PT918536E

PT918536E - Composicao cmpreendendo insulina e factor-i de crescimento do tipo insulina (igf-i)

Info

Publication number: PT918536E
Application number: PT97935259T
Authority: PT
Inventors: Ross G Clark; Douglas A Yeung; James Q Oeswein
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2002-03-28
Also published as: DE69706872D1; EP0918536A1; EP1114644B1; CA2261799C; DE69714796D1; US5783556A; IL128128A; WO1998006423A1; ES2180523T3; JP4187075B2; DE69714796T2; EP1114644A1; HK1042229A1; SI1114644T1; HK1042229B; AU3824397A; IL128128A0; PT1114644E; DK0918536T3; AR009066A1

Description

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DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO INSULINA E FACTOR-I DE CRESCIMENTO DO TIPO INSULINA (IGF-I)

Antecedentes da invenção Âmbito da invenção A presente invenção refere-se a formulações contendo factor-I de crescimento do tipo insulina e insulina NPH ("neutral protamine hagedorn insulin"), útil, por exemplo, num método para o tratamento de desordens hiperglicémicas, tais como a diabetes, em pacientes.

Descrição da arte relacionada Há uma necessidade clara de melhorar o tratamento da diabetes. Uma melhoria é a utilização de IGF-I como agente terapêutico para este fim. 0 IGF-I humano é um polipéptido de 7649 dalton com um pi de 8,4 (Rinderknecht e Humbel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73:2365 (1976); Rinderknecht e Humbel, J, Biol. Chem., 253:2769 (1978) que pertence a uma família de somatomedinas com actividades biológicas mitogénicas do tipo da insulina, que modulam a acção da hormona do crescimento (GH) . Van Wyk et al., Recent Proq. Horm Res., 30:259 (1974); Binoux, Ann. Endocrinol., 41:157 (1980); Clemmons e Van Wyk, Handbook Exp. Pharmacol., 57:161 (1981); Baxter, Adv. Clin. Chem, 25:49 (1986); Pat.

U.S. No. 4.988.675; WO 91/03253; e WO 93/23071. O IGF-I ocorre naturalmente nos fluidos corporais humanos, por exemplo sangue e fluido cerebroespinal humano. A maioria dos tecidos, e especialmente o fígado, produzem IGF-I 1 / juntament© com proteínas de ligação a IGF específicas. Tal como a GH, o IGF-I é uma proteína anabólica potente. Veja-se Tanner et al., Acta Endocrinol,, 84: 681-696 (1977); Uthne et al., J. Clin. Endocrinol, Metab., 39: 548-554 (1974). Veja-se também Ross et al., Intensive Care Med. 19 Suppl. 2:S54-57 (1993), que é uma revisão do papel da insulina, hormona de crescimento e IGF-I, como agentes anabólicos, nos doentes críticos.

Ao contrário de muitos outros factores de crescimento, os IGF estão presentes em concentrações elevadas na circulação, mas apenas uma pequena fracção do IGF não está ligado a proteína. A grande maioria do IGF circula como parte de um complexo ternário, associado de forma não covalente, composto por IGF-I ou IGF-II, proteína-3 de ligação ao factor de crescimento do tipo insulina (IGFBP-3) , e uma proteína grande designada por subunidade lábil a ácido (ALS). Este complexo é composto por quantidades equimolares de cada um dos três componentes. 0 complexo ternário de IGF mais IGFBP-3 mais ALS tem um peso molecular de aproximadamente 150.000 daltons e foi sugerido que a função deste complexo na circulação pode servir como reservatório e tampão para IGF-I e IGF-II, impedindo alterações rápidas no IGF-I livre. Embora o IGF-I seja produzido em muitos tecidos, pensa-se que a maioria do IGF-I circulante é sintetizada no fígado. O IGF-I pode ser purificado a partir de fontes naturais, e.g. soro humano (Rinderknecht e Humbel, J. Biol. Chem. supra) ou produzido de forma recombinante (e.g. EP 123.228 e 128.733). Estão descritos vários métodos para formular o IGF-I. Estes incluem, por exemplo, a EP 440.989, que descreve um método para a preparação de uma composição 2 7 \ \ de IGF-T seca, que compreende a secagem da solução contendo IGF-I juntamente com um ácido forte, a WO 91/18621 na formulação de IGF-I num tampão citrato a pH 6, a Pat. US 5.374.620 na formulação de IGF-I e GH numa composição promotora do crescimento, a PCT/SE94/00010 numa solução estável contendo IGF-I num tampão fosfato, numa quantidade de 50 mmol ou menos, originando um pH de 5,5 a 6,5, o qual é isotónico e adequado para injecção, e a WO 95/34318 numa solução compreendendo IGF-I numa solução aquosa com uma concentração reduzida de oxigénio. O IGF-I tem efeitos hipoglicémicos em humanos semelhantes à insulina quando administrado por injecção de bolo intravenoso, mas também promove um balanço de azoto positivo. CJnderwood et ai., Hormone Research, 24:166 (1986). 0 IGF-I é conhecido por exercer efeitos de abaixamento de glucose tanto em indivíduos normais (Guler et al., N. Engl. J. Med., 317:137-140 [1987]) , como diabéticos (Schoenle et al., Diabetologia, 34:675-679 [1999]; Zenobi et al., J. Clin. Invest., 90:2234-2241 [1992]) [veja-se também Sherwin et al., Hormone Research, 41 (Suppl. 2): 97-101 (1994); Takano et al., Endocrinol.

Japan., 37:309-317 (1990); Guler et al., Acta Paediatr.

Scand (suppl.), 367:52-54 (1990)]com uma evolução no tempo semelhante à da insulina normal. Veja-se também Kerr et al., "Effect of Insulin-Like Growth Factor I on the responses to and recognition of hypoglycemia", American Diabetes Association (ADA), 52nd Annual Meetinq, San Antonio, Texas, 20-23 de Junho, 1992, que descreve uma percepção aumentada de hipoglicémia após administração de rhIGF-I. Além disso, a administração de apenas rhIGF-I reduz os níveis de GH durante a noite e os requisitos de insulina em adolescentes com IDDM. Cheetham et al., Clin. 3

Endocrí nol . , 40:515-555

(1994);

Cheetham et al. ,

Diabetologia, 36:678-681 (1993).

Verificou-se que a administração de IGF-I humano recombinante a diabéticos do tipo II, como descrito por Schalch et al., J, Clin. Metab., 77:1563-1568 (1993), origina uma diminuição tanto da insulina do soro, como um decréscimo paralelo nos niveis de péptido C, o que indica uma redução na secreção de insulina pancreática, após cinco dias de tratamento com IGF-I. Este efeito foi confirmado independentemente por Froesch et al., Horm. Res., 42:66-71 (1994). Estudos in vivo realizados em ratos normais, ilustram que a infusão de IGF-I inibe a libertação de insulina pancreática. Fursinn et ai., Endocrinoloqy, 135:2144-2149 (1994). Além disso, em preparações de perfusão de pâncreas, o IGF-I também suprime a secreção de insulina. Leahy et al., Endocrinology, 126:1593-1598 (1990). Apesar destes efeitos inibitórios in vivo, evidentes, do IGF-I na secreção de insulina, em humanos e animais, estudos in vitro não revelaram resultados uniformes.

Estudos in vitro utilizando concentrações múltiplas tanto de IGF-I como de glucose, mostraram vários niveis de inibição da secreção de insulina, e.g. desde nenhum efeito (Sreradzeri et al., J. Endocrinol., 117:59-62 [1988] a um decréscimo de 30% na libertação de insulina, utilizando niveis fisiológicos de TGF-I. Van Schravendijk et al., Diabetologia, 33:649-653 (1990). Num estudo recente utilizando ilhéus pancreáticos humanos, Eizirik et al., Eur. J. Endocr., 133:248-250 (1995) não observaram nenhum efeito do IGF-I na acumulação de insulina média, nem na libertação de insulina estimulada pela glucose. Estes 4 7

investigadoras especulam que o efeito do IGF-I observado in vivo, na secreção de insulina, pode ser secundário aos efeitos extra-pancreáticos do IGF-I e não o seu efeito directo no pâncreas. Assim, o modo e local de acção do IGF-I na secreção da insulina, não são completamente compreendidos.

Na literatura estão descritas várias alterações bioquímicas induzidas por uma administração a curto prazo de rhIGF-I. Salienta-se entre estas, um efeito de abaixamento do fosfato e potássio, pelo IGF-I humano recombinante (rhIGF-I), referido em indivíduos saudáveis, durante o aperto euglicémico. Boulware et al., "Phosphate and potassium lowering effects of insulin-like growth factor I in humans: comparison with insulin" The Endocrine Society, 74th Annual Meeting, San Antonio, Texas, 24-27 de Junho, 1992. Veja-se também Guler et al., Acta Paediatr. Scand. (Suppl.), 367, supra. A diabetes do tipo I, ou diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), está associada com anomalias na insulina e nos IGF. Até à data, a terapia de "substituição" de insulina através da administração de insulina periférica tem sido o corrente na terapia da IDDM desde há mais de 70 anos. No entanto, os resultados de numerosos ensaios, incluindo o ensaio do controlo e complicações da diabetes, demonstraram agora, claramente, que a administração de insulina periférica só por si, á inadequada para normalizar a homeostase da glucose. DCCT Research Group, N. Enq., J. Med., 239:977-986 (1993).

Numerosos estudos demonstraram uma associação entre a IDDM e desarranjos bioquímicos específicos do eixo GH-IGF. 5 Wínter et al., J. Pediatr., 97:598-600 (1980); Wilson, "Growth Abnormalities in Diabetes Mellitus", in: Contemporary Issues in Endocrinology and Metabolism, R. L. Hintz e R.G. Rosenfeld, ed. Volume 4 (1987), pp. 59-79. Estas anomalias são particularmente surpreendentes quando a IDDM é fracamente controlada e incluem a presença de níveis plasmáticos elevados de GH, níveis plasmáticos baixos de IGF-I, níveis normais a baixos de IGFBP-3 e níveis elevados de IGFBP-1. Noeves-Rivera et al.r J. Clin. Endo. Metab·, 7.7:638-643 (1993); Hermansen et al.r Acta Endocrinol, (Copenh), 114:433-439 (1987); Amiel et al., Diabetes, 33:1175-1179 (1984); Blethen et al., Diabetes, 30:868-872 (1981); Sperling et al., Diabetoloqia, 9:380-383 (1973); Edge et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 71: 1356-1361 (1990); Moinar et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 34:837-846 (1972); Johansen e Hansen, Diabetes, 20:239-245 (1971); Shishko et al., Diabetes Research and Clin. Prac., 25:1-12 (1994); Brismar et al., J. Clin, Endocrin. Metab., 79:872-878 (1994) . A. causa provável destes desarranjos parece ser o fornecimento sub-fisiológico de insulina, ao fígado, a fonte primária de IGF-I, IGFBP-3, ALS e IGFBP-1 circulantes. Winter et al., Diabetes, 28:952-954 (1979); Hall et al., J. Inter. Med., 225:273-278 (1989).

A maioria das acções da GH são mediadas pelo IGF-I e o "feedback" negativo do IGF-I à unidade hipotalâmica-pituitária é um regulador chave da secreção de GH. 0 reduzido "feedback" de IGF-I na IDDM resulta num aumento compensatório na libertação de GH pela pituitária. Hall et al., supra; Lanes et al., Diabetes, 34:156-160 (1985). Existem evidências substanciais de que este aumento secundário da GH tem consequências prejudiciais nos pacientes com IDDM. Por exemplo, níveis elevados de GH 6

/ durante o sono contribuem para o aumento das necessidades nocturnas de insulina e para uma hiperglicémia precoce no jejum matinal. Press et al., N. Eng. J, Med., 310:810-815 (1984); Defeo et al., Diabetologia, 29:532A (1986); Campbell et al.t N. Eng. J. Med,, 312:1473-1479 (1985); Campbell et al., Metabolism, 37:34-37 (1988); Arias et al., Diabetologia, 27:252A (1984); Davidson et al., Diabetes, 37_:166-171 (1988). Além disso, os niveis elevados de GH têm sido implicados como contribuindo directamente para as complicações microvasculares da IDDM. Sonksen et al., Horm. Res., 40: 68-79 (1993). O rhIGF-I tem a capacidade de melhorar a sensibilidade à insulina. Por exemplo, o rhIGF-I (70 pg/kg bid) melhorou a sensibilidade à insulina em pacientes não diabéticos, resistentes à insulina, com distrofia miotónica. Vlachopapadopoulou et al., J. Clin. Endo. Metab., 12:3715-3723 (1995) . Saad et al. Diabetologia, 37: Abstract 40 (1994) referem melhorias dependentes da dose na sensibilidade à insulina, em adultos com obesidade e tolerânica a glucose enfraquecida, após 15 dias de tratamento com rhIGF-I (25 pg e 100 pg/kg bid). O rhIGF-I também melhorou a sensibilidade à insulina e o controlo glicémico nalguns pacientes com resistência a insulina do tipo A, grave (Schoenle 'et al., Diabetologia, 34:675-679 [1991]; Morrow et al., Diabetes, 42 (Suppl.): 269 [1993] (abstract); Kuzuya et al., Diabetes, 42:696-705 [1993]) ou outros com diabetes melitus não dependente de insulina. Schlach et al., "Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor I (rhIGF-I) in type II diabetes mellitus", em: Spencer EM, ed., Modern Concepts of insulin-like Growth Factors (Nova Iorque; 7 Γ\ C : ·

Elsevipr:1991) pp. 705-715; Zenobi et al., J. Clin. Invest., 90: 2234-2241 (1993).

