JP2019104757A - 細菌性バイオフィルムを除去するためのセアプローゼの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】表面上に存在する細菌性バイオフィルムを崩壊させる方法の提供。【解決手段】好ましくは皮膚であり、より好ましくは創傷である、表面上に存在する細菌性バイオフィルムを崩壊させる方法であって、０．０００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜１重％のセアプローゼを含む組成物を細菌性バイオフィルムに適用する段階を含み、組成物の細菌性バイオフィルムへの適用が細菌性バイオフィルム好ましくは、グラム陽性細菌性バイオフィルムであり、スタフィロコッカス属細菌であり、黄色ブドウ球菌、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のバイオフィルムのマトリックスを崩壊させる方法。【効果】前記及び方法はバイオフィルムを処置するために有用である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年5月8日に出願された米国仮出願第61/820,915号、及び、2012年5月11日に出願された米国仮出願第61/645,815号についての恩典を主張する。参照される出願の内容は、参照として本出願に組み入れられる。

A.発明の分野
本発明は概してバイオフィルムを処置するために有用な方法及び組成物に関する。当該組成物は活性成分としてセアプローゼを含み得る。

B.関連技術についての説明
バイオフィルムは、不活性であるかまたは生きている表面に付着した、細菌または菌類の集団である。バイオフィルム中の細菌は、細菌をまとめて保持し、かつ細菌集合体をその下にある表面に堅固に付着させる、一般的には多糖類マトリクスである細胞外高分子マトリクス中に巻き込まれている。バイオフィルムがヒトの健康に対して有意な脅威を構成することを証拠が示している。公衆衛生局は、バイオフィルムがヒトにおける細菌感染の80％超の原因であると推定している（国立保健研究機構、1998RFA# DE-98-006（非特許文献１））。バイオフィルムは、尿路感染症、膀胱炎、肺感染症、皮膚感染症、副鼻腔感染症、耳感染症、挫創、歯性感染症、歯周病、院内感染症、開放創、及び慢性創傷等の健康状態に関与している。バイオフィルム中に生育する細菌は、抗生物質及び抗微生物剤に対する増大した抵抗性を示し、除去するのが非常に困難である。

創傷及び皮膚病変は特に細菌感染しやすい。微生物学の観点から、正常な無傷の皮膚の主な機能は、皮膚表面上に生存する微生物集団を制御し、下にある組織が活性な病原体によってコロニー形成され侵入されるのを防ぐことにある。創傷または皮膚病変等の、皮下組織の曝露は、微生物のコロニー形成及び増殖を招く、湿性で、温かく且つ栄養ある環境を提供する。創傷における細菌のコロニー形成は、大抵、多微生物性であり、潜在的に病原性である多数の微生物を含むため、いかなる創傷または皮膚病変も、感染する危険性が高い。

創傷には、しばしば治癒までに多数の障害がある。創傷治癒及び感染は、創傷環境内に安定で繁栄した群を作るための細菌の能力と、細菌群を制御するための宿主の能力との間の関係に影響される。細菌は、表面への付着後に自身の保護的環境、即ち、バイオフィルムを迅速に形成することができるため、これらの生物を制御する宿主の能力は、バイオフィルム群の成熟と共に減少すると思われ、結局、創傷が治癒する能力に影響を及ぼす。治癒が遅れた創傷、即ち慢性創傷は、バイオフィルム形成に特に関係する。ある人々は、バイオフィルムを慢性創傷と関連付けた（Mertz,2003年、Wounds, 15: 1-9（非特許文献２））。糖尿病性足部潰瘍、静脈性下肢潰瘍、動脈性下肢潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、熱傷及び褥瘡は、慢性創傷となり得る創傷の例である。慢性創傷中の細菌性バイオフィルムは、一般的に、宿主の免疫系によっては解消されず、これらのバイオフィルムは、全身性及び局所的抗微生物剤／抗生物質に対して増大した耐性を有する。従って、慢性創傷における細菌性バイオフィルム感染は除去するのが非常に困難である。

創傷中で特に病原性のある生物は、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)菌、ストレプトコッカス属(Streptococcus)菌及びエンテロコッカス属(Enterococcus)菌等のグラム陽性細菌である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）等の耐性株を含む黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のバイオフィルムは、創傷及び皮膚病変において増々問題となってきている。これらの生物、特にMRSAは前鼻腔に常駐し、鼻における皮膚病変を起こし得、体の他の部分にも拡散してそれらの部位において皮膚病変を起こし得る。

近年、非治癒性の、臨床的に感染した皮膚病変及び慢性創傷の処置において、種々の抗生物質及び抗微生物剤を使用する多数の努力がなされている。これらの抗微生物剤は、様々な化学物質からなり、その中にはバンコマイシン等のペプチド、ムピロシン等の抗微生物剤、及び銀/銀イオンも含まれる。しかしながら、MRSAを含む黄色ブドウ球菌等のある種のグラム陽性細菌は、これらの化合物に対してますます耐性になってきている。

