucosammina nelle adesine di batteri necessarie per la formazione dei biofilm. L’enzima è particolarmente attivo nei confronti dei polisaccaridi dello slime di Staphylococcus epidermis. Tale approccio limita l’applicazione nei confronti di biofilm con matrice EPS costituita oltre che da polimeri di acidi uronici, anche da proteine, poiché l’utilizzo del solo enzima βN-acetilglucosaminidasi consente di degradare solo una parte della matrice EPS.
Orgaz B. et al. (2007) [1], descrivono l’impiego di Pronase®, una miscela di enzimi proteolitici extracellulari prodotti da alcuni ceppi di Streptomyces griseus, che viene incapsulata in alginato. La tecnologia della incapsulazione è stata scelta per proteggere le pectinasi dall’azione delle proteasi. Infatti, è noto che per la loro natura le proteasi vanno usate indipendentemente o nelle applicazioni in combinazione con un altro enzima in una fase successiva. L’utilizzo dell’enzima incapsulato rende poco praticabile l’applicazione nel settore alimentare.
Johansen et al., (1997) [2], descrivono l’impiego di Pectinex Ultra SP un pool enzimatico a base di pectinasi ed emicellulasi su biofilm microbici di Staphylococcus spp. e Pseudomonas spp. L’attività mostrata da Pectinex Ultra SP è di degradazione dei polisaccaridi extracellulari, con una efficacia che varia secondo il microrganismo presente nel biofilm (maggiore efficacia sui biofilm di Staphylococcus spp. che sono notoriamente più sottili rispetto a Pseudomonas spp.). Per quanto riguarda i dati di efficacia nella riduzione di biofilm microbici (Tabella 2) mostrata da Pectinex Ultra SP, gli autori documentano nel caso migliore (Staphylococcus aureus) una riduzione di carica microbica pari a due log decimali, mentre per Pseudomonas la riduzione è pari ad un solo log. Quindi tale pool enzimatico è in grado di ridurre alcune tipologie di biofilm, ma non di rimuovere totalmente tutti i tipi di biofilm microbici a prescindere dalla loro complessità. Ciò è probabilmente dovuto alla assenza o presenza in tracce di attività proteasica nel pool enzimatico che quindi non consente una degradazione completa della matrice EPS.
Sulla base di quanto sopra esposto appare evidente l’esigenza di disporre di nuove composizioni a base di pool enzimatici atte alla rimozione totale di biofilm mediante l’idrolisi della matrice polimerica extracellulare (EPS) costituita da polimeri degli acidi uronici e proteine, in modo rapido, altamente efficace ed applicabili a diversi tipi di biofilm microbici.
Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che pool enzimatici a base di pectinasi, proteasi acida da Aspergillus niger sono in grado di rimuovere biofilm microbici in modo altamente efficace e rapido. Infatti, gli autori hanno riscontrato che l’attività proteasica presente in una determinata concentrazione nel pool enzimatico consente la rimozione della matrice EPS, poiché idrolizza anche la porzione proteica della matrice EPS dei biofilm.
Forma pertanto oggetto della presente invenzione l’uso di una composizione enzimatica comprendente almeno tre pectinasi scelte dal gruppo che consiste in pectina liasi (EC 232-894-5) con attività 25 PL/g, poligalatturonasi (EC 232-885-6) con attività 1000 PG/g, pectina metilesterasi (EC 232-807-0) con attività 170 PE/g, almeno una proteasi acida (EC 232-642-4) con attività 120 PAC/g da Aspergillus niger, per la rimozione di un biofilm microbico in campo alimentare, sanitario o industriale. Secondo una forma preferita di realizzazione dell’invenzione detta composizione enzimatica comprende ulteriormente almeno una arabinasi (EC 253-463-8) con attività 10-50 ARA/g e/o xilanasi (EC 232-800–2) con attività 100-150 AXA/g da Aspergillus niger.
Per ragioni di chiarezza si specifica che 1 PL (Pectina liasi) è la quantità di enzima che libera 1 µmol di doppi legami (misurata mediante assorbanza a 235 nm) al minuto da pectina di agrume a 30°C, pH 5.2; 1 ARA (endoarabinasi) è la quantità di enzima che libera oligomeri non precipitabili da arabinazyme (commercialmente disponibile da MEGAZYME, Irlanda) a 30°C, pH 4, per dare un valore di assorbanza misurata a 590 nm pari a 7; 1 AXA (Endo xilanasi) è la quantità di enzima che libera oligomeri non precipitabili da Remazol Brillant Blue Xylan (commercialmente disponibile da MEGAZYME, Irlanda) a 30°C, pH 2.75, per dare un valore di assorbanza misurata a 590 nm pari a 0.56; 1 PG (Poligalatturonasi) è la quantità di enzima che libera 1 µmol di unità di zucchero ridotte (determinate mediante 2-ciano-acetamide) al minuto da sodio poligalatturonato a 30°C, pH 4.85; 1 PE è la quantità di enzima che libera 1 µmol di acido (determinato mediante titolazione) al minuto dalla pectina a 30°C, pH 4.5.
