CN107921102A

CN107921102A - 组合疗法

Info

Publication number: CN107921102A
Application number: CN201680042973.9A
Authority: CN
Inventors: 阿古斯塔·格维兹门斯多蒂尔; 雷尼尔·谢温
Original assignee: Mei Gongsi
Current assignee: Mei Gongsi
Priority date: 2015-07-24
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-07-22
Also published as: DK201870043A1; AU2016301021A1; RU2725800C2; EP3120866A1; CN107921102B; CA2992677A1; US11338021B2; BR112018001391A2; EP3325002A1; KR20180031704A; RU2018106490A; DK180380B1; RU2018106490A3; AU2016301021B2; US20200085921A1; MX2018000984A; JP2018521143A; WO2017017027A1

Abstract

本发明提供了用于治疗受试者中的细菌生物膜的组合疗法，其包含(a)具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和(b)一种或多种抗生素化合物。还提供了组合物和其使用方法。

Description

组合疗法

技术领域

本发明涉及用于治疗和预防细菌生物膜，诸如存在于复发性上和下呼吸道感染中的那些的组合疗法。

背景技术

生物膜是包含嵌入细胞外基质(ECM)中的微生物细胞群体的异质的复杂3D矩阵。生物膜不仅是细胞的被动结集，而且是形成局部生态系统的结构和动态复杂的生物系统。生物膜群体内的微生物细胞似乎协作并呈现特殊功能。通过协作并形成保护性ECM，生物膜为微生物提供受保护的生长模式，这种模式允许其移生于多样化环境。生物膜生长模式允许细菌抵抗宿主的免疫系统以及抗生素和类似的抑菌剂和杀菌剂。生物膜的发育由此允许群体细菌显示对抗生素的抗性。在生物膜中生长的细菌比其浮游的，即自由生活的配对物更难击败(参看del Pozo和Patel，2007，《临床药理学治疗法(Clin.Pharmacol.Ther.)》82：204-9，以及Stewart和Costerton，2001，《柳叶刀(Lancet)》358：135-8)。

生物膜可以由粘附至几乎任何生物或非生物表面的单细菌或多细菌群体组成。在这类多细胞群体中，细胞粘附至彼此。大多数细菌种类以及古生菌、原生动物、真菌和海藻具有粘附至表面和彼此并且形成生物膜结构的能力。生物膜的形成通常以自由浮动的微生物附着至表面开始。当众多基因的表达改变时，浮游细胞经历表型转变并且从自由生活模式切换至生物膜生长模式。第一批移生者最初经由弱的可逆粘附而粘附至表面，这种粘附可以通过细胞粘附表面，诸如纤毛的产生变得更强。一旦移生已经开始，生物膜经由细胞分裂与新细菌的出现和结合的组合而生长。第一批移生者通过提供更多样的粘附部位并且通过开始构建将生物膜固持在一起的矩阵而促进其它细胞的到达。

生物膜可以在多种设置中，诸如在自然界、国内工业以及医院设置中形成，在此其发挥各种作用，这些作用视情形而定可以是正面或负面的。

在医学设置中，生物膜在表面上形成细菌的持久储集器。生物膜可以直接地在患者上并且间接地在患者的直接环境的表面上出现。直接存在于患者上的生物膜通常与复发性感染相关联，而细菌从直接环境转移患者牵涉于原发性与复发性感染中。在医院设置中的生物膜的实例是在导管和其它形式的管材上以及在诸如心脏瓣膜和关节假体的植入物上的生物膜。

在工业设置中，生物膜可以是必不可少的与有害的。举例来说，在有效的微生物生物反应器的新近发展中，生物膜移生的电极用于产生电力。还已经探索生物膜作为化合物的可能的生物工厂，例如纤维素。

国际专利申请WO 00/78332提供了鱼丝氨酸蛋白酶，包括来源于鳕鱼(诸如大西洋鳕鱼)的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶用于治疗和/或预防多种疾病和病症的用途。举例来说，这些是发炎性疾病，由病毒、细菌和真菌种类引起的感染性疾病，以及受体结合机制涉及于发病机理中的疾病。

Augustin等(2004)和Gudmundsdottir等(2013)论述了使用酶去除生物膜的可能性。然而，单独的酶的使用不足以破坏细菌并且在给予时间和适当的环境下细菌本身可以再附着至表面或任何邻近表面并且再构建生物膜(Augustin等，2004；Gudmundsdottir等，2013)。

已经显示来自鳕鱼的胰蛋白酶促进通过清创术去除死皮并且从而有助于正常皮肤修复过程。使用亲水海洋酶，如鳕鱼胰蛋白酶和来自寒冷环境的其它丝氨酸蛋白酶的主要问题在于这类酶对热灭活敏感并且因此在室温下相对不稳定(Stefansson等，2010)。鳕鱼胰蛋白酶在化妆品、医学装置以及医药品中的使用取决于增加酶的稳定性。

已经发现生物膜涉及于体内广泛多种微生物感染中，据估计占所有感染的80％(参看″关于微生物生物膜的研究(Research on microbial biofilms)(PA-03-047)″，国家卫生研究院(NIH)，国家心肺和血液学会(National Heart，Lung，and Blood Institute)，2002-12-20)。生物膜已经牵涉的感染过程包括常见的问题，诸如泌尿道感染、导管感染、中耳感染、涂层隐形眼镜，以及不太常见但更致命的过程，诸如心内膜炎、囊性纤维化中的感染以及永久留置装置(诸如关节假体和心脏瓣膜)的感染。

有趣的是，附着至表面并且生长成生物膜的微生物，诸如细菌不太易受常规抗生素治疗的攻击。降低的抗生素易感性促使生物膜感染，诸如与植入的装置相关联的那些持久存在。在生物膜中工作的保护机制似乎与负责常规抗生素抗性的那些不同。在生物膜中，假定不良抗生素穿透、营养限制、缓慢生长、适应性应激反应以及存留细胞的形成构成多层防御。

此外，生物膜培养物对于在不发展基因型抗性的情况下用化学疗法根除通常是非常难治的。因此，治疗选项的数目受限制并且具有抗生物膜活性的新颖抗微生物剂的开发越来越重要。

因此，对杀死、抑制或阻止细菌生物膜的生长(在医学与非医学环境中)的新方法存在需要。

发明内容

本发明的第一个方面提供了一种用于治疗受试者中的细菌生物膜的组合疗法，其包含(a)具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和(b)一种或多种抗生素化合物。