国立保健研究機構、1998 RFA# DE-98-006 Mertz,2003年、Wounds, 15: 1-9

発明者らは、バイオフィルムを崩壊させ且つ表面から除去するためにセアプローゼを使用できることを発見した。

一例では、セアプローゼを含む組成物を細菌性バイオフィルムに適用する段階を含む、表面上に存在する細菌性バイオフィルムを崩壊させる方法であって、当該組成物の細菌性バイオフィルムへの適用が細菌性バイオフィルムのマトリックスを崩壊させる方法が開示されている。表面は生きているかまたは無生物の物体であり得る。例えば、表面は皮膚または創傷であり得る。創傷は慢性創傷であり得る（非限定的な例は、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下肢潰瘍、動脈性下肢潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、熱傷及び褥瘡を含む）。ある例においては、創傷は壊死組織（例えば、焼痂等）を含み得る。本発明の組成物は壊死組織を廓清できる。一態様において表面は上皮表面であり得る（非限定的な例は、口腔の一部、角膜表面の一部、生殖器の一部、泌尿器の一部、呼吸器の一部、消化器の一部、腹膜の一部、中耳の一部、または前立腺の一部を含む）。無生物物体の表面の非限定的な例は医療用インプラント機器（例えば、カテーテル、ステント、骨プレート、ネジ、ピン若しくはロッド、椎間板、耳チューブ、またはコンタクトレンズ）であり得る。ある態様では、組成物は0.0001〜1重量％、または0.001〜１重量％のセアプローゼを含み得る（これらの範囲より少ない及び多い、値並びに範囲もまた企図される。例えば、0.000001、0.0001、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％またはそれを超える量）。セアプローゼは、単離または精製されていてもよい。組成物は、局所的または注入可能な適用のために製剤され得る。このような製剤の例は、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、及び溶液であり得る。一つの特定の例では、組成物はグリセリンポリアクリレートクラスレート、グリセリン、乳化蝋若しくはワセリン、またはそれらの任意の組合せをさらに含み得る。ある態様では、組成物はヒドロキシエチルセルロースを含まない。細菌性バイオフィルムはグラム陰性細菌性バイオフィルムであり得る。グラム陰性バイオフィルムの非限定的な例はシュードモナス属(Pseudomonas)細菌により作られるバイオフィルムを含む。シュードモナス属細菌の非限定的な例は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)である。他の態様において、細菌性バイオフィルムはグラム陽性細菌性バイオフィルムであり得る。グラム陽性細菌性バイオフィルムの非限定的な例はスタフィロコッカス属細菌により作られるものである。スタフィロコッカス属細菌の非限定的な例は黄色ブドウ球菌である。黄色ブドウ球菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）であり得る。本発明の組成物によって崩壊した後のバイオフィルムの少なくとも一部の、表面からの除去もまた企図される。組成物は、抗微生物剤（例として、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤または洗浄剤をさらに含む；明細書はまた、これらの剤の例を以下に示す）を含み得る。場合により、当該方法はさらに、細菌性バイオフィルムにセアプローゼ含有組成物が適用される前、適用中または適用後の、第二の組成物の適用を含む。第二の組成物は抗微生物剤（上記のような剤）を含み得る。

細菌性バイオフィルムを崩壊させるための有効量のセアプローゼ及び許容される担体を含む組成物もまた企図される。上記で説明したように、組成物は0.0001〜1重量％、または0.001〜１重量％のセアプローゼを含み得る（これらの範囲より少ない及び多い、値並びに範囲もまた企図される。例えば、0.000001、0.0001、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％またはそれを超える量）。セアプローゼは、単離または精製されたセアプローゼでもよい。許容される担体は、薬学的に許容される局所用担体または薬学的に許容される注入可能な担体であり得る。組成物は、ゲル、クリーム、溶液、ペースト、または軟膏として製剤化され得る。ある特定の例では、組成物はワセリンを含む軟膏、グリセリンポリアクリレートクラスレートを含むゲル、またはグリセリン及び乳化蝋を含むクリームであり得る。ある態様では、組成物はヒドロキシエチルセルロースを含まない。細菌性バイオフィルムはグラム陰性細菌性バイオフィルムであり得る。グラム陰性バイオフィルムの非限定的な例はシュードモナス属細菌により作られるバイオフィルムを含む。シュードモナス属細菌の非限定的な例は緑膿菌である。他の態様において、細菌性バイオフィルムはグラム陽性細菌性バイオフィルムであり得る。グラム陽性細菌性バイオフィルムの非限定的な例はスタフィロコッカス属細菌により作られるものである。スタフィロコッカス属細菌の非限定的な例は黄色ブドウ球菌である。黄色ブドウ球菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）であり得る。組成物はさらに抗微生物剤（例として、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤、または洗浄剤が含まれる；本明細書はまたこれらの剤の例を以下に示す）を含み得る。抗微生物剤は特定の細菌に対して有効であり得る（例えば、スタフィロコッカス属細菌（例、黄色ブドウ球菌）またはシュードモナス属細菌（例、緑膿菌）等）。

明細書及び特許請求の範囲の全体に亘って開示されるいずれか一つの組成物を含むキットもまた企図される。ある実施形態において、組成物は容器中に含まれる。容器はビン、ディスペンサー、またはパッケージであり得る。容器は予め決められた量の組成物を分配することができる。ある態様において、組成物はスプレー、塊、または液体に分配される。

本明細書中で言及されるいずれの実施形態も、本発明の任意の方法または組成物に関して実現され得、その逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用され得る。

「阻害する」、「減ずる」、「処置する」という用語、またはこれらの用語の任意のバリエーションは、表面からのバイオフィルムの任意の測定可能な減少または完全な阻害若しくは除去を意味する。「崩壊する」という用語、またはこの用語の任意のバリエーションは、細菌性バイオフィルムのマトリックスの少なくとも一部の測定可能な減少または分解を意味する。また、本発明の組成物は、細菌性バイオフィルムを生じる恐れのある表面に当該組成物を適用することによって、表面上のバイオフィルムの形成を阻止するために使用することもできる。

「細菌性バイオフィルム」という表現は、細菌（例、グラム陽性またはグラム陰性細菌）によって形成されたバイオフィルムを意味する。

「グラム陽性細菌性バイオフィルム」という表現は、グラム陽性細菌によって形成された細菌性バイオフィルムを意味する。

「グラム陰性細菌性バイオフィルム」という表現は、グラム陰性細菌によって形成された細菌性バイオフィルムを意味する。

「効果的」という用語は、明細書及び／または特許請求の範囲中で使用されるように、所望の、予期された、または意図された結果を達成するために十分であることを意味する。

本明細書及び請求項中で使用されるように、「含む(comprising)」（並びに、含むの任意の語形、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等）、「有する(having)」（並びに、有するの任意の語形、「有する(have)」及び「有する(has)」等）、「含む(including)」（並びに、含むの任意の語形、「含む(include)」及び「含む(includes)」等）、または「含有する(containing)」（並びに、含有するの任意の語形、「含有する(contain)」及び「含有する(contains)」等）という語句は、包括的または開放型であり、付加的な列記されていない要素または方法の段階を排除するものではない。

