JP3701354B2 - ラテックスまたは無機酸化物のグリコシル化粒子、その粒子の製造法、およびその生物学的検出またはアフィニティクロマトグラフィ用薬剤としての使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の背景
本発明は、ラテックスまたは無機酸化物の新規なグリコシル化粒子、そのような粒子の製造法、および診断または生物学的（免疫学的、酵素等の）分析用の薬剤としての、および分子生物学またはアフィニティクロマトグラフィにおけるグリコシル化粒子の応用に関する。
【０００２】
本発明は、前記グリコシル化粒子の製造に特に有用な、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシル化合物にも関する。
【０００３】
【従来の技術】
ラテックス粒子または微小球（ミクロスフェア）は、医療診断の材料およびクロマトグラフィにおけるシリカ微小球として以前から用いられてきている。例えば、ラテックス粒子は凝集試験に用いられており、抗体または抗原の存在または非存在を検出するのに用いられている。実際には、抗体または抗原はラテックス粒子の表面に結合し、従って血清、頭脊柱液（ＣＲＬ）、尿または組織抽出物製剤などの体液中に存在する対応する（１種類以上の）抗原または抗体（１種類以上の抗体）と反応することができる。この検出法は、当業者には周知である。これらのポリマー粒子は、スチレンまたは他のビニルモノマーの乳化重合などの通常の方法で得ることができる。
【０００４】
しかしながら、それらが凝集試験などの医療診断に用いられるときには、これらの粒子は疎水性が強すぎるので、活性や感受性を失うことなく抗体や抗原と結合することはできない。従って、ポリマーと水との界面で疎水性と親水性との平衡を一層効率的に制御する手段が、模索されてきた。
【０００５】
この平衡を改質する目的で、これらの粒子の表面と、反応性基を有するまたは持たない極性官能基とを結合させることが既に提案されている。
【０００６】
特に有利な手法は、これらのラテックス粒子を炭水化物残基で官能化することであるが、その理由はこれらの基が生物学的適合性を有しかつそれらが糖タンパク質または糖脂質が関与する生物学的認識機構において有利であるためである。
【０００７】
これに基づいて、M.T. Charreyreらは、Colloid & Polym. Sci., 271: 668 - 679 (1993)において、ヘキシルメタクリレート基で終わるオリゴサッカライド、すなわち６−（２−メチルプロペノイルオキシ）ヘキシル＝β−Ｄ−セロビオシド（ＣＨＭＡ）の存在下で種から共（重合）法によってジサッカライド単位で被覆したポリスチレンラテックスを製造することを提案した。しかしながら、この化合物は、酸性ｐＨ（４未満）では化学的に安定ではないので、サッカライド基の加水分解反応によって分解して、ラテックス血清中に遊離のグリコシド化合物を形成し、これが細菌の繁殖を促進するという問題点を示す。
【０００８】
また、M.C. Davies ら（Langmuir, 1993, 9, 1637 - 1645）は、スチレンの存在下で、１−［［２−［［（Ｎ−アクリルアミドメチル）アミノ］カルボニル］エチル］チオ］−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであるアクリルアミドチオガラクトースを共重合させることも提案したが、この合成は特に慎重な扱いを必要とし（修飾ガラクトースの−ＯＨ官能基のブロッキングの段階）、またｐＨが９を上回る場合の安定性は一定しないのである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
発明の要約
本発明の目的の一つは、加水分解に対する感受性が極めて少ないポリマーまたは無機酸化物の新規なグリコシル化した粒子を提案することである。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、界面特性を示すラテックスまたはシリカ粒子、更に詳細には、タンパク質との相互作用において、当該技術分野で、特に二つの前記文献に従って既に得られているものに対して改良および／または改質されたものを提案することである。
【００１１】
また、本発明の目的は、ラテックスまたは無機酸化物、特にシリカであってグリコシル残基で官能化されているものの粒子の新規な製造法を提案することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、第一に、ラテックスまたは無機酸化物のグリコシル化粒子であって、グリコシル残基が末端に結合している少なくとも１本の鎖が前記粒子の表面に結合しているグリコシル化粒子に関する。
【００１３】
「結合している」という用語は、この粒子が微小球にグラフトするかまたは種から出発する過剰重合によって得ることができることを意味する。本発明による粒子は、グラフト化によって得るのが好ましい。
【００１４】
鎖／グリコシル残基単位は、「グリコシル化鎖」とも呼ばれる。
【００１５】
ラテックス微小球は、伝統的には、エチレン性不飽和モノマーの重合によって得られるポリマーからなり、無機酸化物、特にシリカの粒子は既知の方法で得られる。これらの粒子は、表面をアミン、チオールまたはフェノール官能基で、またはアミン、チオールまたはフェノール、およびシリカ粒子の場合にはシラノールの前駆体である官能基で官能化した後、転換する。
【００１６】
ラテックス微小球の場合には、これらは、ビニル芳香族またはエチレン性モノマー、場合によってはアルカンまたはエチレン性酸またはエステルから誘導される単位を含むホモポリマーまたはコポリマーであり、これらのモノマーの一部は塩素を含む基で官能化されている。塩素を含む基は、次にアミン官能基にまたはアミン基で転換するか、またはチオール官能基に転換できる。
【００１７】
それらは、ビニル芳香族モノマーから誘導される単位を含むホモポリマーまたはコポリマーであり、ヒドロキシル化され（フェノール官能基）またはチオール基で修飾される（チオフェノール官能基）。
【００１８】
この種類のポリマーは、当業者には容易に得ることができ、以下ではそれらが由来する若干のモノマーを挙げるだけで十分であろうし、何ら制限を伴うものではない。これらは、
イソプレン、１，３−ブタジエン、塩化ビニリデン、またはアクリロニトリル型のエチレン性モノマー、
スチレン、ヒドロキシスチレン、ブロモスチレン、α−メチルスチレン、エチルスチレン、ビニルトルエン、クロロスチレンまたはクロロメチルスチレン、またはビニルナフタレン、４−ヒドロキシスチレン、または４−メルカプトスチレンなどのビニル芳香族モノマー、
アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸アルキルであってアルキル基が１〜１０個の炭素原子を有するもの、アクリル酸ヒドロキシアルキル、アクリルアミド、４または５個の炭素原子を有するエチレン性酸のエステル、並びに
ジビニルベンゼンまたは２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート、および／または他の水に不溶性の共重合性モノマー、
であることができる。
【００１９】
ラテックス粒子が表面にアミン、フェノールまたはチオール基を含むときには、モノマーの一部だけがアミン基またはクロロメチル基のようなアミン基に転換できる基を有し、または用いられるモノマーの総量に対して１〜２５重量％の割合でチオールまたはフェノール基を有する。
【００２０】
これらのモノマーは、混合物として、または多段階工程において遂時的に用いられる。
【００２１】
ポリマー粒子は、通常のエマルジョン、マイクロエマルジョン、懸濁またはマイクロ懸濁重合のような任意の重合技術を用いることによって、または適当な場合には、有機媒質中での重合によって得ることができる。これらの技術は、当業者にはよく知られているものであり、ここでは再掲しない。
【００２２】
シリカ粒子は、既知の方法で官能化される。
【００２３】
本発明による粒子は、疎水性またはシリカのように親水性であり、粒度が一般的には０．０１〜２０ミクロン、好ましくは５ミクロン未満のものが好ましい。これらは、較正されており、単分散性であり、ラテックスの総重量の０．０５〜３０重量％、好ましくは０．１〜１０％の量の割合でラテックスに含まれる。
【００２４】
微小球平方メートル当たりの官能基の表面密度は、通常は約１〜約５０マイクロ当量であり、好ましくは３０マイクロ当量の領域にある。
【００２５】
本発明の粒子は、グリコシル基が結合している０．４〜５０本の鎖（単位面積ｎｍ２当たり）を含有している。
【００２６】
ラテックス粒子は磁化性にすることができ、この場合には、それらは、例えば米国特許第４，３３９，３３７号明細書、米国特許第４，３５８，３８８号明細書および米国特許第４，９４８，７３９号明細書に記載されている磁化性材料と組み合わせて用いられる。
【００２７】
微小球の磁化性部分を構成する材料としては、マグネタイト（磁鉄鉱）、ヘマタイト、二酸化クロム、混合イットリウム鉄酸化物、マンガン、ニッケルおよびマンガン−亜鉛フェライトなどのフェライト、およびコバルト、ニッケル、ガドリニウムおよびサマリウム−コバルト合金が挙げられる。好ましい材料は、通常はマグネタイトおよびヘマタイトである。
【００２８】
微小球に含まれる磁化性材料の量は、磁化性の複合微小球の約０．５〜７０％、好ましくは約１５〜６０重量％に相当する。
【００２９】
「スペーサーアーム」として働くことができる鎖が含まれているため、微小球によって表わされる固相の接近による立体障害およびタンパク質の変性の可能性はなくなる。
【００３０】
この鎖の平均長さは、５〜１２０オングストロームであり、５〜５０オングストロームが有利であり、１０オングストローム程度が更に有利である。
【００３１】
鎖は、好ましくは４〜８０個の炭素原子を有し、３〜２０個の炭素原子を有するのが有利である。
【００３２】
これは、場合によって窒素、酸素、硫黄またはリン原子から選択される１個以上のヘテロ原子を主鎖中に含む、場合によって置換された二価の炭化水素基であるのが普通であり、炭素原子の１個以上がカルボニル基または誘導体（イミン、オキシムなど）に属し、または１個以上の環または複素環を含むことができる。
【００３３】
二価の基の置換基は、微小球の官能基へのグラフト化が困難になるかまたは不可能になるような立体障害をまったく生じることがないものである。従って、それらは、メチル、アミノまたはＯＨ基などの障害のほとんどない置換基である。
【００３４】
同様に、鎖自身の一部を形成するこれらの置換基またはヘテロ原子は、この鎖のグリコシド残基と官能基との間の反応を干渉しないものでなければならない。
【００３５】
一般に、ラテックスまたは無機酸化物の各微小球上のグリコシル鎖の数は、診断試験の適用を可能にするのに十分なものでなければならない。
【００３６】
好ましい態様の説明
本発明による粒子は、好ましくは表面にアミン、チオールまたはフェノール官能基、またはシリカ粒子の場合にはシラノール官能基を含み、その少なくとも一部が前記鎖の構造の一部を形成し、後者が下記の式Ｉに相当するものである。
【００３７】
【化７】
（式中、
Ａは、前記鎖の残りの部分であり、
Ｂは、Ｎ−Ｒ１基、または酸素原子、または硫黄原子からなる群から選択され、
Ｄは、二価の−（ＣＨ２）ｎ−またはフェニレン基、特に１，３−フェニレンまたは１，４−フェニレンであり、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基または水素原子であり、
Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル基または水素原子を表わし、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｇｌｙｃは、グリコシル残基であり、
下記の記号で表わされるものは、球の表面を記号で表わしたものである。）
【００３８】
【化８】
好ましくは、粒子がシリカ粒子であるときには、
Ｄは（ＣＨ２）ｎであって、ｎ＝０であり、
Ｂは０である。
【００３９】
