JP4187075B2 - 製剤 - Google Patents

Description

発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は、例えば患者の糖尿病のような高血糖症を処置する方法に使用されるインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリンを含む製剤に関する。
関連する技術分野に関する記載
糖尿病の処置を改良することが明らかに必要とされている。改良の一つは、この目的のための治療剤としてＩＧＦ−Ｉを使用することである。ヒトＩＧＦ−Ｉは８．４のｐＩを備えた７６４９ダルトンのポリペプチドであり（RinderknechtとHumbel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,73:2365（1976）;RinderknechtとHumbel,J.Biol.Chem.,253:2769（1978）、成長ホルモン（ＧＨ）の作用を調節するインスリン様およびマイトジェンの生物学的活性を備えたソマトメジンのファミリーに属する。Van Wykら,Recent Prog.Horm.Res.,30:259（1974）;Binoux,Ann.Endocrinol.,41:157（1980）;ClemmonsとVan Wyk,Handbook Exp.Pharmacol.,57:161（1981）;Baxter,Adv.Clin.Chem.,25:49（1986）;U.S.Pat.No.4988675;WO91/03253;およびWO93/23071。ＩＧＦ−Ｉは、ヒトの体液、例えば血液および大脳脊椎液（cerebral spinal fluid）に天然に生じる。特に肝臓は、ＩＧＦ−Ｉを特異的ＩＧＦ結合タンパク質と共に産生する。ＧＨのように、ＩＧＦ−Ｉは強い同化タンパク質である。Tannerら,Acta Endocrinol.,84:681-696（1977）;Uthneら,J.Clin.Endocrinol.Metab.,39:548-554（1974）参照。また、臨界的な病状における同化剤としてのインスリン、成長ホルモン、およびＩＧＦ−Ｉの役割の書評であるRossら,Intensive Care Med.,19 Suppl.2:s54-57（1993）も参照。
他の大部分の成長因子と違って、ＩＧＦ群は、循環系に高濃度で存在するが、ＩＧＦのほんのわずかの画分はタンパク質と結合していない。圧倒的大多数のＩＧＦが、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）、および酸変動性サブユニット（ＡＬＳ（acid-labile subunit））と称される巨大タンパク質から構成される、非共有的に結合した三重複合系の一部として循環する。この複合体は、等モル量のそれぞれ３つの成分から構成される。ＩＧＦとＩＧＦＢＰ−３とＡＬＳの三重複合系は、約１５００００ダルトンの分子量を備え、循環系におけるこの複合体の機能は、遊離ＩＧＦ−Ｉの急速な変化を妨げるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのレザバーおよび緩衝剤として働くかもしれないことが示唆されている。ＩＧＦ−Ｉは多くの組織で産生されるが、大部分の循環ＩＧＦ−Ｉは、肝臓で合成されると信じられている。
ＩＧＦ−Ｉは、例えばヒト血清のような天然源（RinderknechtとHumbel,J.Biol.Chem.,上掲）から精製されても、組み換えによって調製されてもよい（例えば、欧州特許第１２３２２８号と１２８７３３号）。ＩＧＦ−Ｉを製剤化するための種々の方法が記載されている。例えば、欧州特許第４４０９８９号には強酸でＩＧＦ−Ｉを含む溶液を乾燥することを含む、ＩＧＦ−Ｉの乾燥された組成物を調製する方法が記載されており、ＷＯ９１／１８６２１にはｐＨ６のクエン酸塩緩衝剤中でＩＧＦ−Ｉを製剤化すること、米国特許第５３７４６２０号には成長促進組成物中にＩＧＦ−ＩとＧＨを製剤化すること、ＰＣＴ／ＳＥ９４／０００１０には等張かつ注入に適したｐＨ５．５から６．５を示す５０ｍｍｏｌ以下の量のリン酸塩緩衝剤中にＩＧＦ−Ｉを含む安定な溶液について、そしてＷＯ９５／３４３１８には酸素濃度が低減された水溶液中にＩＧＦ−Ｉを含む溶液について記載されている。
ＩＧＦ−Ｉは、静脈にボーラス注入するすることにより、ヒトにおいてインスリンに似た血糖降下効果を示すが、陽性の窒素出納も促進する。Underwoodら.,Hormone Research,24:166（1986）。ＩＧＦ−Ｉは、健常者（Gulerら,N.Engl.J.Med.317:137-140［1987］）と糖尿病患者（Schoenleら,Diabetologia,34:675-679［1991］;Zenobiら,J.Clin.Invest.,90:2234-2241［1992］）［Sherwinら,hormone Research,41（上掲２）:97-101（1994）;Takanoら,Endocrinol.Japan,37:309-317（1990）;Gulerら,Acta Paediatr.Scand.（上掲）,367:52-54（1990）も参照］の両方において、正規のインスリンに類似して記載されたタイムコースを伴って、グルコース低下効果を示すことが知られている。ｒｈＩＧＦ−Ｉ投与後に血糖降下の自覚が増大することを報告した、Kerrら,“Effect of Insulin-like Growth Factor 1 on the responses to and recognition of hypoglycemia”American Diabetes Association（ADA）,52nd,Annual Meeting,San Antonio,Texas,June 20-23,1992も参照。さらに、ｒｈＩＧＦ−Ｉの一回の投与により、一晩のＧＨレベルおよびＩＤＤＭの青年におけるインスリン必要量が減少する。Cheethamら,Clin.Endocrinol,40:515-555（1994）;Cheethamら,Diabetologia,36;678-681（1993）。
タイプII糖尿病に投与された組み換えヒトＩＧＦ−Ｉは、Schalchら,J.Clin.Metab.77:1563-1568（1993）に報告されているように、ＩＧＦ−Ｉ処置の５日後の膵臓インスリン分泌の低下を示す血清インスリンの低下と、Ｃペプチドレベルの平行した減少の両方を示した。この効果は、Froeschら,Horm.Res.,42:66-71（1994）によって独立して確認された。正常のラットにおけるin vivo研究も、ＩＧＦ−Ｉ注入が膵臓インスリン放出を阻害することを例証した。Fursinnら,Endocrinology,135:2144-2149（1994）。さらに、膵臓における灌流調製物ＩＧＦ−Ｉもインスリン分泌を抑制する。Leahyら,Endocrinology,126:1593-1598（1990）.ヒトおよび動物のインスリン分泌におけるＩＧＦ−Ｉのこれらの明白なin vivo阻害効果があるにも関わらず、in vitro研究では、このような単一の結果が得られなかった。
ＩＧＦ−Ｉおよびグルコースの両方の多種の濃度を用いたin vitro研究は、全く効果を示さないもの（Sreradzeriら,J.Endocrinol.,117:59-62［1988］）から、生理学的なレベルのＩＧＦ−Ｉを利用しインスリン放出が３０％減少したものまで、種々の程度のインスリン分泌の阻害を示した。Van Schravendijkら,Diabetologia,33:649-653（1990）.ヒトランゲルハンス島を用いた最近の研究では、Eizirikら,Eur.J.Endocr.,133:248-250（1995）は、培地インスリン蓄積またはグルコース刺激インスリン放出において、ＩＧＦ−Ｉの効果を全く見いださなかった。当研究者らは、インスリン分泌においてin vivoで見られるＩＧＦ−Ｉの効果が、膵臓における直接的な効果よりも、ＩＧＦ−Ｉの膵臓外効果に副次的であるかもしれないと考えた。それゆえ、インスリン分泌におけるＩＧＦ−Ｉの作用の方式および部位については完全にはわかっていない。
短期ｒｈＩＧＦ−Ｉ投与により誘導される多数の生化学的変化が文献に記載されている。これらの中でも著名なものは、オイグリセミッククランプ（euglycemic clamp）の間に健常者において報告された組み換えヒトＩＧＦ−Ｉ（rhIGF-I）のリン酸塩およびカリウム低下効果である。Boulwareら,“Phosphate and potassium lowering effects of insulin-like growth factor I in humans:comparison with insulin”The Endocrine Society,74th Annual Meeting,San Antonio,Texas,1992,June 24-27.Gulerら,Acta Paediatr.Scand（上掲）,367も参照。
タイプＩもしくはインスリン依存真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インスリンおよびＩＧＦの異常に関係する。今日まで、末梢インスリン投与を介したインスリン“交換”治療が、７０年以上もの間、ＩＤＤＭの治療の柱であった。しかしながら、今や、糖尿病制御および合併症研究（the Diabetes Control and Complications Trial）を含む多くの研究結果が、末梢インスリン投与のみではグルコースホメオスタシスを正常化するのに不適切であることを明確に示した。DCCT Research Group,N.Eng.J.Med.,329:977-986（1993）.