組成物及びその使用のための方法は、明細書全体に亘って開示される任意の成分若しくは段階を「含んで」もよく、それら任意の成分若しくは段階「から実質的に成って」もよく、または、それら任意の成分若しくは段階「から成って」もよい。「から実質的に成る」という移行句に関して、非限定的な一態様において、本明細書中に開示される組成物及び方法の基本的且つ新規な特徴には、細菌性バイオフィルムを崩壊させる組成物の能力が含まれる。
[本発明1001]
表面上に存在する細菌性バイオフィルムを崩壊させる方法であって、セアプローゼを含む組成物を細菌性バイオフィルムに適用する段階を含み、組成物の細菌性バイオフィルムへの適用が細菌性バイオフィルムのマトリックスを崩壊させる、方法。
[本発明1002]
表面が皮膚である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
表面が創傷である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
創傷が慢性創傷である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
慢性創傷が糖尿病性足部潰瘍、静脈性下肢潰瘍、動脈性下肢潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、熱傷または褥瘡である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
創傷が壊死組織を含む、本発明1003〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
壊死組織が焼痂である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
組成物が壊死組織をさらに廓清する、本発明1006〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
表面が上皮表面である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
上皮表面が口腔、角膜表面、生殖器、泌尿器、呼吸器、消化器、腹膜、中耳、または前立腺の一部である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
表面が無生物物体の一部である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
表面が医療用インプラント機器の一部である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
医療用インプラント機器が、カテーテル、ステント、骨プレート、ネジ、ピン若しくはロッド、椎間板、耳チューブ、またはコンタクトレンズである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
組成物が0.0001〜1重量％または0.001〜1重量％のセアプローゼを含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
セアプローゼが、単離または精製されたセアプローゼである、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
組成物が、ゲル、クリーム、軟膏、溶液、またはペーストとして製剤されている、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
組成物が、グリセリンポリアクリレートクラスレート、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、乳化蝋若しくはワセリン、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
組成物が局所的に表面へ適用される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
細菌性バイオフィルムがグラム陽性細菌性バイオフィルムである、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
細菌性バイオフィルムがスタフィロコッカス属(Staphylococcal)細菌を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
細菌が黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
細菌性バイオフィルムの一部が表面から除去される、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1024]
組成物が抗微生物剤をさらに含む、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
抗微生物剤が、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤、または洗浄剤である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
細菌性バイオフィルムに、第二の組成物が続いて適用される、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
第二の組成物が抗微生物剤を含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
抗微生物剤が、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤、または洗浄剤である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
細菌性バイオフィルムを崩壊させるための組成物であって、有効量のセアプローゼ及び許容される担体を含む、組成物。
[本発明1030]
組成物が0.0001〜1重量％または0.001〜1重量％のセアプローゼを含む、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
セアプローゼが、単離または精製されたセアプローゼである、本発明1029〜1030のいずれかの組成物。
[本発明1032]
許容される担体が薬学的に許容される局所用担体である、本発明1029〜1031のいずれかの組成物。
[本発明1033]
組成物が、ゲル、クリーム、溶液、ペースト、または軟膏として製剤されている、本発明1029〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1034]
組成物がワセリンを含む軟膏である、本発明1029〜1033のいずれかの組成物。
[本発明1035]
組成物がグリセリンポリアクリレートクラスレートを含むゲルである、本発明1029〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1036]
組成物がヒドロキシエチルセルロースを含むゲルである、本発明1029〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1037]
組成物がグリセリン及び乳化蝋を含むクリームである、本発明1029〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1038]
許容される担体が薬学的に許容される注入可能な担体である、本発明1029〜1031のいずれかの組成物。
[本発明1039]
細菌性バイオフィルムがグラム陽性細菌性バイオフィルムである、本発明1029〜1038のいずれかの組成物。
[本発明1040]
グラム陽性細菌性バイオフィルムがスタフィロコッカス属細菌性バイオフィルムである、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
スタフィロコッカス属細菌性バイオフィルムが黄色ブドウ球菌細菌性バイオフィルムである、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
スタフィロコッカス属細菌性バイオフィルムがメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）バイオフィルムである、本発明1041の組成物。
[本発明1043]
組成物が抗微生物剤をさらに含む、本発明1029〜1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
抗微生物剤が、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤、または洗浄剤である、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
抗微生物剤がスタフィロコッカス属細菌に対して効果的である、本発明1044の組成物。
[本発明1046]
スタフィロコッカス属細菌が黄色ブドウ球菌である、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
スタフィロコッカス属細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）である、本発明1046の組成物。

本発明のその他の目的、構成及び利点は以下の詳細な記載により明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び実施例が本発明の特定の実施形態を示すものであるものの、例示としてのみ提供されるものであることが理解されるべきである。さらに、本発明の主旨及び範囲内における変化及び変更がこの詳細な説明により当業者に明らかとなることが企図される。

コラゲナーゼ及び対照と比較した場合の、黄色ブドウ球菌の細菌性バイオフィルムの除去における、セアプローゼの有効性を示すグラフ。 コラゲナーゼ及び対照と比較した場合の、緑膿菌の細菌性バイオフィルムの除去における、セアプローゼの有効性を示すグラフ。 コラゲナーゼ及び対照と比較した場合の、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の細菌性バイオフィルムの除去における、セアプローゼの有効性を示すグラフ。 セアプローゼ及び比較物による処置後の創傷の写真（マウスモデルにおいて前処置した創傷は密なMRSAバイオフィルムを有していた）。 ブロメライン、サーモリシン、及びセアプローゼゲルによる37℃、24時間の期間内におけるブタ焼痂物の分解を比較する、イン・ビトロ試験の結果のプロット。 対照（湿潤創傷療法）と比較した、セアプローゼヒドロゲルによる24時間処置後の、イン・ビボ ブタ創傷のイメージ。 対照（湿潤創傷療法）と比較した、セアプローゼヒドロゲルによる創傷の廓清を比較する、イン・ビボ ブタ試験の結果のグラフ。

例示的実施形態の説明
細菌性バイオフィルムは人々を悩ます幾つかの健康状態において存在する。このような状態の例は、尿道感染、膀胱炎、肺感染症、皮膚感染症、副鼻腔感染症、耳感染症、挫創、齲蝕、歯周病、院内感染症、開放創、及び慢性創傷を含む。

