JP3901214B2 - インターロイキン類の吸着剤,吸着除去方法および吸着器 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は、インターロイキン類の吸着剤、吸着除去方法および吸着器に関する。とくに詳しくは、インターロイキン−8(以下、IL−8という)、インターロイキン−1β(以下、IL−1βという)、インターロイキン−6(以下、IL−6という)およびインターロイキン−2(以下、IL−2という)よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンを吸着する吸着剤、ならびに前記吸着剤を用いた吸着除去方法および吸着器に関する。
【背景技術】
【0002】
サイトカインは種々の抗原特異的、非特異的免疫炎症反応に深く関わる生体防御因子として、非常に重要なタンパク性物質である。その存在は生体の恒常性の維持に必要不可欠な物質であるが、炎症をともなう疾患では過剰に産生され、その疾患の病態の形成、遷延に関与している。
【0003】
「IL−8」は、サイトカインの一種であり、1987年に松島らによって単球由来の好中球走化性因子(MDNCF)として精製され、その遺伝子もクローニングされている。IL−8は、種々の細胞によって産生される好中球活性化遊走制御因子である。
【0004】
IL−8は、好中球に作用して、好中球が有するカンジダ アルビカンス(Candida albicans)およびマイコバクテリウム(Mycobacterium)の増殖抑制作用を増強することが知られており、免疫賦活剤としての効果が期待されている(日本医学館、サイトカイン−基礎から最新情報まで−、1991年、65〜72頁)。それゆえ、IL−8を体液または培養液から大量かつ効率的に精製する方法が望まれている。
【0005】
他方、IL−8の持続大量投与は組織にとって非常に有害であり、肺胞では成人呼吸窮迫症候群様の組織破壊、関節では大量のリンパ球浸潤をともなう組織破壊を生じる。実験的にもリポポリサッカライド(LPS)誘導性皮膚炎、虚血後再灌流時の好中球浸潤にIL−8が本質的に関与していることが示される。これは、前記リンパ球浸潤あるいは好中球浸潤にともなう組織破壊が、IL−8に対する中和抗体を投与することでほぼ完全に抑止されることで、証明されている。さらには、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬、接触性皮膚炎、敗血症、突発性肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、免疫性血管炎、糸球体性腎炎、尿路感染症、心筋梗塞、喘息、気道感染症、周産期感染、移植臓器拒絶症などの疾患においては、炎症局所あるいは全身血中から正常人に比して異常に高濃度のIL−8が検出されており(免疫薬理、12巻1号、15〜21頁、1994年)、これらの疾患にIL−8が関与していることが考えられている。しかしながら、現在のところ、これらの疾患において、IL−8の作用を抑止する有効な方法は確立されていない。
【0006】
つぎに、「IL−1β」は細菌など異物による刺激で、主に単球・マクロファージから産生される炎症性サイトカインであり、1984年にアウロン(Auron)らによってヒトの遺伝子がクローニングされている。
【0007】
1979年の第2回国際リンフォカインワークショップにおいて同一物質としてインターロイキン1(IL−1)との統一的呼称が決定されるまで、内因性発熱物質(endogenious pyrogen)(EP)、白血球内因性メディエーター(leukocytic endogenious mediator)(LEM)、リンパ球活性化因子(lymphocyte activation factor)(LAF)、B細胞活性化因子(B cell−activating factor)(BAF)などとして見い出されていたことからもわかるように、その生物活性は多岐にわたっている。
【0008】
炎症の主要なメディエーターであるIL−1βは、通常の状態では生体の恒常性を含む種々の反応において重要な役割を果たしているが、何らかの機構で過剰、または長期にわたって持続的に産生されると、逆に組織の破壊や炎症性疾患の病態の形成・悪化を誘導することが明らかになってきた(バイオメディカ(Biomedica)、9巻、1993年、703〜707頁)。とくに敗血症をはじめとするトキシック症候群(toxic syndrome)、慢性関節リウマチ、ライム病、骨粗鬆症、川崎病、痛風、糸球体腎炎、拡張性心筋症、子宮内膜炎、早産、肉芽腫、急性骨髄性白血病、アルツハイマー病、ダウン症候群、肝線維化、肝硬変、さらにはアルコール性肝炎などの各病態へのIL−1βの関与が強く示唆されており(日本医学館、サイトカイン−基礎から最新情報まで−、1991年、13〜20頁および177〜187頁)、IL−1βの特異的抑制方法が望まれ、盛んに研究されている。
【0009】
代表的なものとして、抗IL−1β抗体、抗IL−1βレセプター抗体、IL−1レセプターアンタゴニスト(IL−1ra)などが開発され(医学のあゆみ、167巻、1993年、432〜435頁)、一部は敗血症を対象疾患として臨床試験に供されたが、いずれも期待された効果はえられず、実用化にはいたっていない。
【0010】
また「IL−6」は、元来B細胞の分化因子として単離され、1986年に平野、岸本らによってその遺伝子構造が決定されたが、骨髄腫細胞の増殖因子として働いたり、肝臓において急性期タンパク質を誘導するなど炎症の主要メディエーターとしての作用が認められている。
【0011】