Apesar de a resistência à insulina não ser considerada uma caracteristica proeminente da diabetes do tipo I, esta está claramente presente nalguns indivíduos e poderá ser clinicamente' muito importante durante a adolescência. Uma vez que a GH tem efeitos anti-insulina bem conhecidos, os níveis elevados de GH durante a adolescência poderão mediar muita desta resistência à insulina. Press et al., supra; Defeo et al., supra; Campbell et al., N. Eng. J. Med. , supra, Campbell et al., Metabolism, supra; Arias et al., supra; Davidson et al., supra.

Em várias referências está descrito um esquema geral para a etiologia de alguns fenótipos clínicos, que originam resistência a insulina e os efeitos possíveis da administração de IGF-I nos indivíduos representativos seleccionados. Veja-se, e.g. Elahi et al., "Hemodynamic and metabolic responses to human insulin-like growth factor-I (IGF-I) in men", in: Modern concepts of Insulin-Like Growth Factors (Spencer, EM ed) , Elsevier, Nova Iorque, pp. 219-224 (1991); Quinn et al., New Enql. J. Med., 323: 1425-1426 (1990); Schalch et al., "Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor I (rhIGF-I) in type II diabetes mellitus", in: Modern concepts of Insulin-Like Growth Factors (Spencer, EM, ed.), elsevier, Nova Iorquo, pp. 705-714 (1991); Schoenle et al., Diabetologia,34:675-679 (1991); Usala et al., N. Eng. J. Med., 327: 853-857 (1992); Lieberman et al., J. Clin. Endo. Metab., 75:30-36 (1992); Zenobi et al., J. Clin. Invest., jH):2234-2241 (1992); Zenobi et al.J. Clin. Invest., 89:1908-1913 (1992); Kerr et al., J. Clin. Invest., 91: 8 ~s i 141-147 (1993). A WO 94/16722 descreve um método para a modificação crónica das propriedades da barreira celular, expondo uma célula a uma quantidade de IGF-I eficaz para a modificação, durante pelo menos sete dias e um método para a melhoria ou reversão crónica da resistência a insulina. No entanto, quando o IGF-I foi utilizado para tratar pacientes com diabetes mellitus do tipo II, na clinica, a uma dose de 120-160 pg/kg, duas vezes por dia, os efeitos secundários sobrepuseram-se ao beneficio do tratamento. Jabri et al. Diabetes, 43:369-374 (1994). Veja-se também Wilton, Acta Paediatr., 383:137-141 (1992), em relação aos efeitos secundários observados por tratamento dos pacientes com IGF-I. A Pat. US No., 4.988.675 descreve o tratamento de diabéticos tipo II com IGF-I, a Pat. US No. 5.446.670 descreve o tratamento de diabéticos tipo I com IGF-I, a WO 91/03253 refere a utilização de IGF-I para tratar diabéticos resistentes a insulina, graves e a WO 96/01124 descreve a utilização de IGF-I para prevenir a diabetes, para atrasar o inicio clinico da diabetes e proporcionar um efeito protector contra a diabetes.

Os tratamentos de escolha na diabetes tipo II têm sido as terapias de combinação. Estas combinações envolveram, historicamente, a utilização de múltiplas formas de insulina, insulina de acção imediata, de acção intermédia e de acção prolongada. Oo artigos de revisão sobre formulações de insulina incluem Kissel e Volland, Deutsche ApothekerZeitunq, 134: 25 (1994) e Campbell, Pharmacy Times, 59: 40 (1993). Mais recentemente, tornaram-se vulgares as combinações de insulina com outros medicamentos 9 anti -diabéticos que são tomados oralmente, tais como as sulfonilureias e biguanidas.

Quanto a combinações de IGF e insulina, Genn et al., Biochem. Arch., 5:53-59 (1989) descrevem o efeito anabólico da insulina e IGF-II. Jacob et al., Am. J. Physiol., 260: E262-E268 (1991) descrevem os efeitos metabólicos de IGF-I e insulina em ratos BB/w diabéticos, espontâneos; veja-se também Pat. US No. 4.876.242. Além disso, a estimulação da síntese de proteínas cardíacas após tratamento com insulina e IGF é descrita por Fuller et al., Biochem Soc. Trans, lj5:277S (1991). as experiências têm sido realizadas in vitro com miócitos cardíacos isolados de fresco. Os efeitos no metabolismo de proteínas, após tratamento com insulina e IGF, em cães que foram jejuados durante a noite, são referidos por Umpleby et al., Eur. J. Clin. Invest., 2_4:337-344 (1994). Shojaee-Moradie et al. descrevem uma comparação dos efeitos do IGF-I, insulina e infusões combinadas suas derivadas, no metabolismo de glucose em cães. Randazzo e Jarett, Exp. Cell Res., 190 (1):31-39 (1990) descrevem a caracterização do crescimento de fibroblastos de murídeo que expressam receptores de insulina humana e o efeito do IGF-I e insulina na síntese de ADN . Tomas et al., Diabetes, £5:170-177 (1996) descrevem os efeitos de uma infusão conjunta de IGF-I e insulina em ratos diabéticos. Dunger et al. Metabolism, 4_4:119-123 (1995) sugerem que o IGF-I em conjunção com a insulina poderá proporeionar uma aproximação adicional ao tratamento da IDDM durante a adolescência. Mathe,

Biomedicine and Pharmacotherapy, 49:221-224 (1995) descrevem o papel dos IGF na sua relação com a insulina, para o tratamento da diabetes mellitus. 10

Quanto à literatura de patentes, a Pat. US 4.988.675 descreve uma combinação de IGF-I com uma quantidade de insulina inferior ao normal, para tratar a diabetes do tipo II. A WO 96/01125 publicada em 18 de Janeiro de 1996, descreve a utilização de uma combinação de insulina e um IGF-I para a produção de um medicamento para contrabalançar um decréscimo no balanço de azoto e para contrabalançar um decréscimo na síntese de proteínas e que pode ser utilizado no tratamento de um catabolismo de proteínas, devido a um excesso de glucocorticóides. A Pat. US No. 5,091,173 descreve uma composição adequada para a aplicação tópica na pele ou cabelo de mamífero, compreendendo um sobrenadante isento de células, de uma cultura de células de papila dérmica, suficiente para aumentar o crescimento de cabelo, compreendendo um ou mais membros da família IGF, seleccionados de entre IGF-I, IGF-II e insulina. A utilização de um medicamento injectável diferente da insulina, para tratar a diabetes, tal como IGF-I, é naturalmente limitado, devido ao desejo dos diabéticos administrarem um número mínimo de injecções. A adição de mais injecções, para administração de IGF-I, a regimes que já necessitam de várias injecções de insulina por dia, não é prático. Além disso, quando se combinam duas proteínas como o IGF-I e a insulina, será necessário ter a formulação resultante estável e bem absorvida pelo paciente, bem como ter uma insulina de acção prolongada. Uma insulina de acção prolongada, regulada de um modo dependente do tempo e do tecido alvo, em resposta a diferentes exigências do meio metabólico, é descrita por Lewitt et al., Endocrinoloqy, 129:2254-2265 (1991). 11 ι— t A F.P-A-0 331 630 (veiam-se reivindicações 1 e 11) descreve a utilização de IGF-I para o tratamento e prevenção de efeitos secundários de hiperinsulinémia, em pacientes tratados com insulina. Descreve também uma composição anti-diabética compreendendo IGF-I e insulina (veja-se reivindicação 19 e exemplo 2).

Actualmente, os diabéticos misturam insulina NPH ("Neutral protamine hagedorn insulin") com insulina vulgar. Seria desejável poder misturar insulina NPH de acção prolongada com IGF-I, cada um de frascos separados, na mesma seringa, e injectar a mistura imediatamente. Seria também desejável utilizar a mesma quantidade de insulina que se usa normalmente, não uma quantidade de insulina inferior ao normal, de modo que esta fosse mais eficaz em baixar os níveis de glucose no sangue.

Sumário da invenção

Em acordo com o exposto, a presente invenção proporciona uma composição parentérica compreendendo IGF-I e insulina NPH, num transportador farmaceuticamente aceitável. De preferência, estes estão presentes em quantidades de cerca de 1 a 10 mg de IGF-I e de cerca de 0,1 a 2 mg de insulina NPH, de preferência, a um pH de cerca de 5 a 8, mais preferencialmente de cerca de 5 a 6. De preferência, as quantidades de IGF-I e insulina NPH na composição, são de cerca de 1 a 10 mq/ml cada. Também é preferido que o transportador seja um tampão de um sal de ácido acético e um tampão fosfato, o qual contém um contra-ião sódio e um estabilizante. Também é preferido que a composição contenha um tensioactivo, de preferência um polisorbato ou poloxâmero. 12

ΧΛ A-V'- '· ' /

Num outro aspecto, a invenção proporciona uma composição de preferência para utilização parentérica e preferencialmente estéril, compreendendo IGF-I e insulina NPH num tampão de um sal de ácido acético.

Num outro aspecto, a invenção proporciona uma composição, de preferência para utilização parentérica e de preferência estéril, compreendendo IGF-I e insulina NPH numa razão de peso entre insulina NPH e IGF-I de cerca de 10:1 a 1:50 (p/p), de cerca de 0,05 a 0,3 M de um osmólito, de cerca de 0,1 a 10 mg/ml de um estabilizante de cerca de 1 a 5 mg/ml de um tensioactivo e de cerca de 5 a 100 mM de um tampão a um pH de cerca de 5 a 7, mais preferencialmente de 5 a 6.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona as composições acima descritas, para utilização num método para o tratamento de uma desordem hiperglicémica, tal como a diabetes, num mamífero, compreendendo a administração ao mamífero, de preferência por injecção, ou infusão, de uma quantidade eficaz de uma das composições acima referidas. A presente invenção proporciona uma solução para o problema do doseamento de IGF-I. Constituiu uma descoberta inesperada e fortuita o facto de entre as muitas formulações de insulina que estão disponíveis, apenas um tipo, a insulina NPH, poder ser misturada com o IGF-I. Além disso, as vantagens inesperadas do doseamento da combinação da insulina NPH e IGF-I foram descobertas por experimentação, como descrito em detalhe a seguir. 13

Além disso, a presente invenção alcança o objectivo de ser capaz de misturar insulina NPH de acção prolongada e IGF-I, contidos em frascos separados, na mesma seringa, e injectar a mistura imediatamente e utilizar a mesma quantidade de insulina que normalmente se utiliza, de modo que esta será bastante eficaz em baixar a glucose no sangue.

Descrição sumária das Figuras A Figura IA descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de insulina marca HUMULIN® R. A Figura 1B descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de insulina da marca HUMULIN® N. A Figura 1C descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de IGF-I. A Figura 2A descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido de insulina marca HUMULIN® N mais IGF-I. A Figura 2B descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de insulina da marca NOVOLIN® N mais IGF-I. A Figura 3A descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de insulina marca HUMULIN® U. A Figura 3B descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de insulina da marca HUMULIN® U mais IGF-I. A Figura 4A descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de insulina marca HUMULIN® L, sem IGF-I e a Figura 4B descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido, de insulina da marca NOVOIN® L, sem IGF-I. 14