“组合疗法”包括使用两种或更多种治疗剂的任何形式的同期或平行治疗。因此，这类疗法包括独立施用多肽和抗生素化合物，以及提供包含混合在一起的两种治疗剂的单一组合物。

“治疗”包括组合治疗剂的治疗性与预防性用途。关于治疗性用途，本领域的技术人员将了解，组合疗法可以完全根除现有的细菌生物膜或其可以提供部分效益(诸如构成生物膜的细菌群体的大小的减小和/或构成生物膜的细菌群体的生长的减缓)。同样地，关于预防性用途，组合疗法可以完全预防生物膜形成或可以仅提供部分效益，诸如降低细菌生物膜感染的可能性和/或严重性。

在一个实施方案中，受试者是人类。然而，本发明的组合疗法还可以适用于兽医学设置中，例如家畜和/或农畜(包括犬、猫、马、牛、猪、绵羊等等)中的细菌生物膜的治疗。

个别地，抗生素和丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶)不能解决生物膜感染。尽管抗生素可以用于治疗全身和局部细菌感染，这取得不同程度的成功，但这类化合物无法容易地穿透生物膜的细胞外基质并且因此对杀死生物膜内的细菌具有有限的功效。抗生素因此不能完全解决源自于生物膜的感染。

丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶)可以溶解细菌的细胞外基质并且也能够释放粘附至生物或无机物质的细菌，以及阻止其立即再附着。然而，细菌不被胰蛋白酶治疗杀死并且在给予时间下将能够恢复其附着至表面的能力。

因此，当个别地施用时，丝氨酸蛋白酶或抗生素不能完全解决生物膜感染。

本发明源于当组合施用丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶)和常规抗生素化合物时意外发现对细菌生物膜的协同效应。令人惊讶地，活性剂的这种所选组合能够以协同方式毁坏细胞外基质与生物膜内的细菌。不希望受理论约束，据信通过破坏生物膜的细胞外基质，丝氨酸蛋白酶能够使抗生素更深入地穿透至生物膜中并且接近驻留于其中的细菌细胞。这允许抗生素对细菌发挥其功能，这种功能否则受细胞外基质的屏障效应阻碍。

本领域的技术人员将了解，本文所描述的组合疗法可以用于在可以发现微生物生物膜的任何环境中杀死、抑制或阻止这类生物膜的生长。因此，生物膜可以与惰性支持体或与活支持体相关联。

在一个实施方案中，生物膜与活支持体相关联。举例来说，生物膜可以在人类或动物体内的表面上生长或易生长。

因此，本发明提供了如上文所定义的组合疗法，其用于治疗或预防与生物膜的存在或生长相关联的病状。

举例来说，本文所描述的组合疗法可以用于治疗或预防与体内以下部位之一处的微生物生物膜的生长相关联的病症或病状：

(a)呼吸道(例如，上和/或下呼吸道的复发性细菌感染)；

(b)泌尿道(例如，膀胱炎)；

(c)鼻窦(例如，慢性鼻窦炎)；

(d)耳(例如，中耳感染)；

(e)心脏(例如，心内膜炎)；

(f)前列腺(例如，慢性细菌性前列腺炎)；

(g)骨(例如，骨髓炎)；

(h)肺(例如，囊性纤维化中的感染，诸如肺炎)；

(i)肾(例如，感染性肾结石和腹膜透析中)；和/或

(j)皮肤。

在另一个实施方案中，生物膜与惰性支持体相关联。因此，生物膜可以在植入或以其它方式插入人类或动物体内的装置的表面上生长或易生长。

举例来说，本文所描述的组合疗法可以用于治疗或预防与体内以下惰性表面之一上的微生物生物膜的生长相关联的感染：

(a)导管(例如，供血管内或泌尿道使用)；

(b)支架(例如，冠状动脉支架)；

(c)分流器(例如，脑脊液分流器)；

(d)插管或气管切开插管；

(e)眼用装置(例如，隐形眼镜、巩膜扣以及眼内晶状体)；

(f)关节假体(即，关节成形术和其它矫形外科用装置的植入)；

(g)人工心脏瓣膜；和/或

(h)乳房植入物。

因此，将了解，如本文所描述的组合疗法特别适于院内感染的治疗和预防。

在一个实施方案中，生物膜包含或由革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌组成。

因此，细菌可以是革兰氏阳性细菌，诸如选自由葡萄球菌或链球菌组成的群组的那些。举例来说，细菌可以是葡萄球菌，诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA))。或者，细菌可以是链球菌，诸如变形链球菌(Streptococcus mutans)和/或血链球菌(Streptococcus sanguis)。

细菌也可以是革兰氏阴性细菌，诸如军团菌(Legionella)。

在一个优选的实施方案中，生物膜包含独立地选自由以下组成的群组的细菌：肺炎链球菌(Streptococcus pneumomae)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aerugmosa)、流感嗜血杆菌(Heamophilus influenza)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcusaureus)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、变形链球菌、血链球菌(Streptococcussangumis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile)，以及其任何混合物。

因此，所述生物膜可以包含独立地选自以下的细菌：肺炎链球菌、缓症链球菌、绿脓假单胞菌以及流感嗜血杆菌，或其混合物。

举例来说，生物膜可以包含或由链球菌，诸如缓症链球菌和/或肺炎链球菌组成。

本发明的组合疗法将以医药学上有效剂量施用于受试者。如本文所用的‘治疗有效量’或‘有效量’或‘治疗有效的’指的是对于给定的病状和施用方案提供治疗作用(例如，细菌生物膜的根除、大小减小或生长延迟)的量。这是经过计算以与所需添加剂和稀释剂，即载剂或施用媒剂联合产生所要治疗作用的活性物质的预定量。此外，这欲意味着足以减少并且最优选地阻止宿主的活性、功能和反应的临床显著缺乏的量。或者，治疗有效量足以引起宿主的临床显著病状的改善。如本领域的技术人员所了解，化合物的量可以视其比活性而变化。适合的剂量可以含有经过计算以与所需稀释剂联合产生所要治疗作用的活性组合物的预定量。在用于制造本发明的组合物的方法和用途中，提供治疗有效量的活性组分。如本领域中众所周知，治疗有效量可以由一般技能的医学或兽医学工作者基于患者特征，诸如年龄、体重、性别、病状、并发症、其它疾病等等来确定。医药学上有效剂量的施用可以通过以个别剂量单位或者若干更小剂量单位的形式单次施用以及通过在特定时间间隔下多次施用细分的剂量来进行。或者，剂量可以作为经过一段延长时段的连续输注而提供。

本发明的组合疗法的第一个关键组分是具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽。

具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包括能够使蛋白质中的肽键裂解的天然产生的与非天然产生的催化多肽，其中丝氨酸充当多肽的活性位点(如根据EC编号3.4.21所定义)处的亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶活性可以类胰凝乳蛋白酶(即，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及弹性蛋白酶)或类枯草杆菌蛋白酶。

