JP4138826B2 - プレニルトランスフェラーゼの阻害剤 - Google Patents
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Description
CA1A2X
(C=システイン、A1及びA2=イソロイシン、ロイシン又はバリン、X=メチオニン又はセリン)
のシステイン186上でコレステロール生合成の中間体ファルネシルピロホスフェート(FPP)によって修飾される。このファルネシル化反応に続いて、A1A2Xトリペプチドのペプチダーゼ除去と残留システインのカルボキシルメチル化とが生ずる。処理されたp21rasタンパク質は形質膜の内面に結合する(10−14)。
U.S. 5,141,851
WO 91/16340
WO 92/18465
EPA 0456180 A1
EPA 0461869 A2
EPA 0512865 A2
EPA 0520823 A2
EPA 0523873 A1。
上記開示のうち、EPA0520823A2はファルネシルタンパク質トランスフェラーゼと癌遺伝子タンパク質rasのファルネシル化との阻害に有用である化合物を開示する。EPA0520823A2の化合物は式:
Cys−Xaa1−dXaa2−Xaa3
によって示される化合物又はその製薬的に受容される塩であり、上記式においてCysはシステインアミノ酸であり;Xaa1は天然L−異性体形のアミノ酸であり;dXaa2は非天然D−異性体形のアミノ酸であり;Xaa3は天然L−異性体形のアミノ酸である。
システイン Cys C
グリシン Gly G
イソロイシン Ile I
ロイシン Leu L
リシン Lys K
メチオニン Met M
フェニルアラニン Phe F
セリン Ser S
トレオニン Thr T
バリン Val V
EPA0461869は式:
Cys−Aaa1−Aaa2−Xaa
[式中、Aaa1とAaa2は脂肪族アミノ酸であり、Xaaはアミノ酸である]で示される、Rasタンパク質のファルネシル化を阻害する化合物を述べている。開示される脂肪族アミノ酸はAla、Val、Leu及びIleである。好ましい化合物はAaa1がValであり、Aaa2がLeu、Ile又はValであり、XaaがSer又はMetであるような化合物である。好ましい特定の化合物を次に挙げる:
Cys−Val−Leu−Ser
Cys−Val−Ile−Met
Cys−Val−Val−Met
米国特許第5,141,851号とWO91/16340とは精製されたファルネシルタンパク質トランスフェラーゼとそれに対するある種のペプチド阻害剤、例えば、CVIM、TKCVIM及びKKSKTKCVIMとを開示している。
WO92/18465は、rasタンパク質を包含するタンパク質の酵素メチル化を阻害するある種のファルネシル化合物を開示する。
本発明によると、式(A−L):
{式中、R1'は下記を表す:
(i)水素;
(ii)低級アルキル;
(iii)アルケニル;
(iv)アルコキシ;
(v)チオアルコキシ;
(vi)ハロ;
(vii)ハロアルキル;
(viii)アリール−L2−[式中、L2は存在しないか又は−CH2−、−CH2CH2−、−CH(CH3)−、−O−、−S(O)q(式中、qは0、1若しくは2である)、−N(R’)−(式中、R’は水素若しくは低級アルキルである)、又は−C(O)−であり、アリールはフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル及びインデニルからなる群から選択され、アリールは非置換であるか又は置換されている];又は
(ix)複素環−L3−[式中、L3は存在しないか又は−CH2−、−CH2CH2−、−CH(CH3)−、−O−、−S(O)q(式中、qは0、1若しくは2である)、−N(R’)−(式中、R’は水素若しくは低級アルキルである)、又は−C(O)−であり、複素環は単環状複素環(式中、複素環は非置換であるか若しくは低級アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ハロ、ニトロ、オキソ(=O)、アミノ、N−保護アミノ、アルコキシ、チオアルコキシ及びハロアルキルから成る群から独立的に選択される1、2若しくは3個の置換基によって置換されている)である];
R1aは水素又は低級アルキルであり;
R2'は下記を表す:
(i)
[式中、R12aは水素、低級アルキル又は−C(O)O−R13(式中、R13は水素若しくはカルボキシ保護基である)であり、R12bは水素又は低級アルキルである、但し、R12aとR12bが両方とも水素であることはない];
(ii)−C(O)NH−CH(R14)−C(O)OR15[式中、R14は、
(a)低級アルキル、
(b)シクロアルキル、
(c)シクロアルキルアルキル、
(d)アルコキシアルキル、
(e)チオアルコキシアルキル、
(f)ヒドロキシアルキル、
(g)アミノアルキル、
(h)カルボキシアルキル、
(i)アルコキシカルボニルアルキル、
(j)アリールアルキル、又は
(k)アルキルスルホニルアルキルであり、
R15は水素、又はカルボキシ保護基である];又は
(iii)
R3'は
[式中、AはO又は2Hを表し、
R0はSH、NH2又はCxHy−SO2−NH−(式中、CxHyは直鎖の飽和若しくは不飽和炭化水素であり、xは1〜20であり、yは3〜41(41を包含する)である]であり;
L1は−NH−である}
で示される化合物又はその製薬的に受容される塩若しくはプロドラッグが提供される。
CβX (I)
[式中、Cはシステインラジカル又はシステインラジカルの還元形(R−2−アミノ−3−メルカプトプロピルアミン)であり;βは非ペプチドアミノアルキル−若しくはアミノ−置換フェニルカルボン酸であり;Xはアミノ酸のラジカル、好ましくはMetである]で示される新規なペプチド模倣体群がヒト腫瘍p21rasファルネシルトランスフェラーゼに対して高い阻害効力を有し、ヒト癌腫の腫瘍増殖を阻害するという研究結果に基づく。任意の他の天然又は合成アミノ酸もこの位置に用いることができる。本発明はまた、式(I)の製薬的に受容される塩及びプロドラッグをも包含する。
これに関して、本発明の特に好ましい化合物は、図1Aによって説明されるFTI−276のメチルエステル形である。本発明の上記プロドラッグ態様は、本発明の化合物にのみではなく、先行技術のペプチド阻害剤CA1A2X並びに以下に記載するような化合物の総合的効果を改良するために生物学的に使用される可能性を有する他のペプチドにも適用可能である。
C△ (II)
[式中、Cはシステイン又は還元されたシステインであり、△は、ペプチドアミノ酸を包含しないが、以下に述べるように、サイズにおいてA1A2Xと本質的に一致する、例えば3−アミノメチル−ビフェニル−3’−カルボン酸のような、アリール又は複素環式置換基を表す]によって説明されることができる。本発明はまた、式(II)の製薬的に受容される塩及びプロドラッグをも包含する。
C0B (III)
[式中、C0は
であり、
AはO又は2Hであり、
R0はSH、NH2又はCxHy−SO2−NH−(式中、CxHyは直鎖の飽和若しくは不飽和炭化水素であり、xは1〜20であり、yは3〜41(41を包含する)であり;Bは−NHR(式中、Rはアリール基である)を表す]
によって説明されることができる。本発明は式(III)の製薬的に受容される塩とプロドラッグをも包含する。本発明の好ましい1実施態様では、Rは、式:
[式中、R1とR3はH又はCOOHを表し;R2はH、COOH、CH3又はCOOCH3を表し;R4はH又はOCH3を表し;Aは2H又はOを表す]で示されるような、1個以上の−COOH基及び/又は低級アルキル基(例えば、メチル基)によって置換されたビフェニルである。この式は、Val−Ile−Metトリペプチドを模倣するが、制限された形態的フレキシビリティを有する一連の4−アミノ−3’−カルボキシビフェニル誘導体を表す。システインアミド結合の還元(式中、AはH、Hである)は完全な非ペプチドRasCAAX模倣体を提供する。
本発明の特徴をCVIM(EP0461869及び米国特許第5,141,851号参照のこと)及びC−4ABA−Mとして知られたCAAXテトラペプチドを参照することによって本明細書で説明する。これらの化合物はそれぞれCys−Val−Ile−Met及びCys−4アミノ安息香酸−Metであり、式中Cysはシステインラジカルであり、Metはメチオニンラジカルである。
CβL (IV)
[式中、Cはシステインラジカル、又はシステインラジカルの還元形(R−2−アミノ−3−メルカプトプロピルアミン)を意味し;βは非ペプチドアミノアルキル−又はアミノ−置換フェニルカルボン酸のラジカルであり;Lはロイシン又はイソロイシンのラジカルである]で示される新規なペプチド模倣体群がゲラニルゲラニルトランスフェラーゼに対して高い阻害効力を有し、癌遺伝子K−Ras4Bのプロセシングとシグナリングとを分断すると言う研究結果に基づく。本発明はまた式(IV)の製薬的に受容される塩とプロドラッグをも包含する。
本発明の好ましいカルボキシ保護化合物は、保護されたカルボキシ基が低級アルキル、シクロアルキル又はアリールアルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、sec-ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステル等、又はアルカノイルオキシアルキル、シクロアルカノイルオキシアルキル、アロイルオキシアルキル若しくはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルである化合物である。
本明細書で用いられる“アルカノイルアミノアルキル”なる用語は、R71−NH−[式中、R71はアルカノイル基である]が付加した低級アルキルラジカルを意味する。
本明細書で用いられる“アルカノイルオキシアルキル”なる用語は、アルカノイルオキシ基が付加した低級アルキルラジカルを意味する。
本明細書で用いられる“アルコキシアルコキシ”なる用語は、R31O−R32O−[式中、R31は上記で定義したような低級アルキルであり、R32はアルキレンラジカルである]を意味する。
等も包含する。
[式中、X*は−CH2−、−CH2O−又は−O−であり、Y*は−C(O)−又は−(C(R”)2)v−[式中、R”は水素又はC1−C4アルキルであり、vは1、2又は3である]で示される化合物、例えば、1,3−ベンゾジオキソリル、1,4−ベンゾジオキサニル等をも包含する。
(a) ヒドロキシ、
(b) −SH、
(c) ハロ、
(d) オキソ(=O)、
(e) チオキソ(=S)、
(f) アミノ、
(g) −NHOH、
(h) アルキルアミノ、
(i) ジアルキルアミノ、
(j) アルコキシ、
(k) アルコキシアルコキシ、
(l) ハロアルキル、
(m) ヒドロキシアルキル、
(n) アルコキシアルキル、
(o) シクロアルキル、
(p) シクロアルケニル、
(q) アルケニル、
(r) アルキニル、
(s) アリール、
(t) アリールアルキル、
(u) −COOH、
(v) −SO3H、
(w) 低級アルキル、
(x) アルコキシカルボニル、
(y) −C(O)NH2、
(z) −C(S)NH2、
(aa)−C(=N−OH)NH2、
(bb)低級アルキル−C(O)−、
(cc)低級アルキル−C(S)−、
(dd)ホルミル、
(ee)シアノ、及び
(ff)ニトロ
から成る群から独立的に選択される1、2又は3個の置換基によって置換されることもできる。
言及を容易にするために、本明細書において下記略号を用いることができる:
FTアーゼ:ファルネシルトランスフェラーゼ
GGTアーゼ:ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ
SDS−PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS:リン酸塩緩衝化生理的食塩水
CAAX:Cがシステインであり、Aが脂肪族アミノ酸であり、Xがアミノ酸であるテト
ラペプチド
DTT:ジチオトレイトール
DOC:デオキシコーレート(deoxycholate)
BSA:ウシ血清アルブミン
GGTアーゼI:ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼI
PAGE:ポリアクリルアミドゲル電気泳動
MAPK:マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ
FTI:ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤
GGTI:ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤
PMSF:フェニルメチルスルホニルフルオリド
本発明の好ましい実施態様の1つである式(I)のペプチド模倣体は、当該技術分野において慣用的である方法を用いて製造されることができる。好ましくは、βは2−フェニル−4−アミノ安息香酸であるが、例えばテトラヒドロイソキノリン−7−カルボン酸、2−アミノメチルピリジン−6−カルボン酸又はその他の複素環式誘導体のような束縛された誘導体(constrained derivative)も使用可能である。βがアミノメチル安息香酸(特に、3−アミノメチル安息香酸)である化合物は米国特許出願第08/062,287号(本明細書に援用される)に開示されている。βの酸成分はシステインと便利に反応するので、βのアミノ基とシステインのカルボキシル基とが反応して、アミド基を形成し、反応物の他の反応性置換基は好ましくない反応から適当に保護される。還元システイン系列の化合物の場合には、βのアミノ基が適当に保護されたシステイナル(cysteinal)と反応する。次に、Xによって表されるアミノ酸(好ましくは、Met)がそのアミノ基を介してスペーサー化合物βの脱保護され、活性化されたカルボキシル基と反応する。他の保護基の除去による脱保護後に、式(I)化合物が得られる。
△1−C−β−X
式中、C、X、β及び△は既述した通りであり、△1はシステイン硫黄原子を介してシステインに結合したホスホネート基である。
A.N−BOC−4−アミノ安息香酸
4−アミノ安息香酸(10g,72.9mmol)をジオキサン(145.8ml)と0.5M NaOH(145.8ml)との混合物中に入れた。この溶液を0℃に冷却し、ジ−t−ブチルジカルボネート(23.87g,109.5mmol)を加えた。反応混合物を室温まで温度上昇させ、一晩撹拌した。翌日、ジオキサンを除去し、残渣を酸性にして、酢酸エチル中に抽出した。酢酸エチル画分を一緒にし、1N HClで洗浄して、未反応出発物質を除去した。溶液をNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチル/ヘキサンから再結晶して、12.2g(70.6%)の純粋な生成物を得た。
mp189−190℃;1H NMR(CD3OD)1.52(9H,s),7.49(2H,d,J=8.6Hz),7.91(2H,d,J=8.6Hz),9.28(1H,s);13C NMR(CD3OD)28.59,81.29,118.54,125.30,131.81,145.70,155.00,169.80;分析:計算値,C12H15NO4としてC:60.76,H:6.37,N:5.90;実測値,C:60.52,H:6.43,N:5.83;HRMS 計算値,C12H15NO4として、237.0961,実測値,237.1001.
乾燥した窒素充填フラスコに、乾燥CH2Cl2(148ml)中のN−BOC−4−アミノ安息香酸(8.77g,36.97mmol)をメチオニンメチルエステル塩酸塩(8.12g,40.66mmol)と共に入れた。この溶液を氷浴中で冷却し、トリエチルアミン(6.7ml)と、EDCI(7.80g,40.66mmol)と、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT,5.50g,40.66mmol)とを加えた。この混合物を一晩撹拌し、さらにCH2Cl2で希釈し、1M HCl、1M NaHCO3及び水によってそれぞれ3回抽出した。このCH2Cl2をMgSO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。固体を酢酸エチル/ヘキサンから再結晶して、9.72g(71.3%)の純粋な生成物を得た。
mp184−185℃;1H NMR(CDCl3)1.53(9H,s),2.06−2.18(4H,m),2.23−2.33(1H,m),2.59(2H,t,J=7.6Hz),3.80(3H,s),4.92(1H,m),7.45(2H,d,J=8.7Hz),7.77(2H,d,J=8.7Hz);13C NMR(CDCl3)15.59,28.34,30.15,31.64,52.10,52.73,81.20,117.73,127.8,128.33,141.88,152.33,166.50,172.75;分析:計算値,C18H26N2O5SとしてC:56.53,H:6.85,N:7.29;実測値,C:56.47,H:6.86,N:7.29;m/z(EI)382(M).
N−BOC−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステル(3.53g,9.59mmol)をCH2Cl2(30〜35ml)中に入れ、これに3M HCl/Et2O(38.4ml)を加えた。放置した後に、白色沈殿が形成された。2時間後に、溶液をデカントし、結晶を遠心分離によって回収した。次に、結晶を新しいエーテルによって数回洗浄し、真空ポンプ上で一晩乾燥させた。この間に、濾液は一晩放置して、さらに生成物を沈殿させた。この第2画分をエーテルで洗浄して、真空ポンプ上で一晩乾燥させた。純粋な完全脱保護物質の総収量は2.87g(93.9%)収率であった。
mp158−164℃;1H NMR(CDCl3)2.10(3H,s),2.12−2.29(1H,m),2.52−2.71(1H,m),2.59(2H,t,J=7.6Hz),3.75(3H,s),4.79(1H,m),7.02(2H,d,J=8.6Hz),7.55(2H,d,J=8.6Hz);13C NMR(CDCl3)15.23,31.43,31.53,52.91,52.43,124.35,130.56,135.31,135.76,168.95,173.87;HRMS 計算値,C13H18N2O3Sとして,282.1038;実測値,282.1009.
乾燥THF(104ml)を含有する乾燥したN2充填フラスコに、N−BOC−S−トリチル−Cys(2.86g,6.54mmol)とトリエチルアミン(1.2ml)とを入れた。これを氷/塩浴を用いて、−10℃に冷却し、イソブチルクロロホルメート(0.9ml)、IBCF、を加えた。この溶液を−10℃において40分間撹拌し、乾燥CH2Cl2(34.1ml)中のHCl−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステル(2.08g,6.54mmol)をトリエチルアミン(1.2ml,1.3当量)と共に加えた。この溶液を室温に温度上昇させ、N2下で一晩撹拌した。次に、溶媒を真空中で除去し、残渣をCH2Cl2中に入れ、1M HClと、H2Oと、ブライン(飽和NaCl)とによってそれぞれ数回抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。次に、淡黄色泡状物をシリカゲル上で2:1ヘキサン、酢酸エチル溶離用混合物を用いてクロマトグラフィーして、2.62g(54.9%)の純粋な生成物を得た。
mp110−111℃;〔α〕25 D=−8.0°(c=1,CH3OH);1HNMR(CDCl3)1.44(9H,s),2.11−2.18(4H,m),2.22−2.34(1H,m),2.59(2H,t,J=7.4Hz),2.66−2.83(2H,m),3.80(3H,s),3.98(1H,m),4.84(1H,m),4.92(1H,m),6.96(1H,d,J=7.7Hz),7.23−7.33(9H,m),7.43−7.46(6H,m),7.51(2H,d,J=8.5Hz),7.74(2H,d,J=8.5Hz),8.51(1H,s);13C NMR(CDCl3)15.53,28.34,30.72,30.89,33.60,52.23,52.88,54.95,60.50,67.13,80.64,118.81,119.31,126.94,128.07,128.30,129.53,141.06,144.38,156.31,167.02,170.13,174.49;分析:計算値,C40H44N3O6S2・H2OとしてC:64.50,H:6.22,N:5.64;実測値,C:64.14,H:6.19,N:5.56.
