JP5306543B2 - 膜タンパク質の捕捉及び操作を目的とする、両親媒性モノマーを過半数含むポリマー - Google Patents

Description

本発明は、水溶液中の疎水性化合物の操作に有用な両親媒性ポリマー、疎水性化合物（特に膜タンパク質）と該ポリマーとの間で形成される水溶性複合体、該複合体の調製方法、及び該複合体の適用、特に診断方法又は分析方法への適用に関する。

内在性膜タンパク質は、タンパク質の特定のクラスであって、ｉｎ ｖｉｖｏでは生体膜の脂質二重層を貫通して生体膜に挿入されている。自然に膜と接触した状態になるこれらタンパク質の表面（膜貫通領域）は特に疎水性であり、膜外表面は主に親水性である。膜タンパク質は、特に様々な細胞コンパートメント間の情報又は分子の交換、及び細胞とその環境との間の情報又は分子の交換に関して、必須の生物学的機能を担っている。

上記の点から、膜タンパク質には、医薬分野において多大な関心が寄せられている。膜タンパク質は、例えば、医薬分子の特別な標的である。膜タンパク質はまた、ヒトの多数の病気にも関与しており、そのいくつか（例えば、多発性硬化症又は重症筋無力症）は、膜タンパク質に対する自己抗体が血清中に存在することにより示される、自己免疫成分を有する。

水溶液中での膜タンパク質の操作は、通常、膜タンパク質の精製、並びに膜タンパク質の構造及び機能の研究の必須条件である。操作には、疎水性ドメインの自発的な凝集を避けること、且つそのために膜貫通領域周辺を両親媒性環境に維持することが必要となる。

水溶性状態にあるこのようなタンパク質の従来の調製物には、超ミセル（ｓｕｐｒａｍｉｃｅｌｌａｉｒｅｓ）濃度の特定の界面活性剤（ｔｅｎｓｉｏａｃｔｉｆ）、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）が含まれる。この方法が成功しているのは、これら両親媒性化合物及び分散剤が膜貫通タンパク質領域上に吸着することによる。それにも関わらず、この方法により形成される複合体の操作は、正確には洗剤の存在に起因して、可溶性タンパク質の操作よりも非常にデリケートである。洗剤は、研究対象のタンパク質を含む全溶液中、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）よりも高い濃度で存在しなければならない。洗剤の消費により生じ得るコストの問題は別としても、当該実験は、膜タンパク質が洗剤溶液中では通常不安定であるという事実により、多くの場合デリケートなものとなる。従って、界面活性剤が不足すれば、通常、膜タンパク質の沈殿がもたらされる一方で、過剰なミセルの存在下では、膜タンパク質は不可逆的に変性する傾向にある。

このような状況から、洗剤の使用に代わるものの探索が行われており、それらのうち、例えばバイセル（ｂｉｃｅｌｌ）（バイセルとは、界面活性剤により安定化された小さな脂質ディスクである）、ナノディスク（その構造は同様のものであるが、界面活性剤はタンパク質である）、ペプチタージェント（ｐｅｐｔｉｔｅｒｇｅｎｔ）（ペプチタージェントとは両親媒性ペプチドである）、リポペプチド（ペプチド性ではあるが炭化水素鎖を有している）、フッ素化又は半フッ素化界面活性剤、及びアンフィポル（ａｍｐｈｉｐｏｌ）（本特許出願の主題を形成する分子はこのファミリーに属する）を挙げることができる。

アンフィポルは両親媒性ポリマーであり、特に、膜タンパク質の膜貫通表面での洗剤に置き換わるものとして設計されている（Ｔｒｉｂｅｔら、ＷＯ１９９８／０２７４３４）。該特許では、水性媒体中に膜タンパク質を保持するための両親媒性コポリマーの使用が記載されている。

アンフィポル又は今日までに記載されたそのように呼ばれる分子の大多数は、イオン性ポリマー、特にアニオン性ポリマーであり、様々な分析系（等電集束法（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ））又は分離系（イオン交換カラムでのクロマトグラフィー）での使用が禁じられており、膜タンパク質の結晶化（それにより安定化される）にとって好ましい因子ではない。従って、膜タンパク質の操作のために、既存のアンフィポルの利点を有し、非イオン性である両親媒性ポリマーが必要とされている。

非イオン性アンフィポルは、Ｐｒａｔａら及びＳｈａｒｍａらの文献に記載されている。Ｐｒａｔａらの文献では、アンフィポルは、２種のモノマーを含むコポリマーであって（該文献の図２を参照されたい）、１種は親水性であり（２つのＯＨと１つの糖、又は３つのＯＨ）、もう１種は両親媒性である（２つのＯＨと脂肪鎖）。該文献において、親水性モノマーと両親媒性モノマーとのモル比は、３．０と６．７との間で維持されており、これは、７５〜８７％の親水性モノマーと１３〜２５％の両親媒性モノマーに対応し、従って、両親媒性モノマーは少数派である。

Ｓｈａｒｍａらの文献では、アンフィポルは、２種のモノマーを含むコポリマーであって（該文献のスキーマ１を参照されたい）、１種は親水性であり（２つのＯＨと１つの糖）、もう１種は両親媒性である（１つのＯＨ、１つの糖及び１つの脂肪鎖）。該文献において、親水性モノマーＡと両親媒性モノマーＢとのモル比は、３と５との間で維持されており、これは、７５〜８３％の親水性モノマーＡ及び１７〜２５％の両親媒性モノマーＢに対応し、従って、両親媒性モノマーは少数派である。このことは、著者らが、最も高い割合（２５％）の両親媒性モノマーを含むアンフィポルが低い水溶解度を既に有していたと指摘している事実により説明される。

特許出願ＷＯ２００８／０５８９６３には、異なる種類のモノマー（親水性、両親媒性又は疎水性）を含むコポリマーであるアンフィポルによる支持体上への膜タンパク質の固定が記載されており、ここで、親水性モノマー全体の割合に対する、疎水性モノマー又は両親媒性モノマー全体の割合の比率は、０．２５と２．５との間に含まれる（ＷＯ２００８／０５８９６３の請求項３を参照されたい）。例となるアンフィポルは、親水性モノマーと疎水性モノマーとを含むイオン性コポリマーである（該文献の図１Ａを参照されたい）。さらに、該出願において両親媒性として定義される基には、同一の「グラフト」内の混合された親水性官能基と疎水性官能基とが含まれ、側鎖上に別々にグラフトされた親水性基と疎水性基とを分けていない。

従って、アンフィポル及び今日までに記載されたそのように呼ばれる分子は全て、異なる特性の単位を含むコポリマーであって、そのうちあるものは親水性であり、他のものは疎水性及び／又は両親媒性であり、両親媒性モノマーが存在する場合には両親媒性モノマーは少数派である、コポリマーである。

さらに、Ｓｈａｒｍａらの文献で示される結果は、アンフィポルの水溶解度を十分に保つためには、両親媒性モノマーに加えて親水性モノマーを含める必要があることを示唆している。

しかし、今日までに記載された全ての分子のコポリマー構造は、重大な欠点を有している：その構造により１つのバッチから次のバッチへと、同一の化学構造を正確に再現することが難しくなっているのである。事実、合成には、ラジカル共重合か、又はホモポリマー型前駆体のランダムな官能基化のいずれかが必要であり、これら２つは、本質的に非選択的な反応タイプである。従って、疎水性化合物、特に膜タンパク質の操作のために、従来のものと同等の利点を有し、且つその調製方法が１つのバッチから次のバッチへと、より再現性が高い、両親媒性ポリマーが必要とされている。

［発明の説明］
Ｓｈａｒｍａらにより示唆されたものとは異なって（４）、本発明者らは、驚くべき方法で、両親媒性モノマーからなる両親媒性ホモポリマー（ｈｏｍｏＡＰｏｌ）、又は過半数のこのような両親媒性モノマーを含むコポリマー（「準（ｑｕａｓｉ）ホモポリマー」）が、十分な水溶解度を有して、当該分野で公知のコポリマーアンフィポルと同様に、膜タンパク質を操作できることを示した。さらに、これらのホモポリマー又は準ホモポリマーは、完全に再現性のある方法で製造でき、従って、当該分野で公知のコポリマーアンフィポルの欠点を有さないものである。