多くの研究が、ＩＤＤＭとＧＨ−ＩＧＦ軸（axis）の特異的な生物化学的障害との間の関係を証明した。Winterら,J.Pediatr.,97:598-600（1980）;Contemporary Issue in Endocrinology and Metabolism,R.L.Hintz and R.G.Rosenfeld,ed.,Volume 4（1987）,pp.59-79のWilson,“Growth Abnormalities in Diabetes Mellitus”。これらの異常は、ＩＤＤＭがほとんど調節されず、かつ、ＧＨの上昇したプラスマレベル、ＩＧＦ−Ｉの低いプラスマレベル、正常ないし低レベルのＩＧＦＢＰ−３、並びに高レベルのＩＧＦＢＰ−１の存在を含む場合に特に著しい。Nieves-Riveraら,J.Clin.Endo.Metab.,7.7:638-643（1993）;Hermansenら,Acta Endocrinol.（Copenh）,114:433-439（1987）;Amielら,Diabetes,33:1175-1179（1984）;Blethenら,Diabetes,30:868-872（1981）;Sperlingら,Diabetologia,9:380-383（1973）;Edgeら,J.Clin.Endocrin.Metab.,71:1356-1361（1990）;Molnarら.,J.Clin.Endocrin.Metab.,34:837-846（1972）;JohansenとHansen,Diabetes,20:239-245（1971）;Shishkoら,Diabetes Research and Clin.Prac.,25:1-12（1994）;Brismarら,J.Clin.Endocrin.Metab.,79:872-878（1994）.これらの障害のもっともな原因は、循環ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３、ＡＬＳ、およびＩＧＦＢＰ−１の主な源である肝臓への半生理学的（sub-physiologic）インスリン輸送であろう。Winterら,Diabetes,28:952-954（1979）;Hallら,J.Inter.Med.,225:273-278（1989）。
ＧＨのほとんどの作用はＩＧＦ−Ｉに仲介され、視床下部−下垂体ユニット（the hypothalamic-pituitary unit）への陰性ＩＧＦ−ＩのフィードバックがＧＨ分泌の重要なレギュレーターである。ＩＤＤＭにおける低減されたＩＧＦ−Ｉフィードバックが、ＧＨの下垂体における放出の代償的増大を招く。Hallら,上掲;Lanesら,Diabetes,34:156-160（1985）.ＧＨの二次的な上昇がＩＤＤＭ患者において有害な結果を有するという実質的な証拠がある。例えば、睡眠中の高ＧＨレベルは、夜間インスリン要求量の増大および早朝空腹時性高血糖に寄与する。Pressら,N.Eng.J.Med.,310:810-815（1984）;Defeoら,Diabetologia,29:532A（1986）;Campbellら,N.Eng.J.Med.312:1473-1479（1985）;Campbellら,Metabolism,37:34-37（1988）;Ariasら,Diabetologia,27:252A（1984）;Davidsonら,Diabetes,37:166-171（1988）.さらに、上昇したＧＨレベルは、ＩＤＤＭの微小血管疾患（the microvascular complications）に直接寄与するものとして関係している。Sonksenら,Horm.Res.,40:68-79（1993）。
ｒｈＩＧＦ−Ｉは、インスリン感度を改良する能力を備えている。例えば、ｒｈＩＧＦ−Ｉ（７０μｇ／ｋｇ bid）は、筋緊張性ジストロフィーを有する非糖尿病インスリン耐性患者におけるインスリン感度を改善した。Vlachopapadopoulouら,J.Clin.Endo.Metab.,12:3715-3723（1995）.Saadら,Diabetologia,37:Abstract 40（1994）は、ｒｈＩＧＦ−Ｉ処置（２５μｇおよび１００μｇ／ｋｇ bid）の１５日後に、肥満症の成人におけるインスリン感度が投与量に依存して改善されること、およびグルコース寛容が弱められたことを報告した。また、ｒｈＩＧＦ−Ｉは、深刻なタイプＡインスリン耐性の患者（Schoenleら,Diabetologia,34:675-679［1991］;Morrowら,Diabetes,42（上掲）:269［1993］（要約）;Kuzuyaら,Diabetes,42:696-705［1993］）または別の非インスリン依存性真性糖尿病患者において、インスリン感度と血糖調節も改善した。Spencer EM,ed.,Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors（New York:Elsevier:1991）pp.705-715のSchalchら“Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor I（rhIGF-I）in type II diabetes mellitus”;Zenobiら,J.Clin.Invest.,90:2234-2241（1993）。
インスリン耐性は、タイプＩ糖尿病の著名な特徴と認められていなかったが、ある患者には明らかに存在し、青年期に臨床的に最も重要である。ＧＨは周知の抗インスリン効果を備えているので、青年期にＧＨレベルが上昇すると、このインスリン耐性の多くを仲介するかもしれない。Pressら,上掲;Defeoら,上掲;Campbellら,N.Eng.J.Med.,上掲,Campbellら,Metabolism,上掲;Ariasら,上掲;Davidsonら,上掲。
選択された代表的な患者におけるＩＧＦ−Ｉ投与の潜在的な効果およびインスリン耐性を引き起こす臨床的表現型の原因の一般的な概要がいくつかの参照文献に記載されている。Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors,（Spencer,EM,ed.）,Elsevier,New York,pp.219-224（1991）のElahiら,“Hemodynamic and metabolic responses to human insulin-like growth factor-I（IGF-I）in men”;Quinnら,New Engl.J.Med.,323:1425-1426（1990）;Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors,（Spencer,EM,ed.）,Elsevier;New York,pp.705-714（1991）のSchalchら,“Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor 1（rhIGF-1）in type II diabetes mellitus”;Schoenleら,Diabetologia,34:675-679（1991）;Usalaら,N.Eng.J.Med.,327:853-857（1992）;Liebermanら,J.Clin.Endo.Metab.,75:30-36（1992）;Zenobiら,J.Clin.Invest.,90:2234-2241（1992）;Zenobiら,J.Clin.Invest.,89:1908-1913（1992）;Kerrら,J.Clin.Invest.,91:141-147（1993）.ＷＯ９４／１６７２２は、少なくとも約７日間修飾有効量のＩＧＦ−Ｉに細胞を曝すことによる細胞バリア特性の長期修飾方法、並びにインスリン耐性の長期的改善または逆転の方法を開示する。しかしながら、１２０−１６０μｇ／ｋｇの投与量で、一日に二回、診療所でタイプII糖尿病患者を処置するためにＩＧＦ−Ｉを用いた場合には、副作用が処置の利点に勝ってしまう。Jabriら,Diabetes,43:369-374（1994）.ＩＧＦ−Ｉを用いた患者の処置に見られる副作用に関する、Wilton,Acta Paediatr.,383:137-141（1992）も参照。
米国特許第４９８８６７５号は、ＩＧＦ−Ｉを用いたタイプII糖尿病の処置について記載し、米国特許第５４６６６７０号は、ＩＧＦ−Ｉを用いたタイプＩ糖尿病の処置について記載し、ＷＯ９１／０３２５３は、深刻なインスリン耐性糖尿病の処置にＩＧＦ−Ｉを使用することを報告し、ＷＯ９６／０１１２４は、糖尿病の予防、糖尿病の臨床的開始の遅延、および糖尿病に対する保護効果の付与のためにＩＧＦ−Ｉを使用することを記載する。
タイプII糖尿病における選択の処置は、組み合わせ療法となった。これらの組み合わせは、歴史的に、多価形態のインスリン、短期作用インスリン、中期作用、および長期作用インスリンの使用を含む。インスリン製剤に関する論評は、KisselとVolland,Deutsche Apotheker-Zeitung,134:25（1994）およびCampbell,Pharmacy Times,59:40（1993）を含む。最近では、インスリンと、スルホニル尿素とビグアニド（biguanides）のような経口摂取される他の抗糖尿病剤との組み合わせが主流になりつつある。
ＩＧＦとインスリンの組み合わせについて、Gennら,Biochem.Arch.,5:53-59（1989）は、インスリンおよびＩＧＦ−IIの同化効果を開示する。Jacobら,Am.J.Physiol.,260:E262-268（1991）は、自発的糖尿病ＢＢ／ｗラットにおけるＩＧＦ−Ｉおよびインスリンの代謝効果について記載している；米国特許第４８７６２４２号参照。さらに、インスリンおよびＩＧＦを用いた処置後の心臓タンパク合成の刺激が、Fullerら,Biochem.Soc.Trans.,19:277S（1991）によって記載されている。この実験は、新たに単離された心筋細胞を用いてin vitroで行われた。一晩食事を与えていないイヌにインスリンとＩＧＦを処置した後のタンパク質代謝における効果が、Umplebyら,Eur.J.Clin.Invest.,24:337-344（1994）により報告されている。Shojaee-Moradieらは、イヌのグルコース代謝におけるＩＧＦ−Ｉ、インスリン、およびこれらを組み合わせた混和物の効果の比較を開示している。RandazzoとJarett,Exp.Cell Res.,190（1）:31-39（1990）は、ヒトインスリンレセプターを発現するマウス繊維芽細胞の成長の特徴、並びにそのＤＮＡ合成におけるＩＧＦ−Ｉおよびインスリンの効果について開示している。Tomasら,Diabetes,45:170-177（1996）は、糖尿病ラットにおけるＩＧＦ−Ｉおよびインスリン混和物の効果を記載している。Dungerら,Metabolism,44:119-123（1995）は、ＩＧＦ−Ｉとインスリンとの組み合わせが、青年期におけるＩＤＤＭの治療技術に付加的なアプローチを与えるかもしれないことを示唆している。Mathe,Biomedicine and Pharmacotherapy,49:221-224（1995）は、真性糖尿病を処置するためにインスリンとの関係におけるＩＧＦの役割について記載している。
特許文献については、米国特許第４９８８６７５号は、ＩＧＦ−Ｉと、タイプII糖尿病を処置する通常量よりも少量のインスリンとを組み合わせることを記載している。１９９６年１月１８日に公開されたＷＯ９６／０１１２５は、グルココルチコイドの過剰によるタンパク質異化作用の処置のために使用される、窒素出納の減少に対処し、かつタンパク合成の減少に対処するための薬剤の製造におけるインスリンとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせの使用について開示している。米国特許第５０９１１７３号は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびインスリンから選択されたＩＧＦファミリーの一つ以上の成分を含む、髪の成長を増大するのに十分な、真皮乳頭細胞の培養物から得られた、細胞を含まない上清を含む哺乳動物の皮膚または髪の局所的適用に適した組成物を開示している。
ＩＧＦ−Ｉのような、糖尿病処置のためのインスリン以外の注入可能な薬剤の使用は、最小回数の注入を行うために、糖尿病患者の所望によって自然に限定される。一日に数回のインスリンの注入が既に必要とされる療法にＩＧＦ−Ｉ注入のためにさらなる注入を付加することは、実用的ではない。さらに、ＩＧＦ−Ｉとインスリンのように二つのタンパク質を含む場合には、得られた製剤が安定かつ患者によく吸収され、長期間作用するインスリンを含むことが必要である。代謝環境の変化する要求量に応じて時間および標的組織に依存した方法で制御された長期間作用するインスリンは、Lewittら,Endocrinology,129:2254-2265（1991）によって記載されている。
現在、糖尿病患者は、ＮＰＨインスリン（長期間作用する中性のプロタミンハーゲドルン（protamine）インスリン）と正規のインスリンとを混合する。同一の注射器中において、別のバイアルからの長期作用ＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉとを混合し、直ちに混合物を注入できることが望ましい。血糖値を低下するのに最も有効であるように、通常用いられる量と同量またはそれ以上のインスリンを用いることも望ましい。
発明の要旨
従って、本発明は、薬学的に許容されるキャリアにＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンを含む非経口用組成物を提供する。好ましくは、約１から１０ｍｇのＩＧＦ−Ｉ、０．２から２ｍｇのＮＰＨインスリンが含まれ、好ましくはｐＨが約５から８、さらに好ましくは約５から６である。好ましくは、組成物中のＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンの量は、それぞれ約１から１０ｍｇ／ｍＬである。また、キャリアが酢酸塩緩衝剤およびリン酸塩緩衝剤であることが好ましく、このキャリアは、ナトリウムカウンターイオンと安定剤を含む。さらに組成物が、界面活性剤、好ましくはポリソルバート（polysorbate）またはポロキサマー（poloxamer）を含むことが好ましい。