N−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステル(1g,1.37mmol)をフラスコに入れ、CH3OH(13.7ml)中に加えた。この溶液に、CH3OH(13.7ml)中の塩化第2水銀(0.75g,2.74mmol)の溶液を加えた。塩化第2水銀を添加すると、白色沈殿が形成され始めた。混合物をスチーム浴上で65℃に35分間加熱し、次に、冷却し、沈殿を濾過し、少量の(sparingly)冷CH3OHで洗浄した。フィルター上で数分間乾燥させた後に、ガス供給口と排出口とを備えた50mlの三つ口フラスコ中に固体を入れた。約20〜30mlのCH3OHを加え、この不均質な溶液に通してH2Sガスを30分間バブルさせた。ガスが添加されると、白色溶液は橙色に変わり、次に黒色に変わった。溶液を遠心分離し、透明な無色液体を乾燥させて、白色の泡状物を得た。この固体を真空ポンプ上に短時間乗せた後に、CH2Cl2(10ml)中に入れ、3〜4M HCl/Et2O溶液によって生成物を沈殿させた。沈殿を遠心分離によって回収し、pHが中性になるまで、エーテルによって洗浄した。真空下で一晩乾燥させた後に、0.38g(66.5%)の生成物が得られた、これはHPLCによって>95%純度であった。
mp発泡141−143℃;分解195℃;〔α〕25 D=+3°(c=1,H2O);1H NMR(CD3OD)2.09(3H,s),2.14−2.26(1H,m),2.51−2.67(3H,m),3.05(1H,dd,J=14.8Hz,7.3Hz),3.17(1H,dd,J=14.8Hz,4.8Hz),3.74(3H,s),4.17(1H,J=7.3Hz,4.8Hz),4.75−4.81(1H,m),7.74(2H,d,J=8.6Hz),7.87(2H,d,J=8.6Hz),8.67(1H,d,J=8.4Hz);13C NMR(CD3OD)15.23,26.38,31.43,31.56,52.88,53.30,56.92,120.46,129.58,130.75,142.33,166.91,169.66,174.06;分析:計算値,C16H24ClN3O4S2として、C:45.55,H:5.73,N:9.96;実測値,C:45.31,H:5.84,N:9.79.
HCl−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.51g,0.7mmol)をTHF(4.1ml)中に入れ、この溶液に0.5M LiOH(2.9ml)を0℃において加えた。この不均質な溶液を0℃において35〜40分間撹拌し、次にTHFを真空中で除去した。残渣をCH2Cl2中に入れ、1M HClによって3回洗浄した後に、ブラインによって洗浄した。この有機溶液をNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。淡黄色固体を3mlのCH2Cl2中に入れ、生成物を3〜4M HCl/Et2Oによって沈殿させた。固体を遠心分離によって回収し、エーテルによって、エーテル洗液が中性になるまで、数回洗浄し、HPLCが純粋に思われるようになるまで、このプロセスを数回繰り返した。総収量78.6mg(27.5%)の純粋生成物が得られた。
A.N−BOC−4−アミノ−3−メチル安息香酸
4−アミノ−3−メチル安息香酸(5g,33.1mmol)をN−BOC−アミノ安息香酸と同じ方法によって反応させた。橙褐色固体を酢酸エチルとヘキサンから再結晶させて、4.99g(60%)の黄褐色プリズム結晶を得た。
mp180−182℃;1H NMR(CD3OD)1.51(9H,s),2.27(3H,s),7.66(1H,d,J=8.1Hz),7.79−7.82(2H,m),8.32(1H,s);13C NMR(CD3OD)17.98,28.62,81.47,123.12,127.05,129.14,130.65,132.99,142.45,155.33,168.70;分析:計算値,C13H17NO4としてC:62.15,H:6.82,N:5.58;実測値,C:62.07,H:6.86,N:5.46;m/z(EI)251;HRMS 計算値,C13H17NO4として251.1158;実測値,251.1153.
実施例1においてN−BOC−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べた方法に従って、N−BOC−4−アミノ−3−メチル安息香酸(2.00g,7.96mmol)を、乾燥CH2Cl2(31.8ml)中のメチオニンメチルエステル塩酸塩(1.75g,8.76mmol)、EDCI(1.68g,8.76mmol)、HOBT(1.18g,8.76mmol)及びEt3N(1.4ml)と反応させた。粗生成物を酢酸エチルとヘキサンから再結晶して、2.61g(85.7%)の純粋生成物を得た。
mp163−165℃;1H NMR(CDCl3)1.54(9H,s),2.06−2.18(4H,m),2.23−2.34(4H,m),2.59(2H,t,J=6.8Hz),3.80(3H,s),4.92(1H,m),6.45(1H,s),6.88(1H,d,J=7.5Hz),7.63(1H,d,J=8.6Hz),7.66(1H,s),8.05(1H,d,J=8.6);13C NMR(CDCl3)15.47,17.61,28.22,30.03,31.55,51.93,52.57,81.04,118.73,125.62,127.66,129.54,139.89,152.34,166.58,172.66.
N−BOC−4−アミノ−3−メチルベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.99g,2.59mmol)をCH2Cl2(15〜20ml)中に溶解し、3M HCl/Et2O(20.7ml)によって沈殿させた。真空ポンプ上で一晩乾燥させた後に、0.83g(96.6%)の淡橙色沈殿が得られた。
mp157−159℃;1H NMR(CD3OD)2.04(3H,s),2.11−2.25(1H,m),2.47(3H,s),2.52−2.68(3H,m),3.74(3H,s),4.75−4.80(1H,m),7.48(1H,d,J=8.2Hz),7.81(2H,d,J=8.2Hz),7.87(1H,s);13C NMR(CD3OD)15.23,17.28,31.43,31.51,52.91,53.37,124.41,127.85,131.99,133.63,134.14,135.65,169.05,173.84;分析:計算値,C14H21N2O3SとしてC:50.52,H:6.36,N:8.42;実測値,C:50.71,H:6.40,N:8.34.
上述したように、乾燥THF(25ml)中のN−BOC−S−トリチル−システイン(0.55g,1.25mmol)をEt3N(0.19ml)、IBCF(0.16ml,1.25mmol)と−10℃において反応させた。乾燥CH2Cl2(6.5ml)中のHCl−4−アミノ−3−メチルベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.42g,1.25mmol)をEt3N(0.26ml)と共に−10℃において加え、この反応混合物を窒素下で一晩撹拌した。次に、上述したように、仕上げ処理(workup)を実施し、粗生成物をシリカゲル上で溶離用混合物としてヘキサンと酢酸エチルとの2:1混合物を用いてクロマトグラフィーして、0.12g(13.9%)の純粋な生成物を得た。
mp83−85℃;〔α〕25 D=−14.0°(c=1,CH3OH);1H NMR(CDCl3)1.44(9H,s),2.10−2.17(4H,m),2.22−2.32(4H,m),2.61(2H,t,J=6.57Hz),2.68−2.70(1H,m),2.85−2.90(1H,m),3.79(3H,s),3.93−4.08(1H,s),4.84−4.88(1H,m),4.90−4.95(1H,m),6.95(1H,d,J=7.00Hz),7.20−7.33(9H,m),7.39(1H,d,J=6.96Hz),7.44−7.47(6H,m),7.59(1H,d,J=8.46Hz),7.65(1H,s),8.12(1H,d,J=8.22Hz),8.31(1H,s);13C NMR(CDCl3)15.39,17.55,27.70,28.17,30.00,31.43,31.41,51.90,52.51,59.95,67.30,80.74,84.54,120.74,125.33,126.70,126.83,127.89,128.00,129.40,138.92,144.22,166.50,166.89,168.87,172.56.
THF(2.1ml)中のN−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノ−3−メチルベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.27g,0.37mmol)を0.5M LiOH(2.9ml)によって室温において1.5時間にわたって脱保護した。溶媒を真空中で除去し、残渣をCH2Cl2中に入れ、1N HClによって3回抽出した後にブラインによって抽出した。有機溶液をNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去し、0.19g(73.5%)の遊離酸を得た。この遊離酸をCH2Cl2(1.4ml)中に入れ、Et3SiH(0.04ml)を加え、その後にトリフルオロ酢酸、TFA(1.4ml)を加えた。この反応混合物を室温において1時間撹拌した。TFAを除去し、残渣をH2O中に溶解し、トリチル誘導体の全てが除去されるまで、Et2Oによって抽出した。水相(water)を凍結乾燥させ、粗生成物のHPLC(crude HPLC)はこの物質が純粋ではなく、ジアステレオマーを含有することを示した。生成物を水とアセトニトリル中の0.1%TFA溶離用混合物を用いる、分取(preparative)HPLCで精製して、2種類のジアステレオマーを得て、主要成分(HPLCトレース中の主要化合物によって決定)のみを特徴づけた。
mp昇華112℃;発泡158−163℃,分解196−197℃;〔α〕25 D=+12.7°(c=0.6 H2O),〔α〕25 D=+21.0°(c=1 H2O);1H NMR(CD3OD)2.09−2.17(4H,m),2.19−2.30(1H,m),2.36(3H,s),2.57−2.65(2H,m),3.08(1H,dd,J=14.6Hz,6.9Hz),3.19(1H,dd,J=14.6Hz,5.2Hz),4.25(1H,dd,J=6.9,5.2Hz),4.70−4.75(1H,m),7.64(1H,d,J=8.4Hz),7.69−7.73(1H,m),7.77(1H,s);13C NMR(CD3OD)15.23,18.28,26.54,31.5832.06,53.53,56.66,125.54,125.77,126.74,131.04,133.24,139.26,167.53,169.70,175.59.
A.N−BOC−4−アミノ−3−メトキシ安息香酸
4−アミノ−3−メトキシ安息香酸(1g,5.98mmol)をN−BOC−4−アミノ安息香酸と同じ方法によってジオキサン(12ml)と0.5M NaOH(12ml)中のジ−t−ブチルジカーボネート(1.96g,6.58mmol)と反応させた。1.50g(93.7%)の黄褐色結晶が酢酸エチルとヘキサンからの再結晶後に得られた。
mp176−178℃;1H NMR(CD3OD)1.52(9H,s),3.92(3H,s),7.56(1H,s),7.62(1H,d,J=8.4Hz),7.96(1H,s),8.03(1H,d,J=8.4Hz);13C NMR(CD3OD)28.53,56.35,81.78,112.01,118.58,124.20,125.76,133.84,149.04,154.20,169.60;HRMS 計算値,C13H17NO5として、267.1107;実測値,267.1103.
N−BOC−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルにおけると同様にEDCIを用いて、N−BOC−4−アミノ−3−メトキシ安息香酸(0.35g,1.31mmol)を、メチオニンメチルエステル塩酸塩(0.9g,1.43mmol)と反応させた。酢酸エチルとヘキサンからの再結晶後に、0.36g(57.2%)の純粋生成物を得た。
mp163−165℃;1H NMR(CDCl3)1.53(9H,s),2.09−2.18(4H,m),2.23−2.35(1H,m),2.60(2H,t,J=6.9Hz),3.80(3H,s),3.93(3H,s),4.92(1H,br s),6.93(1H,d,J=7.6Hz),7.25(1H,m),7.31(1H,d,J=10.2Hz),7.44(1H,s),8.15(1H,d,J=8.5Hz);13C NMR(CDCl3)15.47,28.23,30.09,31.48,52.06,52.54,55.81,80.82,98.06,109.38,116.66,119.31,131.52,147.23,152.31,166.57,172.58;m/z(FAB)413(M+1).
N−BOC−4−アミノ−3−メトキシベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.71g,1.79mmol)をCH2Cl2(4ml)中に入れ、3〜4M HCl/Et2O(12ml)によって沈殿させ、真空下で一晩乾燥させて、0.55g(88.3%)の赤色物質を得た。
mp176−177℃;1H NMR(CD3OD)2.08(3H,s),2.21(2H,m),2.61(2H,m),3.74(3H,s),4.02(3H,s),4.79(1H,m),7.50(1H,d,J=8.2Hz),7.57(1H,d,J=4.1Hz),7.67(1H,s);13C NMR(CD3OD)15.26,31.34,31.42,52.95,53.38,57.12,112.29,121.43,124.57,124.77,136.15,153.67,168.79,173.81.
上述したように、乾燥THF(27.5ml)中のN−BOC−S−トリチル−システイン(0.76g,1.74mmol)をEt3N(0.24ml)、IBCF(0.23ml,1.74mmol)と−10℃において反応させた。乾燥CH2Cl2(8.7ml)中のHCl−4−アミノ−3−メトキシベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.55g,1.58mmol)をEt3N(0.30ml)と共にこの混合物に加え、窒素下で一晩撹拌した。次に、実施例1においてN−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように、これを仕上げ処理し、粗生成物をシリカゲル上でヘキサンと酢酸エチルとの2:1混合物を用いてクロマトグラフィーして、0.18g(15.2%)の純粋な生成物を得た。
1H NMR(CDCl3)1.45(9H,s),2.05−2.33(5H,m),2.57−2.65(2H,m),2.68−2.72(1H,m),2.75−2.96(1H,m),3.78(3H,s),3.84(3H,s),4.90−5.00(1H,m),5.03−5.18(1H,m),7.17−7.48(17H,m),8.30−8.38(1H,m),8.65(1H,br s).
N−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノ−3−メトキシベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.18g,0.24mmol)をLiOHによって室温において上述のように脱保護して、遊離酸を得た。この遊離酸を次にCH2Cl2(1.2ml)中でEt3SiH(0.04ml,0.24mmol)とTFA(1.2ml)とによってさらに脱保護した。生成物を実施例1においてHCl−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンに関して述べたように仕上げ処理した、HPLCはこの生成物が不純であることを明らかにした。次に、この粗生成物を溶離用溶剤として水とアセトニトリル中の0.1%TFAを用いてHPLC上で精製して、ジアステレオマーであると思われる2種類の純粋なサンプルを得た。主要成分(HPLCトレース中の主要化合物によって決定)を下記のように特徴づけた。
mp昇華109℃,分解191−193℃;〔α〕25 D=+30.0°(c=1,H2O),〔α〕25 D=+19.0°(c=1,H2O);1H NMR(CD3OD)2.10(3H,s),2.12−2.18(1H,m),2.20−2.32(1H,m),2.53−2.71(2H,m),3.00(1H,dd,J=14.6,7.5),3.15(1H,dd,J=14.58,4.8),4.77(1H,dd,J=7.5,4.8),7.50(1H,d,J=8.4Hz),7.56(1H,s),8.23(1H,d,J=8.4Hz);13C NMR(CD3OD)15.20,26.65,31.60,31.76,53.27,56.58,56.76,111.04,121.08,122.14,130.85,131.85,150.88,167.21,169.61,175.36;m/z(FAB)遊離アミン,402(M+1).
A.4−ニトロ−フェニルトルエン
2−ブロモ−4−ニトロトルエン(2.16g,10.00mmol)とフェニルホウ酸(phenyl boric acid)(1.46g,12.00mmol)とを窒素下で無水DMF(25ml)中に溶解させた。この混合物に、Pd(Ph3P)4(0.58g,5%)を加えた。混合物を100℃において一晩加熱した。この溶液を1N HCl中に注入し、Et2Oによって抽出した。粗生成物を溶離剤としてヘキサンを用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーした。エタノールからの再結晶後に、1.23g(57.6%)の淡橙色針状結晶が得られた。
mp69−71℃;1H NMR(CDCl3)2.36(3H,s),7.29−7.40(2H,m),7.41−7.49(5H,m),8.07−8.10(2H,m);13C NMR(CDCl3)20.68,121.96,124.51,127.78,128.41,128.83,131.06,139.44,142.97,143.48,146.05;分析:計算値C13H11NO2として、C:73.26,H:5.20,N:6.57;実測値,C:73.10,H:5.12,N:6.50;m/z(EI)213;HRMS 計算値,C13H11NO2として、213.0790;実測値,213.0793.
4−ニトロ−2−フェニルトルエン(0.50g,2.34mmol)を水(4.6ml)とピリジン(2.3ml)中に溶解させた。この混合物を還流加熱し、KMnO4(1.85g,11.70mmol)を加えた。反応混合物を一晩加熱し、溶液を濾過し、沸騰水によって数回洗浄した。水溶液を酸性にして、生成物を酢酸エチル中に抽出した。酢酸エチルをNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去して、0.37g(67.9%)の純粋な淡黄色生成物を得た。
mp174−176℃;1H NMR(CD3OD)7.38−7.48(5H,m),7.96(1H,d,J=8.5Hz),8.21(1H,d,J=2.3Hz),8.28(1H,dd,J=8.48,2.37);13C NMR(CD3OD)122.95,126.09,129.27,129.42,129.49,131.56,139.26,140.42,144.41,150.17,170.52;m/z(EI)243(M).