粒子がアミン基を含有するラテックス粒子であるときには、
Ｄは（ＣＨ２）ｎであって、ｎ＝１〜１０であり、
ＢはＮ−Ｒ１である。
【００４０】
粒子がフェノールまたはチオール基を含むラテックス粒子であるときには、Ｄはフェニレン基であり、ＢはＯまたはＳである。
【００４１】
本発明による粒子は、好ましくは、表面にアミン官能基を含み、その少なくとも一部が前記鎖の構造の一部を形成し、後者が下記の式IIに相当するものである。
【００４２】
【化９】
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＡは、式Ｉにおけるものと同じ意味を表わし、
ｎは１〜１０の整数であり、
ｇｌｙｃはグリコシル残基である。）
Ｒ２は、水素原子、またはＣ１〜Ｃ14アルキルまたはＣ７〜Ｃ14アラルキル基であり、前記基は、場合によって１個以上の末端または側基のカルボキシレートまたはスルホネート基によって置換される。
【００４３】
実際には、グリコシル化した鎖の数は、微小球上に存在するアミン、チオール、フェノールおよびシラノール官能基の量より多少高い割合である。
【００４４】
この割合は、微小球の表面に存在するアミン、チオール、フェノールおよびシラノール官能基の１０〜９９％の間で有利に変化し、この割合は、好ましくは４０％を上回り、更に好ましくは８０％を上回る。
【００４５】
本発明の有利な態様によれば、グリコシル化したラテックス微小球は、エチレン性不飽和モノマーの重合によって得られるポリマーからなり、表面にアミン、チオールおよびフェノール官能基を表わし、ここでグリコシル残基が官能基の一部に結合しており、且つ前記鎖が下記の式III に相当することを特徴とする。
【００４６】
【化１０】
（式中、Ｄ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびｇｌｙｃは、前記と同じ意味を表わす。）
この「結合し」という用語は、グリコシル残基が、二価のセグメントを介して基Ｂに結合していることを意味する
【００４７】
もう一つの好ましい別の形態によれば、本発明は、アミン、チオール、フェノールおよびシラノール官能基で表面が改質された無機酸化物の粒子であって、官能基の部分がグリコシル残基に結合し、かつ前記鎖が下記の式IVに相当することを特徴とする、粒子に関する。
【００４８】
【化１１】
（式中、Ｄ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｎおよびｇｌｙｃは、前記と同じ意味を表わす。）
シリカ粒子は、シラノール基で改質されているのが好ましい。
【００４９】
本発明による無機粒子は、シリカ粒子であるのが好ましい。
【００５０】
無機粒子の表面に存在するアミン官能基は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ基であってｎが１〜１０でありＲが低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であるのが好ましい。
【００５１】
下記の糖残基を、本発明に関して好適なグリコシル残基の中から例示として挙げることができる。
【００５２】
グルコース、ガラクトース、ガラクトピラノース、グリコフラノース、フルクトース、フルクトピラノース、ラクトース。
【００５３】
グリコシル残基は、グルコース残基であるのが好ましい。
【００５４】
グリコシル化した鎖が式III に相当するグリコシル化ラテックス微小球の態様によれば、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルモノマーおよびアクリル酸型のエチレン性不飽和モノマーは、下記の条件を有するポリスチレン種上で過剰重合する。
【００５５】
アクリルアミドという表現は、メタクリルアミド誘導体も包含する、
「アクリル酸型のモノマー」という表現は、アクリル酸およびメタクリル酸、アルキルアクリレートおよびメタクリレートであってアルキル基が３〜１０個の炭素原子を有するもの、ヒドロキシアルキルアクリレート、アクリルアミド、および４または５個の炭素原子を有するエチレン性酸のエステルなどのアルケン酸、エステルまたは無水物を意味することを目的とする、
種の直径がミクロン以下であり、一般に０．０２〜０．９マイクロメートルであり、水中での粒子質量画分（「固形物含量」）は０．１〜２０％である、
種粒子の表面は、合成中に導入されるスルフェート乳化剤から本質的に生じるスルフェート基で官能化されている（モノマーに対して１．４％程度）、
導入される、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルモノマーの含量は、種の総重量に対して１〜２５重量％、好ましくは５〜１５重量％である。アクリル酸型のモノマーの含量は、５〜３０％であり、有利には１５〜２５％であり、百分率は種の乾燥重量に対する値である、
アクリル酸またはメタクリル酸型のモノマーは、アクリル酸またはメタクリル酸のエステルであるのが好ましい。
【００５６】
重合は、既知の方法で、例えば開始剤として過硫酸カリウムの存在下で、６０〜７０℃程度の適温で行なわれる。
【００５７】
（メタクリル酸メチルの代わりに）スチレンの存在下で、ポリスチレンを用いる過剰重合では、粒子表面へＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルモノマーを結合することができなかったことが認められた。
【００５８】
本発明の粒子のもう一つの態様は、式Ｉのグリコシル化した二価の鎖またはタイプIIのもう一つの二価の鎖で改質されるかどうかに拘らず、第一または第二アミン基で表面が未改質であるかまたは官能化されているラテックスまたはシリカ粒子上に、ミカエル型の求核付加反応を用いてω−グリコシル化したα−アクリル酸鎖をグラフトすることにある。
【００５９】
一般的には、第一または第二アミン官能基は、短い（Ｃ１〜Ｃ５）アルキレン鎖、好ましくはラテックスの場合にはメチレンおよびシリカの場合にはブチレンによってラテックスまたはシリカ粒子に連結される。
【００６０】
グラフト度は、上清についてのＵＶ分光光度法によって、抽出したポリマー／モノマー混合物の薄層クロマトグラフィによって、またはLee, Anal. Biochem., 95, 260 (1979) に記載の「フェノール−硫酸」混合物を用いる特異的試験によって測定される。
【００６１】
モノマーとアミン基との反応は、８〜１２の間の塩基性ｐＨで、好ましくは９程度で行なわれる。
【００６２】
一般に、アミン官能基の量は、生物学的、診断またはアフィニティクロマトグラフィの分野で用いられる粒子を生じるグラフトを得ることができるようにするのに十分でなければならない。
【００６３】
ラテックスの場合には、制限を全く含むことなく、アミン官能基の量はポリマー１ｇ当たり５０〜５００マイクロ当量であるということができる。この反応は総ての場合に特に好適であることが認められているが、グリコシル化した二価の鎖が式III の鎖に相当する場合には特に好適である。
【００６４】
反応は、環境温度または６０℃で不活性雰囲気、例えば窒素中で攪拌しながら行なう。続いて、水相でＵＶ分光光度法、およびＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルおよび抽出したポリマー上で薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行なうことができる。
【００６５】
粒子の界面特性、更に詳細にはそれらのタンパク質との相互作用は、それらの表面でのグリコシル残基の導入の程度および方法（メタクリル酸メチルあるいは同等物などの存在下での、場合によってＮ−アルキルのアクリルアミドグリコシルモノマーの過剰重合、またはアミン官能基の表面反応）によって変化する。表面鎖の配座およびグリコシル残基の位置は、２種類の官能化法の場合には同一ではないので、異なる三次元構造の微小球を生じる。
【００６６】
本発明のもう一つの課題は、式Ｖを有する、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルである。
【００６７】
【化１２】
（式中、
Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基または水素原子であり、
Ｒ２は、場合によって置換したＣ１〜Ｃ14アルキル、またはＣ７〜Ｃ14アラルキル基、または水素原子であり、
ｇｌｙｃは、グリコシル化した粒子の調製に特に有用な糖残基である。）
これらの化合物の調製は、簡単な方法で行なわれ、ヒドロキシル官能基のブロッキングの段階は全く必要としない。
【００６８】
この合成は、グリコシル化した化合物から出発して、アルキルアミンを作用させた後、アルキルグリコシルアミンを水性媒質中で、例えば下記の反応式によってアクリロイル化による２段階で行なわれる。
【００６９】
【化１３】
この方法は、モノマーを約７５％以上の収率で単離することができる。この様にして得られる粗生成物の純度は、約９０％である。含まれる不純物は、グリコシド部位の様々な位置においてジアクリロイル化した化合物であり、これは共重合におけるモノマーの使用または表面反応の適用のための限定因子を構成しない。この化合物は、シリカゲルのカラム上でクロマトグラフィによって精製することができる。アミン、チオールまたはフェノール官能基を含む、表面が官能化したラテックス微小球の調製は、下記の方法を用いることによって行なうことができる。
【００７０】
エマルジョンまたはマイクロエマルジョン中でのスチレン−クロロメチルスチレン共重合（ＶＢＣ）、
塩基性の緩衝媒質（ｐＨ＝８．５）中で過剰のアルキルアミンまたはアラルキルアミンと表面におけるクロロメチル基との反応の後、透析による過剰アミンの除去。
【００７１】
下記の反応図式によれば、
【００７２】
【化１４】
このような反応の収率は、一般に５０％を上回る。これらのアミノ化した微小球上での、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルのグラフトは、８〜１３の弱塩基性に緩衝のｐＨの微小球懸濁液にこの化合物を徐々に加えることによって行なう。一つの態様によれば、反応物は不足量で導入し、反応の進行は溶液中の反応物の消失によって簡単に測定され、測定は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）および高性能液体クロマトグラフィなどによって行なわれる。反応は、下記のように図解的に表わすことができる。
【００７３】
【化１５】
アミン官能基を含む、表面が官能化されたシリカ粒子の調製は、下記の方法を用いることによって行なうことができる：
過剰量のアミノアルコールまたはアミノアラルコールと、水−アルコール性溶媒中での表面シラノール基との反応。
【００７４】
アミノアルコールは、４−アミノ−１−ブタノールが好ましい。
【００７５】
このような反応の収率は、普通は５０％を上回る。これらのアミノ化した微小球上での、場合によってＮ−アルキルであるアクリルアミドグリコシルのグラフト化は、８〜１３の弱塩基性に緩衝のｐＨの微小球の水性懸濁液にこの化合物を徐々に加えることによって行なう。一つの態様によれば、反応物は不足量で導入し、反応の進行は溶液中の反応物の消失によって簡単に測定され、測定は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）および高性能液体クロマトグラフィなどによって行なわれる。反応は、下記のように図解的に表わすことができる。
【００７６】
【化１６】
表面がシラノール官能基で官能化されたシリカ微小球の調製は、既知のやり方のミカエル付加を用いて−ＯＨ官能基を表面上にグラフトすることによって行なうことができる。
【００７７】
最後に、本発明のもう一つの課題は、上記のグリコシル化した粒子の、診断または検出剤としての、またはアフィニティクロマトグラフィにおける固定相としての使用である。
【００７８】