別の態様では、本発明は、好ましくは非経口用、および好ましくは無菌の、酢酸塩緩衝剤中にＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンを含む組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、好ましくは非経口用、および好ましくは無菌の、ＮＰＨインスリン：ＩＧＦ−Ｉが１０：１から１：５０（ｗ／ｗ）の重量比であるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリン、約０．０５から０．３Ｍのオスモライト（osmolyte）、約０．１から１０ｍｇ／ｍＬの安定剤、約１から５ｍｇ／ｍＬの界面活性剤、ｐＨが約５から７、さらに好ましくは５から６の約５から１００ｍＭの緩衝剤を含む組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、有効量の上記組成物の一つを好ましくは注射または輸液のいずれかによって、哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における糖尿病のような高血糖症を処置する方法を提供する。
この発明は、ＩＧＦ−Ｉを投薬する問題に対する答を与える。利用することができる多くのインスリン製剤のなかで、一つのタイプ（ＮＰＨインスリン）だけがＩＧＦ−Ｉと混合することができたことは、予期せぬ思いがけない知見であった。さらに、ＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせの投与の予期せぬ利点は、以下に詳細に記載された実験に基づいて見いだされた。
さらに、本発明は、別個のバイアルに収容された長期間作用するＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉを同一の注射器において混合し、直ちにその混合物を注入し、通常用いられるのと同じ量のインスリンを用いることを可能にするゴールを達成するものであり、そうすることにより最も効果的に血糖を低減する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、HUMULIN（商品名）Ｒブランドインスリンの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。図１Ｂは、HUMULIN（商品名）Ｎブランドインスリンの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。図１Ｃは、ＩＧＦ−Ｉの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。
図２Ａは、HUMULIN（商品名）ＮブランドインスリンとＩＧＦ−Ｉの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。図２Ｂは、NOVOLIN（商品名）ＮブランドインスリンとＩＧＦ−Ｉの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。
図３Ａは、HUMULIN（商品名）Ｕブランドインスリンの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。図３Ｂは、HUMULIN（商品名）ＵブランドインスリンとＩＧＦ−Ｉの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。
図４Ａは、ＩＧＦ−Ｉを含まないHUMULIN（商品名）Ｌブランドインスリンの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示し、図４Ｂは、ＩＧＦ−Ｉを含まないNOVOLIN（商品名）Ｌブランドインスリンの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。
図５Ａは、ＩＧＦ−Ｉを添加したHUMULIN（商品名）Ｌブランドインスリンの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示し、図５Ｂは、ＩＧＦ−Ｉを添加したNOVOLIN（商品名）Ｌブランドインスリンの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを図示する。
図６は、対照（実線白丸）、ｒｈＩＧＦ−Ｉ（点線白丸）、ＮＰＨインスリン（白三角）、ｒｈＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンの二回に分けた注射（白四角）およびｒｈＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンの一回注射（白／黒の四角）について、時間に対するプラスマグルコース量のグラフを作成することによって、ＳＴＺ糖尿病ラットにおけるｒｈＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの皮下（ＳＣ）注射の比較を示す。
図７は、対照（白四角）、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの二回に分けた注入（白ダイヤ型）、および一回の注入（白丸）について、時間に対するプラスマグルコースのパーセント変化のグラフを作成することによって、ＳＴＺ糖尿病ラットにおけるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンＳＣの別個および一回の注入の比較を示す。
図８は、対照（白四角）、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの二回に分けた注入（白ダイヤ型）、および一回の注入（白丸）について、時間に対するプラスマインスリン量のグラフを作成することによって、ＳＴＺ糖尿病ラットにおけるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンＳＣの別個および一回の注入の比較を示す。
図９は、賦形剤（白四角）、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの二回に分けた注入（白ダイヤ型）、および一回の注入（白丸）について、時間に対するプラスマＩＧＦ−Ｉ量のグラフを作成することによって、ＳＴＺ糖尿病ラットにおけるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンＳＣの別個および一回の注入の比較を示す。
図１０は、水中のＮＰＨインスリン（白四角）、ＩＧＦ−Ｉプラセボ中のＮＰＨインスリン（白ダイヤ型）、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの一回の注入（白丸）、およびＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの二回に分けた注入（白三角）について、時間に対する血液グルコース量のグラフを作成することによって、ＳＴＺ糖尿病ラットにおける種々のＳＣ注入の比較を示す。
図１１は、水中のＮＰＨインスリン（白四角）およびＩＧＦ−Ｉプラセボ中のＮＰＨインスリン（白ダイヤ型）について、時間に対するプラスマインスリン量のグラフを作成することによって、ＳＣ注入されたＳＴＺ糖尿病ラットにおける血液インスリンに対するＩＧＦ−Ｉプラセボの効果を示す。
図１２は、水中のＮＰＨインスリン（白四角）、ＩＧＦ−Ｉプラセボ中のＮＰＨインスリン（白ダイヤ型）、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの一回の注入（白丸）、およびＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの二回に分けた注入（白三角）について、時間に対するプラスマＩＧＦ−Ｉ量のグラフを作成することによって、ＳＴＺ糖尿病ラットにおける種々のＳＣ注入の比較を示す。
図１３は、外来の糖尿病患者を４週間カウンセリングした後、ｒｈＩＧＦ−Ｉまたはプラセボのいずれかとインスリンを用いてＩＤＤＭ患者を４週間処置することを含む臨床研究計画を示す。この研究は、２週間のウォッシュアウトで終了する。
図１４は、図１３に示された研究についての、一日の平均の血糖値と後退曲線（regression curve）を示す。屈折した線と滑らかな線は、一日に４回のグルコースレベルの平均と、最適な後退曲線をそれぞれ示す。後退曲線は、予備処置期間（−３０日から０日）中は二つのグループにおいて重複するが、処置期間（０日から３０日）中は、対照と比較してｒｈＩＧＦ−Ｉ処置されたグループの後退曲線は明らかな低下を伴って分けられる。S.I.単位変換については、０．０５５５１の倍増率が用いられた。
図１５は、図１３に概説された研究の処置期間中における全ＩＧＦ−Ｉレベルを示す。ＩＧＦ−Ｉレベルは、予備処置期間中はｒｈＩＧＦ−Ｉおよびプラセボグループの両方において低いが、ｒｈＩＧＦ−Ｉの最初の注入から３時間経過後には正常レベルにまで増大し、処置期間中上昇したままであった。平均±ＳＥＭが例証されている。
図１６は、図１３に概説された研究の処置期間中における遊離したＩＧＦ−Ｉレベルを示す。遊離したＩＧＦ−Ｉレベルは、予備処置期間中はｒｈＩＧＦ−Ｉおよびプラセボグループの両方において低いが、ｒｈＩＧＦ−Ｉの最初の注入から３時間経過後には正常レベルにまで増大し、処置期間中上昇したままであった。平均±ＳＥＭが示されている。
好ましい実施態様の記載
Ａ．定義
ここで用いるように、処置の目的のための“哺乳動物”は、ヒト、飼育された動物および農場の動物、並びに動物園、スポーツ、またはペット用の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ等を含む、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。ここで好ましい哺乳動物とはヒトである。用語“未成熟”とは、周産期の年齢（例えば出産時体重が低い胎児）から、思春期までの哺乳動物を指し、後者は完全に成長する潜在性に未だ到達していないものをいう。
ここで用いるように、“ＩＧＦ−Ｉ”は、天然配列または変異形態であり、天然、合成または組み換えであろうとあらゆる起源に由来する、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび好ましくはヒトを含むあらゆる種のインスリン様成長因子を指す。動物への使用に好ましいのは、ブタを処置するにはブタＩＧＦ−Ｉ、ヒツジを処置するにはヒツジＩＧＦ−Ｉ、ウシを処置するにはウシＩＧＦ−Ｉのように、処置される特定の種のＩＧＦ−Ｉの形態である。ヒトへの使用に好ましいのは、例えば１９８７年８月５日に公開された欧州特許第２３０８６９号；１９８４年１２月１９日に公開された欧州特許第１２８７３３号；もしくは１９８８年１０月２６日に公開された欧州特許第２８８４５１号に記載された方法によって調製された、好ましくはＮ末端メチオニンのないヒト天然配列、成熟ＩＧＦ−Ｉである。より好ましくは、この天然配列ＩＧＦ−Ｉは組み換えによって産生され、臨床調査用には、Genentech,Inc.,South San Francisco,CAから入手される。
好ましいＩＧＦ−Ｉ変異体は、米国特許第５０７７２７６号；第５１６４３７０号；または第５４７０８２８号；もしくはＷＯ８７／０１０３８に記載されたもの、すなわち、成熟した分子のＮ末端の３位において少なくともグルタミン酸残基が欠失したもの、またはＮ末端の５つまでのアミノ酸残基が欠失したものである。最も好ましい変異体は、Ｎ末端から最初の３つのアミノ酸が欠失したものである（脳ＩＧＦ、ｔＩＧＦ−Ｉ、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ、またはｄｅｓ−ＩＧＦ−Ｉのように種々に設計されたもの）。
ここで用いるように、“ＮＰＨインスリン”は、天然、合成または組み換えであろうとあらゆる起源に由来する、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび好ましくはヒトを含むあらゆる種の、中性プロタミンハーゲドルンインスリン、もしくは“イソフェン”として知られるインスリンを指す。動物への使用に好ましいのは、ヒトを処置するにはヒトＮＰＨインスリンのように、処置される特定の種のＮＰＨインスリンの形態である。ヒトに使用するのに好ましいＮＰＨインスリンは、Novo-Nordiskから商品名INSULATAR^TMもしくはEli-Lillyから商品名HUMULIN N^TMとして商業的に市販されているＮＰＨインスリンである。Diabetes Mellitus-Theory and Practice,fourth edition,Harold Rifkin,MD,Ed.（Elsevier,New York,1990）,Chapter 29,およびU.S.Pharmacist,18（Nov.Suppl.）p.38-40（1993）に報告されている全てのＮＰＨインスリン薬剤が、ここでは適している。
ここで用いられているように、用語“高血糖症”は、タイプＩおよびタイプII糖尿病、並びに例えば、肥満患者のような高インスリン血症および高脂血症、およびMendenhall’s症候群、ヴェルナー症候群、妖精症、脂肪萎縮性糖尿病、および他の脂肪組織萎縮症のようなインスリン耐性糖尿病のようなあらゆる形態の糖尿病を指す。好ましい高血糖症は、特にタイプＩおよびタイプII糖尿病等の糖尿病である。“糖尿病”そのものは、インスリンの不適切な産生または利用を含む炭水化物代謝の進行性疾患を指し、高血糖と糖尿によって特徴付けられる。
ここで用いるように、用語“処置”は、治療処置および予防または予防的測定の両方を指す。処置を必要とするものは、既に疾患を有するもの、並びに罹患する傾向を有するものあるいは疾患を有すると診断されたもの、もしくは疾患が予防されるべきものを含む。連続的な処置または投与とは、一日以上の処置の中断のない、少なくとも毎日を基準とする処置を指す。間欠性の処置または投与、すなわち間欠式の処置または投与とは、連続的でないが、周期的な処置を指す。処置様式は、連続的でも間欠的であってもよいが、両方のタンパク質が共に製剤され投与される場合には連続的であることが好ましい。
ここで用いるように、用語“血糖降下薬”は、膵臓によるインスリンの分泌を引き起こす、インスリン以外の分泌促進薬、好ましくは経口試薬を指す。ヒトへの使用では、スルホニル尿素クラスの経口血糖降下薬がさらに好ましい。例としては、グリブリド、グリピジド、およびグリクラジドが含まれる。さらに、ビグアニド（biguanides）のようなインスリン感度を増大する試薬も、この定義の範囲に含まれ、好ましいものである。