Ά Figura 5Α descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido de insulina marca HUMULIN® L, com adição de IGF-I e a Figura 5B descreve um cromatograma de fase inversa a pH ácido de insulina da marca NOVOLIN® L, com adição de IGF-I. A Figura 6 mostra uma comparação entre injecções de rhIGF-I e insulina NPH (SC) em ratos diabéticos STZ, mostrando um gráfico da glucose plasmática versus tempo, para o controlo (círculos abertos com linha a cheio), rhIGF-I (círculos abertos com linha a tracejado), insulina NPH (triângulos abertos), duas injecções separadas de rhIGF-I e insulina NPH (quadrados abertos) e uma única injecção de rhIGF-I e insulina NPH (quadrados abertos/a cheio). A Figura 7 mostra uma comparação entre injecções separadas e única, de IGF-I e insulina NPH SC em ratos diabéticos STZ, mostrando um gráfico da alteração percentual na glucose plasmática versus tempo, para o controlo (quadrados abertos), duas injecções separadas (losangos abertos)e uma injecção única de IGF-I e insulina NPH (círculos abertos). A Figura 8 mostra uma comparação entre injecções separadas e únicas de IGF-I e insulina NPH SC em ratos diabéticos STZ, mostrando um gráfico de insulina plasmática versus tempo, para o controlo (quadrados abertos), duas injecções separadas (losangos abertos) θ uma injecção única de IGF-I e insulina NPH (círculos abertos). A Figura 9 mostra uma comparação entre injecções separadas e únicas de IGF-T e insulina NPH SC em ratos STZ, mostrando um gráfico do IGF-I plasmático versus tempo, para 15

f\ o excipiente (quadrados abertos), duas injecções separadas (losangos abertos) e uma injecção única de IGF-I e insulina NPH (círculos abertos). A Figura 10 mostra uma comparação entre várias injecções SC em ratos diabéticos STZ, mostrando a glucose sanguínea versus tempo para insulina NPH em água (quadrados abertos), insulina NPH em placebo de IGF-I (losangos abertos), uma injecção única de IGF-I e insulina NPH (círculos abertos) e duas injecções separadas de IGF-I e insulina NPH (triângulos abertos). A Figura 11 mostra o efeito do placebo de IGF-I na insulina do sangue em ratos diabéticos STZ, injectados SC, mostrando a insulina plasmática versus tempo, para insulina NPH em água (quadrados abertos) e insulina NPH em placebo de IGF-I (losangos abertos). A Figura 12 mostra uma comparação de várias injecções SC em ratos diabéticos STZ, mostrando o IGF-I plasmático versus tempo para insulina NPH em água (quadrados abertos), insulina NPH em placebo de IGF-I (losangos abertos) , uma injecção única de IGF-I e insulina NPH (círculos abertos) e duas injecções separadas de IGF-I e insulina NPH (triângulos abertos). A Figura 13 mostra uma concepção de um estudo clínico, envolvendo quatro semanas de aconselhamento sobre diabetes a doentes externos, seguido de quatro semanas de tratamento de pacientes com IDDM com insulina e rhIGF-I, ou placebo. O estudo terminou com um período de duas semanas de lavagem. 16 Γ

Λ S" {

A Figura 14 mostra os níveis glicémicos diários, médios e a curva de regressão para o estudo apresentado na Figura 13. As linhas irregulares e as linhas mais suaves representam a média de quatro níveis de glucose diários e o melhor ajuste da curva de regressão, respectivamente. As linhas das curvas de regressão, que se sobrepõem nos dois grupos, durante o período de pré-tratamento (dia -30 a 0) , separam-se durante o período de tratamento (dia 0 a 30) , com um abaixamento definido da linha de regressão do grupo tratado com rhIGF-I vs. o controlo. Para conversão para unidades S.I. utiliza-se um factor de multiplicação de 0,05551. A Figura 15 mostra os níveis de IGF-I total durante o período de tratamento, para o estudo delineado na Figura 13. Os níveis de IGF-I, baixos em ambos os grupos, rhIGF-I e placebo, durante o pré-tratamento, aumentaram para níveis normais ao longo das três horas após a primeira injecção de rhIGF-I e permaneceram elevados durante o período de tratamento. A média + DPM é ilustrada. A Figura 16 mostra os níveis de IGF-I livre durante o período de tratamento para o estudo descrito na Figura 13. Os níveis de IGF-I livre, baixos em ambos os grupos, rhlGF-I e placebo, durante o pré-tratamento, aumentaram para níveis normais ao longo das três horas após a primeira injecção de rhIGF-I e permaneceram elevados durante o período dc tratamento. É apresentada a média +_ DPM.

Descrição das formas de concretização preferidas A. Definições 17

Tal como aqui utilizado, o termo "mamífero", para fins de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta, animais de zoológico, desporto ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, ovelhas, porcos, vacas, etc. O mamífero aqui preferido é o homem. 0 termo "não adulto" refere-se a mamíferos que têm desde a idade perinatal (tais como crianças de baixo peso à nascença) até à idade da puberdade, sendo os últimos aqueles que não atingiram ainda o potencial de crescimento total.

Tal como aqui utilizado, o termo "IGF-I" refere-se a um factor de crescimento do tipo insulina, de qualquer espécie, incluindo bovinos, ovinos, porcinos, equinos e de preferência humanos, com a sequência nativa, ou numa forma variante e de qualquer fonte, quer natural, sintética, ou recombinante. Prefere-se aqui, para utilização animal, a forma de IGF-I da espécie particular a ser tratada, tal como IGF-I de porcino para tratar porcos, IGF-I de ovino, para tratar ovelhas, IGF-I de bovino para tratar gado, etc. Prefere-se aqui, para utilização em humanos, a sequência humana nativa de IGF-I maduro, mais preferencialmente sem uma metionina no terminal N, preparada, e.g. pelo processo descrito na EP 230, 869, publicada em 5 de Agosto de 1987; EP 128, 733 publicada em 19 de Dezembro de 1984; ou EP 288,451 publicada em 26 de Outubro de 1988. Mais preferencialmente, este IGF-I de sequência nativa é produzido de forma recombinante e está disponível da Genentech Inc., São Francisco do sul, CA, para investigações clínicas.

As variantes de IGF-I preferidas são as descritas nas Pat. US Nos 5.077.276; 5.164.370 ou 5.470.828, ou na WO 18

87/0103R, i.e. aqueles em que pelo menos o resíduo de ácido glutâmico está ausente na posição 3 do terminal-N da molécula madura, ou aqueles que têm uma delecção de até cinco aminoácidos no terminal-N. A variante mais preferida tem os primeiros três aminoácidos do terminal-N eliminados (com as várias designações de IGF do cérebro, tIGF-I, des(1-3)-IGF-1 ou des-IGF-I).

Tal como aqui utilizado, o termo "insulina NPH” refere-se a "neutral protamine hagedorn insulin", também conhecida como isofano, de qualquer espécie, incluindo bovinos, ovinos, porcinos, equinos, e de preferência humanos e de qualquer fonte, quer natural, sintética ou recombinante. Prefere-se aqui, para utilização em animais, a forma de insulina NPH da espécie particular a ser tratada, tal como insulina NPH humana para tratar humanos. A insulina NPH preferida para utilização em humanos é a insulina NPH comercializada pela Novo-Nordisk, com a marca registada INSULATAR™ ou por Eli-Lilly, com a marca registada HUMULIN N™. Todos os medicamentos de insulina NPH descritos no Diabetes Mellitus - Theory and Practice, quarta edição, Harold Rifkin, MD, Ed. (Elsevier, Nova Iorque, 1990), capítulo 29, e U.S. Pharmacist, 18 (Nov. Suppl.) p. 38-40 (1993) são adequadas para a invenção.

Tal como aqui utilizado, o termo "desordens hiperglicémicas" refere-se a todas as formas de diabetes, tal como a diabetes do Lipo I e tipo II, bem como a hiperinsulinémia e hiperlipidémia, e.g., indivíduos obesos e diabetes resistente a insulina, tal como o síndrome de Mendenhall, síndrome de Werner, leprechaunismo, diabetes lipoatrófica e outras lipoatrofias. A desordem hiperglicémica preferida é a diabetes, especialmente do 19

tipo T r tipo II. A própria "diabetes" refere-se a uma doença progressiva do metabolismo de hidratos de carbono, envolvendo a produção ou utilização inadequada de insulina e caracteriza-se por hiperglicémia e glicosúria.

Tal como aqui utilizado, o termo "tratar", refere-se tanto a tratamento terapêutico como profilático, ou medidas preventivas. Os que necessitam de tratamento incluem os que já possuem a desordem, bem como aqueles que são propensos a ter a desordem, ou em que foi diagnosticada a desordem, ou aqueles em que a desordem deverá ser prevenida. 0 tratamento ou administração consecutivo refere-se a um tratamento numa base pelo menos diária, sem interrupção no tratamento de um ou mais dias. O tratamento ou administração intermitente, ou tratamento ou administração de um modo intermitente, refere-se a um tratamento que não é consecutivo, mas em vez disso de natureza cíclica. 0 regime de tratamento pode ser consecutivo ou intermitente, mas de preferência é consecutivo, quando ambas as proteínas são formuladas e administradas em conjunto.

Tal como aqui utilizado, o termo "agente hipoglicémico" refere-se a secretagogos, de preferência agentes orais, excluindo a insulina, que originam a secreção de insulina pelo pâncreas. Os mais preferidos para utilização em humanos são a classe de sulfonilureias de agentes hipoglicémicos orais. Exemplos incluem gliburide, glipizide e gliclazide. Além disso, os agentes que aumentam a sensibilidade a insulina, tais como as biguanidas, estão dentro desta definição e são também preferidos. B Modos para realizar a invenção 20 7

O IGF-I e a insulina-NPH são combinados e administrados directamente ao mamífero, por qualquer técnica adequada, incluindo infusão e injecção. A via específica de administração dependerá, e.g., do historial médico do paciente, incluindo quaisquer efeitos secundários percebidos ou antecipados utilizando insulina NPH ou IGF-I sozinho e da desordem particular a ser tratada. Exemplos de administração parentérica incluem administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial e intraperito-neal. Mais preferencialmente, a administração é realizada por infusão contínua (utilizando, e.g., dispositivos de libertação lenta ou mini-bombas, tais como bombas osmóticas ou pachos dérmicos) ou por injecção (utilizando, e.g., meios intravenosos ou subcutâneos). De preferência, a administração é realizada por injecção subcutânea para a mistura. A administração pode também ser realizada por bolo único, ou por formulações de depósito de libertação lenta. 0 fornecimento de insulina NPH e IGF-I por injecção será a forma preferida de administração, para o tratamento da diabetes. A composição de IGF-I e insulina NPH a ser utilizada em terapia será formulada e doseada de um modo consistente com a boa prática médica, tendo em conta a condição clínica do paciente individual (especialmente os efeitos laterais do tratamento com insulina NPH ou IGF-I sozinhos), o local de fornecimento da composição de IGF-I e insulina NPH, o método dc administração, o programa de administração e outros factores conhecidos dos peritos. As "quantidades eficazes" de cada componente, para os fins da presente invenção, são assim determinadas por estas considerações e deverão ser quantidades que resultem numa 21

biodisponibilidade do medicamento para o mamífero e num efeito de diminuição da glucose no sangue.

Como proposição geral, a quantidade total farmaceuti- camente eficaz do IGF-I e insulina NPH administrados parentericamente por dose, será na gama de cerca de 10 pg/kg/dia a 200 μg/kg/dia de IGF-I, com base no peso corporal do paciente em kg, e de cerca de 0,5 a 500 unidades/dia de insulina NPH, embora, como referido acima, isso esteja sujeito a discernimento terapêutico. De preferência, para o tratamento da diabetes em humanos, a dose de IGF-I é de 1 a 10 mg por dia, mais preferencialmente, de cerca de 20 a 80 μg/kg/injecção (i.e. de cerca de 1,5 a 6 mg) duas vezes por dia subcutaneamente, e a dose de insulina NPH é de cerca de 5 a 50 unidades (injecção (i.e., de cerca de 0,2 a 2 mg) duas vezes por dia, subcutaneamente. A razão entre insulina NPH e IGF-I nesta formulação, em peso, é geralmente de cerca de 10:1 a 1:50, de preferência de ou cerca de 1:1 a 1:20, mais preferencialmente 1:1 a 1:10, ainda mais preferencialmente de 1:1 a 1:5 e muito preferencialmente de cerca de 1:1 a 1:3.

Embora a injecção seja preferida, também se pode utilizar um dispositivo de infusão para infusões SC continuas. Também se pode utilizar uma solução de saco intravenoso. 0 factor chave na selecção de uma dose adequada é O resultado obtido, tal como medido por decréscimos na glucose sanguínea, de modo a que esta se aproxime dos valores normais, ou por outros critérios, para medir o tratamento da diabetes, tal como aqui definido como sendo adequados pelo perito. Outras informações sobre o doseamento de insulina NPH podem ser encontradas em 22

Diabetes Mellitus - Theory and Practice, supra, capítulos 29 e 30.

Noutra forma de concretização para administração da combinação de IGF-I e insulina NPH, a administração de insulina é contínua e o IGF-I é administrado ao mamífero de um modo intermitente, de modo a suster a sua resposta biológica no tratamento da diabetes. Isto é normalmente conseguido administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de IGF-I ao mamífero, para se obter uma exposição a IGF-I e insulina NPH durante um período de tempo, que proporciona a .resposta biológica máxima no mamífero, descontinuando em seguida a administração de IGF-I (mas não a de insulina NPH), durante um período de tempo igual, ou inferior ao período de tempo durante o qual o IGF-I foi anteriormente administrado, administrando em seguida uma quantidade terapeuticamente eficaz de IGF-I (com continuação da administração de insulina NPH) ao mamífero, para se obter uma exposição a IGF-I e insulina NPH durante um período de tempo que proporcione a resposta biológica máxima no mamífero, descontinuando em seguida a administração do IGF-I (mas não da insulina NPH), durante um período de tempo igual ou inferior ao período de tempo em que o IGF-I foi anteriormente administrado e repetindo este padrão de administração e descontinuação de administração de IGF-I, durante tanto tempo quanto o necessário para se obter, ou manter, uma resposta biológica consistente, no mamífero.

