JP5394074B2 - ポリマー - Google Patents
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Description
骨格よりも複数の炭水化物に起因して特性が制御される材料を特徴付ける糖ポリマーのライブラリを作成するのに特に有用であると考えられる。アジド糖とアルキンモノマーの併用は興味深いと考えられ、逆に(over the reverse)、同一分子中のアジド基の数を低減させ且つ十分に裏付けされたアジド官能性糖を利用するという安全性の観点から、アルキン機能性糖とアジドポリマーの併用も興味深いと考えられる。本発明は他のペンダント側基、例えば、アルキル基、ポリアルキレングリコール基、及びリン脂質基にも適用可能である。
(i)(a)保護基で保護されてもよいアジド基、又は(b)保護基で保護されてもよいアルキン基で官能化されるオレフィン性不飽和モノマーを、リビングラジカル重合、最も好ましくはRAFT(可逆的付加型開裂連鎖移動重合(Reverse Addition-Fragmentaion Chain Transfer Polymerisation))、遷移金属媒介リビングラジカル重合(TMM−LRP)及び/又は原子移動ラジカル重合によって重合することにより、ポリマー中間体
を生成すること、
(ii)存在する場合には、ポリマー中間体から保護基の総数の少なくとも一部を除去すること、及び
(iii)ポリマー中間体を、(a)アルキン基又は(b)アジド基で各々官能化された少なくとも1つのペンダント側基部分と反応させて、アルキン基及びアジド基が反応しペンダント側基をポリマー中間体に結合させること、
を含む、ペンダント側基を有するポリマーを製造する方法を提供する。
れらは、モノマー(単糖類)(例えばフルクトース若しくはグルコース)又は二糖類、五糖類若しくは多糖類を形成するように互いに結合する2つ以上の糖から成るより複雑な糖であってもよい。種々の糖は、このような二糖類及び多糖類を形成するように共に形成され得る。二糖類としては、グルコース及びフルクトースから成るスクロース等の糖が挙げられる。多糖類としてはデンプン及びセルロースが挙げられる。糖という用語は、置換糖及び非置換糖の両方、並びに糖の誘導体を含む。好ましくは、糖は、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、マンノース、ラクトース、フコース、及びそれらの誘導体、例えばシアル酸、グルコサミンの誘導体から選択される。糖は好ましくはα又はβである。糖は特に、マンノースピラノシド又はガラクトースピラノシドであってもよい。また糖は、1つ若しくは複数のヌクレオシド、例えば3−アジド−3−デオキシチミジン(Aldrich Ltd(United Kingdom)から市販されている)、又は1つ若しくは複数のヌクレオチドであってもよい。糖上のヒドロキシル基は、例えば1つ又は複数のアセチル基で保護されていてもよい。糖は好ましくはN−アセチル化されている。このような糖の好ましい例としては、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸、ノイラミン酸、N−アセチルガラクトース、及びN−アセチルグルコサミンが挙げられる。このようなN−アセチル化された糖は大抵の場合、細胞表面上に存在し、生物体における表面認識に関与している。例えば、それらは、タンパク質、ホルモン、ウイルス、微生物、寄生虫、又は生物体内の他の細胞に関する受容体によって認識される。
6/003352号に記載されている。
酸で緩衝処理を施したTBAF(テトラブチルアンモニウムフルオライド)を用いてアルキン基を処理することによってポリマー中間体から除去される場合、ポリマー中間体から除去される保護基の数が改良されることを予想外に見出した。
(i)各開始剤は、α末端が開始剤に直接由来する1つのポリマー鎖かつ唯一のポリマ
ー鎖をもたらし、
(ii)停止反応がないことにより、停止反応の結果である二官能性生成物の存在がなくなり、
(iii)分子量分布が他の反応によるよりも厳密に制御され、
(iv)複雑な化学変換を実行する必要なく、重合プロセスにより、官能基の導入、例えば開始剤によってタンパク質を結合させることが可能となる
として、請求項に記載の発明と連動すると考えられる。
(i)移動可能な原子又は基を含む開始剤、及び
(ii)重合反応を触媒することができる触媒、
の使用を含む。
Sons) (2002)(参照により本明細書中に援用される)に記載されている。
A−S−C(O)−R、A−S−C(S)−O−R、R−S−C(O)−A、R−S−C(S)−O−A(ここで、Rは、C1〜C20置換又は非置換の直鎖、分枝鎖、環状、複素環式又は芳香族のアルキル;
X=Cl、Br、I、OR20、SR21、SeR21、OP(=O)R21、OP(=O)R21、OP(=O)(OR21)2、OP(=O)O21、O−N(R21)2及びS−C(=S)N(R21)2(ここで、R20=C1〜C20アルキルであり、水素原子の1つ又は複数がハロゲン化物によって独立して置換されてもよく、R21がアリール又は線状若しくは分枝状C1〜C20アルキル基であり、且つ(NR21)2基が存在するときは、2つのR21基が結合して5員複素環又は6員複素環を形成し得る)であり、
Aは、ポリマーに結合された場合、タンパク質又はポリペプチド等の生体分子と結合し
得る部分であり、
Bはリンカーであり、存在しても存在し得なくてもよい)
から選択される。
を有する。
を有する。
される。
第一化合物MY(ここで、Mは、一形式酸化状態により酸化され得る遷移金属、特にCu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ru2+、Ru3+、Cr2+、Cr3+、Mo2+、Mo3+、W2+、W3+、Mn3+、Mn4+、Rh3+、Rh4+、Re2+、Re3+、Co+、Co2+、V2+、V3+、Zn+、Zn2+、Au+、Au2+、Ag+及びAg2+であり、Yは一価又は二価の対イオンである);及び
窒素の少なくとも1つが芳香族環の一部でないオルガノジイミン、
を含む。
[MLm]n+An-
(式中、
M=一形式酸化状態により酸化され得る遷移金属、特にCu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ru2+、Ru3+、Cr2+、Cr3+、Mo2+、Mo3+、W2+、W3+、Mn3+、Mn4+、Rh3+、Rh4+、Re2+、Re3+、Co+、Co2+、V2+、V3+、Zn+、Zn2+、Au+、Au2+、Ag+及びAg2+であり、
