KR20180031704A

KR20180031704A - 병용 요법

Info

Publication number: KR20180031704A
Application number: KR1020187004149A
Authority: KR
Inventors: 아구스타 굿문스도티어; 레이니어 쉐빙
Original assignee: 엔지메티카 에이비
Priority date: 2015-07-24
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2018-03-28
Also published as: EP3325002A1; RU2725800C2; WO2017017027A1; CA2992677A1; DK201870043A1; RU2018106490A3; CN107921102A; JP2018521143A; US20200085921A1; AU2016301021A1; AU2016301021B2; DK180380B1; US11338021B2; MX2018000984A; BR112018001391A2; CN107921102B; EP3120866A1; RU2018106490A

Abstract

본 발명은 (a)　세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 (b) 하나 이상의 항생제 화합물을 포함하는 대상에서 박테리아 생물막을 치료하는데 사용하기 위한 병용 요법을 제공한다. 또한, 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다.

Description

병용 요법

본 발명은 박테리아 생물막, 예컨대 재발성 상부 및 하부 기도 감염에 존재하는 박테리아 생물막의 치료 및 예방을 위한 병용 요법에 관한 것이다.

생물막은 세포외 기질(ECM)에 포매된 미생물 세포 집단을 포함하는 이질적이며 복잡한 3D 기질이다. 이것은 단지 세포의 수동적인 집합이 아니라, 지역 생태계를 형성하는 구조적으로 그리고 동적으로 복잡한 생물학적 시스템이다. 생물막 집단 내의 미생물 세포는 협력하고 특별한 기능을 떠맡는 것으로 보인다. 협력하고 보호적인 ECM을 형성함으로써, 생물막은 미생물에게 보호된 성장 방식을 제공하여 이들이 다양한 환경에서 콜로니화할 수 있게 한다. 생물막 성장 방식은 박테리아가 숙주의 면역계뿐만 아니라 항생제 및 유사한 정균제 및 살균제에 대응할 수 있게 한다. 따라서 생물막의 발달은 집단 박테리아가 항생제에 내성을 나타낼 수 있게 한다. 생물막에서 성장하는 박테리아는 이들의 부유성, 즉,　자유 생활형 박테리아보다 퇴치하기 어렵다(del Pozo & Patel, 2007, Clin . Pharmacol . Ther. 82:204-9 and Stewart & Costerton, 2001, Lancet 358:135-8 참고).

생물막은 사실상 임의의 생물학적 또는 비생물학적 표면에 부착하는 단일 또는 다중 박테리아 집단으로 구성될 수 있다. 이러한 다세포 집단에서, 세포는 서로 부착한다. 대다수의 박테리아 종뿐만 아니라 고세균, 원생동물, 진균 및 조류는 표면과 서로에게 부착하여 생물막 구조를 형성하는 능력이 있다. 생물막의 형성은 전형적으로 자유 부동 미생물이 표면에 부착하면서 시작된다. 많은 유전자의 발현이 변화하면, 부유 세포가 표현형 변화를 겪고 자유 생활 방식에서 생물막 성장 방식으로 바뀐다. 최초의 콜로니 미생물은 초기에는 약하고 가역적인 부착을 통해 표면에 부착하는데, 이는 선모(pili)와 같은 세포 부착 구조의 생성에 의해 더 강해질 수 있다. 콜로니화가 시작되면, 생물막은 세포 분열과 새로운 박테리아의 출현 및 결합의 조합을 통해 성장한다. 최초의 콜로니 미생물은 더욱 다양한 부착 부위를 제공하고 생물막을 결합시키는 기질을 만들기 시작함으로써 다른 세포의 출현을 용이하게 한다.

생물막은 다양한 환경에서, 예컨대 자연, 가정 산업 및 병원 환경에서 형성될 수 있고, 이곳에서 이들은 상황에 따라 긍정적이거나 부정적일 수 있는 다양한 효과를 발휘한다.

의료 환경에서, 생물막은 표면에 박테리아의 지속적인 병원소(reservoir)를 형성한다. 생물막은 환자 상에 직접적으로 그리고 환자의 인근 환경의 표면 상에 간접적으로 발생할 수 있다. 환자 상에 직접 존재하는 생물막은 일반적으로 재발성 감염과 관련된 반면, 인근 환경에서 환자로의 박테리아의 이동은 일차 및 재발성 감염 모두와 관련된다. 병원 환경에서 생물막의 예는 카테터 및 다른 형태의 배관 상의 생물막, 및 심장 판막 및 관절 보철과 같은 이식물 상의 생물막이다.

산업적 환경에서 생물막은 필수적이며 해로울 수 있다. 예를 들어, 효율적인 미생물 생물반응기의 최근 개발에서, 생물막 콜로니화 전극이 전기를 생성하는데 사용된다. 생물막은 또한 화합물, 예컨대 셀룰로오스의 가능한 생물학적 공장으로서 탐구되어 왔다.

국제 특허 출원 WO　제00/78332호는 다양한 질환 및 장애를 치료하고/하거나 예방하기 위해 대서양 대구와 같은 대구로부터 유래된 트립신 및 키모트립신을 포함하는 어류 세린 프로테아제의 용도를 제공한다. 이들은 예를 들어 염증성 질환, 바이러스, 박테리아 및 진균 종에 의해 유발되는 감염성 질환 및 발병에 수용체 결합 기전이 관여하는 질환이다.

Augustin 등 (2004) 및 Gudmundsdottir 등 (2013)은 효소를 사용하여 생물막을 제거하는 가능성을 논의한다. 그러나, 효소 단독의 사용은 박테리아를 파괴하는데 충분치 않으며, 이들은 시간과 적절한 환경이 주어지면 표면이나 임의의 가까운 표면에 재부착하여 생물막을 재구성한다(Augustin et al., 2004; Gudmundsdottir et al., 2013).

대구 유래의 트립신은 괴사조직제거(debridement)에 의해 죽은 피부의 제거를 촉진시키고 이에 의해 정상적인 피부 복구 과정을 돕는 것으로 나타났다. 추운 환경으로부터 대구 트립신 및 다른 세린 프로테아제와 같은 친수성 해양 효소를 사용하는 주된 문제점은 이러한 효소가 열에 의한 불활성화에 민감하고 따라서 상온에서 상대적으로 불안정하다는 것이다(Stefansson et al., 2010). 화장품, 의료 장치 및 약제에서 대구 트립신을 사용하는 것은 효소의 안정성을 증가시키는데 달려 있다.

생물막은 모든 감염의 80%에 해당하는 것으로 추정되는 광범위한 미생물 감염에 관여하는 것으로 나타났다("Research on microbial biofilms (PA-03-047)", NIH, National Heart, Lung, and Blood Institute, 2002-12-20 참고). 생물막이 관련된 감염 과정은 요로 감염, 카테터 감염, 중이 감염, 코팅 콘택트 렌즈와 같은 일반적인 문제, 및 심내막염, 낭포성 섬유증에서의 감염, 및 관절 보철 및 심장 판막과 같은 영구 내재 장치의 감염과 같이 흔하지는 않지만 치명적인 과정을 포함한다.

흥미롭게도, 표면에 부착하여 생물막으로서 성장하는 박테리아와 같은 미생물은 종래의 항생제 치료에 영향을 덜 받는다. 항생제 민감성 감소는 생물막 감염, 예컨대 이식된 장치와 관련된 생물막 감염의 지속성에 기여한다. 생물막에서 작동하는 보호 기전은 일반적인 항생제 내성을 담당하는 기전과 구별되는 것으로 보인다. 생물막에서, 항생제 침투 저하, 영양소 제한, 느린 성장, 적응 스트레스 반응, 및 지속생존(persister) 세포의 형성이 다층 방어를 구성하는 것으로 가정된다.

더욱이, 생물막 배양물은 전형적으로 유전형 내성을 발달시키지 않으면서 화학요법으로 박멸하기가 매우 어렵다. 그 결과, 치료 옵션의 수는 제한적이며, 항생물막 활성을 갖는 신규한 항미생물제의 개발이 점점 중요해지고 있다.

따라서, 박테리아 생물막의 성장을 사멸시키거나, 억제하거나 또는 예방하는 새로운 방법이 필요하다(의료 및 비의료 환경 모두에서).

본 발명의 제1 측면은 (a)　세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 (b) 하나 이상의 항생제 화합물을 포함하는, 대상에서 박테리아 생물막을 치료하는데 사용하기 위한 병용 요법을 제공한다.