従って、本出願は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はさらには１００％の式（Ｉ）：

［式中、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ又はＣ_１−Ｃ_３アルキル基（好ましくはメチル）から選択され；
Ｘ及びＹは、独立して、酸素原子、硫黄原子、カルボニルオキシ（−（ＣＯ）Ｏ−）又はオキシカルボニル（−Ｏ（ＣＯ）−）基、ウレタン基（−ＯＣＯＮＨ−）、及び式（−ＣＯＮＲ_６−）又は（−ＮＲ_６ＣＯ−）｛式中、Ｒ_６は、水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキル（好ましくはメチル又はエチル）である｝のアミド基から選択され；
Ｒ_３及びＲ_４は、独立して、以下から選択され：
ａ）グリコシド基、
ｂ）双性イオン残基、
ｃ）式−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｘ）_ｙ−ＯＨのポリ（オキシアルキレン）基｛式中、ｘは１と６の間（有利には、ｘは２である）に含まれ、ｙは４と３０の間、有利には４と２０の間又は４と１０の間に含まれる｝、
ｄ）式−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＲ_７Ｒ_８又は−（ＣＨ_２）_ｎＮＲ_７ＣＯＲ_８のアルキルアミド基｛式中、ｎは１と４の間に含まれ、Ｒ_７及びＲ_８は、独立して、水素原子（−Ｈ）、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基（好ましくはメチル）、グリコシド基、双性イオン残基、又は式−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｘ）_ｙ−ＯＨのポリ（オキシアルキレン）基（式中、ｘは１と６の間（有利には、ｘは２である）に含まれ、ｙは４と３０の間、有利には４と２０の間又は４と１０の間に含まれる）から選択される｝；
Ｒ_５は、５〜１６個の炭素原子を含む、飽和若しくは不飽和（１つ以上不飽和）の、環式炭化水素鎖（Ｒ_５は、特にシクロヘキサン、シクロペンタン又は芳香族タイプの、１つ又は２つの飽和環又は不飽和環を含んでよい）若しくは非環式炭化水素鎖（直鎖状又は分枝状）、又は式Ｃ_ｔＦ_２ｔ＋１（ＣＨ_２）_ｍの半フッ素化炭素（ｈｅｍｉｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｅｅ）鎖（式中、ｔは２と１０の間に含まれ、ｍは２と１０の間に含まれる）である］
の両親媒性モノマーを含む両親媒性ポリマーであって、ポリマーの平均モル質量が、８００と１００，０００の間（１と１２０の間に含まれるモノマー数に対応する）、有利には５０，０００以下、好ましくは８０００と５０，０００の間に含まれる、両親媒性ポリマーに関する。平均モル質量は、重量により示す。

「Ｃ_ｘ−Ｃ_ｙアルキル」とは、式−Ｃ_ｊＨ_２ｊ＋１（式中、ｘ＜ｊ＜ｙである）の直鎖状又は分枝状の飽和炭化水素ラジカルを意味することを意図する。特に、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルは、Ｃ_１（メチル）、Ｃ_２（エチル）、Ｃ_３（ｎ−プロピル又はイソプロピル）、Ｃ_４（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ_５（例えば、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル）又はＣ_６（例えば、ｎ−ヘキシル）アルキルであってよい。

本発明のポリマーが式（Ｉ）以外の他のモノマーを含む場合には、該モノマーは、親水性基又は疎水性基により置換された側鎖を有するアクリル官能基又はビニル官能基を有するモノマーである。特に、側鎖の親水性基又は疎水性基は、ＰＣＴ公報ＷＯ２００８／０５８９６３の請求項３及び４に定義されるものから選択されてよく、その請求項の内容は参照により援用される。

有利には、Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ又はメチル基から選択される。より有利には、Ｒ_１及び／又はＲ_２は水素原子である。

また、有利には、Ｘは酸素原子である。

また、有利には、Ｙはウレタン基（−ＯＣＯＮＨ−）である。

「グリコシド基」は、糖を含む任意の基を意味することを意図する。Ｒ_３及び／又はＲ_４に有利なグリコシド基は、特に：
単糖若しくは二糖、又は
アミノ化された単糖若しくは二糖である。

「単糖（「ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」又は「ｏｓｅ」）」は、加水分解できない炭水化物モノマーを意味することを意図する。有利には、単糖は、ヘキソース（６個の炭素原子を有する単糖）から選択され、特に、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、アルトロース、イドース又はマルトースから選択される。

「二糖（「ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」又は「ｄｉｈｏｌｏｓｉｄｅ」）」は、化学的経路（熱濃酸の使用）又は酵素的経路により加水分解可能なグリコシド結合（ｌｉａｉｓｏｎ ｏｓｉｄｉｑｕｅ）により結合された２つの単糖から形成された糖を意味することを意図する。有利には、二糖は、ラクトース（ガラクトースβ（ｌ→４）グルコース）、セロビオース（グルコースβ（ｌ→４）グルコース）、マルトース（グルコースα（ｌ→４）グルコース）などの、２つのヘキソースから形成されるジヘキソースから選択される。

「多糖」は、上記で定義したような単糖から選択される少なくとも２つのモノマーからなる、直鎖状又は分枝状のポリマーから構成される糖を意味することを意図し、ある種のアミロースなど、２０単位に達し得る。従って、多糖という用語には、二糖（又は二単糖（ｄｉｏｓｅｓ））、三糖（又は三単糖（ｔｒｉｏｓｅｓ））など、最大２０の単糖単位が含まれる。好ましくは、単糖単位は、上記で定義したようなヘキソース単位である。

「アミノ化された単糖、二糖又は多糖」は、１つ以上のアルコール官能基（−ＯＨ）が、アミン（−ＮＨ_２）で置換されている、上記で定義したような任意の単糖、二糖又は多糖を意味することを意図する。グルコサミン、ガラクトサミン、フルクトサミン又はマンノサミンをアミノ化された単糖の例として挙げることができ、アミノラクチトールをアミノ化された二糖の例として挙げることができる。

単糖又は二糖は、特に、グルコース、マンノース、ガラクトース、ラクトース、アロース、アルトロース、イドース、ラクトース、マルトース又はセロビオースのタイプのモノヘキソース又はジヘキソースが特に好ましく；グルコース、マンノース及びガラクトースが特に好ましく、とりわけグルコースが好ましい。

これらのグリコシド基は、特にＸが酸素原子である場合には、アノマー炭素の酸素を介して（Ｏグリコシル化）、又は１位の（ｐｒｉｍａｉｒｅ）ヒドロキシルの酸素を介して（エステル結合）、又はアミノ化された官能基を介して（アミド結合）、又は最後はニトリド基を介して（ヒドロキシル基の置換でアノマー炭素が予め提供されている）、グラフトされる。後者の場合、糖は、予めＸ官能基（この特定例では酸素原子である）上にグラフトされたプロパルギル官能基でのホイヘンス反応（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｄｅ Ｈｕｙｇｅｎｓ）により導入される。有利には、グリコシド基は、アノマー炭素の酸素を介してグラフトされる（Ｏグリコシル化）。

「双性イオン残基」は、非近接原子上に通常位置する、反対符号の一単位の形式電荷を有する基を意味することを意図する。これらの化合物は、同時に正電荷と負電荷とを有し、極性溶媒である水に高溶解性である。有利な双性イオン残基は、例えば、単純な（ｓｉｍｐｌｅｓ）ベタイン（特に、−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２Ｃ（ＣＨ_２）_ｉＣＯ_２ ⁻、−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２Ｃ（ＣＨ_２）_ｉＳＯ_３ ⁻ Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２Ｃ（ＣＨ_２）_ｉＯＳＯ_３ ⁻タイプのものであって、式中、ｉは１と１０の間に含まれる）、又はアミノ酸官能基（特にリジン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）から生じ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_ｊ−（式中、ｊは２と５の間に含まれる）などの重合可能なアクリル基を提供する。

