KR101920728B1 - ２ 이상의 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

단백질에 대한 비특이적 결합성이 현저하게 감소된 2 이상의 말단 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체 및 그를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

２ 이상의 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체 및 그의 용도{A polymer comprising a group having at least two hyroxyl or zwitterionic group and use thereof}
2 이상의 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체 및 그를 이용하는 방법에 관한 것이다.
지지체에 생물분자를 결합시키거나 그로부터 생물분자를 분리하는 방법은 알려져 있다. 예를 들면, 지지체 상에 고정화된 리간드 단백질을 포함하는 단백질 분리 장치가 알려져 있다. 그러나, 상기 방법은 상기 리간드에 특이적으로 결합하는 단백질을 분리하기 위한 것으로 결합 및 검출의 효율을 높이기 위하여는 비특적 생물분자의 결합을 방지하여야 한다.
종래 지지체와 단백질 사이의 비특이적으로 결합을 감소시키는 방법으로서, 우혈청알부민 (BSA)과 같은 차단제를 사용하여 비특이적으로 결합에 참여하는 지지체의 부위를 차단하는 것이 알려져 있다.
아크릴레이트 중합체는 중합체의 군이다. 아크릴레이트 중합체에 사용될 수 있는 아크릴레이트 모노머는 아크릴산, 메틸 메타크릴레이트, 및 아크릴로니트릴가 포함된다. 아크릴레이트 중합체에는 폴리아크릴레이트, 폴리메타아크릴레이트 및 폴리아크릴로니트릴이 포함될 수 있다. 아크릴레이트 중합체는 아크릴 엘라스토머, 아크릴 섬유, 아크릴 페이트 및 아크릴수지가 포함될 수 있다.
그러나, 생물분자의 비특이적 결합성이 낮은 2 이상의 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체에 대하여는 알려져 있지 않다.
일 구체예는 2 이상의 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체를 제공한다.
다른 구체예는 2 이상의 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체에 생물분자를 결합시키는 방법을 제공한다.
다른 구체예는 2 이상의 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기를 포함하는 중합체를 이용하여 시료 중 생물분자를 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 하기 식 M1으로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위와 M2로부터 선택된 하나 이상의 반복단위를 포함하는 중합체로서,
Figure 112011088113838-pat00001
(M1),
Figure 112011088113838-pat00002
(M2)
식 중 R1, R3, R4 및 R6은 독립적으로 단순결합 또는 치환 또는 비치환된 -C1 -6-알킬-이고, R2 및 R5는 독립적으로 H, 할로, 또는 치환 또는 비치환된 C1 -6-알킬-이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 치환된 경우 치환기는 할로 또는 C1 -3-알킬-인 기이고,
A1 및 A2는 서로 독립적으로 -NH-, -O- 또는 -O-(CO)-이고,
X 및 Y는 서로 독립적으로 -H, 2 이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, PEG 및 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 중합체가 1이상 고정화되어 있는 고체 지지체를 제공한다.
상기 중합체에 있어서, 식 M1 및 M2 중 R1, R3, R4 및 R6은 독립적으로 단순결합, 예를 들면 단순 단일결합 또는 치환 또는 비치환된 -C1 -6-알킬-, 예를 들면, -메틸-, -에틸-, -프로필-, -이소프로필-, -부틸-, -세크-부틸-, -터트-부틸-, -펜틸-, -헥실-이고, R2 및 R5는 독립적으로 H, 할로, 또는 치환 또는 비치환된 C1 -6-알킬-, 예를 들면, -메틸, -에틸, -프로필, -이소프로필, -부틸, -세크-부틸, -터트-부틸, -펜틸, -헥실이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 치환된 경우 치환기는 할로 또는 C1 -3-알킬-, 예를 들면, -메틸, -에틸, -프로필 또는 -이소프로필인 기일 수 있다. 예를 들면, 식 M1 및 M2 중 R1 및 R4는 -CH2-이고, R3 및 R6은 단순 단일결합이고, R2 및 R5는 -H일 수 있다.
상기 중합체 있어서, M1은 1-300개, 예를 들면, 1-250개, 1-200개, 1-180개, 10-300개, 10-250개, 10-200개, 10-180개, 30-300개, 30-250개, 30-200개, 30-180개, 50-300개, 50-250개, 50-200개, 50-180개, 70-300개, 90-250개, 100-200개, 또는 100-180개이고, M2는 1-300개, 예를 들면, 1-250개, 1-200개, 1-180개, 10-300개, 10-250개, 10-200개, 10-180개, 30-300개, 30-250개, 30-200개, 30-180개, 50-300개, 50-250개, 50-200개, 50-180개, 70-300개, 90-250개, 100-200개, 또는 100-180개일 수 있다.
상기 중합체에 있어서, 상기 2 이상의 히드록시를 갖는 기는 하기 식 1의 기로서,
Figure 112011088113838-pat00003
(식 1)
식 중 R7은 치환 또는 비치환 -C1 -6-알킬-, 치환 또는 비치환 -C6 -12-아릴-, -C1-6-알킬-C6 -12-아릴-, 또는 -C6 -12-아릴-C1 -6-알킬-이고, R8, R9 및 R10은 독립적으로 H, 할로, 또는 치환 또는 비치환된 C1 -6-히드록시알킬-로서 R8, R9 및 R10 중 2 이상은 상기 히드록시알킬이고, R7, R8, R9 및 R10이 치환된 경우 치환기는 할로 또는 C1 -3-알킬-인 것일 수 있다. R7 중 -C1 -6-알킬-은, 예를 들면, -메틸-, -에틸-, -프로필-, -이소프로필-, -부틸-, -세크-부틸-, -터트-부틸-, -펜틸-, 또는 -헥실-일 수 있다. R7 중 -C6 -12-아릴-은 예를 들면, -페닐-, 또는 -나프틸-일 수 있다. R8, R9 및 R10 중 C1 -6-히드록시알킬-은 -히드록시메틸-, -히드록시에틸-, -히드록시프로필-, -히드록시이소프로필-, -히드록시부틸-, -히드록시세크-부틸-, -히드록시터트-부틸-, -히드록시펜틸-, 또는 -히드록시헥실-일 수 있다. 상기 치환기 중 C1 -3-알킬-은 -메틸-, -에틸-, -프로필-, 또는 -이소프로필-일 수 있다.
일 구체예에서, 식 1의 기는 R7은 단순 단일결합이고, R8, R9 및 R10은 히드록시알킬인 것일 수 있다. 예를 들면, 식 1의 기는 R7은 단순 단일결합이고, R8, R9 및 R10은 -CH30H인 기일 수 있다.
상기 중합체에 있어서, 상기 쌍성이온성 기는 하기 식 3 또는 식 4의 기로서,
삭제
삭제
삭제
Figure 112011088113838-pat00004
(식 3),
Figure 112011088113838-pat00005
(식 4)
식 중 R11, R12, R17 및 R19는 독립적으로 치환 또는 비치환 -C1 -6-알킬-, 치환 또는 비치환 -C6 -12-아릴-, 치환 또는 비치환 -C1 -6-알킬-C6 -12-아릴-, 또는 치환 또는 비치환 -C6 -12-아릴-C1 -6-알킬-이고, R13 , R14, R15, R16 및 R18은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 -C1 -6-알킬이고, 치환된 경우 치환기는 할로 또는 -C1 -3-알킬인 것일 수 있다.
R11, R12, R17 및 R19 중 -C1 -6-알킬-은, 예를 들면, -메틸-, -에틸-, -프로필-, -이소프로필-, -부틸-, -세크-부틸-, -터트-부틸-, -펜틸-, 또는 -헥실-일 수 있다. R11, R12, R17 및 R19 중 -C6 -12-아릴-은 예를 들면, -페닐-, 또는 -나프틸-일 수 있다. R13 , R14, R15, R16 및 R18은 -C1 -6-알킬은, 예를 들면, -메틸, -에틸, -프로필, -이소프로필, -부틸, -세크-부틸, -터트-부틸, -펜틸, 또는 -헥실일 수 있다. 상기 치환기 중 C1 -3-알킬은 -메틸, -에틸, -프로필, 또는 -이소프로필일 수 있다.
일 구체예에서, 식 3의 기는 R11은 -페닐-메틸-이고, R12는 -에틸-이고, R13, R14 및 R15는 -메틸인 것일 수 있다.
일 구체예에서, 식 4의 기는 R17은 -에틸-이고, R19는 -에틸-이고, R16 및 R18은 -메틸인 것일 수 있다.