在一个实施方案中，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽展现胰蛋白酶活性。举例来说，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以是真核或原核起源的天然产生的胰蛋白酶，或这样的胰蛋白酶的突变型式。具体地包括冷适应胰蛋白酶，诸如来自大西洋鳕鱼(大西洋真鳕(Gadusmorhua))、大西洋和太平洋鲑鱼(例如，大西洋鲑(Salmo salar)和太平洋鲑(Oncorhynchus)种类)以及阿拉斯加狭鳕(黄线狭鳕(Theragra chalcogramma))的胰蛋白酶，以及其突变形式(如下文所描述)。

胰蛋白酶的三种主要同工酶已经从大西洋鳕鱼表征，指定为胰蛋白酶I、II以及III(参看等，1989，《欧洲生物化学期刊(Eur.J.Biochem.)》180：85-94，其公开内容以引用的方式并入本文中)。举例来说，参看GenBank入藏号ACO90397。

另外，大西洋鳕鱼表达胰凝乳蛋白酶的两种主要同工酶，指定为胰凝乳蛋白酶A和B(参看和Bjarnason，1991，《比较生物化学与生理学B辑(Comp.Biochem.Physiol.B)》998：327-335，其公开内容以引用的方式并入本文中)。举例来说，参看GenBank入藏号CAA55242.1。

在一个实施方案中，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含或由与来自大西洋鳕鱼(大西洋真鳕)的胰蛋白酶I的氨基酸序列，即SEQ ID NO：1共有至少70％序列一致性的氨基酸序列组成，SEQ ID NO：1：

16

I

IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG

79

I

TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG

141

I

WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV

200

I

VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY

[SEQ ID NO：1]

(其中氨基酸序列和编号是根据蛋白质数据库[PDB]条目‘2EEK’)

如同许多蛋白酶一样，来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I作为无活性前体或酶原产生，其包含裂解分开以产生成熟的活性胰蛋白酶的前肽(或“活化”)序列。胰蛋白酶的初始表达产物还包含在表达之后去除的信号序列。

来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I的酶原序列(包括信号序列)在下面以SEQ ID NO：2示出(并且对应于Uniprot数据库入藏号P16049-1)：

其中：

信号肽＝氨基酸1至13(加下划线)

前肽＝氨基酸14至19(加粗斜体)

成熟胰蛋白酶＝氨基酸20至241

如本文所用的术语‘氨基酸’包括标准二十个遗传编码的氨基酸和其对应的呈‘D’形式(与天然的‘L’形式相比较)的立体异构体、ω-氨基酸和其它天然产生的氨基酸、非常规氨基酸(例如，α，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸等等)以及化学衍生的氨基酸(参看下文)。

除非另有明确规定，否则当具体地列举氨基酸，诸如‘丙氨酸’或‘Ala’或‘A’时，这个术语指的是L-丙氨酸与D-丙氨酸。其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的适合组分，只要所要的功能特性由多肽保留即可。对于所示的多肽，每个编码的氨基酸残基在适当时由单字母名称表示，对应于常规氨基酸的俗名。

根据惯例，本文所公开的氨基酸序列以N端至C端的方向提供。

通常，本发明的组合物中所用的多肽包含或由L-氨基酸组成。

具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含或由与SEQ ID NO：1共有至少80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列组成。

因此，在一个实施方案中，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含或由SEQ IDNO：1的氨基酸序列组成。

然而，多肽可以替代地包含或由作为SEQ ID NO：1的突变体或变体的氨基酸序列组成。“变体”意味着多肽不与SEQ ID NO：1共有100％氨基酸序列一致性，即，SEQ ID NO：1的一个或多个氨基酸必须发生突变。举例来说，多肽可以包含或由与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％一致性，更优选地与所述序列具有至少60％、70％或80％或85％或90％一致性，并且最优选地与所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列组成。因此，在指定位置处的氨基酸可以缺失，被取代或可以是一个或多个氨基酸插入/添加的位点。本领域的技术人员将了解，取代可以是保守的或非保守的。

一致性百分比可以由例如在Expasy设施网站(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)上的LALIGN程序(Huang和Miller，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》(1991)12：337-357，其公开内容以引用的方式并入本文中)使用全局比对选项、计分矩阵BLOSUM62、开放空位罚分-14、扩展空位罚分-4作为参数来确定。或者，两个多肽之间的序列一致性百分比可以使用适合的计算机程序，例如威斯康星大学遗传计算小组(University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序来确定，并且将了解，一致性百分比是关于序列已经最佳比对的多肽来计算。

或者，可以使用Clustal W程序(如Thompson等，1994，《核酸研究(Nucl.AcidRes.)》22：4673-4680中所描述，其以引用的方式并入本文中)进行比对。所使用的参数可以如下：

-快速成对比对参数：K元组(字)大小：1，窗口大小：5，空位罚分：3，顶部对角数：5。计分方法：x％。

-多重比对参数：空位开放罚分：10，空位扩展罚分：0.05。

-计分矩阵：BLOSUM。

或者，BESTFIT程序可以用于确定局部序列比对。

因此，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以是SEQ ID NO：1的变体，诸如EnzymaticaAB的国际专利申请号PCT/GB2015/051006(公布号WO 2015/150799)中所描述的那些。

本领域的技术人员将了解，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以替代地包含或由上文所定义的氨基酸序列中的任一者的片段组成，其中这种片段展现抗细菌活性。

“片段”包括上述氨基酸序列中的任一者的至少5个相连氨基酸，所述序列诸如(但不限于)SEQ ID NO：1或2。举例来说，片段可以包含上述氨基酸序列中的任一者的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200个或更多个相连氨基酸。

鉴别保留抗微生物(即，抗细菌)活性的上文所定义的丝氨酸蛋白酶多肽的片段的方法在本领域中是众所周知的。举例来说，可以通过已知的重组方法，使用WO 2015/150799中所描述的表达方法产生一系列不同片段，并且然后体外暴露于代表性微生物(诸如细菌菌株、病毒和/或真菌菌株)以确定哪个片段(部分或完全)抑制所述微生物的生长和/或增殖。

在一个特别优选的实施方案中，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含或由天然产生的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列组成。因此，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以由真核或原核起源的天然产生的胰蛋白酶的氨基酸序列组成。具体地包括冷适应胰蛋白酶，诸如来自大西洋鳕鱼(大西洋真鳕)、大西洋和太平洋鲑鱼(例如，大西洋鲑和太平洋鲑种类)以及阿拉斯加狭鳕(黄线狭鳕)的胰蛋白酶。举例来说，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含或由SEQ ID NO：1的氨基酸组成。