A=陰イオンであり、
n=1〜3の整数であり、
m=1〜2の整数であり、
L=窒素の少なくとも1つが芳香族環の一部でないオルガノジイミンである)
の化合物を含む。
R1、R2、R10、R11、R12及びR13は独立して変更可能であり、R1、R2、R10、R11、R12及びR13は、H、直鎖、分枝鎖もしくは環状の飽和アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アリール(例えば、フェニル又は置換フェニル(置換はR4〜R9について記載される通りである))、CH2Ar(ここで、Arはアリール又は置換ア
リールである)又はハロゲンであってもよい)から選択される式を有する。好ましくはR1、R2、R10、R11、R12及びR13は、C1〜C20のアルキル、ヒドロキシアルキル又はカルボキシアルキル、特にC1〜C4アルキル、特にメチル又はエチル、n−プロピルイソプロピル、n−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、シクロヘキシル、2−エチルヘキシル、オクチル、デシル又はラウリルであり得る。
R14=水素、C1〜C10分枝鎖アルキル、カルボキシ−又はヒドロキシC1〜C10アルキルである)。
CuBrと組み合わせた
ント側基を有するポリマーを提供する。好ましくはポリマーの分子量は5000Da〜100000Daである。
から選択される基を含む。
なる官能基が結合した第2のブロックに結合して生成されてもよい。
側基又は末端基、生体分子と結合し得る部分、及び開始剤化合物は好ましくは、本発明の先行するいくつかの態様について上記で定められた通りである。
(i)(a)保護基で保護されてもよいアジド基、又は(b)保護基で保護されてもよいアルキン基で官能化される有機担体又は無機担体を準備すること、
(ii)存在する場合には、官能化された担体から保護基の総数の少なくとも一部を除去すること、及び
(iii)官能化された担体を、(a)アルキン基又は(b)アジド基で各々官能化された少なくとも1つのペンダント側基部分と反応させて、アルキン基及びアジド基が反応しペンダント側基を担体に結合させること、を含む、ペンダント側基を含む担体を製造する方法を提供する。
気体又は液体であってもよい。キラル選択性は通常、キラル固定相を使用することによって得られる。
Keller及びWycoffの方法に従って臭化銅(I)(Aldrich、98%)を精製した(Keller R N, Wycoff H D (1946) 1-4)。2−ブロモ−2−メチル−プロピオン酸ベンジルエステル開始剤(2)(Hovestad N J, et al., Macromolecules (2000), 33 (11): 4048-4052)、メチル−[6−アジド−6−デオキシ−α−D−グルコピラノシド(8)(Wu X, et al., Bioorg. Med. Chem. (2002), 10 (7): 2303-2307)、[(PPh3)3CuBr](Gujadhur R, et al., Tetrahedron Lett. (2001), 42 (29): 4791- 4793)、3−アジド−1−プロパノール(Mantovani G, et al., Chem. Commun. (2005), (16): 2089-2091)、過アセチル化したマンノース(Mukhopadhyay B, et al., J. Org. Chem. (2004), 69
(22): 7758-7760)、及びN−(エチル)−2−ピリジルメタンイミン(Haddleton D M,
et al., Macromolecules (1997), 30 (7): 2190-2193)を以前に記載されているように調製し、0℃で保存した。トリメチルアミン(Fischer、99%)を水酸化ナトリウムペレット上に保存した。無水THF(Romil 製の「Hi−Dry」、99.99%)を乾燥窒素下で、活性化させた4Å分子篩上に保存した。Aldrichからのメタノール(0.20M)中のテトラn−ブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)をそのままの状態で(as
received)使用した。2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルアジド(12)を含む全ての他の試薬及び溶媒は、Aldrich Chemical Companyから入手可能な高純度で得られるため、記述がない限りさらなる精製せずに使用した。
特に指定のない限り標準的なシュレンク技法を用いて、酸素を含有しない窒素の不活性雰囲気下で全ての反応を実行した。Rf値は、事前に被覆されたシリカゲル60 F254を用いて実施され且つ示される溶媒系中で展開される分析TLCを示す。初めに、TLCプレートをサンプルの適用前にチャンバ溶媒中で濯いだ。化合物をUV光(254nm)又はKMnO4の塩基性溶液(水中10%w/w K2CO3)を使用して視覚化した。Merck 60(230〜400メッシュ)シリカゲルをカラムクロマトグラフィに用いた。2つのPLゲル5μmを混合させたD−カラム(300×7.5mm)及び1つのPLゲル5mmガードカラム(50×7.5mm)(Polymer Laboratories、分子量200g/mol〜400000g/molに好適)を備えたシステムにおいて、1.0mL/分で95:5(vol/vol)のTHF/トリエチルアミンを溶離液として用いて示差屈折率検出により、モル質量分布をサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を用いて測定した。ポリ(MMA)標準(1・106g/mol〜200g/mol)をSECを較正するのに用いた。検体サンプルは、(0.2%vol)トルエンをフローマーカーとして含有していた。Mn 対 変換率(%)プロット中で記録されたMnは、PMMA標準で較正されたSECデータから得られ、補正はされていない。それらのプロットは、変換率に伴うMnの結果を示すために記録される。