IL−6の異常産生がB細胞のポリクローナルな活性化を招き、形質細胞腫を引きおこすことが、トランスジェニックマウスの作製により、示されている。また一般に、IL−6は多くの急性炎症疾患や細菌感染、ウイルス感染、火傷、心筋梗塞などにおいて血中のIL−6が高値を示すことが観察されている。実際火傷や外科手術などの侵襲時にIL−6レベルが亢進し、急性の細菌性髄膜炎患者(肺炎菌、ブドウ球菌、リステリア菌による)の脳脊髄液中では、500ng/mlにおよぶIL−6が検出された例が報告されている。一方、慢性肝炎において局所の炎症組織または全身においてIL−6が検出されている。慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患やキャストルマン(Cstleman)症、心房粘液腫などにおいては、IL−6の異常産生があり、これがγグロブリン血症タンパク産生の引き金になっていると考えられている。そのほかにも子宮頸癌、AIDS、アルコール性肝炎、多発性骨髄腫、レンネルトTリンパ腫、メサンジウム増殖性腎炎、腎細胞腫、乾癬、敗血症などの疾患へのIL−6の関与が指摘されている(日本医学館、サイトカイン−基礎から最新情報まで−、1991年、177〜187頁)。しかしながら現在のところ、これら疾患において、IL−6の作用を特異的に抑止する有効な方法は確立されていない。
【0012】
さらに、「IL−2」は従来T細胞増殖因子(TCGF)と呼称されていた分子量約15kDaの糖タンパク質であり、1983年に谷口らによって遺伝子がクローニングされたサイトカインである。IL−2はそのT細胞に対する増殖促進活性から単独療法あるいは局所養子免疫療法による癌の治療薬としての応用が図られている。
【0013】
一方、トランスジェニックマウスを用いた実験から局所(このばあいは膵臓)で持続的に産生されるIL−2が自己免疫性糖尿病の有力な病因の1つであることを示唆する知見がえられている(ヘス ダブリュー アール(Heath W.R.)アリソン ジェー(Allison J.)ら:ネイチャー(Nature)、359巻、547頁、1992年)。またIL−2投与において全身性エリテマトーデス(SLE)、リウマチ性関節炎(RA)を併発したとの報告もある(キャゼライン(Chazerain P.)、メイヤー オー(Meyer O)、カーン エム−エフ(Kahn M−F)ら:アン・インターン・メッド(Ann. Intern. Med.)、116巻、427頁、1992年およびバンドル ユー ビィー(Wandl U.B.)、ナゲル−イムケ エム(Nagel−Hiemke M.)、メイ ディー(May D.)ら:クリン・イミューノル・イムノパソル(Clin. Immunol. Immunopathol.)、65巻、70頁、1992年)。さらには、敗血症性ショックにおいてTNF−αとともにIL−2がその病態に深く関与している可能性が示唆されている(エンドー エス(Endo S.)、イナダ ケー(Inada K.)、イノウエ ワイ(Inoue Y.)ら:サーキュレイトリー ショック(Circulatory Shock)、38巻、264頁、1992年)。しかしながら現在のところ、これらの疾患において、IL−2の作用を抑止する有効な方法は確立されていない。
【0014】
かかる現状を鑑み、本発明者らは病因物質としてのIL−8、IL−1β、IL−6および/またはIL−2を患者体液から吸着除去する、要すれば回収する方法について研究した。本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、アニオン性官能基を有する水不溶性担体が体液と接触した際に、体液中のIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2を強く吸着することを見い出し、さらに検討を進め、本発明を完成するにいたった。
【0015】
本発明の課題は体液、とくに血液、血漿および血清からIL−8、IL−1β、IL−6および/またはIL−2を選択的に吸着除去する、要すれば回収することにある。
【発明の開示】
【0016】
すなわち本発明は、アニオン性官能基を有する水不溶性担体からなるIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンの吸着剤、前記吸着剤を体液と接触させることを特徴とするIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンの吸着除去方法、アニオン性官能基を有する水不溶性担体を、インターロイキン−8、インターロイキン−1β、インターロイキン−6およびインターロイキン−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンを含有しうる液と接触させることにより該インターロイキンを吸着する工程および該吸着したインターロイキンを溶出する工程からなる、インターロイキン−8、インターロイキン−1β、インターロイキン−6およびインターロイキン−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンの回収方法ならびに液の入口、出口を有し、かつ吸着剤の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、前記吸着剤を充填してなるIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンの吸着器に関する。
【0017】
前記吸着剤において、好ましくはアニオン性官能基は硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸エステル基よりなる群から選択される少なくとも1種類よりなり、硫酸、デキストラン硫酸およびポリスチレンスルホン酸よりなる群から選択される少なくとも1つの化合物に由来し、かつ/または前記官能基内に複数のアニオン性官能基を有するポリアニオン性官能基である。