Ｂ．発明を実施するための様式
ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンが組み合わされ、輸液及び注射を含む適切な方法で哺乳動物に直接投与される。投与の特定の経路は、例えばＮＰＨインスリンまたはＩＧＦ−Ｉのみを用いる場合に認められまたは予想される副作用を含む患者の医学的経歴、並びに治されるべき特定の疾患に依存する。非経口投与の例は、皮下、筋内、静脈内、動脈内および腹腔内投与を含む。最も好ましくは、投与が、連続的な輸液（浸透性ポンプまたは皮膚パッチのような遅延放出装置またはミニポンプ等を用いる）、または注射（例えば、静脈内または皮下の手段を用いる）によって行われる。好ましくは、投与は混合物の皮下注射による。投与は、一回のボーラスとして、あるいは緩開放蓄積製剤（slow-release depot formulation）によるものであってもよい。注射によるＮＰＨインスリンおよびＩＧＦ−Ｉの投与は、糖尿病を処置するための投与の好ましい形態である。
この治療に用いられるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリン組成物は、患者の臨床的条件（特にＮＰＨインスリンまたはＩＧＦ−Ｉのみで処置した場合の副作用）、ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリン組成物の輸送部位、投与方法、投与の計画および医者の知る他のファクターを考慮して、医学的に良好な方法と一致する方法で製剤及び投与される。目的のための各成分の“有効量”は、上記考慮によって決定され、哺乳動物に対する薬剤の生物学的利用能を生じ、血糖低下効果を生じる量でなければならない。
一般的な提案として、一回の投与量あたり非経口的に投与されるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンの薬学的に有効な全体量は、上述したように、治療的裁量に大きく依存するが、患者の体重のｋｇに基づいて、約１０μｇ／ｋｇ／日から２００μｇ／ｋｇ／日の範囲のＩＧＦ−Ｉ、並びに約０．５から５００単位／日のＮＰＨインスリンである。ヒトにおける糖尿病の処置で好ましくは、ＩＧＦ−Ｉの投与量は、一日に二回で約１から１０ｍｇ、さらに好ましくは一日に二回で皮下に約２０から８０μｇ／ｋｇ／注射（すなわち、約１．５から６ｍｇ）、また、ＮＰＨインスリンの投与量は、一日に二回で皮下に約５から５０単位／注射（すなわち、約０．２から２ｍｇ）である。この製剤におけるＮＰＨインスリン：ＩＧＦ−Ｉの重量比は、約１０：１から１：５０、好ましくは約１：１から１：２０、さらに好ましくは約１：１から１：１０、さらに好ましくは約１：１から１：５、そして最も好ましくは約１：１から１：３である。
注射が好ましいが、輸液装置が連続的なＳＣ輸液に用いられてもよい。静脈内バッグ溶液（intravenous bag solution）も用いられる。適切な投与量を選択する重要なファクターは、ほぼ正常域まで血糖値が減少することによって評価されたか、あるいは、医者が適切と思うような、ここで定義される糖尿病の処置を評価するための他の基準によって評価された結果である。ＮＰＨインスリン投与に関するさらなる情報は、Diabetes Mellitus-Theory and Practice,上掲,Chapters 29および30に見いだされる。
ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの組み合わせを投与するための他の実施態様では、糖尿病の処置における生物学的応答を持続させるために、インスリン投与が連続的で、かつＩＧＦ−Ｉが間欠的に哺乳動物に投与される。これは、通常、哺乳動物に最大の生物学的応答を与える期間中ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンに曝すために哺乳動物に治療に有効な量のＩＧＦ−Ｉを投与し、ＩＧＦ−Ｉが以前に投与された期間またはそれ以下の間にＩＧＦ−Ｉの投与を中断し（しかしＮＰＨインスリンは中断しない）、哺乳動物における最大の生物学的応答を得る期間にＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンに曝すために哺乳動物に治療に有効な量のＩＧＦ−Ｉを投与し（ＮＰＨインスリン投与は続けたまま）、ＩＧＦ−Ｉが以前に投与された期間またはそれ以下の間ＩＧＦ−Ｉの投与を中断し（しかしＮＰＨインスリンは中断しない）、哺乳動物において維持された生物学的応答を達成または持続するのに必要な限りＩＧＦ−Ｉの投与及び投与の中断のパターンを繰り返すことによって成し遂げられる。
また、ここで製剤は、ＩＧＦ結合タンパク質、例えば現在知られているものの一つ、すなわちＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５またはＩＧＦＢＰ−６、あるいはＩＧＦ結合複合体のＡＬＳと共に適切に投与される。このようなタンパク質は、ＩＧＦ−Ｉと分けて、あるいは複合体として投与されてもよい。ＩＧＦ−Ｉは、投与のためにレセプターまたは抗体もしくは抗体断片に結合されてもよい。ここでＩＧＦ−Ｉに好ましい結合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ３であり、これは米国特許第５２５８２８７号に記載され、かつMartinとBaxter,J.Biol.Chem.,261:8754-8760（1986）に記載されている。このグリコシル化ＩＧＦＢＰ３タンパク質は、内在性ＩＧＦのほとんどを輸送し、またＧＨによって制御される、ヒトのプラスマに見いだされた１２５−１５０Ｋｄの糖タンパク質複合体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約５３Ｋｄの酸安定成分である。
ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンを含むＩＧＦ結合タンパク質の投与は、米国特許第５１８７１５１号に記載された方法によって達成されてもよい。要約すると、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰは、約０．５：１から３：１のモル比、好ましくは約１：１で皮下ボーラス注射によって有効量が投与され、ＮＰＨインスリンは既にＩＧＦ−Ｉと共に存在する。
さらに、スルホニル尿素のような血糖降下薬の有効量と共に安定に投与される。血糖降下薬は、非経口、鼻腔内、経口または他の有効な経路を含む適切な技術によって哺乳動物に投与される。最も好ましくは、経口経路によって投与される。例えば、１．２５、２．５および５ｍｇのタブレット濃度の、Upjohnによって市販されているMICRONASE^TM Tablets（グリブリド）が、経口投与に適している。この治療におけるタイプII糖尿病に対する通常の維持量は、一般的には一日あたり約１．２５から２０ｍｇの範囲である。適当と思えば、一日に一回の投与もしくは分けて投与されてもよい［Physician’s Desk Reference,2563-2565（1995）］。処方に利用できるグリブリドをベースとするタブレットの他の例は、GLYNASE^TMブランド試薬（Upjohn）およびDIABETA^TMブランド試薬（Hoechst-Roussel）を含む。GLUCOTROL^TM（Pratt）は、５および１０ｍｇの両方の強度で利用できるグリピジド（１−シクロヘキシル−３−［ｐ−［２−（５−メチルピラジンカルボキサミド）エチル］フェニル］スルホニル］尿素）タブレットの商標であり、低血糖治療後に食事制限を必要とするタイプII糖尿病患者、または他のスルホニル尿素に対する反応をやめた患者に処方される［Physician’s Desk Reference,1902-1903（1995）］。ビグアニド（例えば、メトホルミンおよびフェンホルミン）またはトログリトゾン（troglitozone）のようなスルホニル尿素以外の他の血糖降下薬、もしくはインスリン作用に影響する他の試薬を用いてもよい。
ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンは、持続放出システムによって共に適切に投与される。持続放出組成物の適切な例は、例えばフィルムのような形のある形態をした半透性のポリマーマトリックスまたはマイクロカプセルを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号、欧州特許第５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Sidmanら,Biopolymers,22,547-556［1983］）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）（Langerら,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277（1981）,およびLanger,Chem.Tech.,12:98-105［1982］）、エチレンビニルアセタート（Langerら,上掲）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許第１３３９８８号）を含む。持続放出性ＩＧＦ−Ｉ組成物は、リポソームにエントラップされたＩＧＦ−Ｉも含む。ＩＧＦ−Ｉを含むリポソームはそれ自身周知の方法、すなわち独国特許第３２１８１２１号；Epsteinら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692（1985）;Hwangら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034（1980）;欧州特許第５２３２２号；欧州特許第３６６７６号；欧州特許第８８０４６号；欧州特許第１４３９４９；欧州特許第１４２６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４４８５０４５号および第４５４４５４５号および欧州特許第１０２３２４号で調製される。通常は、リポソームは、小さい（約２００から８００オングストローム）ユニラメラ（unilamellar）型であり、脂質含量は約３０モルパーセント以上のコレステロールであり、選択された比率は、最適なＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリン治療用に調節される。
非経口投与については、一つの実施態様において、ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンが、薬学的または非経口的に許容できるキャリア、すなわち用いられる投与量および濃度において受容者に非毒性であり、かつ製剤の他の成分と適合するキャリアと、一般的にそれぞれ所望の純度で混合されることによって、単位投与注射形態（溶液、懸濁液またはエマルジョン）に製剤化される。例えば、製剤は、酸化剤およびポリペプチドに有害であることが知られる他の化合物を含まないことが好ましい。
一般的に、製剤は、ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンを、液体キャリアまたは細かく分けられた固体キャリアもしくはこれらの両方と、一様かつ完全に接触させることによって調製される。必要であれば、産物は所望の製剤の形とされる。好ましくは、キャリアは、非経口用キャリアであり、さらに好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。このようなキャリア媒体は、水、生理食塩水、リンガー液、緩衝液、およびブドウ糖液を含む。固定油およびエチルオレアートのような非水溶性媒体もここで用いることができる。
キャリアは、等張性および化学的安定性を増幅する基質のような少量の添加剤を適切に含む。このような物質は、使用される投与量及び濃度において受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはこれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような酸化防止剤；例えばポリアルギニンまたはトリペプチドのような低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、またはアルギニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー（poloxamers）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤；および／または例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＣａＣｌ₂等の中性塩を含む。
通常、ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンは、約４．５から８のｐＨの、上記媒体中に製剤化される。一般的には、全長のＩＧＦ−Ｉは、約６．５以下のｐＨで安定であり、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉは、約３．２から５のｐＨで安定である。前述のある種の賦形剤、キャリアまたは安定剤の使用はＩＧＦ−Ｉまたはインスリン塩の形成を生じることがわかる。最終調製物は、安定な液体または凍結乾燥された固体であってもよい。
糖尿病処置に特に好ましい実施態様の一つにおいては、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンをＮＰＨインスリン：ＩＧＦ−Ｉの重量比が約１０：１から１：５０（ｗ／ｗ）となるように含み、約０．０５から０．３Ｍのオスモライト（osmolyte）、好ましくは無機塩および／または糖アルコール、約０．１から１０ｍｇ／ｍＬの少なくとも一つの安定剤、約１から５ｍｇ／ｍＬの界面活性剤、約５から１００ｍＭの緩衝剤を含み、ｐＨが約５から７、好ましくは５から６である。この組成物におけるＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンのさらに好ましい量は、各注射あたり、約１から１０ｍｇのＩＧＦ−Ｉと約０．２から２ｍｇのＮＰＨインスリンである。ＮＰＨインスリン：ＩＧＦ−Ｉのさらに好ましい重量比は、約１：１から１：２０、さらに好ましくは約１：１から１：１０、さらに好ましくは約１：１から１：５、そして最も好ましくは約１：１から１：３である。
