JP3825502B2 - 修飾蛋白質の製造法及びコンタクトレンズ用汚れ除去剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスホリルコリン基を含む重合体を蛋白質に化学的に結合させた修飾蛋白質の製造法及びこの製造法により得られた修飾蛋白質を有効成分とするコンタクトレンズ用汚れ除去剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンタクトレンズは、主成分がメチルメタクリレートやシリコン含有メタクリレートの重合物からなるハードコンタクトレンズと、２−ヒドロキシエチルメタクリレートやメタクリル酸の重合物からなるソフトコンタクトレンズが広く利用されている。しかしながら、前記ハードコンタクトレンズでは、シリコン含有基が涙液中の分泌物（蛋白質、脂質）と親和性が高く、コンタクトレンズに蛋白質や脂質が付着し易いため、特に長期間にわたり装用すると脂質、蛋白質、化粧品等により汚染されてレンズに曇りが発生し、視力の低下や眼の障害を引き起こす場合がある。一方、ソフトコンタクトレンズにおいても涙液中の分泌物が付着し、更には含水率が高いために、微生物や細菌による汚染が生じやすく、レンズに曇りが発生し、眼に損傷を与える場合がある。
【０００３】
そこで、従来コンタクトレンズの汚れを除去するために、蛋白質による汚れには蛋白質分解酵素が、脂質による汚れには界面活性剤が、更に固着汚れには研磨剤が洗浄剤として使用されている。しかし、界面活性剤及び研磨剤からなる洗浄剤は、特定の汚れに対しては効果があるが、洗浄力が不足であったり、レンズを傷付ける場合があるという問題点がある。一方、特公昭５３−４７８１０号公報に蛋白質分解酵素を含む洗浄剤が提案されている。しかし、水溶液中の酵素活性には寿命があるため、水溶液の状態で２４時間放置すると酵素活性が低下するという問題が生じ、改善が望まれている。
【０００４】
これら問題点を解決するために、特開平６−９５０４号公報には、グリセロール中にセリンプロテアーゼ、陰イオン性界面活性剤等を配合した洗浄剤が、特公平５−３３７６８号公報には、蛋白質分解酵素をポリエチレングリコールに分散させた洗浄剤を用いてコンタクトレンズをこすり洗いする洗浄方法が開示されている。しかし、これらに記載された洗浄剤は、希釈水と混合することによって酵素活性が低下するという問題が生じる。
【０００５】
ところで、特開平６−３１３００９号公報において、末端官能性ホスホリルコリン基含有ポリマーの合成方法が開示されているが、これらポリマーを蛋白質に化学的に修飾させた修飾蛋白質及びその用途については従来知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、水溶液状態で長期間保存しても酵素活性を高く維持して安定に保存可能な修飾蛋白質の製造法を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、コンタクトレンズの汚れ除去能が高く、しかも溶液状態で長期間保存しても汚れ除去能が低下することなく保存安定性に優れたコンタクトレンズ用汚れ除去剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、一般式（１）
Ｐｒｏ−(Ｒ−(Ｘ1)a−Ｘ)b・・・（１）
(式中、Ｐｒｏは蛋白質の残基、Ｒは蛋白質中の官能基と結合可能な官能基から誘導される２価の有機残基を示し、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基、Ｘは式 ( ３ ) で示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基を示す( 但し、式 ( ３ ) 中、Ｘ 2 及びＸ 3 は、同一又は異なる基であって、水素原子又はメチル基を示す。またｎ 2 は１〜１０００の整数を示す )。ａは０又は１であり、ｂは１〜１００の正数を示す。)で表される修飾蛋白質を製造するにあたり、
【化２】
一般式(２)
Ｒ1−(Ｘ1)a−Ｘ・・・（２）
(式中、Ｒ1は蛋白質中の官能基と結合可能な官能基を示し、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基、Ｘは上記式(３)で示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基を示す。ａは０又は１を示す。)で表されるホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質とを反応させることを特徴とする修飾蛋白質の製造法が提供される。
また本発明によれば、前記一般式(２)中のＸで示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの有機残基であり、蛋白質が加水分解酵素である前記製造法により得られた修飾蛋白質を有効成分として含有することを特徴とするコンタクトレンズ用汚れ除去剤が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の修飾蛋白質の製造法では、前記一般式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質とを反応させて、ホスホリルコリン基を有する化合物の有機残基が化学的に蛋白質に結合した前記一般式（１）で表される修飾蛋白質を得ることを特徴とする。
【００１０】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物において、Ｒ1は蛋白質中の官能基と結合可能な官能基を有する有機残基であって、式（１）中のＲはＲ1の有機残基から誘導される２価の有機残基を示す。この蛋白質中の官能基と結合可能な官能基としては、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基、スクシニミジルオキシカルボニル基、イミドエステル基、ハロゲノニトロアリル基、ピリジノジスルフィド基、マレイミド基、フタルイミドチオ基、ハロゲノメチルカルボニル基、ハロゲノカルボニル基、ハロゲノスルホニル基、ニトロアジドフェニル基、ジアゾトリフルオロアセチル基、イソシアネート基等が挙げられる。これらの中では、蛋白質中、特に酵素中のアミノ基との結合が容易である、カルボキシル基、スクシニミジルオキシカルボニル基、イソシアネート基等が好ましい。また、式（１）中のＲとしては、アミド基、ジカルバミド結合、ウレア結合、ジスルフィド結合、イミド酸アミド結合、３−チオスクシンイミド基（マレイミド基にチオール基が反応して形成された結合）等を好ましく挙げることができる。
【００１１】
式（１）及び（２）において、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基であって、特に限定されるものではなく、チオエステル基、エーテル基、アルキレン基、オキシアルキレン基、ポリオキシアルキレン基、アルキレンウレタン基、スルホニル基等が挙げられる。一方、Ｘで表されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基は、末端に有機残基を含む残基であれば特に限定されるものではない。
【００１２】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物としては、下記式で示される重合体等を好ましく挙げることができる。但し、ｎ1は１〜１００００の正数、ｎ2は１〜１０００の正数、ｎ3は１〜１００００の正数を示す。ｎ1、ｎ3が１００００を超える場合、ｎ2が１０００を超える場合は製造が困難である。
【００１３】
【化１】
【００１４】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物の分子量は特に限定されるものではないが、好ましくは数平均分量５００〜１００００００、特に好ましくは後述する蛋白質の活性（酵素活性等）を低下させないために数平均分子量１０００〜１０００００の範囲が好ましい。
【００１５】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する方法は特に限定されないが、例えば、式（２）中のＲ1を構成する特定のラジカル連鎖移動剤の存在下、ホスホリルコリン基を含む単量体を溶液重合あるいは塊状重合等の既知の重合技術により単独若しくは他の共重合可能なビニルモノマーと、ラジカル重合開始剤を用いて重合させる方法等により得ることができる。
【００１６】