ガードカラム及び2つの混合Cカラム(200g/mol〜2000000g/mol)と直列に連結させた、低角レーザー光散乱検出器(LALLS;5°、2−mW HeNeレーザー、Polymer Laboratories)及び濃度検出器(DRI)を備えたゲル浸透クロマトグラフィ(PL−LALS)によって、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)/0.1M LiBr 0.8mL/分を溶離液として用いて絶対重量平均分子量(Mw)を測定した。屈折率の増大(dn/dc)は濃度検出値(detector)の積分によって導き出され、且つMwの計算に用いた。SEC−LALLSシステムの光散乱セルを狭い分子量PMMA標準(PL)で較正した。サンプルを12mg/mL濃度、100μL容積で注入した。Shodex AFpak ARC−894カラム及びHitachi L−7480蛍光検出器を備えたHPLCシステムを用いて、RCA I認識実験を実施した。Bruker DPX300スペクトロメータ及びBruker DPX400スペクトロメータを用いてNMRスペクトルを得た。残留溶媒共鳴の化学シフト(1H及び13C)を参照して、全ての化学シフトをテトラメチ
ルシランに対してppm(δ)で記録する。以下の省略は、多重度:s=一重項、d=二重項、dd=二重項の二重項、bs=幅の広い一重項、m=多重項を説明するのに用いた。ポリマーの分子量Mn(NMR)は、鎖末端シグナル及びポリマー骨格に関する適切なピークの積分を比較することによって算出した。Varian Cary 50 Bio
UV−Visスペクトロメータを用い、2mL容ポリカーボネートキュベット(1cm経路長)を用いて比濁法検査を実施した。Perkin Elmer Lambda 25 UV−Visスペクトロメータ及び2mL容石英キュベット(1cm経路長)を定量沈降(QP)実験に用いた。Bruker VECTOR−22 FTIRスペクトロメータにおいて、Golden Gateダイアモンド減衰全反射セルを用いて赤外吸収スペクトルを記録した。Micromass Autospec装置を用いてマススペクトルを記録した。Kiessling及び共同研究者らによって記載されているように比濁法及び定量沈降検査を実施した(Cairo C W, et al., J. Am. Chem. Soc. (2002), 124 (8): 1615-1619)。融点はBuchi 510装置においてオープンガラスキャピラリーを用いて測定し、データは補正していない。収率は最適化していない。
2−メチル−アクリル酸3−トリメチルシラニル−プロプ−2−イニルエステル(1):
トリメチルシリルプロピン−1−オール(10.0g、78.0mmol)及びEt3N(14.2mL、101.3mmol)のEt2O(100mL)溶液を−20℃に冷却し、メタクリロイルクロリド(8.8mL、93mmol)のEt2O(50mL)溶液を約1時間かけて滴下した。この混合物をこの温度で30分間攪拌した後、環境温度で一晩攪拌し、アンモニウム塩を濾過によって除去し、揮発分を減圧下で除去した。黄色油性残渣の1H NMR分析によって、相当量の不純物の存在はいずれも明らかにならなかったが、2つのさらなる不鮮明な斑点がTLC(石油エーテル/Et2O 20:1)分析により観測されたため、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ(CC、SiO2、石油エーテル/Et2O 50:1;石油エーテル/Et2O 20:1中Rf=0.67)により精製した。得られた12.4g(63.2mmol、81%)(注記:大量調製(10g以上)について、最良の分離は、カラムを100%石油エーテルで溶離させ、その後、モノマー(1)の大部分がカラムから既に除去されている場合、石油エーテル/Et2O 50:1で溶離させることによって得られた。IR(neat):ν=2960,1723,1638,1452,1366,1314,1292,1251,1147,1035,971,942,842,813,761cm-1。1H NMR(400.03MHz、CDCl3、298K)δ=0.16(s,9H,Si(CH3)3);1.93〜1.94(m,3H,CH3C=CH2);4.73(s,2H,OCH2);5.58〜5.59(m,1H,C=CHH);6.14(m,1H,C=CHH)。13C{1H}NMR(100.59MHz、CDCl3、298K)δ=−0.2(3C,Si(CH3)3);18.4(1C,CH3C=CH2);53.0(1C,OCH2);92.0(1C,C≡CSi(CH3)3);99.2(1C,C≡CSi(CH3)3);126.5(1C,CH 3 C=CH2);135.8(1C,CH3C=CH2);166.6(1C,COエステル)。C10H16O2Siに関する分析計算値(Anal. Calcd.):C,61.18;H,8.21;N,0.00;実測値(Found):C,60.89;H,8.22;N,0.00;マススペクトロメトリ(+ESI−MS)m/z(%):219[M+Na](100),197[MH+](40)。
市販のペンタアセチルガラクトースから出発し、1−α−ブロモ−2,3,4,6−テトラアセチル−D−ガラクトースを介して先に記載されているように生成物を調製し、その報告されている不安定性から、対応するアジドの合成に直ちに用いた(Maier M A, et al., Bioconjugate Chem. (2003), 14 (1): 18-29)。1−α−ブロモ−2,3,4,6−テトラアセチル−D−ガラクトース 1H NMR(400.03MHz,CDCl3,
298K)δ=2.02(s,3H,CH3);2.07(s,3H,CH3);2.12(s,3H,CH3);2.16(s,3H,CH3);4.10〜4.22(m,2H,CH2);4.48〜4.50(m,1H,CH);5.06(dd,J=10.6,3.8Hz,1H,CH);5.41(dd,J=10.6,2.9Hz,1H,CH);5.53(bs,1H,CH);6.72(d,J=3.8Hz,1H,CH)。13C{1H}NMR(100.59MHz,CDCl3,298K)δ=20.58(1C,CH3);20.61(1C,CH3);20.65(1C,CH3);20.74(1C,CH3);60.8(1C,CH);66.9(1C,CH);67.7(1C,CH);67.9(1C,CH);71.0(1C,CH);88.1(1C,CHBr);169.7(1C,CO);169.9(1C,CO);.170.0(1C,CO);170.3(1C,CO)。