“オスモライト”とは、緩衝液に重量オスモル濃度を付与する、等張性修飾剤または浸透圧調節剤を指す。重量オスモル濃度とは、イオンおよび非イオン化分子によって溶液に付与された全体的な浸透性の活性を指す。例としては、一般的に安全と認められた（generally regarded as safe（ＧＲＡＳ））ことが、当該技術分野において知られている、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような無機塩、マンニトール、ＰＥＧ、ポリプロピレングリコール、グリシン、スクロース、トレハロース、グリセロール、アミノ酸およびマンニトールのような糖アルコールを含む。ここで好ましいオスモライトは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
“安定剤”とは、製剤中の活性成分、すなわちＮＰＨインスリンおよびＩＧＦ−Ｉを保護するように機能するあらゆる化合物であり、それ故、相当な時間が経過しても分解または不活性化せず、それらの使用を妨げる病原体や毒素を発生させない。安定剤の例は、バクテリア、ウイルス、および真菌が製剤中で成長するのを妨げる防腐剤、酸化防止剤、または製剤の安定性を種々の方法で維持する他の化合物を含む。
例えば、第四級アンモニウム塩は、分子構造が４つの有機（通常はアルキルまたはアリール）基に結合した中央の窒素原子と負にチャージした酸性基を含む使用可能な安定剤である。これらの塩は、多くの病原性非胞子形成細菌および真菌の界面活性殺菌薬および安定剤として使用できる。例としては、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。他のタイプの安定剤は、フェノール及びベンジルアルコールのような芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、およびｍ−クレゾールを含む。ここで最も好ましい安定剤は、フェノールまたはベンジルアルコールである。
安定剤は、ＮＰＨインスリン及びＩＧＦ−Ｉ製剤の安定な液状形態に含まれるが、製剤の凍結乾燥形態には含まれない。後者の場合、安定剤は、再形成に使用される注射用静菌水（bacteriostatic water for injection（ＢＷＦＩ））中に含まれる。界面活性剤は、任意に再形成賦形剤中に存在してもよい。
“無機塩”とは、炭化水素をベースとするカチオンまたはアニオンを有しない塩である。例としては、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム等が含まれる。好ましくは、カチオンがナトリウムであり、アニオンが塩素または硫酸塩であり、最も好ましい無機塩は、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムである。
“界面活性剤”は、約４から７のｐＨにおけるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンの可溶性を増大する。例えばポリソルベート２０、６０、もしくは８０等のポリソルベート、ポロキサマー１８４または１８８等のポロキサマー、またはＧＲＡＳである当該技術分野において周知の他の物質のような、非イオン性界面活性剤が好ましい。さらに好ましくは、界面活性剤がポリソルベートまたはポロキサマー、さらに好ましくはポリソルベート、最も好ましくはポリソルベート２０である。
“緩衝剤”は、ＧＲＡＳであるあらゆる適切な緩衝剤とすることができ、ＮＰＨインスリン＋ＩＧＦ−Ｉ製剤に、一般的には約４．８から８、好ましくは約５から７、さらに好ましくは約５から６のｐＨを与え、好ましくはＩＧＦ−Ｉ製剤に約５から６、さらに好ましくは約５から５．５のｐＨを与える。例としては、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムを含むあらゆる酢酸塩である酢酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、もしくは所望の効果を有することが当該技術分野において知られた他のあらゆる緩衝剤が含まれる。最も好ましい緩衝剤は、任意にリン酸ナトリウムと組み合わせた酢酸ナトリウムである。
ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの両方を含む最も好ましい組成物は以下の通りである。すなわち、ＮＰＨインスリン：ＩＧＦ−Ｉの重量比が約１：１から１：３、約５から７ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、約０．１から３ｍｇ／ｍＬのフェノールおよび／または約６から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール、約１から３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート、約２．５から４ｍｇ／ｍＬの酢酸ナトリウム、約０．１から１ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム、ｐＨが約５．４である。
液状であれば、最終製剤は、約４週まで約２から８℃の温度で貯蔵されるのが好ましい。あるいは、製剤は、凍結乾燥され、注射用の水を用いて再構成するための粉末として提供されてもよく、これは液体製剤について記載したように貯蔵される。
治療的投与のために用いられるＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンは無菌でなければならない。無菌は、無菌濾過膜（例えば０．２ミクロンの膜）を介した濾過により容易に達成される。治療的ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリン組成物は、一般的に無菌口を具備する容器、例えば皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えた静脈の溶液バッグまたはバイアルに収容される。
ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンは、例えば密封されたアンプルまたはバイアルのような、単位または多投与容器に、水溶液または再構成用の凍結乾燥された製剤として貯蔵される。凍結乾燥された製剤の例としては、１０ｍＬのバイアルが、５ｍＬの無菌濾過１％（ｗ／ｖ）ＮＰＨインスリン水溶液で満たされ、得られた混合物が凍結乾燥される。輸液溶液は、静菌性の注射用蒸留水を用いて凍結乾燥されたＮＰＨインスリンを再構成することによって調製される。この輸液溶液は、同様に再構成されたＩＧＦ−Ｉ溶液または液状ＩＧＦ−Ｉ溶液と混合される。
ＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンの両方を含む製剤は、多くの異なる方法によって調製されうる。一つの方法は、ＮＰＨインスリンをＩＧＦ−Ｉ含有組成物（以下に記載するようにオスモライト、安定剤、および緩衝剤を含む）と混合することを含む。
ＮＰＨインスリンから分けてＩＧＦ−Ｉを投与するために、または、上述したようにＮＰＨインスリン溶液と混合するために使用できるＩＧＦ−Ｉ含有溶液は、約２から２０ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ、約２から５０ｍｇ／ｍＬのオスモライト、約１から１５ｍｇ／ｍＬの少なくとも一つの安定剤、並びに組成物のｐＨが約５から５．５となる量の緩衝剤（好ましくは酢酸塩緩衝剤、最も好ましくは酢酸ナトリウム）である。オスモライト、安定剤、および緩衝剤、並びにこれらのカテゴリー内の好ましい化合物は上述されている。任意に、上述されたタイプから選択された界面活性剤を、好ましくは約１から５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約１から３ｍｇ／ｍＬの量で含んでもよい。
好ましい実施態様では、オスモライトは約２から１０ｍｇ／ｍＬの濃度の無機塩もしくは約４０から５０ｍｇ／ｍＬの濃度の糖アルコールであり、安定剤はベンジルアルコール、フェノール、もしくはその両方であり、緩衝液は酢酸塩緩衝溶液である。さらに好ましくは、オスモライトは無機塩であり、最も好ましくは塩化ナトリウムである。
さらに好ましい製剤では、ＩＧＦ−Ｉの量が約８から１２ｍｇ／ｍＬであり、塩化ナトリウムの量が約５から６ｍｇ／ｍＬであり、安定剤は約８から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールおよび／または約２から３ｍｇ／ｍＬのフェノールであり、緩衝剤は約５０ｍＭの酢酸ナトリウムであり、ｐＨが約５．４である。この製剤において、好ましい量のＮＰＨインスリンは約１００単位／ｍＬ、すなわち約４ｍｇ／ｍＬである。薬剤の体積を変更することができ、ＮＰＨインスリンの濃度を固定することができる。任意に、製剤は、約１から３ｍｇ／ｍＬの量で界面活性剤としてポリソルベートを含む。ＮＰＨインスリンと混合する前の開始ＩＧＦ−Ｉ溶液における５０ｍＭの酢酸塩濃度は、広い範囲の混合比率でも懸濁液として低い可溶性のＮＰＨインスリンと高い可溶性のＩＧＦ−Ｉを維持するために、最終的なＩＧＦ−Ｉ／ＮＰＨインスリン混合物において最終的なｐＨが５．４から顕著に変化しないことを確実なものとする。しかしながら、両方のタンパク質の安定性の観点から、より広いｐＨ幅は約４．５から８である。
本発明に係るキットも考えられる。通常のキットは、薬学的に許容される酢酸塩緩衝剤中にＩＧＦ−Ｉを含むＩＧＦ−Ｉ製剤用の容器、好ましくはバイアル；薬学的に許容されるＮＰＨインスリンを含む容器、好ましくはバイアル、並びに、薬学的製剤を提供するために、使用者に二つの容器の内容物、すなわち二つの製剤を組み合わせるように仕向ける製品挿入紙またはラベルのような説明書を含む。好ましくは、薬学的製剤は、糖尿病を処置するためである。また、好ましくは、ＩＧＦ−Ｉを含む容器は、約５．０から５．５のｐＨの緩衝剤中に、塩化ナトリウムおよびベンジルアルコールまたはフェノール、あるいはこれらの両方をさらに含む。好ましくは、使用者は、容器の内容物、すなわち二つの製剤を、直接注射するための注射器中で混合するように指示される。
他の好ましい実施態様では、ＩＧＦ−Ｉを含む容器が、ｐＨが約５．４の約５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液中に、約８から１２ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ、約５から６ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、約８から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールまたは約２から３ｍｇ／ｍＬのフェノール、または約８から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールと約２から３ｍｇ／ｍＬのフェノールの両方を含む。さらに好ましくは、この容器はさらに約１から３ｍｇ／ｍＬのポリソルベートを含む。
本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに十分に理解される。しかしながら、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。ここに引用された全ての刊行物及び特許文献を、参照として明らかに含める。
実施例Ｉ
材料：
１）ＩＧＦ−Ｉ １０．０ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム ５．８４ｍｇ／ｍＬ
酢酸ナトリウム ５０ｍＭ、ｐＨ５．４
ベンジルアルコール ９．０ｍｇ／ｍＬ
ポリソルベート２０ ２．０ｍｇ／ｍＬ
２）ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｒ（正規のインスリンヒト注射、ＵＳＰ、組み換えＤＮＡ由来）
３）ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｎ（ＮＰＨヒトインスリン、組み換えＤＮＡ由来、イソフェン懸濁液）
４）ＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｎ（ＮＰＨヒトインスリン、組み換えＤＮＡ由来、イソフェン懸濁液）
５）ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｌ（レンテヒトインスリン、組み換えＤＮＡ由来、亜鉛懸濁液）
６）ＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｌ（レンテヒトインスリン、組み換えＤＮＡ由来、亜鉛懸濁液）
７）ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｕ（ウルトラレンテ、ヒトインスリン、組み換えＤＮＡ由来、持続型亜鉛懸濁液）
方法：
混合：
一定量のヒトインスリンを、以下の方法を用いて、等量のＩＧＦ−Ｉと混合した。
１）混合用のヒトインスリンと等量の空気を注射器に導入する。ヒトインスリンボトルに針を挿入し、空気を注入する。針を引き出す。
２）同様にＩＧＦ−Ｉボトルに空気を注入するが、針を取り出さない。
３）ボトルと注射器を逆さまにする。
４）針の先端がＩＧＦ−Ｉ中にあることを確認し、注射器に正確な量のＩＧＦ−Ｉを引き出す。
５）ボトルから針を引き抜く前に、注射器中のＩＧＦ−Ｉ量を低減させる空気泡をチェックする。もし泡が存在すれば、注射器を一直線に保持し、泡が上に浮き上がるまで横をたたく。プランジャーで空気を押し出し、正確な量を引き出す。
６）ＩＧＦ−Ｉのボトルから針を引き出し、ヒトインスリンのボトルに挿入する。ボトルと注射器を逆さにする。ボトルと注射器をしっかりと片手に握り、静かに振る（正規のヒトインスリンでは振らない）。針の先端がインスリン中にあることを確認し、ヒトインスリンの投与量を引き出す。
７）針をはずす。
ＨＰＬＣ分析用のサンプル調製：