これらの粒子は、多種多様な生物学的分野で用いることができる。例えば、生物医学的診断薬、特にＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ型の試験では、Ｆｃフラグメントが炭水化物残基を含む粒子の場合には、グリコシル化した基が粒子の表面に固定化された抗体との生物学的適合性に寄与する。
【００７９】
下記の例により、本発明を更に説明する。
例１
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミドの調製
ａ） Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの合成
グルコース５４ｇ（０．３モル）を、オクチルアミン４０ｇ（０．３モル）を無水メタノール５０ｍｌに溶解した液に加える。反応混合物を６５℃に２０分間加熱した後、９５％熱エタノール５０ｍｌを加える。冷却により沈澱するＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン（２時間後に完全に沈澱）をブフナー上で濾別した後、無水エタノール（１．５リットル）から再結晶を行なう。
得られた量：７７．７ｇ、 収率：８９％。
融点（℃）＝１０３〜１０７。
【００８０】
ｂ） 水／ＴＨＦ混合物中でのＮ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド（ＡＣ８）の合成
炭酸ナトリウム３３．６ｇを最少量の水に溶解したものを、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン２５ｇを水４００ｍｌおよびＴＨＦ４００ｍｌに溶解したものに加える。０℃に冷却した反応混合物に、塩化アクリロイル３６ｍｌを２時間間隔で２回に分けて加える。次に、反応混合物を３０℃まで４時間加熱する。ＴＨＦを減圧留去した後、水相を酢酸エチル３×３００ｍｌで抽出する。合わせた有機相を、次に重炭酸ナトリウムの水溶液２×１００ｍｌで洗浄した後、水で洗浄する。硫酸マグネシウム上で乾燥し、酢酸エチルを留去した後、粗製化合物２５．２ｇが単離される。
収率：８５％。
ＩＲ（ヌジョール、νｃｍ-1）：３５００〜３２００（Ｈ−Ｏ）；１６５０（アミドＩ）；１６１０（Ｃ＝Ｃ）。
【００８１】
例２
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」ＡＣ８の合成
ａ） Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの合成
【００８２】
【化１７】
グルコース６０ミリモル（１０．８ｇ）を、オクチルアミン６０ミリモル（７．７ｇ）をメタノール１０ｍｌに溶解した液に加える。反応混合物を６０〜６５℃に１５分間加熱する。９５％エタノール１０ｍｌを加えると、粗製のＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンが沈澱する。これを濾別して、無水エタノールから３回再結晶を行なう。
得られた量：１２．８ｇ、 収率：７５％。
融点（℃）＝１０４〜１０６。
【００８３】
ｂ） メタノール中でのＮ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」ＡＣ８の合成
【００８４】
【化１８】
炭酸ナトリウム６２．５ミリモル（６．６３ｇ）を、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン２４ミリモル（７ｇ）を３０℃でメタノール１００ｍｌに加えたものに加え、塩化アクリロイル４８ミリモル（３．９ｍｌ）を不均一混合物に、０℃で５分間かけて加える。反応混合物を、環境温度で２５分間攪拌する。水１００ｍｌを加え、メタノールを留去した後、アクリルアミド糖を酢酸エチル３００ｍｌで抽出する。有機相をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥して、減圧留去する。
得られる量：８．０ｇ、 収率：９５％。
非晶質固形物。
【００８５】
例３
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−テトラデシルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」ＡＣ１４の合成
ａ） Ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの合成
【００８６】
【化１９】
テトラデシルアミン５０ミリモル（１０．６５ｇ）をエタノール２５ｍｌに溶解したものとグルコース２５ミリモル（４．５ｇ）を水１７．５ｍｌに溶解した液との混合物を、環境温度で２日間放置する。結晶化する生成物を濾別し、無水エタノールから３回再結晶を行なう。
得られる量：５．２５ｇ、 収率：５６％。
融点（℃）＝１０９℃。
【００８７】
ｂ） ＴＨＦ中でのＮ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−テトラデシルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」の合成
炭酸ナトリウム８５ミリモル（９ｇ）を水２５ｍｌに溶解した液を、Ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン１３．７ミリモル（４ｇ）をＴＨＦ１９０ｍｌに溶解した液に加える。塩化アクリロイル２６ミリモル（２．０ｍｌ）をＴＨＦ２０ｍｌに溶解した液を、１時間かけて滴加する。ＴＨＦを留去した後、アクリルアミド糖を酢酸エチル３００ｍｌで抽出する。有機相をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧留去する。
得られた量：３．９９ｇ、 収率：８９％。
非晶質固形物。
融点（℃）（分解）＝１１０℃。
【００８８】
例４
アミノ化した微小（ナノ）粒子の調製
初期マイクロエマルジョンの組成：水（７５％）、ＳＤＳ（８．３％）、１−ペンタノール（９．２％）、スチレン（６％）、ＶＢＣ（１．５％）。
【００８９】
重合：過硫酸アンモニウム−テトラメチルジアミノメタン開始剤、２５℃、２時間。ＰＣＳを用いる懸濁液の検討により、粒度２５±３ｎｍ（ごく僅かの多分散）となる。凝集ポリマーの元素分析では、８０％スチレン−２０％ＶＢＣの組成物と一致する：％Ｃ８５．２４（実測値）、８７．９９（計算値）；％Ｈ７．５１（実測値）、７．３８（計算値）；％Ｃｌ ４．３４（実測値）、４．６５（計算値）。
【００９０】
表面置換：エチルアミン１ｍｌ（最初に導入されたＶＢＣに対して４．６７当量）を、スチレン−ＶＢＣコポリマーのナノ粒子５０ｇをＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝８．５）２８０ｍｌで希釈した懸濁液に加える。懸濁液を４８時間強く攪拌した後、１時間透析し、過剰のエチルアミンを除去する（ｐＨチェック、透析時間約１時間）。凝集したポリマーのＮ／Ｃｌ元素分析により、置換度を約５０％と決定することができる。
【００９１】
例５
水性懸濁液中でのナノ粒子へのグルコシド基のグラフト化
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド（ＡＣ８）を、ｐＨを８．５に緩衝したナノ粒子の懸濁液に徐々に加える。反応の進行は、溶液中の反応物の消失によって簡単に測定される：ＴＬＣ、ＨＰＬＣ。存在しているアミノメチル基に対して表わしたグラフト化度は７６％である。
官能化
１ 表面ＮＨ ２ 官能基を含むＥｓｔａｐｏｒ R ラテックス粒子の官能化
【００９２】
例６（ＣＥ３ａ）
環境温度で糖ＡＣ８から誘導される過剰のモノマー
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス１０ｍｌに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の３５０ｍｇ（１０-3モル、５．５当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して６８時間緩やかに攪拌する（マグネティックスターラー攪拌）。得られた安定な懸濁液を透析して、過剰のアクリルアミド糖ＡＣ８を除去する。
【００９３】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおける糖のグラフト化の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【００９４】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が存在していることを示している。
元素分析：６８．３３％Ｃ、６．４％Ｈ、０．８５％Ｎ。
【００９５】
例７（ＣＥ３ｆ）
加熱による過剰のＡＣ８モノマー
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス１０ｍｌに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８ ３５０ｍｇ（１０-3モル、５．５当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して３．３０時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５０℃に加熱する。得られた安定な懸濁液を透析して、過剰のアクリルアミド糖ＡＣ８を除去する。
【００９６】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおける糖のグラフト化の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【００９７】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：６９．１５％Ｃ、７．６４％Ｈ、１．４％Ｎ。
【００９８】
例８（ＣＥ６ａ）
環境温度におけるＡＣ８モノマーの化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス１０ｍｌに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の５２ｍｇ（１．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して５４時間緩やかに攪拌する（マグネティックスターラー攪拌）。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【００９９】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１００】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：８９．２８％Ｃ、７．５６％Ｈ、０．３５％Ｎ。
【０１０１】
例９（ＣＥ６ｊ）
加熱によるＡＣ８モノマーの化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス３０ｇに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）１５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）１５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム３００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の１５６ｍｇ（４．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して３時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１０２】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１０３】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：８１．２６％Ｃ、７．２５％Ｈ、０．３６％Ｎ。
【０１０４】