1−β−アジド−2,3,4,6−テトラアセチル−D−ガラクトース(12):(ペンタアセチルガラクトースからの全収率89%)m.p.93〜95℃(詳細には(lit.)94〜96℃9)。IR(neat):ν=2984,2124,1736,1435,1373,1273,1210,1167,1167,1117,1082,1047,952,902,842,759,718cm-1。1H NMR(400.03MHz,CDCl3,298K)δ=1.98(s,3H,CH3);2.05(s,3H,CH3);2.08(s,3H,CH3);2.16(s,3H,CH3);4.00(m,1H,CHHO);4.14〜4.17(m,2H,CHHO+CH);4.59(d,J=8.8Hz,1H,CH);5.02(dd,J=10.4,3.3Hz,1H,CH);5.15(dd,J=10.4,8.7Hz,1H,CH);5.41(dd,J=3.3,3.8Hz,1H,CH)。13C{1H}NMR(100.59MHz,CDCl3,298K)δ=20.65(1C,CH3);20.74(1C,CH3);20.78(1C,CH3);20.80(1C,CH3);61.3(1C,CH2);66.9(1C,CH);68.1(1C,CH);70.8(1C,CH);72.9(1C,CH);88.4(1C,CHN3);169.5(1C,CO);170.1(1C,CO);.170.3(1C,CO);170.5(1C,CO)。C14H19N3O9に関する分析計算値:C,45.04;H,5.13;N,11.26;実測値:C,45.05;H,5.07;N,10.63。
16(dd,J=12.3,5.3Hz,1H,H’−6);4.73(d,J=1.5Hz,1H,H−1);5.12−5.13(m,1H,H−2);5.16−5.19(m,2H,H−3,H−4)。13C{1H}NMR(100.59MHz,CDCl3,298K)δ=20.52(1C,CH3);20.55(1C,CH3);20.60(1C,CH3);20.71(1C,CH3);30.00(1C,CH2CH2Br);31.91(1C,CH2CH2Br);62.30(1C,CH2OAc);65.41(1C,CH2CH2O);65.91(1C,CH);68.56(1C,CH);68.956(1C,CH);69.32(1C,CH);97.51(1C,Canomeric);169.53(1C,CH3C(O)O);169.71(1C,CH3C(O)O);169.82(1C,CH3C(O)O);170.40(1C,CH3C(O)O)。C17H25N3O10に関する分析計算値:C,47.33;H,5.84;N,9.74;実測値:C,47.38;H,5.90;N,9.47;C17H24BrO10に関するHRMS−ES計算値(M−H):467.0553:実測値467.0562。
et al., Chem. -Eur. J. (2004), 10 (17): 4240-4251)91%収率。IR(neat):ν=3360(bs),2930,2886,2094,1643,1374,1299,1260,1143,1115,1041,949,915,893,783,75
7cm-1.1H NMR(400.03MHz,CDCl3,298K)δ=1.86(見かけの五重線、J=6.4Hz,2H,CH2CH2N3);3.45(t,J=6.4Hz,2H,CH2N3);3.50−3.55(m,2H,H−2 + H−5);3.64(dt,J=10.0,6.2Hz,1H,OCHHCH2);3.73(d,J=6.0Hz,2H,H’−6 + H’’−6);3.86(dd,J=2.9,1.0Hz,H−4);3.95(dt,J=10.0,6.2Hz,1H,OCHHCH2);4.22(m,1H,H−1)。13C{1H}NMR(100.59MHz,CD3OD,298K)δ=30.19(1C,CH2CH2N3);49.32(1C,CH2CH2N3);62.32(1C,CH2OH);67.46(1C,CH2CH2O);70.13(1C,CH);72.44(1C,CH);74.86(1C,CH);76.468(1C,CH);104.93(1C,Canomeric);C9H18N3O6に関するHRMS−ES計算値(M+H):264.1196:実測値264.1194。
クマリン343(0.285g,1.00mmol)及び3−アジド−1−プロパノール(0.505g,5.00mmol)のCH2Cl2(20mL)溶液を0℃に冷却し、EDC・HCl(0.575g,3.00mmol)及びDMAP(0.006g,0.05mmol)を続けて添加した。この橙色の溶液を0℃で2時間攪拌した後、環境温度で一晩攪拌した。反応混合物を水(2×50mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。揮発分を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ(CC、SiO2、1)100%CH2Cl2;2)CH2Cl2/Et2O10:1)によって精製した。単離生成物は依然としていくらかの3−アジド−1−プロパノール出発材料を含有しており、次に減圧下でのトルエンによる同時蒸着によってこれを除去した。数日にわたって環境温度で静置することによって部分的に凝固する橙色の油として(28)が0.110g(0.299mmol、30%)で得られた。
N−(エチル)−2−ピリジルメタンイミンリガンド(0.072mL、0.51mmol)、(1)(2.0g、10.2mmol)、開始剤(2)(0.065g、0.25mmol)及びメシチレン(内部NMR標準、0.5mL)を溶媒としてトルエン(4.0mL)と一緒に乾燥シュレンク管内に充填した。管をゴム隔膜で封止し、5回の凍結