"병용 요법"은 2개 이상의 치료제를 동시 또는 병행 치료하는 임의의 형태를 포함한다. 따라서, 이러한 요법은 폴리펩타이드 및 항생제 화합물의 별개의 투여 뿐만 아니라 함께 혼합된 2개의 치료제 모두를 포함하는 단일 조성물의 제공을 포함한다.

"치료"는 병용 치료제의 치료 및 예방적 용도 모두를 포함한다. 치료적 용도와 관련하여, 당업자는 병용 요법이 기존 박테리아 생물막을 완전히 퇴치할 수 있거나 또는 그것이 부분적 이점(예컨대, 생물막을 구성하는 박테리아 집단의 크기의 감소 및/또는 생물막을 구성하는 박테리아 집단의 성장의 저하)을 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 마찬가지로, 예방적 용도와 관련하여, 병용 요법은 생물막 형성을 완전히 예방할 수 있거나 또는 박테리아 생물막의 감염 가능성 및/또는 중증도를 감소시키는 것과 같은 부분적인 이점만을 제공할 수 있다.

일 구현예에서, 대상은 인간이다. 그러나, 본 발명의 병용 요법은 또한 수의학 환경에서, 예를 들어 가축 및/또는 농장 동물(개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 등 포함)에서의 박테리아 생물막의 치료에 유용할 수 있다.

개별적으로, 항생제 및 세린 프로테아제(예컨대 트립신)는 생물막 감염을 해결할 수 없다. 항생제가 다양한 정도의 성공으로 전신 및 국소 박테리아 감염을 치료하는데 사용될 수 있긴 하지만, 이러한 화합물은 생물막의 세포외 기질을 쉽게 침투할 수 없으므로 생물막 내의 박테리아를 사멸시키는데 제한된 효능을 갖는다. 따라서, 항생제는 생물막에서 비롯되는 감염을 완전히 해결할 수 없다.

세린 프로테아제(예컨대 트립신)는 박테리아의 세포외 기질을 용해시킬 수 있고, 또한 생물학적 또는 무기 물질에 부착하는 박테리아를 방출할 수 있을 뿐만 아니라 이들의 즉각적인 재부착을 방지할 수 있다. 그러나 박테리아는 트립신 치료에 의해 사멸하지 않으며, 시간이 주어지면 표면에 부착하는 능력을 회복할 수 있을 것이다.

따라서, 개별 투여시, 세린 프로테아제 또는 항생제는 생물막 감염을 완전히 해결할 수 없다.

본 발명은 세린 프로테아제(예컨대 트립신) 및 종래의 항생제 화합물이 병용 투여될 때 박테리아 생물막에 대한 상승 효과의 예기치 못한 발견으로부터 비롯된다. 놀랍게도, 이 선택된 활성제의 병용은 상승 방식으로 생물막 내의 세포외 기질 및 박테리아 모두를 파괴할 수 있다. 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 생물막의 세포외 기질을 파괴함으로써, 세린 프로테아제는 항생제를 생물막 내로 더 깊숙히 침투시켜 그 속에 존재하는 박테리아 세포에 접근시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이것은 항생제가 박테리아에게 기능을 발휘할 수 있게 해주며, 그렇지 않으면 이 기능은 세포외 기질의 장벽 효과에 의해 방해받는다.

당업자는 본원에 기재된 병용 요법이 이러한 생물막이 발견될 수 있는 임의의 환경에서 미생물 생물막의 성장을 사멸시키거나, 억제하거나 또는 예방하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 생물막은 불활성 지지체 또는 살아있는 지지체와 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 생물막은 살아있는 지지체와 결합한다. 예를 들어, 생물막은 인간 또는 동물 체내의 표면 상에서 성장하거나 성장하기 쉽다.

따라서, 본 발명은 생물막의 존재 또는 성장과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 병용 요법을 제공한다.

예를 들어, 본원에 기재된 병용 요법은 체내에 위치한 하기 중 하나에서 미생물 생물막의 성장과 관련된 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다:

(a) 기도(예를 들어, 상부 및/또는 하부 기도에서 재발성 박테리아 감염);

(b) 요로(예를 들어, 방광염);

(c) 부비강(예를 들어, 만성 부비강염);

(d) 귀(예를 들어, 중이 감염);

(e) 심장(예를 들어, 심내막염);

(f) 전립선(예를 들어, 만성 박테리아 전립선염);

(g) 뼈(예를 들어, 골수염);

(h) 폐(예를 들어, 낭포성 섬유증, 예컨대 폐렴에서의 감염) ;

(i) 신장(예를 들어, 감염성 신장 결석 및 복막 투석에서); 및/또는

(j) 피부.

추가 구현예에서, 생물막은 불활성 지지체와 결합한다. 따라서, 생물막은 인간 또는 동물 체내에 이식되거나 삽입된 장치의 표면 상에서 성장하거나 성장하기 쉬울 수 있다.

예를 들어, 본원에 기재된 병용 요법은 체내의 하기 불활성 표면 중 하나에서 미생물 생물막의 성장과 관련된 감염을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다:

(a) 카테터(예를 들어, 혈관내 또는 요로 용도용);

(b) 스텐트(예를 들어, 관상동맥 스텐트);

(c) 션트(shunt)(예를 들어, 뇌척수 션트);

(d) 삽관 또는 기관절개 튜브;

(e) 안과용 장치(예를 들어, 콘택트 렌즈, 공막 버클(scleral buckle) 및 안구내 렌즈);

(f) 관절 보철(즉, 관절성형술 및 기타 정형외과 장치의 이식).

(g) 인공 심장 판막; 및/또는

(h) 유방 이식물.

따라서, 본원에 기재된 바와 같은 병용 요법이 특히 병원내 감염의 치료 및 예방에 적합하다는 것을 이해할 것이다.

일 구현예에서, 생물막은 그람 음성 및/또는 그람 양성 박테리아를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

따라서, 박테리아는 그람 양성 박테리아, 예컨대 스타필로코커스 또는 스트렙토코커스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 스타필로코커스, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(예컨대　메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스, MRSA)일 수 있다. 대안적으로, 박테리아는 스트렙토코커스, 예컨대 스트렙토코커스 뮤탄스 및/또는 스트렙토코커스 산구이스일 수 있다.

박테리아는 또한 그람 음성 박테리아, 예컨대 레지오넬라일 수 있다.

하나의 바람직한 구현예에서, 생물막은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 미티스, 슈도모나스 애루지노사, 해모필러스 인플루엔자, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스, 메티실린 감수성 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오제네스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 산구이니스, 레지오넬라 뉴모필라, 클로스트리듐 디피실, 및 이의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 박테리아를 포함한다.

따라서, 상기 생물막은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 미티스, 슈도모나스 애루지노사 및 해모필러스 인플루엔자, 또는 이의 혼합물로부터 독립적으로 선택되는 박테리아를 포함할 수 있다.

예를 들어, 생물막은 스트렙토코커스, 예컨대 스트렙토코커스 미티스 및/또는 스트렙토코커스 뉴모니애를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

본 발명의 병용 요법은 약제학적 유효량으로 대상에게 투여될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, '치료적 유효량', 또는 '유효량', 또는 '치료적 유효'는 주어진 병태 및 투여 요법에 대해 치료 효과(예를 들어, 박테리아 생물막의 박멸, 크기 감소 또는 성장 저해)를 제공하는 양을 지칭한다. 이것은 필요한 첨가제 및 희석제, 즉, 담체 또는 투여 비히클과 결합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양이다. 또한, 그것은 숙주의 활성, 기능 및 반응에서 임상적으로 유의한 결손을 감소시키고 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 대안적으로, 치료적 유효량은 숙주에서 임상학적으로 유의한 상태에서의 개선을 야기하는데 충분하다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 화합물의 양은 그의 특이적 활성에 따라 달라질 수 있다. 적합한 투여량은 필요한 희석제와 결합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 조성물을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조를 위한 방법 및 용도에서, 활성 성분의 치료적 유효량이 제공된다. 치료적 유효량은 당업계에 공지된 바와 같이 환자 특징, 예컨대 연령, 체중, 성별, 병태, 합병증, 기타 질환 등에 기초하여 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사에 의해 결정될 수 있다. 약제학적 유효량의 투여는 개별 용량 단위 또는 그 밖의 몇 가지 더 작은 용량 단위의 형태로의 단일 투여에 의해 그리고 또한 특정 간격으로 세분화된 용량의 다중 투여에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 용량은 연장된 기간 동안 연속 주입으로서 제공될 수 있다.