这类天然产生的丝氨酸蛋白酶可以从来源生物体(例如，大西洋鳕鱼)纯化或可以重组表达。

因此，本领域的技术人员将了解，本发明的这类天然产生的丝氨酸蛋白酶多肽必须以不同于其在自然界中所发现的形式提供。举例来说，本发明的多肽可以由天然产生的真核胰蛋白酶的氨基酸序列组成，但缺乏在自然界中表达时存在于蛋白质上的糖基化部分。

多肽组分可以按各种浓度配制，这取决于所使用的丝氨酸蛋白酶的功效/毒性。优选地，配方包含至少0.001μM，例如至少0.01μM、至少0.1μM、至少1μM、至少10μM、至少100μM或至少500μM的浓度的活性剂。适宜地，配方包含至多1mM，例如至多500μM、至多100μM、至多10μM、至多1μM、至多0.1μM或至多0.01μM的浓度的活性剂。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶多肽以介于0.001与10μM之间的浓度存在于配方中。因此，治疗性配方可以包含足以杀死或减缓生物膜群体中细菌的生长的量的多肽。

在这个方面的一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶多肽(例如，鳕鱼胰蛋白酶)的活性是0.001U/g至32U/g。

本发明的组合疗法的另一个关键组分是一种或多种抗生素化合物。

可以利用任何已知的抗生素化合物。举例来说，一种或多种抗生素化合物可以选自由以下组成的群组：阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿奇霉素(azithromycin)、碳青霉烯(carbapenem)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢菌素(cephalosporin)、氯霉素(chloramphenicol)、环丙沙星(ciprofloxacin)、克林霉素(clindamycin)、特丽仙(dalacin)、达福普丁(dalfopristin)、达托霉素(daptomycin)、强力霉素(doxycycline)、厄他培南(ertapenem)、红霉素(erythromycin)、氟喹诺酮(fluoroquinolone)、美罗培南(meropenem)、甲硝唑(metronidazole)、米诺环素(minocycline)、莫西沙星(moxifloxacin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素(penicillin)、奎奴普丁(quinupristin)、利福平(r而mpin)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)、替考拉宁(teicoplanin)、四环素(tetracycline)、甲氧苄啶(trimethoprim)、万古霉素(vancomycin)、杆菌肽(bacitracin)以及多粘菌素B(polymyxin B)，或其混合物。

在一个优选的实施方案中，一种或多种抗生素化合物选自由以下组成的群组：四环素、头孢噻肟、万古霉素、红霉素以及苯唑西林。

本领域的技术人员将了解，本发明的组合疗法可以包含单一抗生素化合物或多种抗生素化合物。

根据本领域中的公知常识，用于本发明的组合疗法中的抗生素的浓度将取决于所使用的特定抗生素以及所治疗的生物膜的指征和/或位置。通常，抗生素将以介于0.1至5％(按重量计)之间，例如介于0.1至1％(按重量计)之间的浓度配制。

本发明的第二个相关方面提供了一种用于治疗受试者中的细菌生物膜的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其中这种多肽与一种或多种抗生素化合物组合使用。

本发明的第三个相关方面提供了一种制备用以治疗受试者中的细菌生物膜的药剂的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其中这种多肽与一种或多种抗生素化合物组合使用。

关于本发明的第二个和第三个方面使用的适合的丝氨酸蛋白酶多肽和抗生素化合物的实例在上文详述。

本发明的第四个方面提供了一种医药组合物，其包含(a)具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和(b)一种或多种抗生素化合物，连同医药学上可接受的缓冲剂、赋形剂、稀释剂或载剂。

关于本发明的第四个方面使用的适合的丝氨酸蛋白酶多肽和抗生素化合物的实例在上文详述。

在一个实施方案中，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽以至少0.001μM，例如至少0.01μM、至少0.1μM、至少1μM、至少10μM、至少100μM或至少500μM的浓度存在。适宜地，组合物包含至多1mM，例如至多500μM、至多100μM、至多10μM、至多1μM、至多0.1μM或至多0.01μM的浓度的活性剂。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶多肽以介于0.001与10μM之间的浓度存在于组合物中。

当使用可获自鳕鱼的胰蛋白酶时，其在本发明的组合物中的浓度是0.001U/g至32U/g(即，以每克最终组合物的活性单位测量)。

在一个实施方案中，一种或多种抗生素化合物按重量计以0.1％至5％，例如0.1％至2％、0.5％至1.5％以及优选地1％的浓度存在。

医药组合物可以按本领域中已知的具有足够的储存稳定性并且适合施用于人类和动物的方式制备。举例来说，治疗性组合物可以冻干，例如，经由冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却或经由使用来自超临界粒子形成的粒子形成。

“医药学上可接受的”意味着不降低本发明的多肽的胰蛋白酶活性的效力的无毒物质。这类医药学上可接受的缓冲剂、载剂或赋形剂在本领域中是众所周知的(参看《雷明顿医药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，第18版，A.R Gennaro编，MackPublishing Company(1990)和《医药赋形剂手册(handbook of PharmaceuticalExcipients)》，第3版，A.Kibbe编，Pharmaceutical Press(2000)，其公开内容以引用的方式并入本文中)。

术语“缓冲剂”欲意味着含有旨在稳定pH的酸碱混合物的水溶液。缓冲剂的实例是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲胂酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO以及TES。

术语“稀释剂”欲意味着旨在稀释治疗性制剂中的肽的含水或非水溶液。稀释剂可以是盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中的一者或多者。

“赋形剂”可以是碳水化合物、聚合物、脂质以及矿物质中的一者或多者。碳水化合物的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇以及环糊精，将其添加至组合物中，例如，用于促进冻干。聚合物的实例是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、海藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯以及聚乙烯吡咯烷酮，全部具有不同分子量，将其添加至组合物中，例如，用于粘度控制、用于达成生物粘附或用于保护脂质免于化学和蛋白水解降解。脂质的实例是脂肪酸、磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、全部具有不同酰基链长和饱和度的鞘脂和糖脂、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋卵磷脂和大豆卵磷脂，出于与关于聚合物的那些类似的原因将其添加至组合物中。矿物质的实例是滑石、氧化镁、氧化锌以及氧化钛，将其添加至组合物中以获得效益，诸如液体积聚的减少或有利的颜料特性。