Preferibilmente, detta composizione enzimatica è la miscela PECLYVE UF PLUS™ (Lyven).
Ancora secondo una forma preferita di realizzazione detto biofilm microbico è costituito da batteri appartenenti al genere Listeria (i.e. Lysteria monocytogenes), Staphylococcus (i.e. Staphylococcus aureus), Pseudomonas (i.e. Pseudomona aeruginosa).
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo per la rimozione di un biofilm microbico da una superficie (i.e. attrezzature medicali, superfici abilitate al diretto contatto con alimento, tubazione acque o fluidi corporei) in cui la composizione enzimatica come sopra definita viene applicata su detta superficie ad una temperatura compresa tra 25°C-37°C per un tempo compreso tra 10 e 60 minuti, preferibilmente tra 15 e 50 minuti, a pH 4.
Preferibilmente detta composizione enzimatica è usata ad una concentrazione compresa tra l’1% e il 2%.
Costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione l’uso simultaneo o sequenziale di una composizione enzimatica comprendente almeno tre pectinasi scelte dal gruppo che consiste in pectina liasi (EC 232-894-5) con attività: 25 PL/g, poligalatturonasi (EC 232-885-6) con attività: 1000 PG/g, pectina metilesterasi (EC 232-807-0) con attività: 170 PE/g, almeno una proteasi acida (EC 232-642-4) con attività 120 PAC/g da Aspergillus niger, ed un agente disinfettante, per la rimozione di un biofilm microbico in campo alimentare, sanitario o industriale.
Secondo una forma preferita di realizzazione dell’invenzione detta composizione enzimatica comprende ulteriormente almeno una arabinasi (EC 253-463–8) con attività 10-50 ARA/g e una xilanasi (EC 232-800–2) con attività 100-150 AXA/g da Aspergillus niger.
Preferibilmente, l’agente disinfettante è 5-cloro-2-(2,4-diclorofenossi)fenolo o triclosan.
Secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione l’uso di detta composizione enzimatica in combinazione con un agente disinfettante avviene ad una temperatura compresa tra 25°C-37°C per un tempo compreso tra 10 e 60 minuti, preferibilmente tra 15 e 50 minuti.
Ancora preferibilmente la composizione enzimatica viene usata in combinazione con un agente disinfettante ad una concentrazione compresa tra l’1% e il 2%. Preferibilmente detta composizione enzimatica è usata in concentrazione pari all’1% e detto agente disinfettante è usato in concentrazione pari all’1%.
Nel caso di uso simultaneo per favorire la miscela del pool enzimatico con l’agente disinfettante (i.e. triclosan) viene aggiunta una sostanza gelificante. Pertanto, secondo forme preferite di realizzazione dell’invenzione detta composizione è in forma di gel.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui: la Figura 1 mostra uno schema che illustra l’attività enzimatica di pectinasi, quali la pectina liasi (PL), endo-poligalatturonasi (PG), pectinmetilesterasi (PE), sulle pectine;
la Figura 2 mostra l’effetto del pH sull’attività proteolitica dell’enzima proteasi acida da Aspergillus niger (pannello A); l’effetto della temperatura sull’attività proteolitica dell’enzima proteasi acida da Aspergillus niger (pannello B); l’effetto del pH e della temperatura sulla stabilità dell’enzima proteasi acida da Aspergillus niger dopo un bagno di 18 ore (pannelli C-D);
la Figura 3 mostra nella riga A i biofilm microbici di Staphylococcus aureus e di Listeria monocytogenes cresciuti da 1 settimana; nella riga B i biofilm microbici di Staphylococcus aureus e di Listeria monocytogenes non trattati con le miscele enzimatiche ma solo con tampone acetato (bianco); nella riga C i biofilm microbici controllo di Staphylococcus aureus e di Listeria monocytogenes;
la Figura 4 mostra i risultati del trattamento del biofilm microbico di Listeria monocytogenes con i pool enzimatici E1 (riga A), E2 (riga B) E3 (riga C) alle concentrazioni dell’1-2% dopo 15 minuti;
la Figura 5 mostra i risultati del trattamento del biofilm microbico di Listeria monocytogenes con i pool enzimatici E1 (riga A), E2 (riga B) E3 (riga C) alle concentrazioni dell’1-2% dopo 30 minuti;
la Figura 6 mostra i risultati del trattamento del biofilm microbico di Listeria monocytogenes con i pool enzimatici E1 (riga A), E2 (riga B) E3 (riga C) alle concentrazioni dell’1-2% dopo 50 minuti;
la Figura 7 mostra i risultati del trattamento del biofilm microbico di Staphylococcus aureus con i pool enzimatici E1 (riga A), E2 (riga B) E3 (riga C) alle concentrazioni dell’1-2% dopo 15 minuti;
la Figura 8 mostra i risultati del trattamento del biofilm microbico di Staphylococcus aureus con i pool enzimatici E1 (riga A), E2 (riga B) E3 (riga C) alle concentrazioni dell’1-2% dopo 30 minuti;
la Figura 9 mostra i risultati del trattamento del biofilm microbico di Staphylococcus aureus con i pool enzimatici E1 (riga A), E2 (riga B) E3 (riga C) alle concentrazioni dell’1-2% dopo 50 minuti.