−吸引−解凍(freeze-pump-thaw)サイクルを行った。その後この溶液を、窒素下でカニューレを介して第2のシュレンク管内へ移した。この第2のシュレンク管は、予め排気させ窒素で充填されており、Cu(I)Br(0.036g、0.25mmol)及び磁気フォロアー(magnetic follower)を含有したものであった。温度を一定攪拌により70℃に調節した(t=0)。脱気したシリンジを用いてサンプルを周期的に取り出し、分子量及び変換率を分析した。重合終了時に、混合物を10mLのトルエンで希釈し、空気で4時間かけて泡立たせた。反応混合物を短い中性アルミナカラムに通過させ、続いてトルエンで洗浄した。揮発分を減圧下で除去し、残留物をTHF(約10mL)中に溶解させた後、10:2vol/volメタノール/水混合物(約200mL)中へ沈降させた。白色固体を濾過によって単離し、さらなるメタノール/水混合物で洗浄し、揮発分を減圧下で除去した。5.1ppmにおける開始剤ベンジルシグナルの積分を、4.4ppmにおけるアルキン分枝鎖と結合するC(O)OCH2基の積分と比較することによって、ポリマーの分子量を1H NMRにより算出した。4.4ppmの代わりに0.2ppmにおけるSi(CH3)3の一重項を用いた場合、実質的に同じ分子量が得られた。メシチレン(6.9ppm)のピークを内標準として用い、モノマービニルシグナル(5.6ppm及び6.2ppm)の積分を下げることによって、変換率を1H NMRによって算出した。代替的には、モノマーのC(O)OCH2プロトン(bs,4.6ppm、経時的に低減)に対する積分と、ポリマーの類似C(O)OCH2プロトン(幅の広いシグナル、4.4ppm、経時的に増大)に対する積分との比較によって変換率を算出した。DP(NMR)=75;Mn(NMR)14.7kDa;Mw/Mn(GPC)=1.16;開始効率=41%;変換率82%。
トリメチルシリルで保護されたポリマー(300mg)及び酢酸(アルキン−トリメチルシリル基に対する1.5当量mol/mol)をTHF(20mL)中に溶解させた。窒素を泡立て(約10分)、無色の溶液を−20℃に冷却した。TBAF−3H2O(アルキン−トリメチルシリル基に対する1.5当量mol/mol)の0.20M溶液をシリンジによって徐々に添加した(約2〜3分)。得られた混濁混合物をこの温度で30分間攪拌した後、環境温度に温めた。3時間未満で脱保護を完了させて、ホモポリマー(3a)及びMMAコポリマー(6)を得た。mPEG MAを含むコポリマー(9)では、おそらく、ポリマー骨格上のmPEG側の分枝によってもたらされるより大きい立体障害のために、より長い反応時間(16時間)が必要であった。過剰なTBAFを除去するために反応溶液を短いシリカパッドに通過させ、続いてパッドをさらなるTHFで洗浄した。その後得られた溶液を減圧下で濃縮し、ポリマーを石油エーテル中に沈降させた。
ポリマー(4a)(50mg、「クリック可能」アルキン単位0.40mmol)、アジド糖(12)(225mg、0.604mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、26mg、35μL、0.20mmol)のTHF(5mL)溶液を、窒素を10分間泡立たせることによって脱気した。その後、[(PPh3)3CuBr](37.5mg、0.402mmol)を添加し、得られた溶液中にさらに5分間窒素を泡立たせた。この非常に淡い黄色の澄んだ溶液を環境温度で3日間攪拌した後、短い中性アルミナパッドに通過させてTHFで溶離した。得られた溶液を減圧下で濃縮し、石油エーテル(200mL)中に沈降させた。懸濁液を遠心分離し、得られた固形分をTHF中に再溶解させた。イオン交換樹脂の存在下で溶液を1時間攪拌し、濾過し、1:1のEt2O/石油エーテル混合物(150mL)中で再度沈降させた。遠心分離により固形分を分離し、ポリマー(5a−12)をオフホワイトの固形分として得た。
ポリマー(4b)(100mg、「クリック可能」アルキン単位0.806mmol)、アジド糖(18)(223mg、0.847mmol)及び(22)(74.25mg、0.281mmol)、並びにトリエチルアミン(41mg、0.40mmol)のDMSO(7mL)溶液を、窒素を10分間泡立たせることによって脱気した。その後、[(PPh3)3CuBr](150mg、0.161mmol)を添加し、得られた溶液中にさらに5分間窒素を泡立たせた。この非常に淡い黄色の澄んだ溶液を環境温度で3日間攪拌した後、イオン交換樹脂(150mg)を添加し、懸濁液を4時間穏やかに攪拌した。濾過し、さらにイオン交換樹脂(150mg)を添加した後、懸濁液を環境温度で一晩攪拌した。濾過後、溶液を2:1 CH2Cl2/メタノール混合物に滴下し、遠心分離によりポリマーを分離した。依然として存在する微量のDMSOを除去するために、沈降したポリマーを水中に溶解し、THF中で再沈殿させた。粘着性生成物を遠心分離によって単離し、最少量の水中に溶解させ、凍結乾燥させて、ポリマー(23)を明るい白色粉末として得た。
手順2を用い(反応時間=96時間)、以下の試案に従った:トリメチルアミンを減圧下で反応混合物から除去し、その得られた溶液をイオン交換樹脂の存在下で一晩攪拌させた。濾水(250mL)によって単離した樹脂を添加し、得られた溶液を遠心分離した。上澄み液を透析によって精製し、ポリマーを凍結乾燥によって単離した。
(用いられるアジド試薬の合計量に対して)2.5%のクマリンアジド(28)を用いて、手順2を使用した。
各サンプルを3通りに分析した。
検査は、0.10M Tris・HCl(pH7.2)、0.9M NaCl、1mM
CaCl2及び1mM MnCl2を沈降バッファとして用い(Khan M I, et al., Carbohydr. Res. (1991), 213: 69-77)且つポリマー−ConA凝集体を1mLの1M α−D−メチルマンノピラノシド中に再溶解させた以外、Kiessling及び共同研究者ら(Cairo
C W, et al., J. Am. Chem. Soc. (2002), 124 (8): 1615-1619)によって記載されているように実施した(図2参照)。
Kiessling及び共同研究者ら(Cairo C W, et al., J. Am. Chem. Soc. (2002), 124 (8): 1615-1619)によって記載されているように、0.12秒毎にスペクトルをとって検査を実施した。示したデータは3つの独立した実験結果の平均である。結果を図3、図4及び図5に示す。
「クリック可能」アルキンポリマーの合成
トリメチルシリルメタクリレートモノマー(1)は、市販の3−トリメチルシリルプロ