在一个实施方案中，多肽可以与稳定剂，诸如氯化钙一起提供。

本发明的组合物中还可以包括紫外线吸收剂(例如，N，N-二甲基PABA辛酯、甲基肉桂酸辛酯、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、二对甲氧基肉桂酸-单-2-乙基己酸甘油、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸钠)、低碳醇(例如，乙醇、异丙醇)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯氧基乙醇)、杀菌剂(例如，氯己啶(chlorohexidine)、盐酸盐、三氯卡班(trichlorocarbanilide)、三氯生(triclosan)、吡硫锌(zinc pyrithione))、银(例如，单质银、氧化银、硝酸银、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、银纳米粒子)、着色剂(例如，染料、颜料)、调味剂(例如，薄荷醇、樟脑、百里酚、桉叶醇)粉末、香料(例如，香精油、动物起源的香料、合成香料)、维生素(例如，维生素A和其衍生物、维生素E和其衍生物、维生素C和其衍生物、泛酸、维生素H、维生素B和其衍生物)、脲、水溶性聚合物(例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、黄原胶、透明质酸)、缓冲剂(例如，谷氨酸钠、精氨酸、天冬氨酸、柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、乳酸钠)、抗生素、抗真菌、抗病毒以及抗寄生虫药物。

具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以配制成本领域中已知的适合于递送多肽剂的任何类型的治疗性组合物。

在一个实施方案中，多肽和抗生素化合物可以简单地溶解于水、盐水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲剂中。举例来说，在配制多肽以经口施用(诸如在口腔喷雾中)的情况下，治疗性组合物可以包含溶解于水、甘油以及薄荷醇中的多肽。例示性口腔喷雾配方在斯堪的纳维亚(Scandinavia)内以(由Enzymatica AB，Lund，Sweden)销售。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了渗透活性溶液中的如上文所描述的蛋白酶多肽和抗生素化合物。举例来说，多肽和抗生素化合物可以在甘油(glycerol/glycerine)中配制。不希望受理论约束，据信这类渗透活性溶液促进流体从微生物细胞内移动至细胞外环境。据信这继而通过建立(至少部分)抑制诸如细菌和病毒的微生物细胞被宿主上皮细胞(例如，口咽的)摄取的薄活性屏障来促进本发明的多肽的治疗作用。

在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可以呈脂质体的形式，其中多肽和抗生素化合物加上其它医药学上可接受的载剂与两亲剂组合，所述两亲剂诸如脂质，其以聚集的形式作为胶束、不溶性单层以及液晶存在。用于脂质体配方的适合的脂质包括(但不限于)甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等等。适合的脂质还包括在极性头基中由聚(乙二醇)改性用于延长血流循环时间的上述脂质。这类脂质体配方的制备可以在例如US 4,235,871中找到，其公开内容以引用的方式并入本文中。

本发明的治疗性组合物还可以呈生物可降解微球的形式。脂肪族聚酯，诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)，以及聚酸酐已经广泛用作微球产生中的生物可降解聚合物。这类微球的制备可以在US 5,851,451和EP 0213 303中找到，其公开内容以引用的方式并入本文中。

在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物以聚合物凝胶的形式提供，其中聚合物，诸如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、海藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯以及聚乙烯吡咯烷酮用于含有肽的溶液的增稠。聚合物还可以包含明胶或胶原蛋白。

将了解，本发明的治疗性组合物可以包括用于加强多肽的作用的离子和规定的pH。另外，组合物可以经受常规治疗性操作，诸如灭菌，和/或可以含有常规佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等等。

在一个优选的实施方案中，治疗性组合物包含Tris或磷酸盐缓冲液中的多肽和抗生素化合物，连同EDTA、木糖醇、山梨糖醇、丙二醇以及甘油中的一者或多者。

根据本发明的治疗性组合物可以经由本领域的技术人员所知的任何适合的途径施用。因此，可能的施用途径包括吸入、经颊、肠道外(静脉内、皮下、鞘内以及肌肉内)、局部、经眼、经鼻、经肺、肠道外、经阴道以及经直肠。从植入物施用也是可能的。

在一个替代性实施方案中，治疗性组合物肠道外施用，例如，静脉内、脑室内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下，或其可以通过输注技术施用。治疗性组合物适宜以无菌水溶液的形式使用，所述溶液可以含有其它物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等张。如有必要，水溶液应适当缓冲(优选地达到3至9的pH)。在无菌条件下适合的肠道外配方的制备易于通过本领域的技术人员所熟知的标准医药技术来实现。

适合于肠道外施用的配方包括含水和非水无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及促使配方与预期接受者的血液等张的溶质；以及含水和非水无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。配方可以在单位剂量或多剂量容器，例如密封安瓿和小瓶中呈现，并且可以储存于冷冻干燥(冻干)的条件下，这仅需要在临用前添加无菌液体载剂，例如注射用水。即时注射溶液和悬浮液可以从先前所描述的种类的无菌粉末、颗粒以及片剂制备。

或者，治疗性组合物可以鼻内或通过吸入施用(例如，以气溶胶喷雾呈现形式从加压容器、泵、喷雾器或雾化器，借助于适合的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、诸如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)的氢氟烷烃、二氧化碳或其它适合的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性多肽的溶液或悬浮液，例如，使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可以另外含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。可以配制用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如，由明胶制成)以含有本发明的化合物和适合的粉末基剂(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

有利地，多肽以适合于递送至呼吸道的粘膜的形式提供。

本发明的第五个方面提供了一种治疗受试者中的实体肿瘤的方法，这种方法包括向受试者施用治疗有效量的(a)具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和(b)一种或多种抗生素化合物。

关于本发明的第五个方面使用的适合的丝氨酸蛋白酶多肽和抗生素化合物的实例在上文详述。

“治疗”包括组合治疗剂的治疗性与预防性用途。本领域的技术人员将了解，组合疗法可以完全根除细菌生物膜或可以提供部分效益(诸如构成生物膜的细菌群体的大小的减小和/或构成生物膜的细菌群体的生长的减缓)。

在一个实施方案中，受试者是人类。然而，本发明的方法还可以适用于兽医学设置中，例如家畜和/或农畜(包括犬、猫、马、牛、猪、绵羊等等)中的细菌生物膜的治疗。

本领域的技术人员将了解，本文所描述的方法可以用于在可以发现微生物生物膜的任何环境中杀死、抑制或阻止这类生物膜的生长。因此，生物膜可以与惰性支持体或活支持体相关联。

在一个实施方案中，生物膜与活支持体相关联(参看上文)。举例来说，生物膜可以在人类或动物体内的表面上生长或易生长。因此，本发明提供了如上文所定义的化合物，其用于治疗或预防与生物膜的存在或生长相关联的病状。举例来说，受试者可以在上和/或下呼吸道中具有或易染上与生物膜形成相关联的感染。

