JP3594623B2 - 高等植物におけるステロール蓄積増加のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、高等植物におけるステロール蓄積増加のための方法および組成物、とりわけ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによってステロール蓄積を増加させることに関する。
【０００２】
【従来の技術】
メバロネート（Ｃ６Ｈ１１Ｏ４）は、細胞と有機体の生存能力に必要な数多くの化合物の代謝前駆体である。植物においては、メバロネート由来の主な最終産物は、ステロール及び、その他のイソプレノイドである。（図１参照）。
【０００３】
典型的な植物のイソプレノイドには、テルペン（多くの植物の芳香を生じさせる揮発性Ｃ１０及びＣ１５化合物）、カロチノイド（多くの植物に色を生じさせるＣ４０化合物）及び天然ゴムのような重合体がある。
【０００４】
遊離のステロールは実質的にすべての真核細胞生物の構成成分である。維管束植物の最も豊富にあるステロールは、カンペステロール、２４−メチルコレステロール、シトステロール及びスチグマステロールである。
【０００５】
メバロネートは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）の還元によって生成される。ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロネートへの還元は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素によって触媒される。
【０００６】
動物及び酵母のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、小胞体の膜内在性糖タンパク質である。完全な酵素は３つの領域を含む：酵素の活性部位を含む触媒領域、小胞体に酵素を固着させる膜結合領域、及び、酵素の触媒及び膜結合領域をつなげる連結部位である。膜結合領域は、完全なタンパク質のＮＨ２−末端部を占めている。一方、触媒領域は、タンパク質のＣＯＯＨ−末端部を占めており、連結部位は残りの部分を構成している。バソン，エム．イー．等（Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８（９）：３７９７−３８０８（１９８８）。現在では、植物におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の細胞内局在は知られていない。ルセル，ディー．ダブリュ．等（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４，ｅｄ．ｂｙ Ｄ．Ｄ．Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（１９８５）。
【０００７】
動物及び酵母のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性は、ステロールによるフィードバック阻害を受けることが知られている。そのようなフィードバック阻害は、酵素の膜結合領域を必要とする。例えば、ギル，ジー．等（Ｇｉｌ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．），Ｃｅｌｌ，４１：２４９−２５８（１９８５）；バード，エム．およびダウニング，ジェイ．エフ．（Ｂａｒｄ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２５：４１５−４２０（１９８１）参照。
【０００８】
メバロネートがステロール及び他のイソプレノイドの前駆体である、ということになると、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の量あるいは活性を増大させると、ステロール及び他のイソプレノイドの蓄積が増加するようになることが期待される。酵母及び非−光合成性微生物においては、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の増加は、予想される。ステロールあるいは他のイソプレノイドの産生増加を伴なわない。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性が異常に高レベルとなる酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の変異株では、２つのステロール、４，１４−ジメチルザイモステロール及び１４−メチルフェコステロールの産生が、通常に比べて著しく増加する。ダウニング，ジェイ．エフ．等（Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９４（３）：９７４−９７９（１９８０）。
【０００９】
非−光微合成性微生物における啓発によって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性が増大すると、イソプレノイド（カロチノイド）合成が増進するが、ステロール（エルゴステロール）合成は増進しない。トダ，エム．およびシロイシ，エム．（Ｔａｄａ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｍ．）Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２３（４）：６１５−６２１（１９８２）。植物におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性のこのような増大の影響を報告する研究はない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数の増加することによって植物のステロール蓄積の増加の方法を提供しこれによってこの酵素活性は天然の植物における活性と比較したとき、増加する。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドとは、活性のある、切断されたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素と同様に、完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を含んでいる。好ましい態様では、活性のある、切断されたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒及び結合領域を含み、膜結合領域を含まない。
【００１１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ断片及び、植物内において、上述のポリペプチドを発現させるのに適当なプロモーターに操作的に連結されたベクターを含む、組換えＤＮＡ分子で、植物を形質転換することで、増加させることができる。好ましい組換えＤＮＡ分子は、プラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１である。
【００１２】
プロモーターは、可能であれば、形質転換された植物内のステロールのレベルによる影響を実質的に受けない調節機能を持つプロモーターである。好ましいプロモーターはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである。とりわけ望まれる実施態様においては、蓄積したステロール、シクロアルテノールのレベルは、特に増大している。
【００１３】
本発明では、さらに、植物における害虫抵抗性の増加の方法を提供している。この方法では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数が、前述したように、天然の植物よりも増加している。
【００１４】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数が増加した、形質転換された植物もまた、考慮されている。このような植物は、天然の形質転換されていない植物に比べて全ステロール、とりわけシクロアルテノールの含有量が高くなっている。このような形質転換された植物はまた、形質転換されていない植物、天然の植物に比べて、イモムシ（ｈｏｒｍｗｏｒｍ）のような害虫に対する抵抗性を示す。
【００１５】
本発明はさらに、天然の形質転換されていない同じ株及び変異体に比べてステロールを過剰蓄積する植物に成長できる植物種子、組換え体、それらの遺伝子工学的誘導体及びそれらに誘導された交配種を提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
Ｉ．定義
次に示す単語及び句は、以下に明記された意味を持つ。
【００１７】
発現：ポリペプチドを生成するための、構造遺伝子が受ける転写と翻訳を含む、細胞内過程の組み合わせ。
【００１８】
発現ベクター：構造遺伝子の発現を、それらの遺伝子に有効に結合したときに制御する制御要素を形成するＤＮＡ配列。
【００１９】
有効に結合：構造遺伝子は、例えば構造遺伝子を発現ベクターの制御下に置くために発現ベクターにというように、他のＤＮＡ（あるいは適切な場合ＲＮＡ）部分に正しい読み枠で共有結合している。
【００２０】
プロモーター：構造遺伝子の発現制御要素を与え、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合してその遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列あるいはＤＮＡ配列グループ上の認識部位。
【００２１】
組換えＤＮＡ分子：天然には通常共に見られることのない、最少２つの核酸配列から成る雑種ＤＮＡ配列。
【００２２】
構造遺伝子：ポリペプチド、すなわちアミノ酸残基配列として発現されるＤＮＡ配列。
【００２３】
ベクター：細胞内で複製が可能であり、かつ／または取り付けたＤＮＡ部分の複製を行うように他のＤＮＡ部分を有効に結合することのできるＤＮＡ分子。プラスミドは、典型的なベクータである。
【００２４】
ＩＩ．本発明
本発明は、植物内のステロールの蓄積を増大する組成物及び方法に関するものであり、同様に、天然の様々な植物に比較して増大したステロールの蓄積を示す植物にも関するものである。本発明で注目する植物は、導管のある、多細胞高等植物である。このような高等植物を、以下本明細書中では、通常単に“植物”と表すことにする。典型的な植物は、タバコ、トマト、トウモロコシ、ニンジン、ダイズ、ワタ、大麦、シロイヌナズナ、グアユールゴムノキ、ペチュニアである。望ましい植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）種である。
【００２５】
本発明で注目する植物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ活性を持つポリペプチドをコードする付加された構造遺伝子で、形質転換された植物中でコードされているポリペプチドが発現するように、形質転換される。形質転換植物の前駆体である形質転換されていない植物を、本明細書中では“天然”植物と表す。比較する天然及び形質転換植物は、同じ種子のさやからの兄弟や、同一の親からのクローンまたは同じ系統の植物といった同じタイプのものである。
【００２６】
本発明の植物中でのステロール生成は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の細胞内活性を増大することにより増加し、そこで酵素は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）のメバロン酸への変換を触媒する。本明細書中で用いる“細胞内活性”は、植物細胞中でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の総触媒の活性を意味する。
【００２７】
細胞内ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加することによって増大する。コードされた構造遺伝子の発現は、その酵素の細胞内活性を高める。
【００２８】
コピー数は、植物細胞を、外来ＤＮＡ部分（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする）及び該植物中での該ポリペプチドの発現を誘導するのに適したプロモーターと有効に結合しているベクターから成る組換えＤＮＡ分子で形質転換することで、増加する。このようなポリペプチドは、完全なものを、触媒作用活性型で、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素タンパク質と同様に含む。
【００２９】
従って、形質転換植物細胞及び植物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子を、同じタイプの、天然の形質転換されていない植物に比して、さらに一つ以上持っている。このため、形質転換植物は、天然植物から、ＤＮＡ断片あるいはｍＲＮＡをアガロース分離してトランスファーしてＤＮＡあるいはＲＮＡで適切なブロッティングを行う標準的な技術、またはポリメラーゼ鎖反応技術によって識別でき、これらの技術はよく知られている。形質転換及び天然植物あるいはそれからの細胞培養体の相対ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性も比較することが可能であり、相対活性が形質転換：天然で１．５：１であることで形質転換を示す。
【００３０】
ステロールの蓄積も天然と形質転換植物の識別に使用することができる。さらに遺伝子が１つある場合、形質転換植物は天然植物の少なくとも２倍の総ステロール含有量を持つ。
【００３１】
Ａ．構造遺伝子
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子で植物を形質転換することを意図している。動物及び酵母細胞両方のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、３つの異なるアミノ酸残基配列領域からなり、それらの領域は、触媒領域、膜結合領域及びリンカー領域と呼ばれる。触媒領域は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性部位を含み、完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のＣＯＯＨ末端部分約４０％から成る。膜結合領域は、疎水性アミノ酸残基を含み、完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のＮＨ２末端部分約５０％から成る。リンカー領域は、触媒及び膜結合領域をつなぎ、完全な酵素の残りの約１０％を構成している。以下で非常に詳細に述べるように、本明細書では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域のみが必要とされる。その触媒領域に相当するポリペプチドをコードする構造遺伝子は、植物を形質転換するために必要な最小限の遺伝子である。しかしながら、より大きい酵素及びその構造遺伝子が好ましい。従って、本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする完全な及び切断型の構造遺伝子両方の使用を意図する。
【００３２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子は、様々な材料から、様々な方法論によって、獲得し構築することができる。例えばカールソン，エム．およびボットステイン，ディー．（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，ｄ．），Ｃｅｌｌ，２８：１４５（１９８２）；レイン，ジェイ．等（Ｒｉｎｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：６７５０（１９８３）参照。このような構造遺伝子の典型は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする哺乳類と酵母遺伝子である。
【００３３】
哺乳類の染色体はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードするただ一つの遺伝子を含む。ハムスターとヒトのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の核酸塩基配列を記した。ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの合成核酸配列（配列番号１）及びその予想アミノ酸残基配列（配列番号２）を第２図に、シン，ディー．ジェイ．等（Ｃｈｉｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３０８：６１３−６１７（１９８４）から再び印刷して提供してある。表６から１６の合成核酸配列（配列番号１）は、約４７６８塩基対からなり、完全なハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸配列を含む。
【００３４】
完全なハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、約８８７アミノ酸残基（配列番号２）から成る。８８７アミノ酸残基の完全なハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする構造遺伝子は、表６から１６（配列番号１）の約核酸番号１６４から約核酸番号２８２４の塩基対から成る。
【００３５】
望ましい構造遺伝子は、酵素の触媒領域だけに相当するようなポリペプチドをコードするものである。ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の２つの触媒作用活性部分が定義された。リスム，エル．等（Ｌｉｓｃｕｍ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．），Ｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（１）：５２２（１９８５）。一つの触媒領域は、見かけ分子量６２ｋＤａであり、約番号３７３から約番号８８７までのアミノ酸残基から成る。２つ目の触媒領域は、見かけ分子量５３ｋＤａであり、約番号４６０から約番号８８７までのアミノ酸残基から成る。６２ｋＤａ触媒作用活性部分は、表６から１６（配列番号１）の約核酸番号１２８０から約核酸番号２８２４までの塩基対にコードされている。５３ｋＤａ触媒作用活性部分は、表６から１６（配列番号１）の約核酸番号１５４１から約核酸番号２８２４までの塩基対にコードされている。
【００３６】
好ましい態様では、利用される構造遺伝子はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域と少なくともリンカー領域の一部をコードする。ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のリンカー領域は、約番号３４０から約番号３７３まであるいは、約番号３４０から４６０までのアミノ酸残基からなり、それは触媒領域の定義の仕方に依存している。これらのリンカー領域は、表６から１６（配列番号１）の各々約核酸番号１１８０から約核酸番号１２８３までの、あるいは約核酸番号１１８０から約核酸番号１５４０までの塩基対にコードされている。リンカー領域をコードする構造遺伝子は、触媒領域をコードする構造遺伝子に有効に結合している。一つの特に好ましい態様では、触媒的に活性な、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする構造遺伝子は、酵素の膜領域のごく一部をコードする塩基対を選択して含むことができる。切断型ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、ＨＭＧＲ−Δ２２７と呼ばれ、表６から１６（配列番号１）の核酸１６４−１９０及び１１８７−２８２４からなり、アミノ酸残基１−９（膜結合領域から）と３４２−８８７をコードし、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の欠乏している細胞を形質転換するために使用される。切断型遺伝子を含む形質転換用プラスミド（ｐＲＥＤ−２２７Δ）の図式構造は、第２図に再び印刷されている。酵母のような他の生物由来の、触媒的に活性な、切断型のあるいは完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から成るポリペプチドをコードする構造遺伝子もまた、本発明に従って利用することが可能である。
【００３７】