【0018】
また、前記吸着剤において、好ましくは水不溶性担体が親水性であり、多孔性であり、かつ/または水不溶性担体に−OHで表わされる末端官能基が存在する。
【0019】
本発明において体液とは血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらからえられた画分成分、ならびにその他の生体由来の液性成分をいう。
【0020】
「IL−8」は分子量約8000のタンパク質であり、1〜2量体で存在することが報告されている(サイエンス(Science)264巻、90〜92頁)。
【0021】
「IL−1β」は153アミノ酸からなる分子量約17,500のタンパク質であり、等電点は7〜8である。マクロファージや単球から産生され、免疫担当細胞の増殖や分化の誘導、内因性発熱物質活性、肝臓における急性期炎症タンパク質の合成などの炎症反応の誘導といった様々な生物活性を有している。また「IL−6」は、リンパ系の細胞のみならず非リンパ系の細胞からも産生される分子量約21,000〜28,000の糖タンパク質である。
【0022】
「IL−2」はT細胞から産生される分子量約15,000の糖タンパク質である。IL−2はT細胞、B細胞、NK細胞、単球やマクロファージなどに対して増殖や分化あるいは機能活性化を促すことが知られている。
【0023】
本発明に用いる水不溶性担体とは常温常圧で固体であり、固体表面が水不溶性物質で覆われていてもよい。
【0024】
本願における水不溶性担体の形状は、とくに限定されない。たとえば、粒状、板状、膜状、繊維状などがある。繊維状であるばあい、中空であってもよい。本発明においては、水不溶性担体をカラムに充填して使用しうる。
【0025】
吸着剤をカラムに充填して使用するばあいは、血液を通液できることが好ましい。すなわち血液に含まれる細胞が充分に通過しうる間隙を作れるものであることが好ましい。たとえば吸着剤が粒状あって、IL−8を吸着させるばあい、平均粒径が5μm〜1000μmであることが望ましい。好ましくは、平均粒径が25〜1000μm、最も好ましくは、平均粒径が50〜300μmである。平均粒径が5μm以下であれば、体液を高流速で長時間、安定して通液できなくなる。1000μm以上であれば、吸着効率が低下する。粒子であるばあい、粒径分布が狭い方がより好ましい。
【0026】
また、吸着剤が繊維状でかつ中空であるばあい、内径は5μm以上が好ましく、IL−8を吸着させるならば、好ましくは、20〜1000μm、最も好ましくは、30〜300μmである。
【0027】
中が密な繊維状であるばあいは径が1μm以上であることが好ましく、IL−8を吸着させるならば、好ましくは、2〜500μm、最も好ましくは、5〜200μmである。水不溶性担体の表面は滑らかな方がよく、表面が粗であると非特異吸着が増加し選択性が低下するため好ましくない。
【0028】
本発明におけるアニオン性官能基とは、pHが中性付近で負に帯電するような官能基を含んでいればいかなるものでもよい。このような官能基の代表例としては、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、シラノール基、リン酸エステル基、フェノール性水酸基などがあげられ、これらの中では、IL−1β、IL−6および/またはIL−2を吸着させるばあい、スルホン酸基、硫酸エステル基が好ましいが、これらに限定されるものではない。また、これらの官能基は、単独でも、また2種以上組み合わせても使用しうる。IL−8を吸着させるばあいは、好ましいアニオン性官能基としては、硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸エステル基があげられる。
【0029】
また、本発明におけるアニオン性官能基とは、1分子あたりひとつのアニオン性官能基を有するモノアニオン性官能基であっても、または複数のモノアニオン性官能基を有するポリアニオン性官能基であってもよい。ポリアニオン性官能基はIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2に対する親和性が大きく、また単位量の水不溶性担体に多くのモノアニオン性官能基を導入しやすいので好ましい。なかでも分子量が1000以上のポリアニオン性官能基はIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2に対する親和性、多くのモノアニオン性官能基を導入できる点でより好ましい。ポリアニオン性官能基が有するモノアニオン性官能基は1種類であってもよいし、2種類以上であってもよい。
【0030】
IL−8を吸着させるばあい、本発明におけるアニオン性官能基は、水不溶性担体の単位体積(1ml)当たり、100nmolから10mmol含まれていることが望ましい。好ましくは、1μmolから200μmol、最も好ましくは、5μmolから100μmolである。100nmolより少ないとアニオン性官能基の効果が小さく、10mmolより多すぎると前記インターロイキン類以外の非特異吸着が起こる。
【0031】
本発明におけるポリアニオン性官能基を導入するための化合物の代表例としては、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリスチレンリン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイン酸共重合体などの合成ポリアニオン化合物、およびヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ホスホマンナンなどのアニオン性官能基を有する多糖類があげられるがこれらに限定されるわけではない。また、モノアニオン性官能基を導入するための化合物の代表例としては硫酸などの化合物があげられるが、これらに限定されるわけではない。好ましくはアニオン性官能基は、硫酸、デキストラン硫酸およびポリスチレンスルホン酸よりなる群から選択される少なくとも1つの化合物に由来する。