式（２）中のＲ1、更には式（１）のＲを構成するラジカル連鎖移動剤としては特に限定されるものではないが、チオグリコール酸、チオグリコール、アミノエタンチオール、エタンジチオール等が挙げられる。
【００１７】
式（２）中のＸ（式（１）中のＸ）を構成するホスホリルコリン基を含む単量体としては、下記式（３）で示されるホスホリルコリン基含有（メタ）アクリレート等を挙げることができる。
【００１８】
【化２】
【００１９】
前記ホスホリルコリン基含有（メタ）アクリレートとしては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシ−１−メチルエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、β−（２’−（メタ）アクリロイルオキシ−１’−メチルエトキシ）−プロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシジエトキシエチルホスホリルコリン等を挙げることができる。
【００２０】
式（２）中のＸ1（式（１）中のＸ1）を構成する、前記ホスホリルコリン基を含む単量体と共重合可能なビニルモノマーとしては、例えば（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸トリデシル、（メタ）アクリル酸−２−エトキシエチル、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸アミド、（メタ）アクリル酸−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミド、酢酸ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン、スチレン、α−メチルスチレン、メチレン核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン、プロピオン酸ビニル、エチルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテルジエリルイタコネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネート等を挙げることができ、特にメタクリル酸エステル等が好ましい。使用に際しては単独若しくは混合物として用いることができる。
【００２１】
前記ラジカル重合開始剤としては、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスマレノニトリル、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ジイソプロピルペルオキシカーボネート、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等を挙げることができる。
【００２２】
式（２）で示されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する重合反応は無溶媒で行なうこともできるが、重合反応をより円滑に行なうために溶媒を用いることが好ましい。該溶媒としては、モノマーが可溶であるもの、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、クロロホルム、塩化メチレン、ベンゼン、酢酸エチル又はこれらの混合物等を挙げることができる。
【００２３】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する際のモノマー濃度は、好ましくは前記分子量となるように、０．１〜１０ｍｏｌ／リットル、特に０．２〜１．０ｍｏｌ／リットルが望ましい。また連鎖移動剤のモノマーに対する濃度（［Ｓ］／［Ｍ］）は、前記モノマー濃度に対して、０．００５〜２、特に０．０１〜１が望ましい。更に連鎖移動剤のラジカル重合開始剤に対する濃度比（［Ｓ］／［Ｉ］）は、該ラジカル重合開始剤濃度に対して、連鎖移動剤濃度が１．０〜５００、特に１．０〜２００の範囲となるように添加するのが望ましい。
【００２４】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する際の重合温度は２０〜１００℃、特に３０〜９０℃が望ましい。重合時間は１〜７２時間程度である。更に前記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他の共重合可能なビニルモノマーとを共重合させる場合、前記ビニルモノマーは、モノマー全量に対して、０〜９５モル％の範囲が好ましく、特に酵素活性を低下させない０〜５０モル％が好ましい。
【００２５】
本発明の製造法において用いる蛋白質は、一般式（１）中のＰｒｏで表される基を構成するものであって、蛋白質としては、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、各種糖鎖を開環させたアルデヒド基等の反応性官能基を有し、生体触媒作用を有するペプチド、酵素、各種抗原又は抗原に対する抗体等を挙げることができる。
酵素としては、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素等を挙げることができる。加水分解酵素としては、プロテアーゼ等のペプチド加水分解酵素；リパーゼ、フォスフォリパーゼ、アルカリフォスファターゼ等のエステル加水分解酵素；β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、サッカラーゼ、ペクチナーゼ等の糖加水分解酵素等が挙げられる。また、市販品を使用することもでき、例えば商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、ペプチド加水分解酵素）、商品名「リパーゼサイケン」（ナガセ生化学工業（株）製、エステル加水分解酵素）等が挙げられる。この際、酵素の起源は限定されず、バチルス(Bacillusu)等のあらゆる起源のものが使用できる。
【００２６】
抗原又は抗体としては、例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、リューマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリス等の血漿蛋白及びこれらに対する抗体；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トリヨードサイロニン（Ｔ3）、サイロキシン（Ｔ4）、チロキシン結合性蛋白（ＴＢＧ）、サイログロブリン、インスリン、エストリオール（Ｅ3）、絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）等のホルモンに対する抗体；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β2−マイクログロブリン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質及びこれらに対する抗体；ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体等のウイルス肝炎の抗原に対する抗体又は抗体に対する抗原；ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、サイトメガロ等のウイルス、抗エイズ抗体（ＨＩＶ）等の各種生体成分に対する抗体又は抗原；フェノバルビタール、アセトアミノフェノン、サリチル酸、シクロスポリン等の各種薬剤に対する抗体が挙げられる。
【００２７】
本発明の製造法において、式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物と蛋白質とを反応させるには、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、又は各種生理食塩水等に酵素を溶解した溶液に、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、水、メタノール、エタノール、プロパノール又はこれらの混合液等に修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解した溶液を加え、反応温度０〜５０℃、反応時間１５分間〜２４時間反応させる方法等により行なうことができる。反応生成物である修飾蛋白質は生成することなく使用することができ、また必要により透析、塩析、ゲル濾過等の方法により精製することもできる。