酵母細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする２つの遺伝子を含む。２つの遺伝子はＨＭＧ１及びＨＭＧ２と命名され、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２と命名されている２つの異なる形のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードしている。ＨＭＧ１の核酸塩基配列（配列番号３）は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１のアミノ酸残基配列（配列番号４）と同様に表１７−２６にバリン，エム．イー等（Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８（９）：３７９７（１９８８）から引用して表示してある。ＨＭＧ２の核酸塩基配列（配列番号５）は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２のアミノ酸残基配列（配列番号６）と同様に、以下本明細書で配列リストに発表されている。ＨＭＧ１遺伝子全体は約３３６０塩基対（配列番号３）から成る。完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１は、約１０５４アミノ酸残基のアミノ酸配列（配列番号４）から成る。従って完全な酵素をコードするＨＭＧ１遺伝子の最小限の部分は、表１７−２６（配列番号３）約核酸番号１２１から約核酸番号３２８２までの塩基対から成る。
【００３８】
ＨＭＧ２遺伝子全体は約３３４８塩基対（配列番号５）から成る。完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２は、約１０４５アミノ酸残基のアミノ酸配列（配列番号６）から成る。従って完全な酵素をコードするＨＭＧ２遺伝子の最小限の部分は、表１７−２６（配列番号５）の約核酸番号１２１から約核酸番号３２５５までの塩基対から成る。
【００３９】
切断型ハムスター構造遺伝子との類似性により、酵母由来の、触媒的に活性な、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から成るポリペプチドをコードする構造遺伝子もまた、本発明に従って利用することが可能である。
【００４０】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１の触媒領域は、約残基６１８から約残基１０５４までのアミノ酸残基：すなわちＣＯＯＨ末端、から成る。触媒領域をコードする構造遺伝子は、表１７−２６の約核酸番号１９７４から約核酸番号３２８２までの塩基対から成る。
【００４１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１のリンカー領域は、約残基５２５から約残基６１７までのアミノ酸残基から成る。リンカー領域をコードする構造遺伝子は、表１７−２６の約核酸番号１６９５から約核酸番号１９７３までの塩基対から成る。酵母ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１の、触媒領域と少なくともリンカー領域の一部から成るポリペプチドをコードする構造遺伝子は、好ましくは、酵素の触媒領域をコードする構造遺伝子に有効に結合している、酵素のリンカー領域をコードする構造遺伝子から成る。
【００４２】
またやはり切断型ハムスター構造遺伝子との類似性より、切断型ＨＭＧ１遺伝子は、酵素の膜結合領域のごく一部をコードする塩基対を任意に含むことができる。このような構造遺伝子は、好ましくは、表１７−２６の約核酸番号１２１から約核酸番号１４７までと、約核酸番号１６９５から約核酸番号３２８２までの塩基対から成る。
【００４３】
酵母ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２の類似部分に由来する、上記のものと同類の構築物もまた、利用可能である。
【００４４】
当分野においては明かなことだろうが、本明細書で述べた核酸配列は、上述の配列の場合のように明白に示されていようが、あるいは一般的には知られているが本明細書中で表示していない核酸配列についてのように暗に示されていようがどちらでも、遺伝コードに本来備わっている縮重性と修飾や交換を受け易いポリペプチドである非必須領域のために、変更が可能である。この点を考慮し、本発明はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性をコードする構造遺伝子の対立変異体について熟考する。
【００４５】
前述のＤＮＡ部分は最短長を持つ場合も、総全長と同様に言及される。最短長は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つ特定のポリペプチドをコードするＤＮＡ部分の長さを定義する。当分野でよく知られているように、必須のＤＮＡ配列が存在する限り（開始及び終止シグナルを含む）、部分のどちらの末端にもさらに塩基対を付加しておくことが可能であり、そのような部分は、それでもやはりタンパク質を発現するために利用できる。当然ここでは、発現を抑制したり、発現するように望まれている酵素を消耗するようなそれ以上の産物を発現したり、望ましい酵素以外の産物を発現したり、またそれ以外にもＤＮＡ部分の構造遺伝子を阻害したりするような、有効に結合したＤＮＡ配列が、部分中には存在しないことを前提としている。
【００４６】
従って、ＤＮＡ部分がこのような阻害的ＤＮＡ配列を含まない限り、本発明のＤＮＡ部分は、長さにして１５，０００塩基対にまで可能である。組換えＤＮＡ分子、とりわけ発現ベクターの最大限の大きさは、複製及び発現に必要な最小限のＤＮＡ配列全てが望まれて一旦揃えば、ほとんどは便利さと宿主細胞に収容できるベクターの大きさによって決定される。最小限のベクターの大きさは良く知られている。
【００４７】
Ｂ：組換えＤＮＡ分子
本発明の組換えＤＮＡ分子は、ベクターを有用なＤＮＡ部分と有効に結合して、本明細書で述べられたり、寄託されたようなプラスミドを作成することによって作製される。とりわけ望ましいＤＮＡ分子は、以後の実施例１で詳細に述べられる。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドの発現を導くことのできるベクターを、本明細書中では“発現ベクター”であるとみなす。
【００４８】
このような発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御要素を包含する。ポリペプチドをコードする遺伝子を発現ベクターに有効に結合すると、プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼの結合と望ましいポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導くことが可能になる。ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に有用であるのは、ポスコウスキー等（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．），ＥＭＢＯ Ｊ．，３：２７１９（１８９８）およびオデル等（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５）に述べられているような誘導可能、ウィルス由来、合成、構成的（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーター、及びチャウ等（Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１に提示されているような、一時的に、空間的に、そして時間と空間的に調節されるようなプロモーターである。好ましくは、プロモーターは、構造遺伝子の発現を調節する機能が細胞内ステロール量によって実質上影響を受けないプロモーター配列から成る。本明細書中で用いる“実質上影響を受けない”という用語は、プロモーターが、形質転換細胞内に蓄積されたステロールによる直接のフィードバック制御に預からないことを意味する。
【００４９】
プロモーターは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子に対する、形質転換植物細胞の転写活性を導く能力によってもまた選択される。植物組織中では、構造遺伝子は、様々なプロモーターによって誘導可能である。プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのように、ほとんど構成的（ｎｅａｒ−ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）になり得るし、また、双子葉あるいは単子葉に影響を与える組織特異的または発育特異的なプロモーターにもなり得る。典型的なプロモーターは、トウモロコシ シュクロース シンセターゼ１（ヤン，エヌ．エス．等（Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：４１４４−４８（１９９０））、トウモロコシ アルコール デヒドロゲナーゼ１（ボーゲル，ジェイ．エム．等（Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １３ｄ，３１２）（１９８９））、トウモロコシ ゼイン１９ｋＤ遺伝子（貯蔵タンパク質）（ボストン，アール．エス．等（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｈｙｓｉｏｌ．，８３：７４２−４６）、トウモロコシ集光性複合体（シンプソン，ジェイ．（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：３４（１９８６）、トウモロコシ熱ショックタンパク質オーデル、ジェイ．ティー等（Ｏ’Ｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−１２（１９８５））、エンドウマメ（ｐｅａ）ＲｕＢＰカルボキシラーゼ（ポールセン，シーツ．等（Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：１９３−２００（１９８６）；クシュモア，エー．アール．等（Ｃｕｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２９−３８（１９８３），Ｔｉプラスミドマンノパイン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンセターゼ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｈ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：３２１９−３２２３（１９８９），Ｔｉプラスミド ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンセターゼ（ランブリッジ，ダブリュー．エッチ．アール．，等（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｈ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：３２１９−３２２３（１９８９）、ペチュニア チャルコン（ｃｈａｌｃｏｎｅ）イソメラーゼ（ファン，タンネン，エー．ジェイ．，等（Ｖａｎ Ｔｕｎｅｎ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），ＥＭＢＯ．Ｊ．，７：１２５７（１９８８），マメ（ｂｅａｎ）グリシンリッチタンパク質１（（ケラー，ビー．，等（Ｋｅｌｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ．Ｊ．，８：１３０９−１４（１９８９），ＣａＭＶ ３５ｓ転写産物（オーデル，ジェイ．ティ．，等（Ｏ’Ｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−１２（１９８５）、及びジャガイモパタチン（Ｐａｔａｔｉｎ）（ベエンズラー，エッチ．シー．，等（Ｗｅｎｚｌｅｒ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：４１−５０（１９８９）である。好ましいプロモーターは、カリフラワー モザイク ウィルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターとＳ−Ｅ９ＲｕＢＰカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターである。
【００５０】
どの発現ベクターを選択するか、結局はポリペプチドをコードする遺伝子と有効に発現させるためにどのプロモーター選択するかということであるが、それは所望の機能的特性に、例えばタンパク質発現の位置と時期、形質転換される宿主細胞に、直接依存している。これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する分野に内在する良く知られている限界である。しかしながら、本発明を実行する際に有用なベクターは、有効に結合しているＤＮＡ部分を含む、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導くことができるものである。
【００５１】
高等植物で遺伝子を発現するのに有用なベクターは、当分野では良く知られており、Ａｑｕｒｏｂｑｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ腫瘍誘導（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）（Ｔｉ）プラスミド由来のベクター（ロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：２５３−２７７（１９８７）に記載）を含む。しかし、ほかの数種の発現ベクター系も植物内で機能することが知られていて、フロム等（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４（１９８５）に記載されているｐＣａＭＶＣＮ転写制御ベクターが含まれている。プラスミドｐＣａＭＶＣＮ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから購入可能）は、カリフラワー モザイク ウィルス ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含む。
【００５２】
本発明の組換えＤＮＡを作成するためにレトロウィルス発現ベクターを利用することも熟考された。本明細書で用いる“レトロウィルス発現ベクター”なる用語は、レトロウィルスゲノムのロング ターミナル リピート（ＬＴＲ）領域由来のプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。
【００５３】
好ましい態様では、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に用いられるベクターは、植物細胞内で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。好ましい薬剤耐性マーカーの一つは、発現した結果カナマイシン耐性になる遺伝子であり、すなわち、ロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．），がＭｅｔｏｄｓ Ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｈ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８８）に記載したノパリンシンセターゼ プロモーター，Ｔｎ５ ネオマイシン フォスホトランスフェラーゼＩＩとノパリン シンターゼ３’非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。他の好ましいマーカーは、トランスポゾンＴｎ９のアッセイ可能なクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子がある。相補的付着性末端および平滑性末端を介してＤＮＡをベクターに有効に結合するために、様々な方法が開発された。例えば、相補的ホモポリマートラック（ｔｒａｃｔｓ）を、挿入するＤＮＡ部分とベクターＤＮＡに付加することができる。ベクターとＤＮＡ部分は、次に相補的ホモポリマー尾部間で水素結合によってつながり、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【００５４】
別の方法として、１つ又はそれ以上の制限酵素部位を持つ合成リンカーを用いて、ＤＮＡ断片を発現ベクターに継ぐことも可能である。大過剰量の合成リンカー分子を、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼのように、平滑末端ＤＮＡ分子の結合を触媒できる酵素の存在下で平滑末端ＤＮＡ断片とインキュベートすることにより、合成リンカーは平滑末端ＤＮＡに結合される。従って、反応産物は末端に合成リンカーを持ったＤＮＡ断片である。これらのＤＮＡ断片は適当な制限酵素で切断され、合成リンカーと互換性のある末端を生ずる酵素で予め切断された発現ベクターに結合される。多様な制限酵素部位を含む合成リンカーは、ニューイングランド バイオラボ，バーバリー，マサチューセッツ州（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬｏｂｓ，Ｂｅｖｅｖｌｙ，ＭＡ）のものを含めて多くの供給源から商業的に入手可能である。
【００５５】
上述の組換えＤＮＡ分子と同等なＲＮＡも、本発明により企図される。
【００５６】
本発明に従って用いられた好ましい組換えＤＮＡ分子はプラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１である。
【００５７】
Ｃ．形質転換植物体並びに形質転換法
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数は、その構造遺伝子を含む適当なベクターで所望の植物を形質転換することにより増加する。形質転換植物体中でのその遺伝子の発現は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を上昇させる。
【００５８】
ポリペプチドをコードする遺伝子を植物に形質転換する方法としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を媒介する植物形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子トランスファー、再生産器官への注入及び未成熟胚への注入がある。それぞれの方法に固有の長所、短所がある。従って、ある特定の植物に遺伝子を導入する特定の方法は、他の植物に対しても最良であるとは必ずしも言えないが、特定の植物に対してどの方法が良いかは良く知られている。
【００５９】
アグロバクテリウムを媒介する遺伝子トランスファーは、ＤＮＡが全植物組織に導入され、プロトプラストから元の植物体を再生産する必要が無いため、植物細胞に遺伝子を導入するのに広く用いられる系である。植物細胞にＤＮＡを導入するためのアグロバクテリウムを媒介する発現ベクターの利用は、当業者に良く知られている。例えば、フラレィ等（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：６２９（１９８５）及びロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓｅｔ ａｌ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：２５３−２７７（１９８７）により記述された方法を参照せよ。さらにＴｉ−ＤＮＡの挿入はかなり厳密な過程であり、再編成はほとんど生じない。シュピールマン等（Ｓｐｉｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：３４（１９８６）及びジョーゲンソン等（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０７：４７１（１９８７）によって記述されているように、トランスファーされるＤＮＡの領域は末端の塩基配列によって決まり、介在するＤＮＡは通常、植物ゲノムに挿入される。
【００６０】
クレー等（Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ，テー．ホーン及びジェイ．ジェル編（Ｔ．Ｈｏｈｎ．Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）ｐｐ．１７９−２０３で述べられているように、最近のアグロバクテリウム形質転換ベクターはアグロバクテリウム同様、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でも複製でき、取扱い易くなっている。
【００６１】
さらに、アグロバクテリウムを媒体とする遺伝子トランスファー用のベクターについての最近の技術的進歩は、ベクター中の遺伝子と制限酵素サイトの再配列改善し、ポリペプチドをコードする多様な遺伝子を発現できるベクターの構築を促進した。ロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：２５３（１９８７）によって記述されたベクターは、ポリペプチドをコードする挿入遺伝子を直接発現するためのプロモーターおよびポリアデニル化サイトに隣接したマルチリンカー領域を有し、この目的に適している。
【００６２】
アグロバクテリウムを媒体とするトランスフォーメーション法が有効な植物種では、遺伝子トランスファーが迅速でかつその性質も明確なこの方法が最適である。