【0032】
さらに、本発明におけるアニオン性官能基は前記モノアニオン性官能基および/またはポリアニオン性官能基の群より選択された少なくとも1種類よりなるものであり、2種類以上であってもよい。また、モノアニオン性官能基およびポリアニオン性官能基を同時に有してもよい。
【0033】
本発明の吸着剤であるアニオン性官能基を有する水不溶性担体としては、アニオン性官能基を有する化合物自体が使用されうる。また、アニオン性官能基を有するモノマーを重合してえられる重合体、またはアニオン性官能基を導入することによりえられる水不溶性担体が使用されうる。
【0034】
また、血液を通過させる際に血球成分の非特異吸着を避けるために、たとえばヒドロキシエチルメタクリレートの重合体といった適当な高分子で吸着剤をコーティングしてもよい。また、このコーティングは吸着剤からの微粒子の発生を防ぐために行なってもよい。
【0035】
本発明に用いる水不溶性担体としては、たとえば、ガラスビーズ、シリカゲル、アルミナなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによってえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などがあげられるが、なかでも親水性担体は非特異的吸着が比較的少なくIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2の吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を指す。このような担体としては、セルロース、キトサン、セファロース、デキストランなどの多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。
【0036】
これらのなかでも−OH基が存在する担体は吸着性能、選択性の点ですぐれており、なかでも多孔性セルロースゲルは、
(a)機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填したばあい体液を高流速で流しても圧密化したり、目詰まりしたりせず、さらに細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい、
(b)ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基が多数存在し、非特異吸着が少ない、
(c)空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルにおとらない吸着容量がえられる、
(d)安全性が合成高分子ゲルなどに比べて高いなどの優れた点を有しており、
本発明に用いるのに最も適した担体の1つである。本発明においてはこれらの担体のみに限定されるものではない。なお、前記担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合して用いてもよい。
【0037】
本発明における吸着剤はその外表面だけでもIL−8、IL−1β、IL−6および/またはIL−2を吸着することができるが、より多くのIL−8、IL−1β、IL−6および/またはIL−2を吸着するために水不溶性担体に要求される性質は、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち多孔性であることである。本発明の吸着体の吸着対象であるIL−8は分子量が約8000、IL−1βは分子量が約17,500、IL−6は分子量が約21,000〜28,000、そしてIL−2は分子量が約15,000であることから、これらのタンパク質を効率よく吸着するためにはIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが他のタンパク質の侵入はできる限りおこらないことが好ましい。
【0038】
細孔の孔径の測定には水銀圧入法が最もよく用いられているが、本発明で用いる多孔性水不溶性担体のばあいには適用できないことが多いので、細孔の孔径の目安として排除限界分子量を用いるのが適当である。排除限界分子量とは、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない(排除される)分子の内最も小さい分子量を有するものの分子量をいう(波多野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人)。排除限界分子量は一般に球状タンパク質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられているが、本発明に用いる担体のばあい、球状タンパク質を用いてえられた値を用いるのが適当である。
【0039】
IL−1βおよび/またはIL−6の吸着には、IL−1βの分子量が約17,500であり、IL−6の分子量が約21,000〜28,000であることから、3万未満の排除限界分子量をもつ担体を用いたばあいには、IL−1βおよび/またはIL−6の吸着除去量は小さくその実用性が低下してしまう。したがって、IL−1βおよび/またはIL−6に対して用いる担体の好ましい排除限界分子量は3万以上であり、さらには5万以上であることが好ましい。
【0040】