乾燥CH2Cl2(4.9ml)中の4−ニトロ−2−フェニル安息香酸(0.30g,1.23mmol)、メチオニンメチルエステル塩酸塩(0.27g,1.35mmol)、EDCI(0.26g,1.35mmol)、HOBT(0.18g,1.35mmol)及びEt3N(0.19ml)を上記方法に従って反応させ、実施例1においてN−BOC−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように仕上げ処理した。酢酸エチルとヘキサンからの再結晶後に、0.41g(85.5%)の純粋生成物が単離された。
mp98−101℃;1H NMR(CDCl3)1.62−1.73(1H,m),1.79−1.88(1H,m),1.91(3H,s),1.99(2H,t,J=7.2Hz),3.59(3H,s),4.53(1H,m),6.45(1H,d,J=7.8Hz),7.33−7.40(5H,m),7.67(1H,d,J=8.3Hz),8.07−8.12(2H,m);13C NMR(CDCl3)14.92,29.11,30.67,51.51,52.29,121.86,124.74,128.27,128.60,128.69,129.52,137.50,140.56,141.02,148.09,167.23,171.23;m/z(FAB)389(M+1).
4−ニトロ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.35g,0.90mmol)を酢酸エチル(9.0ml)中に入れた。この混合物に、SnCl2・2H2O(1.02g,4.50mmol)を加え、反応を窒素下で1時間還流加熱した。混合物を氷上に注入し、溶液をNaHCO3を用いて塩基性にして、生成物を酢酸エチルによって数回(7〜8回)抽出した。酢酸エチル画分を一緒にし、ブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去して、0.24g(73.4%)の黄色固体を得た。
1H NMR(CDCl3)1.58−1.70(1H,m),1.80−1.92(1H,m),1.98(3H,s),2.06(2H,t,J=7.7Hz),3.62(3H,s),4.00(2H,br s),4.56−4.63(1H,m),5.84(1H,d,J=7.7Hz),6.50(1H,s),6.61(1H,d,J=8.4Hz),7.29−7.42(5H,m),7.58(1H,d,J=8.3Hz);13C NMR(CDCl3)15.02,29.25,31.25,51.57,52.15,113.27,115.88,123.52,127.56,128.37,128.44,130.92,140.66,141.44,148.53,168.58,171.91.
乾燥THF(11ml)中のN−BOC−S−トリチル−システイン(0.31g,0.66mmol)を実施例1においてN−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように−10℃においてEt3N(0.10ml)、IBCF(0.09ml,0.73mmol)と反応させた。乾燥CH2Cl2(3.5ml)中の4−アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.24g,0.66mmol)を加え、混合物を窒素下で一晩撹拌した。これを実施例1においてN−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように仕上げ処理し、乾燥後に、粗生成物をヘキサンと酢酸エチルとの2:1混合物を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーして、84.70mg(16.0%)の純粋生成物を得た。
mp100−103℃;1H NMR(CDCl3)1.41(9H,s),1.61−1.78(1H,m),1.84−1.95(1H,m),2.00(3H,s),2.05(2H,t,J=7.6Hz),2.63(1H,dd,J=12.7Hz,6.9Hz),2.72(1H,dd,J=12.7Hz,5.51Hz),3.64(3H,s),4.02(1H,br s),4.58−4.63(1H,m),4.90(1H,d,J=7.4Hz),6.10(1H,d,J=6.6Hz),7.18−7.30(10H,m),7.37−7.44(11H,m),7.50(1H,s),7.58(1H,d,J=8.2Hz),8.69(1H,s);13C NMR(CDCl3)15.21,28.20,29.38,31.24,33.00,51.77,52.35,54.15,67.30,80.85,118.18120.86,126.88,127.90,128.03,128.56,128.66,129.44,129.79,130.14,156.00,168.52,169.11,171.85.
N−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(84.70mg,0.11mmol)をTHF(0.62ml)中に入れ、これに、0.5M LiOH(0.32ml)を0℃において加えた。この混合物を0℃において35分間撹拌した。溶媒をロトバップ(rotovap)上での冷水浴を用いて真空中で除去した。残渣を実施例1においてHCl−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンに関して述べたように仕上げ処理し、60mgの遊離酸を得た。次に、これをCH2Cl2(0.8ml)中に溶解させ、Et3SiH(0.01ml)を加え、TFA(0.8ml)を加えた。この反応混合物を室温において1時間撹拌し、実施例2においてTEA・システイン−4−アミノ−3−メチルベンゾイルメチオニンに関して述べたように仕上げ処理した。凍結乾燥後に、0.0387g(84.0%)が得られた。HPLCは、エピマー化が生じなかったことを明らかにしたが、この物質をHPLC上で精製して、基準不純物(baseline impurities)を除去した。
mp150−154℃;〔α〕25 D=+21.5°(c=0.7,H2O/CH3OH);1H NMR(CD3OD)1.62−1.79(1H,m),2.00−2.10(5H,m),2.16−2.18(1H,m),3.03(1H,dd,J=14.7Hz,7.3Hz),3.15(1H,dd,J=14.7Hz,4.8Hz),4.46(1H,br s),7.37−7.41(5H,m),7.52−7.55(1H,m),7.65−7.67(2H,m);13C NMR(CD3OD)15.03,26.35,31.78,32.79,57.01,119.40,122.35,128.95,129.62,129.71,130.15,133.49,140.50,141.36,142.53,167.05,167.76,172.51;分析:計算値,C23H26F3N3O6S2としてC:49.20,H:4.67,N:7.48;実測値,C:49.14,H:4.71,N:7.42.
N−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.06g,0.075mmol)をメタノール(2ml)中に溶解させ、これにメタノール(1ml)中のHgCl2(0.04g)を加えた。この反応を上述のようにおこなって、HPLCによって15.7mgのやや不純な化合物を得た。
mp130−132℃;1H NMR(CD3OD)1.72−1.84(1H,m),1.90−2.24(6H,m),3.05(1H,dd,J=14.6Hz,8.5Hz),3.19(1H,dd,J=14.6Hz,3.6Hz),3.69(3H,s),4.22(1H,dd,J=.5Hz,3.6Hz),4.48−4.53(1H,m),7.33−7.43(5H,m),7.51(1H,d,J=8.9Hz),7.70−7.72(2H,m);13C NMR(CD3OD)15.04,26.36,30.88,31.36,52.85,53.05,56.93,119.42,122.38,128.88,129.55,129.73,130.05,133.17,140.55,141.32,142.52,166.92,172.61,173.58;分析:計算値,C24H29ClN3O6S2・2H2Oとして、C:51.20,H:5.86,N:8.14;実測値,C:51.23,H,5.60,N:8.22.
A.2−ブロモ−4−ニトロ安息香酸
2−ブロモ−4−ニトロトルエン(5.00g,23.14mmol)をピリジン(23ml)と水(46ml)中の溶解させた。この均質な混合物を60℃に加熱し、KMnO4(18.29g,115.7mmol)を細心に加えた。次に、混合物を一晩還流加熱した。この反応混合物を濾過し、沸騰水で洗浄した。溶液を次に酸性にして、酢酸エチル中に抽出し、Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗生成物のNMR(crude NMR)は残留出発物質を明らかにしたので、固体をNaOH中に入れ、ヘキサンによって洗浄した。水相を酸性にして、生成物を酢酸エチル中に抽出した。酢酸エチル画分を一緒にして、Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去して、3.72g(65.4%)を得た。
mp158−160℃;1H NMR(CD3OD)7.81(1H,d,J=8.5Hz),8.08(1H,d,J=8.5Hz),8.30(1H,s);13C NMR(CD3OD)121.96,122.75,129.36,132.24,139.52,149.54,167.75;分析:計算値,C7H4BrNO4+0.1酢酸エチルとして、C:34.88,H:1.90,N:5.50;実測値,C:34.68,H,1.86,N:5.82.
滴下ロートと還流冷却管とを装備した、乾燥したN2充填フラスコ中でMg削り屑(1.44g,59.43mmol)を乾燥THF(18.8ml)によって覆った。これに、Grignard反応の開始後に、THF(15ml)中の5−ブロモ−m−キシレン(10g,54.03mmol)を加えた。この添加は数分間にわたっておこない、反応混合物を、Mgの大部分が反応するまで、1〜2時間還流加熱した。次に、反応混合物を冷却し、トリイソプロピルボレート(24.9ml)を含有するN2充填フラスコに取り付けた滴下ロートに−70℃において移した。滴加を数分間にわたって実施し、混合物を室温に温度上昇させ、一晩撹拌した。灰色溶液を2M HCl上に注入すると、この溶液は直ちに黄色に変わった。溶液をEt2O中に抽出し、Et2O画分を一緒にして、MgSO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去して、2.41g(29.7%)を得た。
mp249−251℃;1H NMR(CDCl3)2.44(6H,s),7.23(1H,s),7.84(2H,s);13C NMR(CD3OD)21.36,133.28,134.39,137.48.
2−ブロモ−4−ニトロ安息香酸(0.50g,2.03mmol)と3,5−ジメチルフェニルボロン酸(0.34g,2.23mmol)とを無水DMF(ジメチルホルムアミド)(25ml)中に窒素下で溶解させた。この混合物に、CS2CO3(1.66g,5.08mmol)を加え、次にPd(Ph3P)4(0.12g,5%)を加えた。この混合物を100℃において一晩加熱した。この溶液を1N HCl上に注入し、Et2O中に抽出した。これをMgSO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をヘキサンと酢酸エチルとの9:1混合物を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーして、0.34g(61.7%)の純粋な生成物を得た。
1H NMR(CDCl3) 2.36(6H,s),6.99(2H,s),7.07(1H,s),8.03(1H,d,J=9.0Hz),8.23−8.25(2H,m);13C NMR(CDCl3)21.28,121.68,123.68,125.74,126.07,130.22,131.19,131.31,135.04,138.21,144.74,170.75.
乾燥CH2Cl2(2.2ml)中の4−ニトロ−2−(3,5−ジメチルフェニル)安息香酸(0.15g,0.55mmol)、メチオニンメチルエステル塩酸塩(0.11g,0.55mmol)、EDCI(0.11g,0.55mmol)、HOBT(0.11g,0.55mmol)及びEt3N(0.08ml)を反応させ、実施例1においてN−BOC−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関する方法に従って仕上げ処理した。酢酸エチルとヘキサンからの再結晶後に、0.13g(58.4%)の純粋な生成物が単離された。
mp122−124℃;1H NMR(CDCl3) 1.2−1.84(1H,m),1.85−1.97(1H,m),2.01(3H,s),2.05(3H,t,J=7.7Hz),2.38(6H,s),3.70(3H,s),4.67−4.74(1H,m),6.03(1H,d,J=7.9Hz),7.05(2H,s),7.09(1H,s),7.84−7.87(1H,m),7.84−7.87(1H,m),8.23−8.26(2H,m);13C NMR(CDCl3),15.20,21.26,29.22,31.15,51.79,52.57,122.07,125.11,126.27,130.03,130.53,137.77,138.82,140.29,141.56,148.41,167.14,171.53.
4−ニトロ−2−(3,5−ジメチルフェニル)ベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.11g,0.26mmol)を酢酸エチル(3.0ml)中に入れた。この混合物に、SnCl2・2H2O(0.30g,1.30mmol)を加え、反応を窒素下で6時間還流加熱した。混合物を実施例2において4−アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように仕上げ処理して、0.15gの黄色フィルムを得た、これは溶媒によって濡れていた。この物質は他の点ではNMRによって純粋であり、これをさらに精製せずに用いた。
1H NMR(CDCl3)1.60−1.70(1H,m),1.80−1.90(1H,m),1.99(3H,s),2.05(2H,t,J=7.6Hz),2.33(6H,s),3.64(3H,s),3.93(2H,brs),4.61−4.64(1H,m),5.82(1H,d,J=7.7Hz),6.49(1H,d,J=2.3Hz),6.62(1H,dd,J=8.4Hz,2.4Hz),6.98(2H,s),7.00(1H,s),7.65(1H,d,J=8.3Hz);13C NMR(CDCl3),15.08,21.17,29.28,31.49,51.70,52.18,113.30,115.94,123.55,126.36,129.32,131.23,138.15,140.72,141.92,148.40,168.45,172.01.
4−アミノ−2−(3,5−ジメチルフェニル)ベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.10g,0.26mmol)を乾燥CH2Cl2(1.4ml)中に溶解させ、これを放置した。別のフラスコにおいて、N−BOC−S−トリチル−Cys(0.12g,0.26mmol)をTHF(4.4ml)中に溶解させ、上述したように、IBCF(0.03ml)及びEt3N(0.04ml)と反応させた。生成物を実施例1においてN−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように仕上げ処理し、1:1ヘキサンと酢酸エチルとの溶離用混合物を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーして、0.12g(56.0%)の純粋物質を得た。
1H NMR(CDCl3)1.33(9H,s),1.61−1.68(1H,m),1.73−1.91(4H,m),1.96(2H,t,J=7.6Hz),2.24(6H,s),2.57−2.64(2H,m),3.57(3H,s),4.00(1H,br s),4.54−4.58(1H,m),5.84(1H,d,J=7.8Hz),5.97(1H,br d),6.90(1H,s),6.92(2H,s),7.18−7.22(9H,m),7.27−7.40(7H,m),7.55(1H,m),7.61(1H,m),8.58(1H,br s);13C NMR(CDCl3)15.11,21.20,27.79,29.25,31.28,51.70,52.28,54.08,60.32,71.45,80.75,118.01,120.80,126.38,126.82,127.98,129.41,129.87,130.22,138.11,139.18,139.79,141.06,144.17,168.38,169.04,171.82.
N−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノ−2−(3,5−ジメチルフェニル)ベンゾイルメチオニンメチルエステル(0.12g,0.15mmol)をTHF(0.9ml)中に入れ、上述したように、0℃において0.5M LiOH(0.6ml)と反応させた後に、TFA(1.5ml)とEt3SiH(0.24ml)とによって脱保護した。過剰なスキャベンジャー(scavenger)の添加が結果に影響するとは思われない。生成物を分取HPLCによって精製して、23.8mg(27.3%)を得た。
mp 135−138℃;1H NMR(CDCl3)1.76−1.84(1H,m),2.00−2.17(6H,m),2.33(6H,s),3.05(1H,dd,J=14.6Hz,7.3Hz),3.17(1H,dd,J=14.6Hz,J=4.9Hz),4.15(1H,dd,J=7.3,4.9Hz),4.45−4.48(1H,m),7.02(3H,s),7.53(1H,d,J=8.0Hz),7.66(2H,m);13C (CD3OD)14.96,21.51,26.28,30.91,31.70,53.03,56.98,119.27,122.30,127.52,130.07,130.57,133.37,139.28,140.39,141.29,142.86,166.89,172.60,174.81.
A.4−アミノ−1−ナフトエ酸
4−アミノ−1−ナフタレンカルボニトリル(1.50g,8.91mmol)を50%KOH溶液(18ml)中の溶解させた。この不均質な溶液を2〜3日間還流加熱した。溶液がひと度均質になり、TLCがもはや出発物質を示さないならば、深赤色の溶液を冷却し、200mlの水の上に注入した。次に、溶液を濾過し、濃HClによってこの酸を沈殿させた。赤色結晶を濾別し、濾液を再濾過して、ピンク色結晶を得た。第1画分を活性炭によって処理して、赤色の一部を除去した。1.51g(90.6%)の生成物が得られた。
mp 169−171℃;1H NMR(CD3OD)6.69(1H,d,J=8.2Hz),7.38−7.43(1H,m),7.48−7.54(1H,m),8.03(1H,d,J=8.5Hz),8.13(1H,d,J=8.2Hz),9.09(1H,d,J=8.5Hz);13C NMR(CD3OD)107.39,114.61,122.99,123.92,125.21,127.40,128.48,135.04,151.35,171.44;HRMS計算値,C11H7NO2として,187.0633;実測値,187.0642.
4−アミノ−1−ナフトエ酸(0.86g,4.61mmol)をジオキサン(9.2ml)と0.5M NaOH(9.2ml)に溶解させた。ジ−t−ブチルジカーボネート(1.11g,5.07mmol)を加え、混合物を一晩撹拌した。反応混合物を実施例1においてN−BOC−4−アミノ安息香酸に関して述べたように仕上げ処理して、0.76g(56.7%)の赤味がかったピンク色固体を得た。mp 194−195℃;1H NMR(CD3OD)1.56(9H,s),7.53−7.62(2H,m),7.79(1H,d,J=8.1Hz),8.12(1H,d,J=8.0Hz),8.22(1H,d,J=8.18Hz),9.02(1H,d,J=8.9Hz);13C NMR(CD3OD)26.68,81.62,119.06,123.40,124.57,127.03,127.37,128.49,128.77,131.89,133.76,139.86,155.95,170.73;分析:計算値,C17H17NO4として,C:66.90,H:5.96,N:4.88;実測値,C:66.49,H:6.08,N:4.79;m/z(EI),289;HRMS計算値,C16H17NO4として,287.1158;実測値,287.1151.
CH2Cl2(6.4ml)中のN−BOC−4−アミノ−1−ナフトエ酸(0.46g,1.60mmol)、メチオニンメチルエステル塩酸塩(0.35g,1.76mmol)、EDCI(0.43g,1.76mmol)、HOBT(0.24g,1.76mmol)及びEt3N(0.27ml)を実施例1においてN−BOC−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように反応させた。仕上げ処理し、酢酸エチルとヘキサンから再結晶させた後に、0.44g(63.6%)の淡ピンク色結晶が得られた。
mp 131−132℃;1H NMR(CDCl3)1.57(9H,s),2.11−2.21(4H,m),2.29−2.41(1H,m),2.65(2H,t,J=7.1Hz),3.83(3H,s),4.99−5.06(1H,m),6.68(1H,d,J=8.0Hz),7.02(1H,s),7.56−7.59(2H,m),7.69(1H,d,J=7.9Hz),7.87−7.90(1H,m),8.02(1H,d,J=7.9Hz),8.44−8.48(1H,m);13C NMR(CDCl3)15.56,28.31,30.19,31.65,52.06,52.64,81.17,115.82,120.18,125.79,126.37,126.53,127.18,131.02,135.65,152.93,169.04,172.40;HRMS計算値,C22H28N2O5Sとして,432.1719;実測値,432.1702;m/z(FAB)433(M+1).