在另一个实施方案中，生物膜与惰性支持体相关联(参看上文)。因此，生物膜可以在植入或以其它方式插入人类或动物体内的装置的表面上生长或易生长。

因此，将了解，如本文所描述的方法特别适于院内感染的治疗和预防。

因此，细菌可以是革兰氏阳性细菌，诸如选自由葡萄球菌或链球菌组成的群组的那些。举例来说，细菌可以是葡萄球菌，诸如金黄色葡萄球菌(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA)。或者，细菌可以是链球菌，诸如变形链球菌和/或血链球菌。

细菌还可以是革兰氏阴性细菌，诸如军团菌。

在一个优选的实施方案中，生物膜包含独立地选自以下的细菌：肺炎链球菌、缓症链球菌、绿脓假单胞菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、变形链球菌、血链球菌、嗜肺军团菌、艰难梭状芽胞杆菌，以及其任何混合物。

在本发明的方法中，组合疗法将以医药学上有效剂量施用于患者。如本文所用的‘治疗有效量’或‘有效量’或‘治疗有效的’指的是对于给定的病状和施用方案提供治疗作用的量(参看上文)。

本发明的第六个方面提供了一种用于向受试者递送有效量的根据本发明的第一个方面的组合疗法的医学装置，这种装置包含根据本发明的第四个方面的组合物的储集器和用于从装置释放所述组合物的构件。

举例来说，装置可以是适合于将根据本发明的第一个方面的组合疗法递送至呼吸道的粘膜的口腔喷雾或鼻腔喷雾。

在一个实施方案中，本发明提供了一种可植入的医学装置，其用如本文所描述的组合物浸渍、涂布或以其它方式处理。

举例来说，医学装置是选自由以下组成的群组的可植入的医学装置：血管内装置、导管、分流器、插管和气管切开插管、眼科装置、关节假体、人工心脏瓣膜以及乳房植入物。“可植入的装置”包括附着身体的内或外表面的装置，例如隐形眼镜。

优选地，可植入的医学装置在使用前封装于密封和无菌的容器中。

本发明的第七个方面提供了一种体外杀死、抑制或阻止细菌生物膜的生长的方法，这种方法包括使生物膜(或有待阻止生物膜生长的表面)暴露于根据本发明的第一个方面的组合疗法。举例来说，本发明的上文所描述的组合物还可以按灭菌溶液或洗涤液的形式使用以阻止表面或基质上微生物生物膜的生长，诸如在家庭环境(例如，厨房工作表面、淋浴器、管道、地板等等)或商业或工业环境(例如，在冷却系统内、管道、地板表面等等)的环境中。

这类洗涤溶液可以进一步包含表面活性剂(surface-active agent/surfactant)。适合的表面活性剂包括阴离子表面活性剂(例如，脂肪族磺酸盐)、两性和/或两性离子表面活性剂(例如，脂肪族季铵、磷翁以及硫翁化合物的衍生物)以及非离子表面活性剂(例如，脂肪醇、酸、酰胺或具有环氧烷的烷基酚)。适宜地，表面活性剂以0.5至5重量％的浓度存在。

在体外与体内用途中，本发明的组合物优选地暴露于目标表面至少5分钟。举例来说，暴露时间可以是至少10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、12小时以及24小时。

以下图式构成本说明书的一部分并且包括在内以进一步展示本发明的某些方面。本发明可以通过与本文所呈现的特定实施方案的详细描述组合参考图式来更好地理解。

图1鳕鱼胰蛋白酶与所选抗生素的组合对生物膜消散的作用

鳕鱼胰蛋白酶与所选抗生素的组合对生物膜消散的作用。这个图显示，鳕鱼胰蛋白酶和所选抗生素的组合可以比单独的更有效地破坏生物膜。使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长并且用作生物膜的模型。用抗生素或抗生素和鳕鱼胰蛋白酶的组合处理生物膜。用结晶紫将生物膜染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。基于研究可以推断，某些抗生素(在这种情况下是四环素、红霉素、苯唑西林以及头孢噻肟)和鳕鱼胰蛋白酶的组合比单独的抗生素更有效地破坏细菌生物膜。然而，万古霉素显示当与胰蛋白酶组合时对模型生物膜不具有显著增加的功效。高于条柱的P值指示如通过斯图登氏t检验(Student′s t test)评估的两个处理之间的差异的显著性。

图2鳕鱼胰蛋白酶与所选抗生素的组合对生物膜消散的作用

鳕鱼胰蛋白酶与所选抗生素的组合对生物膜消散的作用。这个图显示，鳕鱼胰蛋白酶与四环素或头孢噻肟的组合可以比单独的更有效地破坏生物膜。使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长并且用作模型生物膜。用鳕鱼胰蛋白酶、抗生素或两者的组合处理生物膜。用结晶紫将生物膜染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。基于研究可以推断，对于这个模型，鳕鱼胰蛋白酶和抗生素四环素或头孢噻肟的组合比单独的鳕鱼胰蛋白酶或抗生素更有效地破坏细菌生物膜。高于条柱的P值指示如通过ANOVA分析评估的作用的显著性。

图3鳕鱼胰蛋白酶与所选抗生素的组合对生物膜消散的作用

鳕鱼胰蛋白酶与所选抗生素的组合对生物膜消散的作用。这个图像是鳕鱼胰蛋白酶和所选抗生素的组合可以比单独的更有效地破坏生物膜的清晰的视觉展示。使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。用鳕鱼胰蛋白酶、抗生素或两者的组合处理生物膜。然后用结晶紫将生物膜染色。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶和抗生素的组合比单独的抗生素更有效地破坏细菌生物膜。如由万古霉素展示，用抗生素处理生物膜可以增加生物膜形成，其作用被鳕鱼胰蛋白酶的存在抵消，如第7列和第8列显而易见。

这个图像显示由肺炎链球菌和缓症链球菌组成的生物膜生长4小时，继而用鳕鱼胰蛋白酶(ct)、抗生素或鳕鱼胰蛋白酶/抗生素处理的96孔板。每一列表示一种类型的处理或处理组合，其中行表示从上至下递减的浓度。处理之后，用结晶紫将生物膜染色，其中更深的颜色表示更多剩余的生物膜。这个图像展示，抗生素和鳕鱼胰蛋白酶的组合可以比单独的实体更有效。这对于单独的药物似乎增加生物膜形成的万古霉素尤其明显，而在与鳕鱼胰蛋白酶的组合中，万古霉素可以增加鳕鱼胰蛋白酶的功效。最低的行表示空白，其中前六个孔表示未处理的生物膜并且后六个表示无生物膜。左侧的表格展示用于每一行/稀释度的鳕鱼胰蛋白酶和抗生素的浓度。