【００６３】
葉盤及び他の組織のアグロバクテリウムを媒体とする形質転換は、アグロバクテリウムが天然で感染する植物種に限られている。双子葉植物では、アグロバクテリウムを媒体とする形質転換法が最も有効である。ビィテビアー等（Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎｏｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：５３４５（１９８７）に記述されているように、アグロバクテリウムのベクターを用いてアスパラガスのトランスジニック植物が作られているが、アグロバクテリウムの天然の宿主となる単子葉類はほとんどない。従って、米、コーン、小麦のような商業的に重要な穀類は、他の方法で形質転換されねばならない。しかしながら、上述したように、アグロバクテリウムを用いたアスパラガスの形質転換も行われ得る。例えば、ビィテビアー等、Ｐｒｏｃ．Ｎｏｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：５３４５（１９８７）を参照せよ。
【００６４】
アグロバクテリウムを用いて形質転換した植物体は典型的には１コピーの遺伝子をある１つの染色体上に含む。このような植物体は導入された遺伝子についてヘテロ接合体である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性のあるポリペプチドをコードする１コピーの構造遺伝子を有するヘテロ接合型形質転換体が、求める形質転換植物体である。
【００６５】
より望ましいのは、導入した構造遺伝子についてホモ接合体、即ち導入した遺伝子をコピー、相同染色体のそれぞれの染色体上に１遺伝子ずつ持つ植物体である。ホモ接合体の形質転換植物体は、ヘテロ接合植物体の有性的交配（自家受粉）を行い、生じた種子のいくつかを芽生えさせ、対照又はヘテロ接合植物体に対しＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性又はステロールの蓄積、或いはその両方が促進されている植物体を解析することにより得ることができる。ホモ接合植物体は高いＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性及びステロールの蓄積を示す。
【００６６】
植物プロトプラストの形質転換はリン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、並びにこれらの処理の組み合わせに基づく方法を用いて行われる。例えばポートリカス等（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３（１９８５）；ローツ等（Ｌｏｒｚ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１７８（１９８５），フローム等（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３１９：７９１（１９８６）；ウチミヤ等（Ｕｃｈｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４：２０４（１９８６）；カリス等（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．），Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１：１１８３（１９８７）；並びにマルマット等（Ｍａｒｃｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４５４（１９８８）を参照せよ。
他の植物種へのこれらの系の適用は、その植物種のプロトプラストから再生能に依存する。穀類のプロトプラストからの再生についての例は、フジムラ等（Ｆｕｊｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ ＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ，２：７４（１９８５）；トリヤマ等（Ｔｏｒｉｙａｍａ ｅｔａｌ．），Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７３：１６（１９８６）；ヤマダ等（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，４：８５（１９８６）；Ａｂｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：１０８７（１９８６）に記述されている。
【００６７】
プロトプラストからうまく再生され得ない植物種を形質転換するには、無傷の細胞又は組織にＤＮＡを導入する他の方法が用いられ得る。例えば、バジル（Ｖａｓｉｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：３９７（１９８８）により記述されているように、未成熟胚又は外植片からの穀類の再生が行われている。加えて、“パーティクル ガン”（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）又はより高速な発射技術が用いられ得る。
【００６８】
後者の技術では、クレイン等（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ
３２７：７０（１９８７）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：８５０２（１９８８）；及びＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）に記述されているように、微小な金属粒子上のＤＮＡは細胞壁を貫通し、細胞質に運ばれる。金属粒子は数層の細胞を貫通し、それにより組織外植片中の細胞の形質転換が可能になる。
【００６９】
ゴードンカム，ダブリュー．ジェイ．等（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，Ｗ．Ｊ．ｅａ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：６０３−６１８（１９９０）；クレイン，ティー．エム．等（Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（１９８９）；Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８５０２−８５０５（１９８８）；並びにトーマス、ディー．ティ．（Ｔｏｍｅｓ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２６１−２６８（１９９０）に記述されているように、金属粒子はコーンの細胞の形質転換及び稔性のある安定なタバコの形質転換植物体の作成に用いられ成功している。組織外植片の形質転換はプロトプラストの段階を経る必要がないため、トランスジニック植物の生産を早める。 トウ等（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．），Ｍｅ ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１：４３３（１９８３）；Ｄ．Ｈｅｓｓ，Ｉｎｔｅｒｎ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１０７：３６７（１９８７）；ロー等（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，６：１６５（１９８８）により記述されているように、花粉への直接ＤＮＡトランスファーによってもＤＮＡは植物体に導入され得る。ペナ等（Ｐｅｎａ ｅｔ ａｌ．，）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：２７４（１９８７）により記述されているように、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、ＤＮＡを植物体の再生産組織に注入することによっても得られる。ノウハウス等（Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．），Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７５：３０（１９８７）；及びベンブロック等（Ｂｅｎｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃｅｏｄｉｎｇｓ Ｂｉｏ Ｅｘｐｏ １９８６，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ，ｐｐ．２７−５４（１９８６）で述べられているように、ＤＮＡは未成熟胚の細胞に直接注入し、乾燥した胚に再び水を与えることもできる。
【００７０】
１個のプロトプラスト又は多様な外植片からの植物体の再生産はいずれもこれまでの研究で良く解明されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，エイ．バイスバッハ，エイチ．バイスバッハ編（Ａ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｈ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ａｓｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８８）を参照せよ。この再生及び成長の過程は、形質転換細胞及びシュートの選択、形質転換シュートの発根、並びに小植物体の土壌での成長を含む。
【００７１】
アグロバクテリウムにより導入された外来遺伝子を含む植物体の、葉の外植片からの再生は、ホーシュ等（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９−１２３１（１９８５）に記述されているように行われ得る。この方法では、ファレイ（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３（１９８３）に記述されているように形質転換された植物種に於て、形質転換体は選択試薬存在下でシュートの再生を促す培地中で育てられる。
【００７２】
この方法では通常、２から４か月以内にシュートを生じ、次にこの形質転換体のシュートは発根を促進するのに適し、選択試薬とバクテリアの成長を防止する抗生物質を含む培地に移される。選択試薬存在下で発根したシュートは小植物体を形成し、それは土壌又は根を形成できる他の媒体に移植される。これらの方法は用いる特定の植物種によって異なり、そのようなバリエーションはこれまでの研究でよく解明されている。
【００７３】
成熟した再生植物体は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチド遺伝子の発現により、ステロールの蓄積量の増加を示すものとして得られる。再生植物体は自家受粉するのが望ましい。そうでなければ、再生植物体から得られた花粉を、作物学的に重要なできれば近交系の種子から育った植物と交配させる。逆に、それらの重要な系の植物から得た花粉を用いて再生植物に授粉する。後代での導入された遺伝子の存在は、以下に議論されているように評価された。
【００７４】
所望のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドを含む本発明の植物は、当業者に良く知られた技術を用いて栽培された。本発明のどのトランスジニック植物も栽培し、そこに含まれ、目的とされるステロール産物を分離し得る。
【００７５】
このように本発明の形質転換植物体は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数が増加している。所望する形質転換植物体は導入したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素構造遺伝子についてヘテロ接合体、より望ましくは、形質転換植物体がその遺伝子についてホモ接合体で、有性的接合によりその遺伝子をそのすべての子孫に伝える植物体である。
【００７６】
以下で議論されるように、本発明の形質転換植物体は、在来の植物体に比べステロールを蓄積する。以下で議論されるように、ある形質転換植物体はイモムシのような害虫に対する耐性を示した。
【００７７】
Ｄ．商業用（雑種）種子の開発
形質転換植物体からの種子を農地又は温室で栽培し、自家授粉して真に繁殖する植物体を生ずる。これらの植物体から生じた子孫は真の繁殖系となり、農地に於て即ち一連の環境条件の下でステロールの蓄積が認められるのが望ましい。
【００７８】
多数の異なる雑種の組み合わせが販売できれば、ステロール蓄積量が増加した植物の商業的価値は上昇する。成熟時期、スタンダビリティー、或いは他の作物学的特性に基づき、通常、利用者は１種より多くの種類のハイブリッドを栽培する。加えて、成熟期、耐病性及び除草剤への耐性などの特性の違いから、ある国家の一部に適応した雑種が他の地域でも適応するとは限らない。このため、ステロールの蓄積が多くの親系に導入され、多数の雑種の組み合わせが作成でき得るのが望ましい。
【００７９】
作物学的に選良な系へのステロールの蓄積が促進される特性の付加は、当業者に良く知られている技術により行われる。例えば、ステロール蓄積の促進に関してホモ接合型又はヘテロ接合型の親植物と、除草剤耐性（米国特許Ｎｏ．４，７６１，３７３）のような他の望ましい特性を有する系を交配し、雑種を作成する。雑種を作成するには、ステロール蓄積の促進に関してホモ接合型の植物体が望ましい。
【００８０】
例えば、ステロール蓄積の促進に関してホモ接合型の植物体が他の好ましい特性を有する親植物と交配される。ステロール蓄積の促進に関してヘテロ接合型のその後代は、ステロール蓄積の促進と他の好ましい特性を得るよう、親と戻し交配される。望んだすべての特性を持つ植物体を得るには、子孫と親との戻し交配を一度以上繰り返さねばならない。
【００８１】
別の方法として、ステロール蓄積が促進する特性を有する植物体を、他の好ましい特性をコードし発現する他の遺伝子の導入により形質転換するか、或いはその開示が参照文献として編入される米国特許Ｎｏ．４，６１６，０９９号のように、例えばＸ線又はガンマ線の放射線照射により突然変異を生じさせる。このように、本発明は多いステロール蓄積量を有する植物体の突然変異体並びに遺伝学的に操作した誘導体も企図する。
【００８２】
Ｅ．形質転換植物体のステロールの蓄積
本発明は、植物体内にステロール、特にシクロアルテノールの蓄積を増加させる方法を提供する。これはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させ、そのコードされているポリペプチドの発現により達成される。
【００８３】
普通、非形質転換植物体のステロール蓄積量は植物体の乾燥重量の約０．３パーセントである。このような普通の植物体に蓄積される主なステロールは、カンペステロール、シトステロール、スチグマステロール及びコレステロールの誘導体である。シクロアルテノールの５（６）炭素−炭素の不飽和化を受けた、シクロアルテノールのΔ５誘導体であるこれらのステロールは、普通の植物中にある全ステロール重量の８０パーセント以上を占める。シクロアルテノールは普通、植物体に存在する全ステロール量の約３パーセントから約３０パーセントを占める。
【００８４】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させた植物体では、全ステロール蓄積量の著しい増加が示される。さらに、このような植物体に見られる主なステロールはシクロアルテノールであり、形質転換植物体の全ステロール重量の約６０から約７０パーセントに達する。このように、本発明は従来の植物に比べ大量のステロールを蓄積する植物を提供する、ヘテロ接合型の形質転換植物体は、在来の非形質転換植物体に比べ、全ステロール量にして約２倍蓄積される。特に、ヘテロ接合型の形質転換植物体は、在来の植物体より約１０から約１００倍多い量のシクロアルテノールを蓄積する。
【００８５】
これらの結果は他の生物でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性とステロール蓄積に関する研究から考えると、驚くべき、予知できないことである。
【００８６】
酵母では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の上昇は、スクアレン（ステロール前駆体）、４，１４−ジメチルチモステロール及び１４−メチルフェコステロール（植物のΔ５ステロールに相当）の増加と関係している。ダウニング，ジェイ．エフ．等（Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９４（３）：９７４−９７９（１９８０）。酵母のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の上昇は、ラノステロール（シクロアルテノールに相当する酵母のステロール）の増加とは関係がない。ベンベニステ，ピー．，（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ，Ｐ．），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：２７５−３０８（１９８６）。
【００８７】
非光合成微生物中でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の上昇はステロール蓄積とは関係していない。トダ，エム．およびシロイシ，エム（Ｔａｄａ，Ｍ．ａｎｄＳｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｍ．）Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２３（４）：６１５−６２１（１９８２）。
【００８８】
Ｆ．ステロールの回収
所望により栽培後、トランスジニック植物を収穫し、ステロール産物を回収することが可能である。この収穫段階は、植物体全体、或いは植物体の葉又は根のみの収穫から成る。この段階は植物体を全く殺すことも可能であるし、もしトランスジニック植物体の成育に必須ではない部分のみを収穫すれば、植物体の残りは成長を継続できる。
【００８９】
この収穫段階以後の望ましい具体例としては、次のような段階を含む：
（ｉ）トランスジニック植物の少なくともステロールを含む部分をホモジナイズして植物パルプを作り、ステロールを含むパルプをそのまま、或いは乾燥ペレット又はタブレットとし、動物用飼料として企図される；又は
（ｉｉ）有機溶媒のような適当な溶媒で、或いは臨界超過抽出法［ファバティー等（Ｆａｖａｔｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．５３：１５３２（１９８８）及び本文での引用］を用いてステロールを抽出し、ステロールを含む溶液又は懸濁液を作成する；そして
（ｉｉｉ）その溶液又は懸濁液からステロールを分離する。
【００９０】
少なくともトランスジニック植物の一部は当業者に良く知られている技術を用いてホモジナイズされ、植物パルプを形成する。このホモジナイズは植物体の部分に応じて手で、又は機械的に、或いは化学的方法で行われ、小片とし、パルプが作られる。この植物パルプは目的のステロール混合物、わずかな量の前駆体、細胞断片及び細胞質内容物から成る。このパルプは乾燥、加圧してペレット又はタブレットとして可食であり、又はその利点を生かすように用い、或いはパルプは抽出操作を行うことも可能である。
【００９１】
上述のように作成した植物パルプからステロールを抽出し、ステロールを含む溶液又は懸濁液を作成することが可能である。このような過程はこの研究で技術として当業者に良く知られている。例えば、抽出過程は植物パルプで適当な溶媒に浸すことより成り得る。この適当な溶媒は植物パルプ中に存在するステロールを溶解又は懸濁する能力を有する。このような抽出操作に有効な溶媒はこれまでの研究で技術的に良く知られ、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ヘキサン、及びクロロホルムのような有機溶媒とそれらの組み合わせと、水と有機溶媒の混合などを含む。ピーナッツ、コーン、大豆などの植物油やこれらと同様のものも、この抽出に用いることができる。
【００９２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子でトランスフェクトされた植物は、適当な条件下でステロールが合成されるのに十分な期間、栽培される。ステロールを含む植物細胞は、望ましくは乾燥された状態で機械的に又は化学的に溶解され、前述のように溶解した細胞から液体の有機溶媒を用いてステロールを抽出され、ステロールを含む溶液又は懸濁液が形成される。ステロールは、溶液又は懸濁液からクロマトグラフィーのような通常の方法を用いて分離される。
【００９３】
ステロールの抽出について、これまで当業者によく知られた方法を用いて、上述の溶液又は懸濁液からステロールが分離された。これらの方法は、多様な液体媒体への溶解性に基づく分離、カラムクロマトグラフィーなどクロマトグラフの技術を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