N−BOC−4−アミノ−1−ナフトイルメチオニンメチルエステル(0.57g,1.31mmol)をHCl/エーテルによって脱保護して、0.31g(64.1%)の白色固体を得た。
mp 178−181℃;1H NMR(CD3OD)2.08−2.16(4H,m),2.20−2.30(1H,m),2.57−2.75(2H,m),3.82(3H,s),4.87−4.91(1H,m),7.59(1H,d,J=7.5Hz),7.67(1H,d,J=7.5Hz),7.71−7.80(2H,m),8.03(1H,dd,J=7.1Hz,2.0Hz),8.35(1H,dd,J=6.8Hz,1.8Hz);13C NMR(CD3OD)15.23,31.40,53.01,53.33,119.90,122.20,126.15,127.41,127.77,129.09,129.31,131.50,132.33,135.64,171.77,173.83;m/z(FAB),369(M+1).
乾燥THF(11.2ml)中のN−BOC−S−トリチル−Cys(0.31g,0.67mmol)を、上述したように、Et3N(0.10ml)及びIBCF(0.10ml,0.74mmol)と−10℃において反応させた。乾燥CH2Cl2(3.5ml)中のHCl・4−アミノ−1−ナフトイルメチオニンメチルエステル(0.25g,0.67mmol)を加え、混合物を窒素下で一晩撹拌した。この混合物を実施例1においてN−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステルに関して述べたように仕上げ処理し、粗生成物をヘキサンと酢酸エチルとの2:1混合物を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーして、0.20g(37.5%)の純粋な物質を得た。
1H NMR(CDCl3)1.48(9H,s),2.10−2.20(4H,m),2.30−2.37(1H,m),2.63(2H,t,J=7.4),2.74(1H,J=12.9Hz,J=5.3Hz),2.90(1H,J=12.9Hz,6.2Hz),3.81(3H,s),4.96−5.03(2H,m),6.77(1H,d,J=8.0Hz),7.18−7.33(11H,m),7.44−7.56(7H,m),7.60(1H,d,J=7.7Hz),7.88(1H,d,J=8.0Hz),8.00(1H,d,J=7.1Hz),8.37(1H,d,J=8.4Hz),8.94(1H,brs);13C NMR(CDCl3)15.23,26.52,31.41,31.50,52.98,53.31,56.79,68.15,122.52,123.54,126.16,126.99,128.03,128.39,129.52,132.30,134.04,135.24,168.08,172.38,173.94.
N−BOC−S−トリチル−システイン−4−アミノ−1−ナフトイルメチオニンメチルエステル(83.3mg,0.11mmol)をTHF(0.7ml)中に入れ、この混合物に0.5M LiOH(0.43ml)を0℃において加えた。この混合物を0℃において35分間撹拌した。冷水浴を用いて、溶媒を真空中で除去した。残渣を実施例2においてTFA・システイン−4−アミノ−3−メチルベンゾイルメチオニンに関して述べたように仕上げ処理して、74.1mgの遊離酸を得た。次に、これをCH2Cl2(1ml)中に溶解させ、Et3SiH(0.015ml)を加えた後に、TFA(1ml)を加えた。この反応混合物を室温において1時間撹拌し、実施例2においてTFA・システイン−4−アミノ−3−メチルベンゾイルメチオニンに関してさらに述べたように仕上げ処理した。凍結乾燥させた後に、42.4mgの粗生成物を得て、これをHPLC上で水とアセトニトリル中の0.1%TFAを用いて精製した。
mp 121−125℃;〔α〕25 D=+2.4°(c=0.8,H2O);1H NMR(CD3OD)2.03−2.13(4H,m),2.22−2.36(1H,m),2.59−2.74(2H,m),3.16−3.33(2H,m),4.42(1H,m),4.84−4.89(1H,m),7.57−7.61(2H,m),7.64(1H,d,J=7.7Hz),7.70(1H,d,J=7.7Hz),8.08−8.11(1H,m),8.29−8.32(1H,m),8.98(1H,d,J=7.7Hz);13C NMR(CD3OD)15.19,26.45,31.50,31.63,53.20,56.72,122.52,123.43,126.43,126.12,127.02,127.96,128.32,129.49,132.27,134.15,135.12,168.11,172.41,175.17;分析:計算値,C21H23F3N3O6S2として,C:47.19,H:4.34,N:7.86;実測値,C:46.53,H:4.56,N:7.59;注釈:Cの差異は0.65である。
TFA・システイン−4−アミノ−1−ナフトイルメチオニン(0.12g,0.15mmol)をCH3OH(4.3ml)中に溶解させた。この溶液に、CH3OH(4.3ml)中のHgCl2(0.23g,0.86mmol)の溶液を加えた。上述したように操作を続け、HCl/Et2O沈殿及び数回の再沈殿後に、31.0mg(18.3%)の純粋な白色物質を得た。
mp昇華137℃,分解214−215℃;〔α〕25 D=−32.0℃(c=1 CH3OH);1H NMR(CD3OD)2.12(3H,s),2.21−2.28(1H,m),2.57−2.73(3H,m),3.20−3.34(2H,m),3.82(3H,s),4.39−4.43(1H,m),7.61−7.68(3H,m),7.78(1H,d,J=7.7Hz),8.13−8.16(1H,m),8.28−8.32(1H,m);13C(CD3OD)15.23,26.52,31.41,31.50,52.98,53.31,56.79,122.52,123.54,126.16,126.99,128.03,128.39,129.52,132.30,134.04,135.24,168.08,172.38,173.94.
A.N−Boc−S−トリチルシステイナル
トリエチルアミン(2.22ml,16mmol)とN,O−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩(1.57g,16.1mmol)とを85mlの塩化メチレン中のN−BOC−S−トリチルシステイン(7.44g,16mmol)の溶液に加えた。この混合物を氷浴中で冷却し、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDCI,3.08g,16.0mmol)とHOBT(2.17g,16mmol)とを加えた。この混合物を0℃において1時間撹拌し、室温においてさらに10時間撹拌した。この混合物を塩化メチレンと0.5N HClとによって抽出した。有機層を0.5N HClと、濃NaHCO3と、ブラインとによって連続的に洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(1.5:1=ヘキサン:酢酸エチル)によって精製して、白色泡状物(7.40g,91%)を得た。
m.p.59−60℃(分解).1H NMR(CDCl3)δ7.41(m,6H),7.20−7.31(m,9H),5.13(d,8.9Hz,1H),4.76(br s,1H),3.64(s,3H),3.15(s,3H),2.56(dd,4.7及び12.1Hz,1H),2.39(dd,7.8及び12.1Hz,1H),1.43(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ170.7,154.9,144.2,129.3,127.6,126.4,79.3,66.4,61.2,49.5,33.8,31.8,28.1.
10mlのメタノール中の1当量のN−Boc−S−トリチルシステイナルを60mlのメタノールと4mlの氷酢酸中の4−アミノベンゾイルメチオニンメチルエステル塩酸塩(1.7836g,5.6mmol)の溶液に加えた。シアノホウ水素化ナトリウム(sodium cyanoboronhydride)(0.528g,8.40mmol)をこの濃い色の溶液に0℃において加えた。混合物を室温において15時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、残渣を酢酸エチルと濃炭酸水素ナトリウムとによって抽出した。有機層を乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1:1)によって精製して、所望の純粋な生成物(2.52g,65%)を得た。
1H NMR(CDCl3)δ7.63(d,8.6Hz,2H),7.43(m,6H),7.21−7.32(m,9H),6.73(d,7.6Hz,1H,Met アミド),6.50(d,8.6Hz,2H),4.91(ddd,5.1Hz,5.3Hz及び7.6Hz,1H,Met α H),4.59(d,8.9Hz,1H,Boc アミド),4.25−4.40(br,1H,NHPh),3.80(m,1H,Cys α H),3.78(s,3H,OCH3),3.09(d,6.3Hz,2H,CH2NH),2.55−2.60(m,2H,CH2SCPh3),2.46(d,5.0Hz,2H,CH2SCH3),2.23−2.28(m,1H,Met CH2),2.07−2.12(m,1H,Met CH2),2.09(s,3H,SCH3),1.43(s,9H,Boc).
完全に保護された4−N−[2(R)−tert−ブトキシカルボニルアミノ−3−トリフェニルメチルチオプロピル]アミノベンゾイルメチオニンメチルエステル(1.31g,1.83mmol)を20mlのメタノール中に溶解させた。この溶液に、5mlのメタノール中の塩化第2水銀(1.09g,4.04mmol)を加えた。混合物を20分間還流させてから、冷却した。透明な溶液を除去し、固体沈殿を5mlのメタノールで洗浄した。固体を乾燥させ、次に、15mlのメタノール中に懸濁させた。懸濁液を撹拌し、硫化水素ガスと1時間反応させた。黒色沈殿を遠心分離によって取り出した。透明な溶液を蒸発乾固させた。残渣を6mlの塩化メチレン中に溶解させ、その後にエーテル中3N HCl(20ml)を添加した。白色沈殿を濾過し、乾燥させて、所望の生成物の塩酸塩(0.60g,73%)を得た。
1H NMR(CD3OD)δ7.73(d,8.8Hz,2H),6.75(d,8.8Hz,2H),4.74(dd,4.9Hz及び4.3Hz,1H,Met α H),3.72(s,3H,OCH3),3.43−3.59(m,3H,CH2NH 及び Cys α H),2.93(dd,3.9Hz及び14.4Hz,1H,CH2SH),2.81(dd,5.2Hz及び14.5Hz,1H,CH2SH),2.49−2.66(m,2H,CH2SCH3),2.07−2.20(m,2H,Met CH2),2.10(s,3H,SCH3).
完全に保護されたペプチド4−N−[2(R)−tert−ブトキシカルボニルアミノ−3−トリフェニルメチルチオプロピル]アミノベンゾイルメチオニンメチルエステル(567mg,0.79mmol)を3.0mlの0.5N 水酸化リチウムと3.0mlのテトラヒドロフラン中に溶解させた。この混合物を0℃において1時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、残渣を水中に溶解させ、塩化メチレンと1N塩酸とによって抽出した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残渣を1mlの塩化メチレンと2mlのトリフルオロ酢酸との混合物中に溶解させた。濃褐色が消失するまで、トリエチルシランを滴加した。混合物を室温に1時間維持した。溶媒を蒸発させ、残渣を乾燥させた。この残渣を酢酸中1.7N HCl(1ml)中に溶解させた後に、エーテル中3N HCl(20ml)を添加した。白色沈殿を濾過し、乾燥させて、所望の生成物の塩酸塩(159mg,46%)を得た。分析HPLCは98%を越える純度を示した。
1H NMR(CD3OD)δ7.74(d,8.7Hz,2H),6.75(d,8.7Hz,2H),4.73(dd,4.5Hz及び4.7Hz,1H,Met α H),3.45−3.58(m,3H,CH2NH 及び Cys α H),2.93(dd,4.5Hz及び14.6Hz,1H,CH2SH),2.80(dd,5.3Hz及び14.6Hz,1H,CH2SH),2.53−2.64(m,2H,CH2SCH3),2.15−2.23(m,1H,Met CH2),2.07−2.13(m,1H,Met CH2),2.10(s,3H,SCH3).
A.4−ニトロ−2−フェニルベンゾイル−[1’(S)−メトキシカルボニル−3’−メチルスルホニル]プロピルアミド
4−ニトロ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(525mg,1.28mmol)と、N−メチルモルホリンオキシド(453mg,3.87mmol)と、0.5mlの四酸化オスミウム(tert−ブタノール中の2.5重量%溶液)とを40mlのアセトンと10mlの水との混合物に加えた。この混合物を室温において一晩撹拌した。過剰な亜硫酸ナトリウムの添加後に、反応混合物を酢酸エチルによって抽出し、濃炭酸水素ナトリウムによって洗浄した。有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させ、固体(570mg,100%)を得た。
1H NMR(CDCl3)δ8.29(d,7.7Hz,1H),8.25(s,1H),7.83(d,7.7Hz,1H),7.43−7.55(m,5H),6.15(d,7.3Hz,1H,Met アミド),4.68(ddd,5.0Hz,5.1Hz及び7.3Hz,1H,Met α H),3.70(s,3H,OCH3),2.85(s,3H,SCH3),2.69−2.81(m,1H,CH2SO2),2.58−2.66(m,1H,CH2SO2),2.21−2.33(m,1H,Met CH2),1.96−2.08(m,1H,Met CH2).
4−ニトロ−2−フェニルベンゾイル−[1’(S)−メトキシカルボニル−3’−メチルスルホニル]プロピルアミド(430mg,1.02mmol)を20mlのメタノール中に溶解させた。炭素担体付き5%パラジウムの触媒量を加え、混合物を40PSIにおいて1.5時間水素化した。混合物を濾過し、濾液を蒸発乾固させ、4−アミノ生成物(400mg,100%)を得た。
1H NMR(CD3OD)δ7.70(d,8.0Hz,1H),7.38−7.47(m,7H),4.53(dd,4.6Hz及び4.8Hz,1H,Met α H),3.72(s,3H,OCH3),2.89(s,3H,SO2CH3),2.79−2.85(m,1H,CH2SO2),2.58−2.68(m,1H,CH2SO2),2.19−2.29(m,1H,Met CH2),1.93−2.04(m,1H,Met CH2).
1H NMR(CDCl3)δ7.64(d,8.5Hz,1H),7.37−7.46(m,11H),7.18−7.33(m,9H),6.53(d,8.5Hz,1H),6.34(s,1H),5.74(d,7.5Hz,1H,Met アミド),4.64(ddd,4.9Hz,5.1Hz及び7.5Hz,1H,Met α H),4.55(d,7.5Hz,1H,Boc アミド),4.26(br,1H,NHPh),3.79(m,1H,Cys α H),3.68(s,3H,OCH3),3.10(t,5.7Hz,2H,CH2NHPh),2.84(s,3H,SO2CH3),2.62−2.82(m,2H,CH2SO2),2.45(d,2H,CH2SCPh3),2.19−2.27(m,1H,Met CH2),1.84−1.95(m,1H,Met CH2),1.41(s,9H).
完全に保護されたペプチド 4−N−[2(R)−tert−ブトキシカルボニルアミノ−3−トリフェニルメチルチオプロピル]アミノ−2−フェニルベンゾイル−[1’(S)−メトキシカルボニル−3’−メチルスルホニル]プロピルアミド(277mg,0.33mmol)を5mlのメタノール中に溶解させた。この溶液に、2mlのメタノール中の塩化第2水銀(229mg,2.50当量)を加えた。この混合物を20分間還流させた。沈殿を乾燥させてから、10mlのメタノール中に懸濁させた。この混合物を硫化水素ガスと反応させた。反応混合物を遠心分離し、透明な溶液を蒸発させた。残渣を2mlの塩化メチレン中に溶解させた後に、エーテル中の20mlの3N HClを添加した。白色沈殿を回収し、乾燥させて、所望の生成物の塩酸塩(165mg,89%)を得た。
1H NMR(CD3OD)δ7.44(d,8.4Hz,1H),7.32−7.40(m,5H),6.77(d,8.4Hz,1H),6.68(s,1H),4.45(dd,4.5Hz及び4.7Hz,1H,Met α H),3.69(s,3H,OCH3),3.40−3.57(m,3H,CH2NHPh 及び Cys α H),2.78−2.96(m,3H,CH2SH 及び CH2SO2),2.89(s,3H,SO2CH3),2.60−2.69(m,1H,CH2SO2),2.15−2.24(m,1H,Met CH2),1.91−2.02(m,1H,Met CH2).
A.4−N−[2(R)−tert−ブトキシカルボニル−3−トリフェニルメチルチオプロピル]アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル
1.5当量のシアノホウ水素化ナトリウムの存在下での4−アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(3.88g,10mmol)と1当量のN−Boc−S−トリチルシステイナルとのカップリングによって粗混合物を得て、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1:1)によって精製して、純粋な所望の生成物(5.83g,74%)を得た。
1H NMR(CDCl3)δ7.65(d,8.5Hz,1H),7.32−7.45(m,11H),7.18−7.30(m,9H),6.50(d,8.5Hz,1H),6.33(s,1H),5.65(d,7.6Hz,1H,Met アミド),4.62(ddd,5.0Hz,5.2Hz及び7.6Hz,1H,Met α H),4.54(d,8.1Hz,Boc アミド),4.18(br,1H,NHPh),3.78(m,1H,Cys α H),3.64(s,3H,OCH3),3.10(t,6.1Hz,2H,CH2NHPh),2.45(d,5.0Hz,2H,CH2SCPh3),2.04−2.10(m,2H,CH2SCH3),2.00(s,3H,SCH3),1.81−1.92(m,1H,Met CH2),1.61−1.70(m,1H,Met CH2),1.40(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ172.0,168.3,155.7,149.4,144.3,141.6,141.1,131.3,129.5,128.7,128.5,127.9,127.7,126.8,122.6,113.6,111.3,79.8,67.1,52.2,51.7,49.5,47.2,34.3,31.6,29.4,28.3,15.2.