例１０（ＣＥ６１）
加熱により糖ＡＣ１４から誘導されるモノマーの化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス３０ｇに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）１５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）１５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム３００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ１４の１９３ｍｇ（４．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して５時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ１４（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１０５】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１０６】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ１４モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：８０．１３％Ｃ、７．２６％Ｈ、０．６１％Ｎ。
【０１０７】
例１１（ＣＥ６ｍ）
添加した塩基なしでの加熱によるモノマーＡＣ８の化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス３０ｇに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）１５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）１５０ｍｇおよびアクリルアミド糖ＡＣ８の１５６ｍｇ（４．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して５時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１０８】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１０９】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：９０％Ｃ、７．５６％Ｈ、０．５％Ｎ。
【０１１０】
２ 改質シリカ−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨ ２ の粒子の官能化
出発シリカの元素分析：
％Ｃ＝３．０２、％Ｎ＝１．０３、％Ｓｉ＝４１．７５％。
【０１１１】
例１２（ＣＬＰ２３）
加熱によるＡＣ８モノマー（６４０ｍｇ／３００ｍｇ）の付加
ＮＨ２改質したシリカ３００ｍｇ（０．２２１ミリ当量ＮＨ２）に、水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液１０ｍｌ、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の６４０ｍｇ（１．８５×１０-3モル）を加える。反応混合物を、遮光して４時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。
【０１１２】
シリカを分離した後、官能化度を測定する。
改質シリカの分離
反応混合物を１Ｎ塩酸を加えて中和した後、遠心分離する。このようにして単離したシリカを熱水で十分に洗浄して過剰の塩を除去する。このようにして単離した改質シリカを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
グラフト化した糖の存在の実証：
シリカ上のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１１３】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）による単離したシリカの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
【０１１４】
ＩＲスペクトルは、糖の存在を示している。
ＩＲ，ＫＢｒペレット，νｃｍ-1１６４０（Ｃ＝Ｏ、第一アミド）；１２００〜１１００（ＳｉＯ）。
元素分析：３２．９３％Ｃ、２０．１９％Ｓｉ、５．６７％Ｈ、２．７４％Ｎ。
【０１１５】
例１３（ＣＬＰ２５）
加熱によるＡＣ８モノマー（７１０ｍｇ／１００ｍｇ）の添加
ＮＨ２改質したシリカ１００ｍｇ（０．０７４ミリ当量ＮＨ２）に、水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液１０ｍｌ、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の７１０ｍｇ（２×１０-3モル）を加える。反応混合物を、遮光して２０時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１１６】
シリカを分離した後、官能化度を測定する。
改質シリカの分離
反応混合物を１Ｎ塩酸を加えて中和した後、遠心分離する。このようにして単離したシリカを熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離された改質シリカを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
グラフト化した糖の存在の実証：
シリカ上のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１１７】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）による単離したシリカの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が存在することを示している。
【０１１８】
ＩＲスペクトルは、糖の存在を示している。
ＩＲ，ＫＢｒペレット，νｃｍ-1１６４０（Ｃ＝Ｏ、第一アミド）；１２００〜１１００（ＳｉＯ）。
元素分析：３５．９２％Ｃ、１８．２３％Ｓｉ、６．１１％Ｈ、２．９５％Ｎ。
【０１１９】
例１４（ＣＬＰ２６）
加熱によるＡＣ８モノマー（７１０ｍｇ／３３０ｍｇ）の付加
ＮＨ２改質したシリカ３３０ｍｇ（０．２６３ミリ当量ＮＨ２）に、水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液１０ｍｌ、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の７１０ｍｇ（２×１０-3モル）を加える。反応混合物を、遮光して２４時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１２０】
シリカを分離した後、官能化度を測定する。
改質シリカの分離
反応混合物を１Ｎ塩酸を加えて中和した後、遠心分離する。このようにして単離したシリカを熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離された改質シリカを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
グラフト化した糖の存在の実証：
シリカ上のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１２１】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）による単離したシリカの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、シリカに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
【０１２２】
ＩＲスペクトルは、糖の存在を示している。
ＩＲ，ＫＢｒペレット，νｃｍ-1１６４０（Ｃ＝Ｏ、第一アミド）；１２００〜１１００（ＳｉＯ）。
元素分析：２２．５％Ｃ、１８．６３％Ｓｉ、３．８２％Ｈ、４．１１％Ｎ。
改質したラテックスの安定性の検討
１− 様々なｐＨ値において
安定性試験は、懸濁液（ＣＥ６ｊ、ＣＥ３ｆおよびＣＥ６１）の２ｍｌ試験試料について行なった。ｐＨは、ガラス電極を備えたｐＨメーターによって測定した。懸濁液のｐＨは、０．１Ｎ塩酸水溶液を加えて調整した。
【０１２３】
懸濁液は、１２〜２の範囲のｐＨでは安定である（３日間の目視検査）。ｐＨ１では、１０時間後に不安定化が認められる。
【０１２４】
比較のため、ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０の出発ラテックス懸濁液では、ｐＨ＝３で既に、直ちに不安定化することが認められる。
２− 電解質の存在下において
安定性試験は、懸濁液の２ｍｌ試験試料について行なった。
【０１２５】
様々な濃度の各種の塩の存在下での懸濁液の安定性を、３日間に亙って目視検査によって評価した。
【０１２６】
試験は懸濁液ＣＥ６ｊ、ＣＥ３ｆおよびＣＥ６ｌについて行なった。
【０１２７】
塩化ナトリウムＮａＣｌ
懸濁液は、飽和ＮａＣｌ溶液（飽和ＮａＣｌ水溶液２０ｍｌ／懸濁液２ｍｌ）で安定である。比較のため、ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０の出発ラテックス懸濁液の不安定化を同じ条件下で観察する。
【０１２８】
塩化カルシウムＣａＣｌ ２
０．１Ｎ ＮａＯＨ媒質中で得た懸濁液ＣＥ６ｊおよびＣＥ６ｌ（懸濁液＃１１のｐＨ）は、１モル／リットルの濃度までのＣａＣｌ２の存在下では安定である。
【０１２９】
懸濁液ＣＥ３ｆは、５×１０-2モル／リットル（ｌ-1）までの濃度のＣａＣｌ２の存在下では安定である。ｐＨ３に調整した同じ懸濁液は、１モル／リットルの濃度までのＣａＣｌ２の添加に対して安定である。
【０１３０】
硫酸マグネシウムＭｇＳＯ ４
懸濁液ＣＥ６ｊ、ＣＥ３ｆおよびＣＥ６ｌは、１モル／リットルの濃度までのＭｇＳＯ４の存在下で安定である。ＭｇＳＯ４濃度が２モル／リットルより大きい場合には、非可逆的凝集が認められる。
改質ラテックス上のタンパク質の吸着
プロトコール：
懸濁液１ｇを、既知濃度のタンパク質の水溶液で希釈する。溶液を１４時間放置する。ポリマーを、環境温度で塩を加えて分離し（上記、改質ポリマーの凝集を参照）、次に遠心分離を行なう。濾液中の過剰のタンパク質を、クーマシーブルー比色法によって測定する。
【０１３１】
結果： ウシ血清アルブミンＢＳＡの吸着
ＢＳＡの吸着量は、懸濁液１ｇ当たり５ｍｇより大きい（すなわち、「乾燥」ポリマー７０ｍｇより大きい）。
【発明の属する技術分野】
発明の背景
本発明は、ラテックスまたは無機酸化物の新規なグリコシル化粒子、そのような粒子の製造法、および診断または生物学的（免疫学的、酵素等の）分析用の薬剤としての、および分子生物学またはアフィニティクロマトグラフィにおけるグリコシル化粒子の応用に関する。
【０００２】
本発明は、前記グリコシル化粒子の製造に特に有用な、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシル化合物にも関する。
【０００３】
【従来の技術】
ラテックス粒子または微小球（ミクロスフェア）は、医療診断の材料およびクロマトグラフィにおけるシリカ微小球として以前から用いられてきている。例えば、ラテックス粒子は凝集試験に用いられており、抗体または抗原の存在または非存在を検出するのに用いられている。実際には、抗体または抗原はラテックス粒子の表面に結合し、従って血清、頭脊柱液（ＣＲＬ）、尿または組織抽出物製剤などの体液中に存在する対応する（１種類以上の）抗原または抗体（１種類以上の抗体）と反応することができる。この検出法は、当業者には周知である。これらのポリマー粒子は、スチレンまたは他のビニルモノマーの乳化重合などの通常の方法で得ることができる。