本発明の特異な態様の一つは、セアプローゼが、細菌性バイオフィルムを有する表面からの細菌性バイオフィルムの崩壊または除去に使用できるという発明者らの発見である。このような表面の一例は皮膚創傷である。これら及び他の非限定的な態様が以下の項においてさらに詳細に記載される。

A.組成物
本発明の組成物は、細菌性バイオフィルムの存在と戦うために使用できる。このような組成物は、この結果を達成するために有効な量のセアプローゼを含む。組成物はまた薬学的に許容される担体（例、局所用担体または注入可能な担体）を含み得る。本発明の組成物は、創傷への局所的または注入投与に適した薬学的に活性な成分、美容的に活性な成分、及び傷薬剤（例、成長因子）をさらに含み得る。

１．セアプローゼ
セアプローゼは、真菌アスペルギルス・メレウス(Aspergillus melleus)の培養によって産生されるセミアルカリプロテアーゼであり、SEAPROSE S（登録商標）の商品名で日本の天野エンザイム株式会社から粉末形態で市販されている。セアプローゼは、当業者に公知の技術を用いて液体または固体培養工程のどちらかにより調製され得る。セアプローゼは、オノプローゼ、プロメラーゼ、プロメラズム(promelasum)、ジェオアーゼ(Jeoase)、FLAMINASE（登録商標）（Prodotti Formenti S.r.l.,イタリア,ミラノ）及びアスペルギルス・メレウスセミアルカリプロテアーゼとも呼ばれてきた。

セアプローゼ中の主要なプロテアーゼは、約31kDaの分子量のセミアルカリプロテアーゼである。炭水化物を分解する加水分解酵素であるアミラーゼ等の他の酵素も含有し得る。代わりに、セアプローゼは当業者に公知の標準的な技術によって精製または単離され得る。セアプローゼは5〜9の至適pH範囲、および50℃以下の至適温度において優れた安定性を示す。これらの条件は酵素の創傷への適用において好適であり、かつ薬の製剤及び製造において好ましい。

セアプローゼは以前より多様な医療適用及び処置に用いられてきている。しかしながら、これまで、抗バイオフィルム剤として用いるための局所用または注入可能な形態としては用いられたことが無かった。例えば、セアプローゼはイン・ビトロ粘液溶解活性を有し（Braga、1990年）、気管支炎の患者をセアプローゼカプセルの経口投与により効果的に処置できる（Braga、1993年）（Moretti、1993年）ことが示されている。動物モデルにおいて、セアプローゼは多くの異なる炎症性症状に対して抗炎症活性を示した（Fossati、1991年）。セアプローゼ錠剤の経口投与によって炎症性静脈疾患の患者を処置するためにセアプローゼが有効であることが示された（Bracale、1996年）。セアプローゼは膵炎による腹痛を処置するために用いられてきた（米国特許第7,459,155号）。セアプローゼの30mgの錠剤の経口投与により、分娩手術創の合併症を処置するためにセアプローゼは用いられてきた（Dindelli、1990年）。

本発明によると、セアプローゼは薬学的に許容される担体中で、溶解状態及び／または分散状態であり得る。セアプローゼはまたカプセルに包んでもよい。また、担体なしでそのまま用いてもよい。セアプローゼはまた、精製または単離された形態で用いてもよい。

薬学的に許容される担体を含む組成物中でのセアプローゼの量は、創傷廓清に有効な量であり、概して、約0.001％(w/w)〜約10％(w/w)、または約0.01％〜約9％、または約0.1％〜約8％、または約0.1％〜約0.9％、または約0.2％〜約0.8％、または約0.3％〜約0.7％、または約0.4％〜約0.6％、または約0.5％、または約0.5％〜約7％、または約1％〜約6％、または約1.5％〜約5％、または約0.5％〜約1.5％、または約0.6％〜約1.4％、または約0.7％〜約1.3％、または約0.8％〜約1.2％、または約0.9％〜約1.1％の範囲、あるいは約1％であり得る。このような量は、創傷における壊死組織を効果的に廓清する量である。特定の態様において、0.0001〜1％または0.001〜1％の範囲を用い得る。

２．薬学的に許容される担体
本発明の組成物は、局所送達に適しかつセアプローゼと適合性である種々の薬学的に許容される担体を含んでも良い。非限定的な例には、ローション、クリーム、乳剤、軟膏、ゲル、ペースト、溶液、エアロゾルスプレー、エアロゾル泡沫、非エアロゾルスプレー、非エアロゾル泡沫、粉末、液体溶液、液体懸濁剤、フィルム、及びシートが含まれる。組成物は局所送達のために、ガーゼ、包帯、または他の創傷被覆材料に含浸させてもよい。

本発明の組成物はさらに、局所用組成物中での使用に適しかつセアプローゼと適合する機能性成分を含んでも良い。非限定的な例は、吸収剤、抗微生物剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤（トリス緩衝液を含む）、充填剤、キレート剤、着色剤、殺生物剤、脱臭剤、乳化安定剤、被膜形成剤、芳香成分、湿潤剤、溶解剤、酵素剤、不透明剤、酸化剤、pH調整剤、可塑剤、保存剤、還元剤、柔軟皮膚保全剤、湿潤皮膚保全剤、保湿剤、界面活性剤、乳化剤、洗浄剤、発泡剤、ハイドロトープ、溶剤、懸濁剤、粘度調節剤（レオロジー改質剤）、粘度増加剤（増ちょう剤）、及び噴霧剤を含む。本明細書中に記載される機能性成分のリスト及び研究所は、本明細書中に参照として組み入れられるThe International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook (INCI)第12版、2008年に開示される。