完全に保護されたペプチド 4−N−[2(R)−tert−ブトキシカルボニル−3−トリフェニルメチル−チオプロピル]アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(1.57g,2.0mmol)を最初に塩化第2水銀(1.36g,5.0mmol)と反応させ、次に、メタノール中で硫化水素ガスと反応させて、所望の生成物の塩酸塩(0.808g,84%)を得た。分析HPLCは98%を越える純度を示した。
〔α〕25 D=−12.1°(c=0.008,CH3OH).1H NMR(CD3OD)δ7.42(d,8.3Hz,1H),7.30−7.38(m,5H),6.78(d,8.3Hz,1H),6.71(s,1H),4.47(dd,4.2Hz及び5.1Hz,1H,Met α H),3.68(s,3H,OCH3),3.44−3.54(m,3H,CH2NHPh及びCys α H),2.94(dd,4.1Hz及び14.6Hz,1H,CH2SH),2.81(dd,5.0Hz及び14.6Hz,1H,CH2SH),2.12−2.22(m,1H,CH2SCH3),2.03−2.10(m,1H,CH2SCH3),2.00(s,3H,SCH3),1.90−1.97(m,1H,MetCH2),1.73−1.82(m,1H,Met CH2).13C NMR(CD3OD)δ173.7,173.4,150.7,143.5,142.3,131.2,129.8,129.5,128.6,125.6,115.6,112.2,53.7,53.2,52.8,45.0,31.3,30.8,25.3,15.0.
4−N−[2(R)−アミノ−3−メルカプトプロピル]アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニン
完全に保護されたペプチド 4−N−[2(R)−tert−ブトキシカルボニル−3−トリフェニルメチルチオプロピル]アミノ−2−フェニルベンゾイルメチオニンメチルエステル(2.36g,3mmol)を最初に水酸化リチウムと反応させ、次にトリフルオロ酢酸と反応させて、粗生成物(1.30g,77%収率,HPLCによって85%純度を示す)を得て、これを分取HPLCによってさらに精製して、純粋な生成物(0.98g,75%)を得た。
〔α〕25 D=−13.6°(c=0.005,CH3OH).1H NMR(CD3OD)δ7.44(d,8.4Hz,1H),7.30−7.41(m,5H),6.75(d,8.4Hz,1H),6.68(s,1H),4.43(dd,4.2Hz及び5.1Hz,1H,Met α H),3.44−3.58(m,3H,CH2NHPh 及び Cys α H),2.95(dd,4.4Hz及び14.5Hz,1H,CH2SH),2.83(dd,5.0Hz及び14.5Hz,1H,CH2SH),2.14−2.23(m,1H,CH2SCH3),2.05−2.11(m,1H,CH2SCH3),2.00(s,3H,SCH3),1.91−1.99(m,1H,Met CH2),1.72−1.81(m,1H,Met CH2).13C NMR(CD3OD)δ176.4,173.5,150.4,143.0,141.5,131.0,129.7,129.4,128.9,124.6,115.0,112.2,53.3,44.4,30.8,30.1,24.9,14.8.
ヒトBurkittリンパ腫(Daudi)細胞(ATCC,米国,メリーランド州,ロックヴィル)の60,000xg上清からのFTアーゼとGGTアーゼI活性をFTアーゼに関して既述したように分析した(41)。簡単には、100μg の上清を50mM Tris、 pH 7.5、50μM ZnCl2、20mMKCl及び1mMジチオトレイトール(DTT)中でインキュベートした。この反応をFTアーゼに対しては組換え体Ha−Ras−CVLS(11μM )及び[3H]FPP(625nM;16.3Ci/mmol)と共に、GGTアーゼIに対しては組換え体Ha−Ras−CVLL(5μM )及び[3H]ゲラニルゲラニルピロホスフェート(525nM;19.0Ci/mmol)と共に30℃において30分間インキュベートした。ペプチド模倣体をFTアーゼ及びGGTアーゼと混合してから、反応混合物に加えた。
100mm Disk(costar) におけるDulbeccoの修飾イーグル培地(GIBCO)中にH−RasF細胞(45)を0日目に接種して(seeded)、40〜60%集密度(confluency)にまで増殖させた。1日目と2日目に、培地4ml/プレートを種々な濃度のFTI−277又はビヒクルと共に細胞に供給した。3日目に、細胞を氷冷PBSによって1回洗浄し、回収し、氷上の溶解緩衝剤中で30〜60分間インキュベートすることによって溶解させた(41)。溶解産物を清澄化させ(cleared)(14,000rpm ,4℃,15分間)、上清を回収した。等量の溶解産物を12.5%SDS−PAGE上に分離して、ニトロセルロースに移し、抗Ras抗体(Y13−238,ATCC)又は抗Rap1A抗体(Santa Cruz Biotechnology, カリフォルニア州,サンタクルズ)を用いてウェスタンブロット法をおこなった。Y13−238に対してはペルオキシダーゼ抱合(peroxidase-conjugated)ヤギ抗ラットIgG、Rap1Aに対してはペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギIgGを、強化化学発光検出系(ECL;Amersham Corp.)と共に用いて、抗体反応を可視化した。
100mmの皿における10%ウシ血清(Hyclone)と1%pen/strep(GIBCO)とを補充したDulbeccoの修飾イーグル培地(GIBCO)(10ml)中に細胞を0日目に接種した。1日目と2日目に、細胞をFTI−277(5μM )又はビヒクルによって処理した(細胞40〜60%の集密度)。3日目に、細胞を氷冷PBS中での遠心分離によって回収した。次に、細胞ペレットを氷冷低張性緩衝剤(10mM Tris、pH7.5、5mMMgCl2、1mM DTT、1mM PMSF)中に再懸濁させ、細胞を音波処理して、細胞ペレットを破壊して、細胞質ゾルと膜との分離を促進させた。次に、細胞懸濁液を2,000rpm で10分間遠心分離して、デブリ(debri)を清澄化させ、その後に上清を超遠心分離管に入れ、SW Ti55ローターに対する100,000xgにおいて30分間回転させて、膜画分と細胞質ゾル画分とを分離した。膜画分と細胞質ゾル画分とを氷上で、30mM HEPES、pH7.5、1%TX−100、10%グリセロール、10mM NaCl、5mM MgCl2、2mM Na3VO4、25mM NaF、1mM EGTA、10μM 大豆トリプシン、25μg /mlロイペプチン、10μg /ml アプロチニン、2mM PMSFを含有する緩衝剤中で60分間溶解させた。溶解産物を遠心分離によって清澄化させた。等量の細胞質ゾル画分と膜画分とを、50μl の25%プロティンAセファロースCl−4B懸濁液(Sigma)を1μf /mlの抗c−Raf−1(SC133,Santa Cruz Biotechnology, カリフォルニア州,サンタクルズ)と共に用いて免疫沈殿させた。サンプルを4℃において60分間タンブリングさせ(tumbled) 、次に、50mM HEPES、pH7.5、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.1%TX−100、10%グリセロール、20mM NaF中で5回洗浄した。最終ペレットを12.5%SDS−PAGE上でランして、ニトロセルロースに移し、Rasの存在に関しては抗Ras抗体(Y13−238)を用いて免疫ブロットし、Rafの存在に関しては(c−Raf−1、SC133、Santa CruzBiotechnology,カリフォルニア州,サンタクルズ)を用いて免疫ブロットした。検出は、Ras及びRap1Aプロセシングに関して上述した検出と同じであった。
H−RasF細胞をRas/Raf相互作用及びRasとRap1Aとのプロセシングに関して上述したように、接種し、処理した。しかし、2日目に、10%ウシ血清と、1mg/mlのBSAと、20mM HEPES(pH7.5)とを補充した10mlのDMEM−ホスフェート中で100μ Ci /moの[32P]オルトホスフェート(Amersham PBS13)によって一晩、細胞を標識した。3日目に、培地を除去し、細胞を氷冷PBSによって1回洗浄し、細胞スクラパー(cell scraper)によってプレートから削りとり、回収し、遠心分離した。細胞ペレットを上記氷冷低張性緩衝剤中に再懸濁させ、Ra/Raf会合に関して上述したように、細胞質ゾル画分と膜画分とを分離させた。次に、細胞質ゾル画分と膜画分とを氷上で、50mM Tris、pH7.5、5mM MgCl2、1%Triton X−100(TX−100)、0.5%DOC、0.05%SDS、500mM NaCl、1mM EGTA、10μg /ml アプロチニン、10μg /mlの大豆トリプシン阻害剤、25μg /ml ロイペプチン、1mM DTT、1mg/ml BSA中において60分間溶解させた。溶解産物を清澄化させ、抗Ras抗体(Y13−259)を30μl のプロティンAアガロースヤギ抗ラットIgG複合体(Oncogene Science) と共に用いて、等量のタンパク質を4℃において60分間免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、50mM HEPES、pH7.5、0.5M NaCl、0.1%TX−100、0.0005SDS、5mM MgCl2中で6回洗浄し、注射器を用いて排液させ(drained) 、12μl の5mM DTT、5mMEDTA、0.2%SDS、0.5mM GDP及び0.5mM GTP中で68℃において20分間、結合ヌクレオチドを溶離させた。免疫複合体を迅速に回転させ、6μl の上清をPEIセルロース薄層クロマトグラフィープレート(20cmx20cm)上に供給した。ヌクレオチドを78g/リンターのギ酸アンモニウム、9.6%(v/v)濃HCl中でのクロマトグラフィーによって分離させた。プレートをオートラジオグラムによって分析した。
[γ−32P]ATPからホスフェートを、自動リン酸化(autophosphorylation)部位を含有する19マーペプチドに移すRafの能力を評価することによって、Raf−Iキナーゼを分析した。膜画分と細胞質ゾル画分の単離物とRaf免疫沈殿物とを冷HEPES緩衝剤によって3回、キナーゼ緩衝剤(50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、12mMMnCl2、1mM DTT、0.2% Tween 20)によって2回洗浄した。20μCiの[γ−32P]ATP(10 mCi/ml,Amersham)と2μl のRaf−1基質ペプチド(1mg/ml,Promega)とを含む96μl のキナーゼ緩衝剤中で、膜画分と細胞質ゾル画分とからの免疫沈殿物を25℃において30分間インキュベートすることによって、免疫複合体キナーゼ分析をおこなった。Raf−1基質ペプチドの配列はIVQQFGFQRRASDDGKLTDである。分析混合物の50μl アリコートを0.5%オルトリン酸中で40分間にわたってWhatman P81上にスポットすること(spotting)によって、リン酸化反応を停止させ、風乾させた。32Pの組込まれた量を液体シンチレーション計数によって測定した。
図1Bは、FTI−276は[3H]FPPから組換え体H−Ras−CVLSへのファルネシルの転移を500pMのIC50で阻害したことを実証する。FTI−249(FTI−276の親化合物)はFTアーゼを200,000pMのIC50で阻害した。したがって、安息香酸スペーサーの2位置におけるフェニル環はFTアーゼの阻害効力を400倍に高め、このことはFTアーゼのCAAX結合部位内に顕著な疎水性ポケットが存在すると言う我々の予想を確証した。この非常に強力な阻害剤はまた、密接に関連したGGTアーゼIに比べてFTアーゼに対して高度に選択的(100倍)である(図1B)。FTI−276は[3H]GG−PPから組換え体H−Ras−CVllへのゲラニルゲラニルの転移を50nMのIC50で阻害した(図1B)。この100倍の選択性は親化合物、FTI−249の15倍の選択性よりも優れている。他の重要な化合物の幾つかに関するデータを表1に示す。
細胞取り込みを促進するために、Rasプロセシングの阻害を測定する実験にFTI−277(FTI−276のメチルエステル)を用いた。H−RasF細胞(癌遺伝子(61ロイシン)H−Ras−CVLSによって形質転換されたNIH3T3細胞)(45)をFTI−277(0〜50μM )によって処理し、溶解産物を抗Ras又は抗Rap1A抗体によってブロットした。図2Aに示すように、10nM程度の低い濃度がRasプロセシングを阻害したが、10μM 程度の高い濃度はゲラニルゲラニル化Rap1Aのプロセシングを阻害しなかった。FTI−277はRasプロセシングを100nMのIC50で阻害した。これに反して、FTI−249のIC50は100μM であり、今までに報告された最も強力なCAAXペプチド模倣体はRasプロセシングを10μM 以上の濃度で阻害した(44)。
Rasはチロシンキナーゼ受容体からの生物学的情報を核へ、一連のMAPKの活性化によって供給する(29〜31において考察)。成長因子が刺激されると、RasはGTP結合形になり、ser/thrキナーゼ(c−Raf−1)を形質膜に補充することができ(recruit)、これは形質膜で活性化される。次に、c−Raf−1は、MAPKを活性化するMEK(二重thr/tyrキナーゼ)をリン酸化し、活性化する。最近、上皮増殖因子がRafとRasとの会合を誘発することが判明している(46)。
RafがRas−GDPよりも非常に大きいアフィニティでRas−GTPを結合するという事実を利用して、細胞質Ras/Raf複合体中のRasのヌクレオチド状態を上述のように決定した。Ras−F細胞では、図4Aに示すように、膜画分のみがGTPロックトRasを含有した。しかし、FTI−277によって処理すると、非ファルネシル化細胞質ゾルRasはGTP結合することが判明した。したがって、61ロイシンRasへのGTPの結合はRasプロセシングとその後の形質膜会合とを必要としない。Ras/Raf複合体中のRafのser/thrキナーゼ活性は、Rafを免疫沈殿させ、19マー自動リン酸化ペプチドをリン酸化するその能力に関して分析することによって測定した。図4Bは、癌遺伝子Ras−Fが形質膜におけるRafの活性化を誘発したこと及びFTI−277による処理がこの活性化を抑制したことを示す。さらに重要なことには、FTI−277によって誘発された細胞質Ras/Raf複合体(図3)が親NIH3T3細胞ラインpZIPneoの活性に匹敵する基底レベルのRafキナーゼ活性を有した(図4B)。図3と図4は、一緒に考察すると、GTPロックトRasによる癌遺伝子形質転換が形質膜への構造的補充(constitutive recruitment)と、Rafのその後の活性化とを生じることを実証する。さらに、FTI−277によるFTアーゼ阻害が、RasがGTP結合しているがRafキナーゼは活性化されない細胞質におけるRas/Raf複合体の蓄積を誘発することによってこの活性化を抑制する。Rafキナーゼが非膜環境においてRasに結合しているときには活性化されないという事実は、Raf活性化が形質膜における活性化因子を今後決定することを必要とすることを示す最近の報告と一致する(47)。
(44)。
抗癌剤としてのこれらの阻害剤の効力を実証し、これらの化合物が多重の複雑な遺伝的変化を有するヒト腫瘍の腫瘍増殖を阻害することができることを示すために、ヒト腫瘍細胞ラインを用いて抗腫瘍効力実験をおこなった。本発明の化合物の可能な用途に関連した重要な問題は、K−Ras突然変異を有するヒト腫瘍の増殖が阻止されうるか否かである。このことは、K−Ras突然変異はヒト癌において最も一般的に存在し、K−Rasプロセシングはこれより一般的でないH−Rasのプロセシングよりも阻害されることが困難であるので、抗癌剤としてのFTアーゼ阻害剤をさらに開発するために重要である(1−3,15)。さらに、ヒト腫瘍の大部分は多重の遺伝的変化を有し;特に、腫瘍サプレッサー遺伝子p53のデレーション(delation)が最も一般的である。それ故、K−Ras突然変異並びにp53の欠失(deletion)を有するヒト腫瘍の増殖を停止させるためにRas機能の阻害が充分であるか否かを知ることが非常に重要である。
本発明の他の主要な実施態様の化合物は式IIによって表される。幾つかの実施例を図12に示す。この実施態様の上記及びその他の化合物は当該技術分野において慣用的である方法を用いて製造することができる。例えば、図12の化合物4と5はそれぞれ4−アミノ−3’−tert−ブトキシ−カルボニルビフェニル又は4−アミノ−4’−tert−ブトキシ−カルボニルビフェニルのN−BOC−S−トリチルシステイナルによる還元性アミノ化と、その後の例えばトリフルオロ酢酸による脱保護と精製とによって製造することができる。
本発明の化合物の製造に用いた基本的アプローチをスキーム1に化合物4の合成に関して説明する。[以下の考察における化合物番号はスキーム1と2に関連する。]
(c)(1)(COCl)2、(2)tert−ブチルアルコール、n−BuLi;(d)(1)H2、Pd/C、(2)N−Boc−S−トリチルシステイナル17、(3)NaB(CN)H3;(e)TFA、Et3SiH。
3H NMRスペクトルと13C NMRスペクトルとをBruker AM−300スペクトロメーターに記録した。化学シフトはテトラメチルシランを基準としてδ(ppm)で報告した。全ての結合定数(coupling constant) はHzで記載した。元素分析は Atlantic Microlab 社(ジョージア州)によっておこなわれた。旋光度はPerkin−Elmer 241旋光計によって測定した。濃度はg/mlで表す。フラッシュカラムクロマトグラフィーは約4psi の圧力下においてシリカゲル(40〜63μm )上で実施した。溶媒は商業的供給者から入手して、次のように精製した:テトラヒドロフランとエーテルとは、ナトリウムベンゾフェノンケチル(sodium benzophenone ketyl) から蒸留し、塩化メチレンは水素化アルミニウムリチウムから蒸留した。分取HPLCは Waters 600Eコントローラーと、 Waters 490E多重波長UV検出器とを、 Waters 25x10cmラジアル コンプレッション モジュール(radial compression module) 内のDelta−Pak C−18 300Åカートリッジカラムと共に用いておこなった。分析HPLCは Rainin HPコントローラーとRainin UV−C検出器とをRainin 250x4.6mm 5μm Microsorb C−18カラムと共に用いておこなった。高分解能質量スペクトル(HRMS)と低分解能質量スペクトル(LRMS)とはVarian MAT CH−5とVG7070質量分析計上でおこなった。合成した全ての阻害剤の純度は分析HPLCによって実証されるように98%より大きかった。
35mlのアセトンと40mlの水中の4−ニトロベンゼン(3.0g,14.8mmol)と3−メチルフェニルボロン酸(2.06g,15.1mmol)との混合物に、K2CO3・1.5H2O(5.93g,37.5mmol)とPd(OAc)2(101mg,0.50mmol)とを加えた。濃黒色混合物を6時間還流させてから、冷却した。混合物をエーテルで抽出し、有機層をセライトの層に通した。淡黄色溶液をNa2SO4上で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を熱メタノールから再結晶させて、淡黄色結晶(2.68g,85%)を得た。
m.p.59−60℃.1H NMR(CDCl3)δ8.26(d,8.7Hz,2H),7.70(d,8.7Hz,2H),7.41(m,3H),7.26(d,7.1Hz,1H),2.43(s,1H).13C NMR
(CDCl3)δ147.6,146.8,138.8,138.6,129.6,128.9,128.0,127.6,124.4,123.9,21.4,LRMS(EI) C13H11NO2として,213(M+,強度100);HRMS(EI)計算値213.0789,実測値213.0778.
