JP4063770B2 - 検出装置および検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、検出装置および検出方法に関し、限定するわけではないが特にＤＮＡシーケンシングに適した検出装置および検出方法に関する。

ＤＮＡシーケンシング方法は、ここ２０年間ほとんど変化していない［１］。サンガー法がＤＮＡシーケンシングの方法としてよく知られており、該方法では、ジデオキシヌクレオチドの取り込み地点でＤＮＡ複製を終結させることを伴うＤＮＡ合成を行う。ＤＮＡ合成の後、合成されたＤＮＡの電気泳動を行い、ＤＮＡ分子を質量電荷比にしたがって分離し、よってＤＮＡシーケンスを決定する。

サンガー法の欠点は、電気泳動が複雑、コスト高、且つ危険であることである。

本発明の目的は、上述の欠点の少なくとも１つを克服するまたは軽減する検出装置または検出方法を提供することである。

本発明の第一の特徴によると、イオン感応電界効果トランジスタからの電気信号出力を検知することと、化学反応中に起こっている事象を示す電界効果トランジスタの表面またはその近傍で起こるイオン電荷の局所変動を区別するために、検知された電気信号をモニタリングすることからなる検出方法が提供される。

発明者は、電界効果トランジスタの表面で起こるイオン電荷の局所変動は測定できることに気付いた。イオン感応電界効果トランジスタは既知であるが、これまでは、概して、例えば反応混合物中のｐＨの絶対値の緩慢な変化をモニタリングするのに使用されてきており、イオン電荷の局所変動のモニタリングには使用されていなかった。イオン感応電界効果トランジスタの知られている設計では、反応混合物中のｐＨの絶対値の測定が３０秒毎に行われる。通常、無数の化学反応が測定と測定との間に起こり、これがｐＨの絶対値の変化として表れる。本発明は、化学反応の各事象をモニタリングすることを可能とする。各事象は、通常、数千の分子が全て同時に同一の反応を受けることからなる。

好適には、化学反応はＤＮＡ合成であり、イオン電荷の変動はジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰ）とデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の取り込みを示す。

現在のイオン感応電界効果トランジスタの設計の制限は、それらがｐＨの絶対値の測定を目的としており、その結果ドリフトとヒステリシスを受ける点である。本発明は、絶対値ではなくイオン電荷の変動をモニタリングし、よって当該問題を回避する。

好適には、ＤＮＡまたはｍＲＮＡをシーケンシングするために、変動が起こる時期と変動の大きさをモニタリングする。

本発明の第二の特徴によると、トランジスタの表面またはその近傍でのイオン電荷の局所変動に反応して電気出力信号を発生するように設計されたイオン感応電界効果トランジスタと、イオン感応電界効果トランジスタからの電気出力信号を検知する手段と、化学反応中に起こっている事象を示すイオン電荷の局所変動を区別するために、検知された電気信号をモニタリングする手段とを備える検出装置が提供される。

好適には、化学反応はＤＮＡ合成であり、イオン電荷の局所変動はジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰ）とデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の取り込みを示す。

好適には、モニタリング手段は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡをシーケンシングするために、局所変動が起こる時期と局所変動の大きさをモニタリングするように設計されている。

本発明の具体的な実施例を、添付の図面を参照して単なる例として以下に説明する。

本発明の実施例を用いて以下のようにＤＮＡシーケンシングを行う。ポリメラーゼ連鎖反応またはクローニングを用いて対象のＤＮＡの量を増幅し、ｍＲＮＡを用いて対象の領域をプライムする。ＤＮＡポリメラーゼは、成長するＤＮＡ鎖におけるヌクレオチド塩基の結合によりＤＮＡ合成を触媒する。これは、インビボでピロリン酸塩の加水分解を伴い、該加水分解は生理的ｐＨで、水素イオンの分離を引き起こす［２］。

矢印「← →」は反転可能な反応を示す。右側の２つの矢印の大きさが違うのは、ピロリン酸塩と水から、正リン酸塩と水素イオンに進むことのほうが、その逆よりもエネルギー的に好適であることを示す。

図１に示した結果は、ピロリン酸塩加水分解反応とそれによるｐＨへの影響を実証する。ｐＨはガラス電極設備を用いて測定したものであり、ｐＨの絶対値の測定を３０秒毎に行った。ｐＨの緩やかな降下が見られる。本発明の実施例は、イオン感応電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）の表面またはその近傍で起こるｐＨの局所変動を検知することによって、この反応を用いてヌクレオチドの取り込みをモニタリングする。