抗微生物剤の非限定的な例は、硝酸ミコナゾール、硝酸エコナゾール、及びその他等の抗真菌剤、並びに、ネオマイシン、バシトラシン、ポリミキシン等々の抗生物質を含む。使用できるさらなる非限定的な抗微生物剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸またはその塩形態、過酸化ベンゾイル、ベンジルアルコール、ビスピリチオン塩、ボリジオイル、ホウ酸、カデキソマーヨウ素、樟脳メタクレゾール、樟脳フェノール、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロフルカルバン、ダプソン、デヒドロ酢酸またはその塩形態、エチルアルコール、ユーカリプトール、ラベンダー油の抽出物、6〜18個の炭素を有する遊離脂肪酸、ラウリン酸グリセリル、ヘキサクロロフェン、ヘキセチジン、ヘキシルレゾルシノール、過酸化水素、オキシ安息香酸またはその塩形態、アルキルアリールオキシポリエチレンのリン酸エステルと複合体化したヨウ素、ヨードチンキ、ヨウ素局所用溶液、ヨードキノール、イソプロピルアルコール、リパサイドＣＧ、酢酸マフェニド、マグネシウムピリチオン、メントール、メルブロミン、メルクフェノールクロリド、サリチル酸メチル、塩化メチルベンゼトニウム、メチルパラベン、メトロニダゾール、メトロニダゾール誘導体、ニトロフラゾン、ノニルフェノキシポリエタノール-ヨウ素、n-プロパノール、有機過酸化物、p-クロロ-m-キシレノール、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルアルコール、ポロクサマ-ヨウ素複合体、ポビドンヨード、PVPヨウ素、ローズヒップ油、サリチル酸、二級アミルトリクレゾール、硫化セレン、銀またはその塩形態、スルファジアジン銀、オキシクロロセンナトリウム、スルファセタミドナトリウム、ソルビン酸またはその塩形態、硫黄、テトラクロロサリチルアニリド、チモール、トリブロンサラン、トリクロカルバン、トリクロサン、塩化ウンデコイリウム-ヨウ素複合体、ピリチオン亜鉛を含む。さらに、抗微生物ペプチド及びタンパク質を使用できる。

薬学的に許容される好適な局所用担体は、本明細書に参照として組み入れられる米国特許第6,548,556号中に開示される無水親水性創傷廓清組成物、本明細書に参照として組み入れられる米国特許第7,785,584号中に開示される吹き掛ける局所創傷廓清組成物、本明細書に参照として組み入れられる国際PCT出願第PCT/US10/59409号中に開示される酵素創傷廓清組成物、本明細書に参照として組み入れられる米国特許第6,479,060号中に開示される硬化ヒマシ油軟膏、本明細書に参照として組み入れられる米国特許第6,399,092号中に開示される無水親水性吸収剤創傷被覆材、及び、本明細書に参照として組み入れられる米国特許第5,902,600号中に開示されるハイドロゲル創傷被覆材を含む。

本発明の組成物はまた、注入可能な送達に適し、セアプローゼと適合する種々の薬学的に許容される担体を含んでもよい。

本発明の組成物は、局所用または注入可能な製品に適する任意のパッケージ構成中に包装してもよい。局所用製品のための非限定的な例は、ボトル、ローションポンプ、容器（toddles）、チューブ、瓶、非エアロゾルポンプスプレー、エアロゾル容器、シリンジ、ポーチ及び小箱を含む。パッケージは、単回使用（一用量）または複数使用投与のために構成され得る。注入可能製品の非限定的な例は、バイアル、シリンジ、マイクロニードルシリンジまたはバッグを含む。

本発明の組成物は殺菌されていてもよい。無菌製造工程によって殺菌されてもよいし、または、当分野において公知の方法によりパッケージ後に殺菌されても良い。

３．製造
本発明の方法は、当業者に公知の局所用及び／または注入可能な製品のための好適な加工方法により製造され得る。例えば、セアプローゼを薬学的に許容される担体と混ぜることができる。さらに、組成物は表面に吹き付けることができる。代わりに、そのままの形（例えば、担体無し）で、セアプローゼを細菌性バイオフィルムに適用することができる。

B.使用方法
本発明の組成物は、表面の細菌性バイオフィルムを処置する、崩壊させる、若しくは表面から除去する、または、細菌性バイオフィルムを生じやすい表面上（例えば、創傷、外科的切開若しくは創傷、移植した装置等々）の細菌性バイオフィルムの形成を予防若しくは制限する方法において使用し得る。このような方法は、細菌性バイオフィルムまたは標的表面にセアプローゼを含む組成物を適用する段階（例えば、局所、注入可能、スプレー可能等々）を含む。適用後、細菌性バイオフィルムをガーゼパッド等の被覆材で覆うことができる。代わりに、または加えて、細菌性バイオフィルム内に残る細菌を攻撃するために、表面を伝統的な抗微生物剤で処置してもよい。組成物はさらに、または代わりにまずガーゼパッド等の被覆材に適用し、その後、細菌性バイオフィルムに適用することもできる。適用量は、細菌性バイオフィルムの型及び程度に依存し得る。さらに、組成物の適用は、期間適用（例、時間単位、日単位、週単位等々）のあるレジメンの形でもよい。上記で説明したように、細菌性バイオフィルムを有する広範囲にわたる表面を本発明の組成物で処置することができる。例えば、ヒトの皮膚上に存在する創傷表面を処置することができる。このような創傷表面は、例として、細菌性バイオフィルムを含むか、若しくは細菌性バイオフィルムを形成しやすい熱傷、急性創傷、または慢性創傷であり得る。細菌性バイオフィルムを有し得る（例、生存組織、体表面、無生物）または細菌性バイオフィルムを生じやすい（例、創傷、外科的切開若しくは創傷、医療用インプラント機器等々）その他の型の表面を、本発明の組成物で処置することができる。

以下の実施例は本発明の一定の非限定的な態様を示すために記載される。以下の実施例中に開示される技術が、本発明の実施においてよく機能することが出願人により発見された技術を説明するものであることが当業者には認識されるであろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を加え得、それでもなお類似または同様の結果を本発明の主旨及び範囲から離れることなく達成できることを認識するであろう。

実施例１
(製剤例)
以下の表は、本発明のセアプローゼを含有する製剤の非限定的な例を提供する。

（表１）ゲル^*

^＊手順：HEC及びトリス緩衝液からゲルを作った。Seaprose SをHECゲルと混ぜた。おそらくセアプローゼ材料中に存在するHECを分解するアミラーゼのため、ゲルの粘度は時間と共に徐々に減少した。