Ｇ．形質転換植物体の害虫耐性
本発明の形質転換植物体に蓄積されるあるステロールは、浸透性の殺虫剤としての使用法を有する。本発明のこの具体化は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域とそのレダクターゼの発現を制御する適当なプロモーターをコードする外来ＤＮＡ断片が操作上連結したベクターから成る組換えＤＮＡ分子で、在来の植物を形質転換することを含む、植物の害虫に対する耐性を上昇させる方法に関する。望ましい態様では、外来ＤＮＡ断片はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のリンカー領域の少なくとも一部はコードし、膜結合領域はコードしない。ハムスターの遺伝子の利用が特に望ましい。
【００９５】
切断したハムスターのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子で転換したシクロアルテノールの量が増加している植物の葉で成長したタバコのイモムシの幼虫は、成長の遅延が認められた。予備的な研究では、同様な条件下で同様な形質転換植物体の葉を餌として成長したオオタバコガの幼虫は成長が遅延した。
【００９６】
以下の実施例では発明を実行する最高の方法で、例を挙げて説明するものであり、決して明細書並びに請求の範囲の制限を意味するものではない。
【００９７】
【実施例】
【００９８】
【実施例１】
植物細胞の形質転換
植物細胞は植物内で外来遺伝子を発現する標準的な方法に従って形質転換した。シャーデル，シー．エル．等（Ｓｃｈａｒｄｌ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ６１：１−１１（１９８７）。発現系としてｐＫＹＬＸシリーズのベクターを用いた。好ましいプラスミドはｐＫＹＬＸ６及びｐＫＹＬＸ７である。ベーガー．ピー．ジェイ．，等（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８４０２−８４０６（１９８９）。ジェイ．エル．ゴールドスティン（Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）博士の研究室より入手した。切断したハムスターのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＨＭＧＲ−Δ２２７）で形質転換を行った。例えば、ギル，ジー等（Ｇｉｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．），Ｃｅｌｌ，４１：２４９−２５８（１９８５）；バード，エム．およびダウニング，ジェイ．エフ．（Ｂａｒｄ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２５：４１５−４２０（１９８１）を参照せよ。
【００９９】
ＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子は修飾を施したベクターｐＫＹＬＸ６（中間構築体として設計された大腸菌のベクター）及びｐＫＹＬＸ７（クローニングした遺伝子の挿入のために設計されたＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのベクター）に組み込まれた。ベーガー．ピー．ジェイ．，等（Ｂｅｒｇｅｒ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８４０２−８４０６（１９８９）。修飾したベクター、ｐＫＹＬＸ６１及びｐＫＹＬＸ７１は元のＨｉｎｄＩＩＩ ＳｓｔＩ断片の代わりにＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｈｏＩ，ＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩ，及びＳｓｔＩ断片マルチプルクローニングサイト領域に有する。
【０１００】
ＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子をＢａｍＨＩとＳｓｔＩで切断し、約２５００ｂｐのＨＭＧＲ−Δ２２７−ＢａｍＨＩ，−ＳｓｔＩ断片をプラスミドｐＫＹＬＸ６１に挿入した。生じたＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ６１のコンストラクトをＥｃｏＲＩとＣｌａＩで切断し、プロモーター−遺伝子−ターミネーターを含む約４０００ｂｐの断片をｐＫＹＬＸ７１の対応するサイトに挿入し、プラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１を作成した（図６参照）プラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１中で、切断されたＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子は、強力で構成的なＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にある。
ＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１コンストラクトを持つ大腸菌、アームを除去したＴｉプラスミドＧＶ３８５０を持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）、及び接合ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌間の標準的な３親接合により、ＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１プラスミドをアグロバクテリウムに移動させた。例えば、シャーデル等（Ｓｃｈａｒｄｌ，ｅｔ ａｌ．），Ｓｕｐｒａ；Ｄｉｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：７３４７−７３５１：（１９８０）を参照せよ。交雑な結果として、ＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１コンストラクトを持つアグロバクテリウムを、リファンピシン耐性（アグロバクテリウムの染色体上にコードされている）並びにテトラサイクリン及びカナマイシン耐性（ｐＫＹＬＸ７１ベクターにコードされている）により選択した。
【０１０１】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｂａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ．ｘａｎｔｈｉｉ （Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ））を良く知られている“葉盤法”で形質転換した。ホーシュ，アール．ビー．等（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１２２９−１２３１（１９８５）。葉盤をΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１を持ったアグロバクテリアと共に約３日間インキュベートした。形質転換された組織をカナマイシン耐性（ｐＫＹＬＸ７１ベクターにコードされている）によって選択し、抗生物質のメホキシンを用いてアグロバクテリアを治療し、植物体全体を再生した。ホーシュ，アール．ビー等（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１２２９−１２３１（１９８５）。
【０１０２】
メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ，）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５：３４６−３４９（１９８７）の方法により、植物組織に挿入されたＨＭＧＲΔ２２７遺伝子塩基配列のコピーが存在することを確認した。ＲＮＡの転写レベルは、ノザンブロッティング又はＳ−１プロテクションアッセイにより決定した。マニアチス，ティー等（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂａｒｏｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）。
【０１０３】
対照植物体［非形質転換体（天然の）又はＨＭＧＲ−Δ２２７コンストラクトを持たない形質転換体］に比べＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を示す植物体を自家で有性交配させ、子孫を生じた。
【０１０４】
【実施例２】
トランスジニック植物のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性
トランスジニック植物は、溶解した細胞の１００，０００ｘＧ上澄にあるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を標準的なアッセイ（Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄＮａｂｌｅ，Ｒ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：４６９−４７３（１９８７））で調べることにより、切断されたＨＭＧＲ遺伝子の発現をスクリーニングした。
【０１０５】
可溶性のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、選択（カナマイシン）培地上で成育したカルス培養、カナマイシン存在下又は湿らせた濾紙の上で発芽した幼植物、及び温室で培養した植物体から得た様々な大きさの葉について測定された。温室で栽培した植物体から得た葉のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の研究結果も、下の表１にまとめられている。
【０１０６】
対照の植物体、３０はΔ２２７遺伝子ではなく、選択マーカーで形質転換されている。植物体５，１４，１５，１８及び２３は（独立に形質転換され）、ＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子で形質転換されている。
【０１０７】
対照の植物体と比較して、Δ２２７遺伝子を持つ植物体では全ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は１．６から３．９倍高かった。
【０１０８】
【実施例３】
形質転換植物体のステロールの蓄積
実施例１の方法に従ってＨＭＧＲ−Δ２２７で形質転換されたタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の全ステロール含量を測定した。ステロールは内部標準を用いる分析用ガスクロマトグラフィーで測定した。結果は表２に示されている。
【０１０９】
形質転換植物体は、高いＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性とステロール含量の増加を示した。
【０１１０】
全ステロール含量の決定に加え、形質転換タバコの個々のステロールの蓄積も測定した。コントロール（Ｃｎｔｒｌ）及びＨＭＧＲ−Δ２２７形質転換（Ｔｒｆ）植物体のこの分析結果は表３に示されている。
【０１１１】
【０１１２】
対照植物では、シクロアルテノールは全ステロール蓄積量の約３（０．０１１／０．２８３乾燥重量パーセント）（葉）から約３０（０．０３９／０．１２６乾燥重量パーセント）（根）パーセントを示した。対照植物で蓄積される主なステロール（即ちシトステロール、カンペステロール）は、シクロアルテノールのΔ５−ステロール誘導体であり、さらに代謝による変換を受けている。
【０１１３】
ＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子による形質転換の結果、シクロアルテノールとその誘導体との比が逆転する。形質転換植物では、全ステロール蓄積重量のうち、シクロアルテノール蓄積量は約６０（根）から約７０（葉）パーセントを示した。それらのデータは、本発明の形質転換植物は天然の、非形質転換植物に比べより多くのステロールを蓄積していることを示す。形質転換されたヘテロ接合型の植物体は天然の植物体に対し、全ステロール量で約２倍の蓄積がみられる。データはさらに、形質転換されたヘテロ接合型植物体は、天然の植物体に対し約１０から約１００倍以上多くのシクロアルテノールを蓄積することを示す。
【０１１４】
【実施例４】
形質転換植物の殺虫効果
タバコの害虫であるＴｏｂａｃｃｏ Ｈｏｒｎｗｏｒｍ 又はＭａｎｄｕｃａＳｅｘｔａ の初齢幼虫をペトリ皿中の湿らせた濾紙上の対照及びＨＭＧＲ−Δ２２７で形質転換したタバコの葉の上に置いた。対照又は形質転換した植物体から得た葉をさらに与え、幼虫をさらに７日間飼育した。そこで幼虫の成長及び発生を検討した。結果を表４に示されている。
【０１１５】
ＨＭＧＲ−Δ２２７で形質転換された植物体からの葉で飼育したＴｏｂａｃｃｏ Ｈｏｒｎｗｏｒｍ又はＭａｎｄｕｃａ Ｓｅｘｔａ の幼虫は、対照に比べ発生の遅延（２齢幼虫の段階よりも先に進んだものはいなかった）及び成長の阻害（湿重量）を示した。この研究に用いられた対照と形質転換植物のシクロアルテノール量は、それぞれ葉の乾燥重量に対し０．０１７及び１．０２パーセントであった。以上のようにこの研究は植物体中のシクロアルテノール蓄積量の増加と、植物体の害虫耐性の両方を例示する。
【０１１６】
ｈｅｌｉｏ−のメンバーだある害虫のグループに属するオオタバコガの幼虫での予備的な研究は、形質転換植物体１４（実施例２）の葉で飼育された幼虫は、在来の対照植物体３０（実施例２）の葉のものより遅い成長速度を示した。それぞれの葉で飼育された昆虫の繁殖能力に対する影響も注目された。
【０１１７】
【実施例５】
ホモ接合型の形質転換植物
前述した形質転換植物体は、導入したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子についてヘテロ接合型であった。これらの植物体のひとつ、実施例２の植物１４を自家受精した。即ち、それ自身と有性的接合を行った。
【０１１８】
その交配から２０個の種子が芽生え、植物体に成長した。これら兄弟の組織をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、全タンパク質量及び全ステロール含量について検討した。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の比活性も算定した。このアッセイの結果は、植物体３０（実施例２）の自家受精で生じた兄弟からのデータと比較し、下の表５に示した。
【０１１９】
【０１２０】
上述のデータに基づき、植物体を、（ａ）導入したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を全く持たない（ｂ）植物体１４のように導入した遺伝子についてヘテロ接合型、又は（ｃ）導入した遺伝子についてホモ接合型、に分類した。実例で示すと、植物体１４−２は導入遺伝子についてヘテロ接合型、植物体１４−６は導入遺伝子についてヘテロ接合型、そして植物体１４−８は導入遺伝子についてホモ接合型、即ち２本の染色体の双方に導入遺伝子をもつ、と判断された。
【０１２１】
これらのデータは、形質転換された植物体から得た種子は芽生えて植物体に成長し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数の増加によりステロール蓄積量の増加を示す能力があることを示す。
【０１２２】
実施例３のデータと合わせて、これらのデータは、本発明の形質転換植物は在来の植物に比べステロールをより多く蓄積し、このような植物は種子の形成が可能であり、種子はステロールを多く蓄積する植物体を芽生えさせることを示している。
【０１２３】
植物体１４−８の自家受精から生じた種子はブタペスト条約に従い、１９９０年９月２８日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２ Ｕ．Ｓ．Ａ）に保存され、寄託番号ＡＴＣＣ４０９０４である。
【０１２４】
本発明を望ましい具体例として記述した。開示された対象の修飾並びに／又は変形が、本文のこれ以後にある本発明の範囲から離れることなく行われることが当業者には明らかとなるであろう。
【０１２５】
表の説明
表６−１６は（ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの合成核酸配列（配列番号１）及びそのタンパク質の予想アミノ酸配列（配列番号２）であり、チン，ディー．ジェイ．等（Ｃｈｉｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３０８：６１３−６１７（１９８４）により発表されたものと同じである。
【０１２６】
核酸は５’から３’の方向に（右側に）番号がつけてある。予想アミノ酸配列は、核酸配列の下に示されている。アミノ酸配列は、開始メチオニンからはじめて５アミノ酸ごとに下に番号がつけてある。
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
表１７−２６はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１の核酸塩基配列（配列番号３）及び誘導アミノ酸塩基配列（配列番号４）であり、バソン，エム．イー等（Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８（９）：３７９７−３８０８（１９８８）により発表されたものである。核酸は、表６−１６について述べられたように表示及び番号付けされており、誘導アミノ酸残基についても同様である。
【０１３９】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：４７６８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列表（配列番号１）
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【配列表】
配列番号：２
配列の長さ：８８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列表（配列番号２）
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【配列表】
配列番号：３
配列の長さ：３３６０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列の特徴
配列を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１２１．．．３２８２
配列表（配列番号３）
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【配列表】
配列番号：４
配列の長さ：１０５４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列表（配列番号４）
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【配列表】
配列番号：５
配列の長さ：３３４８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列の特徴
配列を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１２１．．．３２５５
配列表（配列番号５）
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【配列表】
配列番号：６
配列の長さ：１０４５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列表（配列番号６）
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【図面の簡単な説明】
本開示の一部を占めている図面は以下のものを含む：
【図１】図１は、アセチルコエンザイムＡからステロイドや他のイソプレノイドに至る植物中での代謝経路の模式図であり、ミッソーリ大学のデー．デー．ランダル等（Ｄ．Ｄ．Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．）編 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４巻，（１９８５）にメセル，デー．ダブリュー．等（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ）により発表されたものと同様である。
【図２】図２はハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする、切断型のハムスター遺伝子を、このハムスターの酵素が欠乏している細胞に挿入するために用いられるプラスミド（ｐＲｅｄ−２２７Δ）の構造を示す模式図である。アミノ酸１０から３４１をコードする還元酵素コード配列（核酸２８から１０２３）の塩基対は、削除されていて、プラスミドの外部に示されている。斜線の領域はプラスミドの還元酵素ｃＤＮＡ配列部分を示している。還元酵素ｃＤＮＡの開始メチオニンコドン（核酸１）及び終止コドン（核酸２６６２）が、プラスミドの他の特徴と同様に表示されている。