【００２８】
具体的な反応としては、例えば式（２）のＲ1がカルボキシル基あるいは水酸基の場合は、修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解あるいは懸濁させた溶液に、１，１’−カルボニルビス−１Ｈ−イミダゾール、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を加えて反応させた後に、直接蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより、あるいは、前記縮合剤を加えた後に更に、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミド等を加えて反応させた後に蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより、一般式（１）で表される修飾蛋白質を得ることができる。
また、例えば式（２）のＲ1がアミノ基の場合には、修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解あるいは懸濁させた溶液に、グルタルアルデヒド溶液等を加えて反応させた後に、蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより一般式（１）で表される修飾蛋白質が得られる。
更に、例えば式（２）のＲ1がスクシニミジルオキシカルボニツ基、イミドエステル基、ハロゲノニトロアリル基、ピリジノジスルフィド基、マレイミド基、フタルイミドチオ基等の活性エステル基の場合には、活性エステル基を有する修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解あるいは直接、蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより一般式（１）で表される修飾蛋白質を得ることができる。
【００２９】
本発明の製造法により得られる修飾蛋白質は、一般式（１）で表されるホスホリルコリン基を有する化合物の有機残基が化学的に蛋白質に結合したものであって、式中のＰｒｏ、Ｒ、Ｘ1及びＸは前述のものを好ましく挙げることができる。また式（１）中のｂは１以上の正数、好ましくは蛋白質の種類にもよるが１〜１００、更に好ましくは１〜１０である。ｂが１００を超えると、蛋白質の種類にもよるが、蛋白質の活性（酵素活性、抗体活性等）が低下する場合があるので好ましくない。尚、合成した修飾蛋白質のｂの数は、合成した修飾蛋白質中の官能基を定量することにより決定することができる。例えば、この官能基がアミノ基の場合、反応前及び反応後の蛋白質中のアミノ基を定量し、修飾されたアミノ基の割合（修飾率）を求め、この修飾率からｂの数を決定することができる。
【００３０】
本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤は、前記一般式（２）中のＸが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの有機残基である式（２）で示されるホスホリルコリン基含有化合物と、加水分解酵素とを反応させて得られた修飾蛋白質を有効成分として含有する。この有効成分の有効濃度は、加水分解酵素の種類及び活性により異なるが、コンタクトレンズ用汚れ除去剤を液状とした際に、通常０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００３１】
本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤は、前記有効成分以外に通常コンタクトレンズ用の汚れ除去剤又は洗浄液の成分として使用されている成分を配合することもできる。具体的には、界面活性剤、等張化剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。界面活性剤としては、カチオン性、アニオン性、ノニオン性又は両性のいずれの界面活性剤も使用することができる。好ましくは、ポリエチレングリコールエステル、ポリエチレングリコールエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のノニオン性又は中性の界面活性剤が望ましい。等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩等が挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはそのアルカリ金属塩、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００３２】
本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤の形態は、液状の他に、粉末、錠剤等の乾燥状態であっても良い。このような乾燥状態の場合には、使用時に適当な媒体に溶解して使用することもできる。一方、液状の場合には、有効成分が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む重合体で化学的に修飾されている加水分解酵素であるため、長期間液状で保存しても酵素活性を高く維持することができ、このため汚れ除去能（洗浄能）はほとんど低下しない。
【００３３】
本発明の汚れ除去剤を用いてコンタクトレンズの汚れを除去するには、溶液状態の汚れ除去剤にコンタクトレンズを浸すか、あるいは溶液状態又は乾燥状態の汚れ除去剤を緩衝液、等張液またはコンタクトレンズ用保存液等で希釈した後、この希釈液にコンタクトレンズを浸し、１５〜１２０分間静置しておけば良い。この際、加熱しても良い。また擦り洗いしても良いが、多くの場合擦り洗いしなくても加水分解酵素の作用により効率的に汚れを分解除去することができる。汚れを除去した後は、適当なリンス液でコンタクトレンズをすすぐ等して装着することができる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の修飾蛋白質の製造法では、溶液状態で長期間保存しても蛋白質活性（酵素活性等）がほとんど低下しないホスホリルコリン基含有化合物で化学修飾された蛋白質を得ることができる。また本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤は、前記製造法により得られた特定の修飾酵素を有効成分として含有するので、長期間液状で保存しても酵素活性を高く維持することができ、このため汚れ除去能（洗浄能）をほとんど低下させないで保存することができる。
【００３５】
【実施例】
以下、参考例、実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
参考例１−１
末端にカルボン酸を有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体（ポリマーａ）の調製
エタノールを溶媒として、０．４５ｍｏｌ／リットルの２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン溶液を調製し、この溶液に連鎖移動剤として３−メルカプロプロピオン酸を０．０９ｍｏｌ／リットルとなる量、ラジカル重合開始剤としてアゾビスイソブチルニトリルを９×１０~4ｍｏｌ／リットルとなる量混合した。得られた溶液を封管法により、凍結脱気、真空封管後、６０℃、６時間重合させた。反応終了後、エーテル中に滴下し沈澱を収集した後、洗浄し減圧乾燥して数平均分子量２００００の末端にカルボン酸を有するポリマーａを調製した。
【００３７】
参考例１−２
末端にカルボン酸を有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレート共重合体（ポリマーｂ）の調製
エタノールを溶媒として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン濃度が０．４０ｍｏｌ／リットル及びｎ−ブチルメタクリレート濃度が０．０５ｍｏｌ／リットルとなる溶液を調製し、この溶液に連鎖移動剤として３−メルカプロプロピオン酸を０．０９ｍｏｌ／リットルとなる量、ラジカル重合開始剤としてアゾビスイソブチルニトリルを９×１０~4ｍｏｌ／リットルとなる量混合し、得られた溶液を参考例１−１と同様に反応させて数平均分子量５５０００のポリマーｂを調製した。
【００３８】
実施例１−１