【０００４】
しかしながら、それらが凝集試験などの医療診断に用いられるときには、これらの粒子は疎水性が強すぎるので、活性や感受性を失うことなく抗体や抗原と結合することはできない。従って、ポリマーと水との界面で疎水性と親水性との平衡を一層効率的に制御する手段が、模索されてきた。
【０００５】
この平衡を改質する目的で、これらの粒子の表面と、反応性基を有するまたは持たない極性官能基とを結合させることが既に提案されている。
【０００６】
特に有利な手法は、これらのラテックス粒子を炭水化物残基で官能化することであるが、その理由はこれらの基が生物学的適合性を有しかつそれらが糖タンパク質または糖脂質が関与する生物学的認識機構において有利であるためである。
【０００７】
これに基づいて、M.T. Charreyreらは、Colloid & Polym. Sci., 271: 668 - 679 (1993)において、ヘキシルメタクリレート基で終わるオリゴサッカライド、すなわち６−（２−メチルプロペノイルオキシ）ヘキシル＝β−Ｄ−セロビオシド（ＣＨＭＡ）の存在下で種から共（重合）法によってジサッカライド単位で被覆したポリスチレンラテックスを製造することを提案した。しかしながら、この化合物は、酸性ｐＨ（４未満）では化学的に安定ではないので、サッカライド基の加水分解反応によって分解して、ラテックス血清中に遊離のグリコシド化合物を形成し、これが細菌の繁殖を促進するという問題点を示す。
【０００８】
また、M.C. Davies ら（Langmuir, 1993, 9, 1637 - 1645）は、スチレンの存在下で、１−［［２−［［（Ｎ−アクリルアミドメチル）アミノ］カルボニル］エチル］チオ］−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであるアクリルアミドチオガラクトースを共重合させることも提案したが、この合成は特に慎重な扱いを必要とし（修飾ガラクトースの−ＯＨ官能基のブロッキングの段階）、またｐＨが９を上回る場合の安定性は一定しないのである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
発明の要約
本発明の目的の一つは、加水分解に対する感受性が極めて少ないポリマーまたは無機酸化物の新規なグリコシル化した粒子を提案することである。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、界面特性を示すラテックスまたはシリカ粒子、更に詳細には、タンパク質との相互作用において、当該技術分野で、特に二つの前記文献に従って既に得られているものに対して改良および／または改質されたものを提案することである。
【００１１】
また、本発明の目的は、ラテックスまたは無機酸化物、特にシリカであってグリコシル残基で官能化されているものの粒子の新規な製造法を提案することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、第一に、ラテックスまたは無機酸化物のグリコシル化粒子であって、グリコシル残基が末端に結合している少なくとも１本の鎖が前記粒子の表面に結合しているグリコシル化粒子に関する。
【００１３】
「結合している」という用語は、この粒子が微小球にグラフトするかまたは種から出発する過剰重合によって得ることができることを意味する。本発明による粒子は、グラフト化によって得るのが好ましい。
【００１４】
鎖／グリコシル残基単位は、「グリコシル化鎖」とも呼ばれる。
【００１５】
ラテックス微小球は、伝統的には、エチレン性不飽和モノマーの重合によって得られるポリマーからなり、無機酸化物、特にシリカの粒子は既知の方法で得られる。これらの粒子は、表面をアミン、チオールまたはフェノール官能基で、またはアミン、チオールまたはフェノール、およびシリカ粒子の場合にはシラノールの前駆体である官能基で官能化した後、転換する。
【００１６】
ラテックス微小球の場合には、これらは、ビニル芳香族またはエチレン性モノマー、場合によってはアルカンまたはエチレン性酸またはエステルから誘導される単位を含むホモポリマーまたはコポリマーであり、これらのモノマーの一部は塩素を含む基で官能化されている。塩素を含む基は、次にアミン官能基にまたはアミン基で転換するか、またはチオール官能基に転換できる。
【００１７】
それらは、ビニル芳香族モノマーから誘導される単位を含むホモポリマーまたはコポリマーであり、ヒドロキシル化され（フェノール官能基）またはチオール基で修飾される（チオフェノール官能基）。
【００１８】
この種類のポリマーは、当業者には容易に得ることができ、以下ではそれらが由来する若干のモノマーを挙げるだけで十分であろうし、何ら制限を伴うものではない。これらは、
イソプレン、１，３−ブタジエン、塩化ビニリデン、またはアクリロニトリル型のエチレン性モノマー、
スチレン、ヒドロキシスチレン、ブロモスチレン、α−メチルスチレン、エチルスチレン、ビニルトルエン、クロロスチレンまたはクロロメチルスチレン、またはビニルナフタレン、４−ヒドロキシスチレン、または４−メルカプトスチレンなどのビニル芳香族モノマー、
アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸アルキルであってアルキル基が１〜１０個の炭素原子を有するもの、アクリル酸ヒドロキシアルキル、アクリルアミド、４または５個の炭素原子を有するエチレン性酸のエステル、並びに
ジビニルベンゼンまたは２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート、および／または他の水に不溶性の共重合性モノマー、
であることができる。
【００１９】
ラテックス粒子が表面にアミン、フェノールまたはチオール基を含むときには、モノマーの一部だけがアミン基またはクロロメチル基のようなアミン基に転換できる基を有し、または用いられるモノマーの総量に対して１〜２５重量％の割合でチオールまたはフェノール基を有する。
【００２０】
これらのモノマーは、混合物として、または多段階工程において遂時的に用いられる。
【００２１】
ポリマー粒子は、通常のエマルジョン、マイクロエマルジョン、懸濁またはマイクロ懸濁重合のような任意の重合技術を用いることによって、または適当な場合には、有機媒質中での重合によって得ることができる。これらの技術は、当業者にはよく知られているものであり、ここでは再掲しない。
【００２２】
シリカ粒子は、既知の方法で官能化される。
【００２３】
本発明による粒子は、疎水性またはシリカのように親水性であり、粒度が一般的には０．０１〜２０ミクロン、好ましくは５ミクロン未満のものが好ましい。これらは、較正されており、単分散性であり、ラテックスの総重量の０．０５〜３０重量％、好ましくは０．１〜１０％の量の割合でラテックスに含まれる。
【００２４】
微小球平方メートル当たりの官能基の表面密度は、通常は約１〜約５０マイクロ当量であり、好ましくは３０マイクロ当量の領域にある。
【００２５】
本発明の粒子は、グリコシル基が結合している０．４〜５０本の鎖（単位面積ｎｍ２当たり）を含有している。
【００２６】
ラテックス粒子は磁化性にすることができ、この場合には、それらは、例えば米国特許第４，３３９，３３７号明細書、米国特許第４，３５８，３８８号明細書および米国特許第４，９４８，７３９号明細書に記載されている磁化性材料と組み合わせて用いられる。
【００２７】
微小球の磁化性部分を構成する材料としては、マグネタイト（磁鉄鉱）、ヘマタイト、二酸化クロム、混合イットリウム鉄酸化物、マンガン、ニッケルおよびマンガン−亜鉛フェライトなどのフェライト、およびコバルト、ニッケル、ガドリニウムおよびサマリウム−コバルト合金が挙げられる。好ましい材料は、通常はマグネタイトおよびヘマタイトである。
【００２８】
微小球に含まれる磁化性材料の量は、磁化性の複合微小球の約０．５〜７０％、好ましくは約１５〜６０重量％に相当する。
【００２９】
「スペーサーアーム」として働くことができる鎖が含まれているため、微小球によって表わされる固相の接近による立体障害およびタンパク質の変性の可能性はなくなる。
【００３０】
この鎖の平均長さは、５〜１２０オングストロームであり、５〜５０オングストロームが有利であり、１０オングストローム程度が更に有利である。
【００３１】
鎖は、好ましくは４〜８０個の炭素原子を有し、３〜２０個の炭素原子を有するのが有利である。
【００３２】
これは、場合によって窒素、酸素、硫黄またはリン原子から選択される１個以上のヘテロ原子を主鎖中に含む、場合によって置換された二価の炭化水素基であるのが普通であり、炭素原子の１個以上がカルボニル基または誘導体（イミン、オキシムなど）に属し、または１個以上の環または複素環を含むことができる。
【００３３】
二価の基の置換基は、微小球の官能基へのグラフト化が困難になるかまたは不可能になるような立体障害をまったく生じることがないものである。従って、それらは、メチル、アミノまたはＯＨ基などの障害のほとんどない置換基である。
【００３４】
同様に、鎖自身の一部を形成するこれらの置換基またはヘテロ原子は、この鎖のグリコシド残基と官能基との間の反応を干渉しないものでなければならない。
【００３５】
一般に、ラテックスまたは無機酸化物の各微小球上のグリコシル鎖の数は、診断試験の適用を可能にするのに十分なものでなければならない。
【００３６】
好ましい態様の説明
本発明による粒子は、好ましくは表面にアミン、チオールまたはフェノール官能基、またはシリカ粒子の場合にはシラノール官能基を含み、その少なくとも一部が前記鎖の構造の一部を形成し、後者が下記の式Ｉに相当するものである。
【００３７】
【化７】
Ａは、前記鎖の残りの部分であり、
Ｂは、Ｎ−Ｒ１基、または酸素原子、または硫黄原子からなる群から選択され、
Ｄは、二価の−（ＣＨ２）ｎ−またはフェニレン基、特に１，３−フェニレンまたは１，４−フェニレンであり、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基または水素原子であり、
Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル基または水素原子を表わし、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｇｌｙｃは、グリコシル残基であり、
下記の記号で表わされるものは、球の表面を記号で表わしたものである。）
【００３８】
【化８】
Ｄは（ＣＨ２）ｎであって、ｎ＝０であり、
Ｂは０である。
【００３９】
粒子がアミン基を含有するラテックス粒子であるときには、
Ｄは（ＣＨ２）ｎであって、ｎ＝１〜１０であり、
ＢはＮ−Ｒ１である。
【００４０】
粒子がフェノールまたはチオール基を含むラテックス粒子であるときには、Ｄはフェニレン基であり、ＢはＯまたはＳである。
【００４１】
本発明による粒子は、好ましくは、表面にアミン官能基を含み、その少なくとも一部が前記鎖の構造の一部を形成し、後者が下記の式IIに相当するものである。
【００４２】
【化９】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＡは、式Ｉにおけるものと同じ意味を表わし、
ｎは１〜１０の整数であり、
ｇｌｙｃはグリコシル残基である。）
【００４３】
実際には、グリコシル化した鎖の数は、微小球上に存在するアミン、チオール、フェノールおよびシラノール官能基の量より多少高い割合である。
【００４４】
この割合は、微小球の表面に存在するアミン、チオール、フェノールおよびシラノール官能基の１０〜９９％の間で有利に変化し、この割合は、好ましくは４０％を上回り、更に好ましくは８０％を上回る。
【００４５】
本発明の有利な態様によれば、グリコシル化したラテックス微小球は、エチレン性不飽和モノマーの重合によって得られるポリマーからなり、表面にアミン、チオールおよびフェノール官能基を表わし、ここでグリコシル残基が官能基の一部に結合しており、且つ前記鎖が下記の式III に相当することを特徴とする。
【００４６】
【化１０】