【図３】図３は、本発明の植物を形質転換するために用いられるプラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１の制限酵素地図の図式である。
【産業上の利用分野】
本発明は、高等植物におけるステロール蓄積増加のための方法および組成物、とりわけ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによってステロール蓄積を増加させることに関する。
【０００２】
【従来の技術】
メバロネート（Ｃ６Ｈ１１Ｏ４）は、細胞と有機体の生存能力に必要な数多くの化合物の代謝前駆体である。植物においては、メバロネート由来の主な最終産物は、ステロール及び、その他のイソプレノイドである。（図１参照）。
【０００３】
典型的な植物のイソプレノイドには、テルペン（多くの植物の芳香を生じさせる揮発性Ｃ１０及びＣ１５化合物）、カロチノイド（多くの植物に色を生じさせるＣ４０化合物）及び天然ゴムのような重合体がある。
【０００４】
遊離のステロールは実質的にすべての真核細胞生物の構成成分である。維管束植物の最も豊富にあるステロールは、カンペステロール、２４−メチルコレステロール、シトステロール及びスチグマステロールである。
【０００５】
メバロネートは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）の還元によって生成される。ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロネートへの還元は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素によって触媒される。
【０００６】
動物及び酵母のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、小胞体の膜内在性糖タンパク質である。完全な酵素は３つの領域を含む：酵素の活性部位を含む触媒領域、小胞体に酵素を固着させる膜結合領域、及び、酵素の触媒及び膜結合領域をつなげる連結部位である。膜結合領域は、完全なタンパク質のＮＨ２−末端部を占めている。一方、触媒領域は、タンパク質のＣＯＯＨ−末端部を占めており、連結部位は残りの部分を構成している。バソン，エム．イー．等（Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８（９）：３７９７−３８０８（１９８８）。現在では、植物におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の細胞内局在は知られていない。ルセル，ディー．ダブリュ．等（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４，ｅｄ．ｂｙ Ｄ．Ｄ．Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（１９８５）。
【０００７】
動物及び酵母のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性は、ステロールによるフィードバック阻害を受けることが知られている。そのようなフィードバック阻害は、酵素の膜結合領域を必要とする。例えば、ギル，ジー．等（Ｇｉｌ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．），Ｃｅｌｌ，４１：２４９−２５８（１９８５）；バード，エム．およびダウニング，ジェイ．エフ．（Ｂａｒｄ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２５：４１５−４２０（１９８１）参照。
【０００８】
メバロネートがステロール及び他のイソプレノイドの前駆体である、ということになると、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の量あるいは活性を増大させると、ステロール及び他のイソプレノイドの蓄積が増加するようになることが期待される。酵母及び非−光合成性微生物においては、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の増加は、予想される。ステロールあるいは他のイソプレノイドの産生増加を伴なわない。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性が異常に高レベルとなる酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の変異株では、２つのステロール、４，１４−ジメチルザイモステロール及び１４−メチルフェコステロールの産生が、通常に比べて著しく増加する。ダウニング，ジェイ．エフ．等（Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９４（３）：９７４−９７９（１９８０）。
【０００９】
非−光微合成性微生物における啓発によって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性が増大すると、イソプレノイド（カロチノイド）合成が増進するが、ステロール（エルゴステロール）合成は増進しない。トダ，エム．およびシロイシ，エム．（Ｔａｄａ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｍ．）Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２３（４）：６１５−６２１（１９８２）。植物におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性のこのような増大の影響を報告する研究はない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数の増加することによって植物のステロール蓄積の増加の方法を提供しこれによってこの酵素活性は天然の植物における活性と比較したとき、増加する。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドとは、活性のある、切断されたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素と同様に、完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を含んでいる。好ましい態様では、活性のある、切断されたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒及び結合領域を含み、膜結合領域を含まない。
【００１１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ断片及び、植物内において、上述のポリペプチドを発現させるのに適当なプロモーターに操作的に連結されたベクターを含む、組換えＤＮＡ分子で、植物を形質転換することで、増加させることができる。好ましい組換えＤＮＡ分子は、プラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１である。
【００１２】
プロモーターは、可能であれば、形質転換された植物内のステロールのレベルによる影響を実質的に受けない調節機能を持つプロモーターである。好ましいプロモーターはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである。とりわけ望まれる実施態様においては、蓄積したステロール、シクロアルテノールのレベルは、特に増大している。
【００１３】
本発明では、さらに、植物における害虫抵抗性の増加の方法を提供している。この方法では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数が、前述したように、天然の植物よりも増加している。
【００１４】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数が増加した、形質転換された植物もまた、考慮されている。このような植物は、天然の形質転換されていない植物に比べて全ステロール、とりわけシクロアルテノールの含有量が高くなっている。このような形質転換された植物はまた、形質転換されていない植物、天然の植物に比べて、イモムシ（ｈｏｒｍｗｏｒｍ）のような害虫に対する抵抗性を示す。
【００１５】
本発明はさらに、天然の形質転換されていない同じ株及び変異体に比べてステロールを過剰蓄積する植物に成長できる植物種子、組換え体、それらの遺伝子工学的誘導体及びそれらに誘導された交配種を提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
Ｉ．定義
次に示す単語及び句は、以下に明記された意味を持つ。
【００１７】
発現：ポリペプチドを生成するための、構造遺伝子が受ける転写と翻訳を含む、細胞内過程の組み合わせ。
【００１８】
発現ベクター：構造遺伝子の発現を、それらの遺伝子に有効に結合したときに制御する制御要素を形成するＤＮＡ配列。
【００１９】
有効に結合：構造遺伝子は、例えば構造遺伝子を発現ベクターの制御下に置くために発現ベクターにというように、他のＤＮＡ（あるいは適切な場合ＲＮＡ）部分に正しい読み枠で共有結合している。
【００２０】
プロモーター：構造遺伝子の発現制御要素を与え、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合してその遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列あるいはＤＮＡ配列グループ上の認識部位。
【００２１】
組換えＤＮＡ分子：天然には通常共に見られることのない、最少２つの核酸配列から成る雑種ＤＮＡ配列。
【００２２】
構造遺伝子：ポリペプチド、すなわちアミノ酸残基配列として発現されるＤＮＡ配列。
【００２３】
ベクター：細胞内で複製が可能であり、かつ／または取り付けたＤＮＡ部分の複製を行うように他のＤＮＡ部分を有効に結合することのできるＤＮＡ分子。プラスミドは、典型的なベクータである。
【００２４】
ＩＩ．本発明
本発明は、植物内のステロールの蓄積を増大する組成物及び方法に関するものであり、同様に、天然の様々な植物に比較して増大したステロールの蓄積を示す植物にも関するものである。本発明で注目する植物は、導管のある、多細胞高等植物である。このような高等植物を、以下本明細書中では、通常単に“植物”と表すことにする。典型的な植物は、タバコ、トマト、トウモロコシ、ニンジン、ダイズ、ワタ、大麦、シロイヌナズナ、グアユールゴムノキ、ペチュニアである。望ましい植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）種である。
【００２５】
本発明で注目する植物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ活性を持つポリペプチドをコードする付加された構造遺伝子で、形質転換された植物中でコードされているポリペプチドが発現するように、形質転換される。形質転換植物の前駆体である形質転換されていない植物を、本明細書中では“天然”植物と表す。比較する天然及び形質転換植物は、同じ種子のさやからの兄弟や、同一の親からのクローンまたは同じ系統の植物といった同じタイプのものである。
【００２６】
本発明の植物中でのステロール生成は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の細胞内活性を増大することにより増加し、そこで酵素は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）のメバロン酸への変換を触媒する。本明細書中で用いる“細胞内活性”は、植物細胞中でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の総触媒の活性を意味する。
【００２７】
細胞内ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加することによって増大する。コードされた構造遺伝子の発現は、その酵素の細胞内活性を高める。
【００２８】
コピー数は、植物細胞を、外来ＤＮＡ部分（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする）及び該植物中での該ポリペプチドの発現を誘導するのに適したプロモーターと有効に結合しているベクターから成る組換えＤＮＡ分子で形質転換することで、増加する。このようなポリペプチドは、完全なものを、触媒作用活性型で、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素タンパク質と同様に含む。
【００２９】
従って、形質転換植物細胞及び植物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子を、同じタイプの、天然の形質転換されていない植物に比して、さらに一つ以上持っている。このため、形質転換植物は、天然植物から、ＤＮＡ断片あるいはｍＲＮＡをアガロース分離してトランスファーしてＤＮＡあるいはＲＮＡで適切なブロッティングを行う標準的な技術、またはポリメラーゼ鎖反応技術によって識別でき、これらの技術はよく知られている。形質転換及び天然植物あるいはそれからの細胞培養体の相対ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性も比較することが可能であり、相対活性が形質転換：天然で１．５：１であることで形質転換を示す。
【００３０】
ステロールの蓄積も天然と形質転換植物の識別に使用することができる。さらに遺伝子が１つある場合、形質転換植物は天然植物の少なくとも２倍の総ステロール含有量を持つ。
【００３１】
Ａ．構造遺伝子
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子で植物を形質転換することを意図している。動物及び酵母細胞両方のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、３つの異なるアミノ酸残基配列領域からなり、それらの領域は、触媒領域、膜結合領域及びリンカー領域と呼ばれる。触媒領域は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性部位を含み、完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のＣＯＯＨ末端部分約４０％から成る。膜結合領域は、疎水性アミノ酸残基を含み、完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のＮＨ２末端部分約５０％から成る。リンカー領域は、触媒及び膜結合領域をつなぎ、完全な酵素の残りの約１０％を構成している。以下で非常に詳細に述べるように、本明細書では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域のみが必要とされる。その触媒領域に相当するポリペプチドをコードする構造遺伝子は、植物を形質転換するために必要な最小限の遺伝子である。しかしながら、より大きい酵素及びその構造遺伝子が好ましい。従って、本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする完全な及び切断型の構造遺伝子両方の使用を意図する。
【００３２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子は、様々な材料から、様々な方法論によって、獲得し構築することができる。例えばカールソン，エム．およびボットステイン，ディー．（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，ｄ．），Ｃｅｌｌ，２８：１４５（１９８２）；レイン，ジェイ．等（Ｒｉｎｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：６７５０（１９８３）参照。このような構造遺伝子の典型は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする哺乳類と酵母遺伝子である。
【００３３】
哺乳類の染色体はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードするただ一つの遺伝子を含む。ハムスターとヒトのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の核酸塩基配列を記した。ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの合成核酸配列（配列番号１）及びその予想アミノ酸残基配列（配列番号２）を第２図に、シン，ディー．ジェイ．等（Ｃｈｉｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３０８：６１３−６１７（１９８４）から再び印刷して提供してある。表６から１６の合成核酸配列（配列番号１）は、約４７６８塩基対からなり、完全なハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸配列を含む。
【００３４】
完全なハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、約８８７アミノ酸残基（配列番号２）から成る。８８７アミノ酸残基の完全なハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする構造遺伝子は、表６から１６（配列番号１）の約核酸番号１６４から約核酸番号２８２４の塩基対から成る。
【００３５】
望ましい構造遺伝子は、酵素の触媒領域だけに相当するようなポリペプチドをコードするものである。ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の２つの触媒作用活性部分が定義された。リスム，エル．等（Ｌｉｓｃｕｍ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．），Ｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（１）：５２２（１９８５）。一つの触媒領域は、見かけ分子量６２ｋＤａであり、約番号３７３から約番号８８７までのアミノ酸残基から成る。２つ目の触媒領域は、見かけ分子量５３ｋＤａであり、約番号４６０から約番号８８７までのアミノ酸残基から成る。６２ｋＤａ触媒作用活性部分は、表６から１６（配列番号１）の約核酸番号１２８０から約核酸番号２８２４までの塩基対にコードされている。５３ｋＤａ触媒作用活性部分は、表６から１６（配列番号１）の約核酸番号１５４１から約核酸番号２８２４までの塩基対にコードされている。
【００３６】
好ましい態様では、利用される構造遺伝子はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域と少なくともリンカー領域の一部をコードする。ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のリンカー領域は、約番号３４０から約番号３７３まであるいは、約番号３４０から４６０までのアミノ酸残基からなり、それは触媒領域の定義の仕方に依存している。これらのリンカー領域は、表６から１６（配列番号１）の各々約核酸番号１１８０から約核酸番号１２８３までの、あるいは約核酸番号１１８０から約核酸番号１５４０までの塩基対にコードされている。リンカー領域をコードする構造遺伝子は、触媒領域をコードする構造遺伝子に有効に結合している。一つの特に好ましい態様では、触媒的に活性な、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする構造遺伝子は、酵素の膜領域のごく一部をコードする塩基対を選択して含むことができる。切断型ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、ＨＭＧＲ−Δ２２７と呼ばれ、表６から１６（配列番号１）の核酸１６４−１９０及び１１８７−２８２４からなり、アミノ酸残基１−９（膜結合領域から）と３４２−８８７をコードし、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の欠乏している細胞を形質転換するために使用される。切断型遺伝子を含む形質転換用プラスミド（ｐＲＥＤ−２２７Δ）の図式構造は、第２図に再び印刷されている。酵母のような他の生物由来の、触媒的に活性な、切断型のあるいは完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から成るポリペプチドをコードする構造遺伝子もまた、本発明に従って利用することが可能である。
【００３７】