Além disso, a formulação é adequadamente administrada juntamente com uma proteína de ligação a IGF, por exemplo, uma das vulgarmente conhecidas, í.e., IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 ou IGFBP-6 ou com o ALS do 23 V' ^ ·· ^ 7 complexo de ligação a IGF. Estas proteínas podem ser administradas separadamente, ou na forma de complexos com IGF-I. O IGF-I pode também ser acoplado a um receptor, ou anticorpo, ou fragmento de anticorpo, para administração. A proteína de ligação preferida para IGF-I é IGFBP3, que é descrita na Pat. U.S. No. 5.258.287 e por Mertin e Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986). Esta proteína IGFBP3 glicosilada é um componente estável a ácido de cerca de 53 Kd num gel de SDS-PAGE não redutor, de um complexo proteico de 125-150 Kd, encontrado no plasma humano, que possui a maioria dos IGF endógenos e é também regulado pela GH. A administração da proteína de ligação de IGF com IGF-I e insulina NPH pode ser realizada pelo método descrito na Pat. US No. 5.187.151. Em resumo, o IGF-I e a IGFBP são administrados em quantidades eficazes, por injecção de bolo subcutâneo, numa razão molar de cerca de 0,5:1 a 3:1, de preferência de cerca de 1:1, estando a insulina NPH já presente com o IGF-I.

Além disso, a formulação é adequadamente administrada juntamente com uma quantidade eficaz de um agente hipoglicémico, tal como uma sulfonilureia. 0 agente hipoglicémico é administrado ao mamífero por qualquer técnica adequada, incluindo por via parentérica, intranasal, oral ou qualquer outra via eficaz. Muito preferencialmente, a administração é realizada por via oral. Por exemplo, os comprimidos de MICRONASE™ (gliburide), comercializados pela Upjohn em concentrações de comprimido de 1,25, 2,5 e 5 mg, são adequados para administração oral. A dose de manutenção usual para os diabéticos do tipo II, submetidos a esta terapia, é geralmente na gama de cerca de 1,25 a 20 mg por dia, que 24

podem ser dados como uma dose única ou divididos ao longo do dia, como considerado adequado [Physician's Desk

Reference, 2563-2565 (1995)]. Outros exemplos de comprimidos baseados em gliburide disponíveis para prescrição, incluem o medicamento da marca GLYNASE™ (Upjohn) e o medicamento da marca DIABETA™(Hoechst-

Roussel). 0 GLUCOTROL™ (Pratt) é a marca registada para um comprimido de glipizida (l-ciclohexil-3[p-[2-(5- metilpirazinacarboxamida)etilfenil]sulfonil]ureia), disponível tanto na força de 5 como 10 mg e é também prescrito para diabéticos do tipo II, que necessitem de terapia hipoglicémica após controlo dietético, ou em pacientes que cessaram de responder a outras sulfonilureias [Physician's Desk Reference, 1902-1903 (1995)]. Também se podem utilizar outros agentes hipoglicémicos, além das sulfonilureias, tais como as biguanidas (e.g. metformina e fenformina) ou troglitozonas ou outros medicamentos que afectam a acção da insulina. O IGF-I e insulina NPH são também adequadamente administrados em conjunto, por sistemas de libertação controlada. Exemplos adequados de composições de libertação controlada incluem matrizes de polímeros semi-permeáveis, na forma de artigos modelados, e.g. películas ou microcápsulas. As matrizes de libertação controlada incluem políláctidos (Pat. U.S. No. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 [1983]), poli(2-hidroxietilmetacrílato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) e Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]), acetato de etileno vinilo (Langer et ai., supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.998). As composições de IGF-I de libertação controlada também 25 incluem TGF-τ inserido em lipossomas. Os lipossomas que contêm IGF-I são preparados por métodos conhecidos per se; DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA, 82_: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 52.322, EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedido de Pat Japonesa 83-118008; Pats. US Nos. 4.485.045 e 4.544.545 e EP 102.324. Vulgarmente, os lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (de cerca de 200 a 800 angstrons) , em que o conteúdo lipidico é superior a cerca de 30 mol. percentuais de colesterol, sendo a proporção seleccionada ajustada para a terapia de IGF-I e insulina NPH óptima.

Para administração parentérica, numa forma de concretização, o IGF-I e insulina NPH são formulados geralmente misturando cada um no grau desejado de pureza, numa forma injectável de dosagem unitária (solução, suspensão ou emulsão) , com um transportador farmacêutica ou parentericamente aceitável, i.e. um que não seja tóxico para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e que seja compatível com outros ingredientes da formulação. Por exemplo, a formulação não inclui, de preferência, agentes oxidantes e outros compostos que são conhecidos por ser prejudiciais para os polipéptidos.

Geralmente, as formulações são preparadas contactando o IGF-I e a insulina NPH, cada um uniforme e intimamente, com transportadores líquidos ou transportadores sólidos finamente divididos, ou ambos. Então, se necessário, o produto é modelado na formulação desejada. De preferência, o transportador é um transportador parentérico, mais preferencialmente uma solução que é isotónica com o sangue do receptor. Exemplos destes veículos transportadores 26

incluem água, solução salina, solução de Ringer, uma solução tamponada e solução de dextrose. Os veículos não aquosos como os óleos fixos e oleato de etilo são também úteis. 0 transportador contém, adequadamente, quantidades mínimas de aditivos, tais como substâncias que melhoram a isotonicidade e a estabilidade química. Estes materiais são não-tóxicos para os receptores, às dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, como fosfato, citrato, succinato, ácido acético e outros ácidos orgânicos, ou os seus sais; antioxidantes como ácido ascórbíco; polipéptidos de baixo peso molecular (menos que cerca de dez resíduos), e.g., poliarginina ou tripéptidos; proteínas, como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; glicina; aminoácidos como ácido glutâmico, ácido aspártico, histidina ou arginina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo celulose ou os seus derivados, glucose, manose, trehalose ou dextrinas, agentes quelantes, como o EDTA; álcoois de açúcares como o manitol ou sorbitol, contra-iões como o sódio; tensioactivos não iónicos, como os polisorbatos, poloxâmeros ou polietilenoglicol (PEG) e/ou sais neutros, e.g. NaCl, KC1, MgCl2, CaCl2, etc. O IGF-I e a insulina NPH são tipicamente formulados nestes veículos, a um pH de cerca de 4,5 a 8. 0 IGF-I de comprimento total é geralmente estável a um pH não superior a cerca de 6,5; o des(1-3)-IGF-I é estável a cerca de 3,2 a 5. Deve entender-se que a utilização de alguns dos excipientes, transportadores ou estabilizantes acima referidos, irá resultar na formação de sais de IGF-I ou de 27

"? insulina. A preparação final pode ser um liquido ou sólido liofilizado, estável.

Numa forma de concretização para tratar a diabetes, particularmente preferida, a composição compreende IGF-I e insulina NPH numa razão de peso entre insulina NPH:IGF-I de cerca de 10:1 a 1:50 (p/p), de cerca de 0,05 a 0,3M de um osmolito, de preferência um sal inorgânico e/ou álcool de açúcar, de cerca de 0,1 a 10 mg/ml de pelo menos um estabilizante, de cerca de 1 a 5 mg/ml de um tensíoactivo e de cerca de 5 a 100 mM de um tampão, a um pH de cerca de 5 a 7, de preferência 5 a 6. As quantidades mais preferenciais de IGF-I e insulina NPH nesta composição são de cerca de 1 a 10 mg de IGF-I e de cerca de 0,2 a 2 mg de insulina NPH, em cada injecção. A razão de peso mais preferida de insulina NPH: IGF-I é de cerca de 1:1 a 1:20, mais preferencialmente de cerca de 1:1 a 1:10, ainda mais preferencialmente de cerca de 1:1 a 1:5 e mais preferencialmente de cerca de 1:1 a 1:3.

Um "osmolito" refere-se a um modificador isotónico ou ajustador osmótico que ajusta a osmolalidade da solução tamponada. A osmolalidade refere-se à actividade osmótica total, para a qual contribuem os iões e moléculas não ionizadas de uma solução. Exemplos incluem sais inorgânicos como o cloreto de sódio e cloreto de potássio, manitol, PEG, polipropilenoglicol, glicina, sucrose, trehalose, glicerol, aminoácidos e álcoois de açúcares, como o manitol, conhecido na arte como sendo geralmente seguro (GRAS). 0 osmolito aqui preferido é o cloreto de sódio ou cloreto de potássio. 28 O "estabilizante" é qualquer composto que funciona para preservar os ingredientes activos na formulação, i.e. insulina NPH e IGF-I, de modo a que estes não se degradem ou de outro modo se tornem inactivos durante um período de tempo razoável, ou desenvolvam patogéneos ou toxinas que impedem a sua utilização. Exemplos de estabilizantes incluem preservantes que previnem bactérias, vírus e fungos de proliferarem na formulação, anti-oxidantes ou outros compostos que funcionam de vários modos para preservar a estabilidade da formulação.

Por exemplo, os sais de amónio quaternário são estabilizantes úteis, em que a estrutura molecular inclui um átomo de azoto central, ligado a quatro grupos orgânicos (normalmente alquilo ou arilo) e um radical ácido carregado negativamente. Estes sais são úteis como germicidas tensioactivos para muitas bactérias e fungos patogénicos não esporulantes e como estabilizantes. Exemplos incluem o cloreto de octadecildimetilbenzil amónio, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamónio em que os grupos alquilo são compostos de cadeia longa) e cloreto de benzetónio. Outros tipos de estabilizantes incluem álcoois aromáticos, como o fenol e álcool benzílico, alquil parabenos, como metil ou propil parabeno e m-cresol. 0 estabilizante mais preferido é o fenol ou álcool benzílico. O estabi1i zante é incluído numa forma líquida estável da formulação de insulina NPH e IGF-I, mas não numa forma liofilizada da formulação. Neste último caso, o estabilizante está presente na água bacteríostática para injecção (BWFI), utilizada na reconstituição. 0 29

Τ', tens·) oactivo está também opcionalmente presente no diluente de reconstituição. 0 "sal inorgânico" é um sal que não tem um catião ou anião baseado num hidrocarboneto. Exemplos incluem cloreto de sódio, cloreto de amónio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, fosfato de cálcio, fosfato de magnésio, fosfato de potássio, fosfato de amónio, sulfato de sódio, sulfato de amónio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, sulfato de cálcio, etc. De preferência, o catião é sódio e o anião é cloro ou sulfato e mais preferencialmente o sal inorgânico é cloreto de potássio ou cloreto de sódio. O "tensioactivo" actua de forma a aumentar a solubilidade do IGF-I e da insulina NPH a um pH de cerca de cerca de 4 a 7. É de preferência um tensioactivo não iónico, tal como um polisorbato, e.g. polisorbatos 20, 60 ou 80 , um poloxâmero, e.g. poloxâmero 184 ou 188 ou quaisquer outros conhecidos na arte que são GRAS. Mais preferencialmente, o tensioactivo é um polisorbato ou poloxâmero, mais preferencialmente um polisorbato e mais preferencialmente polisorbato 20. 0 "tampão" pode ser qualquer tampão adequado que seja GRAS e confere geralmente um pH de cerca de 4,8 a 8, de preferência de cerca de 5 a 7, mais preferencialmente de cerca de 5 a 6, na formulação de insulina NPH + IGF-I e preferencialmente a um pH de cerca de 5 a 6, mais preferencialmente de cerca de 5 a 5,5, na formulação de IGF-I. Exemplos incluem um tampão de um sal de ácido acético, que é qualquer sal de ácido acético, incluindo acetato de sódio e acetato de potássio, tampão succinato, 30

tampão fosfato, tampão citrato, tampão histidina ou quaisquer outros conhecidos na arte por terem o efeito desejado. 0 tampão mais preferido é o acetato de sódio, opcionalmente em combinação com fosfato de sódio. A composição mais preferida contendo tanto IGF-I como insulina NPH é a seguinte: uma razão de peso de insulina NPH:IGF-I de cerca de 1:1 a 1:3, de cerca de 5 a 7 mg/ml de cloreto de sódio, de cerca de 0,1 a 3 mg/ml de fenol e/ou de cerca de 6 a 10 mg/ml de álcool benzilico, de cerca de 1 a 3 mg/ml de polisorbato, de cerca de 2,5 a 4 mg/ml de acetato de sódio e de cerca de 0,1 a 1 mg/ml de fosfato de sódio, pH de cerca de 5,4. A formulação final, se for um líquido, é preferencialmente armazenada a uma temperatura de cerca de 2 a 8°C, durante cerca de quatro semanas. Alternativamente, a formulação pode ser liofilizada e proporcionada na forma de um pó para reconstituição com água para injecção, que é armazenada como descrito para a formulação líquida. O IGF-I e a insulina-NPH a serem utilizados para administração terapêutica deverão ser estéreis. a esterilidade é facilmente conseguida por filtração através de membranas de filtração estéreis (e.g. membranas de 0,2 micron). As composições terapêuticas de IGF-I e insulina NPH são geralmente colocadas num recipiente com uma porta dc acesso estéril, por exemplo um saco ou frasco de solução intravenosa com uma tampa perfurável por meio de uma agulha hipodérmica. 0 IGF-I e insulina NPH serão normalmente armazenados em recipientes unitários ou multi-dose, por exemplo, 31