일 구체예에서, PEG는 분자량 1000 Da 내지 15000 Da의 것일 수 있다.
상기 고체 지지체는 임의의 형태를 갖는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들면, 비드, 플레이트 또는 웰의 형태를 갖는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 생물분자와 비특이적 결합을 하지 않거나 그 결합성이 낮은 성질을 갖는 물질로 되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 고체 지지체는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리부틸렌, 폴리스비닐클로리드 및 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 단면의 길이가 100nm 이상인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 고체 지지체는 하나 이상의 단면의 길이가 1000nm, 10㎛, 100㎛, 또는 1000㎛ 이상인 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 하나 이상의 단면의 길이가 100nm 내지 1000㎛, 1000nm 내지 1000㎛, 10㎛ 내지 1000㎛, 100㎛ 내지 1000㎛, 1㎛ 내지 1000㎛, 1㎛ 내지 1000㎛, 2㎛ 내지 1000㎛, 100nm 내지 1000㎛, 1000nm 내지 100㎛, 1㎛ 내지 10㎛ , 1㎛ 내지 5㎛, 또는 1㎛ 내지 7㎛ 인 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 중합체는 고체 지지체 당 복수 개, 예를 들면, 고체 지지체 당 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10,000 이상의 중합체가 결합되어 있는 형태일 수 있다. 상기 고체 지지체는 하나의 고체 지지체 당 2 내지 10,000, 5 내지 10,000, 10 내지 10,000, 20 내지 10,000, 50 내지 10,000, 100 내지 10,000, 200 내지 10,000, 500 내지 10,000, 1000 내지 10,000, 2000 내지 10,000, 5000 내지 10,000, 2 내지 5,000, 5 내지 5,000, 10 내지 5,000, 20 내지 5,000, 50 내지 5,000, 100 내지 5,000, 200 내지 5,000, 500 내지 5,000, 1000 내지 5,000, 2000 내지 5,000, 2 내지 2,000, 5 내지 2,000, 10 내지 2,000, 20 내지 2,000, 50 내지 2,000, 100 내지 2,000, 200 내지 2,000, 500 내지 2,000, 1000 내지 2,000의 중합체가 결합되어 있는 형태일 수 있다.
상기 중합체에 있어서, 상기 생물분자는 상기 생물분자는 단백질, 핵산 및 당으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 예를 들면, 단백질인 것일 수 있다. 용어 "단백질"은 분자 전체 또는 일부가 천연 또는 비천연 아미노산이 아미드 결합에 의하여 연결되어 있는 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 상기 단백질은 또한 PNA와 같은 단백질 유사체를 포함한다. 용어 "유사체 (analog)"는 분자의 표면에 천연 단백질에서 아미노산 측쇄가 노출되는 것과 같이, 분자의 골격에 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄에 해당하는 기가 결합되어 있는 것을 포함한다. 상기 단백질은 천연 또는 비천연 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 마이크로베지클 (microvesicle)에 존재하는 것일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, 마이크로베지클의 막 표면 또는 그 내부에 존재하는 것일 수 있다. 용어 "마이크로베지클 (microvesicle)"은 세포막의 단편으로서 엑소좀 (exosome), 순환하는 마이크로베지클(circulating microvesicle) 또는 미세입자 (microparticle)이라고도 한다. 마이크로베지클은 예를 들면, 단면의 길이가 50nm 1000nm의 범위에 있는 것일 수 있다.
상기 중합체에 있어서, 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 생물분자에 특이적으로 결합하는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 물질은 단백질, 핵산 및 당으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 물질은 항체, 항체에 대한 항원, 리간드에 대한 수용체, 수용체에 대한 리간드, 효소의 기질 또는 저해제, 또는 기질 또는 저해제에 대한 효소일 수 있다. 일 구체예에서, 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 마이크로베지클의 막. 예를 들면, 그 표면에 존재하는 단백질에 결합하는 항체인 것일 수 있다.
상기 중합체는 M1 및 M2에 있어서 A1 및 A2가 -O-이고 X 및 Y가 -H인 카르복실기 또는 그의 차단된 형태를 갖는 반복단위를 갖는 형태로 합성되고, 상기 카르복실기 또는 그의 차단된 형태를 2이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, PEG 및 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질과의 커플링 반응에 의하여, 합성될 수 있다. 상기 커플링 반응은 분자 자체의 아미노기와 같은 관능기뿐만 아니라, 관능화에 의하여 도입된, 아미노기와 같은 관능기와의 반응에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 카르복실기 또는 그의 차단된 형태를 갖는 반복단위를 갖는 중합체는 예를 들면, 폴리(아크릴산)(PAA) 또는 폴리(메타아크릴산)(PMAA)일 수 있다. 예를 들면, 카르복실기 또는 그의 차단된 형태를 갖는 M1 및 M2의 중합체를 고체 지지체에 고정화한 다음, X 및 Y 중 식 1, 식 3 및 식 4의 기에 해당하는 화합물을 순차적으로 또는 동시에 커플링시킴으로써 합성될 수 있다. 상기 중합체를 고체 지지체에 고정화하는 것은, 반응성 기를 가진 고체 지지체에 중합체를 고정화하는 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 표면에 반응성 아미노 기를 가진 고체 지지체에, 카르보디이미드로 활성화된 카르보닐 기를 가진 상기 중합체를 반응시켜, 상기 아미노 기와 활성화된 카르보닐 기의 반응에 의한 아미드 결합을 통하여 고정화시킬 수 있다.
상기 커플링은 예를 들면, 다음과 같은 과정에 의하여 이루어질 수 있다. 먼저, 활성화 가능한 카르복실기를 갖는 M1 및 M2의 중합체, 예를 들면 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리(메타아크릴산)(PMAA), 폴리(메틸아크릴산), 폴리(에틸아크릴산)과 같은 아크릴계 중합체 (acrylate polymer) 중의 카르복실기를 카르보디이미드 (예, EDC)를 사용하여 활성화시키고, 활성화된 카르보디이미드를 고체 지지체 표면의 아미노 기, 식 1, 식 3 및 식 4 중 하나 이상의 아미노 기와 커플링 반응시킴으로써 이루어질 수 있다.
상기 중합체는 상기 반복단위의 10% 내지 90%가 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질을 갖는 것일 수 있다. 상기 중합체는 상기 반복단위의 10% 내지 90% 가 2 이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택된 것 물질을 갖는 것일 수 있다. 상기 중합체는 상기 반복 단위 중 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질: 2 이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택된 것 물질의 몰비는 1:9 내지 9:1의 비율일 수 있다. 고체 지지체에는 하나 이상의 중합체가 고정되어 있을 수 있고, 상기 중합체는 하나 이상의 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질이 고정되어 있으므로, 결국 고체 지지체에 고밀도로 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질를 고정할 수 있다.
상기 중합체는 2 이상의 히드록시를 갖는 기 및 쌍성이온성 기로 이루어진 군으로부터 선택된 것 물질을 갖는 것일 수 있다.
상기 중합체는 A1 및 A2가 -O-이고, X 및 Y가 H인 M1 또는 M2를 갖고, 상기 고체 지지체는 M1 또는 M2의 카르복실기와의 결합을 통하여 상기 중합체에 연결된 것일 수 있다.
상기 고체 지지체는 고체 지지체에 결합된 부분을 제외하고, R1 및 R4는 -CH2-이고, R3 및 R6은 단순 단일결합이고, R2 및 R5는 -H이고,
A1 및 A2는 -NH-이고,
X 및 Y는 서로 독립적으로 -H, 2 이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, PEG 및 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 중합체가 1이상 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 2 이상의 히드록시를 갖는 기는 식1에 있어서, R7은 단순 단일결합이고, R8, R9, 및 R10은 -CH2OH인 것일 수 있다. 쌍성이온성 기는 식3에 있어서, R11은 -페닐메틸-이고, R12는 -(CH2)2-이고 R13, R14,및 R15는 -CH3인 것일 수 있다. 쌍성이온성 기는 식4에 있어서, R17은 -(CH2)3-이고, R16 및 R18은 -CH3이고 R19는 -(CH2)3일 수 있다.
상기 중합체에 의하면, 비특이적 생물분자, 예를 들면 단백질 결합이 되는 것이 없이, 특정 생물분자를 상기 복합체에 특이적으로 결합시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 고체 지지체에 결합되지 않은 형태의 상기 중합체를 제공한다. 상기 중합체에 대하여 위에서 설명한 바와 같다.