また、IL−2の吸着には、IL−2の分子量が約15,000であることから、1万未満の排除限界分子量を持つ担体を用いたばあいには、IL−2の吸着除去量は小さくその実用性が低下してしまう。したがって、IL−2に対して用いる単体の好ましい排除限界分子量は1万以上であり、さらには2万以上であることが好ましい。体液として血漿または血清を用いる限り、排除限界分子量に上限はない。
【0041】
さらに、体液として血液を用いたばあい、排除限界分子量が500万をこえると血小板の付着の割合が増加する傾向がみられ、本発明の吸着体を直接血液灌流(DHP)型の血液浄化システムで用いたばあい、必ずしも充分な性能を発揮できない。したがって排除限界分子量が500万以下であることが望ましい。すなわち、体液として血液を用いたばあいの排除限界分子量は好ましくは3〜500万、さらに好ましくは5〜500万である。
【0042】
一方、IL−8の吸着には、排除限界分子量が1〜100万、好ましくは3〜50万、さらに好ましくは5〜20万である。この値は水不溶性担体が粒状、板状、繊維状であっても基本的には同じである。
【0043】
つぎに担体の多孔構造について述べる。吸着体の単位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく空孔容積が20%以上であり、比表面積が3m2/g以上であることが好ましい。また担体の形状は粒状、繊維状、中空形状など任意に形状を選ぶことができる。
【0044】
さらに、担体表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などがあげられる。
【0045】つぎに本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環治療用の吸着体として使用するためには、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要である。そのためには充分な機械的強度が要求される。したがって、本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。ここでいう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルのばあい、参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔPと流量の関係が0.3kg/cm2まで直線関係にあるものをいう。
【0046】
本発明の吸着剤は、アニオン性官能基を有する水不溶性担体であることを特徴とするものをいう。そのようなアニオン性官能基を有する水不溶性担体をうるためにアニオン性官能基を水不溶性担体へ導入する方法は種々あり、いかなる方法で導入してもよいが、代表的な導入方法としては、
(1)アニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を有する化合物をモノマーあるいは架橋剤として用いる重合によって吸着剤を形成させる方法、
(2)アニオン性官能基を有する化合物を水不溶性担体に固定させる方法、
(3)アニオン性官能基を有する化合物と水不溶性担体とを直接反応させることによって、水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化合物を固定させる方法
などがあげられる。
【0047】
(1)の方法において用いるアニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を有するモノマーあるいは架橋剤の代表例としては、アクリル酸およびそのエステル、メタクリル酸およびそのエステル、スチレンスルホン酸などがあげられるがこれらに限定されるわけではない。
【0048】
(2)の方法、すなわち、アニオン性官能基を有する化合物を水不溶性担体に固定させる方法としては、物理的吸着による方法、イオン結合による方法、共有結合により固定化する方法などがあり、いかなる方法を用いてもよいが、吸着剤の保存性ならびに安定性のためにはアニオン性官能基を有する化合物が脱離しないことが重要であるので、強固な固定が可能な共有結合法が望ましい。
【0049】
共有結合によりアニオン性官能基を有する化合物を固定化するばあい、アニオン性官能基を有する化合物がアニオン性官能基以外に固定化に利用できる官能基を有する多官能性化合物であることが好ましいが、ポリアニオン性官能基を有する化合物を固定化するばあい、一部のアニオン性官能基を用いて固定化してもよい。
【0050】
固定化に利用できる官能基の代表例としては、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、酸無水物基、スクシニルイミド基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、ハロゲン基、エポキシ基、シラノール基などがあげられるがこれらに限定されるわけではない。
【0051】
たとえば、硫酸エステル基を有する化合物を水不溶性担体に共有結合で固定化するばあい、硫酸エステル基を有する化合物の代表例としてはアルコール、糖類、グリコールなどの水酸基を有する化合物の硫酸エステル化物があげられるが、これらの中でも多価アルコールの部分硫酸エステル化物、とりわけ多糖類の硫酸エステル化物が硫酸エステル基、固定化に必要な官能基の双方を含んでいるうえに、容易に水不溶性担体に固定化できるところからとくに好ましい。
【0052】