有利な実施態様において、Ｒ_３及び／又はＲ_４は、グリコシド基、好ましくは単糖若しくは二糖又はアミノ化された単糖若しくは二糖、有利には単糖若しくは二糖である。好ましくは、単糖又は二糖は、モノヘキソース又はジヘキソースであり、特にグルコース、マンノース、ガラクトース、ラクトース、アロース、アルトロース、イドース、ラクトース、マルトース又はセロビオースタイプであり、有利にはグルコース、マンノース又はガラクトースであり、再度好ましくはグルコースである。

有利には、Ｒ_５は、５〜１６個の炭素原子を含む、飽和又は不飽和（１つ以上不飽和）の、有利には直鎖状及び／又は飽和の、環式炭化水素鎖（Ｒ_５は、特にシクロヘキサン又はシクロペンタンタイプの、１つ又は２つの飽和環又は不飽和環を含んでよい）又は非環式炭化水素鎖（直鎖状又は分枝状）である。好ましくは、Ｒ_５は、Ｃ_５−Ｃ_１６アルキル基、好ましくはＣ_８−Ｃ_１２アルキル基、特にＣ_１１アルキル基であり、有利には直鎖状である。

より正確には、本発明の有利なポリマーは、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はさらには１００％の式（ＩＩ）：

［式中、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基（好ましくはメチル）から選択され、
Ｒ_３及びＲ_４は、上記で定義したとおりのグリコシド基であり、
Ｒ_５は、上記で定義したとおりの５〜１６個の炭素原子を含む、飽和又は不飽和（１つ以上不飽和）の、環式炭化水素鎖（Ｒ_５は、特にシクロヘキサン又はシクロペンタン又は芳香族タイプの、１つ又は２つの飽和環又は不飽和環を含んでよい）又は非環式炭化水素鎖（直鎖状又は分枝状）である］
の両親媒性モノマーを含む。

有利には、Ｒ_３及びＲ_４は、同一又は異なって、好ましくは同一の、単糖又は二糖であり、好ましくはモノヘキソース又はジヘキソースであり、特にグルコース、マンノース、ガラクトース、ラクトース、アロース、アルトロース、イドース、ラクトース、マルトース又はセロビオースタイプであり、好ましくはグルコース、マンノース又はガラクトースであり、有利には、Ｒ_３及びＲ_４はグルコースである。

有利には、Ｒ_５は、Ｃ_５−Ｃ_１６アルキル、好ましくはＣ_８−Ｃ_１２アルキル、特にＣ_１１アルキルであり、好ましくは直鎖状である。

有利な実施態様において：
− Ｒ_３及びＲ_４は同一であって、グルコース、マンノース又はガラクトース、好ましくはグルコースを表し、且つ
− Ｒ_５は、Ｃ_５−Ｃ_１６アルキル、好ましくはＣ_８−Ｃ_１２アルキル、特にＣ_１１アルキルであり、有利には直鎖状である。

本発明の特に有利なポリマーは、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はさらには１００％の式（ＩＩＩ）：

の両親媒性モノマーを含む。

上記で定義したとおりの式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のモノマーは、１つの疎水性脂肪鎖と２つの親水性基（グリコシド基又は双性イオン残基）とを含むアクリル又はビニル単位を有するモノマーである。これらは、グリコシル化、アミド化反応などの当業者に周知の化学的反応により、又はイソシアネートの使用を介して、合成されてよい。式（ＩＩＩ）のモノマーの合成は、実施例に詳細に記載する。グルコースの代わりにガラクトース又はマンノースをグラフトするため、及び／又は別のタイプの脂肪鎖、特に任意の他のアルキル鎖をグラフトするために、完全に同等の合成経路を使用してよい。

本発明のポリマーは、主に両親媒性モノマーを含む。有利な実施態様において、本発明のポリマーは、均一な鎖を形成する、上記で定義したとおりの式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のモノマーを１００％含むホモポリマーであって、鎖の端で別の基と結合されていてもよい。

実際に、本発明のポリマーは、最低でも６０℃まで加熱された、ＴＨＦ、アセトニトリル、他にメタノールなどの無水溶媒中（好ましい溶媒はＴＨＦである）、ＡＩＢＮ、過酸化ベンゾイルなどのラジカル開始剤により開始される重合により調製されてよい。有利には、合成の間のポリマーサイズは、チオールタイプの連鎖移動剤の添加により調節され、モノマーに対する連鎖移動剤の濃度比によりポリマーサイズが調節される。この移動剤の存在による第二の利点（ｉｎｔｅｒｅｔ）は、特定の特性のために使用され得る特定の基を、鎖末端に導入することが可能となることである。従って、この場合には、本発明のポリマーは、ポリマー鎖の端に特定の基を含む。従って、本発明のホモポリマーについて言及する場合、この言及は、連鎖移動剤に由来する特定の異なる基がポリマー鎖の端に存在する可能性を含み、結果としてホモポリマーは修飾され得る。

特に、本発明のポリマーは、式Ｒ_９−Ｓ−のチオール官能基を含む基を鎖の端（すなわち、鎖末端の１つ）にさらに含んでよく、式中、Ｒ_９は、有利には、以下から選択される：
−（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨ（ｍ＝１〜１１）、
−（ＣＨ_２）_ｍ−ＮＨ_２（ｍ＝２〜１１）、
−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｘ−Ｒ_１０（ｍ＝１〜１１であり、Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ、Ｓ、ホスホネートＰ（Ｏ）（Ｏ−Ｒ_１０）_２であり、Ｒ_１０は、Ｈ、ＣＨ_３、ベンゾイル基又はベンジル基、蛍光剤（ＮＢＤ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、ビオチン、ヘキソースを含む直鎖状又は分枝状の多糖（特に三糖）、フリーラジカル捕捉剤（ニトロン、ニトロキシドタイプの環状の常磁性種など）から選択される）、
−（ＣＨ_２）ｍ−ＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_ｐＳ−Ｒ_１１（ｍは１と１０の間に含まれ、ｐは２と１１の間に含まれ、Ｒ_１１は、Ｈ、−Ｃ（Ｃ_６Ｈ_５）_３、蛍光剤（ＮＢＤ、フルオレセインなど）、フリーラジカル捕捉剤（ニトロン、ニトロキシドタイプの環状の常磁性種など）、アクリル系又はビニル系モノマー（メチルアクリレート、アクリルアミド、ＴＨＡＭ、ビニルアセテートなど）のオリゴマー誘導体から選択される）、
−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｐＳ−Ｒ_１１（ｍは１と１０の間に含まれ、ｘは３と１００の間に含まれ、ｐは２と１１の間に含まれ、Ｒ_１１は上記で定義したとおりである）、
−（ＣＨ_２）_２−（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−Ｒ_１０（ｑ＝１〜１００であり、Ｒ_１０は上記で定義したとおりである）、
−（ＣＨ_２）_ｒＣＯＮＨＣ（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_３、−ＣＨ_２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_２、又はＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_２（ｒは１と１１の間に含まれ、Ｒ_１２は、Ｈ、ベンジル基又はベンゾイル基、蛍光剤（ＮＢＤ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、ビオチン、単糖又は直鎖状若しくは分枝状の多糖（アミノ化されていてもよく、好ましくは、マンノース、ガラクトース、グルコース、シアル酸、グルコサミン、ガラクトサミン及び／又はマンノサミンのモノマーからなる）、フリーラジカル捕捉剤（ニトロン、ニトロキシドタイプの環状の常磁性種など）から選択される）、
−（ＣＨ_２）_ｍＰ（Ｏ）（ＯＲ_１３）_２（ｍは２と１１の間に含まれ、Ｒ_１３は、置換されていてもよい直鎖状Ｃ_１〜Ｃ_１６アルキル基を表す）、
−特に１つ以上のＯＨ基で置換されていてもよい、３〜２０個の炭素原子を含む直鎖状の飽和又は不飽和炭化水素鎖（有利には１つ以上のＯＨ基で置換されていてもよい、直鎖状Ｃ_３−Ｃ_２０アルキル基又は直鎖状Ｃ_３−Ｃ_２０アルケニル基（例えばフィトールなど））、又は
−全フッ素置換鎖である式Ｃ_ｔＦ_２ｔ＋１（ＣＨ_２）_ｍ（ｔは２と１０の間に含まれ、ｍは２と１０の間に含まれる）。