ＦＥＴには、イオン感応窒化ケイ素層が設けられ、該層の上にポリメラーゼ層が設けられる。ポリメラーゼ酵素に結合したまま残るピロホスファターゼによるピロリン酸塩加水分解［７］がＦＥＴにより検知される。加水分解は、ＤＮＡ合成中のヌクレオチドの取り込みを示す。いずれかの方向（つまり上昇または降下）へのｐＨの変化の大きさが、後述するように、ヌクレオチドの取り込みを確実に検知するために、検知される。各ヌクレオチドの取り込みは、温度６５℃において約３０ミリ秒毎に起こる［６］。ＦＥＴは、急激なｐＨの変化を検知することができ、ｐＨ変化の１ミリ秒と測定される即時の反応速度を有する［５］。

ピロリン酸塩加水分解により、反応が起こるｐＨに応じて水素イオンの純生産または純消費が起こる。本発明の実施例では、反応はｐＨ６．８で起こる。ｐＨ６．８において水素イオンは概して、ヌクレオチドの取り込み中、分離されるのではなく消費される。よって本発明の実施例では、ヌクレオチドの取り込みを示すものとしてｐＨの上昇がモニタリングされる。

本発明の実施例であるｐＨ感応ＦＥＴを図２に示した。当該ＦＥＴは、従来のＭＯＳＦＥＴ（金属酸化膜半導体電界効果トランジスタ）と類似している。当該ＦＥＴは、シリコン酸化誘電層１と、窒化ケイ素化学物質感応層２と、酵素／電解質の界面３を備える。層１および２と、界面３は、ソース４とドレイン５の間に位置する（ＦＥＴの従来の構造）。当該ＦＥＴは、シリコンチップ上に設けられ、該シリコンチップは、試薬混合溶液から保護されるようにエポキシ樹脂で被包されている。エポキシ樹脂は、ＦＥＴを加湿と電荷移動から保護するのに役立つ［９］。ＦＥＴは、それ自体がエポキシ樹脂で覆われているわけではないので、試薬混合溶液中に含浸できる。

図２に示した酵素／電解質の界面３によって、窒化ケイ素層２のイオン感応性を、ＤＮＡシーケンシングに用いることができる。化学物質感応層２の表面と反応媒体（つまり酵素／電解質の界面３）との間で電荷されたイオンの交換を引き起こすことによって、ＦＥＴは機能する：

窒化ケイ素の含有により、ｐＨの変化に対する感応性が、窒化ケイ素がない場合よりも増加および加速するので、該含有は有利である。さらに、窒化ケイ素は、ＦＥＴを加湿と電荷移動から保護するのに役立つ。

非ネルンスト的な反応は、絶縁ゲート窒化ケイ素表面における電荷されたイオンの急激なプロトン依存性結合および非結合による、ＦＥＴの即座の感応性を説明するものであり、この結果、窒化ケイ素層２にわたって電圧降下が再現可能に変動する。窒化ケイ素層２にわたる電圧降下の変動は、ｐＨの変化と相関する。電圧降下は、計装回路を用いてモニタリングされ、よって各ヌクレオチドの取り込みの検知が可能となる。測定された電圧は、フラットバンド電圧と呼ばれる。

酵素／電解質の界面３は、従来の酵素結合法［１０］を用いて窒化ケイ素層上に付着される。該方法は、アミノシラン溶液を用いて窒化ケイ素層２を予めシラン化処理し、グルタルアルデヒドを用いてその表面を活性化することからなる。その後、バッファ／ポリメラーゼ酵素溶液の滴を窒化ケイ素層２に付着させ、３０分ほど乾かして酵素層３を形成する。

図２に示した実施例では、ｐＨの変化を測定するために参照電極６を用いる。参照電極は、比較的大きく、製造が困難である。本発明の別の実施例では、参照電極を用いず、替わりに第二のＦＥＴを用いる。該第二のＦＥＴは、第一のＦＥＴと同一の構造であるが、酵素層３ではなく非酵素結合層が設けられている。この構造は、信号対雑音比が向上した差動測定がなされるので、有利である。