（表２）ゲル^*

^＊手順：CURASOLゲル創傷被覆材とSeaprose Sを混ぜ、透明なゲルを形成した。粘度は時間が経っても維持された。

（表３）クリーム^*

^＊手順：70℃において、メチルパラベン、プロピルパラベン、及びグリセリンを、トリス緩衝液中に溶解した。上記溶液に70℃において乳化蝋及びイソプロピルパルミテートを添加し、乳剤と形成するよう混合した。乳剤を35℃に冷却し、その時点でSeaprose Sを乳剤と混ぜた。白いクリームが得られた。

（表４）軟膏^*

^＊手順：70℃においてPEG-600の半量及びポロキサマ407の半量の混合物を融解し、混合物を35℃に冷却し、その時点でSeaprose Sを混合物と混ぜて活性相を作った。白色ワセリン及びPEG-600の残り半量及びポロキサマ407の残り半量の混合物を70℃で溶解し、ポロキサマ407の均質化及び融解後に、混合物を35℃に冷却して主要相を作った。活性相をその後主要相と混ぜた。得られた混合物を室温で45分間混合した。

（表５）Capmul 油状基材製剤^*

^＊手順：ポロキサマ407を4℃でTBS緩衝液（10mM TBS）に溶解し、溶解後、油であるAbitecのCapmul(r) MCM, NFを添加し、混合物を室温で高せん断力をかけて均質になるまで混合した。計算された濃度で Seaprose SをTBS中に溶解し、溶解後、溶液をクリームに添加し、室温にて30分間混合した。オフホワイトのクリームが得られた。

実施例２
(イン・ビトロバイオフィルム除去データ)
セアプローゼの、細菌性バイオフィルムを崩壊させ且つ除去する能力を示すため、イン・ビトロ分析を行った。本分析において、黄色ブドウ球菌ATCC6538を、至適の細菌性バイオフィルム形成のため、0.25％グルコースを補ったトリプティックソイブロス中に懸濁した。懸濁液を滅菌96ウェルプレートのウェルに移し、37℃で22時間、一回の培地の交換を行ってインキュベートした。細菌性バイオフィルム形成後、培地を、生育培地中で調製した酵素処理物で置換した。処理（処置組成物はSeaprose S＋上述の生育培地を含んでいた）から16時間後に培地を吸引し、プレートを徹底的に洗った後、クリスタルバイオレット染色して、570nmにおける吸光度を記録することによって残存する付着細菌を定量した。クリスタルバイオレットは残存する付着細菌を染色し、対照と比べて減少した吸光度は付着細菌の除去を示す。図１はこれらのデータのまとめを示す。図１に図示されるように、1％w/w〜0.0000001％w/wの範囲のレベルにおいて、コラゲナーゼよりもセアプローゼは細菌性バイオフィルムを崩壊且つ除去するために遥かに効果的であり、1％w/w〜0.0001％w/wのレベルでは驚くべきレベルの効率で、そして1％w/w〜0.001％w/wではより一層驚くべきレベルの効率であった。この発見の驚くべき特質は、プロテアーゼが、細菌性バイオフィルムを崩壊させるかまたは除去するためにそれ自身だけでは過度に効果的であるとは考えられていないという一般知識に基づく。

緑膿菌に対するセアプローゼの細菌性バイオフィルム崩壊及び除去能力を示すために、イン・ビトロ分析もまた行った。本分析において、緑膿菌ATCC15442を、10％トリプティックソイブロス及び0.45％グルコースを加えたリン酸緩衝食塩水中に懸濁した。懸濁液を滅菌96ウェルプレートのウェルに移し（200マイクロリッター）、37℃で26時間、一回の培地の交換を行ってインキュベートした。バイオフィルム形成後、培地を、生育培地中で予め調製した酵素処理物で置換した。37℃における処理（処置組成物はSeaprose S＋上述の生育培地を含んでいた）から18時間後に培地を吸引し、プレートを徹底的に洗った後、クリスタルバイオレット染色して、570nmにおける吸光度を記録することによって残存する付着細菌を定量した。クリスタルバイオレットは残存する付着細菌を染色し、対照と比べて減少した吸光度は付着細菌の除去を示す。図2はこれらのデータのまとめを示す。

実施例３
(イン・ビボバイオフィルム除去データ)
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）含有バイオフィルムに対するセアプローゼの、細菌性バイオフィルムを崩壊させる及び除去する能力を示すためにイン・ビボ分析が行われた。分析は、E.D. Roche、P.D. Renick、S.P. Tetens及びD.L. Carson、2012年、"A Model of Evaluating Topical Antimicrobial Efficacy against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Biofilms in Superficial Murine Wounds"、Antimicrobial Agents and Chemotherapy、56巻、第4508〜10頁に記載の方法と同様であった。

具体的には、28匹の雌SKH1マウスに創傷を負わせる4日前にシトキサン注射を行った。MRSA33592の終夜培養物を調製し、その純度を確認するためにストリークした。創傷付与前に接種材料を調製し、2.0×10⁹ cfu/mL（コロニー形成単位／ミリリットル）に調節した。負荷(チャレンジ)コロニー形成単位を確認するため接種材料をスポットで播種し、創傷形成の間及び接種手順の間氷上に置いた。全ての創傷付与、処置適用、及び被覆材交換は、イソフルラン吸入剤を投与することにより動物を麻酔下において行った。手術野は、ポビドンヨードに続いてアルコール綿で滅菌した。創傷を負わせる前に皮膚を滅菌ガーゼで拭いて乾燥させた。予め切断した鋳型を用いて、低スピードで回転ツールを用いて、一度に5秒間、何度も皮膚に接触させることによって創傷を作成した。接種前に、回転ツールによって作られた全ての破片を創傷から除くため、塩水で湿らせたガーゼで創傷を拭き取った。各創傷に10μLの接種材料を接種し、予め湿らせたスポットバンドエイドで被覆した。接種した創傷を被覆した後に、一片のElastikon（登録商標）で遠位端を留めたサイズ1のSurgilast（登録商標）被覆材の層を第二被覆材として適用した。動物室に戻す前に、意識を取り戻して動き出すまで各マウスを温めた回復槽に置いた。