본 발명의 병용 요법의 첫 번째 중요 성분은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드이다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 단백질 내의 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 자연발생 및 비자연발생 촉매성 폴리펩타이드 모두를 포함하며, 여기서 세린은 폴리펩타이드(EC 번호 3.4.21에 따라 정의된 바와 같음)의 활성 부위에서 친핵성 아미노산으로 작용한다. 세린 프로테아제 활성은 키모트립신 유사(즉, 트립신, 키모트립신 및 엘라스타제) 또는 서브틸리신 유사일 수 있다.

일 구현예에서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 트립신 활성을 나타낸다. 예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 진핵 또는 원핵 기원의 자연발생 트립신, 또는 이러한 트립신의 돌연변이된 형태일 수 있다. 구체적으로 대서양 대구(Gadus morhua), 대서양 및 태평양 연어(예컨대 Salmo salar 및 Oncorhynchus 종) 및 알라스카 명태(Theragra chalcogramma), 및 이의 돌연변이된 형태(하기에 기재된 바와 같음)로부터의 트립신과 같은 저온 적응 트립신이 포함된다.

트립신 I, II 및 III으로 명명된 트립신의 3개의 주요 동종효소가 대서양 대구로부터 규명되었다(Asgeirsson et al., 1989, Eur . J. Biochem . 180:85-94 참고, 이 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 예를 들어, GenBank 등록번호 ACO90397을 참고한다.

또한, 대서양 대구는 키모트립신 A 및 B로 명명된 키모트립신의 2개의 주요 동종효소를 발현한다(Asgeirsson & Bjarnason, 1991, Comp. Biochem . Physiol. B 998:327-335, 이 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 예를 들어, GenBank 등록번호 CAA55242.1을 참고한다.

일 구현예에서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 대서양 대구 (Gadus morhua)로부터의 트립신 I의 아미노산 서열, 즉, 서열번호: 1과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:

[서열번호: 1]

(여기서, 아미노산 서열 및 번호는 단백질 데이터 은행[PDB] 엔트리 '2EEK'에 따름)

많은 프로테아제와 마찬가지로, 대서양 대구로부터의 트립신 I은 절단되어 성숙한 활성 트립신을 생성하는 프로펩타이드(또는 "활성화") 서열을 포함하는, 불활성 전구체, 또는 자이모겐으로서 생산된다. 트립신에 대한 초기 발현 생성물은 또한 발현 후에 제거되는 신호 서열을 포함한다.

신호 서열을 포함하는, 대서양 대구로부터의 트립신 I에 대한 자이모겐 서열이 서열번호:2로서 하기에 나타나 있다(Uniprot 데이터베이스 등록 번호 P16049-1에 상응함):

[서열번호: 2]

여기서:

신호 펩타이드 = 아미노산 1 내지 13(밑줄 쳐 있음)

프로펩타이드 = 아미노산 14 내지 19(굵은 이탤릭체)

성숙한 트립신 = 아미노산 20 내지 241

본원에 사용된 바와 같이 용어 '아미노산'은 표준 20개의 유전적으로 코딩된 아미노산 및 'D' 형태(천연 'L' 형태와 비교하여)의 이들의 상응하는 입체이성질체, 오메가-아미노산 및 다른 자연발생 아미노산, 비통상적인 아미노산(예컨대, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 등) 및 화학적으로 유도체화된 아미노산(하기 참고)을 포함한다.

'알라닌' 또는 'Ala' 또는 'A'와 같이 아미노산이 구체적으로 열거되고 있을 때, 상기 용어는 달리 명시적으로 언급하지 않는 한, L-알라닌 및 D-알라닌 모두를 지칭한다. 다른 비통상적인 아미노산 역시 원하는 기능적 특성이 폴리펩타이드에 의해 유지되는 한, 본 발명의 폴리펩타이드에 적합한 성분일 수 있다. 나타낸 폴리펩타이드에 대해, 각각의 코딩된 아미노산 잔기는, 적절한 경우, 종래의 아미노산의 관용명에 상응하는, 단일 문자명으로 표시된다.

관례에 따르면, 본원에 개시된 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 제공된다.

전형적으로, 본 발명의 조성물에서 사용되는 폴리펩타이드는 L-아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 서열번호:1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

따라서, 일 구현예에서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

그러나, 폴리펩타이드는 대안적으로 서열번호:1의 돌연변이체 또는 변이체인 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. "변이체"는 폴리펩타이드가 서열번호: 1과 100% 아미노산 서열 동일성을 공유하지 않는다는 것을 의미하며, 즉, 서열번호: 1 중 하나 이상의 아미노산이 돌연변이되어야 한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 서열번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성, 더욱 바람직하게는 상기 서열과 적어도 60%, 70% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 동일성, 및 가장 바람직하게는 상기 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 따라서, 특정 위치에서의 아미노산은 결실되거나, 치환되거나 또는 하나 이상의 아미노산의 삽입/부가의 부위일 수 있다. 당업자는 치환이 보존적이거나 비보존적일 수 있음을 이해할 것이다.

퍼센트 동일성은, 매개변수로서 전역 정렬 옵션, 스코어링 매트릭스 BLOSUM62, 오프닝 갭 페널티 -14, 연장 갭 페널티 -4를 사용하여, 예를 들어 Expasy 시설 사이트(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)에서의 LALIGN 프로그램(Huang and Miller, Adv . Appl . Math. (1991) 12:337-357, 이 개시내용은 본원에 참고로 포함된)에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 2개의 폴리펩타이드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 적합한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 위스컨신 대학 유전적 컴퓨팅 그룹(University of Wisconsin Genetic Computing Group)의 갭 프로그램을 사용하여 결정될 수 있고, 퍼센트 동일성이 서열이 최적으로 정렬된 폴리펩타이드와 관련하여 계산된다는 것이 이해될 것이다.

정렬은 대안적으로 Clustal W 프로그램(Thompson et al., 1994, Nucl . Acid Res. 22:4673-4680에 기재된 바와 같음, 본원에 참고로 포함됨)을 사용하여 수행될 수 있다. 사용되는 매개변수는 하기일 수 있다:

- 빠른 쌍정렬 매개변수: K-tuple(워드) 크기; 1, 윈도우 크기; 5, 갭 페널티; 3, 상위 대각선의 수; 5. 스코어링 방법: x 퍼센트.

- 다중 정렬 매개변수: 갭 오픈 페널티; 10, 갭 연장 페널티; 0.05.

- 스코어링 매트릭스: BLOSUM.

대안적으로, BESTFIT 프로그램이 국소 서열 정렬을 결정하는데 사용될 수 있다.

따라서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 국제 특허 출원 제PCT/GB2015/051006호(공개 WO 제2015/150799호(Enzymatica AB)에 기재된 것과 같은 서열번호:1의 변이체일 수 있다.

당업자는 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드가 대안적으로 상기 정의된 아미노산 서열 중 어느 것의 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있음을 이해할 것이며, 상기 단편은 항박테리아 활성을 나타낸다.

"단편"은 비제한적으로 서열번호: 1 또는 2와 같이, 상기 아미노산 서열 중 어느 것의 적어도 5개의 인접한 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 단편은 상기 아미노산 서열 중 어느 것의 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200개 이상의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다.

항균(즉, 항박테리아) 활성을 보유하는 상기 정의된 세린 프로테아제 폴리펩타이드의 단편을 확인하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 다양한 상이한 단편은 WO 제2015/150799호에 기재된 발현 방법을 사용하여 공지된 재조합 방법에 의해 생성될 수 있고, 이후 어떤 단편이 상기 미생물의 성장 및/또는 증식을 억제하는지(부분적으로 또는 전체적으로) 결정하기 위해 시험관내에서 대표적인 미생물(예컨대, 박테리아 균주, 바이러스 및/또는 진균 균주)에 노출될 수 있다.

특히 바람직한 일 구현예에서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 자연발생 세린 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 진핵 또는 원핵 기원의 자연발생 트립신의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 구체적으로, 대서양 대구(Gadus morhua), 대서양 및 태평양 연어(예컨대 Salmo salar 및 Oncorhynchus 종) 및 알라스카 명태(Theragra chalcogramma)로부터의 트립신과 같은 저온 적응 트립신이 포함된다. 예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 서열번호:1의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

이러한 자연발생 세린 프로테아제는 공급원 유기체(예컨대,　대서양 대구)로부터 정제될 수 있거나 재조합으로 발현될 수 있다.