ESEMPIO 1: Saggio di una miscela di enzimi in grado di degradare un biofilm di Listeria monocytogenes e di Staphylococcus aureus
L’obiettivo della sperimentazione è testare tre tipologie di enzimi nei confronti dell’azione di rimozione di biofilm di Listeria monocytogenes alla temperatura di esercizio degli enzimi di 25°C e 37°C per tempi di contatto di 15 min, 30 min e 50 min.
I pool enzimatici testati sono stati i seguenti: E1: PECLYVE UF PLUS™ (Lyven) comprendente pectinasi (pectina liasi (PL); endo-poligalatturonasi (PG) e pectin metil esterasi (PE)), una proteasi acida da Aspergillus niger.
E2: Multifect Pectinase FE (Genencor) a base di pectinasi, cellulasi, emicellulasi da Aspergillus niger.
E3: Multifect CX13L (Genencor) a base di cellulasi.
La sperimentazione si è articolata in quattro fasi:
- produzione del biofilm di Listeria monocytogenes nelle micropiastre tramite l’applicazione della metodica di produzione biofilm;
- idrolisi della matrice EPS presente nel biofilm contenuto nello micro piastre tramite utilizzo dei tre pool enzimatici E1-E3 per i tempi e alle temperature sopra menzionate;
- rilevazione del livello di riduzione biofilm tramite l’utilizzo della metodica di lettura della presenza di biofilm;
- analisi dei risultati.
MATERIALI E METODI
Caratterizzazione pool enzimatico E1
Il pool enzimatico E1 (PECLYVE UF PLUS™, Lyven) comprende pectinasi (pectina liasi (PL); endopoligalatturonasi (PG) e pectin metil esterasi (PE)), una proteasi acida da Aspergillus niger e delle attività collaterali di xilanasi/arabinasi.
Le pectinasi sono in grado di scindere i legami estere o etere delle pectine secondo lo schema mostrato nella Figura 1.
La proteasi acida di Aspergillus niger idrolizza il substrato proteico in peptidi solubili.
Le proprietà biochimiche dell’enzima sono raffigurate nella Figura 2. Più specificatamente il pannello A mostra l’effetto del pH sull’attività proteolitica; il pannello B l’effetto della temperatura sull’attività proteolitica; il pannello C-D l’effetto del pH e della temperatura sulla stabilità enzimatica dopo un bagno di 18 ore, rispettivamente.
Il pH ottimale è 3, mentre la temperatura ottimale è 30°C.
L’attività ottimale del pool enzimatico PECLYVE UF PLUS™ si ottiene ad un valore di pH di circa 4.5. A pH 3.0 l’attività si riduce al 40% dell’optimum.
La temperatura ottimale di utilizzo del pool enzimatico è normalmente compresa tra 50°-55°C. In questo intervallo di temperatura la velocità di reazione è al massimo senza incorrere nel rischio di deattivazione enzimatica.
A temperature più basse (i.e. 25°C o 37°C) deve essere considerato un tempo di reazione o una dose maggiore per ottenere i medesimi risultati. Pertanto, sono state impiegate delle concentrazioni pari all’1% e al 2% nelle prove condotte con E1 a 25°C e 37°C.
Per quanto riguarda i tempi di reazione, la stessa ditta produttrice Lyven consiglia un trattamento di 1-2 ore a 45°C-55°C o di 6-8 ore a 15°C-25°C. I tempi di impiego nel saggio su biofilm erano compresi tra 15 minuti e 50 minuti.