参考例１−１で調製したポリマーａ ５８０ｍｇ及び商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、分子量約２７０００）５４．８ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ）を、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）６．５ｍｌに溶解させ氷冷させた。続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１５３．４ｍｌを添加して１時間撹拌した。再び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１５３．４ｍｇ（０．８０ｍｍｏｌ）を添加して１時間撹拌した後、室温にて更に１時間撹拌した。反応終了後、反応液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対しての透析を透析膜（spectrum Medical Industries Inc.,商品名「Spectrum/por,membranes MW CO. 6000〜8000)によって行ない、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを除去した。得られた化合物は、下記式（４）で示される修飾ビオプラーゼであった。
Ｅ−(ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ3)Ｓ−Ｐ1)n ・・・（４）
（式中、Ｅは商品名「ビオプラーゼ」の残基を示し、Ｐ1はポリマーａの末端残基を示す。またｎは４．７である）。
商品名「ビオプラーゼ」中の遊離アミノ基がポリマーａのカルボキシル基とアミド結合した割合（修飾率（％））を、グリシン溶液を標準液、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」の修飾率を０％として、遊離アミノ基の定量法（Analytical Biochemistry 14,328-336(1966))に準拠して測定した。その結果、修飾率は５２．８％、ｎは４．７であった。
【００３９】
実施例１−２
実施例１−１で用いた参考例１−１で調製したポリマーａの代わりに、参考例１−２で調製したポリマーｂを用いた以外は、実施例１−１と同様に行ない下記式（５）で表される修飾ビオプラーゼを得た。
Ｅ−(ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ3)Ｓ−Ｐ2)n ・・・（５）
（Ｅは商品名「ビオプラーゼ」の残基を示し、Ｐ2はポリマーｂの末端残基を示す。またｎは４．５である）。
実施例１−１と同様に商品名「ビオプラーゼ」中の遊離アミノ基がポリマーｂのカルボキシル基とアミド結合した割合（修飾率（％））を、グリシン溶液を標準液、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」の修飾率を０％として実施例１−１と同様に修飾率を測定した。その結果修飾率は４９．５％、ｎは４．５であった。
【００４０】
比較例１−１
モノメトキシポリエチレングリコール(CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2COOH)（数平均分子量３０００）３．００ｇ（１．０ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン５０．０ｍｌに溶解させた。次いで、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１３８．１２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド２４７．６０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で６時間反応させた。反応終了後、反応液をヘキサン５００ｍｌに滴下してポリオキシアルキレン誘導体を沈澱させた。沈澱物を濾過し、充分にヘキサンで洗浄させた後、減圧乾燥して白色粉末のポリオキシアルキレン誘導体（以下ポリマーｃと称す）２．６７ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）を得た。
【００４１】
商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、分子量約２７０００）５４．８ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）６．５ｍｌに溶解させ氷冷させた。続いて前記ポリマーｃ６０．８９ｍｇを添加して１時間撹拌した後、室温にて更に１時間撹拌した。反応終了後、反応液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対しての透析を実施例１と同様に行ない、下記式（６）で表される修飾ビオプラーゼを得た。
Ｅ−(ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＯＣＨ3)n ・・・（６）
（式中、Ｅは商品名「ビオプラーゼ」の残基を示す。ｎは５．５である）。
商品名「ビオプラーゼ」中の遊離アミノ基がポリマーｃのスクシンイミド基とアミド結合した割合（修飾率（％））を、グリシン溶液を標準液、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」の修飾率を０％として、実施例１−１と同様に修飾率を求めた。その結果修飾率は５２．８％であり、ｎは４．７であった。
【００４２】
実施例２−１
実施例１−１で調製した修飾酵素を生理食塩水に０．４重量％の濃度になるように溶解し、コンタクトレンズ用汚れ除去液を調製した。この汚れ除去液に蛋白質を付着させたコンタクトレンズを浸漬し、静置させた状態で洗浄した。洗浄効果は２時間後に目視にて行ない、付着蛋白質がほとんど除かれている場合を良好、それ以外を不良として判定した。結果を表１に示す。尚、蛋白質を付着させたコンタクトレンズは次のように調製した。即ち、人工涙液（アルブミン０．６ｇ、グロブリン０．３ｇ、リゾチーム０．２ｇ、ムチン０．１ｇを生理食塩水に溶解させ１００ｍｌとしたもの）にコンタクトレンズ（セイコーコンタクトレンズ社製、商品名「スーパーＥＸ１」）を浸し、６５℃に加熱して蛋白質を付着させた。
【００４３】
また、この汚れ除去液の蛋白質分解酵素の酵素活性を、汚れ除去液調製直後及び１４週間後（４０℃で保存）に、カゼイン−フォリン法により測定した。結果を表１に示す。
【００４４】
実施例２−２
実施例１−１で調製した修飾酵素の代わりに、実施例１−２で調製した修飾酵素を用いた以外は、実施例２−１と同様に汚れ除去液を調製し各測定を行なった。結果を表１に示す。
【００４５】
比較例２−１
実施例１−１で調製した修飾酵素の代わりに、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、分子量約２７０００）を用いた以外は、実施例２−１と同様に汚れ除去液を調製し各測定を行なった。結果を表１に示す。
【００４６】
比較例２−２
実施例１−１で調製した修飾酵素の代わりに、比較例１−１で調製した修飾酵素を用いた以外は、実施例２−１と同様に汚れ除去液を調製し各測定を行なった。結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１の結果から、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む重合体を化学的に酵素に結合させた修飾酵素は、洗浄効果が良好であり、しかも水溶液状態で長期間保存しても酵素活性はほとんど低下せず、高く維持されていることが判る。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスホリルコリン基を含む重合体を蛋白質に化学的に結合させた修飾蛋白質の製造法及びこの製造法により得られた修飾蛋白質を有効成分とするコンタクトレンズ用汚れ除去剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンタクトレンズは、主成分がメチルメタクリレートやシリコン含有メタクリレートの重合物からなるハードコンタクトレンズと、２−ヒドロキシエチルメタクリレートやメタクリル酸の重合物からなるソフトコンタクトレンズが広く利用されている。しかしながら、前記ハードコンタクトレンズでは、シリコン含有基が涙液中の分泌物（蛋白質、脂質）と親和性が高く、コンタクトレンズに蛋白質や脂質が付着し易いため、特に長期間にわたり装用すると脂質、蛋白質、化粧品等により汚染されてレンズに曇りが発生し、視力の低下や眼の障害を引き起こす場合がある。一方、ソフトコンタクトレンズにおいても涙液中の分泌物が付着し、更には含水率が高いために、微生物や細菌による汚染が生じやすく、レンズに曇りが発生し、眼に損傷を与える場合がある。