（ａ）ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｎ、ＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｎ、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｌ、ＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｌ、並びにＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｕ
ヒトインスリンは、懸濁液を混合するために数回優しく転倒させる。約１ｍＬのサンプルがインスリン注射器に引き出される。インスリンを、遠心管に出し、３０００r.p.m.で１０分間遠心した。遠心行程は、溶液からヒトインスリン懸濁液を除去するように設計された。遠心後、ヒトインスリン懸濁液をさらに除去するために、０．２２μｍのフィルターを介してインスリンサンプルを濾過した。濾過後、以下に記載した酸性ｐＨ逆相ＨＰＬＣ法を用いて溶液を分析した。
溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸
溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
波長：２１４ｎｍ
注入量：２５μｇ／注入
カラム：ＶＹＤＡＣ（商標）Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム、４．６Ｘ２５０ｃｍ、３００Å
（ｂ）ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｒ
この溶液を、サンプル調製行程を含まない上記ＨＰＬＣ法によって分析した。
（ｃ）ＩＧＦ−Ｉ
ＩＧＦ−Ｉを、ＩＧＦ−Ｉプラセボを用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈した。この希釈サンプルを上記ＨＰＬＣ法で分析した。
（ｄ）ヒトインスリン／ＩＧＦ−Ｉ混合物
ヒトインスリンを、上記混合方法を用いてインスリン注射器中でＩＧＦ−Ｉと混合した。混合したらすぐに、混合物を遠心管に注入し、１−２秒間優しくボルテックス攪拌した。ボルテックス終了後、混合物を３０００r.p.m.で１０分間遠心し、ヒトインスリン懸濁液を除去するために０．２２μｍフィルターを介して濾過した。濾過されたサンプルを、上記の酸性ｐＨ逆相ＨＰＬＣ法で分析した。
結果：
結果を以下の表Ｉに示す。

論考：
ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｒ
ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＲとＩＧＦ−Ｉとを混合するとすぐに、溶液のｐＨは７．３から５．４に変化した（表Ｉ参照）。これはＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｒが緩衝剤で処理されていないからである。ヒトインスリンは、等電点ｐＨ（ｐＨ５．４）において最も溶けにくいため、不溶性になり混合物が濁った。約９５％の全ヒトインスリンと２５％のＩＧＦ−Ｉが沈殿した。このデータは、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｒが、ＩＧＦ−Ｉと適合しないことを示している。
ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＮとＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｎ（ＮＰＨ）
ＩＧＦ−Ｉの添加後、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｎ結晶に変化はみられなかった。図１Ａは、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｒの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムに基づいて、ヒトインスリンが４１分で溶出することを示している。図１Ｂは、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｎの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムであり、ヒトインスリンが溶液中に存在しないことを示している。ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｎ中のヒトインスリンは、不溶性結晶としてのみ存在する。これらの結晶は、遠心及び濾過によって除去された。図１Ｃは、実施例IIにおいて以下に示された製剤中のＩＧＦ−Ｉの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムであり、約９９％のＩＧＦ−Ｉが完全であり、酸化されてなく、２２分で溶出することを示してる。
図２Ａおよび２Ｂは、それぞれＩＧＦ−Ｉと組み合わせた場合の、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＮとＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｎの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを示す。ＩＧＦ−Ｉの添加後、ヒトインスリンは結晶性のままである。ヒトインスリンはこの溶液中には全く存在しなかった。ＩＧＦ−Ｉのピークエリアおよび形状は、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＮまたはＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｎの混合物中において変化しないままであった。
ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｕ（ウルトラレンテ）
ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｕ結晶の大きさ及び形状は、ＩＧＦ−Ｉの添加により影響を受けないようであった。図３Ａは、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｕの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムである。ヒトインスリンは結晶として存在するので、ヒトインスリンは逆相クロマトグラフィーによって溶液中に検出されなかった。図３Ｂは、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＵとＩＧＦ−Ｉの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを示す。ＩＧＦ−Ｉの添加後、全ヒトインスリンの約０．７％が、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｕ結晶から放出された。ＩＧＦ−Ｉのピーク形状は、わずかに変化したが、ＩＧＦ−Ｉのピークエリアは変わらなかった。
ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＬとＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｌ（レンテ）
ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）Ｌは、３０％無晶性および７０％結晶性ヒトインスリンである。無晶性または結晶性ヒトインスリンの大きさおよび形状は、ＩＧＦ−Ｉの添加によって変化しないようであった。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれＩＧＦ−Ｉを含まないＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＬとＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｌの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを示す。ヒトインスリンは、不溶性の無晶性または結晶性形態として存在するため、遠心および濾過によって除去された。ヒトインスリンは全く検出されなかった。図５Ａおよび５Ｂは、それぞれＩＧＦ−Ｉをさらに含むＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＬとＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｌの酸性ｐＨ逆相クロマトグラムを示す。ＩＧＦ−Ｉの添加後、全ヒトインスリンの約４．８％が溶液中に放出された。ＩＧＦ−Ｉのピークエリアは変化しなかったが、ピーク形状はわずかに変化した。
結論
このデータは、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）ＮとＮＯＶＯＬＩＮ（商標）Ｎのみが、ＩＧＦ−Ｉと完全に適合することを示した。
実施例II
これらの実験の目的は、糖尿病ラットへの皮下注射（ＳＣ）として組み合わせて注射された場合の、ｒｈＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの、血糖値、プラスマインスリン、およびプラスマＩＧＦ−Ｉ濃度に対する効果を調べることである。これらの実験では、組み換えヒトＩＧＦ−ＩおよびＮＰＨインスリンは、一つの溶液として混合されＳＣ注射によって投与され、一回の注射または二つの異なる部位に二回に分けて投与された。
方法
腹腔内（ＩＰ）にクエン酸緩衝剤中の
ストレプトゾトシン（Streptozotocin（ＳＴＺ））麻酔（７５ｍｇ／ｋｇ） ０日目
糖尿病ラットのカニューレ挿入 ５日目
研究１ ７日目
研究２ ９日日
方法
動物／外科学
４７−８週齢のオスのＳＤラットをCharles River Laboratoriesから入手し、一日後にＳＴＺを７５ｍｇ／ｋｇ ＩＰで注入した。５日後に、尾の静脈から採血し、血清を得て、グルコース濃度を測定した。血糖値が＜２００ｍｇ／ｄＬのラットは糖尿病でないと見なし、研究からはずした。残りの動物に以下の方法でカニューレ挿入した。すなわち、ラットを麻酔し（ＫＥＴＡＭＩＮＥ^TM、６５ｍｇ／ｋｇ、およびＸＹＬＡＺＩＮＥ^TM、１２．５ｍｇ／ｋｇ ＩＰ）、剃毛された外科的部位を７０％イソプロピルアルコールと、ついでベタジン（betadine）溶液を用いて調製した。右の頸静脈を小さいＳＣ切開を介して単離し、０．０２インチｘ０．０３７インチの斜めに切れたゴム状の先端部を有するカニューレを用いてカニューレ挿入した。カニューレを洗い流し、４−０シルク縫合糸を用いて傷を塞ぐ前にヘパリン（１０Ｕ／ｍＬ）を用いて開通性をチェックした。回復用の暖められたパッド上に動物を置く直前に、カニューレを、〜５０μｌヘパリン（１００Ｕ／ｍＬ）を用いて“ヘパリンロック”した。ラットが、歩き回る場合には飼育用のカゴに入れた。
カニューレは、開通性を維持するために、新鮮なヘパリン／生理食塩水で毎日洗い流された。カニューレ挿入から２日後、研究１（以下参照）を行い、二日後に研究２を行った。これらの研究に関して、カニューレに接続しているピンを引き抜いた後に、ヘパリン／生理食塩水で満たされた１２インチのＰＥ４０ポリエチレンチューブの延長チューブをカニューレに取り付けた。このチューブを注射器に接続し、実験の間中、動物に取り付けたままにした。採血した後に、血液量を維持するために等量の生理食塩水をカニューレを介して注射した。以下の時に採血した。
−１０分、
０分、
次いで以下に示す溶液を注射し、
１０、２０、４０、６０分後、２、３、４、６時間後に再度採血した。
各研究において、各グループ当たり４または５匹とした。データは、ダンカン試験（Duncan’s Test）により比較して、平均±ＳＥＭである。統計学的に意味のある結果は、ｐ＜０．０５である場合に評価した。
研究１
実験設計は以下の通りである。

研究２
実験設計は以下の通りである。

使用した化合物
１）ｒｈＩＧＦ−Ｉ（Genentech Inc,lot#G117AZ/A9841AX）１０ｍｇ／ｍＬ ＩＧＦ−Ｉプラセボで１：２に希釈。ｒｈＩＧＦ−Ｉは、１０ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ、５．８４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、９．０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール、２．０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４からなる。意図された最終産物構成は、１０ｍＬグラスバイアル中に７ｍＬ（７０ｍｇ）の上記溶液を含み、その有効期間を最大限にするために一般的には冷蔵貯蔵（２−８℃）される。この製造物は、通常の針と注射器を用いた皮下または静脈内投与用の使用可能な液体として設計される。
２）ＩＧＦ−Ｉプラセボ（ｐＨ５．４の酢酸ナトリウム緩衝剤）＝５ｍｇ／ｍＬ：１００μＬ＝５００μｇ
３）ＮＰＨインスリン（HUMULIN^TMN,Eli Lilly,Lot#9MF78M）１００Ｕ／ｍＬ
無菌水で１：２に希釈＝５０Ｕ／ｍＬ：１００μＬ＝５Ｕ
４）無菌水
測定方法
プラスマグルコース濃度を、Ｃｈｅｍ１Ａ血清化学分析器（Miles laboratories,Tarrytown,NY）を用いて測定した。プラスマ中のインスリンは、ラット特異的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Linco Research Inc.,St.Charles,MO.）で測定した。プラスマＩＧＦ−Ｉは、サンプルの酸−エタノール抽出後にＲＩＡによって測定した。
結果
研究１
ラットの糖尿病の状態が、動物の血糖値（４００ｍｇ／１００ｍＬ）によって示されている（図６）。賦形剤が注入された対照群と比較して、全ての処置がプラスマグルコースレベルの顕著な低下を引き起こした。最初のグルコース反応において各グループ間に明確な差があった。一回の注入組み合わせグループ（ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンで処置）は、他のグループのいずれと比べても、注入後１０および２０分において、実質的に低いプラスマグルコースレベルを備えていた。注入から２０分後の血液グルコースレベルは、プラセボ４０９．５±６６．５；ｒｈＩＧＦ−Ｉ２１８．３±３８．１；ＮＰＨインスリン２４０．３±２４．１；二回に分けた注入２４０．３±６１．３；一回の注入１５１．０±１７．９ｍｇ％であった。ＩＧＦ−Ｉ処置されたラットの血糖値は、６時間後には基本値に戻ったが、ＮＰＨインスリンのみ、またはＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉの混合物を与えたラットでは、６時間後でさえも、血糖値は顕著に抑制されたままであった。