マウスは各群4匹からなる7つの群に編成した。各ケースにおける異なる処置とは対照的に、各処置が2つの処置群になされた。接種から24時間後の0時点において最初の処置が適用された。24時間目に2回目の処置が適用された。創傷付加時、各処置適用時、及び研究の最後の時点において創傷を撮影した。最初の処置が行われてから48時間後に、各群について3匹のマウスから微生物学検体としてサンプリングした。微生物学検体は、4mmパンチ生検器により得て、予めラベルし予め計量した、PBS（リン酸緩衝塩水）溶液を含有する試験管に入れた。続く手順が行われるまで試料は氷上に載置した。全ての試料が得られてから、再計量のため試料を室温まで温めた。再計量後、試料が完全に崩壊するまで10秒間隔で30,000rpmでホモジェナイズした。完全にホモジェナイズされたら、全ての試料が処置されるまで、試料を再び氷上に戻した。試料は、全ての試料について2個ずつ、TSA及び炭末寒天培地上へスポットで蒔くための希釈プレートを作成するために使用した。スポットプレートは、コロニーを数える前に37℃の培養器中で一晩生育させた。コロニー数はlog cfu/gに換算し、グラフ化した。データは図3及び4に示され、セアプローゼが、セアプローゼが含まれていた油状基材以上にマウスMRSA創傷細菌性バイオフィルムモデルにおいてMRSAの負荷を減少させる効果を有することが認められる。油状基材＋セアプローゼ（図3及び4中「セアプローゼ(基材中)」と言及）はまた、銀のゲル（Medline Industries, Inc. (米国イリノイ州マンデライン)から得られたSilvaSorb(登録商標)ゲル）よりも大きな効果を示す傾向があった。

上述され、図3及び4に述べられる油状基材及び油状基材-セアプローゼ処方を、各々、表6及び7に示す。

（表６）油状基材^*

^＊手順：ポロキサマ407を4℃でTBS緩衝液（10mM TBS）中に溶解し、溶解後、油であるAbitecからのCapmul MCM, NFを添加し、混合物を室温で高せん断力をかけて均質になるまで混合した。オフホワイトのクリームが得られた。

（表７）油状基材＋Seaprose S^*

^＊手順：ポロキサマ407を4℃でTBS緩衝液（10mM TBS）中に溶解し、溶解後、油であるAbitecのCapmul MCM, NFを添加し、混合物を室温で高せん断力をかけて均質になるまで混合した。計算された濃度でSeaprose SをTBS中に溶解し、溶解後、溶液をクリームに添加し、室温にて30分間混合した。オフホワイトのクリームが得られた。

実施例４
(ブタ熱傷焼痂物のイン・ビトロ消化)
表1（１％セアプローゼゲル）中のゲル処方、並びに、続く2つのゲル処方（1％サーモリシンゲル（表8）及び10％ブロメラインゲル（表9））を、各ゲル処方によるブタ焼痂物の分解を比較するためのイン・ビトロ試験で使用した。

（表８）１％サーモリシンゲル

（表９）１０％ブロメラインゲル

試験はイン・ビトロにおいてブタ熱傷創傷から得られた焼痂材料を用いて行った。焼痂材料は完全に乾燥させた。乾燥重量をベースラインとして用いた。40〜60mgの重さの乾燥焼痂試料を50μlのトリス緩衝塩水で加湿した。加湿した焼痂試料を3つのゲル処方の各3gに浸した。焼痂物を含むゲルを37℃で24時間貯蔵した。24時間後、試料を5000rpmで5分間遠心した。上清を除き、沈殿を洗浄するために水を添加した。試料を再度遠心した。別の洗浄工程を行った後、沈殿を凍結乾燥した。沈殿の乾燥重量を、ベースラインの乾燥重量に基づく分解割合を計算するために使用した。結果は図5に示される。

図5の結果は、１％サーモリシンゲル（表8）及び10％ブロメラインゲル（表9）と比べて、24時間の期間内での焼痂材料の消化において、セアプローゼゲルがより効果的且つより優れた効能を示したことを証明する。サーモリシン及びブロメラインは両方とも当分野において急速廓清酵素（例、各米国特許公開公報第2003/0198631号及び米国特許第8,119,124号参照）として知られているため、１％サーモリシンゲル及び10％ブロメラインゲルと比べて、焼痂物を消化するセアプローゼゲルの素早さは予期されないものであった。イン・ビトロ試験の結果は、焼痂タンパク質をセアプローゼが効率的且つ効果的に標的化して消化することができ、そのため、廓清を必要とする創傷の処置において用いることができる優れた酵素的創傷廓清剤として好適であることを示唆する。

実施例５
(ブタ熱傷のイン・ビボ廓清)
本イン・ビボ ブタ試験では、加熱した真鍮の棒を用いて熱傷創傷を導入し、数日に亘って乾燥した焼痂を形成させることによりブタの背中に焼痂を形成した。1日の処置後、対照と比較して多くの創傷においてセアプローゼ（SAP）による目に見える効果があった（図6）。全体として、対照と比べた場合、SAPは焼痂のより早い完全な廓清を示した（塩水で予め加湿された非粘着性創傷被覆材）（図7）。

本イン・ビボ試験の詳細は次の通りである。ブタを麻酔し、胴をハサミ及び剃刀で剃り、ベタジンで洗浄した。その後、術野を殺菌するためにイソプロピルにより洗浄した。各ブタの背に20個の2cmの創傷を作った。砂浴中で100℃に加熱した固体真鍮棒を用いて、45秒間皮膚に密着させることにより、創傷を作った。創傷は乾燥するよう5日間放置されて焼痂が形成される時間を与えられ、焼痂形成の間、一日おきに保護的泡状被覆材が交換された。焼痂形成後、及び、処置のために、毎日創傷を洗浄し、撮影し、処置無作為化スキームに則って処置し、非粘着性の被覆材（塩水で予め加湿）によって被覆し、トランスポアテープ及び閉塞性の第二の被覆材で固定した。完全に廓清された焼痂の数についての統計学的有意性はフィッシャー直接検定により決定した。