ピン−1−オール及びメタクリロイルクロリドから一工程で調製した。芳香族プロトン及びベンジルプロトンが両方とも、対応するポリマーの数平均分子量(Mn(NMR))を確定するのに1H NMR内標準として用いられ得ることから、O−ベンジルα−ブロモエステル(2)76を開始剤として選択した(スキーム1)。Cu(I)Br/N−(n−エチル)−2−ピリジルメタンイミン触媒77の存在下におけるMMA及びmPEG300MAによる(1)のホモ重合及び共重合は両方とも優れた一次動態プロットを与え、ポリマー分子量及び分子量分布に関する良好な制御を示す(図2及び表1)。(1)のホモ重合では、精製したポリマーの多分散度指数(Mw/Mn)が、比較的高いモノマー変換率(80%より大きい)であっても1.15と同程度に低いことに留意されたい。提案された合成手法の多用性を確認するために、有機溶媒及び水性溶媒中で全く異なる溶解性を有する何種類かのポリマーを調製した。疎水性及び親水性コポリマーをそれぞれ与えることから、メチルメタクリレート(MMA)及びメトキシ(ポリエチレングリコール)300メタクリレート(mPEG300MA)をモデルコモノマーとして選択した。その上、ポリエチレングリコールは、非特異的タンパク質結合を誘導しないことが示されており、この非特異的タンパク質結合は、後で報告するレクチン結合の解釈において重要である78。
の添加は予想された末端アルキンポリマーを実質的に100%の収率でもたらすのに十分であることが見出された79。トリメチルシリル基の完全な除去は、2.5ppmにおけるC≡CHシグナルの出現に加えて0.2ppmにおけるSi(CH3)3シグナルの消滅を伴う1H NMR分析、及び3291cm-1におけるアルキンC−H伸縮振動数を伴うFT IR分析の両方で確認された。またSEC分析により、予想通りに、ポリマーの水力学的体積が脱保護後に減少するのに対し、多分散度指数は変化しないままであることが明らかとなった。SEC分析用の低角レーザー光散乱(LALLS)検出器(5°)により、トリメチルシリル基の除去前後にポリマーの絶対Mw値を測定した。得られた結果であるMw(3b)=19.8kDa及びMw(4b)=13.0kDaは、これらのポリマーの相対多分散度指数と組み合わせて、数平均分子量であるMn(3b)=17.3kDa及びMn(4b)=11.3kDaを示し、これは1H NMR分析によって得られたデータと十分一致していた(Mn(NMR)(3b)=17.7kDa及びMn(NMR)(4b)=11.2kDa)。
続いて、本発明者らは種々の種類の糖ポリマーの調製についてこの合成手法を履行し、特に、適切なレクチンと結合することができる材料に着目した。コンカバリンA(ConA)は、その化学的挙動及び生物学的挙動の両方に焦点を当てた大量の文献を踏まえ、多くの生物学的プロセスとの関係に起因してモデルα−マンノース−結合レクチンとして選択された80〜84。ConAは、高次オリゴマー構造中の26kDaモノマー単位の凝集体である。pH範囲5.0〜5.6では、ConAが排他的に二量体として存在するのに対し、これより高いpHでは二量体が結合して四量体となり、四量体はpH7.0で最も優勢な形態である44。各モノマー単位は、α−グルコピラノシド誘導及びα−マンノピラノシド誘導体を選択的に結合する能力があり、好ましくはC2にマンノ(manno-)構造を含む、1つの配位部位を有する57、85。
た。所望のアジド官能性モノマー(18)及び(22)を、ブロミド中間体を対応するアジド((17)及び(21))に変換し、その後酢酸保護基を除去することによって得た。
開発した手法の多用性は、原理上、所望の機能を実行する誘導体が必要なアジド基を含有する限り、多くのさらなる異なる官能基をポリマー骨格へ付加することを可能にする。高分子骨格における視認可能な蛍光性のタグを「同時クリック」する可能性は興味深いものであると考えられるが、その理由は、結合要素及びリポーター単位(reporter unit)の両方を示す得られる多価リガンドが、タンパク質−炭水化物結合相互作用の研究において極めて有用であるとして知られているからである95、96。蛍光性糖ポリマーは、細胞表面相互作用97、98、抗癌療法99、レクチン認識分析100、101、PEG化化学作用102、L−セレクチン結合95及び精子安定性研究103を含む一連の用途で使用されていた。リビングラジカル重合は、蛍光性開始剤又はモノマーのいずれかを用いることによって視認可能な蛍光性のポリマーを調製するのに使用することができる104。
)と蛍光挙動で異なる類似体である(表5及び図5)。
要約すれば、新規な一連の櫛形糖ポリマーは、適切な糖アジドのフイスゲン1,3双極子環化付加反応によって調製されている。これらの「クリック可能」材料は、ポリマー特性に対して優れた制御を伴うトリメチルシリル−プロパルギルメタクリレートのTMM−LRPによって調製されており、この精製された生成物のMw/Mnは1.09〜1.16である。TMS保護基の除去は、末端アルキン基の十分な保持によって穏やかな条件下で行った。ポリマー骨格上のC−6又はα若しくはβアノマーアジドのいずれかを介した、保護された炭水化物及び保護されていない炭水化物のグラフト化は、Cu(I)触媒されたクリック反応によって首尾良く実施された。レクチン結合研究用ディスプレイのための、多くのマンノース含有多座リガンド及びガラクトース含有多座リガンドを、ポリアルキンメタクリレート骨格上に種々の糖アジドを同時に反応させることによって調製した。この「同時クリック」手法は、高効率官能化後プロセスによる制御されたラジカル共重合の利点と上手く結びついており、これにより、それらのエピトープ密度のみが異なる多価ディスプレイのライブラリがもたらされる。また、蛍光性リガンドは、視認可能な蛍光性アジドタグ、即ちクマリン343誘導体を反応混合物に単に添加するだけで調製された。このためそれらの挙動は、マンノース(ConA)単位及びガラクトース(RCA I)単位と選択的に結合し得るモデルレクチンの存在下で試験した。ConAの場合にはこの研
究によって、ポリマー−タンパク質複合体のクラスタリング速度及び化学量論比は両方とも、使用されるディスプレイのエピトープ密度に応じて決まることが示された。
実験
概括
窒素の不活性雰囲気下における標準シュレンク技法を用いて重合を行った。FirstMateベンチトップ合成機(benchtop synthesizer)(Argonaut Technologies Limited, New Road, Hengoed, Mid Glamorgan, UK)を用いて、同様に窒素下で行う樹脂修飾を行った。