化合物14(2.31g,10mmol)を10mlのピリジンと20mlの水との混合物中に懸濁させた。この混合物を還流加熱してから、KMnO4(7.9g,50mmol)を数回に分けて加えた。この混合物を1時間還流させ、室温において4時間撹拌した。熱混合物を濾過して、黒色固体を熱水で洗浄した。濾液を6N HClによって酸性化した。沈殿を回収し、乾燥させた(2.16g,89%)。
m.p.265℃(分解).1H NMR(DMSO−d6)δ11.1−11.4(br s,COOH),8.32(d,8.7Hz,2H),8.27(s,1H),8.02(m,4H),7.66(t,7.8Hz,1H).13C NMR(DMSO−d6)δ167.1,148.9,145.6,138.2,131.8,131.5,129.6(br),127.9,124.2(br).LRMS(EI) C13H9O4Nとして,243(M+,100),152(60);HRMS(EI)計算値243.0531,実測値243.0544.分析:(C13H9NO4)C,H,N.
30mlの塩化メチレン中の15(1.215g,5mmol)の溶液に、塩化オキサリル(0.65ml,7.45mmol)と1滴のDMFとを加えた。この混合物をバブリング(bubbling)がもはや観察されなくなるまで撹拌した。透明な溶液を蒸発乾固させ、粗酸塩化物を得た。7.0mlのtert−ブタノールを含有する別のフラスコに、n−BuLi(ヘキサン中1.8M,2.8ml,5.04mmol)を水浴下で加えた。濁った溶液を室温において5分間撹拌し、次に20mlのTHF中の上記酸塩化物を滴下ロートから加えた。混合物を一晩撹拌してから、溶媒を除去した。残渣を塩化メチレン中に溶解させ、0.5N NaOHによって洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をメタノールから再結晶させて、淡黄色結晶(851mg,57%)を得た。
m.p.110.5−111.0℃.1H NMR(CDCl3)δ8.32(d,7.8Hz,2H),8.24(s,1H),8.06(d,7.7Hz,1H),7.77(m,3H),7.56(t,7.7Hz,1H),1.63(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ165.1,147.1,146.5,138.7,132.8,131.0,129.6,129.0,128.2,127.8,124.0,81.4,28.0,LRMS(EI)C17H17O4Nとして,299(M+,20),243(70),266(30),152(25);HRMS(EI)計算値299.1157,実測値299.1192.分析:(C17H17NO4)C,H,N.
85mlの塩化メチレン中のN−Boc−S−トリチルシステイン(7.44g,16mmol)の溶液に、トリエチルアミン(2.22ml,16mmol)とN,O−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸(1.57g,16.1mmol)とを加えた。この混合物を氷浴中で冷却し、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸(EDCI,3.08g,16.0mmol)とHOBT(2.17g,16mmol)とを加えた。混合物を0℃において1時間、室温においてさらに10時間撹拌した。混合物を塩化メチレンと0.5NHClとによって抽出した。有機層を0.5N HClと、濃NaHCO3と、ブラインとによって連続的に洗浄した。有機層を乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(1.5:1=ヘキサン:酢酸エチル)によって精製して、白色泡状物(7.40g,91%)を得た。
m.p.59−60°(分解).1H NMR(CDCl3)δ7.41(m,6H),7.20−7.31(m,9H),5.13(d,8.9Hz,1H),4.76(br s,1H),3.64(s,3H),3.15(s,3H),2.56(dd,4.7及び12.1Hz,1H),2.39(dd,7.8及び12.1Hz,1H),1.43(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ170.7,154.9,144.2,129.3,127.6,126.4,79.3,66.4,61.2,49.5,33.8,31.8,28.1.
化合物16(768mg,2.56mmol)をTHF中に溶解させた。触媒量の活性炭上10%Pd(78mg)を加えた。混合物を30分間水素化した(40psi)。黒色混合物をセライトの薄層に通し、淡黄色溶液を蒸発させた。残渣を10mlのメタノール中に溶解させた。この溶液に0.5mlの酢酸と、6mlのメタノール中の等量のアルデヒド17(1H NMR測定による)の溶液とを加えた。シアノホウ水素化ナトリウム(241mg,3.84mmol,1.5当量)を加え、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、残渣を酢酸エチルと濃炭酸水素ナトリウムとによって抽出した。有機層を乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(3.5:1=ヘキサン:THF)して、白色泡状物(1.09g,61%)を得た。
m.p.75.0−76.0℃(分解).〔α〕25 D=−2.13(c=0.01,CH3COOC2H5).1H NMR(CDCl3)δ8.14(s,1H),7.86(d,7.7Hz,1H),7.66(d,7.8Hz,1H),7.40(m,9H),7.22−7.30(m,9H),6.61(d,8.5Hz,2H),4.58(d,7.1Hz,1H),3.83(br m,2H,Cys α プロトン及びアミン),3.12(br m,2H,CH2N),2.48(br,m,2H,CH2S),1.60(s,9H),1.44(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ165.9,155.6,147.5,144.4,141.2,132.3,130.1,129.5,129.2,128.5,128.0,127.9,127.1,126.8,112.9,80.9,79.7,67.0,49.4,47.1,34.3,28.3,28.2(予想14 芳香族C,実測値13).分析:(C44H48N2O4S・1.2H2O)C,H,N,S.
化合物18(600mg,0.85mmol)を2mlのTFAと2mlの塩化メチレン中に溶解させた。トリエチルシランを濃褐色の混合物に、褐色が消失するまで、滴加した。次に、この混合物を室温に1時間維持した。次に、溶媒を蒸発させて、残渣を真空下で乾燥させた。固体に30mlのエーテルと3mlのエーテル中3N HClを加えて磨砕した。白色沈殿を濾過し、エーテルで洗浄して、粗生成物(270mg,84%)を得た。この粗生成物を30mlの希HCl溶液(0.01N)中に溶解させ、凍結乾燥させた。分析HPLCは純度が95%であることを実証した。
m.p.105−106℃(分解).〔α〕25 D=+13.16(c=0.01メタノール中 1J M<R(CD3OD)δ8.18(s,1H),7.89(d,7.7Hz,1H),7.78(d,7.3Hz,1H),7.49(m,3H),6.82(d,8.5Hz,2H),3.56(m,2H,CHN 及び CH2N),3.42(dd,8.9及び15.2Hz,1H,CH2S).13C NMR(D2O 及び CD3OD)δ171.1,147.1,141.4,131.9,130.9,130.1,128.8,128.5,127.0,115.2,53.2,45.4,25.0 LRMS(FAB,グリセロール) C16H18N2O2Sとして(M+1)303.分析:(C16H18N2O2S・2HCl)C,H,N,S.
3−メチルフェニルボロン酸と3−ブロモ安息香酸メチルエステルとのカップリングによって、3−メチル−3’−メトキシカルボニルビフェニル(79%収率)を得、次に、これを加水分解して、3−メチル−3’−カルボキシビフェニル(97%収率)を得た。この酸から化合物16の製造と同じ方法を用いて化合物19(油状物)を製造した(65%収率)。
1H NMR(CDCl3)δ8.21(s,1H),7.95(d,7.8Hz,1H),7.73(d,6.6Hz,1H),7.46(m,3H),7.35(t,7.5Hz,1H),7.20(d,7.4Hz,1H),2.43(s,3H),1.62(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ165.6,141.3,140.2,138.3,132.4,140.0,128.7,128.5,128.3,128.0,127.9,124.2,81.0,28.1,21.4.LRMS(EI)C18H20O2として,268(M+,35),212(100),195(20);HRMS(EI)計算値268.1463,実測値268.1458.
化合物19(2.18g,8.13mmol)とN−ブロモスクシンイミド(1.70g,9.50mmol)とを60mlのCCl4中に懸濁させた。過酸化ジベンゾイル(20mg)を加え、混合物を1.5時間還流させた。固体を取り出した後に、濾液を濃炭酸水素ナトリウムによって洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。
1H NMRは、粗生成物が70%の一臭素化生成物と、30%の二臭素化生成物とを含有することを示した。この物質を20mlのDMSO中に溶解させ、アジ化ナトリウム(3.70g,57mmol)を加えた。混合物を80℃に4時間かけて加熱してから、塩化メチレンと水との混合物中に注入した。有機層を乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン中酢酸エチル5%)によって精製して、20(2.14g,78%,2段階)を無色油状物として得た。
1H NMR(CDCl3)δ8.22(s,1H),8.00(d,7.7Hz,1H),7.76(d,8.2Hz,1H),7.58(m,2H),7.50(m,2H),7.33(d,7.6Hz,1H),4.43(s,2H),1.62(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ165.2,140.5,140.3,135.8,132.3,130.7,129.1,128.5,128.2,127.8,127.1,126.7,126.6,80.9,54.3,27.8.
化合物20(0.75g,2.43mmol)を30mlのメタノール中に溶解させた。触媒量の硫酸バリウム上5%Pd(0.30g)を加えた。混合物を1気圧において5時間水素化した。触媒を濾別し、メタノールを蒸発させた。この残渣を40mlの塩化メチレン中に溶解させた。N−Boc−S−トリチルシステイン(1.12g,2.43mmol)を0℃において加え、EDCI(1当量)とHOBT(1当量)とを加えた。混合物を24時間撹拌した。仕上げ処理し、溶媒を蒸発させた後に、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3.2:1)によって精製して、21(570mg,44%)を得た。
m.p.84−86℃.1H NMR(CDCl3)δ8.17(s,1H),7.95(d,7.7Hz,1H),7.70(d,7.7Hz,1H),7.50−7.30(m,9H),7.30−7.10(m,11H),6.44(br,1H),4.86(br,1H),4.45(d,4.0Hz,2H,CH2Ph),3.87(br,1H,Cys α H),2.75(dd,7.2及び12.8Hz,1H,CH2S),2.55(dd,5.3及び12.8Hz,1H,CH2S),1.62(s,9H),1.36(s,9H).分析:(C45H48N2O5S) C,H,N,S.
化合物4の製造と同じ方法を用いて、化合物21(150mg)を脱保護した。分取HPLCによる最終精製によって、11を白色固体(42mg,46%)として得た。
m.p.88−89℃(分解).1H NMR(CD3OD)δ8.26(s,1H),8.01(d,7.7Hz,1H),7.86(d,7.7Hz,1H),7.64(s,1H),7.56(m,2H),7.46(t,7.6Hz,1H),7.35(d,7.6Hz,1H),4.53(s,2H),4.00(t,5.2Hz,1H,Cys α H),3.06(dd,14.6及び5.2Hz,1H,CH2S),2.97(dd,14.6及び6.8Hz,1H,CH2S).LRMS(EI)C17H18N2O3Sとして,331(M+1,8),281(100),226(75),分析:(C17H18N2O3S・HCl・0.6H2O)C,H,N.
アジド20(900mg,2.91mmol)を20mlのメタノール中に溶解させた。触媒量の硫酸バリウム上5%Pd(90mg)を加えた。この混合物を1気圧において一晩水素化した。触媒を除去し、メタノールを蒸発させた。残留する残渣を0.5N HCl(20ml)とエーテル(20ml)との混合物中に溶解させた。水相を1N NaOHによって中和し、塩化メチレン中に抽出した。溶媒を蒸発させた後に、粘稠な油状物を得た(600mg,73%)。
1H NMR(CDCl3)δ8.22(s,1H),7.97(d,7.8Hz,1H),7.75(d,7.7Hz,1H),7.57(s,1H),7.50(m,2H),7.43(t,7.7Hz,1H),7.33(d,7.4Hz,1H),3.96(s,2H),1.62(s,9H),1.46(br s,2H,NH2).
m.p.66−68℃(分解).1H NMR(CDCl3)δ8.21(s,1H),7.96(d,7.7Hz,1H),7.73(d,8.0Hz,1H),7.37−7.51(m,10H),7.15−7.31(m,10H),4.69(br d,1H),3.75(br s,3H,PhCH2N 及びCys α H),2.68(dd,6.0及び12.3Hz,1H,CH2S),2.56(dd,5.5及び12.3Hz,1H,CH2S),2.47(m,1H,CH2N),2.35(m,1H,CH2N),1.62(s,9H),1.42(s,9H),1.12(br s,1H,NH).
化合物22(480mg,0.672mmol)を2mlの塩化メチレンと2mlのトリフルオロ酢酸との混合物中に溶解させた。数滴のトリエチルシランを濃褐色が消失するまで、加えた。この混合物を室温に1.5時間維持し、次に、溶媒を蒸発させて、残渣を真空下で乾燥させた。固体残渣を1mlの酢酸と2mlの酢酸中HCl(1.7M)中に溶解させた。最後に、5mlのエーテル中HCl(3M)と10mlのエーテルとを加えた。白色沈殿を乾燥エーテルで洗浄し、乾燥させて、塩酸塩(215mg,81%)を得た。
1H NMR(D2O)δ8.16(s,1H),7.94(d,7.7Hz,1H),7.85(d,7.7Hz,1H),7.70(s,2H),7.55(t,7.8Hz,2H),7.46(d,7.5Hz,1H),4.36(s,2H,PhCH2),3.81(m,1H,Cys α H),3.57(dd,5.7及び13.7Hz,1H,CH2N),3.44(dd,6.5及び13.7Hz,1H,CH2N),2.97(dd,5.3及び15.1Hz,1H,CH2S),2.86(dd,5.9及び15.1Hz,1H,CH2S).
1−ブロモ−2−メトキシ−4−ニトロベンゼンと3−メチルフェニルボロン酸とのカップリングによって、2−メトキシ−4−ニトロ−3’−カルボキシビフェニルを得た。酸塩化物とリチウム t−ブトキシドとの反応によって23(3段階、35%)を得た。
m.p.88.0−88.5℃.1H NMR(CDCl3)δ8.13(s,1H),8.00(d,7.7Hz,1H),7.89(d,8.3Hz,1H),7.81(s,1H),7.69(d,7.7Hz,1H),7.48(m,2H),3.90(s,3H),1.60(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ165.2,156.7,148.0,136.3,136.2,133.2,132.0,130.8,130.1,129.0,127.9,115.8,106.0,81.1,55.9,27.9.LRMS(EI)C18H19NO5として,329(M+,30),273(100).
化合物18の製造と同じ方法を用いて、化合物24を製造した(収率63%)。m.p.76.0−77.0℃(分解).〔α〕25 D=−11.25(c=0.01,CH3COOC2H5).1H NMR(CDCl3)δ8.09(s,1H),7.86(d,7.0Hz,1H),7.65(d,7.0Hz,1H),7.37(t,7.7Hz,1H),7.43(m,6H),7.21−7.32(m,9H),7.11(d,8.1Hz,1H),6.21(s,1H),6.18(d,8.1Hz,1H),4.58(d,6.1Hz,1H),3.86(br s,1H),3.76(s及びm,4H),3.14(br d,4.9Hz,2H),2.49(br d,5.1Hz,2H),1.59(s,9H),1.43(s,9H).13C NMR(CDCl3)δ165.9,157.3,155.5,148.8,144.3,138.9,133.3,131.5,131.2,130.0,129.4,127.8,127.5,126.7,118.7,104.7,96.2,80.5,79.4,66.8,55.2,49.3,47.0,34.1,28.2,28.1.分析:(C45H50N2O5S)C,H,N,S.
化合物10を化合物24の脱保護から得た。
m.p.120−121℃(分解).〔α〕25 D=+12.62(c=0.01,メタノール中).1H NMR(CD3OD)δ8.09(s,1H),7.89(d,7.8Hz,1H),7.67(d,7.8Hz,1H),7.43(t,7.7Hz,1H),7.20(d,8.1Hz,1H),6.56(s,1H),6.53(d,8.1Hz,1H),3.81(s,3H),3.60(m,2H,Cys α H 及び CH2N),3.48(m,1H,CH2N),2.96(dd,4.9及び13.7Hz,1H,CH2S),2.86(dd,5.4及び13.7Hz,1H,CH2S).13C NMR(D2O及びCD3OD)δ171.1,158.2,149.3,139.7,135.1,132.2,131.1,130.4,129.4,128.4,120.5,106.2(広幅,ジウテリウム置換による),98.8,56.3,53.4,45.1,24.9.LRMS(EI)C17H20N2O3Sとして,332(M+).分析:(C17H20N2O3S・1.2HCl・H2O)C,H,N,S.