酵母細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする２つの遺伝子を含む。２つの遺伝子はＨＭＧ１及びＨＭＧ２と命名され、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２と命名されている２つの異なる形のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードしている。ＨＭＧ１の核酸塩基配列（配列番号３）は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１のアミノ酸残基配列（配列番号４）と同様に表１７−２６にバリン，エム．イー等（Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８（９）：３７９７（１９８８）から引用して表示してある。ＨＭＧ２の核酸塩基配列（配列番号５）は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２のアミノ酸残基配列（配列番号６）と同様に、以下本明細書で配列リストに発表されている。ＨＭＧ１遺伝子全体は約３３６０塩基対（配列番号３）から成る。完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１は、約１０５４アミノ酸残基のアミノ酸配列（配列番号４）から成る。従って完全な酵素をコードするＨＭＧ１遺伝子の最小限の部分は、表１７−２６（配列番号３）約核酸番号１２１から約核酸番号３２８２までの塩基対から成る。
【００３８】
ＨＭＧ２遺伝子全体は約３３４８塩基対（配列番号５）から成る。完全なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２は、約１０４５アミノ酸残基のアミノ酸配列（配列番号６）から成る。従って完全な酵素をコードするＨＭＧ２遺伝子の最小限の部分は、表１７−２６（配列番号５）の約核酸番号１２１から約核酸番号３２５５までの塩基対から成る。
【００３９】
切断型ハムスター構造遺伝子との類似性により、酵母由来の、触媒的に活性な、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から成るポリペプチドをコードする構造遺伝子もまた、本発明に従って利用することが可能である。
【００４０】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１の触媒領域は、約残基６１８から約残基１０５４までのアミノ酸残基：すなわちＣＯＯＨ末端、から成る。触媒領域をコードする構造遺伝子は、表１７−２６の約核酸番号１９７４から約核酸番号３２８２までの塩基対から成る。
【００４１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１のリンカー領域は、約残基５２５から約残基６１７までのアミノ酸残基から成る。リンカー領域をコードする構造遺伝子は、表１７−２６の約核酸番号１６９５から約核酸番号１９７３までの塩基対から成る。酵母ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１の、触媒領域と少なくともリンカー領域の一部から成るポリペプチドをコードする構造遺伝子は、好ましくは、酵素の触媒領域をコードする構造遺伝子に有効に結合している、酵素のリンカー領域をコードする構造遺伝子から成る。
【００４２】
またやはり切断型ハムスター構造遺伝子との類似性より、切断型ＨＭＧ１遺伝子は、酵素の膜結合領域のごく一部をコードする塩基対を任意に含むことができる。このような構造遺伝子は、好ましくは、表１７−２６の約核酸番号１２１から約核酸番号１４７までと、約核酸番号１６９５から約核酸番号３２８２までの塩基対から成る。
【００４３】
酵母ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素２の類似部分に由来する、上記のものと同類の構築物もまた、利用可能である。
【００４４】
当分野においては明かなことだろうが、本明細書で述べた核酸配列は、上述の配列の場合のように明白に示されていようが、あるいは一般的には知られているが本明細書中で表示していない核酸配列についてのように暗に示されていようがどちらでも、遺伝コードに本来備わっている縮重性と修飾や交換を受け易いポリペプチドである非必須領域のために、変更が可能である。この点を考慮し、本発明はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性をコードする構造遺伝子の対立変異体について熟考する。
【００４５】
前述のＤＮＡ部分は最短長を持つ場合も、総全長と同様に言及される。最短長は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つ特定のポリペプチドをコードするＤＮＡ部分の長さを定義する。当分野でよく知られているように、必須のＤＮＡ配列が存在する限り（開始及び終止シグナルを含む）、部分のどちらの末端にもさらに塩基対を付加しておくことが可能であり、そのような部分は、それでもやはりタンパク質を発現するために利用できる。当然ここでは、発現を抑制したり、発現するように望まれている酵素を消耗するようなそれ以上の産物を発現したり、望ましい酵素以外の産物を発現したり、またそれ以外にもＤＮＡ部分の構造遺伝子を阻害したりするような、有効に結合したＤＮＡ配列が、部分中には存在しないことを前提としている。
【００４６】
従って、ＤＮＡ部分がこのような阻害的ＤＮＡ配列を含まない限り、本発明のＤＮＡ部分は、長さにして１５，０００塩基対にまで可能である。組換えＤＮＡ分子、とりわけ発現ベクターの最大限の大きさは、複製及び発現に必要な最小限のＤＮＡ配列全てが望まれて一旦揃えば、ほとんどは便利さと宿主細胞に収容できるベクターの大きさによって決定される。最小限のベクターの大きさは良く知られている。
【００４７】
Ｂ：組換えＤＮＡ分子
本発明の組換えＤＮＡ分子は、ベクターを有用なＤＮＡ部分と有効に結合して、本明細書で述べられたり、寄託されたようなプラスミドを作成することによって作製される。とりわけ望ましいＤＮＡ分子は、以後の実施例１で詳細に述べられる。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドの発現を導くことのできるベクターを、本明細書中では“発現ベクター”であるとみなす。
【００４８】
このような発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御要素を包含する。ポリペプチドをコードする遺伝子を発現ベクターに有効に結合すると、プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼの結合と望ましいポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導くことが可能になる。ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に有用であるのは、ポスコウスキー等（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．），ＥＭＢＯ Ｊ．，３：２７１９（１８９８）およびオデル等（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５）に述べられているような誘導可能、ウィルス由来、合成、構成的（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーター、及びチャウ等（Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１に提示されているような、一時的に、空間的に、そして時間と空間的に調節されるようなプロモーターである。好ましくは、プロモーターは、構造遺伝子の発現を調節する機能が細胞内ステロール量によって実質上影響を受けないプロモーター配列から成る。本明細書中で用いる“実質上影響を受けない”という用語は、プロモーターが、形質転換細胞内に蓄積されたステロールによる直接のフィードバック制御に預からないことを意味する。
【００４９】
プロモーターは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子に対する、形質転換植物細胞の転写活性を導く能力によってもまた選択される。植物組織中では、構造遺伝子は、様々なプロモーターによって誘導可能である。プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのように、ほとんど構成的（ｎｅａｒ−ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）になり得るし、また、双子葉あるいは単子葉に影響を与える組織特異的または発育特異的なプロモーターにもなり得る。典型的なプロモーターは、トウモロコシ シュクロース シンセターゼ１（ヤン，エヌ．エス．等（Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：４１４４−４８（１９９０））、トウモロコシ アルコール デヒドロゲナーゼ１（ボーゲル，ジェイ．エム．等（Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １３ｄ，３１２）（１９８９））、トウモロコシ ゼイン１９ｋＤ遺伝子（貯蔵タンパク質）（ボストン，アール．エス．等（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｈｙｓｉｏｌ．，８３：７４２−４６）、トウモロコシ集光性複合体（シンプソン，ジェイ．（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：３４（１９８６）、トウモロコシ熱ショックタンパク質オーデル、ジェイ．ティー等（Ｏ’Ｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−１２（１９８５））、エンドウマメ（ｐｅａ）ＲｕＢＰカルボキシラーゼ（ポールセン，シーツ．等（Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：１９３−２００（１９８６）；クシュモア，エー．アール．等（Ｃｕｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２９−３８（１９８３），Ｔｉプラスミドマンノパイン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンセターゼ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｈ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：３２１９−３２２３（１９８９），Ｔｉプラスミド ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンセターゼ（ランブリッジ，ダブリュー．エッチ．アール．，等（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｈ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：３２１９−３２２３（１９８９）、ペチュニア チャルコン（ｃｈａｌｃｏｎｅ）イソメラーゼ（ファン，タンネン，エー．ジェイ．，等（Ｖａｎ Ｔｕｎｅｎ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），ＥＭＢＯ．Ｊ．，７：１２５７（１９８８），マメ（ｂｅａｎ）グリシンリッチタンパク質１（（ケラー，ビー．，等（Ｋｅｌｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ．Ｊ．，８：１３０９−１４（１９８９），ＣａＭＶ ３５ｓ転写産物（オーデル，ジェイ．ティ．，等（Ｏ’Ｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−１２（１９８５）、及びジャガイモパタチン（Ｐａｔａｔｉｎ）（ベエンズラー，エッチ．シー．，等（Ｗｅｎｚｌｅｒ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：４１−５０（１９８９）である。好ましいプロモーターは、カリフラワー モザイク ウィルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターとＳ−Ｅ９ＲｕＢＰカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターである。
【００５０】
どの発現ベクターを選択するか、結局はポリペプチドをコードする遺伝子と有効に発現させるためにどのプロモーター選択するかということであるが、それは所望の機能的特性に、例えばタンパク質発現の位置と時期、形質転換される宿主細胞に、直接依存している。これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する分野に内在する良く知られている限界である。しかしながら、本発明を実行する際に有用なベクターは、有効に結合しているＤＮＡ部分を含む、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導くことができるものである。
【００５１】
高等植物で遺伝子を発現するのに有用なベクターは、当分野では良く知られており、Ａｑｕｒｏｂｑｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ腫瘍誘導（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）（Ｔｉ）プラスミド由来のベクター（ロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：２５３−２７７（１９８７）に記載）を含む。しかし、ほかの数種の発現ベクター系も植物内で機能することが知られていて、フロム等（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４（１９８５）に記載されているｐＣａＭＶＣＮ転写制御ベクターが含まれている。プラスミドｐＣａＭＶＣＮ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから購入可能）は、カリフラワー モザイク ウィルス ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含む。
【００５２】
本発明の組換えＤＮＡを作成するためにレトロウィルス発現ベクターを利用することも熟考された。本明細書で用いる“レトロウィルス発現ベクター”なる用語は、レトロウィルスゲノムのロング ターミナル リピート（ＬＴＲ）領域由来のプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。
【００５３】
好ましい態様では、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に用いられるベクターは、植物細胞内で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。好ましい薬剤耐性マーカーの一つは、発現した結果カナマイシン耐性になる遺伝子であり、すなわち、ロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．），がＭｅｔｏｄｓ Ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｈ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８８）に記載したノパリンシンセターゼ プロモーター，Ｔｎ５ ネオマイシン フォスホトランスフェラーゼＩＩとノパリン シンターゼ３’非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。他の好ましいマーカーは、トランスポゾンＴｎ９のアッセイ可能なクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子がある。相補的付着性末端および平滑性末端を介してＤＮＡをベクターに有効に結合するために、様々な方法が開発された。例えば、相補的ホモポリマートラック（ｔｒａｃｔｓ）を、挿入するＤＮＡ部分とベクターＤＮＡに付加することができる。ベクターとＤＮＡ部分は、次に相補的ホモポリマー尾部間で水素結合によってつながり、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【００５４】
別の方法として、１つ又はそれ以上の制限酵素部位を持つ合成リンカーを用いて、ＤＮＡ断片を発現ベクターに継ぐことも可能である。大過剰量の合成リンカー分子を、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼのように、平滑末端ＤＮＡ分子の結合を触媒できる酵素の存在下で平滑末端ＤＮＡ断片とインキュベートすることにより、合成リンカーは平滑末端ＤＮＡに結合される。従って、反応産物は末端に合成リンカーを持ったＤＮＡ断片である。これらのＤＮＡ断片は適当な制限酵素で切断され、合成リンカーと互換性のある末端を生ずる酵素で予め切断された発現ベクターに結合される。多様な制限酵素部位を含む合成リンカーは、ニューイングランド バイオラボ，バーバリー，マサチューセッツ州（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬｏｂｓ，Ｂｅｖｅｖｌｙ，ＭＡ）のものを含めて多くの供給源から商業的に入手可能である。
【００５５】
上述の組換えＤＮＡ分子と同等なＲＮＡも、本発明により企図される。
【００５６】
本発明に従って用いられた好ましい組換えＤＮＡ分子はプラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１である。
【００５７】
Ｃ．形質転換植物体並びに形質転換法
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数は、その構造遺伝子を含む適当なベクターで所望の植物を形質転換することにより増加する。形質転換植物体中でのその遺伝子の発現は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を上昇させる。
【００５８】
ポリペプチドをコードする遺伝子を植物に形質転換する方法としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を媒介する植物形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子トランスファー、再生産器官への注入及び未成熟胚への注入がある。それぞれの方法に固有の長所、短所がある。従って、ある特定の植物に遺伝子を導入する特定の方法は、他の植物に対しても最良であるとは必ずしも言えないが、特定の植物に対してどの方法が良いかは良く知られている。
【００５９】
アグロバクテリウムを媒介する遺伝子トランスファーは、ＤＮＡが全植物組織に導入され、プロトプラストから元の植物体を再生産する必要が無いため、植物細胞に遺伝子を導入するのに広く用いられる系である。植物細胞にＤＮＡを導入するためのアグロバクテリウムを媒介する発現ベクターの利用は、当業者に良く知られている。例えば、フラレィ等（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：６２９（１９８５）及びロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓｅｔ ａｌ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：２５３−２７７（１９８７）により記述された方法を参照せよ。さらにＴｉ−ＤＮＡの挿入はかなり厳密な過程であり、再編成はほとんど生じない。シュピールマン等（Ｓｐｉｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：３４（１９８６）及びジョーゲンソン等（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０７：４７１（１９８７）によって記述されているように、トランスファーされるＤＮＡの領域は末端の塩基配列によって決まり、介在するＤＮＡは通常、植物ゲノムに挿入される。
【００６０】
クレー等（Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ，テー．ホーン及びジェイ．ジェル編（Ｔ．Ｈｏｈｎ．Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）ｐｐ．１７９−２０３で述べられているように、最近のアグロバクテリウム形質転換ベクターはアグロバクテリウム同様、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でも複製でき、取扱い易くなっている。
【００６１】
さらに、アグロバクテリウムを媒体とする遺伝子トランスファー用のベクターについての最近の技術的進歩は、ベクター中の遺伝子と制限酵素サイトの再配列改善し、ポリペプチドをコードする多様な遺伝子を発現できるベクターの構築を促進した。ロジャース等（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：２５３（１９８７）によって記述されたベクターは、ポリペプチドをコードする挿入遺伝子を直接発現するためのプロモーターおよびポリアデニル化サイトに隣接したマルチリンカー領域を有し、この目的に適している。