分子量及び多分散度を、Polymer Laboratoriesからのサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を用いて測定した。NMRスペクトルをBruker DPX300及びBruker DPX400スペクトロメータで得た。赤外吸収スペクトルをBruker VECTOR−22 FTIRスペクトロメータでGolden Gateダイアモンド減衰全反射セルを用いて記録した。電界放出走査電子顕微鏡法(FE−SEM)及び共焦点顕微鏡法を用いて、樹脂の表面を画像化した。FE−SEMは、Oxford JSIS分析システムを備える、10kVの加速電圧を有するJoel JSM6100によるものである。HPLC−SECスペクトル及びHPLC−FLスペクトルは、HP 1050
UV検出器、及びHitachi L7480 FL検出器によって求めた。共焦点顕微鏡法実験はZeiss LSM 510システムによって行った。488nmバンドのアルゴンイオンレーザーを用いて、蛍光材料を励起させた。実験機構のフィルタは、505nmを超えて発光する蛍光を測定することができるように選択した。
開始剤2−ブロモ−2−メチル−プロピオン酸3−アジド−プロピルエステル(Mantovani et al 2005, Chem Commun, 2089)、メチルメタクリレート(MMA)、ホスタゾルメタクリレート、N−(n−プロピル)−2−ピリジルメタンイミン、及び内部1H NMR標準としてトルエン中に溶解されるメシチレンを含有する密閉乾燥シュレンクフラスコを、4回の凍結−吸引−解凍サイクルによって脱気した。その後この溶液を、CuBrを含有し、事前に排気した後N2で充填させたカニューレを介して別のシュレンク管内へ移した。重合は90℃で行った。
FirstMateベンチトップ合成機を用いて、Wang樹脂を無水ピリジン及び4−ジメチルアミノピリジンで1時間湿潤させた後、アルキン−エステルを添加した。その後反応混合物を60℃に加熱し、この温度で20時間維持した。
トルエン溶液中のWang樹脂、(PPh3)CuBr及びアジド末端材料を含有する反応管を窒素下で70℃に加熱し、一晩反応させた。ビーズを取り出し、濾過した後、十分に水洗した。
D−マンノース結合レクチンとして選択した。モニタリングを容易にするために、フルオレセインイソチオシアネート結合ConA(FITC−ConA)を使用した。マンノース修飾Wang樹脂をスモールピペット内への充填剤として用いてフラッシュ・フロー(flush and flow)カラムシステムを使用し、1M FITC−ConA溶液を溶離液とて使用し、カラム後の溶液を分析のために回収した。図12に示した結果は、FITC−ConAに対するその結合能が、強度な減少として、カラム前後の同量のサンプルを用いたHPLC及び蛍光検出器の両方により観測されたことを示す。これは共焦点顕微鏡法によっても確認され(図13b)、マンノース修飾Wang樹脂によってFITC−ConAが首尾良く吸収されることが示される。
(A)ガラクトース官能性ポリマーの合成のための手順
1.ガラクトースアジドの合成
ル/石油エーテル(1:4、v/v))によって粗生成物を精製した。関係のある分画を回収し、併せてから、揮発分を減圧下で除去した。得られた収量=10.05g(50.13%)無色粉末。
トリメチルシリルプロピン−1−オール(10.0g、78.0mmol)及びEt3N(14.2mL、101.3mmol)のEt2O(100mL)溶液を−20℃に冷却し、メタクリロイルクロリド(8.8mL、93mmol)のEt2O(50mL)溶
液を約1時間かけて滴下した。この混合物をこの温度で30分間攪拌した後、環境温度で一晩攪拌した。濾過によりアンモニウム塩を除去し、揮発分を減圧下で除去した。フラッシュクロマトグラフィ(CC、SiO2、石油エーテル/Et2O 50:1;石油エーテル/Et2O 50:1中Rf=0.67)によって粗生成物精製した。得られた収量=12.4g(63.2mmol、81%)。
N−(エチル)−2−ピリジルメタンイミンリガンド(0.072mL、0.51mmol)、(6)(2.0g、10.2mmol)、開始剤(5)(0.065g、0.25mmol)及びメシチレン(内部NMR標準、0.5mL)を溶媒としてトルエン(4.0mL)と一緒に乾燥シュレンク管内に充填した。管をゴム隔膜で封止し、5回の凍結−吸引−解凍サイクルを行った。その後この溶液を、窒素下でカニューレを介して第2のシュレンク管内へ移した。この第2のシュレンク管は、予め排気させ窒素で充填されており、Cu(I)Br(0.036g、0.25mmol)及び磁気フォロアーを含有したものであった。温度を一定攪拌により70℃に調節した(t=0)。脱気したシリンジを用いてサンプルを周期的に取り出し、分子量及び変換率を分析した。重合終了時に、混合物を10mLのトルエンで希釈し、空気で4時間かけて泡立たせた。反応混合物を短い中性アルミナカラムに通過させ、続いてトルエンで洗浄した。揮発分を減圧下で除去し、残留物をTHF(約10mL)中に溶解させた後、10:2vol/volメタノール/水混合物(約200mL)中へ沈降させた。白色固体を濾過によって単離し、さらなるメタノール/水混合物で洗浄し、揮発分を減圧下で除去した。5.1ppmにおける開始剤ベンジルシグナルの積分を、4.4ppmにおけるアルキン分枝鎖と結合するC(O)OCH2基の積分と比較することによって、ポリマーの分子量を1H NMRにより算出した。4.4ppmの代わりに0.2ppmにおけるSi(CH3)3の一重項を用いた場合、実質的に同じ分子量が得られた。メシチレン(6.9ppm)のピークを内標準として用い、モノマービニルシグナル(5.6ppm及び6.2ppm)の積分を下げることによって、変換率を1H NMRによって算出した。代替的には、モノマーのC(O)OCH2プロトン(bs,4.6ppm、経時的に低減)に対する積分と、ポリマーの類似C(O)OCH2プロトン(幅の広いシグナル、4.4ppm、経時的に増大)に対する積分との比較によって変換率を算出した。DP(NMR)=75;Mn(NMR)14.7kDa;Mw/Mn(GPC)=1.15;開始効率=41%;変換率82%。
トリメチルシリルで保護されたポリマー(1.5g、7.653mmolアルキン−トリメチルシリル基)及び酢酸(2.19mL、0.0382mol、アルキン−トリメチルシリル基に対して5当量)をTHF(100mL)中に溶解させた。窒素を泡立て(約10分)、溶液を−20℃に冷却した。TBAF・3H2O(0.0114mol、アルキン−トリメチルシリル基に対して1.5当量)の0.20M溶液を約20分かけて滴下した。得られた混濁混合物をこの温度で30分間攪拌した後、環境温度に温めた。Amberlite IR−120(PLUS)イオン交換樹脂を添加し、反応混合物と一緒に30分間攪拌した。その後この樹脂を動下で濾過により除去し、得られた溶液を減圧下で乾燥濃縮し、ポリマーを石油エーテル中に沈降させた。得られた収量=0.46g(48%)無色粉末。