Η \.Λ .>·«*- ampolas ou frascos selados, na forma de soluções aquosas, ou como formulações liofilizadas, para reconstituição. Como exemplo de uma formulação liofilizada, enchem-se frascos de 10 ml com 5 ml de solução aquosa de insulina NPH a 1% (p/v), filtrada em condições estéreis e a mistura resultante é liofilizada. A solução de infusão é preparada por reconstituição da insulina NPH liofilizada utilizando água para injecção bacteriostática. Esta solução de infusão é então misturada com uma solução de IGF-I reconstituída de forma semelhante, ou uma solução líquida de IGF-I. A formulação contendo ambos o IGF-I e a insulina NPH pode ser feita de diferentes modos. Um dos métodos compreende misturar a insulina NPH com uma composição contendo IGF-I (contendo osmolito, estabilizante e tampão, como descrito a seguir). A solução contendo IGF-I, útil para administração de IGF-I separadamente da insulina NPH e para mistura com a solução de insulina NPH, como descrito acima, é como se segue: cerca de 2 a 20 mg/ml de IGF-I, cerca de 2 a 50 mg/ml de osmolito, cerca de 1 a 15 mg/ml de pelo menos um estabilizante e um tampão (de preferência um tampão de um sal de ácido acético e mais preferencialmente acetato de sódio) numa quantidade tal que a composição tem um pH de cerca de 5 a 5,5. O osmolito, estabilizante e tampão e os compostos preferidos nestas categorias estão definidos acima. Opcion alimente!, a formulação pode também conter um tensioactivo, seleccionado de entre os tipos descritos acima, de preferência numa quantidade de cerca de 1 a 5 mg/ml, mais preferencialmente de cerca de 1 a 3 mg/ml. 32 V./,~

/

Numa forma de concretização preferida, o osmolito é um sal inorgânico a uma concentração de cerca de 2 a 10 mg/ml, ou um álcool de açúcar a uma concentração de cerca de 40 a 50 mg/ml, o estabilizante é álcool benzilico, fenol ou ambos e a solução tamponada é uma solução tamponada de um sal de ácido acético. Mais preferencialmente, o osmolito é um sal inorgânico, mais preferencialmente cloreto de sódio.

Numa formulação ainda mais preferida, a quantidade de IGF-I é de cerca de 8 a 12 mg/ml, a quantidade de cloreto de sódio é de cerca de 5 a 6 mg/ml, os estabilizantes são álcool benzilico numa quantidade de cerca de 8 a 10 mg/ml e/ou fenol numa quantidade de cerca de 2 a 3 mg/ml e o tampão é acetato de sódio cerca de 50 mM, de modo que o pH é cerca de 5,4. Nesta formulação, a quantidade preferida de insulina NPH é de cerca de 100 unidades/ml ou cerca de 4 mg/ml. Os volumes de medicamentos podem variar, ou as concentrações de insulina NPH podem ser fixadas. Opcionalmente, a formulação contém polisorbato como tensioactivo numa quantidade de cerca de 1 a 3 mg/ml. Uma concentração de acetato de 50 mM na solução de IGF-I de partida, antes da mistura com a insulina NPH assegura que o pH final não varie significativamente de 5,4, na mistura final de IGF-I/NPH, para manter uma solubilidade de IGF-I elevada e uma solubilidade de insulina NPH baixa, na forma de uma suspensão, numa vasta gama de razões de mistura. No entanto, uma gama de pH maior, em termos de estabilidade de ambas as proteínas, é de cerca de 4,5 a 8.

Também se contemplam kits para a presente invenção. Um kit completo compreenderá um recipiente, de preferência um frasco, para a formulação de IGF-I que compreende IGF-I num tampão de um sal de ácido acético, farmaceuticamente 33

/ aceitável; um recipiente, de preferência um frasco, compreendendo insulina NPH farmaceuticamente aceitável e instruções, tais como uma bula ou rótulo do produto, que díreccionam o utilizador sobre o modo de combinar o conteúdo dos dois recipientes, i.e. as duas formulações, para se obter uma formulação farmacêutica. De preferência, a formulação farmacêutica destina-se a tratar diabetes. Também preferencialmente, o recipiente com IGF-I compreende adicionalmente cloreto de sódio e álcool benzilico, ou fenol, ou ambos, no tampão, a um pH de cerca de 5,0 a 5,5. De preferência, o utilizador será instruído a combinar os conteúdos dos recipientes, i.e. as duas formulações, numa seringa, para injecção imediata.

Noutra forma de concretização preferida, o recipiente com IGF-I compreende de cerca de 8 a 12 mg/ml de IGF-I, de cerca de 5 a 6 mg/ml de cloreto de sódio, de cerca de 8 a 10 mg/ml de álcool benzilico ou de cerca de 2 a 3 mg/ml de fenol, ou ambos de cerca de 8 a 10 mg/ml de álcool benzilico e de cerca de 2 a 3 mg/ml de fenol, em solução de tampão acetato de sódio de cerca de 50 mM, a um pH de cerca de 5,4. Mais preferencialmente, este recipiente contém ainda de cerca de 1 a 3 mg/ml de polisorbato. A invenção será melhor compreendida com referência aos exemplos seguintes. Estes não deverão, no entanto, ser considerados limitantes do âmbito da invenção. Todas as citações de literatura e de patentes aqui mencionadas, são expressamente incorporadas para referência. EXEMPLO 1

MATERIAIS 1) IGF-I 10,0 mg/ml 34 rV ,

Ca 5,84 mq/ml 50 mM, pH 5,4 9.0 mg/ml 2.0 mg/ml

Cloreto de sódio Acetato de sódio Álcool benzilico Polisorbato 20 2) HUMULIN® R (injecção de insulina humana normal, USP, com origem em ADN recombinante) 3} HUMULIN® N (insulina humana NPH, com origem em ADN recombinante, suspensão de isofano) 4) NOVOLIN® N (insulina humana NPH, com origem em ADN recombinante, suspensão de isofano) 5) HUMULIN® L (insulina humana Lente, com origem em ADN recombinante, suspensão de zinco) 6) NOVOLIN® N (insulina humana Lente, com origem em ADN recombinante, suspensão de zinco) 7) HUMULIN® U (insulina humana, Ultralente, com origem em ADN recombinante, suspensão de zinco estendida)

MÉTODOS

Mistura

Misturou-se um volume de insulina humana com um volume igual de IGF-I, utilizando o seguinte processo: 1) Introduzir ar numa seringa numa quantidade igual à de insulina para mistura. Inserir a agulha no frasco de insulina humana e injectar o ar. Remover a agulha. 2) Injectar ar do mesmo modo no frasco de IGF-I, mas não remover a agulha. 3) Inverter a garrafa e a seringa. 4) Assegurar que a ponta da agulha está no IGF-I, remover a dose correcta de IGF-I para a seringa.

5) Antes de remover a agulha do frasco, verificar se a seringa tem bolhas de ar, o que reduz a quantidade de IGF-I 35

t ? nesta. Se estiverem presentes bolhas, segurar a seringa direita e dar piparotes nos seus lados até que as bolhas de ar se movam para o topo. Empurrar estas para fora, com o êmbolo, e remover a dose correcta. 6) Remover a agulha do frasco de IGF-I e inserir esta no frasco de insulina humana. Inverter o frasco e a seringa. Segurar o frasco e a seringa firmemente numa mão e agitar suavemente (não é necessário agitar no caso de insulina normal). Certificar que a ponta da agulha está na insulina, remover a dose de insulina humana. 7) Remover a agulha

Preparação da amostra para análise de HPLC:

(a) HUMULIN® N, NOVOLIN® N, HUMULIN® L, NOVOLIN® L e HUMULIN® U A insulina humana foi invertida suavemente várias vezes, para misturar a suspensão. Removeu-se aproximadamente 1 ml de amostra para uma seringa de insulina. A insulina foi descarregada num tubo de centrífuga, em seguida centrifugada a 3000 rpm , durante 10 minutos. 0 passo de centrifugação foi concebido para remover a suspensão de insulina da solução. Após centrifugação, a amostra de insulina foi filtrada através de um filtro de 0,22 μπι, para remover ainda mais a suspensão de insulina humana. Após filtração, a solução foi analisada, utilizando o método de HPLC de fase inversa a pH ácido, descrito a seguir: solvente A: ácido trifluoroacético a 0,1% solvente B: ácido trifluoroacético a 0,1% em acetonitrilo fluxo: 0,5 ml/minuto temperatura da coluna: 50°C comprimento de onda: 214 nm 36 >Λ^_ΑΛ/· r--v? y-n volume de injecção: 2 5 ^ig/injecção coluna: coluna de HPLC C18 VYDAC®, 4,6 x 250 cm, 300 Â

(b) HUMULIN® R

Esta solução foi analisada pelo mctodo de HPLC acima, sem nenhum passo de preparação de amostra.

(c) IGF-I O IGF-I foi diluído para 1 mg/ml utilizando placebo de IGF-I. A amostra diluída foi analisada pelo método de HPLC acima descrito.

(d) Mistura de Insulina humana/lGF-I

Misturou-se insulina humana com IGF-I numa seringa de insulina, utilizando o método de mistura acima descrito. Imediatamente após mistura, a mistura foi injectada num tubo de centrífuga, em seguida misturado cuidadosamente num vortex durante 1-2 segundos. Após agitação no vortex, a mistura foi centrifugada a 3000 rpm durante 10 minutos, em seguida filtrada através de um filtro de 0,22 μιη, para remover a suspensão de insulina. A amostra filtrada foi então analisada pelo método de HPLC de fase inversa, a pH ácido, acima descrito.

RESULTADOS

Os resultados são apresentados na tabela 1 a seguir: 37

TABELA I

Antes da Mistura Após a mistura

Amostra pH Cor e aparência pH Cor e aparecia IGF-I 5.4 Incolor, solução clara N/A N/A1 HUMULIN®R 7.3 Incolor, solução clara 5.4 Suspensão nebulosa HUMULIN®N 7.0 Suspensão nebulosa 6.1 Suspensão nebulosa NOVOLIN®N 7.2 Suspensão nebulosa 6.2 Suspensão nebulosa HUMULIN®! 7.1 Suspensão nebulosa 5.6 Suspensão nebulosa NOVOLIN®L 7.3 Suspensão nebulosa 5.6 Suspensão nebulosa HUMULIN®U 7.2 Suspensão nebulosa 5.7 Suspensão nebulosa N/A1 - Significa não aplicável.

DISCUSSÃO HUMULIN® R

Imediatamente após mistura do HUMULIN® R com IGF-I, o pH da solução foi alterado de 7,3 para 5,4 (veja-se tabela I), uma vez que o HUMULIN® R não é tamponado. Uma vez que a insulina humana é menos solúvel ao seu pH isoeléctrico (pH 5,4), esta torna-se insolúvel e a mistura torna-se nebulosa. Aproximadamente 95% da insulina humana total e 25% do IGF-I precipitam. Os dados indicam que o HUMULIN® R não é compatível com o IGF-I. HUMULIN® N e NOVOLIN® N (NPH)

Após adição de IGF-I, não se observou nenhuma alteração nos cristais de HUMULIN® N. A Fig. IA mostra que num cromatograma de fase inversa a pH ácido de HUMULIN® R, a insulina humana elui aos 41 minutos. A Fig. 1B, que é um cromatograma de fase inversa, a pH ácido, de HUMULIN® N, mostra que não estava presente nenhuma insulina humana na 38

solução. A insulina humana no HUMULIN® N está presente apenas como cristais insolúveis. Estes cristais foram removidos por centrifugação e filtração. A Fig. 1C, que é um cromatograma de fase inversa, a pH ácido, de IGF-I na formulação indicada a seguir no Exemplo II, mostra que aproximadamente 99% do IGF-I está intacto e não oxidado e elui aos 22 minutos.

As Figuras 2A e 2B representam os cromatogramas de fase inversa a pH ácido de HUMULIN® N e NOVOLIN® N, respectivamente, combinado com IGF-I. Após adição de IGF-I, a insulina humana permanece cristalina. Não estava presente nenhuma insulina humana na solução. A área e forma do pico de IGF-I permanecem inalterados na mistura de HUMULIN® N ou NOVOLIN® N. HUMULIN® U (Ultra lente) 0 tamanho e forma dos cristais de HUMULIN® U não parecem ser afectados pela adição de IGF-I. A Figura 3A é um cromatograma de fase inversa, a pH ácido, de HUMULIN® U. Uma vez que a insulina humana estava presente na forma de cristais, a insulina humana não foi detectada na solução, por cromatografia de fase inversa. A Figura 3B mostra um cromatograma de fase inversa, a pH ácido, de HUMULIN® U mais IGF-I. Após adição de IGF-I, aproximadamente 0,7% da insulina humana total foi libertada dos cristais de HUMULIN® U. A forma do pico de IGF-I foi ligeiramente alterada; no entanto, a área de pico de IGF-T não foi afectada. HUMULIN® L e NOVOLIN® L (Lente) 39 O HUMULIN® L é 30% de insulina amorfa e 70% de insulina humana cristalina. 0 tamanho e forma da insulina humana amorfa ou cristalina parecem não ser alterados com a adição de IGF-I. As Figuras 4A e 4B mostram, respectivamente, os cromatogramas de fase inversa a pH ácido, de HUMULIN® L e NOVOLIN® L, sem IGF-I. A insulina humana estava presente na forma amorfa ou cristalina insolúvel; pelo que foi removida por centrifugação e filtração. Não se detectou nenhuma insulina humana. As Figuras 5A e 5B mostram respectivamente os cromatogramas de fase inversa a pH ácido de HUMULIN® L e NOVOLIN® L com adição de IGF-I. Após adição de IGF-I, aproximadamente 4,8% da insulina humana total foi libertada para a solução. A área de pico de IGF-I permaneceu inalterada; no entanto, a forma do pico foi ligeiramente alterada.