따라서, 당업자는 본 발명의 이러한 자연발생 세린 프로테아제 폴리펩타이드가 이들이 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태로 제공된다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 자연발생 진핵 트립신의 아미노산 서열로 구성되지만 자연에서 발현될 때 단백질 상에 존재하는 당화 모이어티가 결여될 수 있다.

폴리펩타이드 성분은 사용되는 세린 프로테아제의 효능/독성에 따라 다양한 농도로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 제제는 적어도 0.001 μM, 예를 들어 적어도 0.01 μM, 적어도 0.1 μM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 또는 적어도 500 μM의 농도로 활성제를 포함한다. 편리하게는, 제제는 최대 1 mM, 예를 들어 최대 500 μM, 최대 100 μM, 최대 10 μM, 최대 1 μM, 최대 0.1 μM, 또는 최대 0.01 μM의 농도로 활성제를 포함한다. 일 구현예에서, 세린 프로테아제 폴리펩타이드는 0.001 내지 10 μM의 농도로 제제에 존재한다. 따라서, 치료 제제는 생물막 집단에서 박테리아의 성장을 사멸시키거나 늦추는데 충분한 폴리펩타이드의 양을 포함할 수 있다.

이 측면의 일 구현예에서, 세린 프로테아제 폴리펩타이드(예컨대 대구 트립신)의 활성은 0.001 U/g 내지 32 U/g이다.

본 발명의 병용 요법의 추가의 중요 성분은 하나 이상의 항생제 화합물이다.

임의의 공지된 항생제 화합물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 항생제 화합물은 아목시실린, 암피실린, 아지트로마이신, 카르바페넴, 세포탁심, 세프트리악손, 세푸록심, 세팔로스포린, 클로람페니콜, 시프로플록사신, 클린다마이신, 달라신, 달포프리스틴, 답토마이신, 독시사이클린, 에르타페넴, 에리트로마이신, 플루오로퀴놀론, 메로페넴, 메트로니다졸, 미노사이클린, 목시플록사신, 나프실린, 옥사실린, 페니실린, 퀴누프리스틴, 리팜핀, 설파메톡사졸, 테이코플라닌, 테트라사이클린, 트리메토피림, 반코마이신, 바시트라신 및 폴리믹신 B, 또는 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 항생제 화합물은 테트라사이클린, 세포탁심, 반코마이신, 에리트로마이신 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

당업자는 본 발명의 병용 요법이 단일 항생제 화합물 또는 다수의 항생제 화합물을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명의 병용 요법에 사용될 항생제의 농도는 본 분야에서 통상의 일반 지식에 따라 사용될 특정 항생제 및 치료될 생물막의 징후 및/또는 위치에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 항생제는 0.1 내지 5%(중량), 예를 들어 0.1 내지 1%(중량)의 농도로 제형화될 것이다.

본 발명의 제2의 관련된 측면은 대상에서 박테리아 생물막을 치료하는데 사용하기 위한 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 항생제 화합물과 병용하여 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 제3의 관련된 측면은 대상에서 박테리아 생물막을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 항생제 화합물과 병용하여 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 제2 및 제3 측면과 관련하여 사용하기 위한 적합한 세린 프로테아제 폴리펩타이드 및 항생제 화합물의 예가 상기에 상술되어 있다.

본 발명의 제4 측면은 약제학적으로 허용가능한 완충제, 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, (a)　세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 (b) 하나 이상의 항생제 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 제4 측면과 관련하여 사용하기 위한 적합한 세린 프로테아제 폴리펩타이드 및 항생제 화합물의 예가 상기에 상술되어 있다.

일 구현예에서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 적어도 0.001 μM, 예를 들어 적어도 0.01 μM, 적어도 0.1 μM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 또는 적어도 500 μM의 농도로 존재한다. 편리하게는, 조성물은 최대 1 mM, 예를 들어 최대 500 μM, 최대 100 μM, 최대 10 μM, 최대 1 μM, 최대 0.1 μM, 또는 최대 0.01 μM의 농도로 활성제를 포함한다. 일 구현예에서, 세린 프로테아제 폴리펩타이드는 0.001 내지 10 μM의 농도로 조성물에 존재한다.

대구로부터 수득가능한 트립신이 사용될 때, 본 발명의 조성물에서의 그 농도는 0.001 U/g 내지 32 U/g(즉, 최종 조성물의 그램당 활성 단위로서 측정됨)이다.

일 구현예에서, 하나 이상의 항생제 화합물은 0.1 중량% 내지 5 중량%, 예를 들어 0.1 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 및 바람직하게는 1 중량%의 농도로 존재한다.

약제학적 조성물은 충분히 보관 안정하고 인간 및 동물의 투여에 적합한 당업계에 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 치료 조성물은, 예컨대 동결 건조, 분무 건조, 분무 냉각을 통해, 또는 초임계 입자 형성으로부터의 입자 형성의 사용을 통해, 동결건조될 수 있다.

"약제학적으로 허용가능한"은 본 발명의 폴리펩타이드의 트립신 활성의 효과를 감소시키지 않는 비독성 물질을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 완충제, 담체 또는 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) and handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), 그 개시내용은 본원에 참고로 포함되어 있음).

용어 "완충제"는 pH를 안정화시키기 위한 목적으로 산-염기 혼합물을 함유하는 수용액을 의미하고자 하는 것으로 의도된다. 완충제의 예는 트리즈마, 비신, 트리신, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 구연산염, 글리콜산염, 젖산염, 붕산염, ACES, ADA, 타르타르산염, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜산염, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸젖산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.

용어 "희석제"는 치료 제제에서 펩타이드를 희석하기 위한 목적을 갖는 수용액 또는 비수용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대, 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름) 중 하나 이상일 수 있다.

"부형제"는 탄수화물, 중합체, 지질 및 미네랄 중 하나 이상일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토스, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 및 사이클로덱스트린을 포함하며, 이는, 예컨대, 동결건조를 용이하게 하기 위해 조성물에 첨가된다. 중합체는 전분, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로오스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알콜/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈(이들 모두는 상이한 분자량임)이며, 예컨대, 점도 제어를 위해, 생부착을 달성하기 위해, 또는 지질이 화학적 및 단백질 분해되는 것을 방지하기 위해 조성물에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 모노-, 디-, 및 트리글리세라이드, 세라마이드, 스핑고지질 및 당지질(모두 상이한 아실 쇄 길이 및 포화), 달걀 레시틴, 대두 레시틴, 수소화 달걀 및 대두 레시틴이며, 이들은 중합체와 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 탈크, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티타늄이며, 이는 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 이점을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.

일 구현예에서, 폴리펩타이드는 염화칼슘과 같은 안정화제와 함께 제공될 수 있다.

또한, 자외선 흡수제(예컨대 N,N-디메틸 PABA 옥틸 에스테르, 옥틸 메틸 신나메이트, 부틸 메톡시디벤조일메탄, 디-p-메톡시신남산-모노-2-에틸 헥사노산 글리세릴, 2-하이드록시-4-메톡시 벤조페논, 2-하이드록시-4-메톡시 벤조페논-5-소디움 설포네이트), 저급 알콜(예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜), 보존제(예컨대 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 부틸 파라벤, 페녹시 에탄올), 살균제(예컨대 클로로헥시딘, 염산염, 트리클로로카르바닐리드, 트리클로산, 아연 피리티온), 은(예컨대 원소 은, 산화은, 질산은, 은 설파디아진, 은 나노입자), 착색제(예컨대 염료, 안료), 방향제(예컨대 멘톨, 장뇌, 티몰, 유칼립톨) 분말, 향료(예컨대 정유, 동물 기원의 항료, 합성 향료), 비타민(예컨대 비타민 A 및 그 유도체, 비타민 E 및 그 유도체, 비타민 C 및 그 유도체, 판토텐산, 비타민 H, 비타민 B 및 그 유도체), 우레아, 수용성 중합체(예컨대 폴리 비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복실 비닐 중합체, 잔탄검, 히알루론산), 완충제(예컨대 글루탐산 나트륨, 아르기닌, 아스파르트산, 구연산, 구연산 나트륨, 젖산, 젖산 나트륨), 항생, 항진균, 항바이러스 및 항기생충 약물이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 제제의 전달에 적합한 것으로 당업계에 공지된 임의의 유형의 치료 조성물로 제형화될 수 있다.