【００６２】
アグロバクテリウムを媒体とするトランスフォーメーション法が有効な植物種では、遺伝子トランスファーが迅速でかつその性質も明確なこの方法が最適である。
【００６３】
葉盤及び他の組織のアグロバクテリウムを媒体とする形質転換は、アグロバクテリウムが天然で感染する植物種に限られている。双子葉植物では、アグロバクテリウムを媒体とする形質転換法が最も有効である。ビィテビアー等（Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎｏｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：５３４５（１９８７）に記述されているように、アグロバクテリウムのベクターを用いてアスパラガスのトランスジニック植物が作られているが、アグロバクテリウムの天然の宿主となる単子葉類はほとんどない。従って、米、コーン、小麦のような商業的に重要な穀類は、他の方法で形質転換されねばならない。しかしながら、上述したように、アグロバクテリウムを用いたアスパラガスの形質転換も行われ得る。例えば、ビィテビアー等、Ｐｒｏｃ．Ｎｏｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：５３４５（１９８７）を参照せよ。
【００６４】
アグロバクテリウムを用いて形質転換した植物体は典型的には１コピーの遺伝子をある１つの染色体上に含む。このような植物体は導入された遺伝子についてヘテロ接合体である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性のあるポリペプチドをコードする１コピーの構造遺伝子を有するヘテロ接合型形質転換体が、求める形質転換植物体である。
【００６５】
より望ましいのは、導入した構造遺伝子についてホモ接合体、即ち導入した遺伝子をコピー、相同染色体のそれぞれの染色体上に１遺伝子ずつ持つ植物体である。ホモ接合体の形質転換植物体は、ヘテロ接合植物体の有性的交配（自家受粉）を行い、生じた種子のいくつかを芽生えさせ、対照又はヘテロ接合植物体に対しＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性又はステロールの蓄積、或いはその両方が促進されている植物体を解析することにより得ることができる。ホモ接合植物体は高いＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性及びステロールの蓄積を示す。
【００６６】
植物プロトプラストの形質転換はリン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、並びにこれらの処理の組み合わせに基づく方法を用いて行われる。例えばポートリカス等（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３（１９８５）；ローツ等（Ｌｏｒｚ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１７８（１９８５），フローム等（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３１９：７９１（１９８６）；ウチミヤ等（Ｕｃｈｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４：２０４（１９８６）；カリス等（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．），Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１：１１８３（１９８７）；並びにマルマット等（Ｍａｒｃｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４５４（１９８８）を参照せよ。
他の植物種へのこれらの系の適用は、その植物種のプロトプラストから再生能に依存する。穀類のプロトプラストからの再生についての例は、フジムラ等（Ｆｕｊｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ ＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ，２：７４（１９８５）；トリヤマ等（Ｔｏｒｉｙａｍａ ｅｔａｌ．），Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７３：１６（１９８６）；ヤマダ等（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，４：８５（１９８６）；Ａｂｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：１０８７（１９８６）に記述されている。
【００６７】
プロトプラストからうまく再生され得ない植物種を形質転換するには、無傷の細胞又は組織にＤＮＡを導入する他の方法が用いられ得る。例えば、バジル（Ｖａｓｉｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：３９７（１９８８）により記述されているように、未成熟胚又は外植片からの穀類の再生が行われている。加えて、“パーティクル ガン”（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）又はより高速な発射技術が用いられ得る。
【００６８】
後者の技術では、クレイン等（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ
３２７：７０（１９８７）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：８５０２（１９８８）；及びＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）に記述されているように、微小な金属粒子上のＤＮＡは細胞壁を貫通し、細胞質に運ばれる。金属粒子は数層の細胞を貫通し、それにより組織外植片中の細胞の形質転換が可能になる。
【００６９】
ゴードンカム，ダブリュー．ジェイ．等（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，Ｗ．Ｊ．ｅａ ａｌ．，）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：６０３−６１８（１９９０）；クレイン，ティー．エム．等（Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（１９８９）；Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８５０２−８５０５（１９８８）；並びにトーマス、ディー．ティ．（Ｔｏｍｅｓ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２６１−２６８（１９９０）に記述されているように、金属粒子はコーンの細胞の形質転換及び稔性のある安定なタバコの形質転換植物体の作成に用いられ成功している。組織外植片の形質転換はプロトプラストの段階を経る必要がないため、トランスジニック植物の生産を早める。 トウ等（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．），Ｍｅ ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１：４３３（１９８３）；Ｄ．Ｈｅｓｓ，Ｉｎｔｅｒｎ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１０７：３６７（１９８７）；ロー等（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，６：１６５（１９８８）により記述されているように、花粉への直接ＤＮＡトランスファーによってもＤＮＡは植物体に導入され得る。ペナ等（Ｐｅｎａ ｅｔ ａｌ．，）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：２７４（１９８７）により記述されているように、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、ＤＮＡを植物体の再生産組織に注入することによっても得られる。ノウハウス等（Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．），Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７５：３０（１９８７）；及びベンブロック等（Ｂｅｎｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃｅｏｄｉｎｇｓ Ｂｉｏ Ｅｘｐｏ １９８６，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ，ｐｐ．２７−５４（１９８６）で述べられているように、ＤＮＡは未成熟胚の細胞に直接注入し、乾燥した胚に再び水を与えることもできる。
【００７０】
１個のプロトプラスト又は多様な外植片からの植物体の再生産はいずれもこれまでの研究で良く解明されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，エイ．バイスバッハ，エイチ．バイスバッハ編（Ａ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｈ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ａｓｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８８）を参照せよ。この再生及び成長の過程は、形質転換細胞及びシュートの選択、形質転換シュートの発根、並びに小植物体の土壌での成長を含む。
【００７１】
アグロバクテリウムにより導入された外来遺伝子を含む植物体の、葉の外植片からの再生は、ホーシュ等（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９−１２３１（１９８５）に記述されているように行われ得る。この方法では、ファレイ（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３（１９８３）に記述されているように形質転換された植物種に於て、形質転換体は選択試薬存在下でシュートの再生を促す培地中で育てられる。
【００７２】
この方法では通常、２から４か月以内にシュートを生じ、次にこの形質転換体のシュートは発根を促進するのに適し、選択試薬とバクテリアの成長を防止する抗生物質を含む培地に移される。選択試薬存在下で発根したシュートは小植物体を形成し、それは土壌又は根を形成できる他の媒体に移植される。これらの方法は用いる特定の植物種によって異なり、そのようなバリエーションはこれまでの研究でよく解明されている。
【００７３】
成熟した再生植物体は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチド遺伝子の発現により、ステロールの蓄積量の増加を示すものとして得られる。再生植物体は自家受粉するのが望ましい。そうでなければ、再生植物体から得られた花粉を、作物学的に重要なできれば近交系の種子から育った植物と交配させる。逆に、それらの重要な系の植物から得た花粉を用いて再生植物に授粉する。後代での導入された遺伝子の存在は、以下に議論されているように評価された。
【００７４】
所望のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドを含む本発明の植物は、当業者に良く知られた技術を用いて栽培された。本発明のどのトランスジニック植物も栽培し、そこに含まれ、目的とされるステロール産物を分離し得る。
【００７５】
このように本発明の形質転換植物体は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子のコピー数が増加している。所望する形質転換植物体は導入したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素構造遺伝子についてヘテロ接合体、より望ましくは、形質転換植物体がその遺伝子についてホモ接合体で、有性的接合によりその遺伝子をそのすべての子孫に伝える植物体である。
【００７６】
以下で議論されるように、本発明の形質転換植物体は、在来の植物体に比べステロールを蓄積する。以下で議論されるように、ある形質転換植物体はイモムシのような害虫に対する耐性を示した。
【００７７】
Ｄ．商業用（雑種）種子の開発
形質転換植物体からの種子を農地又は温室で栽培し、自家授粉して真に繁殖する植物体を生ずる。これらの植物体から生じた子孫は真の繁殖系となり、農地に於て即ち一連の環境条件の下でステロールの蓄積が認められるのが望ましい。
【００７８】
多数の異なる雑種の組み合わせが販売できれば、ステロール蓄積量が増加した植物の商業的価値は上昇する。成熟時期、スタンダビリティー、或いは他の作物学的特性に基づき、通常、利用者は１種より多くの種類のハイブリッドを栽培する。加えて、成熟期、耐病性及び除草剤への耐性などの特性の違いから、ある国家の一部に適応した雑種が他の地域でも適応するとは限らない。このため、ステロールの蓄積が多くの親系に導入され、多数の雑種の組み合わせが作成でき得るのが望ましい。
【００７９】
作物学的に選良な系へのステロールの蓄積が促進される特性の付加は、当業者に良く知られている技術により行われる。例えば、ステロール蓄積の促進に関してホモ接合型又はヘテロ接合型の親植物と、除草剤耐性（米国特許Ｎｏ．４，７６１，３７３）のような他の望ましい特性を有する系を交配し、雑種を作成する。雑種を作成するには、ステロール蓄積の促進に関してホモ接合型の植物体が望ましい。
【００８０】
例えば、ステロール蓄積の促進に関してホモ接合型の植物体が他の好ましい特性を有する親植物と交配される。ステロール蓄積の促進に関してヘテロ接合型のその後代は、ステロール蓄積の促進と他の好ましい特性を得るよう、親と戻し交配される。望んだすべての特性を持つ植物体を得るには、子孫と親との戻し交配を一度以上繰り返さねばならない。
【００８１】
別の方法として、ステロール蓄積が促進する特性を有する植物体を、他の好ましい特性をコードし発現する他の遺伝子の導入により形質転換するか、或いはその開示が参照文献として編入される米国特許Ｎｏ．４，６１６，０９９号のように、例えばＸ線又はガンマ線の放射線照射により突然変異を生じさせる。このように、本発明は多いステロール蓄積量を有する植物体の突然変異体並びに遺伝学的に操作した誘導体も企図する。
【００８２】
Ｅ．形質転換植物体のステロールの蓄積
本発明は、植物体内にステロール、特にシクロアルテノールの蓄積を増加させる方法を提供する。これはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させ、そのコードされているポリペプチドの発現により達成される。
【００８３】
普通、非形質転換植物体のステロール蓄積量は植物体の乾燥重量の約０．３パーセントである。このような普通の植物体に蓄積される主なステロールは、カンペステロール、シトステロール、スチグマステロール及びコレステロールの誘導体である。シクロアルテノールの５（６）炭素−炭素の不飽和化を受けた、シクロアルテノールのΔ５誘導体であるこれらのステロールは、普通の植物中にある全ステロール重量の８０パーセント以上を占める。シクロアルテノールは普通、植物体に存在する全ステロール量の約３パーセントから約３０パーセントを占める。
【００８４】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させた植物体では、全ステロール蓄積量の著しい増加が示される。さらに、このような植物体に見られる主なステロールはシクロアルテノールであり、形質転換植物体の全ステロール重量の約６０から約７０パーセントに達する。このように、本発明は従来の植物に比べ大量のステロールを蓄積する植物を提供する、ヘテロ接合型の形質転換植物体は、在来の非形質転換植物体に比べ、全ステロール量にして約２倍蓄積される。特に、ヘテロ接合型の形質転換植物体は、在来の植物体より約１０から約１００倍多い量のシクロアルテノールを蓄積する。
【００８５】
これらの結果は他の生物でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性とステロール蓄積に関する研究から考えると、驚くべき、予知できないことである。
【００８６】
酵母では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の上昇は、スクアレン（ステロール前駆体）、４，１４−ジメチルチモステロール及び１４−メチルフェコステロール（植物のΔ５ステロールに相当）の増加と関係している。ダウニング，ジェイ．エフ．等（Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９４（３）：９７４−９７９（１９８０）。酵母のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の上昇は、ラノステロール（シクロアルテノールに相当する酵母のステロール）の増加とは関係がない。ベンベニステ，ピー．，（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ，Ｐ．），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：２７５−３０８（１９８６）。
【００８７】
非光合成微生物中でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の上昇はステロール蓄積とは関係していない。トダ，エム．およびシロイシ，エム（Ｔａｄａ，Ｍ．ａｎｄＳｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｍ．）Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２３（４）：６１５−６２１（１９８２）。
【００８８】
Ｆ．ステロールの回収
所望により栽培後、トランスジニック植物を収穫し、ステロール産物を回収することが可能である。この収穫段階は、植物体全体、或いは植物体の葉又は根のみの収穫から成る。この段階は植物体を全く殺すことも可能であるし、もしトランスジニック植物体の成育に必須ではない部分のみを収穫すれば、植物体の残りは成長を継続できる。
【００８９】
この収穫段階以後の望ましい具体例としては、次のような段階を含む：
（ｉ）トランスジニック植物の少なくともステロールを含む部分をホモジナイズして植物パルプを作り、ステロールを含むパルプをそのまま、或いは乾燥ペレット又はタブレットとし、動物用飼料として企図される；又は
（ｉｉ）有機溶媒のような適当な溶媒で、或いは臨界超過抽出法［ファバティー等（Ｆａｖａｔｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．５３：１５３２（１９８８）及び本文での引用］を用いてステロールを抽出し、ステロールを含む溶液又は懸濁液を作成する；そして
（ｉｉｉ）その溶液又は懸濁液からステロールを分離する。
【００９０】
少なくともトランスジニック植物の一部は当業者に良く知られている技術を用いてホモジナイズされ、植物パルプを形成する。このホモジナイズは植物体の部分に応じて手で、又は機械的に、或いは化学的方法で行われ、小片とし、パルプが作られる。この植物パルプは目的のステロール混合物、わずかな量の前駆体、細胞断片及び細胞質内容物から成る。このパルプは乾燥、加圧してペレット又はタブレットとして可食であり、又はその利点を生かすように用い、或いはパルプは抽出操作を行うことも可能である。
【００９１】
上述のように作成した植物パルプからステロールを抽出し、ステロールを含む溶液又は懸濁液を作成することが可能である。このような過程はこの研究で技術として当業者に良く知られている。例えば、抽出過程は植物パルプで適当な溶媒に浸すことより成り得る。この適当な溶媒は植物パルプ中に存在するステロールを溶解又は懸濁する能力を有する。このような抽出操作に有効な溶媒はこれまでの研究で技術的に良く知られ、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ヘキサン、及びクロロホルムのような有機溶媒とそれらの組み合わせと、水と有機溶媒の混合などを含む。ピーナッツ、コーン、大豆などの植物油やこれらと同様のものも、この抽出に用いることができる。
【００９２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子でトランスフェクトされた植物は、適当な条件下でステロールが合成されるのに十分な期間、栽培される。ステロールを含む植物細胞は、望ましくは乾燥された状態で機械的に又は化学的に溶解され、前述のように溶解した細胞から液体の有機溶媒を用いてステロールを抽出され、ステロールを含む溶液又は懸濁液が形成される。ステロールは、溶液又は懸濁液からクロマトグラフィーのような通常の方法を用いて分離される。
【００９３】