I pool enzimatici comparativi E2 ed E3 sono presenti sul mercato come Multifect Pectinase FE (Genencor) a base di pectinasi, cellulasi, emicellulasi da Aspergillus niger e Multifect CX13L (Genencor) a base di un complesso di cellulasi derivato da Penicillum funiculosm e Trichoderma reesei.
Metodo per la produzione di biofilm
Il test di produzione di biofilm è stato effettuato su micropiastre contenenti Tryptone Soya Broth (Oxoid, Milano) incubate a 37°C per 7 giorni; dopo 48, 72 e 96 ore si è proceduto con l'aspirazione del terreno di coltura esausto e sostituzione con terreno fresco.
In ogni pozzetto della micropiastra sono stati dispensati 200 µl di TSB inoculati con 10 µl di coltura microbica per tutta la notte in TSB diluita in modo tale da ottenere una concentrazione finale in ogni pozzetto di 100-1000 CFU/ml; per ogni esperimento sono stati riempiti otto pozzetti e otto pozzetti sono stati utilizzati come controllo e riempiti unicamente da 200 µl di TSB non inoculato.
Alla fine dell’incubazione è stato effettuato il test di formazione di biofilm secondo il protocollo messo a punto da Christensen et al., (1985) [3] modificato secondo quanto riportato da Stepanovic et al., (2007) [4].
Le micropiastre sono state svuotate e ogni pozzetto è stato lavato per tre volte con 300 µl di tampone sterile fosfato (PBS) per rimuovere tutte le cellule non aderite. Le micropiastre sono state quindi poste ad asciugare a 60°C per 60 minuti.
Metodica di lettura della presenza di biofilm
Ogni pozzetto è stato quindi riempito con 150 µl di cristalvioletto usato per la colorazione di Gram (2% Hucker) e colorato per 15 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, il colorante è stato aspirato, i pozzetti lavati sotto acqua corrente. Le micropiastre sono poi state messe ad asciugare a temperatura ambiente. Per ogni pozzetto sono stati dispensati 150 µl di alcol etilico al 96% (Carlo Erba) e si sono coperte le micropiastre per minimizzare l’evaporazione dell’etanolo e lasciate a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitazione per permettere la completa solubilizzazione in etanolo del biofilm colorato.
Le micropiastre sono quindi state lette a 570 nm utilizzando il lettore di micropiastre Sunrise (Tecan).
Il cristalvioletto è un colorante che penetra nelle cellule batteriche e che si scioglie in etanolo, che ha un picco massimo di assorbimento a valori di DO pari a 570 nm. I lavaggi con tampone eliminano le cellule libere che non sono inglobate nel biofilm.
Il dato di DO relativo ai singoli trattamenti va confrontato con il dato di DO dei pozzetti di controllo: elevate differenze di DO tra i pozzetti trattati con enzimi e DO dei pozzetti controllo corrispondono a un elevato effetto di rimozione del biofilm da parte dell'enzima.
Ai fini della sperimentazione, valori di DO570elevati implicano presenza di un numero elevato di cellule microbiche organizzate in biofilm.
Idrolisi della matrice EPS presente nel biofilm delle micropiastre
Le micropiastre provviste di biofilm sono state trattate con tre diverse miscele di enzimi per tempi e concentrazioni diverse.
Gli enzimi utilizzati sono:
E1: PECLYVE UF PLUS (Lyven)
E2: Multifect Pectinase FE (Genecor)
E3: Multifect CX13L (Genecor)
Le temperature di idrolisi testate sono rispettivamente 25°C e 37°C.
Al termine del trattamento con i pool enzimatici i campioni sono stati sottoposti alla procedura di colorazione in cristalvioletto e successiva lettura secondo quanto precedentemente esposto per i campioni non trattati.
RISULTATI
Per ogni prova vengono riportati, oltre ai valori di DO570dei singoli trattamenti con miscele di enzimi, anche:
- il valore di DO570del controllo (biofilm non trattato);
- il valore di DO570dei campioni trattati per 15, 30 min e 50 min con tampone acetato (tampone in cui sono sciolte le 3 miscele enzimatiche);
- il valore di DO570dei campioni trattati per 50 min con acqua.