다른 양상은 하기 식 M1으로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위와 M2로부터 선택된 하나 이상의 반복단위를 포함하는 중합체로서,
Figure 112011088113838-pat00006
(M1),
Figure 112011088113838-pat00007
(M2)
식 중 R1, R3, R4 및 R6은 독립적으로 단순결합 또는 치환 또는 비치환된 -C1 -6-알킬-이고, R2 및 R5는 독립적으로 H, 할로, 또는 치환 또는 비치환된 C1 -6-알킬-이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 치환된 경우 치환기는 할로 또는 C1 -3-알킬-인 기이고,
A1 및 A2는 서로 독립적으로 -NH-, -O- 또는 -O-(CO)-이고,
X 및 Y는 서로 독립적으로 -H, 2 이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, PEG 및 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 중합체가 1이상 고정화되어 있는 고체 지지체를 시료 중의 상기 생물분자와 접촉시켜 상기 생물분자와 고체 지지체의 복합체를 형성하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 생물분자를 고체 지지체에 결합시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 상기 중합체 중의 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질과 상기 생물분자가 결합하는 조건에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조건은 상기 물질과 생물분자가 결합하기 적합한 pH, 염 농도 및 온도를 갖는 액체 매질 중에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 물 또는 버퍼 (예를 들면, PBS 버퍼)일 수 있다. 상기 pH는 생리적 pH 예를 들면, pH 6.8 내지 7.0일 수 있다. 상기 온도는 예를 들면, 15℃ 내지 40℃, 15℃ 내지 37℃일 수 있다. 이러한 반응 조건은 선택되는 생물분자 및 상기 생물분자에 결합하는 물질에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 중합체 및 생물분자는 일 양상에 따른 고체 지지체 부분에서 설명한 바와 같다. 상기 시료는 생물분자를 포함하는 임의의 시료일 수 있다. 시료는 생물체로부터 분리된 것 또는 인공 합성된 생물분자가 된 것일 수 있다. 상기 시료는 예를 들면, 마이크로베지클 또는 그 파쇄물을 포함하는 시료일 수 있다. 상기 복합체는 항체와 항원, 리간드와 수용체, 효소와 기질 또는 그의 저해제 또는 활성화제 또는 보조효소 사이의 결합에 의하여 형성되는 것일 수 있다.
상기 방법은, 상기 접촉 단계 후에 상기 복합체를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척은 상기 복합체의 결합은 유지하면서, 상기 생물분자 및/또는 중합체에 비특이적으로 결합되어 있는 물질을 제거하는 것일 수 있다. 상기 세척은 예를 들면, 상기 복합체의 결합은 유지하면서, 상기 생물분자 및/또는 중합체에 비특이적으로 결합되어 있는 물질을 제거할 수 있는 액체 매질, 예를 들면, 물 또는 버퍼 (PBS 버퍼) 등을 상기 복합체에 흘려주는 것에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 방법은, 상기 접촉 단계 후에 상기 복합체로부터 생물분자를 용출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 용출은 상기 복합체의 결합을 제거하는 임의의 액체 매질을 흘러주는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 용출은 액체 매질 중에 pH 및/또는 염 농도의 구배를 부여함으로써 이루어질 수 있다. 상기 용출액은 선택되는 생물분자 및 그에 결합하는 상기 물질에 따라 pH 및/또는 염 농도의 구배가 적절하게 부여된 액체 매질, 예를 들면, 물 또는 버퍼 (PBS 버퍼)일 수 있다. 이러한 용출 조건은 선택되는 생물분자 및 그에 결합하는 상기 물질에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 선택되는 생물분자가 단백질이고, 그에 결합하는 상기 물질이 항체인 경우, 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의하여 항원, 예를 들면 단백질을 분리하는 방법에 종사하는 당업자에게 상기 용출 조건은 잘 알려져 있다.
상기 방법에 의하면, 비특이적 생물분자, 예를 들면 단백질 결합이 되는 것이 없이, 특정 생물분자를 상기 중합체에 특이적으로 결합시킬 수 있다. 특정 생물분자를 상기 중합체에 특이적으로 결합시키는 것에 의하여, 특정 생물분자를 포함하는 물질 예를 들면, 세포 또는 마이크로베지클을 상기 중합체에 특이적으로 결합시킬 수 있다.
상기 방법에 의하면, 비특이적 생물분자, 예를 들면 단백질 결합이 되는 것이 없이, 특정 생물분자를 시료로부터 분리할 수 있다. 또한, 특정 생물분자를 상기 중합체에 특이적으로 결합시키고 분리하는 것에 의하여, 특정 생물분자를 포함하는 물질 예를 들면, 세포 또는 마이크로베지클을 시료로부터 특이적으로 분리시킬 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 있어서, 상기 시료 중의 생물분자가 상기 중합체와 결합하는지를 확인하는 단계 및
상기 생물분자가 상기 중합체가 결합하는 경우, 상기 시료 중에 상기 생물분자가 존재하는 것으로 결정하고, 상기 생물분자가 상기 중합체가 결합하지 않는 경우, 상기 시료 중에 상기 생물분자가 존재하지 않는 것으로 결정하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 시료 중의 생물분자가 상기 중합체와 결합하는지를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 확인은 상기 생물분자와 상기 중합체의 복합체의 존재 여부를 검출하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 확인은 상기 생물분자와 상기 중합체의 복합체로부터 상기 생물분자를 용출하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 검출은 분광학적 방법, 전기적 방법, 및 ELISA와 같은 면역 흡착 분석 법을 포함한 당업자에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
일 양상에 따른 중합체에 의하면, 비특이적 생물분자, 예를 들면 단백질 결합이 되는 것이 없이, 특정 생물분자를 상기 복합체에 특이적으로 결합시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 방법에 의하면, 비특이적 생물분자, 예를 들면 단백질 결합이 되는 것이 없이, 특정 생물분자를 상기 중합체에 특이적으로 결합시킬 수 있다. 특정 생물분자를 상기 중합체에 특이적으로 결합시키는 것에 의하여, 특정 생물분자를 포함하는 물질 예를 들면, 세포 또는 마이크로베지클을 상기 중합체에 특이적으로 결합시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 방법에 의하면, 비특이적 생물분자, 예를 들면 단백질 결합이 되는 것이 없이, 특정 생물분자를 시료로부터 분리할 수 있다. 또한, 특정 생물분자를 상기 중합체에 특이적으로 결합시키고 분리하는 것에 의하여, 특정 생물분자를 포함하는 물질 예를 들면, 세포 또는 마이크로베지클을 시료로부터 특이적으로 분리시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 방법에 의하면, 상기 시료 중에 생물분자가 존재하는지 여부를 효율적으로 검출할 수 있다.
도 1은 혈청을 포함하는 세포 용해액을 중합체에 결합시킨 것을 웨스턴 블롯팅에 의하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 혈청을 포함하는 엑소좀 용액을 중합체에 결합시킨 것을 웨스턴 블롯팅에 의하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 하나이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 이들 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 중합체의 제조 및 생물분자의 결합
1. 일 양상에 따른 중합체의 합성
본 실시예에서는 일 양상에 따른 중합체를 제조하기 위하여, X 및 Y가 -H이고, A가 -O-이고, R1 및 R4가 -CH2-이고, R2 및 R5가 -H이고, R3 및 R6은 단순 단일결합 (-)인, 폴리(아크릴산)(PAA)을 고체 지지체 표면에 결합시켰다. 다음으로, 상기 PAA의 카르복실기를 카르보디이미드를 사용하여 활성화시키고, 식 1, 2 및 3의 아미노기 및 생물분자 (예, 단백질) 중의 아미노기와 반응시켜 식 1, 2 및 3의 기 및 생물분자 (예, 단백질)을 고제 지지체에 고정화하였다. 고체 지지체로는 비드 형상의 것을 사용하였다. 일 양상에 따른 중합체를 구체적인 제작 과정은 다음과 같다.
(1) 자성 비드에 카르복실기를 갖는 제1 중합체의 결합
고체 지지체로서 자성 비드를 사용하였다. 자성 비드는 Dynabeads® M-270 Amine (Invitrogen 社)을 사용하였다. Dynabeads® M-270 Amine은 비드 전체에 걸쳐서 균일하게 분포된 포어 내에 침전된 자성 물질을 가진 고도로 가교된 폴리스티렌으로 구성된 균일한, 수퍼상자성 (superparamagnetic) 비드이다. 상기 비드는 비드 내부에 있는 철 옥시드를 밀봉하는 글리시딜 에테르의 친수성 층으로 더 코팅되어 있고, 상기 표면은 짧은 친수성 링커 상의 1차 아미노 관능기에 의하여 활성화되어 있다.