【０００３】
そこで、従来コンタクトレンズの汚れを除去するために、蛋白質による汚れには蛋白質分解酵素が、脂質による汚れには界面活性剤が、更に固着汚れには研磨剤が洗浄剤として使用されている。しかし、界面活性剤及び研磨剤からなる洗浄剤は、特定の汚れに対しては効果があるが、洗浄力が不足であったり、レンズを傷付ける場合があるという問題点がある。一方、特公昭５３−４７８１０号公報に蛋白質分解酵素を含む洗浄剤が提案されている。しかし、水溶液中の酵素活性には寿命があるため、水溶液の状態で２４時間放置すると酵素活性が低下するという問題が生じ、改善が望まれている。
【０００４】
これら問題点を解決するために、特開平６−９５０４号公報には、グリセロール中にセリンプロテアーゼ、陰イオン性界面活性剤等を配合した洗浄剤が、特公平５−３３７６８号公報には、蛋白質分解酵素をポリエチレングリコールに分散させた洗浄剤を用いてコンタクトレンズをこすり洗いする洗浄方法が開示されている。しかし、これらに記載された洗浄剤は、希釈水と混合することによって酵素活性が低下するという問題が生じる。
【０００５】
ところで、特開平６−３１３００９号公報において、末端官能性ホスホリルコリン基含有ポリマーの合成方法が開示されているが、これらポリマーを蛋白質に化学的に修飾させた修飾蛋白質及びその用途については従来知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、水溶液状態で長期間保存しても酵素活性を高く維持して安定に保存可能な修飾蛋白質の製造法を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、コンタクトレンズの汚れ除去能が高く、しかも溶液状態で長期間保存しても汚れ除去能が低下することなく保存安定性に優れたコンタクトレンズ用汚れ除去剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、一般式（１）
Ｐｒｏ−(Ｒ−(Ｘ1)a−Ｘ)b・・・（１）
(式中、Ｐｒｏは蛋白質の残基、Ｒは蛋白質中の官能基と結合可能な官能基から誘導される２価の有機残基を示し、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基、Ｘは式 ( ３ ) で示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基を示す( 但し、式 ( ３ ) 中、Ｘ 2 及びＸ 3 は、同一又は異なる基であって、水素原子又はメチル基を示す。またｎ 2 は１〜１０００の整数を示す )。ａは０又は１であり、ｂは１〜１００の正数を示す。)で表される修飾蛋白質を製造するにあたり、
【化２】
Ｒ1−(Ｘ1)a−Ｘ・・・（２）
(式中、Ｒ1は蛋白質中の官能基と結合可能な官能基を示し、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基、Ｘは上記式(３)で示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基を示す。ａは０又は１を示す。)で表されるホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質とを反応させることを特徴とする修飾蛋白質の製造法が提供される。
また本発明によれば、前記一般式(２)中のＸで示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの有機残基であり、蛋白質が加水分解酵素である前記製造法により得られた修飾蛋白質を有効成分として含有することを特徴とするコンタクトレンズ用汚れ除去剤が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の修飾蛋白質の製造法では、前記一般式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質とを反応させて、ホスホリルコリン基を有する化合物の有機残基が化学的に蛋白質に結合した前記一般式（１）で表される修飾蛋白質を得ることを特徴とする。
【００１０】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物において、Ｒ1は蛋白質中の官能基と結合可能な官能基を有する有機残基であって、式（１）中のＲはＲ1の有機残基から誘導される２価の有機残基を示す。この蛋白質中の官能基と結合可能な官能基としては、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基、スクシニミジルオキシカルボニル基、イミドエステル基、ハロゲノニトロアリル基、ピリジノジスルフィド基、マレイミド基、フタルイミドチオ基、ハロゲノメチルカルボニル基、ハロゲノカルボニル基、ハロゲノスルホニル基、ニトロアジドフェニル基、ジアゾトリフルオロアセチル基、イソシアネート基等が挙げられる。これらの中では、蛋白質中、特に酵素中のアミノ基との結合が容易である、カルボキシル基、スクシニミジルオキシカルボニル基、イソシアネート基等が好ましい。また、式（１）中のＲとしては、アミド基、ジカルバミド結合、ウレア結合、ジスルフィド結合、イミド酸アミド結合、３−チオスクシンイミド基（マレイミド基にチオール基が反応して形成された結合）等を好ましく挙げることができる。
【００１１】
式（１）及び（２）において、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基であって、特に限定されるものではなく、チオエステル基、エーテル基、アルキレン基、オキシアルキレン基、ポリオキシアルキレン基、アルキレンウレタン基、スルホニル基等が挙げられる。一方、Ｘで表されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基は、末端に有機残基を含む残基であれば特に限定されるものではない。
【００１２】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物としては、下記式で示される重合体等を好ましく挙げることができる。但し、ｎ1は１〜１００００の正数、ｎ2は１〜１０００の正数、ｎ3は１〜１００００の正数を示す。ｎ1、ｎ3が１００００を超える場合、ｎ2が１０００を超える場合は製造が困難である。
【００１３】
【化１】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物の分子量は特に限定されるものではないが、好ましくは数平均分量５００〜１００００００、特に好ましくは後述する蛋白質の活性（酵素活性等）を低下させないために数平均分子量１０００〜１０００００の範囲が好ましい。
【００１５】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する方法は特に限定されないが、例えば、式（２）中のＲ1を構成する特定のラジカル連鎖移動剤の存在下、ホスホリルコリン基を含む単量体を溶液重合あるいは塊状重合等の既知の重合技術により単独若しくは他の共重合可能なビニルモノマーと、ラジカル重合開始剤を用いて重合させる方法等により得ることができる。
【００１６】
式（２）中のＲ1、更には式（１）のＲを構成するラジカル連鎖移動剤としては特に限定されるものではないが、チオグリコール酸、チオグリコール、アミノエタンチオール、エタンジチオール等が挙げられる。
【００１７】
式（２）中のＸ（式（１）中のＸ）を構成するホスホリルコリン基を含む単量体としては、下記式（３）で示されるホスホリルコリン基含有（メタ）アクリレート等を挙げることができる。
【００１８】
【化２】
前記ホスホリルコリン基含有（メタ）アクリレートとしては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシ−１−メチルエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、β−（２’−（メタ）アクリロイルオキシ−１’−メチルエトキシ）−プロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシジエトキシエチルホスホリルコリン等を挙げることができる。