Analisi dei dati
Prova a 25°C – Listeria monocytogenes
DO570controllo: 0,784
DO570trattamento per 50 min con H2O: 0,519
Tempo di contatto: 15 min
DO570trattamento per 15 min con tampone: 0,709
Tempo di contatto: 30 min
DO570trattamento per 30 min con tampone: 0,690
Tempo di contatto: 50 min
DO570trattamento per 50 min con tampone: 0,618
Prova a 37°C – Listeria monocytogenes
DO570controllo: 0,900
DO570trattamento per 50 min con H2O: 0,543 Tempo di contatto: 15 min
DO570trattamento per 15 min con tampone: 0,563
Tempo di contatto: 30 min
DO570trattamento per 30 min con tampone: 0,504
Tempo di contatto: 50 min
DO570trattamento per 50 min con tampone: 0,405
I risultati dimostrano come già dopo 15 minuti di trattamento a 25°C con il pool enzimatico E1 si ottengono dei risultati di rimozione del biofilm molto più consistenti ed in tempi più brevi rispetto ai pool enzimatici comparativi E2 ed E3.
Analisi dei dati
Le stesse prove sono state condotte in piastre di grandi dimensioni senza la lettura dell’assorbanza. Prova a 25°C – Staphylococcus aureus
DO570controllo: 0,745
DO570trattamento per 50 min con H2O: 0,529
Tempo di contatto: 15 min
DO570trattamento per 15 min con tampone: 0,625
Tempo di contatto: 30 min
DO570trattamento per 30 min con tampone: 0,486
Tempo di contatto: 50 min
DO570trattamento per 50 min con tampone: 0,711
Prova a 37°C – Staphylococcus aureus
DO570controllo: 1,032
DO570trattamento per 50 min con H2O: 1,051
Tempo di contatto: 15 min
DO570trattamento per 15 min con tampone: 1,147
Tempo di contatto: 30 min
DO570trattamento per 30 min con tampone: 0,739
Tempo di contatto: 50 min
DO570trattamento per 50 min con tampone: 0,680
BIBLIOGRAFIA
[1] Orgaz B., R.J. Neufeld, SanJose C. Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 1045-1051.
[2] Johansen C., Falholt P., Gram L. Applied and Environmental Microbiology, 1997, p.3724-3728.
[3] Christensen G.D., Simpson W.A., Younger J.J., Baddour L.M., Barrett F.F., Melton D.M., Beachey E.H. (1985). J. Clin. Microbiol. 22, 996-1006.
[4] Stepanovic S., Vukovi D., Hola V., Bonaventura G., Djuki S., Irkovi I., Ruzicka F. (2007). APMIS 115, 891-899.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di una composizione enzimatica comprendente almeno tre pectinasi scelte dal gruppo che consiste in pectina liasi (EC 232-894-5) con attività 25 PL/g, poligalatturonasi (EC 232-885-6) con attività 1000 PG/g, pectina metilesterasi (EC 232-807-0) con attività 170 PE/g, almeno una proteasi acida (EC 232-642-4) con attività 120 PAC/g da Aspergillus niger, per la rimozione di un biofilm microbico da una superficie in campo alimentare, sanitario o industriale.
- 2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta composizione enzimatica comprende ulteriormente almeno una cellulasi e/o emicellulasi da Aspergillus niger.
- 3. Uso secondo la rivendicazione 2 in cui detta cellulasi è arabinasi da Aspergillus niger (EC 253-463-8) con attività 10-50 ARA/g.
- 4. Uso secondo la rivendicazione 2 in cui detta emicellulasi è xilanasi da Aspergillus niger (EC 232-800–2) con attività 100-150 AXA/g.
- 5. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in cui detta composizione enzimatica è la miscela PECLYVE UF PLUS™.
- 6. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-5 in cui detto biofilm microbico è costituito da batteri appartenenti al genere Listeria, Staphylococcus, Pseudomonas, Streptomyces, Flavobacterium, o loro associazioni.
- 7. Metodo per la rimozione di un biofilm microbico da una superficie in cui la composizione enzimatica come definita secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6 viene applicata su detta superficie ad una temperatura compresa tra 25°C-37°C per un tempo compreso tra 10 e 60 minuti, preferibilmente tra 15 e 50 minuti, a pH 4.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui detta composizione enzimatica è usata ad una concentrazione compresa tra l’1% e il 2%.
- 9. Uso simultaneo o sequenziale della composizione enzimatica come definita secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6 in combinazione con un agente disinfettante, per la rimozione di un biofilm microbico in campo alimentare, sanitario o industriale.
- 10. Uso secondo la rivendicazione 9, in cui detto agente disinfettante è triclosan.
- 11. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 9-10 in cui detta composizione enzimatica viene usata ad una concentrazione compresa tra 1%-2%.
- 12. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 9-11 in cui detto agente disinfettante viene usato ad una concentrazione pari all’1%.
- 13. Uso simultaneo secondo ognuna delle rivendicazioni 9-12, in cui detta composizione è in forma di gel.
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- 2009-05-25 IT IT000921A patent/ITMI20090921A1/it unknown
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