この「結合し」という用語は、グリコシル残基が、二価のセグメントを介して基Ｂに結合していることを意味する
もう一つの好ましい別の形態によれば、本発明は、アミン、チオール、フェノールおよびシラノール官能基で表面が改質された無機酸化物の粒子であって、官能基の部分がグリコシル残基に結合し、かつ前記鎖が下記の式IVに相当することを特徴とする、粒子に関する。
【００４８】
【化１１】
シリカ粒子は、シラノール基で改質されているのが好ましい。
【００４９】
本発明による無機粒子は、シリカ粒子であるのが好ましい。
【００５０】
無機粒子の表面に存在するアミン官能基は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ基であってｎが１〜１０でありＲが低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であるのが好ましい。
【００５１】
下記の糖残基を、本発明に関して好適なグリコシル残基の中から例示として挙げることができる。
【００５２】
グルコース、ガラクトース、ガラクトピラノース、グリコフラノース、フルクトース、フルクトピラノース、ラクトース。
【００５３】
グリコシル残基は、グルコース残基であるのが好ましい。
【００５４】
グリコシル化した鎖が式III に相当するグリコシル化ラテックス微小球の態様によれば、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルモノマーおよびアクリル酸型のエチレン性不飽和モノマーは、下記の条件を有するポリスチレン種上で過剰重合する。
【００５５】
アクリルアミドという表現は、メタクリルアミド誘導体も包含する、
「アクリル酸型のモノマー」という表現は、アクリル酸およびメタクリル酸、アルキルアクリレートおよびメタクリレートであってアルキル基が３〜１０個の炭素原子を有するもの、ヒドロキシアルキルアクリレート、アクリルアミド、および４または５個の炭素原子を有するエチレン性酸のエステルなどのアルケン酸、エステルまたは無水物を意味することを目的とする、
種の直径がミクロン以下であり、一般に０．０２〜０．９マイクロメートルであり、水中での粒子質量画分（「固形物含量」）は０．１〜２０％である、
種粒子の表面は、合成中に導入されるスルフェート乳化剤から本質的に生じるスルフェート基で官能化されている（モノマーに対して１．４％程度）、
導入される、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルモノマーの含量は、種の総重量に対して１〜２５重量％、好ましくは５〜１５重量％である。アクリル酸型のモノマーの含量は、５〜３０％であり、有利には１５〜２５％であり、百分率は種の乾燥重量に対する値である、
アクリル酸またはメタクリル酸型のモノマーは、アクリル酸またはメタクリル酸のエステルであるのが好ましい。
【００５６】
重合は、既知の方法で、例えば開始剤として過硫酸カリウムの存在下で、６０〜７０℃程度の適温で行なわれる。
【００５７】
（メタクリル酸メチルの代わりに）スチレンの存在下で、ポリスチレンを用いる過剰重合では、粒子表面へＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルモノマーを結合することができなかったことが認められた。
【００５８】
本発明の粒子のもう一つの態様は、式Ｉのグリコシル化した二価の鎖またはタイプIIのもう一つの二価の鎖で改質されるかどうかに拘らず、第一または第二アミン基で表面が未改質であるかまたは官能化されているラテックスまたはシリカ粒子上に、ミカエル型の求核付加反応を用いてω−グリコシル化したα−アクリル酸鎖をグラフトすることにある。
【００５９】
一般的には、第一または第二アミン官能基は、短い（Ｃ１〜Ｃ５）アルキレン鎖、好ましくはラテックスの場合にはメチレンおよびシリカの場合にはブチレンによってラテックスまたはシリカ粒子に連結される。
【００６０】
グラフト度は、上清についてのＵＶ分光光度法によって、抽出したポリマー／モノマー混合物の薄層クロマトグラフィによって、またはLee, Anal. Biochem., 95, 260 (1979) に記載の「フェノール−硫酸」混合物を用いる特異的試験によって測定される。
【００６１】
モノマーとアミン基との反応は、８〜１２の間の塩基性ｐＨで、好ましくは９程度で行なわれる。
【００６２】
一般に、アミン官能基の量は、生物学的、診断またはアフィニティクロマトグラフィの分野で用いられる粒子を生じるグラフトを得ることができるようにするのに十分でなければならない。
【００６３】
ラテックスの場合には、制限を全く含むことなく、アミン官能基の量はポリマー１ｇ当たり５０〜５００マイクロ当量であるということができる。この反応は総ての場合に特に好適であることが認められているが、グリコシル化した二価の鎖が式III の鎖に相当する場合には特に好適である。
【００６４】
反応は、環境温度または６０℃で不活性雰囲気、例えば窒素中で攪拌しながら行なう。続いて、水相でＵＶ分光光度法、およびＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルおよび抽出したポリマー上で薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行なうことができる。
【００６５】
粒子の界面特性、更に詳細にはそれらのタンパク質との相互作用は、それらの表面でのグリコシル残基の導入の程度および方法（メタクリル酸メチルあるいは同等物などの存在下での、場合によってＮ−アルキルのアクリルアミドグリコシルモノマーの過剰重合、またはアミン官能基の表面反応）によって変化する。表面鎖の配座およびグリコシル残基の位置は、２種類の官能化法の場合には同一ではないので、異なる三次元構造の微小球を生じる。
【００６６】
本発明のもう一つの課題は、式Ｖを有する、場合によってＮ−アルキルアクリルアミドグリコシルである。
【００６７】
【化１２】
Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基または水素原子であり、
Ｒ２は、場合によって置換したＣ１〜Ｃ14アルキル、またはＣ７〜Ｃ14アラルキル基、または水素原子であり、
ｇｌｙｃは、グリコシル化した粒子の調製に特に有用な糖残基である。）
これらの化合物の調製は、簡単な方法で行なわれ、ヒドロキシル官能基のブロッキングの段階は全く必要としない。
【００６８】
この合成は、グリコシル化した化合物から出発して、アルキルアミンを作用させた後、アルキルグリコシルアミンを水性媒質中で、例えば下記の反応式によってアクリロイル化による２段階で行なわれる。
【００６９】
【化１３】
【００７０】
エマルジョンまたはマイクロエマルジョン中でのスチレン−クロロメチルスチレン共重合（ＶＢＣ）、
塩基性の緩衝媒質（ｐＨ＝８．５）中で過剰のアルキルアミンまたはアラルキルアミンと表面におけるクロロメチル基との反応の後、透析による過剰アミンの除去。
【００７１】
下記の反応図式によれば、
【００７２】
【化１４】
【００７３】
【化１５】
過剰量のアミノアルコールまたはアミノアラルコールと、水−アルコール性溶媒中での表面シラノール基との反応。
【００７４】
アミノアルコールは、４−アミノ−１−ブタノールが好ましい。
【００７５】
このような反応の収率は、普通は５０％を上回る。これらのアミノ化した微小球上での、場合によってＮ−アルキルであるアクリルアミドグリコシルのグラフト化は、８〜１３の弱塩基性に緩衝のｐＨの微小球の水性懸濁液にこの化合物を徐々に加えることによって行なう。一つの態様によれば、反応物は不足量で導入し、反応の進行は溶液中の反応物の消失によって簡単に測定され、測定は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）および高性能液体クロマトグラフィなどによって行なわれる。反応は、下記のように図解的に表わすことができる。
【００７６】
【化１６】
【００７７】
最後に、本発明のもう一つの課題は、上記のグリコシル化した粒子の、診断または検出剤としての、またはアフィニティクロマトグラフィにおける固定相としての使用である。
【００７８】
これらの粒子は、多種多様な生物学的分野で用いることができる。例えば、生物医学的診断薬、特にＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ型の試験では、Ｆｃフラグメントが炭水化物残基を含む粒子の場合には、グリコシル化した基が粒子の表面に固定化された抗体との生物学的適合性に寄与する。
【００７９】
下記の例により、本発明を更に説明する。
例１
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミドの調製
ａ） Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの合成
グルコース５４ｇ（０．３モル）を、オクチルアミン４０ｇ（０．３モル）を無水メタノール５０ｍｌに溶解した液に加える。反応混合物を６５℃に２０分間加熱した後、９５％熱エタノール５０ｍｌを加える。冷却により沈澱するＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン（２時間後に完全に沈澱）をブフナー上で濾別した後、無水エタノール（１．５リットル）から再結晶を行なう。
得られた量：７７．７ｇ、 収率：８９％。
融点（℃）＝１０３〜１０７。
【００８０】
ｂ） 水／ＴＨＦ混合物中でのＮ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド（ＡＣ８）の合成
炭酸ナトリウム３３．６ｇを最少量の水に溶解したものを、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン２５ｇを水４００ｍｌおよびＴＨＦ４００ｍｌに溶解したものに加える。０℃に冷却した反応混合物に、塩化アクリロイル３６ｍｌを２時間間隔で２回に分けて加える。次に、反応混合物を３０℃まで４時間加熱する。ＴＨＦを減圧留去した後、水相を酢酸エチル３×３００ｍｌで抽出する。合わせた有機相を、次に重炭酸ナトリウムの水溶液２×１００ｍｌで洗浄した後、水で洗浄する。硫酸マグネシウム上で乾燥し、酢酸エチルを留去した後、粗製化合物２５．２ｇが単離される。
収率：８５％。
ＩＲ（ヌジョール、νｃｍ-1）：３５００〜３２００（Ｈ−Ｏ）；１６５０（アミドＩ）；１６１０（Ｃ＝Ｃ）。
【００８１】
例２
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」ＡＣ８の合成
ａ） Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの合成
【００８２】
【化１７】
得られた量：１２．８ｇ、 収率：７５％。
融点（℃）＝１０４〜１０６。
【００８３】
ｂ） メタノール中でのＮ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」ＡＣ８の合成
【００８４】
【化１８】
得られる量：８．０ｇ、 収率：９５％。
非晶質固形物。
【００８５】
例３
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−テトラデシルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」ＡＣ１４の合成
ａ） Ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの合成
【００８６】
【化１９】
得られる量：５．２５ｇ、 収率：５６％。
融点（℃）＝１０９℃。
【００８７】
ｂ） ＴＨＦ中でのＮ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−テトラデシルアクリルアミド：「アクリルアミド糖」の合成