本試験のための治療レジメンは、以下の方法により調製されたセアプローゼ含有製剤、及び、非粘着性の塩水で予め加湿された創傷被覆材からなる対照の使用を含んでいた：（1）Seaprose S粉末を調製し（以下の表10参照）、当該粉末100mgが直接創傷に適用された；及び、（2）ゲルを調製し（以下の表11参照）、当該ゲル400mgがSeaprose S粉末の上に適用された。15日間の期間中、処置は一日一回行った。処置後最初の24時間で、焼痂のくぼみ及び幾つかのケースでは健康な創傷組織の限定的な曝露を含む、視覚的な相違が多くのセアプローゼ処置創傷について明らかとなった（図6）。15日間の処置期間に亘って、セアプローゼ処置は対照と比べてより多くの創傷の完全な廓清を一貫して示す傾向にあった（処置13日目において、対照に対して、セアプローゼ処置は統計学的有意（p<0.05）を達成した）（図７）。

（表１０）Seaprose S粉末^*

^＊手順：Seaprose S及びソルビトールを室温（およそ20〜25℃）で混合し、均質な粉末を得た。

（表１１）ゲル^*

^＊手順：高温（>70℃）で保存剤をトリス緩衝液中でグリセリンと共に混合した。冷却後、ヒスパゲル200を添加した。透明で透き通ったゲルが得られた。

参考文献
刊行物

Claims (47)

1. 表面上に存在する細菌性バイオフィルムを崩壊させる方法であって、セアプローゼを含む組成物を細菌性バイオフィルムに適用する段階を含み、組成物の細菌性バイオフィルムへの適用が細菌性バイオフィルムのマトリックスを崩壊させる、方法。
2. 表面が皮膚である、請求項1記載の方法。
3. 表面が創傷である、請求項1記載の方法。
4. 創傷が慢性創傷である、請求項3記載の方法。
5. 慢性創傷が糖尿病性足部潰瘍、静脈性下肢潰瘍、動脈性下肢潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、皮膚潰瘍、熱傷または褥瘡である、請求項4記載の方法。
6. 創傷が壊死組織を含む、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
7. 壊死組織が焼痂である、請求項6記載の方法。
8. 組成物が壊死組織をさらに廓清する、請求項6〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 表面が上皮表面である、請求項1記載の方法。
10. 上皮表面が口腔、角膜表面、生殖器、泌尿器、呼吸器、消化器、腹膜、中耳、または前立腺の一部である、請求項9記載の方法。
11. 表面が無生物物体の一部である、請求項1記載の方法。
12. 表面が医療用インプラント機器の一部である、請求項11記載の方法。
13. 医療用インプラント機器が、カテーテル、ステント、骨プレート、ネジ、ピン若しくはロッド、椎間板、耳チューブ、またはコンタクトレンズである、請求項12記載の方法。
14. 組成物が0.0001〜1重量％または0.001〜1重量％のセアプローゼを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. セアプローゼが、単離または精製されたセアプローゼである、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
16. 組成物が、ゲル、クリーム、軟膏、溶液、またはペーストとして製剤されている、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
17. 組成物が、グリセリンポリアクリレートクラスレート、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、乳化蝋若しくはワセリン、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項16記載の方法。
18. 組成物が局所的に表面へ適用される、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
19. 細菌性バイオフィルムがグラム陽性細菌性バイオフィルムである、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
20. 細菌性バイオフィルムがスタフィロコッカス属(Staphylococcal)細菌を含む、請求項19記載の方法。
21. 細菌が黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)である、請求項20記載の方法。
22. 細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）である、請求項21記載の方法。
23. 細菌性バイオフィルムの一部が表面から除去される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
24. 組成物が抗微生物剤をさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
25. 抗微生物剤が、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤、または洗浄剤である、請求項24記載の方法。
26. 細菌性バイオフィルムに、第二の組成物が続いて適用される、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
27. 第二の組成物が抗微生物剤を含む、請求項26記載の方法。
28. 抗微生物剤が、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤、または洗浄剤である、請求項27記載の方法。
29. 細菌性バイオフィルムを崩壊させるための組成物であって、有効量のセアプローゼ及び許容される担体を含む、組成物。
30. 組成物が0.0001〜1重量％または0.001〜1重量％のセアプローゼを含む、請求項29記載の組成物。
31. セアプローゼが、単離または精製されたセアプローゼである、請求項29〜30のいずれか一項記載の組成物。
32. 許容される担体が薬学的に許容される局所用担体である、請求項29〜31のいずれか一項記載の組成物。
33. 組成物が、ゲル、クリーム、溶液、ペースト、または軟膏として製剤されている、請求項29〜32のいずれか一項記載の組成物。
34. 組成物がワセリンを含む軟膏である、請求項29〜33のいずれか一項記載の組成物。
35. 組成物がグリセリンポリアクリレートクラスレートを含むゲルである、請求項29〜32のいずれか一項記載の組成物。
36. 組成物がヒドロキシエチルセルロースを含むゲルである、請求項29〜32のいずれか一項記載の組成物。
37. 組成物がグリセリン及び乳化蝋を含むクリームである、請求項29〜32のいずれか一項記載の組成物。
38. 許容される担体が薬学的に許容される注入可能な担体である、請求項29〜31のいずれか一項記載の組成物。
39. 細菌性バイオフィルムがグラム陽性細菌性バイオフィルムである、請求項29〜38のいずれか一項記載の組成物。
40. グラム陽性細菌性バイオフィルムがスタフィロコッカス属細菌性バイオフィルムである、請求項39記載の組成物。
41. スタフィロコッカス属細菌性バイオフィルムが黄色ブドウ球菌細菌性バイオフィルムである、請求項40記載の組成物。
42. スタフィロコッカス属細菌性バイオフィルムがメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）バイオフィルムである、請求項41記載の組成物。
43. 組成物が抗微生物剤をさらに含む、請求項29〜42のいずれか一項記載の組成物。
44. 抗微生物剤が、抗生物質、抗真菌剤、防腐剤、または洗浄剤である、請求項43記載の組成物。
45. 抗微生物剤がスタフィロコッカス属細菌に対して効果的である、請求項44記載の組成物。
46. スタフィロコッカス属細菌が黄色ブドウ球菌である、請求項45記載の組成物。
47. スタフィロコッカス属細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）である、請求項46記載の組成物。

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