本発明の別の実施例を図３に示した。本実施例の構成は、ｐＨの緩慢な変動をモニタリングするためにこれまで使用されてきた従来の構造［１１］に基づく。当該実施例は、第一のＦＥＴ１１（該第一のＦＥＴは酵素結合層を備える）のソースが連結されている第一の演算増幅器１０と、第二のＦＥＴ１３（該第二のＦＥＴは非酵素結合層を備える）のソースが連結されている第二の演算増幅器１２を備える。第一および第二のＦＥＴのドレインは、固定の電流原（図示せず）に連結されている。第一および第二の演算増幅器からの出力は、差動増幅器１４に送られ、該差動増幅器が、出力信号Ｖ_outを発生するために出力間の差を増幅する。差動増幅器１４からの負のフィードバックは、試薬混合溶液中に配置された貴金属電極１５に伝わる。演算増幅器１４は、ＦＥＴ１１，１３に印加される電圧を、水素濃度が変化しても同一に保つ出力電圧を発生する。

図３に示した実施例は、ＦＥＴ１１，１３と、演算増幅器１０，１２，１５の製造を合理化するので有利である。

ＦＥＴ１１，１３は、演算増幅器１０，１２の第一ステージを形成するように設計できる。これは、演算増幅器の入力部に位置するロングテールペアの従来のＦＥＴを、第一または第二のＦＥＴ１１，１３に取り替えることによって、各演算増幅器について行われる。これは、第一および第二のＦＥＴが増幅回路の一部を形成することができるので、有利である。

図３に示した実施例を用いて検知されるフラットバンド電圧の図表例を図４に示した。当該実施例では、ＮＭＯＳ ＦＥＴの場合、反応が上述したようにイオン消費モードで作動している（ＰＭＯＳ ＦＥＴの場合または反応がイオン分離モードで作動している場合、図は反転される）。フラットバンド電圧は、ヌクレオチドの取り込みに関連するｐＨの変化と、ｄｄＮＴＰの取り込みと鎖終結に対応する降下を表すパルスからなる。大きな降下の前、局所パルス数が、周知のベースにおいて終結の前に存在するベース数を決定する；より大きな降下の大きさは、試薬混合溶液で使用されるｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰの比に依存し、該大きさは、該降下についての読み取り長の依存の故に重要である。この工程を、４つのｄｄＮＴＰのそれぞれを別個に含む異なる反応チャンバで４回繰り返すと、完全なシーケンスが表示される。

図４を詳細に参照すると、ＤＮＡ合成は、チミン塩基のジデオキシヌクレオチドの取り込み地点でＤＮＡ合成を終結させてなる。個々のヌクレオチドの取り込みは、それぞれ、水素イオンの分離を引き起こし、これらは図４で見られるようにフラットバンド電圧のパルスとして検知される。ＤＮＡ鎖がチミン塩基に到達すると、ヌクレオチドの取り込みがＤＮＡ鎖の一部について妨げられ、水素イオン消費量が降下し、信号出力が低下する。ＤＮＡ合成は、チミン塩基で終結されなかったこれらのＤＮＡ鎖について続行し、これは、新たなより低いレベルでのフラットバンド電圧のパルスとして見られる。フラットバンド電圧は、ＤＮＡ鎖が第二のチミン塩基に到達したとき再び低下し、その後、より低いレベルでパルスし続ける。

当該方法は、サーモサイクリングありまたはなしで用いることができる。例えば、サーモサイクリングは、タックポリメラーゼをシーケンシング酵素として用いて［１２］、最適化を促進するために用いてよい。例えば試薬混合溶液のｐＨを調節してもよい。ｐＨの低下は、より多くの水素イオンの生成につながるが、同時に、反応をつぶしてしまいがちである。試験によって、ｐＨ６．８が有用なｐＨ値であることがわかった。酵素を活性化するために、試薬混合溶液にマグネシウムを付加してもよい。試薬の濃度は変更できる。

表１に、標準的なサーモサイクリングシーケンスを示した。

サーマルサイクラー内で作業することにより、最小限の操作でシーケンシング工程を複数回繰り返すことが可能となる。これにより、信号対雑音比を高めることができ、ＧＣリッチな領域または単一ヌクレオチドの繰り返しの領域といった読み取り困難な領域の表示がより容易になる。

タックポリメラーゼの替わりに、組み替えＴ７ポリメラーゼを用いてもよい。Ｔ７ポリメラーゼを使用すると、ヌクレオチドの取り込みをモニタリングする際の速度が上昇し、精度が向上する。