상기 친수성 표면은 낮은 비특이적 결합, 우수한 분산능, 및 넓은 범위의 버퍼에서 상기 비드의 용이한 취급을 가능하게 한다. 상기 비드는 2x109 비드/ml (약 30 mg/ml)의 농도로 수성 현탁액으로 판매된다. 비드의 직경은 2.8um이었다. 표면 반응성 1차 이미노 기는 단백질, 펩티드, 당, 또는 다른 표적 특이적 분자와 같은 리간드의 고정화를 가능하게 한다.
상기 Dynabeads® M-270 Amine (Invitrogen 사) 100 ㎕를 0.1 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid: 이하 MES라 함), 0.5M NaCl pH 6.0 완충용액 200 ㎕로 2회 세척 후 100 ㎕ 동일 완충용액에 재현탁시켰다. 폴리(아크릴산) (PAA) 용액 (물 중 35% w/v, 평균 중량 평균분자량 (Mw) 약 15,000, 카탈로그 번호: 416037, Aldrich 사)의 1/10 희석용액 48 ㎕와 상기 완충용액 236 ㎕를 혼합한 뒤, 상기 재현탁된 비드 용액에 가하고 잘 섞어 주었다.
다음으로, 상기 혼합물에 증류수 중의 75 mg/ml (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드) (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide: 이하 EDC라 함) 용액 54 ㎕ 및 증류수 중의 15 mg/ml N-히드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide: 이하 NHS라 함) 용액 210 ㎕를 넣고 1시간 동안 순환시켰다. 이후 0.5M NaCl pH6.0 완충용액 400 ㎕로 2회 세척한 후, 동일 완충용액 400 ㎕에 재현탁시켰다. 그 결과, 폴리(아크릴산)이 아미드 결합에 의하여 표면에 결합된 자성 비드를 얻었다. 상기 아미드 결합은 폴리(아크릴산)의 카르보닐기와 상기 자성 비드의 1차 아미노 기의 결합에 의하여 생성되었다.
(2) 폴리(아크릴산)이 표면에 결합된 자성 비드에 단백질 G의 결합
(1)에서 준비된 비드 현탁액을 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다. 여기서 동일 완충용액 236 ㎕, 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 중75mg/ml EDC 용액 54 ㎕, 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 중 15mg/ml NHS 용액 210 ㎕를 넣고 잘 섞은 뒤 30분간 순환시켰다.
비드를 다시 동일 완충용액 400 ㎕로 2회 세척 후 400 ㎕ 동일 완충용액에 재현탁한 뒤 여기에 단백질 G 용액 (10 ㎍/㎕) (Fluka, 카탈로그 번호 08062)를 3 ㎕ 가하고 1시간 동안 순환시켰다. 그 결과, 단백질 G가 결합된 폴리(아크릴산)이 표면에 결합된 자성 비드를 얻었다. 여기서 단백질 G는 폴리(아크릴산)의 카르보닐기를 통하여 결합되어 있을 수 있다.
다음으로, 상기 반응물에 사용하고자 하는 차단제 (blocker)의 종류에 따라, 차단제를 각각 첨가하여 차단제를 상기 폴리(아크릴산) 골격에 커플링시켰다. 구체적으로, 상기 반응물에 증류수 중 100 ug/㎕ 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (tri(hydroxymethyl)aminomethan: 이하 Tris라 함) 28㎕, 증류수 중 100 ug/㎕ 4-아미노페닐메틸포스포릴콜릴 (4-aminophenylmethylphosphorylcoline: 이하 APC라 함)을 50 ㎕, 증류수 중 100 ug/㎕ NH2(CH2)3N+(CH3)2(CH2)3SO3 -(sulfobetaine: 이하 SB라 함), 증류수 중 20 ug/㎕ PEG (polyethyleneglycol) (BlockMaster, JSR corporation: Mw =5,000Da) 300㎕ 씩 넣고 1~2 시간 동안 순환시켰다. 반응물을 1x PBS (0.02% tween 20) 400 ㎕로 2회 세척, 1x PBS 400 ㎕로 2회 세척하였다. 여기서, 상기 PEG는 말단 OH기가 아미노기로 관능화된 것이다.
(3) 단백질 G와 항체의 접합
(2)에서 준비된 비드 현탁액에서 자석을 이용하여 비드를 분리하여 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.0 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다.
항-Rab5b 항체 (SantaCruz 사: 카탈로그 번호 sc-598, 200㎕/ml) 80 ㎕와 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.0 완충용액 420 ㎕ 혼합한 후, 이 혼합물을 상기 세척된 비드에 가하고 1시간 동안 순환시켰다. 반응물을 1x PBS (0.02% tween 20) 400 ㎕로 2회 세척, 1x PBS 400 ㎕로 2회 세척한 후 1x PBS 100 ㎕에 재현탁하였다. Rab5b는 RAS 발암유전자 (oncogene) 패밀리의 멤버이다. Rab 단백질은 막 이동 (traffic)의 조절에 관여하는 작은 GTPase이다. Rab5a는 초기 세포내이입(endocytosis) 과정에서 수송을 조절하는 것으로 밝혀졌다. Rab5b는 Rab5a의 이소폼으로서 세포내이입의 조절에 필요한 모든 특징을 Rab5a와 공유한다. Rab5b 및 Rab5c는 트란스페린 수용체 및 Rab5a와 공동위치하고(colocalize), 인 비트로 초기 엔도좀 사이의 융합을 촉진하여 인 비보에서 과발현되는 경우 호모타입 융합을 촉진한다. Rab5b는 마이크로베지클의 내부에 존재하는 것으로 알려져 있다.
그 결과, (2)에서 준비된 비드의 단백질 G에 항-Rab5b 항체가 결합된 비드를 얻었다.
(4) 단백질 G와 항체의 가교 결합
(3) 단계에서 준비된 비드 현탁액을 0.1M 소듐 보레이트, pH 9.3 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다. 0.1M 소듐 보레이트, pH 9.3 완충용액 중 15mM 디메틸 피멜이미데이트 (dimethyl pimelimidate: 이하 DMP라 함) 400 ㎕을 상기 세척된 비드에 가하고 1시간 동안 순환시켰다. 그 후 0.1M 소듐 보레이트, pH 8.0 완충용액 중 50mM 에탄올아민 400 ㎕로 2회 세척한 후 다시 200㎕를 가하고 1시간 동안 순환시켰다. 반응물을 1x PBS (0.02% Tween 20) 200 ㎕로 2회 세척, 1x PBS 200 ㎕로 2회 세척한 후 1x PBS 100 ㎕에 재현탁하였다.
(5) 비드 표면에 식 1, 2 및 3의 기의 결합
(4)에서 준비된 비드 현택액을 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다. 세척된 비드에 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 300 ㎕, 75mg/ml (in 0.025M MES, pH 6.0) EDC 용액 50 ㎕, 15mg/ml NHS 용액 50 ㎕ (in 0.025M MES, pH 6.0)을 넣고 잘 섞은 뒤 30분간 순환시켰다.
반응된 비드를 다시 동일 완충용액 400 ㎕로 2회 세척 후 400 ㎕ 동일 완충용액에 재현탁한 뒤 여기에 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (tri(hydroxymethyl)aminomethan: 이하 Tris라 함) (1 mg/㎕ in D.W.) 또는 4-아미노페닐메틸포스포릴콜릴(4-aminophenylmethylphosphorylcoline: APC, 1mg/㎕ in D.W)을 6~24 ㎕ 씩 넣고 1~2 시간 동안 순환시켰다. 반응물을 1x PBS (0.02% Tween 20) 400 ㎕로 2회 세척, 1x PBS 400 ㎕로 2회 세척 후 1x PBS 100 ㎕에 재현탁시켰다. 상기 방법으로 합성된 비드의 종류는 표 1과 같다.