炭酸ナトリウム８５ミリモル（９ｇ）を水２５ｍｌに溶解した液を、Ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン１３．７ミリモル（４ｇ）をＴＨＦ１９０ｍｌに溶解した液に加える。塩化アクリロイル２６ミリモル（２．０ｍｌ）をＴＨＦ２０ｍｌに溶解した液を、１時間かけて滴加する。ＴＨＦを留去した後、アクリルアミド糖を酢酸エチル３００ｍｌで抽出する。有機相をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧留去する。
得られた量：３．９９ｇ、 収率：８９％。
非晶質固形物。
融点（℃）（分解）＝１１０℃。
【００８８】
例４
アミノ化した微小（ナノ）粒子の調製
初期マイクロエマルジョンの組成：水（７５％）、ＳＤＳ（８．３％）、１−ペンタノール（９．２％）、スチレン（６％）、ＶＢＣ（１．５％）。
【００８９】
重合：過硫酸アンモニウム−テトラメチルジアミノメタン開始剤、２５℃、２時間。ＰＣＳを用いる懸濁液の検討により、粒度２５±３ｎｍ（ごく僅かの多分散）となる。凝集ポリマーの元素分析では、８０％スチレン−２０％ＶＢＣの組成物と一致する：％Ｃ８５．２４（実測値）、８７．９９（計算値）；％Ｈ７．５１（実測値）、７．３８（計算値）；％Ｃｌ ４．３４（実測値）、４．６５（計算値）。
【００９０】
表面置換：エチルアミン１ｍｌ（最初に導入されたＶＢＣに対して４．６７当量）を、スチレン−ＶＢＣコポリマーのナノ粒子５０ｇをＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝８．５）２８０ｍｌで希釈した懸濁液に加える。懸濁液を４８時間強く攪拌した後、１時間透析し、過剰のエチルアミンを除去する（ｐＨチェック、透析時間約１時間）。凝集したポリマーのＮ／Ｃｌ元素分析により、置換度を約５０％と決定することができる。
【００９１】
例５
水性懸濁液中でのナノ粒子へのグルコシド基のグラフト化
Ｎ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクチルアクリルアミド（ＡＣ８）を、ｐＨを８．５に緩衝したナノ粒子の懸濁液に徐々に加える。反応の進行は、溶液中の反応物の消失によって簡単に測定される：ＴＬＣ、ＨＰＬＣ。存在しているアミノメチル基に対して表わしたグラフト化度は７６％である。
官能化
１ 表面ＮＨ ２ 官能基を含むＥｓｔａｐｏｒ R ラテックス粒子の官能化
【００９２】
例６（ＣＥ３ａ）
環境温度で糖ＡＣ８から誘導される過剰のモノマー
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス１０ｍｌに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の３５０ｍｇ（１０-3モル、５．５当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して６８時間緩やかに攪拌する（マグネティックスターラー攪拌）。得られた安定な懸濁液を透析して、過剰のアクリルアミド糖ＡＣ８を除去する。
【００９３】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおける糖のグラフト化の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【００９４】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が存在していることを示している。
元素分析：６８．３３％Ｃ、６．４％Ｈ、０．８５％Ｎ。
【００９５】
例７（ＣＥ３ｆ）
加熱による過剰のＡＣ８モノマー
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス１０ｍｌに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８ ３５０ｍｇ（１０-3モル、５．５当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して３．３０時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５０℃に加熱する。得られた安定な懸濁液を透析して、過剰のアクリルアミド糖ＡＣ８を除去する。
【００９６】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおける糖のグラフト化の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【００９７】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：６９．１５％Ｃ、７．６４％Ｈ、１．４％Ｎ。
【００９８】
例８（ＣＥ６ａ）
環境温度におけるＡＣ８モノマーの化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス１０ｍｌに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の５２ｍｇ（１．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して５４時間緩やかに攪拌する（マグネティックスターラー攪拌）。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【００９９】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１００】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：８９．２８％Ｃ、７．５６％Ｈ、０．３５％Ｎ。
【０１０１】
例９（ＣＥ６ｊ）
加熱によるＡＣ８モノマーの化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス３０ｇに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）１５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）１５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム３００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の１５６ｍｇ（４．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して３時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１０２】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１０３】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：８１．２６％Ｃ、７．２５％Ｈ、０．３６％Ｎ。
【０１０４】
例１０（ＣＥ６１）
加熱により糖ＡＣ１４から誘導されるモノマーの化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス３０ｇに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）１５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）１５０ｍｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム３００μｌ（反応混合物中の水酸化ナトリウムの濃度：０．１Ｎ）、およびアクリルアミド糖ＡＣ１４の１９３ｍｇ（４．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して５時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ１４（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１０５】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１０６】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ１４モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：８０．１３％Ｃ、７．２６％Ｈ、０．６１％Ｎ。
【０１０７】
例１１（ＣＥ６ｍ）
添加した塩基なしでの加熱によるモノマーＡＣ８の化学量論的量
ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０ラテックス３０ｇに、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）１５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）１５０ｍｇおよびアクリルアミド糖ＡＣ８の１５６ｍｇ（４．５×１０-4モル、１当量／ＮＨ２）を加える。反応混合物を、遮光して５時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１０８】
ポリマーが凝集した後、官能化度を測定する。
凝集：
飽和塩溶液（ＮａＣｌ）１０ｍｌおよび硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の飽和溶液１０ｍｌを、懸濁液５ｍｌに加える。混合物を８０℃に１時間加熱して、完全に凝集させる。凝集したポリマーを熱溶液から濾過によって回収した後、熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離したポリマーを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
凝集したポリマーにおけるグラフト化した糖の存在の実証：
ポリマー中のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１０９】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）によるポリマーの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
元素分析：９０％Ｃ、７．５６％Ｈ、０．５％Ｎ。
【０１１０】
２ 改質シリカ−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨ ２ の粒子の官能化
出発シリカの元素分析：
％Ｃ＝３．０２、％Ｎ＝１．０３、％Ｓｉ＝４１．７５％。
【０１１１】
例１２（ＣＬＰ２３）
加熱によるＡＣ８モノマー（６４０ｍｇ／３００ｍｇ）の付加
ＮＨ２改質したシリカ３００ｍｇ（０．２２１ミリ当量ＮＨ２）に、水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液１０ｍｌ、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の６４０ｍｇ（１．８５×１０-3モル）を加える。反応混合物を、遮光して４時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。
【０１１２】
シリカを分離した後、官能化度を測定する。
改質シリカの分離
反応混合物を１Ｎ塩酸を加えて中和した後、遠心分離する。このようにして単離したシリカを熱水で十分に洗浄して過剰の塩を除去する。このようにして単離した改質シリカを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
グラフト化した糖の存在の実証：
シリカ上のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１１３】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）による単離したシリカの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
【０１１４】