これらのチオールタイプの化合物はすべて、商業的に入手可能であるか、又は単純で高収率な化学反応により容易に調製されるかのいずれかである。

「直鎖状Ｃ_３−Ｃ_２０アルケニル」は、３〜２０個の炭素原子と少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖状炭化水素鎖を意味することを意図する。

有利には、Ｒ_９は、−（ＣＨ_２）_ｒＣＯＮＨＣ（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_３、ＣＨ_２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_２又は−ＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_２（ｒは１と１１の間に含まれ、Ｒ_９は、Ｈ、ベンジル基又はベンゾイル基、蛍光剤（ＮＢＤ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、ビオチン、又は単糖又は直鎖状若しくは分枝状の多糖であって、アミノ化されていてもよく、好ましくはマンノース、ガラクトース、グルコース、シアル酸、グルコサミン、ガラクトサミン及び／又はマンノサミンのモノマーの化合物を表す。

特に好ましい連鎖移動剤は、Ｒ_９が（ＣＨ_２）_２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ_２ＯＨ）_３であるものである。

本発明のポリマーが、式（Ｉ）のモノマーを１００％含む場合、結果として式（ＩＶ）：

（式中、Ｒ_１〜Ｒ_５及びＲ_９は上記で定義したとおりであり、ｎは、ポリマーが、８００と１００，０００の間（ｎが１と１２０の間に含まれる場合に相当）、有利には５０，０００以下（ｎは６０以下）、好ましくは８０００と５０，０００の間（ｎは１と６０の間に含まれる）の平均モル質量を有するようなものである）
のポリマーとなる。

本発明のとりわけ好ましいポリマーは、式（Ｖ）：

（式中、ｎは１と１２０の間、好ましくは１と６０の間に含まれる）
のポリマーである。

本発明は、少なくとも６０℃で、無水溶媒中、ラジカル開始剤の存在下で、上記の式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のモノマーと連鎖移動剤とを反応させる工程を含む、本発明の両親媒性ポリマーの調製方法にも関する。

連鎖移動剤は、チオールタイプの化合物、好ましくは式（ＶＩ）：
Ｒ_９−ＳＨ （ＶＩ）
（式中、Ｒ_９は上記で定義したとおりである）
の化合物である。

ラジカル開始剤は、特に、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）又は過酸化ベンゾイルであってよい。

本発明は、疎水性又は両親媒性化合物、有利には膜タンパク質と本発明の両親媒性ポリマーとの水溶性複合体にも関する。有利には、膜タンパク質は、膜酵素、膜受容体、膜イオンチャネル、膜抗原（微生物又は腫瘍のもの）、及び医薬タンパク質（特に抗体など）からなる群から選択される。さらに、本発明の複合体は、凍結又は凍結乾燥形態であってよい。

本発明は、本発明の１つ以上の複合体を、１ｇ／Ｌ超、有利には２ｇ／Ｌ超、３ｇ／Ｌ超又は４ｇ／Ｌ超、好ましくは５ｇ／Ｌ超、６ｇ／Ｌ超、７ｇ／Ｌ超、８ｇ／Ｌ超、９ｇ／Ｌ超又は１０ｇ／Ｌ超の濃度で有する水溶液にも関する。該濃度は、有利には５００ｇ／Ｌ未満である。好ましくは、溶液の濃度は、１０ｇ／Ｌと５００ｇ／Ｌの間である。

本発明は、支持体と、少なくとも１つの本発明の複合体とを含む製品であって、該複合体が、本発明の両親媒性ポリマーを介して該支持体上に固定されている製品にも関する。

最後に、本発明は、生物学的サンプル中の前記疎水性又は両親媒性化合物のリガンドの存在又は不在を検出するための、本発明の複合体、水溶液又は製品の使用に関する。

図１には、両親媒性テロマー粒子のサイズ及び分散度について、分子篩濾過による推定を示す。ホモテロマーの保存溶液１００μＬ（バッチＳＳ１７４）を９００μＬのトリス／ＨＣｌバッファー（２０ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．５）で希釈し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０−３００ＧＬカラムに注入した。トリスバッファーで溶出を行い、２２０ｎｍで検出した。Ｖｏ及びＶｒは、それぞれ、カラムの排除体積及び全体積を示す（それぞれ、７．５３及び１９．９ｍＬ）。見かけのストークス半径は２．６ｎｍである。比較のために、従来のアニオン性アンフィポルＡ８−３５タイプのサンプルを同一条件で分析した（バッチＦＧＨ２０）。Ａ８−３５粒子の見かけのストークス半径は、３．１５ｎｍである。 図２には、ｔＯｍｐＡ／両親媒性テロマー複合体のサイズ及び分散度について、分子篩濾過による推定を示す。バクテリア大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡの膜貫通ドメイン（ｔＯｍｐＡ）を、１：４（中心のピーク）又は１：１０（右側のピーク）の２つの異なるタンパク質／ポリマー質量比で、両親媒性ホモテロマーにより捕捉し、トリス／ＨＣｌバッファー（２０ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．５）で希釈したサンプルをＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０−３００ＧＬカラムに注入した。トリスバッファーで溶出を行い、２８０ｎｍで検出した。ピークは、同一の最大値に対して正規化されている。Ｖｏ及びＶｒは、それぞれ、カラムの排除体積及び全体積を示す。比較のために、従来のアニオン性アンフィポルＡ８−３５タイプで捕捉したｔＯｍｐＡのサンプルを同一条件で分析した（左側のピーク）。溶出量は、左から順に、１１．９、１２．２及び１２．６ｍＬである：半分の高さ（ｍｉ−ｈａｕｔｅｕｒ）のピーク幅は、それぞれ、１．００、１．１３及び０．８９ｍＬである。 図３には、Ａ８−３５又は非イオン性ホモテロマーで捕捉した後のバクテリオロドプシンのＵＶ／可視吸収スペクトルを示す。１：５のタンパク質／アンフィポル質量比でＢＲを捕捉した。アンフィポルは、Ａ８−３５（バッチ５ＦＧＨ２０；黒）又は非イオン性ホモテロマー（バッチＳＳ１７４：グレー；バッチＳＳ２９８：黒破線）のいずれかである。洗剤を除去した直後にスペクトルを記録した（ＢｉｏＢｅａｄｓとともに４℃で２時間インキュベートし、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離）。

実施例１：両親媒性ホモポリマーの調製
１．１ ジグルコシル化アクリルアミドモノマーの合成：Ｎ−（１．１−ジ（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシメチル）−１−（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）メチル）アクリルアミドの実施例
残りの実施例で使用するモノマーを生産する第一の方法では、市販のＴＨＡＭ（トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタンから９０％超の収率で得られうる）から下記スキーマ１に従い、３つの工程で合成を行う。

スキーマ１：ジグルコシル化アクリルアミドモノマーを合成する第一の方法
試薬及び反応条件：ａ）（ＣＨ_３）_２Ｃ（ＯＣＨ_３）_２、ＣＨ_３ＣＮ、ａｐｔｓ、２０°、Ｒ＝８０％；ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１０ＮＣＯ、ＤＡＢＣＯ、トルエン、８０℃、Ｒ＝９８％；樹脂ＭＫ−１０、４８時間、ＣＨ_２Ｃ１_２、８４％）；ＨｇＣＮ２、ドライエライト、トルエン、アセトブロモグルコース（３当量）、）））、ｒ＝６３％。

イソプロピリデンＴＨＡＭの合成
初めに、周囲温度で、アセトニトリル中、触媒量のパラトルエンスルホン酸の存在下で、ＴＨＡＭをジメトキシプロパンで２４時間処理することにより、イソプロピリデン基の形態で２つのヒドロキシル官能基をブロックする。通常の処理後、イソプロピリデンＴＨＡＭは結晶化し、８０％の収率で単離される。