ポリマー(8)(50mg、「クリック可能」アルキン単位0.40mmol)、アジド糖(4)(225mg、0.604mmol)及びトリエチルアミン(26mg、35μL、0.20mmol)のTHF(5mL)溶液を、窒素を10分間泡立たせることによって脱気した。その後、[(PPh3)3CuBr](37.5mg、0.402mmol)を添加し、得られた溶液中にさらに窒素を5分間泡立たせた。この非常に淡い黄色の
澄んだ溶液を環境温度で3日間攪拌した後、短い中性アルミナパッドに通過させてTHFで溶離した。得られた溶液を減圧下で濃縮し、石油エーテル(200mL)中に沈降させた。懸濁液を遠心分離し、得られた固形分をTHF中に再溶解させた。イオン交換樹脂の存在下で溶液を1時間攪拌し、濾過し、1:1のEt2O/石油エーテル混合物(150mL)中で再度沈降させた。遠心分離により固形分を分離し、ポリマーを得た。
1.ラクトースアジドの合成
。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して、揮発分を減圧下で除去した。得られた収量=32.01g(89%)。
Claims (13)
- 1つ又は複数の糖であるペンダント側基を有するポリマーを製造する方法であって、
(i)(a)保護基で保護されてもよいアジド基、又は(b)保護基で保護されてもよいアルキン基で官能化されたオレフィン性不飽和モノマーを、RAFT、遷移金属媒介リビングラジカル重合(TMM−LRP)及び/又は原子移動ラジカル重合によって重合して、ポリマー中間体を生成すること、
(ii)存在する場合には、前記ポリマー中間体から保護基の総数の少なくとも一部を除去すること、及び
(iii)前記ポリマー中間体を、(a)アルキン基又は(b)アジド基で各々官能化された少なくとも1つの糖側基部分と反応させて、該アルキン基及び該アジド基が反応し該糖側基をペンダント側基として該ポリマー中間体に結合させること、
を含み、
前記モノマーが、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート(全ての異性体)、ブチルメタクリレート(全ての異性体)、及び他のアルキルメタクリレート;対応するアクリレート;グリシジルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、アリルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジアルキルアミノアルキルメタクリレートを含む官能化されたメタクリレート及びアクリレート;フルオロアルキル(メタ)アクリレート;メタクリル酸、アクリル酸;フマル酸(及びエステル)、イタコン酸(及びエステル)、無水マレイン酸;塩化ビニル及びフッ化ビニルを含むビニルハロゲン化物;アクリロニトリル、メタクリロニトリル;式CH2=C(Hal)2(ここで、各ハロゲンは独立してCl又はFである)のビニリデンハロゲン化物;式CH2=C(R15)C(R15)=CH2(ここで、R15は、独立してH、C1〜C10アルキル、Cl又はFである)の置換されてもよいブタジエン;式CH2=CHSO2OM(ここで、MはNa、K、Li、N(R16)4(ここで、R16は、各々独立して、H又はCl又はアルキルである)である)のスルホン酸;式CH2=CHCON(R16)2のアクリルアミド、及び式CH2=C(CH3)CON(R16)2のメタクリルアミド、又はオレフィン性不飽和アルコキシポリエーテル、又はそれらの混合物から選択されるモノマーが前記アジド基又は前記アルキン基で官能化されたものである、方法。 - 前記モノマーが、保護基で保護されてもよいアルキン基を含み、且つ前記糖側基がアジド基を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの糖がN−アセチル化されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記オレフィン性不飽和モノマーが、1つ又は複数の官能基で官能化されてもよい1つ又は複数の異なるオレフィン性不飽和モノマーと共重合される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記官能基が、標識基、ポリアルキレングリコール及び薬剤から選択される、請求項4に記載の方法。
- 工程(iii)中の前記ポリマー中間体が、(a)アルキン基又は(b)アジド基で各々官能化された2つ以上の異なるペンダント側基部分と反応する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(iii)中の前記ポリマー中間体が、前記糖側基、及び(a)アルキン基又は(b)アジド基を各々含む1つ又は複数のさらなる化合物と反応する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペンダント側基又は前記化合物が、標識基、ポリアルキレングリコール基又は薬剤を含む、請求項6又は7に記載の方法。
- 生体分子と結合し得る基を有する開始剤の使用を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖が、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、マンノース、ラクトース、フコース、及びそれらの誘導体から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- (iv)前記ポリマーと結合する前記ペンダント側基が、さらに反応して誘導体化された前記ペンダント側基となる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペンダント側基が糖であり、該糖が、キラル化合物と反応することによって誘導体化される、請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって生成されるポリマーを含むクロマトグラフィカラムを準備する工程を含む、クロマトグラフィカラムの製造方法。
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