일 구현예에서, 폴리펩타이드 및 항생제 화합물(들)은 물, 식염수, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대, 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참깨유), 트라가칸트 검, 및/또는 다양한 완충제에 간단하게 용해될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 경구 투여로 제형화되는 경우(예컨대 입 분무에서), 치료 조성물은 물, 글리세롤 및 멘톨에 용해된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예시적인 입 분무 제제는 ColdZyme ®(Enzymatica AB, Lund, Sweden)으로서 스칸디나비아에서 시판되고 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 삼투압 활성 용액 중에 상기 기재된 바와 같은 프로테아제 폴리펩타이드 및 항생제 화합물(들)을 제공한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 및 항생제 화합물(들)은 글리세롤 또는 글리세린에서 제제화될 수 있다. 이론에 구속되기 바라지 않으면서, 이러한 삼투압 활성 용액은 미생물 세포 내에서 세포외 환경으로의 유체의 이동을 촉진하는 것으로 여겨진다. 이것은 결국, 예컨대 구강인두의 숙주 상피 세포에 의한 박테리아 및 바이러스와 같은 미생물 세포의 흡수를 (적어도 부분적으로) 억제하는 얇은 활성 장벽을 생성함으로써 본 발명의 폴리펩타이드의 치료 효과를 촉진하는 것으로 여겨진다.

추가 구현예에서, 본 발명의 치료 조성물은 폴리펩타이드 및 항생제 화합물(들)이, 다른 약제학적으로 허용가능한 담체 외에도, 마이셀, 불용성 단일층 및 액정과 같은 응집된 형태로 존재하는, 지질과 같은 양친매성 제제와 함께 조합된 리포좀의 형태일 수 있다. 리포좀 제형을 위한 적합한 지질은, 비제한적으로, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파티드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 적합한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 연장하기 위해 극성 헤드그룹 내에 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 상기 지질을 포함한다. 이러한 리포좀 제형의 제조는, 예를 들어 개시내용이 본원에 참고로 포함된 US 제4,235,871호에서 발견될 수 있다.

본 발명의 치료 조성물은 또한 생분해성 미소구체의 형태일 수 있다. 지방족 폴리에스테르, 예컨대 폴리(젖산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), PLA 및 PGA의 공중합체(PLGA) 또는 폴리(카프로락톤)(PCL), 및 폴리무수물이 미소구체의 생산에서 생분해성 중합체로서 널리 사용되어 왔다. 이러한 미소구체의 제조는 개시내용이 본원에 참고로 통합된 US　제5,851,451호 및 EP　제0 213　303호에서 발견될 수 있다.

추가 구현예에서, 본 발명의 치료 조성물은 중합체 겔의 형태로 제공되며, 여기서 전분, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로오스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알콜/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 중합체는 펩타이드를 함유하는 용액의 증점에 사용된다. 중합체는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.

본 발명의 치료 조성물은 폴리펩타이드의 작용 강화를 위해 이온 및 원하는 pH를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 조성물은 멸균과 같은 종래의 치료 활동을 받을 수 있고/있거나 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 완충제, 충전제 등과 같은 종래의 보조제를 함유할 수 있다.

일 바람직한 구현예에서, 치료 조성물은 EDTA, 자일리톨, 소르비톨, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤 중 하나 이상과 함께, Tris 또는 인산염 완충제 내에 폴리펩타이드 및 항생제 화합물(들)을 포함한다.

본 발명에 따른 치료 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 가능한 투여 경로는 흡입, 구강, 비경구(정맥내, 피하, 척추강내 및 근육내), 국소, 안구, 비강, 폐, 비경구, 질 및 직장을 포함한다. 또한, 이식물로부터의 투여가 가능하다.

대안적인 구현예에서, 치료 조성물은 비경구로, 예를 들어, 정맥내로, 뇌실내로, 관절내로, 동맥내로, 복강내로, 척추강내로, 심실내로, 흉골내로, 두개내로, 근육내로 또는 피하로 투여되거나, 또는 이들은 주입 기술에 의해 투여될 수 있다. 이들은 다른 물질, 예를 들어, 용액을 혈액과 등장성으로 만들기 위해 충분한 염 또는 글루코스를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 간편하게 사용된다. 수용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 한다(바람직하게는 3 내지 9의 pH로). 멸균 조건하에서의 적합한 비경구 제형의 제조는 당업자에게 널리 공지된 표준 약제학적 기술에 의해 쉽게 달성된다.

비경구 투여에 적합한 제제는 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제제는 단위 용량 또는 다중 용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 전술한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

대안적으로, 치료 조성물은 비강내로 또는 흡입에 의해(예를 들어, 적합한 추진체, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로-메탄, 디클로로테트라플루오로-에탄, 하이드로플루오로알칸, 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3), 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체와 같은 적합한 추진체의 사용으로 가압 용기, 펌프, 분무 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 제시의 형태임) 투여될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 분무 또는 분무기는 예컨대 소르비탄 트리올레에이트를 추가로 함유할 수 있는 용매로서 예컨대 에탄올 및 추진체의 혼합물을 사용하여, 활성 폴리펩타이드의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다. 흡입기 또는 분무기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로부터 제조됨)는 본 발명의 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.

유리하게도, 폴리펩타이드는 기도의 점막으로 전달하는데 적합한 형태로 제공된다.

본 발명의 제5 측면은 대상에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a)　세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 (b) 하나 이상의 항생제 화합물의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 제5 측면과 관련하여 사용하기 위한 적합한 세린 프로테아제 폴리펩타이드 및 항생제 화합물의 예는 상기에 상술되어 있다

"치료"는 병용 치료제의 치료 및 예방 용도 모두를 포함한다. 당업자는 병용 요법이 박테리아 생물막을 완전히 박멸할 수 있거나 또는 부분적 이점(예컨대, 생물막을 구성하는 박테리아 집단의 크기의 감소 및/또는 생물막을 구성하는 박테리아 집단의 성장의 늦춤)을 제공할 수 있음을 이해할 것이다.

일 구현예에서, 대상은 인간이다. 그러나 본 발명의 방법은 또한 수의학적 환경에서, 예를 들어 가축 및/또는 농장 동물(개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 등)에서의 박테리아 생물막의 치료에 유용할 수 있다

당업자는 본원에 기재된 방법이 이러한 생물막이 발견될 수 있는 임의의 환경에서 미생물 생물막의 성장을 사멸시키거나, 억제하거나 예방하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

일 구현예에서, 생물막은 살아있는 지지체(상기 참조)와 결합된다. 예를 들어, 생물막은 인간 또는 동물 체내의 표면 상에서 성장하거나 성장하기 쉬울 수 있다. 따라서, 본 발명은 생물막의 존재 또는 성장과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 화합물을 제공한다. 예를 들어, 대상은 생물막 형성과 관련된 상부 및/또는 하부 기도에서 감염되거나 감염되기 쉬울 수 있다.

추가 구현예에서, 생물막은 불활성 지지체(상기 참조)와 결합된다. 따라서, 생물막은 인간 또는 동물 체내에서 이식되거나 삽입된 장치의 표면 상에서 성장하거나 성장하기 쉬울 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 방법은 특히 병원내 감염의 치료 및 예방에 적합하다는 것을 이해할 것이다.

일 구현예에서, 생물막은 그람 음성 및/또는 그람 양성 박테리아를 포함하거나 이로 구성된다.

하나의 바람직한 구현예에서, 생물막은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 미티스, 슈도모나스 애루지노사, 해모필러스 인플루엔자, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스, 메티실린 감수성 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오제네스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 산구이니스, 레지오넬라 뉴모필라, 클로스트리듐 디피실, 및 이의 임의의 혼합물로부터 독립적으로 선택되는 박테리아를 포함한다.

본 발명의 방법에서, 병용 요법은 약제학적 유효량으로 환자에게 투여될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, '치료적 유효량', 또는 '유효량', 또는 '치료적 유효'는 본원에 사용된 바와 같이, 주어진 병태 및 투여 요법에 대해 치료 효과를 제공하는 양을 지칭한다(상기 참고).

본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 병용 요법의 유효량을 대상에게 전달하기 위한 의료 장치를 제공하며, 상기 장치는 본 발명의 제4 측면에 따른 조성물의 병원소 및 장치로부터 상기 조성물을 방출하기 위한 수단을 포함한다.

예를 들어, 장치는 본 발명의 제1 측면에 따른 병용 요법을 기도의 점막에 전달하는데 적합한 입 분무 또는 비강 분무일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 함침되거나, 코팅되거나, 처리되는 이식가능한 의료 장치를 제공한다.