CONCLUSÃO

Os dados indicam que apenas o HUMULIN® N e o NOVOLIN® N são totalmente compatíveis com o IGF-I.

EXEMPLO II A finalidade destas experiências era determinar os efeitos nas concentrações de glucose no sangue, insulina no plasma e IGF-I no plasma de rhIGF-I e insulina NPH, quando injectados em combinação, como injecções subcutâneas (SC) a ratos diabéticos. Nestas experiências, o IGF-I humano recombinante e a insulina NPH foram administrados por injecção subcutânea, quer misturados em conjunto, como uma solução e administrados como uma injecção, ou dados em injecções separadas, em dois locais diferentes.

PROCEDIMENTO

Anestesia de estreptozotocina (STZ) 40 dia 0 dia 5 dia 7 dia 9 (75 mg/kg) em tampão de ácido cítrico intraperitoneal (IP) canulação de ratos diabéticos

Estudo 1

Estudo 2

MÉTODOS

Animais/cirurgia

Receberam-se 40 ratos SD, macho, de 7-8 semanas de idade, dos Charles River Laboratories e um dia mais tarde estes foram injectados com STZ 75 mg/kg IP. Cinco dias mais tarde, os ratos foram sangrados através de uma veia da cauda, recolheu-se soro e mediu-se a concentração de glucose. Todos os animais com glucose <200 mg/dl foram considerados não diabéticos e foram retirados do estudo. Os restantes animais foram então canulados do seguinte modo: Anestesiaram-se os ratos (KETAMINE™, 65 mg/kg e XYLAZINE™, 12,5 mg/kg IP) e preparou-se um local cirúrgico, barbeado, utilizando álcool isopropílico a 70% e em seguida solução de betadine. A veia jugular direita foi então isolada através de uma incisão SC pequena, e canulada utilizando uma cânula de silicone com uma ponta de borracha biselada com 0,02 polegadas (0,0508 cm) x 0,037 polegadas(0,095 cm). As cânulas foram irrigadas e analisadas quanto a patência, utilizando heparina (10 u/ml), antes de fechar as feridas utilizando fio de sutura de seda 0-4. As cânulas foram "bloqueadas com heparina", utilizando ~50 μΐ de heparina (100 U/ml), imediatamente antes dos animais serem colocados numa almofada aquecida, para recuperação. Os ratos foram 41 colocados nas suas gaiolas de viveiro, quando em ambulatório.

As cânulas foram irrigadas diariamente com heparina/solução salina fresca, para manter a patência. Dois dias depois realizou-se o estudo de canulação 1 (veja-se a seguir) e dois dias mais tarde, o estudo 2. Para estes estudos, ligou-se um tubo de extensão de 12 polegadas (30,48 cm) de tubagem de polietileno PE40, cheia com heparina/solução salina à cânula, após remoção da tampa que tapa a cânula. Esta linha foi ligada a uma seringa e deixada ligada ao animal, ao longo da experiência. Após cada amostra de sangue, re-injectou-se um volume igual de solução salina através da cânula, para manter o volume de sangue. O sangue foi recolhido aos seguintes tempos: aos -10 minutos aos 0 minutos em seguida injectaram-se as soluções a seguir indicadas, em seguida recolheu-se de novo sangue, após 10, 20, 40, 60 minutos, 2, 3, 4, 6 horas.

Em cada estudo, havia 4 a 5 ratos por grupo. Os dados eram média + DPM, sendo as comparações feitas pelo teste de Duncan. Um resultado estatisticamente significativo era anotado quando p<0,05

Estudo 1 A concepção experimental foi como se segue:

Grupo concentração (Hl) (SC)

1 placebo de rhIGF-I (formulação de ácido acético, pH 5,4) 50 42

2 rhIGF-I 500 μς (solução mãe de 10 mg/ml) 50 3 insulina NPH 50 (solução mãe de 100 U/ml) 50 rhIGF-I + insulina NPH duas injecções separadas 50 x 2 rhIGF-I + insulina NPH injecção única 100

Estudo 2 A concepção experimental foi como se segue:

Grupo concentração 1 placebo de rhIGF-I (ácido acético, pH 5,4) (ul) (SC) 50 rhIGF-I + insulina NPH duas injecções separadas 100 x 2 3 rhIGF-I + insulina NPH injecção única 100

Compostos utilizados 1) rhIGF-I (Genentech Inc, lote # C117AZ/A9841AX) 10 mg/ml diluído 1:2 com placebo de IGF-I. O rhIGF-I consiste de IGF-I 10 mg/ml, NaCl 5,84 mg/ml, álcool benzílico 9,0 mg/ml, polisorbato 2,0 mg/ml, acetato de sódio 20, 50 mM, pH 5,4. A configuração de produto final pretendida contém 7 ml (70 mg) da solução acima num frasco de vidro de 10 ml, 43

,.-/ íl->? ' ./. que c geralmente armazenado no frigorífico (2-8°C), para maximizar o seu tempo de vida. Este produto é concebido para ser um líquido pronto a usar, para administração subcutânea ou intravenosa, utilizando uma agulha e seringa convencionais. 2) placebo de IGF-I (tampão acetato de sódio a pH 5,4) = 5 mg/ml: 100 μΐ = 500 μg

3) insulina NPH (HUMULUN™N, Eli Lilly, lote # 9MF78M) 100 U/ml diluído 1:2 com água estéril = 50 U/ml: 100 μΐ = 5U 4) água estéril

Medições

As concentrações de glucose no plasma foram medidas utilizando um analisador químico Chem IA (Miles

Laboratories, Tarrytown, NY). A insulina no plasma foi medida por um radioimunoensaio (RIA) específico de rato (Linco Research Inc., St. Charles, MO). O IGF-I do plasma foi medido por RIA, após extraeção das amostras com ácido-etanol. RESULTADOS Estudo 1 O estado diabético dos ratos é mostrado (Figura 6) pelos níveis de glucose no sangue (400 mg/100 ml) nos animais. Em comparação com o grupo controlo, que foi injectado com excipiente, todos os tratamentos provocaram uma queda significativa nos níveis de glucose no 3angue. Havia uma diferença clara entre os grupos na resposta de glucose inicial. O grupo de combinação de injecção única (tratado com IGF-I + insulina NPH) tinha um nível de glucose no plasma subatancialmente inferior, 10 min e 20 min após a injecção, do que qualquer dos outros grupos. 44

Ν

Vinte minutos após a injecção, os níveis de glucose no sangue eram: Placebo 409,5 + 66,5; rhIGF-I 218,3 + 38,1; insulina NPH 240,3 + 24,1; duas injecções separadas 240,3 + 61,3, injecção única 151,0 + 17,9 mg %. Os níveis de glucose no sanque nos ratos tratados com IGF-I voltaram aos valores basais após 6 horas, mas nos ratos a que foi fornecida apenas insulina NPH, ou a mistura de insulina NPH e IGF-I, os níveis de glucose no sangue permaneceram significativamente diminuídos, mesmo após 6 horas.

Estudo 2

No segundo estudo, o volume de dosagem foi ajustado para testar se a concentração e volume de injecção podiam ser factores na diferença observada entre os grupos de uma injecção e de combinação de duas injecções, no estudo 1. Assim, no grupo de combinação de duas injecções, os animais receberam 100 μΐ, cada, de insulina NPH e rhIGF-I (metade da concentração e duas vezes o volume, mas uma dose equivalente à do estudo 1). No grupo de uma única injecção, injectaram-se 100 μΐ de uma solução que continha tanto IGF-I como insulina NPH. Este estudo era semelhante ao estudo 1 em todos os outros aspectos.

Todos os tratamentos originaram uma baixa significativa nos níveis de glucose no plasma, mesmo após apenas 10 minutos (placebo 380 + 21,3; duas injecções separadas 388 + 13,3; injecção única 332 + 14,8 mg %) e 20 minutos após a injecção (placebo 445,3 + 17,6; duas injecções separadas 275,4 +_ 25,3; injecção única 216,8 + 19,5 mg %) . Este decréscimo também foi observado numa base de alteração de percentagem relativa. Assim, nem o volume de injecção, nem a concentração, parecem ser a causa da diferença entre o grupo dc injecções separadas e o grupo de injecção única. 45 Níveis de insulina e IGF-I no sangue

Para compreender porque é que a co-injecção da combinação de IGF-I e insulina NPH originou um desencadear mais rápido da hipoglicémia, mediram-se as concentrações de insulina e de IGF-I no sangue. A Figura 8 mostra que houve um efeito de tratamento significativo da insulina no plasma. Aos quarenta minutos após doseamento, a combinação de injecção única aumentou a insulina no plasma quase duas vezes, em comparação com o grupo de injecções separadas (placebo 1,15 + 0,45, duas injecções separadas 63,0 + 12,2, injecção única 112,8 + 21,0 ng/ml; p<0,05 vs duas injecções separadas). A Figura 9 mostra as concentrações de IGF-I no soro, após o co-fornecimento de IGF-I e insulina NPH, ou após a sua injecção separada. As concentrações de IGF-I no soro eram significativamente maiores no grupo de tratamento com a combinação de injecção única, do que no grupo de injecções separadas, aos 20 min após injecção. Assim, a co-formulação da insulina NPH e IGF-I tem uma maior eficácia do que se as formulações forem injectadas separadamente e esta maior eficácia estava associada com um aparecimento mais rápido de insulina no sangue e possivelmente de IGF-I no sangue.

Dados combinados de glucose do estudo 1 e 2

Quando os dados de glucose são combinados, observa-se uma diferença significativa no regime de tratamento, aos 10 e 20 min após injecção. 0 tratamento de injecção única provocou um decréscimo mais rápido na glucose do plasma, o qual era estatisticamente significativo, 10 minutos após a injecção (placebo 365,7 18,6 mg/dl, duas injecções 46 separadas 368,7 + 17,3 mg/dl, injecção única 311,8 + 12,4 mg/dl).

Estudo 3

Esta experiência em ratos diabéticos foi concebida para verificar se 1) o placebo de IGF-I afectava, ele próprio, a eficácia e absorção da insulina NPH. 2) a doses de insulina NPH e IGF-I diferentes das utilizadas nos estudos 1 e 2, se podiam observar efeitos de co-fornecimento. segue: (ul) (SC) 50 A concepção experimental foi como se

Grupo concentração 1 insulina NPH 2,5 U 1:1 em água estéril

2 insulina NPH 2,5 U 1:1 em placebo de IGF-I 50 3 insulina NPH 2,5 U + IGF-I 250 \iq injecção única 100 4 insulina NPH 2,5 U + IGF-I 250 μg duas injecções separadas 100 x 2

Todos os métodos e procedimentos eram idênticos aos utilizados nos estudos 1 e 2. 03 dadoo de glucose no sangue, expressos como percentagem do controlo, para a primeira hora após 47 W»-,v r\

?

injecção, neste estudo, são apresentados na Figura 10. Pode-se ver que a mistura de insulina NPH no tampão IGF-I (grupo 2) tinha tendência a originar um efeito maior na glucose sanguínea, do que a mistura de insulina NPH em água (grupo 1). Isto sugere um efeito directo do tampão de IGF-I na absorção de insulina NPH. A medição de insulina (Figura 11) confirmou que diluindo a insulina NPH em placebo de IGF-I, em vez de em água, aumentava a absorção de insulina. Uma comparação entre as Figs. 8 e 11 mostra que o efeito na absorção de insulina de co-misturar insulina NPH e IGF-I (Figura 8) , pode ser duplicado por adição do tampão de formulação para IGF-I à insulina NPH. Sem pretender estar limitado a qualquer teoria, pensa-se que a mais rápida absorção de insulina apresentada na Figura 8 não é provavelmente devida à presença de IGF-I, mas devido ao tampão de formulação utilizado para dissolver o IGF-I. A medição das concentrações de IGF-I (Figura 12) nesta experiência mostra que a absorção de IGF-I não era afectada por ser co-misturada com insulina NPH.