비드번호 PAA(㎕) 단백질
G(㎕)		 항-Rab5b 항체(㎕) APC(㎕) Tris(㎕) 비고
A1 65 4 80 0 0 대조군
A2 65 8 80 0 0
B1 65 4 80 24 0 X가 APC인 하나 이상의 M1을 포함하는 중합체
B2 65 8 80 24 0
B3 65 6 80 12 0
C1 65 4 80 0 12 X가 Tris인 하나 이상의 M1을 포함하는 중합체
C2 65 8 80 0 12
C3 65 6 80 0 6
2. 중합체와 생물분자의 결합
제작된 중합체에 생물분자로서 단백질을 포함하는 시료를 결합시켜, 단백질 Rab5b의 결합 효율 및 비특이적 생물분자의 결합 효율을 측정하였다.
(1) 비특이적 단백질 결합 실험
비특이적 단백질이 결합하는 효율을 측정하기 위하여, 사람 혈청을 1에서 얻어진 중합체와 반응시켰다.
먼저, 준비된 비드 10 ㎕에 사람 혈청 (Sigma 사)과 1xPBS 완충용액을 혼합한 용액 200 ㎕을 첨가한 후, 실온에서 한 시간 동안 순환시킨 (rotation) 뒤, 상등액을 제거하고 1x PBS (0.02% Tween 20) 200 ㎕로 3회 세척하였다. 비드를 분리한 뒤 여기에 60㎕ 1x PBS (2% SDS) 60㎕를 가하고 잘 섞어준 뒤 60℃에서 2~3시간 인큐베이션하였다. 상온으로 식힌 후 BCA 단백질 정량 kit (Pierce 사)를 이용하여 용액 내 단백질 양을 정량하였다. 사용된 사람 혈청과 완충용액의 혼합 비율은 다음과 같다.
시료 명칭 혈청% 버퍼 및 %
pH 7.4-S80 80 1xPBS 20
pH 7.4-S50 50 1xPBS 20
pH 9.3-S50 50 0.1 M 보레이트 50
(2) 혈청과 혼합된 특이적 단백질의 결합 측정
(2.1) 세포 용해물 ( cell lysate )의 제작
세포 용해물 제작은 모든 과정이 얼음 또는 4℃에서 진행하였다. 먼저, 세포 펠렛을 준비하였다. 150mm 플레이트에 70~80% 컨플루언시 (confluency)가 되도록 (약 1.5x107) 세포 MCF-7, 유방암 세포주를 DMEM 배지(10% FBS 포함, Invitrogen 사) 중에서 배양한 후, 플레이트에 있던 배지를 버리고, 차갑게 해 둔 1x PBS(pH 7.4) 10 ml을 첨가한다. 스크레이퍼를 이용하여 플레이트 바닥에 부착된 세포를 긁어 모은 후, PBS로 2회 세척하여 배지 (media) 및 잔여물을 제거하였다. 300g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거 (1차 세척)하고, 1ml의 1X PBS로 침전물 (세포 펠렛)을 재부유(resuspension)시켜 1.7ml 튜브로 옮기고, 1,500g, 5분 원심분리 후 상층액을 제거하여 2차 세척한 후, 최종 세포 시료를 세포 펠렛으로 얻었다.
세포 펠렛으로부터 세포 용해물 (cell lysate)를 얻었다. 세포 시료 부피의 약 5배의 용해 용액 (passive lysis solution: Promega 사) (Promega 사)을 첨가 후 30초씩 3회 보르텍싱하여 30 분간 얼음에 인큐베이션하여 충분하게 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여, 세포 유래 잔여물 (cell-derived debris)을 제거하고, 상층액 (세포 용해물: total protein)만 모아 BCA 방법 (Pierce 사)으로 단백질을 정량하고 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다.
(2.2) 혈청을 포함하는 세포 용해액과 중합체의 결합
(1) 준비된 비드 15 ㎕에 사람 혈청 (Sigma 사)과 완충용액 및 (2.1)에서 준비된 세포 용해물을 혼합한 용액 200 ㎕를 넣고 한 시간 동안 순환시켰다. 자석을 이용하여 액체 부분을 제거하고 1x PBS (0.02% Tween 20) 200 ㎕로 3회 세척한 뒤 비드를 자석을 이용하여 분리하였다. 용액의 혼합 비율은 표 3과 같다.
시료 번호 혈청 부피% 버퍼 및 부피% 세포 용해물 부피%
pH7.4-C-S80 80 0 20
pH7.4-C-S50 50 1xPBS 20
pH7.4-C-S50 50 0.1 보레이트 30 20
(2.3) 웨스턴 블롯
(2.2)에서 같이 단백질을 비드에 결합시킨 후, 비드에 7 ㎕의 로딩 버퍼 (5㎕ LDS 샘플 버퍼 + 2㎕ 환원제: Invitrogen 사)와 13 ㎕의 물을 넣은 후, 100℃에서 10분간 가열하여 단백질을 변성시키고 비드에 결합된 단백질을 분리하였다.
다음으로, 가열된 비드를 원심분리하여 식힌 후 단백질 크기 마커 (Invitrogen 사)와 함께 5㎕ 씩 SDS-PAGE 겔에 로딩하여, GEL 당 200V, 50mA의 전압을 걸어서 약 50분간 전개하였다.
전개가 완료된 후, 겔을 건조 블롯팅 시스템 (dry blotting system) (Incitrogen 사)을 이용하여 20V로 7분 20초간 단백질을 PVDF 막으로 옮겼다. 옮겨진 막의 빈공간에 항체가 결합하는 것을 막기 위하여, 막에 탈지분유 (Bio-rad 사)가 5% 포함된 TBST (0.1% Tween 20이 포함된 1x TBS) 완충용액 10ml 넣고 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 막 이외의 용액을 완전히 제거한 후, 항-Rab5b 항체 (Santacruz Biotechnology 사) 5 ㎕ (200㎍/ml)가 포함된 TBST (1% 탈지분유 포함) 10ml을 넣고 1시간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 막을 증류수 20ml로 5분씩 3회 세척한 후 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 TBST(1% 탈지분유 포함) 와 1대 3000의 비율로 섞어 막과 반응시켰다. 반응 후 위와 같은 방법으로 세척하였다.
세척이 완료된 막에 2ml의 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce 사)로 5분간 상온에서 반응시킨 후 LAS (Fujifilm 사) 장비를 이용하여 항-Rab-5b 밴드를 검출하고, 검출된 이미지를 저장하였다. Image J (NCI 제공) 프로그램을 이용하여 저장된 이미지 내 배경, 비특이적 결합 밴드 및 항-Rab5b 밴드 강도를 각각 정량하였다.
3. 측정 결과
(1) 비특이적 단백질 흡착 측정
합성된 각 비드의 비특이적 단백질 흡착량 측정 결과는 표 4와 같다. 표 4에 나타낸 바와 같이, APC 또는 Tris가 결합되지 않은 비드 (A1 및 A2 비드)에 비해 APC 또는 Tris가 결합된 비드 (B1 내지 B3, 및 C1 내지 C3 비드)의 경우 비특이적 흡착이 최대 57%까지 감소하였다. 그리고 APC가 결합된 비드 (B1 내지 B3)와 Tris가 결합된 비드 (C1 내지 C3)는 유사한 수준으로 감소하였다.
흡착량(ng/cm2) 감소율(%)*
비드번호 pH7.4-S80 pH7.4-S50 pH9.3-S50 pH7.4-S80 pH7.4-S50 pH9.3-S50
A1 1251.9 633.9 655.4 0.0 0.0 0.0
A2 937.7 628.9 589.1 25.1 0.8 10.1
B1 535.4 470.2 500.2 57.2 25.8 23.7
B2 665.1 564.6 421.1 46.9 10.9 35.7
B3 551.4 569.4 378.0 56.0 10.2 42.3
C1 600.4 394.8 435.3 52.0 37.7 33.6
C2 651.3 593.0 428.3 48.0 6.5 34.7
C3 599.2 442.9 372.4 52.1 30.1 43.2
* 감소율(%)은 A1 비드에 대한 감소율이다.
(2) 혈청과 혼합된 특이적 단백질의 결합 측정 결과
도 1은 혈청을 포함하는 세포 용해액을 중합체에 결합시킨 것을 웨스턴 블롯팅에 의하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 모든 비드에서 Rab5b 단백질에 해당하는 밴드 (하단 박스)는 유사한 수준의 밴드 세기를 보였다. 그러나, 비특이적 결합에 의한 단백질에 해당하는 밴드 (상단 박스)는 비드 간의 차이가 있었다. 이 차이는 X 및 Y로서 2 이상의 말단 히드록시를 갖는 기 또는 쌍성이온성 기의 기를 포함하지 않는 비드 (A1 및 A2 비드)에 비해 상기 기를 갖는 비드의 경우 (B1 내지 B3, 및 C1 내지 C3) 비특이적 흡착에 의한 밴드의 세기가 약하였다. 그리고 APC를 가진 비드(B1 내지 B3)와 Tris를 갖는 비드 (C1 내지 C3)에서 비특이적 흡착에 의한 밴드의 세기는 유사하였다. 도 1의 밴드의 세기를 정량화한 결과를 표 5에 나타내었다.