つぎに、(3)の方法すなわちアニオン性官能基を有する化合物と水不溶性担体とを直接反応させることによって水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化合物を固定化してアニオン性官能基を導入する方法の代表例として水酸基を有する水不溶性担体に硫酸エステル基を導入する方法があげられる。このばあい、水酸基を有する水不溶性担体とクロルスルホン酸、濃硫酸などの試薬を反応させることによって直接硫酸エステル基を導入することができる。
【0053】
これら3種類の方法のほかにも
(4)アニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を有する化合物をモノマーとして用いて水不溶性担体上にグラフト重合することにより、ポリアニオン性官能基を有する水不溶性担体をうる方法がある。
【0054】
つぎに、アニオン性官能基を有する水不溶性担体からなる吸着剤を体液と接触させ体液中のIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2よりなる群から選択されるインターロイキンを吸着除去する方法には種々の方法がある。代表的な方法としては、体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着剤を混合してIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2よりなる群から選択されるインターロイキンを吸着除去したのち、前記吸着剤を濾別してIL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2よりなる群から選択されるインターロイキンの除去された体液をうるバッチ式の方法、体液の入口および出口を有し、出口に体液は通過するが吸着剤は通過しないフィルターを装着した容器に吸着剤を充填し、これに常圧または加圧下で体液を流す連続式の方法などがある。いずれの方法を用いてもよいが、後者の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液から効率よくオンラインで、IL−8、IL−1β、IL−6およびIL−2を除去することが可能であり、本発明の吸着剤はこの方法に適している。両方の方法を組み合わせて用いてもかまわない。
【0055】
吸着剤に吸着したIL−8の回収は、たとえばIL−8の吸着した吸着剤を高塩濃度の水溶液、たとえば0.5Mの濃度の食塩を含むリン酸緩衝溶液(PBS)で処理し、吸着したIL−8を溶出させることにより行なわれる。塩濃度の勾配をつけた緩衝液も用いられうる。なお、IL−1β、IL−2および/またはIL−6についても同様の方法で回収できる。
【0056】
前記の除去および回収は前記のようにバッチ式、連続式あるいはこれらを組み合わせて行ないうる。連続式のばあいは簡単な操作で吸着剤からIL−8を回収することも容易である。たとえば、IL−8の遺伝子を組み込んだ微生物を培養してIL−8を含む培養液からIL−8を回収するばあい、あるいは血液からIL−8を回収するばあいに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0057】
つぎにIL−1βの吸着剤を用いた本発明のIL−1βの吸着器を、その一実施例の概略断面図である図1にもとづき説明する。なお、前記以外のIL−8、IL−1β、IL−6および/またはIL−2の吸着器のばあいも同様である。
【0058】
図中、1は体液の流入口、2は体液の流出口、3は本発明のIL−1β(IL−8、IL−6、IL−1βおよび/またはIL−2)吸着剤、4および5は体液および体液に含まれる成分は通過できるがIL−1β(IL−8、IL−6、IL−1βおよび/またはIL−2)吸着剤は通過できない吸着剤流出防止手段、6はカラム、7は吸着器である。前記吸着器の容器の形状、材質にとくに限定はないが、好ましい具体例としては、たとえば容量150〜400ml程度、直径4〜10cm程度の筒状容器があげられる。
【0059】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【0060】
参考例
両端に孔径15μmのフィルターを装着したガラス製円筒カラム(内径9mm、カラム長150mm)にアガロースゲル(バイオラッド(BIO−RAD)社製のバイオゲル(Biogel)A−5m、粒径50〜100メッシュ)、ビニル系ポリマーゲル(東ソー(株)製のトヨパールHW−65、粒径50〜100μm)およびセルロースゲル(チッソ(株)製のセルロファインGC700−m、粒径45〜105μm)をそれぞれ均一に充填し、ペリスタリックポンプにより水を流し、流量と圧力損失ΔPとの関係を求めた。その結果を図2に示す。
【0061】
図2に示すごとく、トヨパールHW−65およびセルロファインGC−700mが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、バイオゲルA−5mは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。本発明においては前者のごとく、圧力損失ΔPと流量の関係が0.3kg/cm2まで直線関係にあるものを硬質ゲルという。
【0062】
実施例1
吸着剤の作製:多孔質セルロースゲルとしてセルロファインGC200−m(球状タンパク質の排除限界分子量120,000、粒径44〜105μm、チッソ(株)製)(以下、GC200−mという。)10mlに20%NaOH 4g、ヘプタン12gおよびノニオン系界面活性剤トウィーン(Tween)20を1滴加えた。40℃で2時間撹拌後、エピクロルヒドリン5gを加えて40℃で2時間撹拌し、ゲルを水洗濾過してエポキシ化セルロースゲルをえた。導入されたエポキシ基の量はカラム体積1mlあたり30μmolであった。えられたゲル2mlに極限粘度数0.027dl/g、硫黄含量17.7%のデキストラン硫酸ナトリウム0.12gおよび水2mlを加え(デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は約2.5%)、pH11に調整して45℃で16時間振とうした。そのあとゲルを濾別して、2M食塩水溶液、0.5M食塩溶液および水を用いて、この順に水洗し、デキストラン硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲル(以下、G−1という)をえた。