Em conclusão, a estes níveis de dose inferiores de insulina NPH e IGF-I, os efeitos observados na absorção de insulina nos estudos 1 e 2 foram duplicados no estudo 3. Além disso, verificou-se que o próprio IGF-I não era essencial para a absorção aumentada de insulina; o placebo de IGF-I, por si só, causou um aumento mais rápido nas concentrações de insulina no sangue.

SUMÁRIO

Estes estudos mostram que a co-formulação de insulina NPH e IGF-I conduz a níveis de glucose inesperadamente 48 7 \ 1 baixos. Isto constitui uma vantagem no tratamento de pacientes diabéticos, pois o número de injecções que os pacientes devem auto-administrar seria reduzido. 0 único meio pelo qual é possível co-injectar IGF-I e insulina é utilizando insulina NPH. 0 método preferido de fornecimento é utilizar uma formulação de tampão acetato de IGF-I, dado que esta formulação permite uma absorção mais rápida de insulina NPH. Esta absorção mais rápida de insulina tem vantagens em relação a métodos usuais de administração de insulina. A insulina NPH é uma forma de insulina de acção prolongada, que é normalmente administrada à noite para manter as concentrações de insulina durante a noite. Antes da refeição da noite, é normal dar-se adicionalmente uma injecção de insulina de acção imediata. A presente invenção descreve uma vantagem em que a libertação rápida de uma porção da insulina ocorre se se administrar insulina NPH com IGF-I. Assim, por exemplo, em vez de um doente diabético que recebe duas injecções, de insulina NPH ao deitar e de insulina normal antes do jantar, a presente invenção permite que se dê apenas uma injecção de IGF-I/insulina NPH antes do jantar. A redução no número de injecções é portanto conseguida.

Deste modo, é evidente que existem vários benefícios da presente invenção. Estes benefícios incluem a utilização de um número menor de injecções de insulina e rhIGF-I, a utilização de um número menor de injecções de insulina e uma farmacocinética diferente da insulina NPH. 49 η , I ααλ>·

EXEMPLO III Não parece haver nenhum ensaio clinico bem controlado que determine os efeitos a longo prazo da terapia de combinação de rhIGF-I/insulina, na sub-população de pacientes IDDM. Assim, para investigar se este paradigma de substituição hormonal dupla pode ser superior à mono-terapia de insulina, realizou-se um estudo de quatro semanas, ao acaso, duplo cego, controlado com placebo. 0 controlo glicémico durante o rhIGF-I mais insulina foi comparado e contrastado com um grupo tratado com insulina como única terapia. Os indivíduos , eram crianças e adolescentes com IDDM. Este estudo, apesar de não fornecer aos pacientes a formulação contendo IGF-I e insulina como agora reivindicado, mas em vez disso em injecções separadas, indica o doseamento que seria típico num ensaio clínico para esta indicação.

MÉTODOS

Recrutaram-se quarenta e três pacientes (22 machos e 21 fêmeas) com IDDM, de idades entre 8-17 anos, em três clínicas de diabetes baseadas em universidades. Os critérios de elegibilidade foram os seguintes: 1. idade igual a superior a 8 anos 2. IDDM com uma duração > 6 meses 3. controlo metabólico sub-óptimo, definido por uma hemoglobina desglicosilada (HbAi) igual a, ou superior à média dc HbAi para pacientes com IDDM observados na clínica. Isto é determinado pelo laboratório de cada local (Duke e Philadelphia HBAic > 8,4% e 8,2%, respectivamente; Buffalo HbAi > 10,4) num mínimo de duas ocasiões, em 4 meses antes da entrada no estudo. 50 ? / 4. regime de injecção duas vezes por dia de insulina normal e NPH, durante pelo menos 6 meses. Condições médicas associadas (excepto tiroidite autoimune em terapia de substituição), evidências bioquímicas e/ou clínicas de complicações de diabetes e utilização de medicamentos para além da insulina ou L-tiroxina foram critérios de exclusão. Também se excluíram pacientes com um historial prévio de desordens psiquiátricas, abuso de etanol, cancro ou utilização recente (dentro de 30 dias de entrada em estudo) de outros agentes/procedimentos experimentais. O estudo foi aprovado pelo "Institutional Review Board" de cada instituição. Os indivíduos e/ou um dos país deram o seu consentimento informado, por escrito.

Concepção do estudo

A concepção do estudo incluía um período de tratamento de 4 semanas de carga e um período de lavagem de 2 semanas (Fig. 13) . Ao longo do estudo, os pacientes continuaram a receber duas injecções de insulina normal e NPH diariamente. Ao entrarem no estudo, forneceram-se aos pacientes instruções detalhadas sobre a técnica de monitorização da glucose sanguínea (GS) em casa. Foram instruídos a testar a GS antes do pequeno-almoço, almoço, jantar e ceia, bem como de todas as vezes que ocorresse hipoglicémía sintomática. Os valores de glucose eram automaticamente armazenados no medidos (One Touch II Lifescan Inc., Milpitas, CA) e transferidos electronicamente para um computador pessoal no local do estudo, durante cada visita clínica. Durante o período de carga, os pacientes foram aconselhados semanalmente sobre os cuidados gerais da diabetes e dieta (dia -28 e -14 na clínica, dia -21 e -7 pelo telefone). Durante este período, forneceram-se aos pacientes objectivos específicos de 51

/) Λ·

controlo glicémico e foram instruídos a telefonar para os locais de estudos sempre que necessário, para assistência no ajuste da insulina.

No final do período de carga, os pacientes foram escolhidos ao acaso para administrar, ou rhIGF-I, ou placebo como injecção adicional, imediatamente antes das suas injecções matinais de insulina. Os pacientes foram distribuídos utilizando um processo ao acaso adaptativo, que classificava com base no estádio de Tanner e no valor de hemoglobina glicosilada no dia -28 do período de carga. Deixou-se um período janela de sete dias entre o dia -1 do período carga e o dia 1 do período de tratamento. Os indivíduos foram admitidos no hospital na tarde anterior ao dia 1 de tratamento e receberam a sua dose de insulina e dieta usuais. No dia 1, inseriu-se uma cânula IV no antebraço distai ou fossa antecubital. Administrou-se uma única dose de IGF-I (80 μς/kg) ou placebo, SC, seguido de uma injecção de insulina SC e pequeno-almoço. A dose de IGF-I de manhã foi administrada, por razões de segurança. No dia 1, a dose de insulina normal da manhã foi reduzida em 1/3 em ambos os grupos, como uma precaução contra o desenvolvimento de hipoglicémia. Ambas as amostras foram obtidas para teste posterior, a cada 15 minutos durante as 3 horas seguintes. Os pacientes foram encorajados a estar activos e fazer exercício após o período de amostragem inicial, de 3 horas. A alta hospitalar ocorreu no dia 3 ou 4 de tratamento. Os pacientes foram então contactados por telefone no dia 5 e observados, como pacientes externos, aos dias 7, 14, 21 e 28 de tratamento e 14 dias após a cessação do doseamento. Os pacientes foram instruídos quanto à dieta e tratamento da diabetes em cada encontro de monitorização. 52 / i- : J N/ν''

Durante todo o período de tratamento de quatro semanas, as doses de rhIGF-I e de placebo permaneceram constantes (80 μς/]<^ SC de manhã) . No entanto, as doses de insulina foram ajustadas, numa tentativa de conseguir os seguintes GS alvo: glucose no sangue em jejum (GSJ) 80-120 mg/dl (4,4-6,7 mmol/1) para idades superiores a 12 anos e 80-140 mg/dl (4,4-7,8 mmol/1) para idades inferiores a 12 anos; 80-180 mg/dl (4,4-10,0 mmol/1) em qualquer outra altura. Realizou-se um exame físico no dia -28 do período de carga, aos dias 1, 7, 21 e 28 do período de tratamento e no dia 14 do período de lavagem. 0 período de tratamento foi seguido por um período de lavagem de duas semanas, durante o qual os pacientes permaneceram numa terapia de apenas insulina, e os ajustes de dose permaneceram como necessário para alcançar os objectivos glicémicos.

Avaliações laboratoriais A tabela II resume as avaliações laboratoriais realizadas durante o estudo.

TABELA II

Fluxograma de estudo

DIA CARGA 1 TRATAMENTO 1 7 14 21 28 PÓS- TRATAMENTO 14 Hiatorial médico Avaliação fisíca X X X X 53

Teste de gravidez X X X CBC X X X X QUÍMICA X X X X X X Hemoglobina glicosilada X X X X X Colesterol HDL X X X X X GH, IGFs, e Bps X X X X X X X T4 e FSH livre X X Análise de urina X X X Eleminação da creatinina e proteína a 24 horas X X índices de controlo glicémico

Os índices primários de controlo glicémico foram: 1) a HbAi foi medida ao dia -28 da carga, bem como aos dias 1 e 28 de tratamento; 2) a média dos valores das quatro monitorizações diárias de glucose em casa ao longo dos últimos dez dias do período de carga foi comparada com os últimos dez dias de tratamento. A hemoglobina glicosilada foi testada por cromatografia de afinidade (SmithKline Beecham Clinicai Laboratories). A gama de referência era de 4,4-6,1%.

Eixo hormona de crescimento/lGF-I 54

?

Mediram-se Os níveis plasmáticos de GH, IGF-I, IGF-I livre, IGF-II, IGFBP-1, IGFBP-2 e IGFBP-3. Os níveis de IGF-I no plasma foram obtidos antes e a cada 30 minutos durante três horas, após a administração do medicamento de estudo no dia 1 de tratamento e 2-4 horas após a administração do medicamento de estudo, aos dias 7, 14, 21 e 28 de tratamento. A concentração de IGF-I plasmática, total, foi determinada por radioimunoensaio (RIA), após extracção com ácido-etanol, como descrito por Lieberman et al.e supra. O IGF-I livre no plasma foi separado do IGF-I complexado com proteínas de ligação, utilizando um HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC) com uma coluna TSK G2000SW e uma fase móvel de fosfato de sódio 0,2 M, Tween-20 a 0,5% a pH 6,5. A medição dos níveis de IGF-I após a cromatografia revela concentrações de IGF-I (extracção + RIA) de 7,0 e 19%. As concentrações de IGF-I livre (SE-HPLC + RIA) têm um coeficiente de variação inter-ensaios de 17% a 100 ng/ml. Lieberman et al., supra.

Medidas laboratoriais de segurança

As medições primárias laboratoriais, de segurança, foram os perfis bioquímicos do soro e tiróide, CBC, análise de urina, taxa de excreção de albumina urinária e eliminação da creatinina, em 24-horas. A hipoglicémia foi definida por um nível de GS igual ou inferior a 50 mg/dl, com ou sem sintomatologia. Esta definição de hipoglicémia foi utilizada para fins de análise estatística.

Descontinuações de indivíduos

De acordo com o protocolo, um paciente deverá ser descontinuado do estudo se ele ou ela tiver falhado cinco ou mais injecções, ou 14 ou mais medições de GS, ao longo do estudo. 55 \

? Métodos estatísticos

Os pacientes com pelo menos duas semanas de dados recolhidos após distribuição ao acaso, foram incluídos na análise. Para os pacientes que foram descontinuados mais cedo, mas que tiveram pelo menos duas semanas de dados para o período de tratamento, o último valor de dados disponíveis foi continuado até ao dia 28 e utilizado na análise. Os dados estão resumidos como média + DP para cada grupo. As comparações entre os dois grupos foram realizadas utilizando o teste da soma de classes de Wilcoxon, para variáveis contínuas e o teste exacto de Fisher, para dados discretos. Todos os testes eram de duas extremidades e um valor de p inferior ou igual a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Características de base

Como se pode ver pela Tabela III, as características demográficas de base, dos indivíduos nos grupos rhIGF-I e placebo eram semelhantes. Quatro de entre 21 indivíduos no grupo placebo e 4 de entre 22 no grupo rhIGF-I eram pré-púberes .

TABELA III

Características de base dos pacientes

RhIGF-I Placebo Macho/Fêmea 14/8 8/13 Idade(anos) 12.6(8-17) 13.0(9-16) HbAi(%) 11.3 (8.1-14.9) 11.4(9.9-16.4) Duração de IDDM (meses) 66(14-167) 77(13-192) Peso(kg) 51.8 (28.1-77.4) 53.8 (31.9-89.8) 56

Disposição dos pacientes

Quatro pacientes terminaram cedo o estudo. Ocorreu uma descontinuação no grupo de placebo em resposta ao pedido do paciente, ao dia 6 de tratamento. Três indivíduos sofreram uma descontinuação cedo, no grupo rhIGF-I: um dos pacientes desenvolveu um episódio de síncope, não associado a hipoglicémia, quatro horas após a administração do medicamento de estudo, no dia 1 de tratamento. 0 paciente estava sob terapia com antibiótico para otite média recorrente e não é certo se isso estaria relacionado com o acontecimento. 0 segundo paciente tinha níveis de GS erráticos no período de carga, com melhorias durante o período de tratamento; no entanto, o indivíduo experimentou uma hipoglicémia significativa, que não pôde ser adequadamente compensada diminuindo a dose de insulina normal. 0 terceiro paciente foi descontinuado no final do período de carga, devido a um não cumprimento da monitorização de GS.