특이적 단백질 밴드 세기 비특이적 단백질 밴드 세기
비드번호 pH7.4-C-S80 pH7.4-C-S50 pH9.3-C-S50 pH7.4-C-S80 pH7.4-C-S50 pH9.3-C-S50
A1 107.0 105.9 96.5 56.5 67.6 54.9
A2 97.7 96.9 84.7 36.9 43.2 34.6.
B1 91.1 91.0 84.1 29.6 43.7 31.5
B2 88.7 79.2 74.7 28.0 36.5 24.8
B3 96.0 89.5 87.7 30.4 36.5 33.1
C1 103.5 104.3 98.3 14.7 17.8 16.2
C2 90.9 87.8 79.0 29.0 31.8 24.0
C3 89.6 89.8 89.4 28.9 34.3 30.5
표 5에 나타낸 바와 같이, 도 1로부터 예상되었던 바와 같이 특이적 단백질에 의한 밴드의 세기는 비드 간에 차이가 10% 미만인 반면, 비특이적 단백질에 의한 밴드 세기는 A1 및 A2 비드, 및 APC가 고정된 비드 (B1 내지 B3) 및 Tris가 고정된 비드 (C1 내지 C3 비드) 사이의 차이가 컸다. 특히 B1 비드와 B1 내지 B3 및 C1 내지 C3 비드는 A1 및 B1 비드에 비하여 그 세기가 약하였다. 또한 시료 종류에 따라 정도의 차이는 있으나 APC가 고정된 경우와 Tris가 고정된 경우가 유사한 수준의 밴드 세기를 보여주고 있다.
실시예 2 : 중합체의 제조 및 생물분자의 결합
1. 일 양상에 따른 중합체의 합성
본 실시예에서는 일 양상에 따른 중합체를 제조하기 위하여, X 및 Y가 -H이고, A가 -O-이고, R1 및 R4가 -CH2-이고, R2 및 R5가 -H이고, R3 및 R6은 단순 단일결합 (-)인, 폴리(아크릴산)(PAA)을 고체 지지체 표면에 결합시켰다. 다음으로, 상기 PAA의 카르복실기를 카르보디이미드를 사용하여 활성화시키고, 식 1, 3 및 4의 아미노기 및 생물분자 (예, 단백질) 중의 아미노기와 반응시켜 식 1, 3 및 4의 기 및 생물분자 (예, 단백질)을 고제 지지체에 고정화하였다. 고체 지지체로는 비드 형상의 것을 사용하였다. 일 양상에 따른 중합체를 구체적인 제작 과정은 다음과 같다.
(1) 자성 비드에 카르복실기를 갖는 제1 중합체의 결합
고체 지지체로서 자성 비드를 사용하였다. 자성 비드는 Dynabeads® M-270 Amine (Invitrogen 社)을 사용하였다. Dynabeads® M-270 Amine은 비드 전체에 걸쳐서 균일하게 분포된 포어 내에 침전된 자성 물질을 가진 고도로 가교된 폴리스티렌으로 구성된 균일한, 수퍼상자성 (superparamagnetic) 비드이다. 상기 비드는 비드 내부에 있는 철 옥시드를 밀봉하는 글리시딜 에테르의 친수성 층으로 더 코팅되어 있고, 상기 표면은 짧은 친수성 링커 상의 1차 아미노 관능기에 의하여 활성화되어 있다.
상기 친수성 표면은 낮은 비특이적 결합, 우수한 분산능, 및 넓은 범위의 버퍼에서 상기 비드의 용이한 취급을 가능하게 한다. 상기 비드는 2x109 비드/ml (약 30 mg/ml)의 농도로 수성 현탁액으로 판매된다. 비드의 직경은 2.8um이었다. 표면 반응성 1차 이미노 기는 단백질, 펩티드, 당, 또는 다른 표적 특이적 분자와 같은 리간드의 고정화를 가능하게 한다.
상기 Dynabeads® M-270 Amine (Invitrogen 사) 100 ㎕를 0.1 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid: 이하 MES라 함), 0.5M NaCl pH 6.0 완충용액 200 ㎕로 2회 세척 후 100 ㎕ 동일 완충용액에 재현탁시켰다. 폴리(아크릴산) (PAA) 용액 (물 중 35% w/v, 평균 중량 평균분자량 (Mw) 약 15,000, 카탈로그 번호: 416037, Aldrich 사)의 1/10 희석용액 48 ㎕와 상기 완충용액 236 ㎕를 혼합한 뒤, 상기 재현탁된 비드 용액에 가하고 잘 섞어 주었다.
다음으로, 상기 혼합물에 증류수 중의 75 mg/ml (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드) (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide: 이하 EDC라 함) 용액 54 ㎕ 및 증류수 중의 15 mg/ml N-히드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide: 이하 NHS라 함) 용액 210 ㎕를 넣고 1시간 동안 순환시켰다. 이후 0.5M NaCl pH6.0 완충용액 400 ㎕로 2회 세척한 후, 동일 완충용액 400 ㎕에 재현탁시켰다. 그 결과, 폴리(아크릴산)이 아미드 결합에 의하여 표면에 결합된 자성 비드를 얻었다. 상기 아미드 결합은 폴리(아크릴산)의 카르보닐기와 상기 자성 비드의 1차 아미노 기의 결합에 의하여 생성되었다.
(2) 폴리(아크릴산)이 표면에 결합된 자성 비드에 단백질 G 및 차단제의 결합
(1)에서 준비된 비드 현탁액을 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다. 여기서 동일 완충용액 236 ㎕, 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 중75mg/ml EDC 용액 54 ㎕, 0.025M MES, pH 6.0 완충용액 중 15mg/ml NHS 용액 210 ㎕를 넣고 잘 섞은 뒤 30분간 순환시켰다.
비드를 다시 동일 완충용액 400 ㎕로 2회 세척 후 400 ㎕ 동일 완충용액에 재현탁한 뒤 여기에 단백질 G 용액 (10 ㎍/㎕) (Fluka, 카탈로그 번호 08062)를 3 ㎕ 가하고 1시간 동안 순환시켰다. 그 결과, 단백질 G가 결합된 폴리(아크릴산)이 표면에 결합된 자성 비드를 얻었다. 여기서 단백질 G는 폴리(아크릴산)의 카르보닐기를 통하여 결합되어 있을 수 있다.
다음으로, 상기 반응물에 사용하고자 하는 차단제 (blocker)의 종류에 따라, 차단제를 각각 첨가하여 차단제를 상기 폴리(아크릴산) 골격에 커플링시켰다. 구체적으로, 상기 반응물에 증류수 중 100 ug/㎕ 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (tri(hydroxymethyl)aminomethan: 이하 Tris라 함) 28㎕, 증류수 중 100 ug/㎕ 4-아미노페닐메틸포스포릴콜릴 (4-aminophenylmethylphosphorylcoline: 이하 APC라 함)을 50 ㎕, 증류수 중 100 ug/㎕ NH2(CH2)3N+(CH3)2(CH2)3SO3 -(sulfobetaine: 이하 SB라 함), 증류수 중 20 ug/㎕ PEG (polyethyleneglycol) (BlockMaster, JSR corporation: Mw =5,000Da) 300㎕ 씩 넣고 1~2 시간 동안 순환시켰다. 반응물을 1x PBS (0.02% Tween 20) 400 ㎕로 2회 세척, 1x PBS 400 ㎕로 2회 세척하였다. 여기서, 상기 PEG는 말단 OH기가 아미노기로 관능화된 것이다 (synthetic aqueous polymer with amine (-NH2) group at one end).
(3) 단백질 G와 항체의 접합
(2)에서 준비된 비드 현탁액에서 자석을 이용하여 비드를 분리하여 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.0 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다.