５−アクリルアミド−５−ウンデシルカルバモイルオキシメチル−２，２ジメチル−シクロール，３ジオキサへキサン
イソプロピリデンＴＨＡＭ（２．６４ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ、１．０当量）及び１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタンＤＡＢＣＯ（４．０５ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ、１．２当量）を無水トルエンに溶解し、混合物をアルゴン下で３０分間加熱還流する。ドデシルイソシアネート（２．９１ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ、１．２当量）のトルエン溶液を、８０℃に維持した溶液に滴下する。１２時間撹拌した後、５滴のメタノールを添加し、混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）中に投入する。有機相を１Ｎ ＨＣ１（３×１００ｍＬ）及びＮａＣｌ飽和溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮して、カルバメート基により結合されたウンデシル鎖を備えるイソプロピリデンＴＨＡＭ化合物を白色粉末の形態で得る（５．０ｇ、１２．１２ｍｍｏｌ、９８％）。Ｒ_ｆ約０．７、酢酸エチル／シクロヘキサン（７：３ ｖ／ｖ）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１_３δ７．０１（ｓ，１Ｈ），６．２１（ｄｄ，Ｊ＝１．６及び１７．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｄｄ，Ｊ＝１０．０及び１７．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｄｄ，Ｊ＝１．６及び１０．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９９（ｍ，１Ｈ），４．７２（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２０（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，３Ｈ），１．２７（ｓ，１８Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１_３δ１６５．７，１５７．６（ＣＯ），１３１．４（ＣＨ），１２６．５（ＣＨ_２），９８．５（Ｃ），６４．９，６０．５（ＣＨ_２），５３．５（Ｃ），４３．０，４１．３，１０ ３１．９，３１．３，２９．８，２９．６，２９．６，２９．５，２９．３，２６．７（ＣＨ_２），２６．６（ＣＨ_３），２２．７（ＣＨ_２），２１．０，１４．１（ＣＨ_３）。

Ｎ−（１，１−（２’，３’，４’，６’テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−メチル）−１−（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）−メチル）−アクリル−アミド
上記化合物（５．０ｇ、１２．１２ｍｍｏｌ）及び樹脂ＭＫ−１０（３０ｇ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）中、４８時間撹拌し、次いで短いセライトカラムで樹脂を濾過し、メタノール（２×１００ｍＬ）ですすぐ。有機相を減圧下で濃縮して、Ｎ−（１，１−ビスヒドロキシメチル−１−（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）メチル）−アクリルアミド（３．８ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、８４％）を得る。この化合物（２．０ｇ、５．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）、シアン化水銀（２．１３ｇ、１６．１０ｍｍｏｌ、３．０当量）及びドライエライトをアルゴン下、トルエン中で混合する。２分間超音波処理をした後、ブロモテトラアセチルグルコースＴＡＧＢ（６．６２ｇ、１６．１０ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、混合物を３０分間超音波処理に供する。次いで、反応混合物をセライトで濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）ですすぐ。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和溶液（２×１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、１０％ヨウ化カリウム溶液（４×５０ｍＬ）、チオ硫酸塩飽和溶液（４×５０ｍＬ）及び水（２×５０ｍＬ）で連続して洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮し、得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーに供し、酢酸エチル／シクロヘキサン（３：７ ｖ／ｖ）で溶出して、所期のモノマーを白色粉末の形態で得る（３．５ｇ、３．３９ｍｍｏｌ、６３％）。Ｒ_ｆ約０．３５、酢酸エチル／シクロヘキサン（７：３ ｖ／ｖ）。Ｍｐ＝５８．０℃。［α_Ｄ ^２５］＝−１２．７０（ｃ，１，ＣＨ_２Ｃ１_２）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１_３）δ６．９２（ｓ，１Ｈ），６．２４（ｄｄ，Ｊ＝１．４及び１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｄｄ，Ｊ＝１０．０及び１６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄｄ，Ｊ＝１．４及び１０．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３−４．９（ｍ，７Ｈ），４．５（ｍ，２Ｈ），４．４−３．９（ｍ，１０Ｈ），３．７１（ｄｔ，Ｊ＝２．４及び７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．１６（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１１，２．０７，２．０５，２．０２（５ｓ，２４Ｈ），１．３４（ｍ，１８Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１７０．８，１７０．７，１７０．７，１７０．２，１６９．６，１６９．５，１６９．５，１６９．５，１６５．７，１５７．２（ＣＯ），１３１．３（ＣＨ），１２６．６（ＣＨ_２），１０１．０，１００．８，７７．３，７２．６，７２．５，７１．８，７１．８，７１．１，６８．３，６８．２，（ＣＨ），６８．６，６８．３，６８．０，６４．５，６１．７，６０．４（ＣＨ_２），５９．６（Ｃ），４１．２，３１．９，２９．８，２９．６，２９．３，２６．８，２６．８，２２．７（ＣＨ_２），２１．１，２０．８，２０．８，２０．７，２０．７，２０．６，２０．６，２０．６，１４．２（ＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ_４７Ｈ_７２Ｎ_２Ｏ_２３について計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）：１０３３．４５９９ 実測値：１０３３．４６０９［Ｍ＋Ｈ］＋。

別法として、アクリルアミドモノマー（Ｎ−（１，１−ジ（−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシメチル）−１−（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）メチル）アクリルアミド）の合成を、市販のＴＨＡＭ（トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタンから９０％超の収率で得られうる）から下記スキーマ１に従い、２つの工程で行う。

スキーマ２：ジグルコシル化アクリルアミドモノマーを合成する第二の方法
試薬及び反応条件：ａ）ＴＨＡＭ（５当量）、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１０ＮＣＯ（１当量）、ＤＡＢＣＯ（０．５当量）、ＤＭＦ、６０℃、３Ｈ、Ｒ＝８０％；ｂ）ＨｇＣＮ_２、ドライエライト、トルエン、アセトブロモグルコース（３当量）、）））、ｒ＝６３％

Ｎ−１，１−ジ（ヒドロキシメチルメチル）−１（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）−メチル）アクリルアミド
６０℃まで加熱した４０ｍＬのＤＭＦ中、ＴＨＡＭ（２１．９ｇ、１２５ｍＭｏｌ、５当量）及びジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）（１．５ｇ、１３．４ｍＭｏｌ、０．５当量）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下、１０ｍＬの塩化メチレンに予め可溶化したウンデシルイソシアネート（５ｇ、２５ｍＭｏｌ、１当量）を滴下する。ウンデシルイソシアネートが完全に消失するまで、反応混合物を６０℃で維持する（約３０分間）。次いで、減圧下で溶媒を留去し、沈殿を２００ｍＬの塩化メチレンで回収する。懸濁液を周囲温度で１５分間機械的に撹拌する。残った沈殿を濾過し、再度１００ｍＬの塩化メチレン懸濁物中に回収し、次いでもう一度濾過する。この操作を２回繰り返す。残った沈殿を無水メタノールですぐに再結晶化して、１６．５ｇのＴＨＡＭを得、これは再度反応に置くことができる。有機相を合わせ、２×５０ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液、２×５０ｍＬの炭酸ナトリウム飽和溶液及び２×５０ｍＬの水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。２／８のＡｃＯＥｔ／ヘキサン溶液中で粗生成物を結晶化して、Ｎ−１，１−ジ（ヒドロキシメチルメチル）−１（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）−メチル）アクリルアミドを白色粉末の形態で得る（７．５５ｇ、Ｒ＝８０％）。Ｒ_ｆ約０．５（酢酸エチル／シクロヘキサン（８：２ ｖ／ｖ）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６）δ７．５６（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝５，１Ｈ），６．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０及び１７．５Ｈｚ，２５ １Ｈ），６．０４（ｄｄ，Ｊ＝２．２及び１７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．５６（ｄｄ，Ｊ＝２．２及び１０Ｈｚ，１Ｈ），４．８７（ｍ，２Ｈ），４．１７，（ｓ，２Ｈ），３．６３（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｓ，２Ｈ），２．９５（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｍ，１６Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．７５，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６）δ１６６．５，１５６．８，１３２．８，１２５．５（ＣＯ），６２．６，６１．５，６０．４（ＣＨ_２），３１．８，２９．９，２９．５，２９．２，２９．３，２６．７，２２．６，１４．５（ＣＨ_３）。