化合物6を分取HPLCによって精製した。純度は99%を越えることが判明した。
m.p.120.0−121.0℃.1H NMR(CD3OD)δ8.25(s,1H),7.98(d,7.6Hz,1H),7.84(d,7.7Hz,1H),7.74(d,7.0Hz,2H),7.54(t,7.7Hz,1H),7.66(d,8.6Hz,2H),4.16(q,5.0Hz,1H),3.19(dd,5.20及び14.8Hz,1H),3.07(dd,7.7及び14.7Hz,1H);13C NMR(CD3OD)δ169.8,166.7,141.9,138.7,137.8,132.6,132.2,130.2,129.5,128.8,128.5,121.6,56.9,26.4.LRMS(EI)C16H16O3N2Sとして,316(M+,25),213(100);HRMS(EI)計算値,316.0882,実測値,316.0867.分析:(C16H16N2O3S・CF3COOH・H2O)C,H,N.
m.p.129−130℃(分解).〔α〕25 D=+12.58(c=0.01,CH3OH).1H NMR(CD3OD)δ7.73(d,7.6Hz,1H),7.50(d,7.6Hz,1H),7.35(m,2H),7.21(d,8.5Hz,2H),6.86(d,8.5Hz,2H),3.58(m,2H),3.46(m,1H),2.97(dd,4.8及び14.6Hz,1H),2.86(dd,5.4及び14.6Hz,1H).13C NMR(D2O 及び CD3OD)δ174.3,146.3,141.9,132.8,132.7,131.4,130.6,130.2,127.9,115.3,52.9,45.8,25.0.LRMS(FAB,グリセロール)
C16H18N2O2Sとして,(M+1)303.分析:(C16H18N2O2S・1.6HCl)C,H,N,S.
m.p.260℃(分解).〔α〕25 D=+12.20(c=0.01,CH3OH).1H NMR(CD3OD)δ8.03(d,8.5Hz,2H),7.66(d,8.4Hz,2H),7.56(d,8.4Hz,2H),6.85(d,8.5Hz,2H),3.57(m,2H),3.45(m,1H),2.98(dd,4.8及び14.5Hz,1H),2.85(dd,5.7及び14.5Hz,1H).13C NMR(D2O 及び CD3OD)δ169.8,146.4,146.1,133.6,131.4,129.8,129.4,127.1,117.0,53.3,47.2,25.5.LRMS(EI) C16H18O2N2Sとして,302(M+,15),285(15),226(100),213(50).HRMS(EI)計算値302.1088,実測値302.1089.分析:(C16H18N2O2S・2HCl)C,H,N.
m.p.216℃(分解).〔α〕25 D=+13.27(c=0.01,CH3OH).1H NMR(CD3OD)δ7.54(m,4H),7.39(m,2H),7.26(m,1H),6.82(br s,2H),3.56(br m,2H),3.45(m,1H),2.98(m,1H),2.87(m,1H);13C NMR(CD3OD)δ144.8,141.8,135.7,129.9,129.1,127.8,127.4,117.4,53.2,47.6,25.5.LRMS(EI) C15H18N2Sとして,258(M+,15),182(100);HRMS(EI)計算値258.1190,実測値258.1183.分析:(C15H18N2S・1.6HCl)C,H,N,S.
1H NMR(CD3OD)δ7.50(d,8.2Hz,2H),7.35(m,2H),7.27(t,7.6Hz,1H),7.08(d,7.3Hz,1H),6.95(d,8.2Hz,2H),3.60(m,2H),3.46(m,1H),2.99(dd,4.9及び14.6Hz,1H),2.88(dd,5.5及び14.6Hz,1H),2.37(s,3H).LRMS(EI) C16H20N2Sとして,272(M+,15),196(100).HRMS(EI)計算値272.1341,実測値272.1347.
m.p.86−89℃(分解).1H NMR(CD3OD)δ8.18(s,1H),7.90(d,7.7Hz,1H),7.79(d,6.6Hz,1H),7.55(d,8.6Hz,2H),7.49(t,7.7Hz,1H),7.01(d,8.6Hz,2H),3.92(s,3H),3.543.65(m,2H),3.44−3.52(m,1H),2.97(dd,4.7及び14.7Hz,1H),2.88(dd,5.5及び14.7Hz,1H).LRMS(EI) C17H20O2N2Sとして,316(M+,15),299(20),240(100).HRMS(EI)計算値316.1240,実測値316.1239.分析:(C17H20N2O2S・2HCl)C,H,N,S.
ヒトBurkittリンパ腫(Daudi)細胞(ATCC,米国,メリーランド州,ロックヴィル)を、加湿10%CO2インキュベーター中、37℃において、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%Pen−Strepとを含有するRPMI1640培地中で増殖させた。細胞を回収し、50mM Tris、pH7.5、1mM EDTA、1mM EGTA、25μg /mlのロイペプチン、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド中で音波処理した。次に、ホモジネートを12,000xgにおいて回転させ、得られた上清を60,000xgにおいてさらに回転させた。上清をFTアーゼとGGTアーゼIとの両方に関して分析した。簡単には、100μg の上清を50mM Tris、pH7.5、50μM ZnCl2、20mM KCl、3mM MgCl2及び1mM DTT中でインキュベートした。FTアーゼ分析に関しては、この反応を組換え体H−Ras−CVLS(11μM)及び[3H]FPP(625nM;16.3Ci/mmol)と共に37℃において30分間インキュベートした。GGTアーゼ分析に関しては、この反応を組換え体H−Ras−CVLL(5μM )及び[3H]GGPP(525nM;19.0Ci/mmol)と共に37℃において30分間インキュベートした。反応を停止させ、ガラス繊維フィルターに通して、遊離と取り込まれた標識とに分離した。阻害試験に関して、ペプチド模倣体をFTアーゼ及びGGTアーゼIとプレミックスしてから、反応混合物の残部に加えた。組換え体H−Ras−CVLSを細菌(31)から既述したように(26)製造した。組換え体H−Ras−CVLLを細菌(32)から製造した。
ヒトBurkittリンパ腫(Daudi)FTアーゼがペプチド及びペプチド模倣体をファルネシル化する能力を既述されたように(34、35)判定した。簡単には、50mM Tris、pH7.5、50μM ZnCl2、20mM KCl、3mM MgCl2、1mM DTT及び0.2%オクチルβ−D−グルコシド中に50μg の60,000xg上清と20μM ペプチド模倣体とを含有する反応混合物(25μl )を37℃において30分間インキュベートし、シリカゲルGTLCシート(20x20cm,Brinkmann Instruments)上にスポットし、n−プロパノール/5N 水酸化アンモニウム/水(6:1:1)で展開させた。乾燥したシートにEn3Hance(DuPont NEN)をスプレイして、[3H]ファルネシル化生成物の検出のためにX線フィルムに暴露させた。
EJ3細胞をペプチド模倣体又はビヒクルによって20〜24時間処置した。細胞を溶解緩衝剤(10mM Na2HPO4、pH7.25、150mM NaCl、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1%Triton X−100、12mMデオキシコール酸ナトリウム、1mM NaF、0.2%NaN3、2mM PMSF、25μg /mlロイペプチン)中で溶解させ、溶解産物を13,000rpm において15分間回転させることによって清澄化させた。Rasタンパク質を50μgの抗Ras抗体(Y13−259;ATCCからのハイブリドーマ,メリーランド州,ロックビル)を30μl のプロティンA−アガロースヤギ抗ラットIgG複合体(Oncogene Science, ニューヨーク州,ユニオンダール)と共に用いて、4℃において一晩免疫沈殿させた。免疫沈殿物を溶解緩衝剤によって4回洗浄し、結合タンパク質を40μl のSDS−PAGEサンプル緩衝剤中で5分間加熱することによって放出させ、次いで12.5%SDS−PAGE上で電気泳動させた。タンパク質をニトロセルロース上に転移させ、次に、PBS(1%Tween20を含有、PBS−T)中の5%脱脂ドライミルクによってブロックし、Y13−259(PBS−T中3%脱脂ドライミルク中の50μg /ml)で検査した。ポジティブ抗体反応をペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ラットIgG(Oncogene Science, ニューヨーク州,ユニオンダール)と、強化化学発光検出系(ECL;Amersham)とを用いて可視化した。
構造モデル化(図13)
エネルギー最小化コンフォーメーションの算出を MacroModel program,第3.5a版内のAMBERフォースフィールド(force field)を用いて実施した。
a括弧内の数字は測定回数を示す。数字が記載されない場合には、少なくとも2回の測定をおこなった。
bndは測定されなかったを意味する。
ペプチド模倣体FTI−276とFTI−277とを上述したように製造した。GGTアーゼ阻害剤のGGTI−287とGGTI−286とを2−フェニル−4−ニトロ安息香酸(66)からL−ロイシンメチルエステルとの反応と、その後の塩化第1スズによる還元とによって製造した。得られた4−アミノ−2−フェニルベンゾイルロイシンメチルエステルをN−Boc−S−トリチル−システイナルと反応させ、FTアーゼ阻害剤に関して述べられた方法(66)と同様な方法によって脱保護して、それらの塩酸塩としてGGTI−286とGGTI−287を得た。
70mlのアセトンと85mlの水との混合物に、2−ブロモ−4−ニトロトルエン6.84g(30mmol)と、フェニルボロン酸3.84g(31.5mmol)と、炭酸カリウム10.35g(75mmol)と、酢酸パラジウム336mg(1.5mmol)とを加えた。この混合物を10時間還流させてから、エーテルと希塩酸とによって抽出した。溶媒を蒸発させた後に、固体残渣をメタノールから再結晶させて、5.64gの4−ニトロ−2−フェニルトルエン(88%収率)を得た。
1H NMR(CDCl3) δ8.09−8.11(m,2H),7.40−7.49(m,4H),7.30−7.33(m,2H),2.37(s,3H).
上記4−ニトロ−2−フェニルトルエン(4.46g,21mmol)を21mlのピリジンと42mlの水中に懸濁させた。混合物を沸騰するまで加熱した後に、過マンガン酸カリウム(19.8,126mmol)を添加した。この混合物を2時間還流させてから、濾過して、固体を除去した。濾液を6N HClによって酸性化して、4.48gの4−ニトロ−2−フェニル安息香酸(89%収率)を得た。
1H NMR(CDCl3) δ8.25−8.33(m,2H),8.08(d,8.9Hz,1H),7.41−7.51(m,3H),7.31−7.39(m,2H).
1H NMR(CDCl3) δ8.24−8.28(m,2H),7.85(d,8.9Hz,1H),7.43−7.52(m,5H),6.01(d,7.5Hz,1H),4.69(ddd,1H),3.68(s,3H),2.05(m,2H),1.98(s,3H),1.88−1.96(m,1H),1.72−1.81(m,1H).
1H NMR(CD3OD)δ7.65(d,8.1Hz,1H),7.39−7.46(m,7H),4.53(dd,4.3及び9.5Hz,1H),3.69(s,3H),2.15−2.23(m,1H),2.00(s,3H),1.93−2.11(m,2H),1.74−1.83(m,1H);13C NMR(CD3OD)δ173.4,171.7,143.4,140.1,137.4,134.0,130.9,129.7,129.4,125.5,122.7,53.0,52.9,31.3,30.9,15.1.
20mlのメタノール中の4−アミノ−2−フェニルベンゾイル−(S)−メチオニンメチルエステル塩酸塩(1.27g,3.22mmol)の混合物に、N−Boc−S−トリチル−(L)−システイナル(アルデヒド割合の1H NMR測定によって、1.0当量)と、シアノホウ水素化ナトリウム(400mg,2.0当量)とを加えた。この混合物を12時間撹拌した。溶媒を蒸発した後に、残渣を酢酸エチルと濃炭酸水素ナトリウムとによって抽出した。溶媒を除去した後に、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(1:1=ヘキサン:酢酸エチル,シリカ)によって精製して、生成物1.67g(収率67%)を得た。
1H NMR(CDCl3) δ7.65(d,8.6Hz,1H),7.34−7.42(m,11H),7.18−7.29(m,9H),6.52(dd,2.3及び8.1Hz,1H),6.34(d,2.3Hz,1H),5.65(d,7.7Hz,1H),4.64(ddd,1H),4.55(d,8.1Hz,1H),4.19(br t,1H),3.78(br m,1H),3.64(s,3H),3.09(t,6.1Hz,2H),2.44(m,2H),2.04−2.10(m,2H),2.00(s,3H),1.81−1.90(m,1H),1.60−1.70(m,1H),1.41(s,9H);13C NMR(CDCl3) δ172.0,168.3,155.7,149.4,144.3,141.6,141.1,131.3,129.5,128.7,128.5,127.9,127.7,126.8,122.6,113.6,111.3,79.8,67.1,52.2,51.7,49.5,47.2,34.3,31.6,29.4,28.2,15.2.
上記N−Boc−S−トリチル保護ペプチドメチルエステル(900mg)を5mlのメタノール中に溶解させた。この混合物に5mlのメタノール中の塩化第2水銀(774mg,2.50当量)の溶液を加えた。この混合物を20分間還流させた。沈殿を回収し、乾燥させた。この固体を10mlのメタノール中に懸濁させ、気体状の硫化水素と反応させた。黒色固体を除去した後に、透明な溶液を蒸発乾固させた。次に、残渣を塩化メチレンに溶解させた後に、エーテル中3N塩化水素を添加した。白色固体を回収し、乾燥させて、純粋な生成物476mg(収率81%)を得た。
1H NMR(CD3OD)δ7.42(d,8.4Hz,1H),7.30−7.38(m,5H),7.77(d,8.4Hz,1H),6.71(s,1H),4.48(dd,4.2及び5.1Hz,1H),3.68(s,3H),3.44−3.58(m,3H),2.90−2.95(dd,4.1及び14.5Hz,1H),2.79−2.85(dd,4.7及び14.5Hz,1H),2.18−2.22(m,1H),2.03−2.16(m,1H),2.00(s,3H),1.91−1.97(m,1H),1.73−1.82〜(m,1H);13C NMR(CD3OD)δ173.7,173.4,150.7,143.5,142.3,131.2,129.8,129.5,128.6,125.6,115.6,112.2,53.7,53.2,52.8,45.0,31.4,30.9,25.3,15.0.
上記N−Boc−S−トリチル保護ペプチドメチルエステル(500mg)を2.0当量の水酸化リチウムによって0℃において1時間加水分解した。生成物を塩化メチレン(1ml)中のトリフルオロ酢酸(2ml)によって脱保護した。濃黄色が消失するまで、トリエチルシランを滴加した。混合物を室温に1.5時間維持した。溶媒を蒸発させた後に、残渣を乾燥させ、乾燥エーテルによって洗浄した。固体を分取HPLCによって精製し、純粋な生成物270mg(収率78%)を得た。
1H NMR(CD3OD)δ7.44(d,8.4Hz,1H),7.30−7.39(m,5H),6.75(d,8.4Hz,1H),6.67(s,1H),4.45(dd,4.2及び5.1Hz,1H),3.42−3.58(m,3H),2.90(dd,4.3及び14.5Hz,1H),2.81(dd,5.5及び14.5Hz,1H),2.17−2.23(m,1H),2.09−2.15(m,1H),2.00(s,3H),1.90−1.99(m,1H),1.71−1.81(m,1H);13C NMR(CD3OD)δ176.4,173.5,150.4,143.0,141.5,131.0,129.7,129.4,128.9,124.6,115.0,112.3,53.3,49.6,44.4,30.8,30.1,24.9,14.8.
この化合物は、メチオニン誘導体の製造と同様に(実施例26,セクションA参照)、4−ニトロ−2−フェニル安息香酸と(L)−ロイシンメチルエステル塩酸塩とのカップリングによって製造した。
1H NMR(CDCl3) δ8.24−8.26(m,2H),7.86(d,8.7Hz,1H),7.41−7.46(m,5H),5.71(d,7.4Hz,1H),4.57(ddd,1H),3.67(s,3H),1.37−1.46(m,1H),1.08−1.25(m,2H),0.78(dd,6H).
この化合物は、メチオニン誘導体の製造と同じ方法を用いて(実施例26,セクションB参照)、出発物質として4−アミノ−2−フェニルベンゾイル−(S)−ロイシンメチルエステルとN−Boc−S−トリチル−(L)−システイナルとを用いて製造した。
1H NMR(CDCl3) δ7.68(d,8.6Hz,1H),7.33−7.41(m,11H),7.17−7.29(m,9H),6.50(d,8.6Hz,1H),6.31(s,1H),5.43(d,7.8Hz,1H),4.60(d,6.1Hz,1H),4.47(ddd,1H),4.19(br t,1H),3.77(br m,1H),3.62(s,3H),3.09(t,5.9Hz,2H),2.45(br m,2H),1.40(s,9H),1.27−1.33(m,1H),1.03−1.18(m,2H),0.75(dd,6H);13C(CDCl3) δ173.2,168.2,155.6,149.4,144.4,141.7,141.2,131.4,129.5,128.8,128.5,127.9,127.6,126.8,122.7,113.6,111.3,79.6,67.1,51.9,50.9,49.5,47.1,41.2,34.3,28.3,24.4,22.7,21.8.
この化合物は、メチオニン誘導体の製造と同じ方法によって(実施例26,セクションC参照)、4−[2(R)−tert−ブトキシカルボニル−3−トリフェニルメチルチオプロピル]アミノ−2−フェニルベンゾイル−(S)−ロイシンメチルエステルと塩化第2水銀とを用いて製造した。
1H NMR(CD3OD)δ7.42(d,8.5Hz,1H),7.31−7.38(m,5H),6.76(d,8.5Hz,1H),6.68(s,1H),4.33(t,7.8Hz,1H),3.67(s,3H),3.46−3.55(m,3H),2.95(dd,4.4及び14.5Hz,1H),2.81(dd,5.1及び14.5Hz,1H),1.44(t,7.6Hz,2H),1.18−1.25(m,1H),0.76−0.83(dd,4.1及び6.6Hz,6H).