【0063】
ヒトIL−8の調製:大腸菌組換えヒトIL−8(アールアンドディー システムズ(R&D systems)社製)を、リン酸緩衝食塩液(PBS)0.1%BSAにて所定の濃度に調製した。
【0064】
吸着操作:GC200−mまたは前記のG−1を乾燥重量として10mgおよびヒトIL−8が5ng/mlになるように調製したPBS溶液を、ポリプロピレンチューブ(エッペンドルフ社製)に加えて、37℃にて2時間振とうした。
【0065】
分析方法:各サンプルの上清を一部抜き取り、アールアンドディー システムズ社製ヒトIL−8測定キットを用いてIL−8の濃度を測定し、IL−8の吸着率を算出した。
分析結果を表1に示す。
【0066】
【表1】
【0067】
実施例2
吸着剤G−1の作製は実施例1と同様に行った。
ヒトIL−8の調製は実施例1と同様に行った。
【0068】
吸着操作:GC200−mまたは実施例1と同様にしてえられたG−1を乾燥重量として10mg、最終容量に対してヒト血清50%およびヒトIL−8が5ng/mlになるように調製したPBS溶液を、ポリプロピレンチューブ(エッペンドルフ社製)に加えて、37℃にて2時間振とうした。
【0069】
分析方法:各サンプルを実施例1と同様に測定した。
分析結果を表2に示す。
【0070】
【表2】
【0071】
実施例3
吸着剤G−1の作製は実施例1と同様に行った。
ヒトIL−8の調製は実施例1と同様に行った。
【0072】
吸着操作:GC200−mまたはG−1を乾燥重量として10mg、最終容量に対してヒト血清70%、ヒトIL−8が5ng/mlになるように調製したPBS溶液を、ポリプロピレンチューブ(エッペンドルフ社製)に加えて、37℃にて2時間振とうした。
【0073】
分析方法:各サンプルを実施例1と同様に測定した。
分析結果を表3に示す。
【0074】
【表3】
【0075】
実施例4
吸着剤G−1の作製は実施例1と同様に行った。
ヒトIL−8の調製は実施例1と同様に行った。
【0076】
吸着および回収操作:G−1ゲルPBS懸濁液500μ1(乾燥重量として30mg)を、ポリプロピレン性小型カラムであるセバコールミニPP(生化学工業(株)製)に充填し、ここへ90%健常人血清を含むヒトIL−8の5ng/ml溶液3mlを流した。流速はペリスタリックポンプで約0.1ml/minに調整した。この流出液のヒトIL−8を実施例1と同様に測定した。さらに続いて、0.5M NaClを含むPBS溶液にてヒトIL−8を脱離、回収した。
【0077】
分析方法:各サンプルを実施例1と同様に測定した。
吸着率の分析結果を表4に示す。また、ヒトIL−8回収率は98%であった(吸着量を100%とする)。
【0078】
【表4】
【0079】
実施例5
吸着剤の作製:GC200−m 10mlを取り、エタノール中で臨界点乾燥により乾燥させた。乾燥ゲルを10mlのよく脱水したピリジン中に懸濁させ氷冷した。これにクロルスルホン酸2mlを撹拌下に滴下し、滴下終了後10分間撹拌を続けた。反応終了後ゲルを濾過し、ピリジンついで水で洗浄して、単位体積(1ml)あたり硫酸エステル基が0.05mmol/ml量導入されたセルロースゲル(以下、G−2という)をえた。
【0080】
ヒトIL−8の調製は実施例1と同様に行った。
吸着および回収操作は実施例4と同様に行った。
【0081】
分析方法:各サンプルを実施例1と同様に測定した。
吸着率の分析結果を表5に示す。また、ヒトIL−8回収率は98%であった(吸着量を100%とする)。
【0082】
【表5】
【0083】
実施例6
吸着剤の作製:セルロースビーズCK−A3(チッソ(株)製、球状タンパク質の排除限界分子量500万、粒径45〜105)100ml、水100ml、2M水酸化ナトリウム50mlおよびエピクロルヒドリン20mlを反応容器中で混合し40℃で2時間反応させることにより、エポキシ化セルロースビーズCK−A3をえた。えられたエポキシ化セルロースビーズCK−A3を100ml、水100mlおよび28%アンモニア水10mlを反応容器中で混合し、室温で一晩反応させることによりアミノ化セルロースビーズCK−A3をえた。一方、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム10g、塩化チオニル1mlおよびトルエン250mlを反応容器中で混合し、室温で8時間反応させることにより、一部をクロロ化したポリスチレンスルホン酸ナトリウムをえた。このクロロ化ポリスチレンスルホン酸ナトリウム10g、アミノ化セルロースビーズCK−A3を100mlおよび水100mlを反応容器中で混合し室温で一晩反応させることにより、ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースビーズCK−A3をえた。
【0084】
吸着剤の評価:ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースビーズCK−A3を生理食塩水で平衡化した。このビーズ0.5mlを試験管にとり、余分な生理食塩水を除いた。ここに、IL−1βを約1.3ng/mlまたはIL−2を約750pg/ml含んだヒト血清3ml加え、37℃で2時間振とうした。上清のIL−1βまたはIL−2の濃度をELISA法で測定した。