예를 들어, 의료 장치는 혈관내 장치, 카테터, 션트, 삽관 및 기관절개 튜브, 안과용 장치, 관절 보철, 인공 심장 파막 및 유방 이식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 이식가능한 의료 장치이다. "이식가능한 장치"는 신체의 내부 또는 외부 표면에 부착된 장치, 예컨대 콘택트 렌즈를 포함한다.

바람직하게는, 이식가능한 의료 장치는 사용 전에 밀봉되고 멸균된 용기에 포장된다.

본 발명의 제7 측면은 시험관내에서 박테리아 생물막의 성장을 사멸시키거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 생물막(또는 생물막 성장이 예방될 표면)을 본 발명의 제1 측면에 따른 병용 요법에 노출시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 상기 기재된 조성물은 또한 가정 환경(예컨대, 주방 작업 표면, 샤워기, 파이프, 바닥 등) 또는 상업적 또는 산업적 환경(예컨대, 냉각 시스템 내, 파이프, 바닥 표면 등) 환경과 같은 표면 또는 기재 상에서의 미생물 생물막의 성장을 예방하기 위해 멸균 용액 또는 세척의 형태로 사용될 수 있다.

이러한 세척 용액은 또한 표면활성제 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 적합한 계면활성제는 음이온 계면활성제(예컨대 지방족 설포네이트), 양쪽성 및/또는 양성이온성 계면활성제(예컨대　지방족 4차 암모늄, 포스포늄 및 설포늄 화합물의 유도체) 및 비이온 계면활성제(예컨대 지방족 알콜, 산, 아미드 또는 알킬렌 옥사이드를 갖는 알킬 페놀)를 포함한다. 편리하게는, 표면활성제는 0.5 내지 5 중량 퍼센트의 농도로 존재한다.

시험관내 및 생체내 용도 모두에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 적어도 5분 동안 표적 표면에 노출된다. 예를 들어, 노출 시간은 적어도 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 3시간, 5시간, 12시간 및 24시간일 수 있다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이것을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.

도 1 대구 트립신과 선택된 항생제의 병용이 생물막 분산에 미치는 효과
대구 트립신과 선택된 항생제의 병용이 생물막 분산에 미치는 효과. 도면은 대구 트립신 및 선택된 항생제의 병용이 어느 단독보다 생물막을 파괴하는데 더 효과적일 수 있음을 보여준다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시키고 생물막 모델로서 사용하였다. 생물막을 항생제로 처리하거나 또는 항생제 및 대구 트립신의 병용으로 처리하였다. 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 연구에 기초하여, 특정 항생제, 이 경우 테트라사이클린, 에리트로마이신, 옥사실린, 및 세포탁심, 및 대구 트립신 병용이 항생제 단독보다 박테리아 생물막을 파괴하는데 더 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다. 그러나, 반코마이신은 트립신과 병용될 때 모델 생물막에 대해 유의하게 증가된 효능이 없는 것으로 나타났다. 막대 위의 P 값은 스튜던트 t 검정에 의해 평가된 2개의 치료 간의 차이의 유의성을 나타낸다.
도 2 대구 트립신과 선택된 항생제의 병용이 생물막 분산에 미치 는 효과
대구 트립신과 선택된 항생제의 병용이 생물막 분산에 미치는 효과. 도면은 대구 트립신 및 테트라사이클린 또는 세포탁심의 병용이 어느 단독보다 생물막을 파괴하는데 더 효과적일 수 있음을 보여준다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시키고 모델 생물막으로서 사용하였다. 생물막을 대구 트립신, 항생제, 또는 이 둘의 병용으로 처리하였다. 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 연구에 기초하여 이 모델에 대하여 대구 트립신 및 항생제 테트라사이클린 또는 세포탁심의 병용이 대구 트립신 또는 항생제 단독보다 박테리아 생물막을 파괴하는데 더 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다. 막대 위의 P 값은 ANOVA 분석에 의해 평가된 바와 같은 효과의 유의성을 나타낸다.
도 3 대구 트립신과 선택된 항생제의 병용이 생물막 분산에 미치는 효과
대구 트립신과 선택된 항생제의 병용이 생물막 분산에 미치는 효과. 이미지는 대구 트립신 및 선택된 항생제의 병용이 어느 단독보다 생물막을 파괴하는데 더 효과적일 수 있다는 것을 명확하게 시각적으로 입증한다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 대구 트립신, 항생제, 또는 이 둘의 병용으로 처리하였다. 이후, 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신 및 항생제 병용이 항생제 단독보다 박테리아 생물막을 파괴하는데 더 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다. 반코마이신에 의해 입증된 바와 같이, 생물막을 항생제로 처리하는 것은 생물막 형성을 증가시킬 수 있고, 이 효과는 컬럼 7 및 8에 의해 명백한 바와 같dl 대구 트립신의 존재에 의해 상쇄된다.
이미지는 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스로 구성된 생물막을 4시간 동안 성장시킨 다음, 대구 트립신(ct), 항생제, 또는 대구 트립신/항생제 병용으로 처리한 96 웰 플레이트를 보여준다. 각 컬럼은 치료 또는 치료 병용의 하나의 유형을 나타내며, 행은 위에서 아래로 감소하는 농도를 나타낸다. 치료 후 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색하며, 더 어두운 색은 더 많이 남아있는 생물막을 나타낸다. 이미지는 항생제 및 대구 트립신의 병용이 어느 전체 단독보다 더 효과적일 수 있다는 것을 입증한다. 이것은 약물 단독이 생물막 형성을 증가시키는 것으로 보이는 반코마이신에 대해 특히 극심한 반면, 대구 트립신과의 병용에서 반코마이신은 대구 트립신의 효능을 증가시킬 수 있다. 가장 아래의 행은 공란을 나타내며, 여기서 처음 6개의 구멍은 처리되지 않은 생물막을 나타내고 다음 6개는 생물막이 없음을 나타낸다. 좌측의 표는 각 행/희석에서 사용된 대구 트립신 및 항생제의 농도를 나타낸다.
이미지는 트립신이 아마도 생물막을 파괴하고 이에 의해 항생제가 박테리아에 접근할 수 있게 함으로써 특정 항생제의 효능을 증가시키는 방법을 입증한다.
도 4 크리스탈 바이올렛으로 생물막 염색 후, 육안으로 제시된 대구 트립신이 수퍼 생물막에 미치는 효과.
크리스탈 바이올렛으로 생물막을 염색한 후 육안으로 제시된 대구 트립신이 수퍼 생물막에 미치는 효과. 도면은 생물막의 부존재를 나타내는 투명한 웰에 의해 관찰된 바와 같이 대구 트립신이 농도 의존적 방식으로 수퍼 생물막을 파괴시킨다는 것을 보여준다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 갖는 수퍼 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 대구 트립신 또는 위약으로 2분 동안 처리하고, 웰을 염색하여 처리 후 생물막의 존재(검정색 웰) 또는 그의 부존재(투명한 웰)를 측정하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신이 수퍼 생물막을 파괴하는데 매우 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다.
사진 이미지는 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스로 구성된 생물막을 4시간 동안 성장시킨 다음 대구 트립신 또는 위약으로 치료한 96 웰 플레이트를 나타낸다. 각 컬럼은 하나의 농도를 나타내며, 처음 3개 행은 대구 트립신 치료의 복제물을 나타내고 하부 3개의 행은 동일한 희석의 대구 트립신이 없는 제형의 복제물을 나타낸다. 치료 후 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색하였고, 가장 어두운 색상은 더 많은 남아있는 생물막을 나타낸다. 이미지는 대구 트립신이 고농도에서 생물막을 제거하는데 효과적일 수 있지만 저농도에서는 부가적인 요인을 필요로 할 수 있다는 것을 입증한다.
도 5 대구 트립신이 수퍼 생물막에 미치는 효과
크리스탈 바이올렛 염색 및 아세트산 용해 후 분광광도계에 의해 측정된 대구 트립신이 수퍼 생물막에 미치는 효과. 도면은 대구 트립신이 농도 의존적 방식으로 수퍼 생물막을 파괴한다는 것을 보여준다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 대구 트립신 또는 위약으로 처리하고 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신이 박테리아 생물막을 파괴하는데 매우 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다. 데이터는 막대 그래프로 제시되고, 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. 위약 및 대구 트립신 처리된 박테리아 생물막의 희석에 대한 데이터는 서로 옆에 위치한다. 동일한 희석의 위약의 것과 비교하여 펜자임(Penzyme)의 생물막 형성의 로그 감소는, 별표(*)로 표시된 유의성의 수준에서와 같이, 막대를 초과하며, 여기서 *는 < 0.05의 P를 나타내고, **는 P < 0.01를 나타내며 ***는 P < 0.001을 나타낸다. 스튜던트 T 검정을 사용하여 유의성을 계산하였다.
도 6. 상이한 농도의 대구 트립신에 의한 수퍼 생물막의 로그 감소
상이한 농도의 대구 트립신에 의한 수퍼 생물막의 로그 감소. 도면은 대구 트립신이 농도 의존적 방식으로 수퍼 생물막을 파괴시킨다는 것을 보여준다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 대구 트립신 또는 위약으로 처리하고 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 감소를 로그 규모로 위약 처리된 생물막과 비교하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신은 농도 8 U/g 이상인 박테리아 생물막을 2분 이내에 파괴하는데 매우 효과적인 것으로 결론내릴 수 있으며, 3의 로그 감소는 생물막의 99.9%를 제거를 나타내고 4의 로그 감소는 생물막의 99.99% 감소이다.
도 7 대구 트립신 전처리가 생물막 형성에 미치는 효과.
대구 트립신 전처리가 생물막 형성에 미치는 효과. 도면은 96 웰 미세적정 플레이트에서 37℃에서 인큐베이션하기 전에 생물막 형성 박테리아 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스를 대구 트립신으로 전처리하는 것이 생물막을 형성하는 이들의 능력에 대해 농도 의존적인 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 대구 트립신 또는 위약으로 간략하게 처리한 후 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 4시간 동안 성장시킨 후, 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신이 박테리아 생물막 형성을 예방하는데 매우 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다. 데이터는 박스그래프로서 제시되며, 여기서 직사각형의 상단은 3분위수를 나타내고, 직사각형의 중간 근처의 수평선은 중앙값을 나타내며, 직사각형의 하단은 1분위수를 나타낸다. 수직선은 최대값을 나타내기 위해 직사각형의 상단으로부터 연장되며, 또 다른 수직선은 최소값을 나타내기 위해 직사각형의 하단으로부터 연장된다.
도 8 대구 트립신 전처리가 생물막 형성에 미치는 효과
대구 트립신 전처리가 생물막 형성에 미치는 효과. 도는 부유 박테리아가 생물막을 형성하기 전에 트립신으로 처리될 때 대구 트립신이 농도 의존적 방식으로 생물막의 형성을 예방할 수 있다는 것을 보여준다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 대구 트립신 또는 위약으로 처리한 후 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 4시간 동안 성장시킨 후, 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신이 박테리아 생물막 형성을 예방하는데 매우 효과적인 것으로 결론내릴 수 있다. 스튜던트 t 검정에 의해 평가된 바와 같이, 통계학적 유의차는 박스 위의 기호에 의해 표시되며, n.s.는 p > 0.05이고, *는 p < 0.05이며, **는 p < 0.01이고, ***은 p < 0.001이다.