酵素感応ＦＥＴ製造時のステップを以下の表２に示した。

当該ＦＥＴ、特に図３に示したもの、と増幅ステージは、弱反転領域で作動しているＰＭＯＳトランジスタに替えてもよく、または組み合わせてもよい。これは、ＰＭＯＳトランジスタによって生成された指数関数的増幅の使用が可能になるので、有利である。この場合、そうでなければ減衰していく信号を逆に動作させ、増大させることができる。

シーケンシング可能なＤＮＡ長は、信号がｄｄＮＴＰの取り込みとともに減衰するため、通常、末端塩基において信号対雑音比によって制限される。ＰＭＯＳ ＦＥＴの使用により、読み取り長の伸張が可能となるはずであるが、より近位の塩基の位置に関して妥協が必要となり得る。２つの別個のＦＥＴ回路（１つはＦＥＴのＮＭＯＳ対、もう１つはＦＥＴのＰＭＯＳ対である、図３に示したタイプ）を設置することにより、最適な読み取り長が提供されるはずである。実施されるべき測定は、絶対値ではなく出力への変化についてであるため、弱反転におけるバイアスが可能であり、信号分析のための信号増幅における絶対線形性は必要とされない。

信号対雑音比を向上するために、測定を繰り返してもよい。

参照文献
［１］F. Sterky, J. Lundeberg, “Sequence of genes and genoumes,” Journal of Biotechnology, vol.76, pp.1-31, 2000.
［２］Mathews, Holde, Ahern, Biochemistry, 2nd Edn
［３］Yuri A. Shakhov, Pal Nyren, ‘A Sensitive and Rapid Method for Determination of Pyophosphate Activity’ Acta Chemica Scandinavica B 36(1982) pp 689-694
［４］R. Buck, “Electrochemistry of Ion-Selective Electrodes,” Sensors and Actuators, (1), pp.197-260, 1981
［５］P. Woias, L. Meixner, D. Amandi, et. al, “Modelling the short-time response of ISFET sensors,” Sensors and Actuators B, 24-25, pp.211-217, 1995
［６］Taor, S. and Richardson, C.C, “DNA Sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Effect of pyrophosphorolysis and metal irons” Journal of Biological Chemistry, pp8322 8328, 1990
［７］L. Victorova, et al., “New substrates of DNA polymerases,” Federation of European Biochemical Societies Letters, 453, pp.6-10, 1999
［８］Hanazato et al., “Integrated Multi-Biosensors Based on an Ion-sensitive Field-Effect Transistor Using Photolithographic Techniques,” IEEE Transactions of Electron Devices, vol.36, pp.1303-1310, 1989.
［９］Matsuo, M. Esashi, “Methods of ISFET fabrication,” Sensors and Actuators, 1, pp.77-96, 1981
［１０］N.F. Starodub, W. Torbicz. et. al, “Optimisation methods of enzyme integration with transducers for analysis of irreversible inhibitors,” Sensors and Actuators B, 58, pp.420-426, 1999
［１１］Hon-Sum Wong, Marvin White, “A Self-Contained CMOS Integrated pH Sensor,” Electron Devices Meeting,
［１２］Alphey Luke, “DNA sequencing: from experimental methods to bioinformatics”

緩衝反応媒体を用いたピロリン酸塩加水分解中に起こるｐＨの変化を示す。 本発明の実施例による電界効果トランジスタの概略図である。 本発明の実施例による一対の電界効果トランジスタの概略図である。 一対の電界効果トランジスタを使用して得られる結果を図表で表したものである。

Claims (31)