研究２
第二の研究では、濃度と注入量が、研究１の一回注入組み合わせグループと２回注入組み合わせグループとの差異のファクターであるかどうかを調べるために、投与量が調節された。それゆえ、二回の注入組み合わせグループにおいて、動物はＮＰＨインスリンとｒｈＩＧＦ−Ｉをそれぞれ１００μｌ投与された（半分の濃度かつ２倍の注入量であるが、研究１と同じ投与量）。一回の注入グループでは、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの両方を含む１００μＬの溶液が注入された。この研究は、他の全ての点において研究１と同一である。
全ての処置がプラスマグルコースレベルにおいて顕著な低減を示した。しかしながら、一回の注入グループは、注入からわずか１０分後（プラセボ３８０±２１．３；二回に分けた注入３８８±１３．３；一回の注入３３２±１４．８ｍｇ％）および２０分後（プラセボ４４５．３±１７．６；二回に分けた注入２７５．４±２５．３；一回の注入２１６．８±１９．５ｍｇ％）にさえプラスマグルコースレベルを実質的に低減した。この低減も、相対的なパーセント変化ベースにおいて顕著であった。それゆえ、注入量または濃度は、分離注入および一回の注入グループの間の差異の原因ではないようである。
血液中のインスリンおよびＩＧＦ−Ｉレベル
ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの組み合わせの共注入が、より早い低血糖の開始を引き起こす原因を調べるために、血液中のインスリンとＩＧＦ−Ｉ濃度を測定した。
図８は、プラスマインスリンへの顕著な処置効果があることを示す。投与から４０分で、一回の注入組み合わせは、分けて注入したグループと比較してプラスマインスリンを約２倍に増大させた（プラセボ１．１５±．４５、二回に分けた注入６３．０±１２．２、一回の注入１１２．８±２１．０ｎｇ／ｍＬ；二回に分けた注入に対してｐ＜０．０５）。図９は、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンの共輸送後、またはそれらを分けて注入した後の血清ＩＧＦ−Ｉ濃度を示す。血清ＩＧＦ−Ｉ濃度は、注入後２０分において、分けて注したグループより一回の注入組み合わせ処置グループにおいて顕著に高かった。それゆえ、ＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉの共製剤（co-formulation）は、製剤が分けて注入された場合よりも高い効力を与え、この増大された効力は、血液中のインスリン、そしておそらく血液中のＩＧＦ−Ｉがより急速に出現することと関連がある。
グルコースデータと組み合わせられた研究１および２
グルコースデータを組み合わせた場合には、注入後１０および２０分に、処置法において顕著な差異がみられた。一回の注入処置は、プラスマグルコースにおいて、より急速な減少を引き起こし、これは統計学的に注入後１０分で顕著であった（プラセボ３６５．７±１８．６ｍｇ／ｄＬ、二回に分けた注入３６８．７±１７．３ｍｇ／ｄＬ、一回の注入３１１．８±１２．４ｍｇ／ｄＬ）。
研究３
糖尿病ラットにおけるこの実験は、以下のことを調べるように設計された。
１）ＩＧＦ−Ｉプラセボそのものが、ＮＰＨインスリンの効力および吸収に影響するか。
２）研究１および２に用いた以外のＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉの投与量において、共輸送の効果が認められるか。
実験設計は以下の通りである。

全ての方法および行程は、研究１および２で用いたものと同一である。
対照のパーセントとして表された、この研究の注入後最初の１時間の血液グルコースデータが、図１０に示されている。ＩＧＦ−Ｉ緩衝剤にＮＰＨインスリンを混合すると（グループ２）、水にＮＰＨインスリンを混合した場合（グループ１）よりも、血糖値に優れた効果を与える傾向がある。これは、ＮＰＨインスリンの吸収におけるＩＧＦ−Ｉ緩衝剤の直接的な効果を示唆している。
インスリンの測定（図１１）により、ＩＧＦ−ＩプラセボにＮＰＨインスリンを希釈すると、水で希釈した場合より、インスリン吸収を増大することが確認された。図８と１１の比較は、ＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉとの共混合のインスリン吸収における効果（図８）が、ＮＰＨインスリンにＩＧＦ−Ｉの製剤緩衝剤を添加することによって繰り返されたことを示す。何らかの一つの理論に限定されることなく、図８に示された、より急速なインスリンの吸収は、ＩＧＦ−Ｉの存在によるものでなく、ＩＧＦ−Ｉを溶解するために用いられた製剤緩衝剤によるものであると思われる。この実験におけるＩＧＦ−Ｉ濃度の測定（図１２）は、ＩＧＦ−Ｉの吸収が、ＮＰＨインスリンと共混合されることによって影響されないことを示した。
結局のところ、このように少量のＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉにおいては、研究１および２におけるインスリン吸収に見られる効果は、研究３において繰り返された。さらに、ＩＧＦ−Ｉ自身がインスリン吸収の増大に必須なのではなく、ＩＧＦ−Ｉプラセボがそれ自身で血液インスリン濃度をさらに急速に増大させることが見いだされた。
概要
これらの研究は、ＮＰＨインスリンとＩＧＦ−Ｉの共製剤が、予期せぬことに、より低いグルコースレベルを導くことを示した。これは、患者が自分で投与しなければならない注射回数が減少するので、糖尿病患者の処置に有利である。ＩＧＦ−Ｉとインスリンを共注入することができる唯一の手段は、ＮＰＨインスリンを用いる手段である。好ましい輸送方法は、この製剤がＮＰＨインスリンのさらに急速な吸収を可能にするように、ＩＧＦ−Ｉ酢酸塩緩衝製剤を用いる。インスリンのさらに急速な吸収は、インスリン投与に関する現在の方法を越えた利点を有する。
ＮＰＨインスリンは、一晩中インスリンの濃度を維持するために一般には夕方に投与される、インスリンの比較的長期間作用する形態である。夕食の前に、短期間作用するインスリンの注入に加えて投与されるのが通例である。本発明は、ＮＰＨインスリンがＩＧＦ−Ｉと共に投与された場合に、一部のインスリンの急速な放出が起こる利点を開示する。それゆえ、例えば、糖尿病患者が二回の注射、就寝時のＮＰＨインスリンおよび夕食前の正規のインスリンを投与される代わりに、本発明は、夕食前にＩＧＦ−Ｉ／ＮＰＨインスリンを一回注入すればよい。それゆえ、注射回数を低減することができる。
従って、本発明の多様な利点が存在することが明白である。これらの利点は、より少ない回数のインスリンとｒｈＩＧＦ−Ｉの注射の使用、より少ないインスリンの注射の使用、およびＮＰＨインスリンの変更された薬物動力学を含む。
実施例III
ＩＤＤＭ患者の部分母集団におけるｒｈＩＧＦ−Ｉ／インスリン組み合わせ治療の長期的な効果を評価する、よく制御された臨床試験は存在し得ないと思われる。それゆえ、二重のホルモン置換例がインスリン単独の治療より優れているか否かを調べるために、４週間、無作為化、プラセボ調節、二重盲検試験を行った。ｒｈＩＧＦ−Ｉとインスリンの血糖の調節が、単独治療としてインスリンで処置されたグループと比較および対比された。患者は、ＩＤＤＭを有する子供と青年の両方であった。この研究は、請求の範囲に記載されているようにＩＧＦ−Ｉとインスリンを含む製剤を患者に与えるのではなく、むしろ分けて注入した場合に、この示唆の臨床的背景において典型的な投与を示唆する。
方法：
ＩＤＤＭを有する、８−１７歳の４３人の患者（男性２２人と女性２１人）を３つの大学の糖尿病診療所で採用した。適格基準は以下の通りである。
１．８歳以上
２．ＩＤＤＭ期間≧６ヶ月
３．診療所で診断されたＩＤＤＭ患者の平均グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ₁）以上のＨｂＡ₁で定義された、最適以下の代謝調節。これは、研究開始前４ヶ月以内の２回の最小値に基づいて、各試験所によって決められる（DukeとPhiladelphia HbA_1cはそれぞれ≧８．４％と８．２％；Buffalo HbA₁≧１０．４）。
４．少なくとも６ヶ月間正規およびＮＰＨインスリンの一日２回の注入。関係する医学的状態（置換療法における自己免疫性甲状腺炎を除く）、糖尿病合併症の生化学的および／または臨床的証拠、インスリンまたはＬ−チロキシン以外の薬剤の使用は、除外基準である。精神医学上の疾患、エタノールの乱用、ガンまたは他の実験試薬／手法の最近の使用（研究開始の３０日以内）の経歴のある患者も除外する。この研究は、各機関のInstitutional Review Boardによって認可された。患者および／または親の一人が、インフォームドコンセントにサインした。
研究設計
この研究設計は、４週間の導入期間、４週間の処置期間、並びに２週間の洗浄期間を含む（図１３）。この研究の間、患者は、一日に正規およびＮＰＨインスリンの二回の注入を受け続けた。研究開始時に、患者は、家庭用血液グルコース（ＢＧ）モニタリング技術について詳細な説明を受けた。患者は、朝食、昼食、夕食および夕方の間食の前、並びに症候性低血糖のときはいつでもＢＧを調べるように指導を受けた。グルコースの値はメーター（One Touch II-Lifescan Inc.,Milpitas,CA）に自動的に蓄えられ、診療訪問時に研究部のパソコンに電気的に移される。導入期間に、患者は一般的な糖尿病のケアと食事管理について相談を毎週受ける（−２８日と−１４日に診療所で、−２１日と−７日に電話で）。この期間に、患者は血糖制御について特定の目標を与えられ、インスリン調節に関する援助が必要なときは研究部に電話するように指導された。
導入期間の最後に、朝のインスリン注入の直前にさらなる注入としてｒｈＩＧＦ−Ｉまたはプラセボのいずれかを投与するために無作為化した。患者は、導入期間の−２８日におけるグリコシル化ヘモグロビンの値とタナー段階とに基づいて階層化された適応性のある無作為化方法を用いて分けられた。導入期間の−１日目と処置期間の１日目の間に７日のウィンドウ期間を設けた。処置の１日目の前の午後に患者は病院に収容され、通常のインスリン投与量と食事を与えられた。１日目に、IVカニューレが遠位の前腕または肘前の窩に挿入された。一回の投与量のｒｈＩＧＦ−Ｉ（８０μｇ／ｋｇ）またはプラセボがＳＣに投与され、その後にＳＣインスリン注入および朝食が与えられた。朝にＩＧＦ−Ｉを投与するのは、安全の理由のためである。１日目に、低血糖の発生に対する警戒として、両方のグループにおいて、１／３までａ．ｍ．の正規のインスリン投与量を低減した。次の３時間に１５分ごとに将来のアッセイ用に採血した。患者は、最初の３時間の採血後に、活発に運動するように励まされた。処置の３または４日目に病院から解放された。処置の５日目に患者と電話で接触し、７、１４、２１および２８日目に外来患者として診察を受け、１４日後に投与を中止した。患者は、追跡面会で食事および糖尿病の管理について指導された。
４週間の処置期間中、ｒｈＩＧＦ−Ｉおよびプラセボの投与量は一定のままであった（８０μｇ／ｋｇ ＳＣ ｑ ａ．ｍ．）。しかしながら、インスリン投与量は、以下の目標ＢＧを達成するように調節された：すなわち、空腹時性血糖（ＦＢＧ）が、１２歳以上に対しては８０−１２０ｍｇ／ｄｌ（４．４−６．７ｍｍｏｌ／Ｌ）かつ１２歳未満に対しては８０−１４０ｍｇ／ｄＬ（４．４−７．８ｍｍｏｌ／Ｌ）であり；他の場合には８０−１８０ｍｇ／ｄＬ（４．４−１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ）である。診察は、導入期間の−２８日目、処置期間の１、７、２１および２８日目、洗浄期間の１４日目に行われた。処置期間の後には２週間の洗浄期間があり、その期間には、患者はインスリン治療のみを受け、投与量の調節が血糖の目標を達成するように続けられた。
研究機関の評価
表IIは、研究中になされた研究機関の評価をまとめたものである。

血糖調節の指標
血糖調節の主な指標は、１）ＨｂＡ₁が導入の−２８日目、並びに処置の１日目および２８日目に測定された；２）導入期間の最後の１０日間の、一日４回の家庭でのグルコースモニタリングの値の平均と処置の最後の１０日間の値とを比較した。グリコシル化ヘモグロビンを、アフィニティークロマトグラフィーでアッセイした（SmithKline Beecham Clinical Laboratories）。参照範囲は、４．４−６．１％であった。
成長ホルモン／ＩＧＦ−Ｉ軸
ＧＨ、ＩＧＦ−Ｉ、遊離ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−３のプラスマレベルを測定した。プラスマＩＧＦ−Ｉレベルは、処置の１日目の研究試薬投与前、投与後３時間の３０分ごと、並びに処置の７、１４、２１および２８日に研究試薬投与後２−４時間に調べられた。全プラスマＩＧＦ−Ｉ濃度は、Liebermanら、上掲によって記載された酸エタノール抽出後のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって調べられた。プラスマ中の遊離のＩＧＦ−Ｉは、ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷカラムと０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．５％Tween-20、ｐＨ６．５の移動相とを有するゲルろ過ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いて、結合タンパク質に結合したＩＧＦ−Ｉから分離した。クロマトグラフィー後のＩＧＦ−Ｉレベルの測定は、７．０％と１９％のＩＧＦ−Ｉ濃度（抽出＋ＲＩＡ）を示した。遊離のＩＧＦ−Ｉ濃度（ＳＥ−ＨＰＬＣ＋ＲＩＡ）は、１００ｎｇ／ｍＬで１７％の変化の内部アッセイ係数を有する。Liebermanら、上掲。
安全性の検査室測定