这个图像展示胰蛋白酶如何增加某些抗生素的功效，据推测是通过破坏生物膜并且从而准许抗生素接近细菌。

图4鳕鱼胰蛋白酶对在用结晶紫将生物膜染色之后视觉上呈现的超级生物膜的作用

鳕鱼胰蛋白酶对在用结晶紫将生物膜染色之后视觉上呈现的超级生物膜的作用。这个图显示，鳕鱼胰蛋白酶如由指示生物膜不存在的透明孔所见以浓度依赖性方式破坏超级生物膜。具有肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的超级生物膜在微量滴定板中生长。用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂处理生物膜2分钟并且将孔染色以测量在处理之后生物膜的存在(黑色孔)或其不存在(透明孔)。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶非常有效地破坏超级生物膜。

摄影图像显示由肺炎链球菌和缓症链球菌组成的生物膜生长4小时，继而用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂处理的96孔板。每一列表示一种浓度，其中前三行表示鳕鱼胰蛋白酶处理的重复实验并且下三行显示在相同稀释度下无鳕鱼胰蛋白酶配方的重复实验。处理之后，用结晶紫将生物膜染色，其中更深的颜色表示更多剩余的生物膜。这个图像展示，鳕鱼胰蛋白酶可以在更高浓度下有效地去除生物膜，但在更低浓度下可能需要额外的因素。

图5鳕鱼胰蛋白酶对超级生物膜的作用

在结晶紫染色并且在乙酸中溶解之后如通过分光光度法测量的鳕鱼胰蛋白酶对超级生物膜的作用。这个图显示，鳕鱼胰蛋白酶以浓度依赖性方式破坏超级生物膜。使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂处理生物膜并且用结晶紫将孔染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶非常有效地破坏细菌生物膜。数据以条形图呈现，其中误差条指示平均值的标准误差(SEM)。对于安慰剂和鳕鱼胰蛋白酶的稀释液处理的细菌生物膜的数据彼此相邻放置。在相同稀释度下鳕鱼体内酶(Penzyme)与安慰剂相比生物膜形成的对数减少高于条柱，如同由星号(*)指示的显著性的水平，其中*表示P＜0.05，**P＜0.01并且***P＜0.001。斯图登氏T检验用于计算显著性。

图6.在不同浓度下由鳕鱼胰蛋白酶引起的超级生物膜的对数减少

在不同浓度下由鳕鱼胰蛋白酶引起的超级生物膜的对数减少。这个图显示，鳕鱼胰蛋白酶以浓度依赖性方式破坏超级生物膜。使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂处理生物膜并且用结晶紫将孔染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成并且在对数标度上将减少与安慰剂处理的生物膜相比较。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶在8U/g或更高的浓度下在小于2分钟内非常有效地破坏细菌生物膜，其中3的对数减少表示99.9％去除生物膜并且4的对数减少是生物膜减少99.99％。

图7鳕鱼胰蛋白酶预处理对生物膜形成的作用

鳕鱼胰蛋白酶预处理对生物膜形成的作用。这个图显示，在37℃下在96孔微量滴定板中孵育之前用鳕鱼胰蛋白酶预处理形成生物膜的细菌肺炎链球菌和缓症链球菌对其形成生物膜的能力具有浓度依赖性作用。在用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂短暂处理之后使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。允许生物膜生长4小时后，用结晶紫将孔染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶非常有效地阻止细菌生物膜形成。数据以箱形图呈现，其中长方形的顶部指示第三四分位数，接近长方形中间的水平线指示中位数，并且长方形的底部指示第一四分位数。垂直线从长方形的顶部延伸以指示最大值，并且另一个垂直线从长方形的底部延伸以指示最小值。

图8鳕鱼胰蛋白酶预处理对生物膜形成的作用

鳕鱼胰蛋白酶预处理对生物膜形成的作用。这个图显示，当浮游细菌在允许形成生物膜之前用胰蛋白酶处理时鳕鱼胰蛋白酶可以按浓度依赖性方式阻止生物膜的形成。在用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂处理之后使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。允许生物膜生长4小时后，用结晶紫将孔染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶非常有效地阻止细菌生物膜形成。如通过斯图登氏t检验评估的差异的统计显著性由高于箱的符号指示，其中n.s是p＞0.05，*是p＜0.05，**p＜0.01，并且***p＜0.001。

实施例

实施例1：鳕鱼胰蛋白酶组合物对肺炎球菌(Pneumococcus)和缓症链球菌(S.mitis)的粘附的抑制

如图1和图2中展示，在用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂处理之后使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。允许生物膜生长4小时后，用结晶紫将孔染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。基于研究推断，鳕鱼胰蛋白酶组合物非常有效地阻止细菌生物膜形成。在生物膜形成之前用鳕鱼胰蛋白酶组合物处理细菌显示对体外生物膜形成的浓度依赖性作用。鳕鱼胰蛋白酶以浓度依赖性方式阻止生物膜形成。在用鳕鱼胰蛋白酶或安慰剂处理之后使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。允许生物膜生长4小时后，用结晶紫将孔染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶非常有效地阻止细菌生物膜形成。数据以箱形图呈现，其中长方形的顶部指示第三四分位数，接近长方形中间的水平线指示中位数，并且长方形的底部指示第一四分位数。垂直线从长方形的顶部延伸以指示最大值，并且另一个垂直线从长方形的底部延伸以指示最小值。对于安慰剂和鳕鱼胰蛋白酶处理的细菌的数据放在同一图中。箱的重叠将指示生物膜形成无差异。如通过斯图登氏t检验评估的差异的统计显著性由高于箱的符号指示，其中n.s是p＞0.05，*是p＜0.05，**p＜0.01，并且***p＜0.001。结果呈现于图1和2中。

图4、5、6、7以及8展示，鳕鱼胰蛋白酶很能以浓度依赖性方式从表面去除细菌并且部分地阻止细菌再附着至表面。然而，这单独地可能不足以完全根除细菌感染，因为鳕鱼胰蛋白酶对细菌不是致命的。