Ｎ−（１，１−（２’，３’，４’，６’テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−メチル）−１−（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）−メチル）−アクリル−アミド
上記化合物（２．０ｇ、５．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）、シアン化水銀（２．１３ｇ、１６．１０ｍｍｏｌ、３．０当量）及びドライエライトをアルゴン下、トルエン中で混合する。２分間超音波処理した後、ブロモテトラアセチルグルコースＴＡＧＢ（６．６２ｇ、１６．１０ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、混合物を３０分間超音波処理に供する。次いで、反応混合物をセライトで濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）ですすぐ。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和溶液（２×１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、１０％ヨウ化カリウム溶液（４×５０ｍＬ）、チオ硫酸塩飽和溶液（４×５０ｍＬ）及び水（２×５０ｍＬ）で連続して洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮し、得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーに供し、酢酸エチル／シクロヘキサン（３：７ ｖ／ｖ）で溶出して、所期のモノマーを白色粉末の形態で得る（３．５ｇ、３．３９ｍｍｏｌ、６３％）。Ｒ_ｆ約０．３５、酢酸エチル／シクロヘキサン（７：３ ｖ／ｖ）。Ｍｐ５８．０°Ｃ。［α_Ｄ ^２５］＝−１２．７０（ｃ，１，ＣＨ_２Ｃ１_２）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１_３）δ６．９２（ｓ，１Ｈ），６．２４（ｄｄ，Ｊ＝１．４及び１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｄｄ，Ｊ＝１０．０及び１６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄｄ，Ｊ＝１．４及び１０．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３−４．９ １５（ｍ，７Ｈ），４．５（ｍ，２Ｈ），４．４−３．９（ｍ，１０Ｈ），３．７１（ｄｔ，Ｊ＝２．４及び７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．１６（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．１１，２．０９，２．０７，２．０５，２．０２（５ｓ，２４Ｈ），１．３４（ｍ，１８Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１７０．８，１７０．７，１７０．７，１７０．２，１６９．６，１６９．５，１６９．５，１６９．５，１６５．７，１５７．２（ＣＯ），１３１．３（ＣＨ），１２６．６（ＣＨ_２），１０１．０，１００．８，７７．３，７２．６，７２．５，７１．８，７１．８，７１．１，６８．３，６８．２，（ＣＨ），６８．６，６８．３，６８．０，６４．５，６１．７，６０．４（ＣＨ_２），５９．６（Ｃ），４１．２，３１．９，２９．８，２９．６，２９．３，２６．９，２６．８，２６．８，２２．７（ＣＨ_２），２１．１，２０．８，２０．８，２０．７，２０．７，２０．６，２０．６，２０．６，１４．２（ＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ_４７Ｈ_７２Ｎ_２Ｏ_２３の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）：１０３３．４５９９実測値：１０３３．４６０９［Ｍ＋Ｈ］＋。

１．２ ＮＡＰｏｌの合成
テロマーの合成（スキーマ３）は、ポリベンゾイル化されたトリス基を有するメルカプトプロピオン酸誘導体移動剤の使用による。これらの異なるベンゾイル基は、強いＵＶ吸収を有し、ポリマー鎖の末端に位置する。結果として、それらは、最終生成物のＵＶ吸収を測定することによる、テロマー質量の正確な測定、ひいては平均重合度の正確な測定を可能にする。ここで、トリベンゾイル化官能基の選択は、関心のある官能基（フルオレセイン、コレステロール、ビオチン、ニトロンなど）の導入（使用した移動剤の特性による）、すなわち鎖末端官能化の可能性の一例としてみなしてよいことに留意すべきである。この官能化は、テロゲンに予め導入された活性エステル型基の中間体（ヒドロキシスクシンイミド、パラニトロ−ベンゾアート、ペンタフルオロ−ベンゾアートなど）を介したテロ重合（ｔｅｌｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）の後に行うこともできる。

ＮＡＰｏｌの合成は以下のスキーマ３に続く：

スキーマ３：ホモテロマー合成の略図
試薬及び条件：（ａ）ＡＩＢＮ（０．５当量）、ＴＨＦ、Ａｒ、６６℃、２４ｈ、約５１％；（ｂ）ＭｅＯＮａ、ＭｅＯＨ、ｐＨ＝８〜９、周囲温度、１２ｈ、約６５％（透析後）。

モノマーＴＨＡＭ、Ｎ−（１，１−（２’，３’，４’，６’テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ−メチル）−１−（ウンデシルカルバモイルオキシメチル）−メチル）−アクリル−アミド（１．０ｇ、０．９６８ｍｍｏｌ、４０．０当量）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解する。溶液をアルゴンバブリングにより脱気し、３０分間加熱還流する。次いで、ＴＨＦに溶解したテロゲン剤ＴＡ（１２．６２ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、１．０当量）（その合成は、以前に記載されている（Ｓｈａｒｍａら））及びＡＩＢＮ（１．９８ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、０．５当量）をマイクロシリンジで添加する。モノマーが完全に消失するまで、反応混合物を還流状態で撹拌する（約２４時間）。次いで、減圧下で濃縮し、粗テロマーをサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０）により、ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２混合物（１：１，ｖ／ｖ）で溶出することにより単離し、次いで減圧下で乾燥する。保護形態のテロマーが白色粉末の形態で単離される（０．５２４ｇ、５２％）。Ｒ_ｆ＝０．０酢酸エチル／シクロヘキサン（６：４ ｖ／ｖ）。^１Ｈ ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３δｐｐｍ）０．８（アルキル鎖の−ＣＨ_３），１．３−１．７（アルキル鎖の（−ＣＨ_２）_１０，２．１−２．４（ｂｒｏａｄ ｓ，−ＯＣＯＣＨ_３），３．１（−ＮＨ− 隣接メチレン），４．８−５．３（ｍ，グルコース単位 ２Ｈ，３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，及び６Ｈ），６．６（−ＮＨ），７．４−８．１（３つのｔ，ＴＡのＣ_６Ｈ_５）。

^１Ｈ ＮＭＲ及びＵＶによりモル質量を決定した後、ホモテロマー（２．０ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で無水メタノール（５０ｍＬ）に溶解する。触媒量のナトリウムメトキシドＭｅＯＮａを添加し、溶液を周囲温度で一晩撹拌する。次いで、溶液を酸性樹脂ＩＲＣ５０で、１５分間撹拌することにより（ｐＨ＝８まで）中和する。樹脂を濾過し、溶媒留去した後、カットオフポイントが６〜８ｋＤａである膜でテロマーを透析する。精製したポリマーを凍結乾燥により単離し、該ポリマーを白色粉末の形態で得る（０．８５０ｍｇ、６５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６，δｐｐｍ）０．８（アルキル鎖の−ＣＨ_３），１．２−１．６（アルキル鎖の（−ＣＨ_２）_１０），３．２（−ＮＨ−隣接メチレン），４．８−５．２（ｍ，グルコース単位 ２Ｈ，３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，及び６Ｈ），７．１（−ＮＨ）。

開発された技術は普遍的であり、種々の糖（特にガラクトース及びマンノース）を有するモノマー官能基及びフッ素化炭素鎖を有するモノマーに適用でき、既に適用されている。さらに、親水性モノマーと疎水性モノマーとの混合物について本発明者らが以前に立証したように、この技術は、両親媒性であるか、疎水性であるか、又は親水性であるかに関わらず、各種モノマーを組み込んだコテロマーに容易に拡張することができる。

実施例２：得られたホモテロマーの再現性
モノマー及びテロゲン剤ＴＡの相対量の関数として、異なるホモテロマーを合成した。合成条件及び合成されたホモテロマーの化学構造を表１に要約する。