【００２０】
式（２）中のＸ1（式（１）中のＸ1）を構成する、前記ホスホリルコリン基を含む単量体と共重合可能なビニルモノマーとしては、例えば（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸トリデシル、（メタ）アクリル酸−２−エトキシエチル、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸アミド、（メタ）アクリル酸−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミド、酢酸ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン、スチレン、α−メチルスチレン、メチレン核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン、プロピオン酸ビニル、エチルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテルジエリルイタコネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネート等を挙げることができ、特にメタクリル酸エステル等が好ましい。使用に際しては単独若しくは混合物として用いることができる。
【００２１】
前記ラジカル重合開始剤としては、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスマレノニトリル、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ジイソプロピルペルオキシカーボネート、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等を挙げることができる。
【００２２】
式（２）で示されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する重合反応は無溶媒で行なうこともできるが、重合反応をより円滑に行なうために溶媒を用いることが好ましい。該溶媒としては、モノマーが可溶であるもの、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、クロロホルム、塩化メチレン、ベンゼン、酢酸エチル又はこれらの混合物等を挙げることができる。
【００２３】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する際のモノマー濃度は、好ましくは前記分子量となるように、０．１〜１０ｍｏｌ／リットル、特に０．２〜１．０ｍｏｌ／リットルが望ましい。また連鎖移動剤のモノマーに対する濃度（［Ｓ］／［Ｍ］）は、前記モノマー濃度に対して、０．００５〜２、特に０．０１〜１が望ましい。更に連鎖移動剤のラジカル重合開始剤に対する濃度比（［Ｓ］／［Ｉ］）は、該ラジカル重合開始剤濃度に対して、連鎖移動剤濃度が１．０〜５００、特に１．０〜２００の範囲となるように添加するのが望ましい。
【００２４】
式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物を合成する際の重合温度は２０〜１００℃、特に３０〜９０℃が望ましい。重合時間は１〜７２時間程度である。更に前記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他の共重合可能なビニルモノマーとを共重合させる場合、前記ビニルモノマーは、モノマー全量に対して、０〜９５モル％の範囲が好ましく、特に酵素活性を低下させない０〜５０モル％が好ましい。
【００２５】
本発明の製造法において用いる蛋白質は、一般式（１）中のＰｒｏで表される基を構成するものであって、蛋白質としては、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、各種糖鎖を開環させたアルデヒド基等の反応性官能基を有し、生体触媒作用を有するペプチド、酵素、各種抗原又は抗原に対する抗体等を挙げることができる。
酵素としては、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素等を挙げることができる。加水分解酵素としては、プロテアーゼ等のペプチド加水分解酵素；リパーゼ、フォスフォリパーゼ、アルカリフォスファターゼ等のエステル加水分解酵素；β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、サッカラーゼ、ペクチナーゼ等の糖加水分解酵素等が挙げられる。また、市販品を使用することもでき、例えば商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、ペプチド加水分解酵素）、商品名「リパーゼサイケン」（ナガセ生化学工業（株）製、エステル加水分解酵素）等が挙げられる。この際、酵素の起源は限定されず、バチルス(Bacillusu)等のあらゆる起源のものが使用できる。
【００２６】
抗原又は抗体としては、例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、リューマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリス等の血漿蛋白及びこれらに対する抗体；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トリヨードサイロニン（Ｔ3）、サイロキシン（Ｔ4）、チロキシン結合性蛋白（ＴＢＧ）、サイログロブリン、インスリン、エストリオール（Ｅ3）、絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）等のホルモンに対する抗体；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β2−マイクログロブリン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質及びこれらに対する抗体；ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体等のウイルス肝炎の抗原に対する抗体又は抗体に対する抗原；ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、サイトメガロ等のウイルス、抗エイズ抗体（ＨＩＶ）等の各種生体成分に対する抗体又は抗原；フェノバルビタール、アセトアミノフェノン、サリチル酸、シクロスポリン等の各種薬剤に対する抗体が挙げられる。
【００２７】
本発明の製造法において、式（２）で表されるホスホリルコリン基含有化合物と蛋白質とを反応させるには、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、又は各種生理食塩水等に酵素を溶解した溶液に、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、水、メタノール、エタノール、プロパノール又はこれらの混合液等に修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解した溶液を加え、反応温度０〜５０℃、反応時間１５分間〜２４時間反応させる方法等により行なうことができる。反応生成物である修飾蛋白質は生成することなく使用することができ、また必要により透析、塩析、ゲル濾過等の方法により精製することもできる。
【００２８】
具体的な反応としては、例えば式（２）のＲ1がカルボキシル基あるいは水酸基の場合は、修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解あるいは懸濁させた溶液に、１，１’−カルボニルビス−１Ｈ−イミダゾール、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を加えて反応させた後に、直接蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより、あるいは、前記縮合剤を加えた後に更に、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミド等を加えて反応させた後に蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより、一般式（１）で表される修飾蛋白質を得ることができる。