主な安全性検査室評価は、血清生化学および甲状腺プロフィール、ＣＢＣ、検尿、２４時間尿アルブミン排出速度およびクレアチニンクリアランスである。低血糖は、症候学に関わりなく、５０ｍｇ／ｄＬ以下のＢＧレベルによって定義される。低血糖に関するこの定義は、統計学的分析の目的に用いられた。
患者の投薬中止
プロトコルに従って、研究中に患者が５回以上の注射または１４回以上のＢＧ測定をしなかった場合には、その患者の研究を中止した。
統計学的方法
少なくとも二週の後無作為化データを有する患者が、分析に含められた。早期に中止したものの、少なくとも２週間分の処置期間のデータを有する患者については、最後の利用できるデータ値が２８日まで行われ、分析に用いられた。データは、各グループにつき平均±ＳＥでまとめられた。連続的な変数に対してはウィルコキソンランク総和試験（the Wilcoxon rank sum test）、不連続のデータに対してはフィッシャーの直接確率検定を用いて、二つのグループの比較を行った。全ての試験は両側検定であり、０．０５以下のｐ値が統計学的に重要であると認識された。
結果：
基準的特徴
表IIIに示されているように、ｒｈＩＧＦ−Ｉとプラセボグループの患者の基準人口統計学的特徴は類似している。プラセボの２１人の患者のうちの４人と、ｒｈＩＧＦ−Ｉグループの２２人中の４人は思春期前であった。

患者の処分
４人の患者が研究を早期に中止した。処置の６日目に患者の要求に応じてプラセボグループにおいて一人が中断した。ｒｈＩＧＦ−Ｉグループにおいて三人の患者が早期に中断した。一人の患者は、処置の１日目に研究薬剤投与後４時間で、低血糖と無関係な失神のエピソードを示した。この患者は、再発性の中耳炎のために抗生物質治療中であったが、これが結果に関連するか否かは確かではない。第二の患者は、導入期間に不規則なＢＧレベルを示し、処置期間に改善を示したが、正規のインスリン投与量を低減することによって適切に補償され得ない顕著な低血糖を示した。第三の患者は、ＢＧモニタリングに従わないために、導入期間の最後に中止した。
血糖調節
導入期間の最後の１０日間（−１９から−２８日目）の一日の平均ＢＧレベルと比較した処置の最後の１０日間（１９から２８日目）の平均ＢＧ値が表IVに示されている。ｒｈＩＧＦ−Ｉグループに観察された血糖調節における全体的な改良は、プラセボグループと比較して、朝食、昼食および就寝前の、低い血糖値によるものである。図１４に示されているように、血糖プロフィールは、プラセボグループと比較してｒｈＩＧＦ−Ｉグループにおいて処置期間を通じて改善された。両方のグループにおいて、４週間の導入期間にＨｂＡ₁（プラセボグループでは１％より大きい）においてある程度の減少があった（１１．５±１．３％から１１．４±１．４％、プラセボ；１２．４±３．２％から１１．２±１．７％、ｒｈＩＧＦ−Ｉ）。しかしながら、処置期間中は、ＨｂＡ₁は、プラセボグループに比較してｒｈＩＧＦ−Ｉにおいてさらに減少した（１．８±１．２５％に対して１．３±１．６％の平均減少率）。

インスリン使用
正規およびＮＰＨインスリンの使用を、別個に評価した。正規およびＮＰＨインスリンのインスリン投与量を、単位／ｋｇ／１０日として規格化した。導入期間の最後の１０日間は、正規のインスリン（０．２７±０．１０プラセボ；０．２７±０．１０ｒｈＩＧＦ−Ｉ）またはＮＰＨインスリン（０．７７±０．１９プラセボ；０．６６±０．１３ｒｈＩＧＦ−Ｉ）のいずれかについて、体重のｋｇ当たり一日に用いられるインスリン単位の平均数には、プラセボとｒｈＩＧＦ−Ｉグループとの間に差異はなかった。対照的に、処置期間中は、ｒｈＩＧＦ−Ｉグループに用いられた正規のインスリンの平均量は、顕著に低かった（０．２８±０．１０に対して０．２０±０．１０；ｐ＜０．０５）。ｋｇ体重当たりに用いられるＮＰＨ単位の平均数も、プラセボに対してｒｈＩＧＦ−Ｉを投与された患者の処置の間は低かった（０．８０±０．２３プラセボ；０．６５±０．１４ｒｈＩＧＦ−Ｉ）。
ホルモンレベル
図１５は、処置の１日目、並びに処置期間の７、１４、２１、および２８日目の薬物投与後２−４時間における薬物動力学的研究中の全ＩＧＦ−Ｉレベルを示す。プラセボグループの平均ＩＧＦ−Ｉレベルは、研究中１５０から２００ｎｇ／ｍＬの間（１９．６−２６ｎｍｏｌ／Ｌ）を変動した。処置の１日目のｒｈＩＧＦ−Ｉグループにおいて、低い基準のＩＧＦ−Ｉレベル（１３７±５１ｎｇ／ｍＬ；１７．９±６．７ｎｍｏｌ／Ｌ）が、最初のｒｈＩＧＦ−Ｉ注入後２時間で中間の正常な範囲（３１５±７２ｎｇ／ｍＬ；４１．２±９．４ｎｍｏｌ／Ｌ）まで上昇した。ＩＧＦ−Ｉは、処置期間中、中間の正常な範囲（３４０−４４０ｎｇ／ｍＬ；４４−５７ｎｍｏｌ／Ｌ）のままであった。
図１６に示すように、処置後に遊離ＩＧＦ−Ｉレベルも上昇した。ｒｈＩＧＦ−Ｉ注入後２−４時間に測定された平均遊離ＩＧＦ−Ｉレベルは、１日目では高かったが、研究中に上昇したままであった。ｒｈＩＧＦ−Ｉ処置グループの全ての値が、対応するタナー段階プラセボグループに観察される値よりも高かった（ｐ＜０．０１）。ｒｈＩＧＦ−Ｉグループにおいて観察された遊離ＩＧＦ−Ｉレベルは、２０人の思春期前の対照（１１．４±１０．３ｎｇ／ｍＬ）とタナー段階２−４の青年期の１９人（１４．５±１２．３ｎｇ／ｍＬ）を含む、健康的な甲状腺機能正常対照（euthyroid controls）のグループで測定された値（平均±ＳＤ）に類似していた。Quattrinら、“Low Plasma-Free IGF-I Levels in IDDM:Additional Evidence for a Bi-hormonal Defect in Diabetes,”ADA-San Francisco,CA,June 8,18のthe 56th Scientific Sessionsへのプレゼンテーション；Quattrinら,Diabetes,45 Suppl.2:53（１９９６年５月）。
安全性評価
失神エピソード（上述）を示した一人の患者を除いて、かなりの頻度で報告された唯一顕著な不利の症状は、低血糖であった。２の中央低血糖エピソードは、導入期間の両方のグループで類似していた。それは、処置期間中、ｒｈＩＧＦ−Ｉ対プラセボグループにいて顕著に増大した（６対３、ｐ＜０．０５）。しかしながら、研究週ごとに評価すると、低血糖の総数の増大は、処置の第一週目においてのみｒｈＩＧＦ−Ｉグループにおいて顕著に高かった（１．６±１．４対０．９±１．６、ｐ＜０．０５）。一日のうちの時間について見れば、低血糖エピソードの中央値は、処置期間全体を通じて、朝食前および昼食前にのみプラセボに対してｒｈＩＧＦ−Ｉにおいて顕著に高かった（ｐ＜０．０５）。処置の２８日目においては、低血糖の数とＨｂＡ₁またはプラスマＩＧＦ−Ｉレベルとの間には何ら関係がなかった。
生物化学、脂質、および甲状腺プロフィールは、導入期間の最初の時点で正常であり、研究期間を通じて正常の限界範囲内であった。ｒｈＩＧＦ−Ｉグループ中の全体的に改善された血糖プロフィールは、２８日までの体重の顕著な増大を伴わなかった（プラセボグループにおいて５２±１３ｋｇから５３±１３ｋｇ、ｒｈＩＧＦ−Ｉグループにおいて５４±１６ｋｇから５５±１７ｋｇ）。
論考：
この実験は、ＩＤＤＭ患者におけるプラセボ調節試験が、ＩＧＦ−Ｉとインスリンを用いた長期の二重ホルモン置換療法がインスリンのみより優れた血糖調節を安全に行えることを証明することを示した。さらに、改善された制御は、顕著に少ないインスリン使用量で達成された。血糖調節における長期の改善は、明らかに改善された臨床的結果に結びつけられ（DCCT Research Group,上掲）、この知見は、ＩＤＤＭのさらなる処置と主な関係を有する。
ピークＩＧＦ−Ｉ濃度はＳＣ注入後２−３時間で生じることから、この研究で観察された持続性急性血糖降下効果は、ｒｈＩＧＦ−Ｉ補給がグルコース制御に独自に寄与することを示唆している。これは、両方のグループの全ての患者が、グルコース目標を達成するのに必要なだけのインスリンを用いることを承認および推奨されるが、ｒｈＩＧＦ−Ｉの付随的投与が顕著に低いインスリン投与量と関連してより優れた全体的な血糖調節を生じたという事実によってさらに支持される。
ｒｈＩＧＦ−Ｉとプラセボグループの両方に研究中に見られた唯一の顕著な不利の出来事は、低血糖であった。このエピソードは、早朝および朝遅くに最も普通に見られた。重要なことに、深刻なエピソードは全くなく、これらの全ての症状は炭水化物の経口投与で解決された。今回の研究では、低血糖頻度における真の増大を低血糖の自覚における増大から分けるための技術または設計は含まれなかった。報告された増加した数の低血糖は、Kerrら,American Diabetes Association（上掲）に先に記載されたように、ｒｈＩＧＦ−Ｉ投与後に増大した低血糖の認識に副次的である可能性がある。静脈内へのｒｈＩＧＦ−Ｉ投与中には、上述した深刻な不利の症状は全く観察されなかった。低い脱退率（９．３％）とわずか二人の患者だけが研究の中止を要求したという事実が、４週間の試験中のさらなる安全性および不利な影響の低い発生率を示している。
Boulwareら（上掲）の知見とは対照的に、研究中に、顕著な生化学的異常は全く観察されなかった。また、Gulerら,Acta paediatr.Scand.,367（上掲）に記載されているように、ｒｈＩＧＦ−Ｉが、トリグリセリドおよび高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロールに対する全コレステロールの比率を低減することは確認されなかった。脂質プロフィールは、試験に入る前のほとんどの患者にとって正常域内またはその近傍であった（１日目平均コレステロール１７２±３２ｍｇ／ｋＬまたは４．５±０．８ｍｍｏｌ／Ｌ）。ｒｈＩＧＦ−Ｉの脂質改善効果は、処置の前、種々の投与量レベルまたは治療中に、さらに実質的な異常を有する患者においてさらによく証明されるかもしれない。
結論として、これらの結果は、ＩＧＦ−Ｉ／インスリン組み合わせ治療が、インスリン治療のみを越えて明瞭かつ独特な利益を提供しうることを示唆している。この試験は、一日一回朝に投与された耐容量のみを用いたので、高い投与量、より頻繁な投与、および／または投与を夕方に移すことにより、さらに優れた血糖調節が可能になるかもしれない。

Claims (15)

1. 非経口に許容されるキャリアに、１から１０ｍｇの量のＩＧＦ−Ｉおよび０．２から２ｍｇの量のＮＰＨインスリンを含む、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンを含む非経口用組成物。
2. キャリアが酢酸塩緩衝剤である、請求項１記載の組成物。
3. ｐＨが５から６の酢酸塩緩衝剤中に、塩化ナトリウム、およびベンジルアルコールまたはフェノールをさらに含む、請求項１記載の組成物。
4. 組成物中のＮＰＨインスリン：ＩＧＦ−Ｉの重量比が、１０：１から１：５０の範囲である、請求項１記載の組成物。
5. ｐＨが４．５から８の酢酸塩緩衝剤中に、ＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリンとを含む組成物。
6. ＮＰＨインスリン：ＩＧＦ−Ｉの重量比が１０：１から１：５０（ｗ／ｗ）であるＩＧＦ−ＩとＮＰＨインスリン、０．０５から０．３Ｍのオスモライト、０．１から１０ｍｇ／ｍＬの安定剤、５から１００ｍＭのｐＨが５から７である酢酸塩緩衝剤を含む組成物。
7. ２から２０ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ、２から５０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１から１５ｍｇ／ｍＬの安定剤、およびｐＨが５から５．５の緩衝剤を含むＩＧＦ−Ｉ製剤とＮＰＨインスリンとを混合することを含む、請求項１記載の組成物の調製方法。
8. ＩＧＦ−Ｉ製剤が、８から１２ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ、５から６ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、８から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールまたは２から３ｍｇ／ｍＬのフェノール、もしくは８から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールと２から３ｍｇ／ｍＬのフェノールの両方からなる安定剤、並びにｐＨが５．４の５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液を含み、ＮＰＨインスリンが４ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項７記載の方法。
9. ＩＧＦ−Ｉを含まない酢酸塩緩衝剤中にＮＰＨインスリンを含む組成物。
10. 緩衝剤のｐＨが４．５から８である請求項９記載の組成物。
11. ｐＨが４．５から８の酢酸塩緩衝剤中に、ＮＰＨインスリンを含む組成物。
12. ５から６ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、８から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールまたは２から３ｍｇ／ｍＬのフェノール、もしくは８から１０ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールと２から３ｍｇ／ｍＬのフェノールの両方からなる安定剤をさらに含み、緩衝剤はｐＨが５．４の５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液である、請求項９記載の組成物。
13. 哺乳動物の高血糖疾患の処置に使用される請求項１ないし６または９ないし１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 請求項１ないし６または９ないし１２のいずれか一項に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の高血糖疾患の処置方法に使用される請求項１ないし６または９ないし１２のいずれか一項に記載の組成物。
15. 哺乳動物に、有効量の請求項１ないし６または９ないし１２のいずれか一項に記載の組成物と有効量のさらなる血糖降下薬とを投与することを含む、哺乳動物の高血糖疾患の処置方法に使用される、請求項１ないし６または９ないし１２のいずれか一項に記載の組成物。

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