この化合物は、メチオニン誘導体の製造と同じ方法によって(実施例26,セクションD参照)、4−[2(R)−アミノ−3−メルカプトプロピル]アミノ−2−フェニルベンゾイル−(S)−ロイシンメチルエステル塩酸塩と水酸化リチウムとを用いて製造した。
1H NMR(CD3OD)δ7.42(d,8.5Hz,1H),7.29−7.38(m,5H),6.73(d,8.5Hz,1H),6.66(s,1H),4.32(dd,3.3及び5.9Hz,1H),3.41−3.57(m,3H),2.94(dd,4.3及び14.5Hz,1H),2.78(5.2及び14.5Hz,1H),1.45(t,6.7Hz,2H),1.17−1.26(m,1H),0.78−0.83(t,8.5Hz,6H).
50mlのDMF中の無水リン酸ナトリウム(3.64g,22.2mmol)とパラジウムテトラキストリフェニルホスフィン(426mg,0.368mmol)との存在下での100℃における4−ニトロ−2−ブロモ安息香酸メチルエステル(1.92g,7.4mmol)と1−ナフチルボロン酸(2.53g,14.7mmol)とのカップリングは、4−ニトロ−2−ナフチル安息香酸メチルエステル(1.66g,75%収率)を生成した。
1H NMR(CDCl3) δ8.34(d,8.5Hz,1H),8.28(s,1H),8.14(d,8.5Hz,1H),7.92(d,8.2Hz,2H),7.47−7.56(m,2H),7.41(d,3.8Hz,2H),7.34(d,6.8Hz,1H),3.40(s,3H).
1H NMR(CDCl3) δ8.33(d,8.6Hz,1H),8.23(s,1H),8.17(d,8.6Hz,1H),7.88(d,8.2Hz,2H),7.46−7.52(m,2H),7.38−7.42(m,2H),7.33(d,7.0Hz,1H);13C NMR(CD3COCD3) δ167.2,150.1,143.1,139.0,138.2,134.4,132.5,132.1,129.2,127.3,126.7,125.8,125.9,123.3.
EDCIとHOBTとの存在下での4−ニトロ−2−ナフチル安息香酸と(L)−メチオニンメチルエステルとのカップリングによって、所望の生成物を得た(収率95%)。生成物のTLCは単一スポットを示したが、1H NMRはナフチル環とフェニル環との間での回転の制限によって生じたジアステレオマーの存在を示した。
1H NMR(CDCl3) δ8.33−8.38(m,1H),8.26(ss,1H),8.14(d,8.5Hz,0.5H),8.00(d,8.5Hz,0.5H),7.94−7.98(m,2H),7.42−7.65(m,5H),5.98(t,1H),4.42(m,1H),3.56(s,1.5H),3.51(s,1.5H),1.83(s,1.5H),1.74(s,1.5H),1.56−1.64(m,1H),1.33−1.45(m,2H),1.09−1.14(m,1H).
4−ニトロ−2−ナフチルベンゾイル−(L)−メチオニンメチルエステルの還元によって定量的収量のアミノ誘導体を得て、これをシアノホウ水素化ナトリウムの存在下でN−Boc−S−トリチル−システイナルと反応させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(1:1=酢酸エチル:ヘキサン)による精製後に、所望の生成物が得られた(収率40%)。TLCは単一スポットを示したが、1H NMRはナフチル環とフェニル環との間での回転の制限によって生じたジアステレオマーを示した。
1H NMR(CDCl3) δ7.84−7.96(m,3H),7.49−7.66(m,4H),7.37−7.43(m,7H),7.14−7.27(m,9H),6.60−6.63(d,8.6Hz,1H),6.33(m,1H),5.67(d,7.8Hz,0.6H),5.60(d,7.8Hz,0.4H),4.56(br d,6.2Hz,1H),4.35−4.44(m,1H),4.30(br,1H),3.78(br m,1H),3.55(s,1.9H),3.38(s,1.1H),3.06(t,5.8Hz,2H),2.44(m,2H),1.90(s,1H),1.79(s,2H),1.57−1.68(m,0.5H),1.36−1.45(m,10H),1.23−1.32(m,2H),0.94−0.98(m,0.7H).
この化合物はN−Boc−S−トリチル保護形(セクションK)からケン化と、その後のトリフルオロ酢酸による酸性開裂とによって製造した。分取HPLCによって純粋な化合物が得られた。1H NMRはアリール−アリール結合の回転の制限によって生じる複雑なジアステレオマーを示した。
1H NMR(CD3OD)δ7.86−7.94(m,2H),7.73(d,8.6Hz,0.6H),7.35−7.67(m,5.4H),6.83−6.88(m,1H),6.63−6.67(m,1H),4.17−4.23(m,1H),3.41−3.58(m,3H),2.91(dd,4.2及び14.5Hz,1H),2.80(dd,5.3及び14.5Hz,1H),1.82(s,1.4H),1.80(s,1.6H),1.65−1.77(m,1H),1.41−1.52(m,2H),1.09−1.32(m,1H).
この化合物はメチオニン誘導体の製造(セクションJ)と同じ方法によって、4−ニトロ−2−ナフチル安息香酸と、(S)−ロイシンメチルエステルと、EDCIと、HOBTとを用いて製造した。
1H NMR(CDCl3) δ8.34−8.39(m,1H),8.25(s,1H),8.18(d,8.6Hz,0.6H),8.02(d,8.6Hz,0.4H),7.91−8.00(m,2H),7.62(t,7.0Hz,0.6H),7.48−7.58(m,3H),7.41(t,7.0Hz,1.4H),5.71(d,7.9Hz,0.6H),5.60(d,7.9Hz,0.4H),4.29(m,1H),3.57(s,1.7H),3.52(s,1.3H),1.05−1.11(m,0.5H),0.88−0.97(m,0.7H),0.69−0.78(m,0.5H),0.41−0.59(m,7.0H),0.19−0.26(m,0.6H).
この化合物はメチオニン誘導体の製造(セクションK)と同じ方法によって製造した。
1H NMR(CDCl3) δ7.85−8.00(m,3H),7.47−7.67(m,4H),7.39−7.43(m,7H),7.14−7.37(m,9H),6.61(d,8.6Hz,1H),6.32(s,1H),5.46(d,7.6Hz,0.6H),5.36(d,7.6Hz,0.4H),4.55(d,7.2Hz,1H),4.20−4.27(m,2H),3.76(br,1H),3.56(s,2H),3.38(s,1H),3.06(t,5.9Hz,2H),2.43(m,2H),1.36−1.43(m,9H),0.81−1.03(m,1H),0.55−0.67(m,2.8H),0.36−0.45(m,4.7H),0.00−0.09(m,0.6H).
この化合物は対応化合物のN−Boc−S−トリチルメチルエステルから、セクションLの方法を用いて製造した。
1H NMR(CDCl3) δ7.98(d,8.5Hz,0.6H),7.84−7.90(m,2.4H),7.65(d,8.5Hz,0.4H),7.43−7.58(m,3.6H),7.34−7.39(m,1H),6.72(m,1H),6.45(ss,1H),5.46(d,7.8Hz,0.6H),5.40(d,7.7Hz,0.4H),4.64(m,1H),4.23(m,1H),3.54(s,2H),3.30(s,1H),3.25(m,1H),2.97−3.06(m,2H),2.67(dd,3.7及び13.1Hz,1H),2.47(dd,6.5及び13.2Hz,1H),1.45−1.65(br s,2H),0.81−1.03(m,1.2H),0.54−0.67(m,3H),0.36−0.39(m,4.3H),0.00−0.10(m,0.7H).
ヒトBurkittリンパ腫(Daudi)細胞(ATCC,メリーランド州,ロックヴィル)の60,000xg上清からのFTアーゼとGGTアーゼI活性を、正確にFTアーゼに関して既述したように(41)、分析した。阻害試験は、[3H]FPPと[3H]GGPPとから、それぞれ、H−ras−CVLSとH−Ras−CVLLとへの[3H]ファルネシルと[3H]ゲラニルゲラニルとの転移を阻害するRas CAAXペプチド模倣体の能力を測定することによって、実施した(41)。
H−Ras細胞(45)とK−Ras4B細胞(32)とはDr. Channing Derと Dr. Adrienne Cox (ノースカロライナ大学、チャペルヒル)からの好意的な贈り物であった。これらの細胞ラインを得る手段は、熟練した実施者によって容易に理解されるであろう。100mm皿における、10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン−ストレプトマイシンとを補充したDulbeccoの修飾イーグル培地中に、細胞を0日目に接種した。1日目と2日目に、細胞を種々な濃度のFTI−277又はGGTI−286又はビヒクル(DMSO中10mMDTT)を含有する培地で再度供給した。3日目に、細胞を洗浄し、50mM HEPES、pH7.5、10mM NaClと、1%TX−100と、10%グリセロールと、5mM MgCl2と、1mM EGTAと、25μg /mlのロイペプチンと、2mM PMSFと、2mM Na3VO4と、1mg/mlの大豆トリプシン阻害剤と、10μg/mlのアプロチニンと、6.4mg/mlの Sigma−104(登録商標)ホスファターゼ基質とを含有する溶解緩衝剤中で溶解させた。溶解産物を清澄化させ(14,000rpm ,4℃,15分間)、等量のタンパク質を12.5%SDS−PAGE上に分離して、ニトロセルロースに移し、抗Ras抗体(Y13−259,ATCC)又は抗Rap1A抗体(SC−65,Santa Cruz Biotechnology, カリフォルニア州,サンタクルズ)を用いて免疫ブロットした。ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ラットIgG(Y13−259に対して)、又はペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギIgG(Rap1Aに対して)を、強化化学発光検出系(ECL,Amersham corp.)と共に用いて、既述したように(41)、抗体反応を可視化した。
細胞をFTI−277、GGTI−286又はビヒクルによって処置して、Ras及びRap1Aプロセシングに関して既述したように、溶解させた。等量のタンパク質を15%SDS−PAGE上で分離して、ニトロセルロースに移し、抗MAPキナーゼ抗体(erk2,モノクローナル,UB1,ニューヨーク州,レイクプラシド)を用いて免疫ブロットした。ペルオキシダーゼ抱合ロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.,ペンシルバニア州,ウェストグローブ)と強化化学発光系(ECL,Amersham Corp.)とを用いて、抗体反応を可視化した。
GGTI−287はインビトロにおいてGGTアーゼIを強力に阻害し(IC50=5nM)、FTアーゼ(IC50=25nM)よりもGGTアーゼI阻害に対して選択的であった(表5)。したがって、FTI−276におけるメチオニンをGGTI−287におけるロイシンと置換すると(図17)、GGTアーゼIに対する効力が約10倍上昇した(表5)。さらに重要なことには、このことはFTアーゼ特異的阻害剤からGGTアーゼ特異的阻害剤へ選択性を500倍に逆転させた(表5)。この選択性が全細胞に関するものであるかどうかを知るために、GGTI−287の細胞透過性メチルエステル誘導体(GGTI−286)(図17)を合成して、癌遺伝子H−Ras−CVLSを過度発現するNIH3T3細胞(31)を処置するために用いた。細胞溶解産物をSDS−PAGE上で電気泳動させ、実施例28で述べたように、抗Ras抗体によって免疫ブロットした。図18は30μM 未満の低濃度のGGTI−286において非プロセシングH−Rasの蓄積が生じなかったことを示す。それ故、GGTI−286は全細胞におけるH−Rasプロセシングの良好な阻害剤ではない。しかし、GGTI−286はゲラニルゲラニル化Rap1Aタンパク質のプロセシングの非常に強力な阻害剤であった(IC50=2μM) (図18)。したがって、GGTI−286はファルネシル化プロセシングよりもゲラニルゲラニル化プロセシングの阻害に対して15倍より大きく選択的である(表5)。このデータは、それぞれ、100nMと50μM のIC50でH−RasプロセシングとRap1Aプロセシングを阻害したFTアーゼ特異的阻害剤FTI−277とは全く対照的である(図18)。したがって、GGTI−286は全細胞中でのゲラニルゲラニル化の阻害に関してFTI−277よりも25倍強力である(表5)。
フェニル置換基をナフチルと置換することのGGTアーゼI阻害に対する効果を知るために、4−[2(R)−アミノ−3−メルカプトプロピル]アミノ−2−ナフチルベンゾイル−(L)−ロイシン(GGTI−297)とそのメチルエステル(GGTI−298)とを試験した。GGTI−297はインビトロにおいてGGTアーゼIを40nMのIC50で阻害し、FTアーゼ(IC50=270nM)よりもGGTアーゼIの阻害に対して選択的であった(図21,表5)。したがって、GGTI−287におけるフェニルをGGTI−297におけるナフチルによって置換すると、GGTアーゼIに対する効力は8分の1に低下し、FTアーゼに対する効力は10分の1より大きく低下した。しかし、さらに重要なことには、FTアーゼよりもGGTアーゼIに対する選択性は、表5に示すように、5倍(GGTI−287)〜7倍(GGTI−297)に上昇した。20μM 程度の高濃度がH−Rasプロセシングを阻害しないにも拘わらず、Rap1AとRas4Bとは10μM GGTI−298で完全にブロックされたので、この選択性はインビボにも関したものであった(表5)。
この場合には、癌遺伝子K−Ras4Bのプロセシングとシグナリングとを阻害するGGTI−286の能力を評価した。癌遺伝子K−Ras4Bを過度発現するNIH3T3細胞(32)をGGTI−286(0〜30μM )又はFTI−277(0〜30μM )のいずれかで処置し、溶解産物を抗Ras抗体によって、実施例28に述べたように、免疫ブロットした。図19は、GGTI−286がK−Ras4Bのプロセシングを2μM のIC50で強力に阻害したことを示す。K−Ras4Bのプロセシングを阻害するGGTI−286の能力はファルネシル化H−Rasのプロセシング(IC50>30μM )よりもゲラニルゲラニル化Rap1Aのプロセシング(IC50=2μM )を阻害するその能力に非常に近似した(図18)(表5)。このことは、K−Ras4Bがゲラニルゲラニル化されうることを示唆した。K−Ras4BのプロセシングがFTアーゼ特異性阻害剤FT−277に非常に耐性である(IC50=10μM )という事実は、これと一致する(図19)。さらに、GGTI−286はK−Ras4Bプロセシングを、ファルネシル化H−Rasプロセシングに影響を与えない(図18)濃度(1〜3μM )で阻害した(図19)。
GGTI−286によるK−Ras4Bプロセシングの阻害が癌遺伝子シグナリングの分断を生じるかどうかを知るために、MAPキナーゼの癌遺伝子K−Ras4B構成活性化(constitutive activation)に拮抗するGGTI−286の能力を試験した。活性化MAPキナーゼは高リン酸化されており、SDS−PAGE上で低リン酸化(不活性)MAPキナーゼよりも緩慢に移動する(43、66)。図20は、K−Ras4B形質転換細胞が主として活性化MAPキナーゼを含有することを示す。これらの細胞をFTアーゼ特異性阻害剤FTI−277(0〜30μM )で処置すると、30μM までMAPキナーゼ活性化を阻害しなかった(図20)。これに反して、GGTI−286はMAPキナーゼ活性化を1μM のIC50で阻害し、ブロックは10μM で完成した。したがって、GGTI−286は癌遺伝子K−Ras4BMAPキナーゼ活性化を、FTI−277が効果を示さない濃度(10μM )においてブロックした。これに反して、MAPキナーゼの癌遺伝子H−Ras活性化はGGTI−286によってはごく軽度に阻害されるに過ぎなかったが、FTI−277はこの活性化を3μM において完全にブロックした(図20)。さらに、GGTI−286はMAPキナーゼのK−Ras4B活性化を、MAPキナーゼのH−Ras活性化に殆ど影響を与えない濃度(10μM )においてブロックした(図20)。
上記実施例は、GGTI−286がK−Ras4Bプロセシングと、癌遺伝子シグナリングの活性化との強力で高度に選択的な阻害剤であることを実証する。これらの阻害剤の抗癌剤としての効力を実証するために、K−Ras4B形質転換NIH−3T3細胞をヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が50〜100mm3のサイズに達したときに、マウスを対照群と処置群(5動物/群,各動物は右わき腹と左わき腹の両方に腫瘍を有した)とにランダムに分類した。図22は、1日1回生理的食塩水で処置された対照動物からの腫瘍が2週間にわたって2900mm3の平均サイズに成長したことを示す。これに反して、1日1回GGTI−286(25mg/kg又は50mg/kg)で処置された動物からの腫瘍はそれぞれ1600mm3又は900mm3のサイズに成長した(図22)。したがって、GGTI−286は腫瘍成長をそれぞれ50%と70%阻害したことになる。
Claims (5)
- 式:
CβX
[式中、
Cは3−メルカプト−2−アミノ−プロピル基であり;
Xはアミノ酸であり(ただし、Xはフェニルアラニン、ロイシン又はイソロイシンではない);
βはフェニル、キシレン又はナフチルで置換されているアミノ安息香酸の残基であり、
Xとβは、相互に、Xのアミノ基とβのカルボキシル基により形成されるアミド結合を介して連結され;
Cとβは、相互に、Cのプロピル基とβのアミノ基とを介して連結されている]
で示されるペプチド模倣体。 - βが2−フェニル−4−アミノ安息香酸の残基である、請求項1記載のペプチド模倣体。
- 請求項1又は2に記載のペプチド模倣体と、製薬的に受容されるキャリヤーとを含む、薬剤組成物。
- 請求項1又は2に記載のペプチド模倣体の有効量を活性成分として含む、ファルネシルトランスフェラーゼを阻害するための薬剤組成物。
- 請求項1又は2に記載のペプチド模倣体の有効量を活性成分として含む、癌を治療するための薬剤組成物。
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