また、例えば式（２）のＲ1がアミノ基の場合には、修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解あるいは懸濁させた溶液に、グルタルアルデヒド溶液等を加えて反応させた後に、蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより一般式（１）で表される修飾蛋白質が得られる。
更に、例えば式（２）のＲ1がスクシニミジルオキシカルボニツ基、イミドエステル基、ハロゲノニトロアリル基、ピリジノジスルフィド基、マレイミド基、フタルイミドチオ基等の活性エステル基の場合には、活性エステル基を有する修飾剤としてのホスホリルコリン基含有化合物を溶解あるいは直接、蛋白質を溶解させた溶液に添加することにより一般式（１）で表される修飾蛋白質を得ることができる。
【００２９】
本発明の製造法により得られる修飾蛋白質は、一般式（１）で表されるホスホリルコリン基を有する化合物の有機残基が化学的に蛋白質に結合したものであって、式中のＰｒｏ、Ｒ、Ｘ1及びＸは前述のものを好ましく挙げることができる。また式（１）中のｂは１以上の正数、好ましくは蛋白質の種類にもよるが１〜１００、更に好ましくは１〜１０である。ｂが１００を超えると、蛋白質の種類にもよるが、蛋白質の活性（酵素活性、抗体活性等）が低下する場合があるので好ましくない。尚、合成した修飾蛋白質のｂの数は、合成した修飾蛋白質中の官能基を定量することにより決定することができる。例えば、この官能基がアミノ基の場合、反応前及び反応後の蛋白質中のアミノ基を定量し、修飾されたアミノ基の割合（修飾率）を求め、この修飾率からｂの数を決定することができる。
【００３０】
本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤は、前記一般式（２）中のＸが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの有機残基である式（２）で示されるホスホリルコリン基含有化合物と、加水分解酵素とを反応させて得られた修飾蛋白質を有効成分として含有する。この有効成分の有効濃度は、加水分解酵素の種類及び活性により異なるが、コンタクトレンズ用汚れ除去剤を液状とした際に、通常０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００３１】
本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤は、前記有効成分以外に通常コンタクトレンズ用の汚れ除去剤又は洗浄液の成分として使用されている成分を配合することもできる。具体的には、界面活性剤、等張化剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。界面活性剤としては、カチオン性、アニオン性、ノニオン性又は両性のいずれの界面活性剤も使用することができる。好ましくは、ポリエチレングリコールエステル、ポリエチレングリコールエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のノニオン性又は中性の界面活性剤が望ましい。等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩等が挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはそのアルカリ金属塩、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００３２】
本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤の形態は、液状の他に、粉末、錠剤等の乾燥状態であっても良い。このような乾燥状態の場合には、使用時に適当な媒体に溶解して使用することもできる。一方、液状の場合には、有効成分が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む重合体で化学的に修飾されている加水分解酵素であるため、長期間液状で保存しても酵素活性を高く維持することができ、このため汚れ除去能（洗浄能）はほとんど低下しない。
【００３３】
本発明の汚れ除去剤を用いてコンタクトレンズの汚れを除去するには、溶液状態の汚れ除去剤にコンタクトレンズを浸すか、あるいは溶液状態又は乾燥状態の汚れ除去剤を緩衝液、等張液またはコンタクトレンズ用保存液等で希釈した後、この希釈液にコンタクトレンズを浸し、１５〜１２０分間静置しておけば良い。この際、加熱しても良い。また擦り洗いしても良いが、多くの場合擦り洗いしなくても加水分解酵素の作用により効率的に汚れを分解除去することができる。汚れを除去した後は、適当なリンス液でコンタクトレンズをすすぐ等して装着することができる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の修飾蛋白質の製造法では、溶液状態で長期間保存しても蛋白質活性（酵素活性等）がほとんど低下しないホスホリルコリン基含有化合物で化学修飾された蛋白質を得ることができる。また本発明のコンタクトレンズ用汚れ除去剤は、前記製造法により得られた特定の修飾酵素を有効成分として含有するので、長期間液状で保存しても酵素活性を高く維持することができ、このため汚れ除去能（洗浄能）をほとんど低下させないで保存することができる。
【００３５】
【実施例】
以下、参考例、実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
参考例１−１
末端にカルボン酸を有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体（ポリマーａ）の調製
エタノールを溶媒として、０．４５ｍｏｌ／リットルの２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン溶液を調製し、この溶液に連鎖移動剤として３−メルカプロプロピオン酸を０．０９ｍｏｌ／リットルとなる量、ラジカル重合開始剤としてアゾビスイソブチルニトリルを９×１０~4ｍｏｌ／リットルとなる量混合した。得られた溶液を封管法により、凍結脱気、真空封管後、６０℃、６時間重合させた。反応終了後、エーテル中に滴下し沈澱を収集した後、洗浄し減圧乾燥して数平均分子量２００００の末端にカルボン酸を有するポリマーａを調製した。
【００３７】
参考例１−２
末端にカルボン酸を有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレート共重合体（ポリマーｂ）の調製
エタノールを溶媒として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン濃度が０．４０ｍｏｌ／リットル及びｎ−ブチルメタクリレート濃度が０．０５ｍｏｌ／リットルとなる溶液を調製し、この溶液に連鎖移動剤として３−メルカプロプロピオン酸を０．０９ｍｏｌ／リットルとなる量、ラジカル重合開始剤としてアゾビスイソブチルニトリルを９×１０~4ｍｏｌ／リットルとなる量混合し、得られた溶液を参考例１−１と同様に反応させて数平均分子量５５０００のポリマーｂを調製した。
【００３８】
実施例１−１
参考例１−１で調製したポリマーａ ５８０ｍｇ及び商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、分子量約２７０００）５４．８ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ）を、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）６．５ｍｌに溶解させ氷冷させた。続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１５３．４ｍｌを添加して１時間撹拌した。再び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１５３．４ｍｇ（０．８０ｍｍｏｌ）を添加して１時間撹拌した後、室温にて更に１時間撹拌した。反応終了後、反応液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対しての透析を透析膜（spectrum Medical Industries Inc.,商品名「Spectrum/por,membranes MW CO. 6000〜8000)によって行ない、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを除去した。得られた化合物は、下記式（４）で示される修飾ビオプラーゼであった。