实施例2：鳕鱼胰蛋白酶和抗生素的组合用于由这类胰蛋白酶组合物引起的超强生物膜破坏

使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。用抗生素或抗生素和鳕鱼胰蛋白酶的组合处理生物膜。用结晶紫将生物膜染色，继而用乙酸溶解。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。据推断，鳕鱼胰蛋白酶和抗生素的组合比单独的抗生素更有效地破坏细菌生物膜(参看图3)。高于条柱的P值指示如通过斯图登氏t检验评估的两个处理之间的差异的显著性。使用与鳕鱼胰蛋白酶处理组合的所选抗生素显示，如图1中所见在所测试的5种药物中的4者中鳕鱼胰蛋白酶的使用显著增强抗生素的作用。图2中的数据提供了用结晶紫将生物膜染色，继而用乙酸溶解的结果。以492nm下的吸光度测量生物膜形成，并且针对未处理的生物膜标准化。高于条柱的P值指示如通过ANOVA分析评估的作用的显著性。数据展示，鳕鱼胰蛋白酶与抗生素处理的局部组合使用与单独的抗生素相比改善生物膜的破坏。意外地发现，鳕鱼胰蛋白酶与抗生素的组合改善抗生素对生物膜的破坏。鳕鱼胰蛋白酶的添加允许当处理生物膜感染时使用更低浓度的抗生素。图3显示鳕鱼胰蛋白酶与所选抗生素的组合对生物膜消散的作用。这个图像是鳕鱼胰蛋白酶和所选抗生素的组合比单独的更有效地破坏生物膜的清晰的视觉展示。使用肺炎链球菌和缓症链球菌的组合的生物膜在微量滴定板中生长。用鳕鱼胰蛋白酶、抗生素或两者的组合处理生物膜。然后用结晶紫将生物膜染色。基于研究可以推断，鳕鱼胰蛋白酶和抗生素的组合比单独的抗生素更有效地破坏细菌生物膜。

参考文献

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Claims

1.一种用于治疗受试者中的细菌生物膜的组合疗法，其包含(a)具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和(b)一种或多种抗生素化合物。

2.如权利要求1所述的供使用的组合疗法，其中所述受试者是人类。

3.如权利要求1或2所述的供使用的组合疗法，其中所述生物膜位于上和/或下呼吸道中。

4.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述生物膜包含或由革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌组成。

5.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述生物膜包含独立地选自以下的细菌：肺炎链球菌、缓症链球菌、绿脓假单胞菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、变形链球菌、血链球菌、嗜肺军团菌、艰难梭状芽胞杆菌，以及其任何混合物。

6.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述生物膜包含或由链球菌组成。

7.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述生物膜包含或由缓症链球菌和/或肺炎链球菌组成。

8.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，或其混合物的组分。

9.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是天然产生的。

10.如权利要求9所述的供使用的组合疗法，其中所述多肽是海洋丝氨酸蛋白酶。

11.如权利要求10所述的供使用的组合疗法，其中所述海洋丝氨酸蛋白酶可获自鳕鱼、狭鳕、鲑鱼或磷虾。

12.如权利要求11所述的供使用的组合疗法，其中所述海洋丝氨酸蛋白酶可获自大西洋鳕鱼。

13.如权利要求12所述的供使用的组合疗法，其中所述海洋丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶，例如胰蛋白酶I。

14.如权利要求13所述的供使用的组合疗法，其中胰蛋白酶的所述活性在0.1至16U/g的范围内。

15.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽包含或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成：

IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY

[SEQ ID NO：1]

或其保留所述氨基酸序列的所述胰蛋白酶活性的片段、变体、衍生物或融合物。

16.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽从天然来源纯化。

17.如权利要求1至15中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是重组蛋白。

18.如权利要求17所述的供使用的组合疗法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽是非天然产生的。

19.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述一种或多种抗生素化合物选自由以下组成的群组：阿莫西林、氨苄西林、阿奇霉素、碳青霉烯、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢菌素、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、特丽仙、达福普丁、达托霉素、强力霉素、厄他培南、红霉素、氟喹诺酮、美罗培南、甲硝唑、米诺环素、莫西沙星、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、奎奴普丁、利福平、磺胺甲恶唑、替考拉宁、四环素、甲氧苄啶、万古霉素、杆菌肽以及多粘菌素B，或其混合物。

20.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其中所述一种或多种抗生素化合物选自由以下组成的群组：四环素、头孢噻肟、万古霉素、红霉素以及苯唑西林。

21.如前述权利要求中任一项所述的供使用的组合疗法，其包含单一抗生素化合物。

22.一种用于治疗受试者中的细菌生物膜的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽与一种或多种抗生素化合物组合使用。

23.如权利要求22所述的供使用的多肽，其中所述多肽如权利要求8至18中任一项所定义。

24.如权利要求22或23所述的供使用的多肽，其中所述一种或多种抗生素化合物如权利要求19至21中任一项所定义。

25.一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的用途，其用于制备用以治疗受试者中的细菌生物膜的药剂，其中所述多肽与一种或多种抗生素化合物组合使用。

26.如权利要求25所述的多肽的用途，其中所述多肽如权利要求8至18中任一项所定义。

27.如权利要求25或26所述的多肽的用途，其中所述一种或多种抗生素化合物如权利要求19至21中任一项所定义。

28.一种医药组合物，其包含(a)具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和(b)一种或多种抗生素化合物，连同医药学上可接受的缓冲剂、赋形剂、稀释剂或载剂。

29.如权利要求28所述的组合物，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽如权利要求8至18中任一项所定义。

30.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述一种或多种抗生素化合物如权利要求19至21中任一项所定义。

31.如权利要求28至30中任一项所述的组合物，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽以介于0.001与10μM之间的浓度存在。

32.如权利要求28至31中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种抗生素化合物按重量计以0.1％至5％，例如0.1％至2％、0.5％至1.5％以及优选地1％的浓度存在。

33.一种治疗受试者中的实体肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(a)具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和(b)一种或多种抗生素化合物。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述受试者是人类。

35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述生物膜位于上和/或下呼吸道中。

36.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述生物膜包含或由革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌组成。

37.如权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述生物膜包含独立地选自以下的细菌：肺炎链球菌、缓症链球菌、绿脓假单胞菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、变形链球菌、血链球菌、嗜肺军团菌、艰难梭状芽胞杆菌，以及其任何混合物。

38.如权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述生物膜包含或由链球菌组成。

39.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述生物膜包含或由缓症链球菌和/或肺炎链球菌组成。

40.如权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述多肽如权利要求8至18中任一项所定义。

41.如权利要求33至40中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗生素化合物如权利要求19至21中任一项所定义。

42.如权利要求33至41中任一项所述的方法，其中所述具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽通过口腔喷雾递送。

43.一种用于向受试者递送有效量的如权利要求1至21中任一项所述的组合疗法的医学装置，所述装置包含如权利要求28至32中任一项所述的组合物的储集器和用于从所述装置释放所述组合物的构件。

44.如权利要求43所述的医学装置，其中所述装置是口腔喷雾。

45.如权利要求43所述的医学装置，其中所述装置是鼻腔喷雾。

46.一种体外杀死、抑制或阻止细菌生物膜的生长的方法，所述方法包括使所述生物膜(或有待阻止生物膜生长的表面)暴露于如权利要求1至21中任一项所述的组合疗法。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述多肽如权利要求8至18中任一项所定义。

48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述一种或多种抗生素化合物如权利要求19至21中任一项所定义。