항-EpCAM 항체 (R&D system 사: p9601, 0.5μg/㎕) 160 ㎕와 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.0 완충용액 340 ㎕ 혼합한 후, 이 혼합물을 상기 세척된 비드에 가하고 3시간 동안 순환시켰다. 반응물을 1x PBS (0.02% tween 20) 200 ㎕로 2회 세척, 1x PBS 200 ㎕로 2회 세척한 후 1x PBS 100 ㎕에 재현탁하였다.
상피세포흡착분자(epithelial cell adhesion molecule: 이하 EpCAM이라 함)는 사람에서는 EPCAM 유전자에 의하여 코딩된 단백질이다. EpCAM은 대부분의 종양 (carcinoma) 상에 발현되는 범-상피 분화 항원이다. EpCAM은 분화되지 않은 다능 (pluripotent) 줄기세포에서 발현된다.
그 결과, (2)에서 준비된 비드의 단백질 G에 항-EpCAM 항체가 결합된 비드를 얻었다. 단백질 G와 항-EpCAM 항체는 비공유 결합에 의하여 결합된 것으로 여겨진다.
(4) 단백질 G와 항체의 가교 결합
(3) 단계에서 준비된 비드 현탁액을 0.1M 소듐 보레이트, pH 9.3 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다. 0.1M 소듐 보레이트, pH 9.3 완충용액 중 15mM 디메틸 피멜이미데이트 (dimethyl pimelimidate: 이하 DMP라 함) 400 ㎕을 상기 세척된 비드에 가하고 1시간 동안 순환시켰다. 그 후 0.1M 소듐 보레이트, pH 8.0 완충용액 중 50mM 에탄올아민 400 ㎕로 2회 세척한 후 다시 200㎕를 가하고 1시간 동안 순환시켰다. 반응물을 1x PBS (0.02% tween 20) 200 ㎕로 2회 세척, 1x PBS 200 ㎕로 2회 세척한 후 1x PBS 100 ㎕에 재현탁하였다.
비드번호 PAA(㎕) 단백질
G(㎕)		 항-EpCAM 항체(㎕) 차단제 비고
2-1 48 3 160 0 차단제 없는 대조군
2-2 48 3 160 Tris
2-3 48 3 160 APC
2-4 48 3 160 SB
2-5 48 3 160 PEG
2. 중합체와 생물분자의 결합
제작된 중합체에 생물분자로서 단백질을 포함하는 시료를 결합시켜, 단백질 EpCAM의 결합 효율 및 비특이적 생물분자의 결합 효율을 측정하였다.
(1) 비특이적 단백질 결합 실험
비특이적 단백질이 결합하는 효율을 측정하기 위하여, 사람 혈청을 1에서 얻어진 중합체와 반응시켰다.
먼저, 준비된 비드 20 ㎕에 사람 혈청 (Sigma 사)과 1xPBS 완충용액을 혼합한 용액 200 ㎕을 첨가한 후, 실온에서 밤새 동안 순환시킨 뒤, 상등액을 제거하고 1x PBS (0.02% tween 20) 200 ㎕로 3회 세척하였다. 비드를 분리한 뒤 여기에 90㎕ 1x PBS (2% SDS)를 가하고 잘 섞어준 뒤 60℃에서 2~3시간 인큐베이션하였다. 상온으로 식힌 후 BCA 단백질 정량 kit (Pierce 사)를 이용하여 용액 내 단백질 양을 정량하였다. 사용된 사람 혈청과 완충용액의 혼합 비율은 혈청 90%, 버퍼 (1xPBS) 10%이었다.
(2) 혈청 내 마이크로베지클 표면에 있는 표적 단백질에 대한 결합 측정
(2.1) 엑소좀 펠렛의 준비
마이크로베지클의 예로서 엑소좀을 준비하였다. 엑소좀 준비의 모든 과정은 얼음 또는 4℃에서 진행하였다. 150mm 플레이트에 70~80% 컨플루언시 (confluency)가 되도록 (약 1.5x107) 세포 MCF-7, 유방암 세포주를 DMEM 배지(10% FBS 포함, Invitrogen 사) 중에서 배양한 후, 배지를 50ml 원심분리 분리 튜브로 회수하였다. 다음으로, 상기 50ml 원심 분리 튜브를 300g, 4℃에서 10분간 원심 분리하여, 상등액을 취하였다. 상층액을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 800g, 4℃에서 10분간 원심 분리하였다. 다음으로, 상층액을 취하여 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 2000g, 4℃에서 20분간 원심 분리하였다. 상층액을 취하여 폴리카르보네이트 튜브로 옮기고, 10,000g, 4℃에서 30분간 원심 분리하였다. 상층액을 취하여 폴리카르보네이트 튜브로 옮기고, 110,000g, 4℃에서 70분간 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고, 펠렛을 1ml PBS로 재현탁하고, 100,000g, 4℃에서 70분간 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거하였다. BCA 단백질 정량 키트 (Pierce 社)를 사용하여 단백질을 정량하고 사용 전까지 -70℃에 보관하였다.
(2.2) 엑소좀 표면의 표적 단백질과 중합체의 결합
(1) 준비된 비드 20 ㎕에 사람 혈청 (Sigma 사)과 완충용액 및 (2.1)에서 준비된 엑소좀을 포함한 용액 200 ㎕를 넣고 1 시간 동안 순환시켰다. 자석을 이용하여 액체 부분을 제거하고 1x PBS (0.02% Tween 20) 200 ㎕로 3회 세척한 뒤 비드를 자석을 이용하여 분리하였다. 용액의 혼합 비율은 혈청 180 ㎕, 버퍼 18 ㎕ 및 엑소좀 2 ㎕이었다.
(2.3) 웨스턴 블롯
(2.2)에서 단백질을 비드에 결합시킨 후, 비드에 7 ㎕의 로딩 버퍼 (5㎕ LDS 샘플 버퍼 + 2㎕ 환원제: Invitrogen 사)와 13 ㎕의 물을 넣은 후, 100℃에서 10분간 가열하여 단백질을 변성시키고 비드에 결합된 단백질을 분리하였다.
다음으로, 가열된 비드를 원심분리하여 식힌 후 단백질 크기 마커 (Invitrogen 사)와 함께 5㎕ 씩 SDS-PAGE 겔에 로딩하여, GEL 당 200V, 100mA의 전압을 걸어서 약 50분간 전개하였다.
전개가 완료된 후, 겔을 건조 블롯팅 시스템 (dry blotting system) (Invitrogen 사)을 이용하여 20V로 7분 20초간 단백질을 PVDF 막으로 옮겼다. 옮겨진 막의 빈공간에 항체가 결합하는 것을 막기 위하여, 막에 탈지분유 (Bio-rad 사)가 5% 포함된 TBST (0.1% Tween 20이 포함된 1x TBS) 완충용액 10ml 넣고 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 막 이외의 용액을 완전히 제거한 후, 항-EpCAM 항체 (R&D systems 사) 1 ㎕ (200㎍/ml가 포함된 TBST (1% 탈지분유 포함) 10ml을 넣고 1시간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 막을 증류수 20ml로 5분씩 3회 세척한 후 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 1차와 동일한 방법으로 TBST에 섞어 막과 반응시켰다. 반응 후 위와 같은 방법으로 세척하였다.
세척이 완료된 막에 2ml의 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce 사)로 5분간 상온에서 반응시킨 후 LAS (Fujifilm 사) 장비를 이용하여 항-EpCAM 밴드를 검출하고, 검출된 이미지를 저장하였다. Image J (NCI 제공) 프로그램을 이용하여 저장된 이미지 내 배경, 비특이적 결합 밴드 및 항-EpCAM 밴드 강도를 각각 정량하였다.
3. 측정 결과
(1) 비특이적 단백질 흡착 측정
표 7은 합성된 각 비드의 비특이적 단백질 흡착량 측정 결과를 나타낸다. 표7에 나타낸 바와 같이, 차단제가 결합되지 않은 비드 (2-1 비드)에 비해 차단제가 결합된 비드 (2-2, 2-3, 2-4, 및 2-5)는 비특이적 단백질 흡착량이 현저하게 감소하였다. 구체적으로, 비드 2-1를 기준으로, 비드 2-2, 2-3, 2-4, 및 2-5의 비특이적 단백질 흡착량은 각각 60%, 66%, 33% 및 41%이었다. 즉, 비드 2-1에 비하여, 비드 2-3 및 2-4의 비특이적 단백질 흡착량은 각각 34% 및 67% 감소하였다. 표 7의 값은 평균값이다.