Ｅ−(ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ3)Ｓ−Ｐ1)n ・・・（４）
（式中、Ｅは商品名「ビオプラーゼ」の残基を示し、Ｐ1はポリマーａの末端残基を示す。またｎは４．７である）。
商品名「ビオプラーゼ」中の遊離アミノ基がポリマーａのカルボキシル基とアミド結合した割合（修飾率（％））を、グリシン溶液を標準液、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」の修飾率を０％として、遊離アミノ基の定量法（Analytical Biochemistry 14,328-336(1966))に準拠して測定した。その結果、修飾率は５２．８％、ｎは４．７であった。
【００３９】
実施例１−２
実施例１−１で用いた参考例１−１で調製したポリマーａの代わりに、参考例１−２で調製したポリマーｂを用いた以外は、実施例１−１と同様に行ない下記式（５）で表される修飾ビオプラーゼを得た。
Ｅ−(ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ3)Ｓ−Ｐ2)n ・・・（５）
（Ｅは商品名「ビオプラーゼ」の残基を示し、Ｐ2はポリマーｂの末端残基を示す。またｎは４．５である）。
実施例１−１と同様に商品名「ビオプラーゼ」中の遊離アミノ基がポリマーｂのカルボキシル基とアミド結合した割合（修飾率（％））を、グリシン溶液を標準液、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」の修飾率を０％として実施例１−１と同様に修飾率を測定した。その結果修飾率は４９．５％、ｎは４．５であった。
【００４０】
比較例１−１
モノメトキシポリエチレングリコール(CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2COOH)（数平均分子量３０００）３．００ｇ（１．０ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン５０．０ｍｌに溶解させた。次いで、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１３８．１２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド２４７．６０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で６時間反応させた。反応終了後、反応液をヘキサン５００ｍｌに滴下してポリオキシアルキレン誘導体を沈澱させた。沈澱物を濾過し、充分にヘキサンで洗浄させた後、減圧乾燥して白色粉末のポリオキシアルキレン誘導体（以下ポリマーｃと称す）２．６７ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）を得た。
【００４１】
商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、分子量約２７０００）５４．８ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）６．５ｍｌに溶解させ氷冷させた。続いて前記ポリマーｃ６０．８９ｍｇを添加して１時間撹拌した後、室温にて更に１時間撹拌した。反応終了後、反応液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対しての透析を実施例１と同様に行ない、下記式（６）で表される修飾ビオプラーゼを得た。
Ｅ−(ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＯＣＨ3)n ・・・（６）
（式中、Ｅは商品名「ビオプラーゼ」の残基を示す。ｎは５．５である）。
商品名「ビオプラーゼ」中の遊離アミノ基がポリマーｃのスクシンイミド基とアミド結合した割合（修飾率（％））を、グリシン溶液を標準液、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」の修飾率を０％として、実施例１−１と同様に修飾率を求めた。その結果修飾率は５２．８％であり、ｎは４．７であった。
【００４２】
実施例２−１
実施例１−１で調製した修飾酵素を生理食塩水に０．４重量％の濃度になるように溶解し、コンタクトレンズ用汚れ除去液を調製した。この汚れ除去液に蛋白質を付着させたコンタクトレンズを浸漬し、静置させた状態で洗浄した。洗浄効果は２時間後に目視にて行ない、付着蛋白質がほとんど除かれている場合を良好、それ以外を不良として判定した。結果を表１に示す。尚、蛋白質を付着させたコンタクトレンズは次のように調製した。即ち、人工涙液（アルブミン０．６ｇ、グロブリン０．３ｇ、リゾチーム０．２ｇ、ムチン０．１ｇを生理食塩水に溶解させ１００ｍｌとしたもの）にコンタクトレンズ（セイコーコンタクトレンズ社製、商品名「スーパーＥＸ１」）を浸し、６５℃に加熱して蛋白質を付着させた。
【００４３】
また、この汚れ除去液の蛋白質分解酵素の酵素活性を、汚れ除去液調製直後及び１４週間後（４０℃で保存）に、カゼイン−フォリン法により測定した。結果を表１に示す。
【００４４】
実施例２−２
実施例１−１で調製した修飾酵素の代わりに、実施例１−２で調製した修飾酵素を用いた以外は、実施例２−１と同様に汚れ除去液を調製し各測定を行なった。結果を表１に示す。
【００４５】
比較例２−１
実施例１−１で調製した修飾酵素の代わりに、未修飾の商品名「ビオプラーゼ」（ナガセ生化学工業（株）製、分子量約２７０００）を用いた以外は、実施例２−１と同様に汚れ除去液を調製し各測定を行なった。結果を表１に示す。
【００４６】
比較例２−２
実施例１−１で調製した修飾酵素の代わりに、比較例１−１で調製した修飾酵素を用いた以外は、実施例２−１と同様に汚れ除去液を調製し各測定を行なった。結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
表１の結果から、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む重合体を化学的に酵素に結合させた修飾酵素は、洗浄効果が良好であり、しかも水溶液状態で長期間保存しても酵素活性はほとんど低下せず、高く維持されていることが判る。
Claims (4)
- 一般式（１）
Ｐｒｏ−(Ｒ−(Ｘ1)a−Ｘ)b・・・（１）
(式中、Ｐｒｏは蛋白質の残基、Ｒは蛋白質中の官能基と結合可能な官能基から誘導される２価の有機残基を示し、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基、Ｘは式 ( ３ ) で示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基を示す( 但し、式 ( ３ ) 中、Ｘ 2 及びＸ 3 は、同一又は異なる基であって、水素原子又はメチル基を示す。またｎ 2 は１〜１０００の整数を示す )。ａは０又は１であり、ｂは１〜１００の正数を示す。)で表される修飾蛋白質を製造するにあたり、
Ｒ1−(Ｘ1)a−Ｘ・・・（２）
(式中、Ｒ1は蛋白質中の官能基と結合可能な官能基を示し、Ｘ1はホスホリルコリン基を含まない２価の有機残基、Ｘは上記式(３)で示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基を示す。ａは０又は１を示す。)で表されるホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質とを反応させることを特徴とする修飾蛋白質の製造法。 - 前記一般式(２)中のＸで示されるホスホリルコリン基を含む化合物の有機残基が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの有機残基であることを特徴とする請求項１記載の修飾蛋白質の製造法。
- 蛋白質が加水分解酵素であることを特徴とする請求項２記載の修飾蛋白質の製造法。
- 請求項３記載の製造法により得られた修飾蛋白質を有効成分として含有することを特徴とするコンタクトレンズ用汚れ除去剤。
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