실시예

실시예 1: 대구 트립신 조성물에 의한 뉴모코커스 ( Pneumococcus ) 및 S.　 미티 스의 부착의 억제

도 1 및 도 2에서 입증된 바와 같이, 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 대구 트립신 또는 위약으로 처리한 후 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 4시간 동안 성장시킨 후, 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신 조성물이 박테리아 생물막 형성을 예방하는데 매우 효과적인 것으로 결론내린다. 생물막 형성 전에 대구 트립신 조성물로 박테리아를 처리하는 것은 시험관내에서 생물막 형성에 대해 농도 의존적 효과를 나타내었다. 대구 트립신은 농도 의존적 방식으로 생물막 형성을 예방한다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 대구 트립신 또는 위약으로 처리한 후 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 4시간 동안 성장시킨 후, 웰을 크리스탈 바이올렛으로 염색시킨 다음 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신이 박테리아 생물막 형성을 예방하는데 매우 효과적이라고 결론내릴 수 있다. 데이터는 박스그래프로서 제시되며, 여기서 직사각형의 상단은 3분위수를 나타내고, 직사각형의 중간 근처의 수평선은 중앙값을 나타내며, 직사각형의 하단은 1분위수를 나타낸다. 수직선은 최대값을 나타내기 위해 직사각형의 상단으로부터 연장되며, 또 다른 수직선은 최소값을 나타내기 위해 직사각형의 하단으로부터 연장된다. 위약 및 대구 트립신 처리된 박테리아에 대한 데이터는 동일한 그래프 상에 위치한다. 박스의 중첩은 생물막 형성에 차이가 없음을 나타낼 것이다. 스튜던트 t 검정에 의해 평가된 바와 같이, 통계학적 유의차는 박스 위의 기호에 의해 표시되며, n.s.는 p > 0.05이고, *는 p < 0.05이며, **는 p < 0.01이고, ***은 p < 0.001이다. 결과가 도 1 및 2에 제시되어 있다.

도 4, 5, 6, 7, 및 8은 대구 트립신이 농도 의존적 방식으로 표면으로부터 박테리아를 상당히 제거할 수 있고 박테리아가 표면에 재부착하는 것을 방지할 수 있음을 입증한다. 그러나 대구 트립신이 박테리아에게 치명적이지 않기 때문에 이것만으로는 박테리아 감염을 완전히 퇴치하기에는 충분하지 않을 수 있다.

실시예 2: 이러한 트립신 조성물에 의해 수퍼 생물막을 파괴하기 위한 대구 트립신 및 항생제의 병용

스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 항생제로 처리하거나 또는 항생제 및 대구 트립신의 병용으로 처리하였다. 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음, 아세트산으로 용해시켰다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 이를 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 대구 트립신 및 항생제 병용이 항생제 단독보다 박테리아 생물막을 파괴하는데 더 효과적인 것으로 결론내렸다(도 3 참고). 막대를 초과하는 P 값은 스튜던트 t 검정에 의해 평가된 바와 같이 2개의 치료 간의 유의차를 나타낸다. 선택된 항생제를 대구 트립신 치료와 병용하여 사용하는 것은 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 시험된 5개의 약물 중 4개에서 항생제의 효과를 유의하게 향상시킨 것으로 나타났다. 도 2의 데이터는 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 아세트산으로 용해시킨 결과를 제공한다. 생물막 형성을 492nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 처리되지 않은 생물막에 대해 표준화하였다. 막대를 초과하는 P　값은 ANOVA 분석에 의해 평가된 바와 같은 효과의 유의성을 나타낸다. 데이터는 항생제 치료와 함께 대구 트립신의 국소 병용 사용이 항생제 단독과 비교하여 생물막의 파괴를 개선하였다는 것을 입증한다. 대구 트립신과 항생제의 병용이 항생제에 의한 생물막 파괴를 개선하였다는 것이 뜻밖에 발견되었다. 대구 트립신 첨가는 생물막 감염을 치료할 때 더 낮은 농도의 항생제의 사용을 가능하게 한다. 도 3은 대구 트립신과 선택된 항생제의 병용이 생물막 분산에 미치는 효과를 나타낸다. 이미지는 대구 트립신 및 선택된 항생제의 병용이 어느 단독보다 생물막을 파괴하는데 더 효과적이라는 것을 명확하게 시각적으로 입증한다. 스트렙토코커스 뉴모니애 및 스트렙토코커스 미티스의 조합을 사용한 생물막을 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 생물막을 대구 트립신, 항생제, 또는 이 둘의 병용으로 처리하였다. 이후, 생물막을 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 연구에 기초하여 대구 트립신 및 항생제 병용이 항생제 단독보다 박테리아 생물막을 파괴하는데 더 효과적이라고 결론내릴 수 있다.

참고문헌

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Bjarnason, J. B., 2000, Fish serine proteases and their pharmaceutical and cosmetic use. Patent: PCT, WO 00/78332 A2.

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Stefansson, B., L. Helgadottir, S. Olafsdottir, A. Gudmundsdottir, and J. B. Bjarnason, 2010, Characterization of cold-adapted Atlantic cod (Gadus morhua) trypsin I - Kinetic parameters, autolysis and thermal stability: Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, v. 155, p. 186-194.