表１：種々のＮＡＰｏｌの合成条件及び化学構造

さらに、同一の前駆体及び同一条件で、複数の異なるバッチを介してＳＳ２９８及びＳＳ３２５を合成した。ＳＳ２９８バッチの再現性分析を以下の表２に示す。

表２：ＳＳ２９８バッチの再現性

これらの結果から、本発明の両親媒性ホモテロマーバッチの良好な再現性が示される。

実施例３：ホモテロマーの特徴付け及び物理化学的性質
実施例３及び４において、本発明の新規両親媒性ホモテロマーを、下記式のコポリマーアニオン性アンフィポルである参照アンフィポルＡ８−３５と比較する：

スキーマ４：アンフィポルＡ８−３５の化学式

実施例１で調製した本発明の両親媒性ホモテロマーはすべて、エステル官能基の加水分解後に、１００ｇ／Ｌ超の水溶解度を有する。溶液は無色で、激しく撹拌した後わずかに泡立つ。表面張力測定によっては、いずれの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）も臨界凝集濃度（ＣＡＣ）も検出できず、これにより、参照アンフィポルＡ８−３５に関しては、ＣＡＣが極めて低いことが示される。小角中性子散乱測定（ＳＡＮＳ；示さず）及び分子篩濾過（ＳＥＣ；図１）は、このタイプのテロマーが水溶液中で合わさって、５０ｋＤａのオーダーの総質量を有する粒子を形成することを示しており、これは、２つのテロマー分子の会合に実質的に相当し、従来のＡ８−３５タイプのアンフィポルで以前に測定された値（約４０ｋＤａ）と近い。有効半径は、Ａ８−３５粒子の半径と同程度（約２．６ｎｍ対約３．１５ｎｍ）であり、その分散度も同程度である（図１）。擬弾性光散乱（ＱＬＳ）により観察されるように、これらテロマー溶液は、直径５〜６ｎｍの均一サイズの粒子を形成しているようであり、これは、ＳＥＣデータと十分に一致する（表３）。粒子サイズは、濃度（表３）又は温度（表４）にあまり影響されない。

表３：異なる温度でＱＬＳにより測定された、１０、５０及び１００ｇ／Ｌの濃度での非イオン性ホモテロマーＳＳ１７４の粒径

表４：異なる温度でＱＬＳにより測定された、５０ｇ／Ｌの濃度での非イオン性ホモテロマーＳＳ２９８、ＳＳ２９３及びＳＳ２９２の粒径

このように、本発明の非イオン性両親媒性ホモテロマーの物理的／化学的性質の特徴付けは、これらのアンフィポルが、コポリマーアニオン性アンフィポルＡ８−３５の性質と類似する性質を有することを示す。

実施例４：ホモテロマーと膜タンパク質との複合体形成（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）
定義により、アンフィポルとは、洗剤の不在下において、膜タンパク質を溶解性のままにし、生化学的に安定なままにするために設計された両親媒性ポリマーである。これら２つの機能を満たす本発明の非イオン性ホモテロマーの能力を、２つのタンパク質（大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡの膜貫通領域（ｔＯｍｐＡ）及びバクテリオロドプシン（ＢＲ））で試験した。これら２つのタンパク質は、膜貫通タンパク質が取る２つの主要な構造タイプであるβバレル（ｔＯｍｐＡ）とヘリックスバンドル（ＢＲ）を代表する。さらに、ＢＲは、洗剤溶液中で比較的不安定なタンパク質であり、その変性は、補因子であるレチナールの放出によって生じる約５６４ｎｍでの吸収損失（ホロタンパク質の消失）及び３８０ｎｍでのピーク出現（遊離レチナールに起因する）により容易に測定される。

表５に要約したデータは、洗剤の濃度が、洗剤を含まないバッファーで希釈するか（ｔＯｍｐＡ）、又はポリスチレンビーズに吸着させることにより（ＢＲ）、その臨界ミセル濃度を下回った後でも、試験したホモテロマーの２つのバッチが、参照アニオン性アンフィポルＡ８−３５と事実上同程度に、溶液中、２つのタンパク質を効率的に維持することを示す：溶液中での保持率は、Ａ８−３５による複合体形成後には８９〜９８％になったのに対し、７５から９４％まで変動するが、ｔＯｍｐＡで観察された差異（約７５％対約９０％）は、おそらく、非イオン性アンフィポルとともに形成された複合体がより高密度であるために、溶液中での保持試験として使用した高速遠心分離の間にわずかな沈殿がもたらされたことに起因する。ＢＲについてはより低速を使用したが、これにより、溶液中での保持における差があまり重要でない理由が説明される（アンフィポル不在下でのタンパク質の沈殿（ライン２）はあまり完全ではない）。

表５：溶液中で膜タンパク質を保持する非イオン性テロマーの能力

ｔＯｍｐＡ及びＢＲの洗剤溶液に、指定の質量比で、バッチＳＳ１７４（４〜５）又はバッチＳＳ２９８（６〜７）のいずれかの、上記スキーマ３に記載のタイプの非イオン性ホモテロマーを添加した。２０分間インキュベートした後、ｔＯｍｐＡ溶液を、洗剤を含まないバッファーで希釈して、洗剤の濃度をｃｍｃ未満に低下させ、他方、ＢＲ溶液にはポリスチレンビーズ（ＢｉｏＢｅａｄｓ）を添加し、洗剤をそこに吸着させた。２時間インキュベートした後、溶液を２００，０００×ｇ（ｔＯｍｐＡ）又は１６，０００×ｇ（ＢＲ）で３０分間遠心分離した。上清中に存在するタンパク質画分は、２８０ｎｍ（ｔＯｍｐＡ、ＢＲ）又は５５４ｎｍ（ＢＲ）での吸収を測定することにより推定した。コントロールには、洗剤溶液中のタンパク質サンプルを、そのｃｍｃを超える濃度の洗剤溶液で希釈したもの（１）、又は洗剤を含まないバッファーで希釈したもの（２）、及びアニオン性アンフィポルＡ８−３５で捕捉する実験（３）が含まれ、これらは実験４〜７と同一条件で実施した。ｎ．ｄ．：測定せず。

予備データ（示さず）は、非イオン性ＢＲ／テロマー複合体が、ＢＲ／Ａ−３５複合体と同程度のサイズであり（ＳＥＣ）、ひいては生化学及び生物物理学での使用に適合する小さなサイズであることを示す。図２で明確に示されるとおり、非イオン性ｔＯｍｐＡ／テロマー複合体も同様である。

ＢＲに対して非イオン性ホモテロマーが悪影響を及ぼさないことは、Ａ８−３５で捕捉されたＢＲ、又は試験した２つのバッチの非イオン性ホモテロマーのそれぞれで捕捉されたＢＲのＵＶ／可視スペクトルにより説明される（図３）。３つのケースにおいて、５５４及び２８０ｎｍでの吸収の比率、並びに３８０ｎｍに有意なピークが存在しないことは、タンパク質がネイティブであって、その補因子を放出していないことを示す（バッチＳＳ１７４で捕捉されたサンプルについて、２８０ｎｍでの吸光度がわずかに高いのは、わずかな濁りに起因する）。

要約すると、実施した生化学試験により、本発明の非イオン性両親媒性ホモテロマーが、ａ）効率的に膜タンパク質を捕捉し、洗剤の不在下において、溶液中で膜タンパク質を保持し：ｂ）Ａ８−３５などのアニオン性アンフィポルとともに形成される複合体と同程度のサイズ及び分散度の小さな複合体を膜タンパク質とともに形成し：且つｃ）洗剤溶液と比較して膜タンパク質を安定させる、ことを確認することが可能になる。すなわち、これらのポリマーは、アンフィポルを作製する特性の全てを有し、アンフィポルの適用全てに役立つことができ、その非イオン性の特徴がそれらに与える更なる利点を有し、それらの合成の高い再現性を有し、テロマー鎖ごとに、決められた単一の官能基をその上にグラフトするか、又はＡ８−３５について以前に実施されたように、確率的な方法でそれらを官能化するかのいずれかが可能であるという容易性を有する。

［参考文献］
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Ｔｒｉｂｅｔ，Ｃ．，Ａｕｄｅｂｅｒｔ，Ｒ．＆ Ｐｏｐｏｔ，Ｊ．−Ｌ．（１９９６）．Ａｍｐｈｉｐｏｌｓ：ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｋｅｅｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１５０４７−１５０５０．
ＷＯ１９９８／０２７４３４
ＷＯ２００８／０５８９６３