Controlo glicémico

I

Os níveis de GS diários, médios, durante os últimos dez dias do período de carga (dia -19 a -28), comparados com os valores de GS médios durante pelo menos os últimos dez dias de tratamento (dia 19 a 28) , são apresentados na tabela IV. A melhoria global no controlo glicémico, observada no grupo rhIGF-I era devida a valores de glucose mais baixos antes do pequeno-almoço, almoço e hora de deitar, em comparação com o grupo placebo. 0 perfil de glicémia melhorou ao longo do período de tratamento no grupo rhIGF-I, em comparação com o grupo placebo, como se mostra na Figura 14. Em ambos os grupos, observou-se algum decréscimo de HbA! (mais que 1% no grupo de placebo) durante 57 o período de carga de 4 semanas (11,5 + 1,3% a 11,4 + 1,4%, placebo; 12,4 + 3,2% a 11,2 + 1,7%, rhIGF-I). No entanto, durante o período de tratamento, a HbAi decresceu ainda mais no grupo rhIGF-I, em comparação com o grupo placebo (redução média de 1,8 + 1,25% versus 1,3 + 1,6%)

TABELA IV

Concentrações médias de glucose no plasma, nos últimos 10 dias dos períodos de carga e de tratamento (mg/dl)

Para conversão para unidades S:I: multiplicar por 0,0551 rhIGF-I Placebo (medida V- DPM)

Tempo Carga Tratamento Carga Tratamento Antes do Pequeno-almoço 188 +- 45 176 +- 39 176 +- 39 191 +- 40 Antes do almoço 192 +- 60 142 +- 56 188 +- 51 174 +- 53 Antes do j antar 229 +- 63 199 +- 47 252 +- 68 228 +- 63 Antes de deitar 206 +- 76 171 +- 51 185 +- 54 178 +- 42

Utilização de insulina A utilização de insulina normal e NPH foi avaliada separadamente. A dose de insulina, de insulina normal e NPH, foi padronizada como unidades/kg/10 dias. Durante os últimos dez dias do período de carga, não se observaram diferenças entre os grupos de placebo e rh-IGF-I, quanto ao número médio de unidades de insulina utilizadas por dia, por kg de peso corporal, quer para a insulina normal (0,27 + 0,10 placebo; 0,27 + 0,10 rhIGF-I), ou insulina NPH (0,77 + 0,19 placebo; 0,66 + 0,13 rhIGF-I). Pelo contrário, 58

durante a fase de tratamento, a quantidade média de insulina normal utilizada no grupo rhIGF-I era significativamente inferior (0,28 + 0,10 vs 0,20 + 0,10; p<0,05). O número médio de unidades de NPH utilizadas por kg de peso corporal era também inferior durante o tratamento, para indivíduos que estavam a receber rhIGF-I vs. placebo (0,80 + 0,23 placebo; 0,65 + 0,14 rhIGF-I). Níveis hormonais A Figura 15 mostra os niveis totais de IGF-I durante o estudo farmacocinético no dia 1 de tratamento e 2-4 horas após a administração do medicamento de estudo, nos dias 7, 14, 21 e 28 do período de tratamento. Os níveis médios de IGF-I no grupo de placebo flutuaram entre 150 e 200 ng/ml (19,6-26 nmol/1) ao longo do estudo. No grupo rhIGF-I no dia 1 de tratamento o nível de IGF-I de base, baixo (137 + 51 ng/ml; 17,9 + 6,7 nmol/1) aumentou para a gama médio-normal (315 + 72 ng/ml; 41,2 + 9,4 nmol/1) em duas horas, após a primeira injecção de rhIGF-I. O IGF-I permaneceu na gama médio-normal (340-440 ng/ml; 44-57 nmol/1) ao longo do período de tratamento.

Os níveis de IGF-I livre também subiram após o tratamento, como se mostra na Figura 16. O nível de IGF-I livre, médio, medido 2-4 horas após a injecção de rhIGF-I era elevado no dia 1 e permaneceu elevado ao longo do estudo. Todos os valores no grupo tratado com rhIGF-I eram maiores do que os observados no grupo placebo, no estádio de Tanner correspondente (p<0,01). Os níveis de IGF-I livre observados no grupo rhIGF-I eram semelhantes aos medidos num grupo de controlos de eutiróide saudáveis (média +_ DP) , incluindo controlos pré-púberes (11,4 + 10,3 ng/ml) e 19 adolescentes no estádio 2-4 de Tanner (14,5 + 12,3 ng/ml). 59 7 7

\ !f \\ ^ V* V

Quattrin et al.r "Low Plasma-Free IGF-I leves in IDDM: Additional Evidence foa a Bi-hormonal Defect in Diabetes", apresentação na 56a sessão cientifica da ADA - São Francisco, CA, 8, 18 de Junho; Quattrin et al., Diabetes, 45 suppl. 2:53 (Maio 1996).

Medições de segurança

Excepto para um paciente, que sofreu um episódio de síncope (descrito acima), a única experiência adversa registada com uma frequência apreciável foi a hipoglicémia. Os episódios hipoglicémicos médios, de 2, eram semelhantes em ambos os grupos, durante o período de carga. Estes aumentaram significativamente no grupo rhIGF-I vs Placebo durante o período de tratamento (6 vs 3, p< 0,05) . No entanto, quando determinado pelo estudo semanal, o aumento no número de fenómenos hipoglicémicos era significativamente maior no grupo rh-IGF-I, apenas na primeira semana de tratamento (1,6 + 1,4 vs 0,9 + 1,6, p< 0,05). No que respeita à altura do dia, o número médio de episódios hipoglicémicos era significativamente maior no grupo de rhIGF-I vs. placebo, apenas antes do pequeno-almoço e antes do almoço, ao longo de todo o período de tratamento (p < 0,05). Não houve nenhuma correlação entre o número de fenómenos hipoglicémicos e o nível de HbAi, ou de IGF-I no plasma, no dia 28 de tratamento.

Os perfis bioquímico, de lípidos e tiróide eram normais no início de cada período de carga e permaneceram nos limites normais durante a duração do estudo. O perfil glicémico global melhorado no grupo rhIGF-I não foi acompanhado por um aumento significativo de peso corporal no dia 28 (de 52 + 13 kg a 53 + 13 kg no grupo de placebo e de 54 + 16 kg a 55 +_ 17 kg no grupo rhIGF-I) . 60

ι | i DISCUSSÃO:

Este exemplo mostra um ensaio controlado com placebo em pacientes IDDM, demonstrando que a terapia de substituição hormonal dupla, crónica, com IGF-I mais insulina é capaz de produzir, com segurança um melhor controlo glicémico do que a insulina sozinha. Além disso, conseguiu-se um melhor controlo com a utilização de significativamente menos insulina. Uma vez que as melhorias prolongadas no controlo glicémico estão claramente ligadas a resultados clínicos melhorados (DCCT Research Group, supra), esta descoberta pode ter implicações grandes no tratamento futuro da IDDM.

Uma vez que as concentrações de IGF-I do pico ocorrem 2-3 horas após a injecção sc, o efeito hipoglicémico agudo, persistente, observado neste estudo, sugere que a suplementação de rhIGF-I contribui unicamente para a regulação de glucose. Isto é ainda suportado pelo facto de, embora se ter deixado e encorajado que todos os indivíduos em ambos os grupos utilizassem tanta insulina quanto o necessário para alcançar a sua glucose alvo, a administração concomitante de rhIGF-I resultou num melhor controlo glicémico, associado com uma dose de insulina significativamente menor. 0 único fenómeno adverso significativo observado durante o estudo, em ambos os grupos rhIGF-I e placebo, foi a hipoglicémia. Os episódios eram muito comuns no início e final da manhã. De notar que não houve episódios graves e todos os fenómenos foram resolvidos com administração oral de hidratos de carbono. No presente estudo, não se incluiu 61 \ .j

uma técnica ou concepção para separar um verdadeiro aumento na frequência hipoglicémica de um aumento na consciência de existir hipoglicémia. É possível que o maior número de fenómenos hipoglicémicos referidos seja secundário à maior consciência de existência de hipoglicémia após administração de rhIGF-I, como anteriormente descrito por Kerr et al., American Diabetes Association, supra. Não se observaram nenhuns dos efeitos secundários adversos, graves, anteriormente descritos durante a administração de rhIGF-I. A baixa taxa de desistência (9,3%) e o facto de apenas dois pacientes pedirem para ser descontinuados do estudo, demonstra também a segurança e a baixa taxa de efeitos adversos durante este ensaio de 4 semanas.

Em contraste com as descobertas de Boulware et al., supra, não se observaram nenhumas anomalias bioquímicas durante o estudo. Além disso, não foi confirmado que o rhIGF-I diminuísse os triglicéridos e a razão entre o colesterol total e colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL), como referido por Guler et al., Acta Paediatr. Scand., 367, supra. Os perfis de lípidos estavam na gama normal ou próximo, para a maioria dos indivíduos, antes de entrar no ensaio (dia 1 colesterol médio 172 + 32 mg/kl ou 4 ,5 + 0,8 mmol/L) . Os efeitos de melhoria de lípidos do rhIGF-I podem ser melhor demonstrados em pacientes com anomalias mais substanciais antes do tratamento, ou por meio de diferentes níveis de dose ou regimes.

Em conclusão, estes resultados sugerem que a terapia de combinação de IGF-I/insulina pode proporcionar benefícios claros e únicos, para além da terapia com insulina sozinha. Uma vez que este ensaio utiliza apenas 62 uma dose bem tolerada, administrada uma vez por dia de manhã, é provável que doses mais elevadas, uma administração mais frequente e/ou uma troca da dose para a noite resultem num controlo glicémico ainda melhor.

Lisboa, 18 de Dezembro de 2001 ^/agente oficial da propriedade industrial

63

Claims

Γ\ \ ι \ ΐ l-Ai REIVINDICAÇÕES 1. Composição parentérica compreendendo IGF-I e insulina NPH, em quantidades desde cerca de 1 a 10 mg de IGF-I e de cerca de 0,2 a 2 mg de insulina NPH, num veiculo parentericamente aceitável.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o veículo é um tampão de sal de ácido acético.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicíonalmente cloreto de sódio e álcool benzílico ou fenol, num tampão acetato a pH de cerca de 5 a 6.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a razão de peso entre insulina NPH e IGF-I na composição é desde cerca de 10:1 a 1:50.
5. Composição compreendendo IGF-I e insulina NPH num tampão de sal de ácido acético, a um pH de cerca de 4,5-8.
6. Composição compreendendo IGF-I e insulina NPH, numa razão de peso entre insulina NPH e IGF-I de cerca de 10:1 a 1:50 (p/p) , de cerca de 0,05 a 0,3M de um osmolito, de cerca de 0,1 a 10 mg/ml de um estabilizante e de cerca de 5 a 100 mM de um tampão de um sal de ácido acético, a um pH de cerca de 5 a 7.
7. Método para preparar a composição de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a mistura de insulina NPH com uma formulação de IGF-I, compreendendo de cerca de 2 a 20 mg/ml de IGF-I, de cerca de 2 a 50 mg/ml de cloreto de 1 «

sódio, de cerca de 1 a 15 mg/ml de um estabilizante e um tampão a um pH de cerca de 5 a 5,5.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a formulação de IGF-I compreende de cerca de 8 a 12 mg/ml de IGF-I, de cerca de 5 a 6 mg/ml de cloreto de sódio, um estabilizante que consiste de cerca de 8 a 10 mg/ml de álcool benzilico ou de cerca de 2 a 3 mg/ml de fenol, ou simultaneamente de cerca de 8 a 10 mg/ml de álcool benzilico e de cerca de 2 a 3 mg/ml de fenol e uma solução tamponada de acetato de sódio a cerca de 50 mM, a um pH de cerca de 5,4 e a insulina NPH tem uma concentração de cerca de 4 mg/ml.
9. Kit compreendendo: (a) um recipiente compreendendo IGF-I num tampão de um sal de ácido acético farmaceuticamente aceitável, a um pH de cerca de 4,5 a 8; (b) um recipiente compreendendo insulina NPH farmaceuticamente aceitável; e (c) instruções para combinar os conteúdos dos recipientes (a) e (b), para se obter uma formulação farmaceuticamente aceitável.
10. Kit de acordo com a reivindicação 9, em que o recipiente (a) compreende adicionalmente cloreto de sódio e álcool benzilico ou fenol, ou ambos, no tampão a um pH de cerca de 5,0 a 5,5.
11. Kit de acordo com a reivindicação 9, em que os recipientes são frascos e as instruções especificam a combinação dos conteúdos dos recipientes (a) e (b) numa seringa, para injecção imediata. 2 Η
12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, para utilização num método para o tratamento de uma desordem hiperglicémica num mamífero, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz da referida composição.
13. composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, para utilização num método para o tratamento de uma desordem hiperglicémica num mamífero, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz da referida composição e adicionalmente de uma quantidade eficaz de um agente hipoglicémico. Lisboa, 18 de Dezembro de 2001

UjfeNTG OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL ! 3