SEQUENCE LISTING <110> Zymetech ehf <120> COMBINATION THERAPIES <130> ENZBA/P61071PC <150> EP15178209.1 <151> 2015-07-24 <160> 2 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Gadus morhua <220> <223> trypsin I <400> 1 Ile Val Gly Gly Tyr Glu Cys Thr Lys His Ser Gln Ala His Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys 20 25 30 Asp Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Val Leu Arg Val 35 40 45 Arg Leu Gly Glu His His Ile Arg Val Asn Glu Gly Thr Glu Gln Tyr 50 55 60 Ile Ser Ser Ser Ser Val Ile Arg His Pro Asn Tyr Ser Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Ile Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Thr Lys Pro Ala Thr Leu 85 90 95 Asn Gln Tyr Val His Ala Val Ala Leu Pro Thr Glu Cys Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Met Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Asn Thr Met Ser Ser Val 115 120 125 Ala Asp Gly Asp Lys Leu Gln Cys Leu Ser Leu Pro Ile Leu Ser His 130 135 140 Ala Asp Cys Ala Asn Ser Tyr Pro Gly Met Ile Thr Gln Ser Met Phe 145 150 155 160 Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser 165 170 175 Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Val Val Ser Trp 180 185 190 Gly Tyr Gly Cys Ala Glu Arg Asp His Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val 195 200 205 Cys Val Leu Ser Gly Trp Val Arg Asp Thr Met Ala Asn Tyr 210 215 220 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Gadus morhua <220> <223> zymogen sequence for trypsin I <400> 2 Met Lys Ser Leu Ile Phe Val Leu Leu Leu Gly Ala Val Phe Ala Glu 1 5 10 15 Glu Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Glu Cys Thr Lys His Ser Gln Ala 20 25 30 His Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu 35 40 45 Val Ser Lys Asp Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Val 50 55 60 Leu Arg Val Arg Leu Gly Glu His His Ile Arg Val Asn Glu Gly Thr 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Val Ile Arg His Pro Asn Tyr Ser 85 90 95 Ser Tyr Asn Ile Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Thr Lys Pro 100 105 110 Ala Thr Leu Asn Gln Tyr Val His Ala Val Ala Leu Pro Thr Glu Cys 115 120 125 Ala Ala Asp Ala Thr Met Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Asn Thr Met 130 135 140 Ser Ser Val Ala Asp Gly Asp Lys Leu Gln Cys Leu Ser Leu Pro Ile 145 150 155 160 Leu Ser His Ala Asp Cys Ala Asn Ser Tyr Pro Gly Met Ile Thr Gln 165 170 175 Ser Met Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln 180 185 190 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Val 195 200 205 Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Glu Arg Asp His Pro Gly Val Tyr 210 215 220 Ala Lys Val Cys Val Leu Ser Gly Trp Val Arg Asp Thr Met Ala Asn 225 230 235 240 Tyr

Claims

(a) 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 (b) 하나 이상의 항생제 화합물을 포함하는, 대상에서 박테리아 생물막을 치료하는데 사용하기 위한 병용 요법.
제1항에 있어서, 상기 대상이 인간인 병용 요법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생물막이 상부 및/또는 하부 기도에 위치한 것인 병용 요법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 그람 음성 및/또는 그람 양성 박테리아를 포함하거나 이로 구성되는 것인 병용 요법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 미티스 , 슈도모나스 애루지노사 , 해모필러스 인플루엔 자, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 , 메티실린 감수성 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오제네스 , 스트렙토코커스 뮤탄스 , 스트렙토코커스 산구이니스, 레지오넬라 뉴모필라 , 클로스트리듐 디피실, 및 이의 임의의 혼합물로부터 독립적으로 선택되는 박테리아를 포함하는 것인, 병용 요법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 스트렙토코커스(Streptococci)를 포함하거나 이로 구성되는 것인 병용 요법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 스트렙토코커스 미티스 및/또는 스트렙토코커스 뉴모니애를 포함하거나 이로 구성되는 것인 병용 요법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 트립신 또는 키모트립신, 또는 이의 혼합물의 성분인 것인 병용 요법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 자연발생인 것인 병용 요법.
제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 해양(marine) 세린 프로테아제인 것인 병용 요법.
제10항에 있어서, 상기 해양 세린 프로테아제가 대구, 명태, 연어 또는 크릴새우로부터 수득가능한 것인 병용 요법.
제11항에 있어서, 상기 해양 세린 프로테아제가 대서양 대구(Atlantic cod)로부터 수득가능한 것인 병용 요법.
제12항에 있어서, 상기 해양 세린 프로테아제가 트립신, 예를 들어 트립신 I인 것인 병용 요법.
제13항에 있어서, 상기 트립신의 활성이 0.1 내지 16 U/g의 범위인 것인 병용 요법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서의 폴리펩타이드로서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 서열번호: 1의 아미노산 서열:
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[서열번호: 1]
또는 상기 아미노산 서열의 트립신 활성을 보유하는 이의 단편, 변이체, 유도체 또는 융합체를 포함하거나 이로 구성되는 것인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 천연 공급원으로부터 정제된 것인 병용 요법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 재조합 단백질인 것인 병용 요법.
제17항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 비자연발생인 것인 병용 요법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 아목시실린, 암피실린, 아지트로마이신, 카르바페넴, 세포탁심, 세프트리악손, 세푸록심, 세팔로스포린, 클로람페니콜, 시프로플록사신, 클린다마이신, 달라신, 달포프리스틴, 답토마이신, 독시사이클린, 에르타페넴, 에리트로마이신, 플루오로퀴놀론, 메로페넴, 메트로니다졸, 미노사이클린, 목시플록사신, 나프실린, 옥사실린, 페니실린, 퀴누프리스틴, 리팜핀, 설파메톡사졸, 테이코플라닌, 테트라사이클린, 트리메토피림, 반코마이신, 바시트라신 및 폴리믹신 B, 또는 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 병용 요법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 테트라사이클린, 세포탁심, 반코마이신, 에리트로마이신 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 병용 요법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 항생제 화합물을 포함하는 것인 병용 요법.
대상에서 박테리아 생물막을 치료하는데 사용하기 위한 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 항생제 화합물과 병용하여 사용하기 위한 것인 폴리펩타이드.
제22항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 폴리펩타이드.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 폴리펩타이드.
대상에서 박테리아 생물막을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 용도로서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 항생제 화합물과 병용하여 사용하기 위한 것인 폴리펩타이드의 용도.
제25항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인, 폴리펩타이드의 용도.
제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인, 폴리펩타이드의 용도.
약제학적으로 허용가능한 완충제, 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, (a)　세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 (b) 하나 이상의 항생제 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
제28항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 조성물.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 조성물.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 0.001 내지 10 μM의 농도로 존재하는 것인 조성물.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 0.1 중량% 내지 5 중량%, 예를 들어 0.1 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 및 바람직하게는 1 중량%의 농도로 존재하는 것인 조성물.
대상에서 고형 종양을 치료하는 방법으로서,
(a)　세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 (b) 하나 이상의 항생제 화합물의 치료적 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제33항에 있어서, 상기 대상이 인간인 방법.
제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 생물막이 상부 및/또는 하부 기도에 위치하는 것인 방법.
제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 그람 음성 및/또는 그람 양성 박테리아를 포함하거나 이로 구성되는 것인 방법.
제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 미티스 , 슈도모나스 애루지노사 , 해모필러스 인플루엔 자, 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 , 메티실린 감수성 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 피오제네스 , 스트렙토코커스 뮤탄스 , 스트렙토코커스 산구이니스, 레지오넬라 뉴모필라 , 클로스트리듐 디피실, 및 이의 임의의 혼합물로부터 독립적으로 선택되는 박테리아를 포함하는 것인 방법.
제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 스트렙토코커스를 포함하거나 이로 구성되는 것인 방법.
제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물막이 스트렙토코커스 미티스 및/또는 스트렙토코커스 뉴모니애를 포함하거나 이로 구성되는 것인 방법.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 활성을 갖는 상기 폴리펩타이드가 입 분무(mouth spray)에 의해 전달되는 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 병용 요법의 유효량을 대상에게 전달하기 위한 의료 장치로서, 상기 장치는 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 병원소(reservoir) 및 상기 장치로부터 상기 조성물을 방출하기 위한 수단을 포함하는, 장치.
제43항에 있어서, 상기 장치가 입 분무인 것인 의료 장치.
제43항에 있어서, 상기 장치가 비강 분무인 것인 의료 장치.
시험관내에서 박테리아 생물막의 성장을 사멸시키거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법으로서,
상기 생물막(또는 생물막 성장이 예방될 표면)을 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 병용 요법에 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 화합물이 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.