비드번호 단백질 흡착량(ng/cm2) 감소율(%)*
2-1 5210.9 0
2-2 3131.0 40
2-3 3462.2 34
2-4 1745.0 67
2-5 2162.3 59
* 감소율(%)은 2-1 비드에 대한 감소율이다.
(2) 혈청과 포함된 엑소좀 표면에 있는 표적 단백질에 대한 결합 측정 결과
도 2는 혈청을 포함하는 엑소좀 용액을 중합체에 결합시킨 것을 웨스턴 블롯팅에 의하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 표 8은 도 2의 EpCAM에 해당하는 밴드의 세기를 정량화한 결과를 나타낸다. 도 2에서 M은 분자량 마커를 나타내고, C는 표적 단백질을 주입하는 경우를 나타낸다. 표 8의 값은 평균값이다.
비드번호 강도 포획효율(%)*
2-1 86.3 100
2-2 88.1 102
2-3 100.1 116
2-4 111.8 130
2-5 111.2 129
* 포획효율(%)은 2-1 비드에 대한 백분율을 나타낸다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 엑소좀 표면의 특정 단백질 또는 엑소좀의 포획 효율은 2-1 비드에 비하여, 차단제를 포함하는 비드 2-2. 2-3, 2-4, 2-5에서 각각 2%, 16%, 30% 및 29% 증가하였다. 이는 차단제를 포함하는 비드는 단백질의 비특이적 결합을 감소시키는 것뿐만 아니라, 표적 단백질 또는 표적 단백질이 표면에 존재하는 마이크로베지클의 포획효율을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 특히, 차단제가 술포베타인인 경우, 단백질의 비특이적 결합을 현저하게 감소시키는 것뿐만 아니라, 표적 단백질 또는 표적 단백질이 표면에 존재하는 마이크로베지클의 포획효율을 현저하게 증가시킨다는 것을 나타낸다.
이상과 같은 실시예의 결과는, 고체 지지체에 고정화된 중합체에 단백질의 비특이적 결합을 차단하는 성질을 가진 차단제를 부착시키는 동시에 표적 분자에 대하여 결합하는 결합 모이어티를 부착하는 경우, 시료 중의 표적분자를 효율적으로 분리할 수 있는 예기치 않은 효과가 있다는 것을 나타낸다. 특히, 표적 분자가 마이크로베지클의 표면에 존재하는 경우, 상기 결합 분자와 표적 분자 사이의 결합력을 이용하여 마이크로베지클 자체를 효율적으로 포획하여 분리할 수 있다는 것을 나타낸다.

Claims (30)

  1. 하기 식 M1으로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위와 M2로부터 선택된 하나 이상의 반복단위를 포함하는 중합체로서,
    Figure 112019500356823-pat00020
    (M1),
    Figure 112019500356823-pat00021
    (M2)
    식 중 R1, R3, R4 및 R6은 독립적으로 단순결합 또는 치환 또는 비치환된 -C1-6-알킬렌-이고, R2 및 R5는 독립적으로 H, 할로, 또는 치환 또는 비치환된 C1-6-알킬-이고, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 치환된 경우 치환기는 할로 또는 C1-3-알킬-인 기이고,
    A1 및 A2는 서로 독립적으로 -NH-, -O- 또는 -O-(CO)-이고,
    X 및 Y는 서로 독립적으로 -H, 2 이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, PEG 및 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 중합체가 1이상 고정화되어 있는 고체 지지체로서,
    상기 2 이상의 히드록시를 갖는 기는 하기 식 1의 기로서,
    Figure 112019500356823-pat00022
    (식 1)
    식 중 R7은 치환 또는 비치환 -C1-6-알킬렌-, 치환 또는 비치환 -C6-12-아릴렌-, -C1-6-알킬렌-C6-12-아릴렌-, 또는 -C6-12-아릴렌-C1-6-알킬렌-이고, R8, R9 및 R10은 독립적으로 H, 할로, 또는 치환 또는 비치환된 C1-6-히드록시알킬-로서 R8, R9 및 R10 중 2 이상은 상기 히드록시알킬이고, R7, R8, R9 및 R10이 치환된 경우 치환기는 할로 또는 C1-3-알킬-인 것이고,
    상기 쌍성이온성 기는 하기 식 3 또는 식 4의 기로서,

    Figure 112019500356823-pat00023
    (식 3),
    Figure 112019500356823-pat00024
    (식 4)
    식 중 R11, R12, R17 및 R19는 독립적으로 치환 또는 비치환 -C1-6-알킬렌-, 치환 또는 비치환 -C6-12-아릴렌-, 치환 또는 비치환 -C1-6-알킬렌-C6-12-아릴렌-, 또는 치환 또는 비치환 -C6-12-아릴렌-C1-6-알킬렌-이고, R13, R14, R15, R16 및 R18은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 -C1-6-알킬-이고, 치환된 경우 치환기는 할로 또는 -C1-3-알킬인 것이고,
    상기 중합체는 고체 지지체에 결합하는 상기 반복단위를 제외한 상기 반복단위의 10% 내지 90%가 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질을 갖는 것이고, 상기 중합체는 고체 지지체에 결합하는 식 M1으로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위와 M2로부터 선택된 하나 이상의 반복단위 중 어느 하나의 반복단위를 제외한 다른 반복단위의 10% 내지 90%가 2 이상의 히드록시를 갖는 기, 쌍성이온성 기, 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 갖는 것이고, 상기 중합체는 M1은 1-300개이고, M2는 1-300개인 것이고, M1과 M2는 서로 다른 것이고, 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 항체, 항체에 대한 항원, 리간드에 대한 수용체, 수용체에 대한 리간드, 효소의 기질 또는 저해제, 또는 기질 또는 저해제에 대한 효소인 것인 고체 지지체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 생물분자는 단백질, 핵산 및 당으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 고체 지지체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 단백질, 핵산, 당 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 고체 지지체.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 마이크로베지클의 막에 존재하는 단백질에 결합하는 항체인 것인 고체 지지체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드, 플레이트 또는 웰의 형태를 갖는 것인 고체 지지체.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 고체 지지체에 결합된 부분을 제외하고, R1 및 R4는 -CH2-이고, R3 및 R6은 단순 단일결합이고, R2 및 R5는 -H이고,
    A1 및 A2는 -NH-인 중합체가 1 이상 고정화되어 있는 고체 지지체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 중합체는 A1 및 A2가 -O-이고, X 및 Y가 H인 M1 또는 M2를 갖고, 상기 고체 지지체는 M1 또는 M2의 카르복실기와의 결합을 통하여 상기 중합체에 연결된 것인 고체 지지체.
  16. 청구항 1의 고체 지지체를 시료 중의 상기 생물분자와 접촉시켜 상기 생물분자와 고체 지지체의 복합체를 형성하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 생물분자를 고체 지지체에 결합시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 접촉 단계 후에 상기 복합체를 세척하는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 접촉 단계 후에 상기 복합체로부터 생물분자를 용출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 생물분자는 단백질, 핵산 및 당으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제16항에 있어서, 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 단백질, 핵산, 당 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제16항에 있어서, 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 항체, 항체에 대한 항원, 리간드에 대한 수용체, 수용체에 대한 리간드, 효소의 기질 또는 저해제, 또는 기질 또는 저해제에 대한 효소인 것인 방법.
  25. 제16항에 있어서, 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 마이크로베지클의 막에 존재하는 단백질에 결합하는 항체인 것인 방법.
  26. 제16항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드, 플레이트 또는 웰의 형태를 갖는 것인 방법.
  27. 제16항에 있어서, 상기 시료는 마이크로베지클 또는 그 파쇄물을 포함하는 시료이고, 상기 생물분자에 특이적으로 결합하는 물질은 마이크로베지클 유래 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것인 방법.
  28. 제17항에 있어서, 상기 세척 단계 후에 상기 복합체로부터 생물분자를 용출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  29. 제18항에 있어서, 상기 접촉 단계 후 및 상기 용출 단계 전에 상기 복합체를 세척하는 단계를 더 포함하는 방법.
  30. 제16항에 있어서, 상기 시료 중의 생물분자가 상기 중합체와 결합하는지를 확인하는 단계 및
    상기 생물분자가 상기 중합체가 결합하는 경우, 상기 시료 중에 상기 생물분자가 존재하는 것으로 결정하고, 상기 생물분자가 상기 중합체가 결합하지 않는 경우, 상기 시료 중에 상기 생물분자가 존재하지 않는 것으로 결정하는 단계;를 포함하는 방법.
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