ＩＲスペクトルは、糖の存在を示している。
ＩＲ，ＫＢｒペレット，νｃｍ-1１６４０（Ｃ＝Ｏ、第一アミド）；１２００〜１１００（ＳｉＯ）。
元素分析：３２．９３％Ｃ、２０．１９％Ｓｉ、５．６７％Ｈ、２．７４％Ｎ。
【０１１５】
例１３（ＣＬＰ２５）
加熱によるＡＣ８モノマー（７１０ｍｇ／１００ｍｇ）の添加
ＮＨ２改質したシリカ１００ｍｇ（０．０７４ミリ当量ＮＨ２）に、水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液１０ｍｌ、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の７１０ｍｇ（２×１０-3モル）を加える。反応混合物を、遮光して２０時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１１６】
シリカを分離した後、官能化度を測定する。
改質シリカの分離
反応混合物を１Ｎ塩酸を加えて中和した後、遠心分離する。このようにして単離したシリカを熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離された改質シリカを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
グラフト化した糖の存在の実証：
シリカ上のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１１７】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）による単離したシリカの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、ポリマーに結合した糖（Ｒｆ＝０）が存在することを示している。
【０１１８】
ＩＲスペクトルは、糖の存在を示している。
ＩＲ，ＫＢｒペレット，νｃｍ-1１６４０（Ｃ＝Ｏ、第一アミド）；１２００〜１１００（ＳｉＯ）。
元素分析：３５．９２％Ｃ、１８．２３％Ｓｉ、６．１１％Ｈ、２．９５％Ｎ。
【０１１９】
例１４（ＣＬＰ２６）
加熱によるＡＣ８モノマー（７１０ｍｇ／３３０ｍｇ）の付加
ＮＨ２改質したシリカ３３０ｍｇ（０．２６３ミリ当量ＮＨ２）に、水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液１０ｍｌ、ナトリウムアジドＮａＮ３（殺菌剤）５０ｍｇ、亜硝酸ナトリウムＮａＮＯ２（重合防止剤）５０ｍｇ、およびアクリルアミド糖ＡＣ８の７１０ｍｇ（２×１０-3モル）を加える。反応混合物を、遮光して２４時間緩やかに攪拌（マグネティックスターラー攪拌）しながら５８℃に加熱する。反応の後、薄層クロマトグラフィ（８０／２０ジクロロメタン／メタノール溶離剤）を行なうと、アクリルアミド糖ＡＣ８（Ｒｆ＝０．４）が完全に消失していることが示される。
【０１２０】
シリカを分離した後、官能化度を測定する。
改質シリカの分離
反応混合物を１Ｎ塩酸を加えて中和した後、遠心分離する。このようにして単離したシリカを熱水で十分に洗浄して、過剰の塩を除去する。このようにして単離された改質シリカを６０℃のオーブンで乾燥して、一定重量とする。
グラフト化した糖の存在の実証：
シリカ上のグラフト化した糖の存在は、特異的な「フェノール−硫酸」試験で実証する。
【０１２１】
薄層クロマトグラフィ（８０／２０ ジクロロメタン／メタノール溶離剤）による単離したシリカの検討では、遊離のアクリルアミド糖ＡＣ８モノマー（Ｒｆ＝０．４）は含まれておらず、シリカに結合した糖（Ｒｆ＝０）が含まれることを示している。
【０１２２】
ＩＲスペクトルは、糖の存在を示している。
ＩＲ，ＫＢｒペレット，νｃｍ-1１６４０（Ｃ＝Ｏ、第一アミド）；１２００〜１１００（ＳｉＯ）。
元素分析：２２．５％Ｃ、１８．６３％Ｓｉ、３．８２％Ｈ、４．１１％Ｎ。
改質したラテックスの安定性の検討
１− 様々なｐＨ値において
安定性試験は、懸濁液（ＣＥ６ｊ、ＣＥ３ｆおよびＣＥ６１）の２ｍｌ試験試料について行なった。ｐＨは、ガラス電極を備えたｐＨメーターによって測定した。懸濁液のｐＨは、０．１Ｎ塩酸水溶液を加えて調整した。
【０１２３】
懸濁液は、１２〜２の範囲のｐＨでは安定である（３日間の目視検査）。ｐＨ１では、１０時間後に不安定化が認められる。
【０１２４】
比較のため、ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０の出発ラテックス懸濁液では、ｐＨ＝３で既に、直ちに不安定化することが認められる。
２− 電解質の存在下において
安定性試験は、懸濁液の２ｍｌ試験試料について行なった。
【０１２５】
様々な濃度の各種の塩の存在下での懸濁液の安定性を、３日間に亙って目視検査によって評価した。
【０１２６】
試験は懸濁液ＣＥ６ｊ、ＣＥ３ｆおよびＣＥ６ｌについて行なった。
【０１２７】
塩化ナトリウムＮａＣｌ
懸濁液は、飽和ＮａＣｌ溶液（飽和ＮａＣｌ水溶液２０ｍｌ／懸濁液２ｍｌ）で安定である。比較のため、ＥｓｔａｐｏｒＲＫ３−０８０の出発ラテックス懸濁液の不安定化を同じ条件下で観察する。
【０１２８】
塩化カルシウムＣａＣｌ ２
０．１Ｎ ＮａＯＨ媒質中で得た懸濁液ＣＥ６ｊおよびＣＥ６ｌ（懸濁液＃１１のｐＨ）は、１モル／リットルの濃度までのＣａＣｌ２の存在下では安定である。
【０１２９】
懸濁液ＣＥ３ｆは、５×１０-2モル／リットル（ｌ-1）までの濃度のＣａＣｌ２の存在下では安定である。ｐＨ３に調整した同じ懸濁液は、１モル／リットルの濃度までのＣａＣｌ２の添加に対して安定である。
【０１３０】
硫酸マグネシウムＭｇＳＯ ４
懸濁液ＣＥ６ｊ、ＣＥ３ｆおよびＣＥ６ｌは、１モル／リットルの濃度までのＭｇＳＯ４の存在下で安定である。ＭｇＳＯ４濃度が２モル／リットルより大きい場合には、非可逆的凝集が認められる。
改質ラテックス上のタンパク質の吸着
プロトコール：
懸濁液１ｇを、既知濃度のタンパク質の水溶液で希釈する。溶液を１４時間放置する。ポリマーを、環境温度で塩を加えて分離し（上記、改質ポリマーの凝集を参照）、次に遠心分離を行なう。濾液中の過剰のタンパク質を、クーマシーブルー比色法によって測定する。
【０１３１】
結果： ウシ血清アルブミンＢＳＡの吸着
ＢＳＡの吸着量は、懸濁液１ｇ当たり５ｍｇより大きい（すなわち、「乾燥」ポリマー７０ｍｇより大きい）。
Claims (16)
- ラテックスまたは無機酸化物の粒子であって、グリコシル残基が末端に結合している少なくとも１本の鎖が、前記粒子の表面に結合してなり、表面にアミン、チオールまたはフェノール官能基、またはシリカ粒子の場合にはシラノール部位を含み、その少なくとも一部が前記鎖の構造の一部を形成し、後者が下記の式Ｉに相当する、粒子。
Ａは、前記鎖の残りの部分であり、
Ｂは、Ｎ−Ｒ１基、または酸素原子、または硫黄原子からなる群から選択され、
Ｄは、二価の−（ＣＨ２）ｎ−またはフェニレン基であり、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基または水素原子であり、
Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル基または水素原子を表わし、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｇｌｙｃは、グリコシル残基であり、
下記の記号で表わされるものは、球の表面を記号で表わしたものである。）
- 粒子がシリカ粒子であるときは、Ｄは（ＣＨ２）ｎ（ここでｎ＝０）でありかつＢは酸素原子であり、粒子がアミン基を含有するラテックス粒子であるときは、Ｄは（ＣＨ２）ｎ（ここでｎ＝１〜１０）でありかつＢはＮ−Ｒ１であり、粒子がフェノールまたはチオール基を含有するラテックス粒子であるときは、Ｄはフェニレン基でありかつＢは酸素または硫黄原子であることを特徴とする、請求項１に記載の粒子。
- 前記鎖が、下記式IIに相当する、請求項１または２に記載の粒子。
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基または水素原子であり、
Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル基または水素原子を表わし、
Ａは、前記鎖の残りの部分であり、
ｎは、１〜１０の整数であり、
ｇｌｙｃは、グリコシル残基であり、
下記の記号で表わされるものは、球の表面を記号で表わしたものである。）
- Ａが、基−Ｎ−であって、Ｒ２が水素原子またはＣ１〜Ｃ14アルキルまたは
｜
Ｒ２
Ｃ７〜Ｃ14アラルキル基であり、前記の基が場合によって１個以上の末端または側基のカルボキシレートまたはスルホネート基によって置換されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。 - 微小球の表面におけるアミン、チオールまたはフェノール基またはシラノール部位の量に対するグリコシル化鎖の割合が１０〜９９％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子。
- エチレン性不飽和モノマーの重合によって得られるポリマーからなり、その１〜２５重量％が表面にアミン、チオールまたはフェノール官能基を表わし、官能基の一部がグリコシル残基に結び付いており、且つ前記鎖が下記の式III に相当する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のグリコシル化ラテックス粒子。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載されたアミン、チオールまたはフェノール官能基またはシリカ粒子の場合にはシラノール部位で表面が改質された無機酸化物粒子であって、官能基の一部がグリコシル残基に結合し、かつ前記鎖が下記の式IVに相当することを特徴とする、粒子。
- グリコシル残基が、次の糖残基：グルコース、ガラクトース、ガラクトピラノース、グリコフラノース、フルクトース、フルクトピラノース、スクロースおよびラクトースから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子。
- グリコシル残基が結合している０．４〜５０本の鎖（単位面積ｎｍ２当たり）を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の粒子。
- 鎖の平均長が０．５〜１２ｎｍ（５〜１２０オングストローム）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の粒子。
- 鎖が４〜８０個の炭素原子、有利には３〜２０個の炭素原子を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の粒子。
- ０．０１〜２０μｍの大きさである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の粒子。
- 場合によってＮ−アルキル（メト）アクリルアミドグリコシルを、ミカエル型の付加を用いて、ラテックスまたは無機酸化物の微小球であって表面が第一または第二アミン、チオールまたはフェノール基、またはシリカの粒子の場合にはシラノール部位で官能化されたものにグラフトすることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の粒子の製造法。
- 場合によってＮ−アルキル（メト）アクリルアミドグリコシルモノマーを（メト）アクリル酸型のエチレン性不飽和モノマーの適量の存在下にてポリスチレン種に過剰重合することを特徴とする、請求項６に記載のラテックス粒子の製造法。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の粒子の、生物学的検出のための診断剤または薬剤としての使用。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の粒子の、アフィニティクロマトグラフィにおける固定相としての使用。
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