1. 化学反応中に反応中間体を観察する方法であって、該反応に曝されたイオン感応電界効果トランジスタからの電気信号出力を検知し、検知された電気信号をモニタリングして、電気信号中の離散的変動であって化学反応中に生じている反応中間体を示す離散的変動を区別する方法。
2. ヌクレオチド鎖の末端への一又は複数のヌクレオチドの挿入を検出する、請求項１に記載の方法。
3. ヌクレオチド鎖の末端へのジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰ）の挿入を検出する、請求項２に記載の方法。
4. ＤＮＡ合成を観察し、電気信号中の離散的変動が一又は複数のデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の挿入とジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰ）の挿入によるＤＮＡ合成の終結を示す、請求項１に記載の方法。
5. ＤＮＡまたはｍＲＮＡをシーケンシングするために、変動が起こる時期と変動の大きさをモニタリングする、請求項４に記載の方法。
6. サーモサイクリングを含む、請求項４または５に記載の方法。
7. 信号対雑音比を向上するために反応ステップと、検出およびモニタリングステップを複数回繰り返す、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. トランジスタが曝された化学反応に反応して電気出力信号を発生するように配設されたイオン感応電界効果トランジスタと、電気信号中の離散的変動であって、化学反応中に生じている反応中間体を示す離散的変動を区別する手段とを具備する検出装置。
9. イオン感応電界効果トランジスタが窒化ケイ素層を有する、請求項８に記載の検出装置。
10. イオン感応電界効果トランジスタが酵素結合層を有する、請求項８または９に記載の検出装置。
11. 酵素結合層が窒化ケイ素層にわたって設けられている、請求項１０に記載の検出装置。
12. 酵素結合層がポリメラーゼを含む、請求項１１に記載の検出装置。
13. イオン感応電界効果トランジスタが、エポキシ樹脂でほぼ覆われている集積回路の一部として設けられ、該電界効果トランジスタそのものはエポキシ樹脂で覆われていない、請求項８ないし１２のいずれか１項に記載の検出装置。
14. イオン電荷の離散的変動がヌクレオチド鎖の末端への一又は複数のヌクレオチドの挿入を示す、請求項８ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
15. ＤＮＡまたはｍＲＮＡをシーケンシングするために、離散的変動が起こる時期と局所変動の大きさをモニタリングするように配設されたモニタリング手段をさらに具備する、請求項１４に記載の検出装置。
16. イオン感応電界効果トランジスタが、ピロリン酸塩加水分解反応に応じて電気出力信号を発生するように構成される、請求項１４または１５に記載の検出装置。
17. イオン感応電界効果トランジスタが、ｐＨが７未満の試薬混合溶液中に配される、請求項１６に記載の検出装置。
18. イオン感応電界効果トランジスタが、ｐＨが６．８の試薬混合溶液中に配される、請求項１７に記載の検出装置。
19. 試薬混合溶液がマグネシウムを含有する、請求項１７または１８に記載の検出装置。
20. 酵素結合層を有する第一のトランジスタと非酵素結合層を有する第二のトランジスタの二のイオン感応電界効果トランジスタと、第一および第二トランジスタによって発生される電気信号間の差を決定して電気出力信号を提供する手段とを具備する、請求項８ないし１９のいずれか１項に記載の検出装置。
21. 第一および第二トランジスタが第一および第二演算増幅器に連結され、演算増幅器の出力が、電気出力信号を提供する別の増幅器に送られる、請求項２０に記載の検出装置。
22. 電気出力信号が、試薬混合溶液中に配された電極に送られて、第一および第二トランジスタに印加される電圧が一定のレベルに保たれる、請求項１９に記載の検出装置。
23. 第一および第二トランジスタが、第一および第二演算増幅器の一部をそれぞれ形成するように配設されている、請求項２１または２２に記載の検出装置。
24. 弱反転領域において作動するように構成された少なくとも一のＰＭＯＳトランジスタを含む、請求項８ないし２３のいずれか１項に記載の検出装置。
25. 弱反転領域において作動するように構成された少なくとも一のＮＭＯＳトランジスタを含む、請求項８ないし２４のいずれか１項に記載の検出装置。
26. 二のイオン感応電界効果トランジスタが両方とも弱反転領域において作動するように構成されたＰＭＯＳトランジスタである、請求項２０ないし２３のいずれか１項に記載の検出装置。
27. 二のイオン感応電界効果トランジスタが両方とも弱反転領域において作動するように構成されたＮＭＯＳトランジスタである、請求項２０ないし２３のいずれか１項に記載の検出装置。
28. イオン消費またはイオン分離に応じて電気出力信号を発生するように構成される、請求項８ないし２７のいずれか１項に記載の検出装置。
29. 化学反応の反応中間体をモニタリングするのに十分な速度で電気出力信号を変更できるように構成される、請求項８ないし２８のいずれか１項に記載の検出装置。
30. １０ミリ秒より速い速度で電気出力信号を変更できるように構成される、請求項２９に記載の検出装置。
31. ３ミリ秒より速い速度で電気出力信号を変更できるように構成される、請求項３０に記載の検出装置。

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