ステロールの抽出について、これまで当業者によく知られた方法を用いて、上述の溶液又は懸濁液からステロールが分離された。これらの方法は、多様な液体媒体への溶解性に基づく分離、カラムクロマトグラフィーなどクロマトグラフの技術を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
Ｇ．形質転換植物体の害虫耐性
本発明の形質転換植物体に蓄積されるあるステロールは、浸透性の殺虫剤としての使用法を有する。本発明のこの具体化は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域とそのレダクターゼの発現を制御する適当なプロモーターをコードする外来ＤＮＡ断片が操作上連結したベクターから成る組換えＤＮＡ分子で、在来の植物を形質転換することを含む、植物の害虫に対する耐性を上昇させる方法に関する。望ましい態様では、外来ＤＮＡ断片はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のリンカー領域の少なくとも一部はコードし、膜結合領域はコードしない。ハムスターの遺伝子の利用が特に望ましい。
【００９５】
切断したハムスターのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子で転換したシクロアルテノールの量が増加している植物の葉で成長したタバコのイモムシの幼虫は、成長の遅延が認められた。予備的な研究では、同様な条件下で同様な形質転換植物体の葉を餌として成長したオオタバコガの幼虫は成長が遅延した。
【００９６】
以下の実施例では発明を実行する最高の方法で、例を挙げて説明するものであり、決して明細書並びに請求の範囲の制限を意味するものではない。
【００９７】
【実施例】
【００９８】
【実施例１】
植物細胞の形質転換
植物細胞は植物内で外来遺伝子を発現する標準的な方法に従って形質転換した。シャーデル，シー．エル．等（Ｓｃｈａｒｄｌ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ６１：１−１１（１９８７）。発現系としてｐＫＹＬＸシリーズのベクターを用いた。好ましいプラスミドはｐＫＹＬＸ６及びｐＫＹＬＸ７である。ベーガー．ピー．ジェイ．，等（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８４０２−８４０６（１９８９）。ジェイ．エル．ゴールドスティン（Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）博士の研究室より入手した。切断したハムスターのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＨＭＧＲ−Δ２２７）で形質転換を行った。例えば、ギル，ジー等（Ｇｉｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．），Ｃｅｌｌ，４１：２４９−２５８（１９８５）；バード，エム．およびダウニング，ジェイ．エフ．（Ｂａｒｄ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２５：４１５−４２０（１９８１）を参照せよ。
【００９９】
ＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子は修飾を施したベクターｐＫＹＬＸ６（中間構築体として設計された大腸菌のベクター）及びｐＫＹＬＸ７（クローニングした遺伝子の挿入のために設計されたＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのベクター）に組み込まれた。ベーガー．ピー．ジェイ．，等（Ｂｅｒｇｅｒ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８４０２−８４０６（１９８９）。修飾したベクター、ｐＫＹＬＸ６１及びｐＫＹＬＸ７１は元のＨｉｎｄＩＩＩ ＳｓｔＩ断片の代わりにＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｈｏＩ，ＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩ，及びＳｓｔＩ断片マルチプルクローニングサイト領域に有する。
【０１００】
ＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子をＢａｍＨＩとＳｓｔＩで切断し、約２５００ｂｐのＨＭＧＲ−Δ２２７−ＢａｍＨＩ，−ＳｓｔＩ断片をプラスミドｐＫＹＬＸ６１に挿入した。生じたＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ６１のコンストラクトをＥｃｏＲＩとＣｌａＩで切断し、プロモーター−遺伝子−ターミネーターを含む約４０００ｂｐの断片をｐＫＹＬＸ７１の対応するサイトに挿入し、プラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１を作成した（図６参照）プラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１中で、切断されたＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子は、強力で構成的なＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下にある。
ＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１コンストラクトを持つ大腸菌、アームを除去したＴｉプラスミドＧＶ３８５０を持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）、及び接合ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌間の標準的な３親接合により、ＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１プラスミドをアグロバクテリウムに移動させた。例えば、シャーデル等（Ｓｃｈａｒｄｌ，ｅｔ ａｌ．），Ｓｕｐｒａ；Ｄｉｔｔａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：７３４７−７３５１：（１９８０）を参照せよ。交雑な結果として、ＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１コンストラクトを持つアグロバクテリウムを、リファンピシン耐性（アグロバクテリウムの染色体上にコードされている）並びにテトラサイクリン及びカナマイシン耐性（ｐＫＹＬＸ７１ベクターにコードされている）により選択した。
【０１０１】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｂａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ．ｘａｎｔｈｉｉ （Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ））を良く知られている“葉盤法”で形質転換した。ホーシュ，アール．ビー．等（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１２２９−１２３１（１９８５）。葉盤をΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１を持ったアグロバクテリアと共に約３日間インキュベートした。形質転換された組織をカナマイシン耐性（ｐＫＹＬＸ７１ベクターにコードされている）によって選択し、抗生物質のメホキシンを用いてアグロバクテリアを治療し、植物体全体を再生した。ホーシュ，アール．ビー等（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１２２９−１２３１（１９８５）。
【０１０２】
メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ，）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５：３４６−３４９（１９８７）の方法により、植物組織に挿入されたＨＭＧＲΔ２２７遺伝子塩基配列のコピーが存在することを確認した。ＲＮＡの転写レベルは、ノザンブロッティング又はＳ−１プロテクションアッセイにより決定した。マニアチス，ティー等（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂａｒｏｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）。
【０１０３】
対照植物体［非形質転換体（天然の）又はＨＭＧＲ−Δ２２７コンストラクトを持たない形質転換体］に比べＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を示す植物体を自家で有性交配させ、子孫を生じた。
【０１０４】
【実施例２】
トランスジニック植物のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性
トランスジニック植物は、溶解した細胞の１００，０００ｘＧ上澄にあるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を標準的なアッセイ（Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄＮａｂｌｅ，Ｒ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：４６９−４７３（１９８７））で調べることにより、切断されたＨＭＧＲ遺伝子の発現をスクリーニングした。
【０１０５】
可溶性のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、選択（カナマイシン）培地上で成育したカルス培養、カナマイシン存在下又は湿らせた濾紙の上で発芽した幼植物、及び温室で培養した植物体から得た様々な大きさの葉について測定された。温室で栽培した植物体から得た葉のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の研究結果も、下の表１にまとめられている。
【０１０６】
【０１０７】
対照の植物体と比較して、Δ２２７遺伝子を持つ植物体では全ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は１．６から３．９倍高かった。
【０１０８】
【実施例３】
形質転換植物体のステロールの蓄積
実施例１の方法に従ってＨＭＧＲ−Δ２２７で形質転換されたタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の全ステロール含量を測定した。ステロールは内部標準を用いる分析用ガスクロマトグラフィーで測定した。結果は表２に示されている。
【０１０９】
【０１１０】
全ステロール含量の決定に加え、形質転換タバコの個々のステロールの蓄積も測定した。コントロール（Ｃｎｔｒｌ）及びＨＭＧＲ−Δ２２７形質転換（Ｔｒｆ）植物体のこの分析結果は表３に示されている。
【０１１１】
対照植物では、シクロアルテノールは全ステロール蓄積量の約３（０．０１１／０．２８３乾燥重量パーセント）（葉）から約３０（０．０３９／０．１２６乾燥重量パーセント）（根）パーセントを示した。対照植物で蓄積される主なステロール（即ちシトステロール、カンペステロール）は、シクロアルテノールのΔ５−ステロール誘導体であり、さらに代謝による変換を受けている。
【０１１３】
ＨＭＧＲ−Δ２２７遺伝子による形質転換の結果、シクロアルテノールとその誘導体との比が逆転する。形質転換植物では、全ステロール蓄積重量のうち、シクロアルテノール蓄積量は約６０（根）から約７０（葉）パーセントを示した。それらのデータは、本発明の形質転換植物は天然の、非形質転換植物に比べより多くのステロールを蓄積していることを示す。形質転換されたヘテロ接合型の植物体は天然の植物体に対し、全ステロール量で約２倍の蓄積がみられる。データはさらに、形質転換されたヘテロ接合型植物体は、天然の植物体に対し約１０から約１００倍以上多くのシクロアルテノールを蓄積することを示す。
【０１１４】
【実施例４】
形質転換植物の殺虫効果
タバコの害虫であるＴｏｂａｃｃｏ Ｈｏｒｎｗｏｒｍ 又はＭａｎｄｕｃａＳｅｘｔａ の初齢幼虫をペトリ皿中の湿らせた濾紙上の対照及びＨＭＧＲ−Δ２２７で形質転換したタバコの葉の上に置いた。対照又は形質転換した植物体から得た葉をさらに与え、幼虫をさらに７日間飼育した。そこで幼虫の成長及び発生を検討した。結果を表４に示されている。
【０１１５】
【０１１６】
ｈｅｌｉｏ−のメンバーだある害虫のグループに属するオオタバコガの幼虫での予備的な研究は、形質転換植物体１４（実施例２）の葉で飼育された幼虫は、在来の対照植物体３０（実施例２）の葉のものより遅い成長速度を示した。それぞれの葉で飼育された昆虫の繁殖能力に対する影響も注目された。
【０１１７】
【実施例５】
ホモ接合型の形質転換植物
前述した形質転換植物体は、導入したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子についてヘテロ接合型であった。これらの植物体のひとつ、実施例２の植物１４を自家受精した。即ち、それ自身と有性的接合を行った。
【０１１８】
その交配から２０個の種子が芽生え、植物体に成長した。これら兄弟の組織をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、全タンパク質量及び全ステロール含量について検討した。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の比活性も算定した。このアッセイの結果は、植物体３０（実施例２）の自家受精で生じた兄弟からのデータと比較し、下の表５に示した。
【０１１９】
上述のデータに基づき、植物体を、（ａ）導入したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を全く持たない（ｂ）植物体１４のように導入した遺伝子についてヘテロ接合型、又は（ｃ）導入した遺伝子についてホモ接合型、に分類した。実例で示すと、植物体１４−２は導入遺伝子についてヘテロ接合型、植物体１４−６は導入遺伝子についてヘテロ接合型、そして植物体１４−８は導入遺伝子についてホモ接合型、即ち２本の染色体の双方に導入遺伝子をもつ、と判断された。
【０１２１】
これらのデータは、形質転換された植物体から得た種子は芽生えて植物体に成長し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数の増加によりステロール蓄積量の増加を示す能力があることを示す。
【０１２２】
実施例３のデータと合わせて、これらのデータは、本発明の形質転換植物は在来の植物に比べステロールをより多く蓄積し、このような植物は種子の形成が可能であり、種子はステロールを多く蓄積する植物体を芽生えさせることを示している。
【０１２３】
植物体１４−８の自家受精から生じた種子はブタペスト条約に従い、１９９０年９月２８日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２ Ｕ．Ｓ．Ａ）に保存され、寄託番号ＡＴＣＣ４０９０４である。
【０１２４】
本発明を望ましい具体例として記述した。開示された対象の修飾並びに／又は変形が、本文のこれ以後にある本発明の範囲から離れることなく行われることが当業者には明らかとなるであろう。
【０１２５】
表の説明
表６−１６は（ハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの合成核酸配列（配列番号１）及びそのタンパク質の予想アミノ酸配列（配列番号２）であり、チン，ディー．ジェイ．等（Ｃｈｉｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３０８：６１３−６１７（１９８４）により発表されたものと同じである。
【０１２６】
核酸は５’から３’の方向に（右側に）番号がつけてある。予想アミノ酸配列は、核酸配列の下に示されている。アミノ酸配列は、開始メチオニンからはじめて５アミノ酸ごとに下に番号がつけてある。
【０１２７】
表１７−２６はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１の核酸塩基配列（配列番号３）及び誘導アミノ酸塩基配列（配列番号４）であり、バソン，エム．イー等（Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８（９）：３７９７−３８０８（１９８８）により発表されたものである。核酸は、表６−１６について述べられたように表示及び番号付けされており、誘導アミノ酸残基についても同様である。
【０１３９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：４７６８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列表（配列番号１）
【０１５０】
【配列表】
配列番号：２
配列の長さ：８８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列表（配列番号２）
【０１５９】
【配列表】
配列番号：３
配列の長さ：３３６０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列の特徴
配列を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１２１．．．３２８２
配列表（配列番号３）
【０１６４】
【配列表】
配列番号：４
配列の長さ：１０５４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列表（配列番号４）
【０１７３】
【配列表】
配列番号：５
配列の長さ：３３４８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列の特徴
配列を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１２１．．．３２５５
配列表（配列番号５）
【０１７９】
【配列表】
配列番号：６
配列の長さ：１０４５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列表（配列番号６）
【０１８８】
【図面の簡単な説明】
本開示の一部を占めている図面は以下のものを含む：
【図１】図１は、アセチルコエンザイムＡからステロイドや他のイソプレノイドに至る植物中での代謝経路の模式図であり、ミッソーリ大学のデー．デー．ランダル等（Ｄ．Ｄ．Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．）編 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４巻，（１９８５）にメセル，デー．ダブリュー．等（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ）により発表されたものと同様である。
【図２】図２はハムスターＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする、切断型のハムスター遺伝子を、このハムスターの酵素が欠乏している細胞に挿入するために用いられるプラスミド（ｐＲｅｄ−２２７Δ）の構造を示す模式図である。アミノ酸１０から３４１をコードする還元酵素コード配列（核酸２８から１０２３）の塩基対は、削除されていて、プラスミドの外部に示されている。斜線の領域はプラスミドの還元酵素ｃＤＮＡ配列部分を示している。還元酵素ｃＤＮＡの開始メチオニンコドン（核酸１）及び終止コドン（核酸２６６２）が、プラスミドの他の特徴と同様に表示されている。
【図３】図３は、本発明の植物を形質転換するために用いられるプラスミドＨＭＧＲΔ２２７−ｐＫＹＬＸ７１の制限酵素地図の図式である。
Claims (3)
- 双子葉植物におけるステロールの蓄積を増加する方法であって、
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域を含み且つＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子を導入することによって双子葉植物を形質転換し、前記構造遺伝子のコピー数を増加することを含んでなる方法。 - 双子葉植物の害虫抵抗性を増加する方法であって、
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子を導入することによって双子葉植物を形質転換し、前記構造遺伝子のコピー数を増加することを含んでなる方法。 - ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域を含み且つＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする構造遺伝子が導入されることによって形質転換されて、前記構造遺伝子のコピー数が増加させられた形質転換双子葉植物。
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