分析結果を表6に示す。
【0085】
実施例7
吸着剤の作製:実施例6と同様にしてえられたエポキシ化セルロースビーズCK−A3 100mlに極限粘度数0.27dl/g、硫黄含量17.7%のデキストラン硫酸ナトリウム6gおよび水100mlを加え(デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は約2.5%)、pH11に調整して45℃で16時間振とうした。そののちゲルをろ別して水洗し、デキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズCK−A3をえた。
【0086】
吸着剤の評価はデキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズCK−A3について実施例6と同様に行った。
分析結果を表6に示す。
【0087】
比較例1
実施例6で用いたセルロースビーズCK−A3について、実施例6と同様に前記ビーズの評価を行った。
分析結果を表6に示す。
【0088】
【表6】
【0089】
比較例1に対して実施例6および7の上清IL−1βおよびIL−2の濃度が低下しており、本発明の吸着剤を用いることにより効率よく体液中のIL−1βおよびIL−2を吸着除去できることがわかる。
【0090】
実施例8
吸着剤の作製:実施例6と同様の方法で、ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースCK−A3をえた。
【0091】
吸着剤の評価:ポリスチレンスルホン酸固定化セルロースビーズCK−A3を生理食塩水で平衡化した。このビーズ0.5mlを試験管にとり、余分な生理食塩水を除いた。ここにIL−6を約420pg/ml含んだヒト血清3ml加え、37℃で2時間振とうした。上清のIL−6濃度をELISA法で測定した。
分析結果を表7に示す。
【0092】
実施例9
吸着剤の作製:実施例7と同様の方法で、デキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズCK−A3をえた。
【0093】
吸着剤の評価はデキストラン硫酸ナトリウム固定化セルロースビーズCK−A3について実施例8と同様に行った。
分析結果を表7に示す。
【0094】
比較例2
実施例6で用いたセルロースビーズCK−A3について、実施例8と同様に前記ビーズの評価を行った。
分析結果を表7に示す。
【0095】
【表7】
【0096】
比較例2に対して実施例8および9の上清1L−6濃度が低下しており、本発明の吸着剤を用いることにより効率よく体液中のIL−6を吸着除去できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【0097】
本発明の、アニオン性官能基を有する水不溶性担体からなる吸着剤および吸着器を用いることにより、病因、物質たりうるIL−8、IL−1β、IL−6および/またはIL−2を、患者の血液、血漿および血清などの体液から効率よく吸着除去、要すれば回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【0098】
【図1】本発明のIL−8、IL−1β、IL−6および/またはIL−2の吸着器の一実施例の概略断面図である。
【図2】3種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
Claims (7)
- デキストラン硫酸およびポリスチレンスルホン酸よりなる群から選択される少なくとも1つの化合物に由来するアニオン性官能基を有する水不溶性担体からなる、体液中のインターロイキン−8、インターロイキン−1β、インターロイキン−6およびインターロイキン−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンを吸着除去するための吸着剤。
- 水不溶性担体が親水性であることを特徴とする請求項1記載の吸着剤。
- 水不溶性担体に−OHで表される末端官能基が存在することを特徴とする請求項1記載の吸着剤。
- 水不溶性担体が多孔性であることを特徴とする請求項1記載の吸着剤。
- 体液中のインターロイキン−8、インターロイキン−1β、インターロイキン−6およびインターロイキン−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンを吸着除去するための吸着器を製造するための請求項1記載の吸着剤の使用。
- アニオン性官能基を有する水不溶性担体を、インターロイキン−8、インターロイキン−1β、インターロイキン−6およびインターロイキン−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンを含有しうる体液と接触させることにより該インターロイキンを吸着する工程および該吸着したインターロイキンを溶出する工程からなる、インターロイキン−8、インターロイキン−1β、インターロイキン−6およびインターロイキン−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンの回収方法。
- 体液の入口および出口を有し、かつ吸着剤の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、請求項1記載の吸着剤を充填してなるインターロイキン−8、インターロイキン−1β、インターロイキン−6およびインターロイキン−2よりなる群から選択される少なくとも1つのインターロイキンの吸着器。
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