Claims (25)

1. 式（Ｉ）：
   ［式中、
   Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ又はＣ_１−Ｃ_６アルキル基から選択され；
   Ｘ及びＹは、独立して、酸素原子、カルボニルオキシ（−（ＣＯ）Ｏ−）又はオキシカルボニル（−Ｏ（ＣＯ）−）基、ウレタン基（−ＯＣＯＮＨ−）、及び式（−ＣＯＮＲ_６−）又は（−ＮＲ_６ＣＯ−）｛式中、Ｒ_６は、水素原子又はＣ_１−Ｃ_６アルキルである｝のアミド基から選択され；
   Ｒ_３及びＲ_４は、独立して、グリコシド基から選択され；
   Ｒ_５は、５〜１６個の炭素原子を含む、飽和若しくは不飽和の、環式炭化水素鎖若しくは非環式炭化水素鎖（直鎖状又は分枝状）、又は式Ｃ_ｔＦ_２ｔ＋１（ＣＨ_２）_ｍの半フッ素化炭素鎖（式中、ｔは２と１０の間に含まれ、ｍは２と１０の間に含まれる）である］
   の両親媒性モノマーを少なくとも７５％含む両親媒性ポリマーであって、ポリマーの重量平均モル質量が、８００と１００，０００の間に含まれる、両親媒性ポリマー。
2. Ｒ_１及び／又はＲ_２が水素原子であることを特徴とする、請求項１記載の両親媒性ポリマー。
3. Ｘが酸素原子であることを特徴とする、請求項１又は２記載の両親媒性ポリマー。
4. Ｙがウレタン基（−ＯＣＯＮＨ−）であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項記載の両親媒性ポリマー。
5. Ｒ_３及び／又はＲ_４が、
   − 単糖若しくは二糖、又は
   − アミノ化された単糖若しくは二糖
   から選択されるグリコシド基であることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項記載の両親媒性ポリマー。
6. 前記単糖若しくは二糖が、グルコース、マンノース、ガラクトース、ラクトース、アロース、アルトロース、イドース、ラクトース、マルトロース及びセロビオースのタイプのモノヘキソース若しくはジヘキソースから選択されることを特徴とする、請求項５記載の両親媒性ポリマー。
7. 前記アミノ化された単糖若しくは二糖が、グルコサミン、アミノ化ガラクトース、フルクトサミン、アミノ化マンノース及びアミノラクチトールから選択されることを特徴とする、請求項５記載の両親媒性ポリマー。
8. Ｒ_３及びＲ_４がグルコースであることを特徴とする、請求項５記載の両親媒性ポリマー。
9. Ｒ_５がＣ_５−Ｃ_１６アルキル基であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項記載の両親媒性ポリマー。
10. Ｒ _５ が直鎖状Ｃ _１１ アルキル基であることを特徴とする、請求項９記載の両親媒性ポリマー。
11. 式（ＩＩＩ）：
    のモノマーを少なくとも７５％含むことを特徴とする、請求項１記載の両親媒性ポリマー。
12. 式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）の両親媒性モノマーを１００％含むことを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項記載の両親媒性ポリマー。
13. 式Ｒ_９−Ｓ−
    ［式中、Ｒ_９は、
    −（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨ（ｍ＝１〜１１）、
    −（ＣＨ_２）_ｍ−ＮＨ_２（ｍ＝２〜１１）、
    −（ＣＨ_２）_ｍ−ＯＲ_１０（ｍ＝１〜１１であり、Ｒ _１０は、Ｈ、ＣＨ_３、ベンゾイル基又はベンジル基、蛍光剤、ビオチン、ヘキソースを含む直鎖状又は分枝状の多糖、フリーラジカル捕捉剤から選択される）、
    −（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_ｐＳ−Ｒ_１１（ｍは１と１０の間に含まれ、ｐは２と１１の間に含まれ、Ｒ_１１は、Ｈ、−Ｃ（Ｃ_６Ｈ_５）_３、蛍光剤、フリーラジカル捕捉剤、アクリル系又はビニル系モノマーのオリゴマー誘導体から選択される）、
    −（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｐＳ−Ｒ_１１（ｍは１と１０の間に含まれ、ｘは３と１００の間に含まれ、ｐは２と１１の間に含まれ、Ｒ_１１は、Ｈ及び−Ｃ（Ｃ_６Ｈ_５）_３から選択される）、
    −（ＣＨ_２）_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−Ｒ_１０（ｑ＝１〜１００であり、Ｒ_１０は、Ｈ、ＣＨ_３、ベンゾイル基又はベンジル基、蛍光剤、ビオチン、アミノ化されていてもよい、単糖又は直鎖状若しくは分枝状の多糖から選択される）、
    −（ＣＨ_２）_ｒＣＯＮＨＣ（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_３、−ＣＨ_２ＣＯＮＨＣ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_２、又はＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ_２ＯＲ_１２）_２（ｒは１と１１の間に含まれ、Ｒ_１２は、Ｈ、ベンジル基又はベンゾイル基、蛍光剤、ビオチン、アミノ化されていてもよい、単糖又は直鎖状若しくは分枝状の多糖から選択される）、
    −（ＣＨ_２）_ｍＰ（Ｏ）（ＯＲ_１３）_２（ｍは２と１１の間に含まれ、Ｒ_１３は、置換されていてもよい直鎖状Ｃ_１〜Ｃ_１６アルキル基を表す）、
    −置換されていてもよい、３〜２０個の炭素原子を含む直鎖状の飽和又は不飽和炭化水素鎖、又は
    −全フッ素置換鎖である式Ｃ_ｔＦ_２ｔ＋１（ＣＨ_２）_ｍ（ｔは２と１０の間に含まれ、ｍは２と１０の間に含まれる）
    から選択される］
    のチオール官能基を含む基を鎖の端にさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項記載の両親媒性ポリマー。
14. 両親媒性ポリマーが、式（Ｖ）：
    （式中、ｎは１〜１２０の間に含まれる）
    で表されることを特徴とする、請求項１３記載の両親媒性ポリマー。
15. ｎが１と６０の間に含まれることを特徴とする、請求項１４記載の両親媒性ポリマー。
16. 少なくとも６０℃で、無水溶媒中、ラジカル開始剤の存在下で、式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）のモノマーと連鎖移動剤とを反応させる工程を含む、請求項１乃至１５のいずれか一項記載の両親媒性ポリマーの調製方法。
17. 疎水性又は両親媒性化合物と、請求項１乃至１５のいずれか一項記載の両親媒性ポリマーとの、水溶性複合体。
18. 疎水性又は両親媒性化合物が膜タンパク質であることを特徴とする、請求項１７記載の水溶性複合体。
19. 膜タンパク質が、膜酵素、膜受容体、膜イオンチャネル、微生物又は腫瘍の膜抗原、及び医薬タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８記載の水溶性複合体。
20. 医薬タンパク質が抗体であることを特徴とする、請求項１９記載の水溶性複合体。
21. 凍結形態又は凍結乾燥形態である、請求項１７乃至２０のいずれか一項記載の水溶性複合体。
22. 請求項１７乃至２１のいずれか一項記載の水溶性複合体の１つ以上を１ｇ／Ｌ超の濃度で有する水溶液。
23. 請求項１７乃至２１のいずれか一項記載の水溶性複合体の１つ以上を１０ｇ／Ｌと５００ｇ／Ｌの間の濃度で有することを特徴とする、請求項２２記載の水溶液。
24. 支持体と、請求項１７乃至２１のいずれか一項記載の水溶性複合体の少なくとも１つとを含む製品であって、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の両親媒性ポリマーを介して、水溶性複合体が支持体に固定されている、製品。
25. 生物学的サンプル中の疎水性又は両親媒性化合物のリガンドの存在又は不在を検出するための、請求項１７乃至２１のいずれか一項記載の水溶性複合体又は請求項２２若しくは２３記載の水溶液又は請求項２４記載の製品、の使用。