JP3523650B2 - 新規蛋白質及びその製造方法 - Google Patents

新規蛋白質及びその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenes
is inhibitory factor;以下、OCIFということがある）
に結合する新規な蛋白質（OCIF結合分子；以下OBMとい
うことがある）、及びその製造方法に関する。
また本発明は、該蛋白質をコードするDNA、このDNAに
よりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白
質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有
する医薬組成物に関する。
さらに本発明は、該蛋白質びそのDNAを用いた、該蛋
白質の発現を調節する物質、該蛋白質の生物活性を阻害
又は修飾する物質、あるいは該蛋白質と結合しその作用
を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これによ
り得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬組成
物に関する。
またさらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、その製
造方法、それを用いた該蛋白質の測定方法、及び抗体を
含有する医薬に関する。
背景技術 骨代謝は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当
する破骨細胞の、総合された活性に依存している。骨代
謝異常は、骨形成と骨吸収の均衡が崩れることにより発
生すると考えられている。骨代謝の異常を伴う疾患とし
ては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ページェット
病、腎性骨異栄養症、慢性関節リューマチ、及び変形性
関節炎などが知られている。これらの骨代謝異常疾患の
代表として骨粗鬆症が挙げられる。この疾患は、破骨細
胞による骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上まわること
により発生する疾患であり、骨の石灰質と骨基質とが等
しく減少することを特徴とする。この疾患の発生メカニ
ズムについては未だ完全には解明されていないが、骨の
疼痛が発生し、骨の脆弱化による骨折が起こる疾患であ
る。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり老人の
原因となり、この疾患は社会問題にもなっており、その
治療薬の開発が急務となっている。このような骨代謝異
常による骨量減少症は、骨形成の促進、骨吸収の抑制、
あるいはこれらのバランスの改善により治療できること
が期待される。即ち、骨形成は、骨形成を担当する骨芽
細胞の増殖、分化、機能を促進すること、破骨細胞前駆
細胞からの破骨細胞への分化、成熟を抑制すること、あ
るいは破骨細胞の骨吸収活性などの機能を抑制すること
により促進されると期待される。このような活性を有す
るホルモン、低分子物質、あるいは生理活性蛋白質につ
いて、現在精力的な探索及び開発研究が進められてい
る。
すでに、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を
図る医薬品として、カルシトニン製剤、活性型ビタミン
D3製剤、エストラジオールを含有するホルモン製剤、イ
プリフラボン、ビタミンK2、ビスフォスフォネート系化
合物などがあり、さらに、より副作用が少なく、有効性
に優れた治療薬の開発を目指して活性型ビタミンD3誘導
体、エストラジオール誘導体、第２世代または第３世代
のビスフォスフォネート系化合物などの臨床試験が実施
されている。
しかし、これらの薬剤を用いた治療法は、その効果並
びに治療結果において必ずしも満足出来るものではな
く、より安全かつ有効性の高い新しい治療薬の開発が期
待されている。また、骨代謝疾患の治療に使用されてい
る薬剤の中には、その副作用により治療可能な疾患が限
定されているものもある。更に現在、骨粗鬆症などの骨
代謝疾患の治療には、複数の薬剤を同時に使用する多剤
併用療法が主流になってきている。このような観点か
ら、従来の医薬品とは異なった作用メカニズムを持ち、
しかもより有効性が高くかつ副作用の少ない医薬品の開
発が期待されている。
前述したように、骨代謝を担当する細胞は骨芽細胞と
破骨細胞である。これらの細胞は互いに密接に相互作用
していることが知られており、この現象はカップリング
と呼ばれている。即ち、破骨細胞の分化、成熟には骨芽
細胞様ストローマ細胞が分泌するサイトカイン類、イン
ターロイキン１（IL−１）、３（IL−３）、６（IL−
６）、11（IL−11）、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子（GM−CSF）、マクロファージコロニー刺激因子
（Ｍ−CSF）、インターフェロンガンマー（IFN−γ）、
腫瘍壊死因子α（TNF−α）、トランスフォーミング増
殖因子β（TGF−β）などが促進的又は抑制的に作用す
ることが報告されている（Raisz:Disorders of Bone an
d Mineral Metabolism,287−311,1992;Suda et al.:Pri
nceples of Bone Biology,87−102,1996;Suda et al.:E
ndocrine Reviews,4,266−270,1955,Lacey et al.:Endo
crinology,186,2369−2376,1995）。骨芽細胞様ストロ
ーマ細胞は、未熟な破骨細胞前駆細胞や破骨細胞との細
胞間接着により、それぞれ破骨細胞の分化、成熟や成熟
破骨細胞による骨吸収などの機能発現に重要な役割を演
じていることが知られている。この細胞間接着による破
骨細胞形成に関与する因子として、骨芽細胞様ストロー
マ細胞の膜上に発現される破骨細胞分化誘導因子（oste
oclast differentiation factor,ODF）（Suda et al.:E
ndocrine Rev.13,66−80,1992;Suda et al.:Bone 17,87
S−91S,1995）という分子が仮想されており、この仮説
によれば破骨細胞の前駆細胞にODFのレセプターが存在
している。しかし、ODF及びこのレセプターとも未だ精
製及び同定されておらず、それらの性質、作用機作、及
び構造に関する報告もない。このように、破骨細胞の分
化、成熟のメカニズムは未だ十分に解明されておらず、
このメカニズムの解明は基礎医学領域に多大な貢献をす
るだけでなく、新しい作用メカニズムに基づく新規な骨
代謝異常症治療薬の開発にも貢献することが期待され
る。
本発明者らは、このような状況に鑑み鋭意探索を進め
た結果、ヒト胎児肺線維芽細胞、IMR−90（ATCC CCL18
6）の培養液中に破骨細胞形成抑制因子（osteoclastoge
nesis inhibitory factor,OCIF）を見出した（WO96/262
17号）。
さらに、本発明者らは、OCIFのDNAクローニング、動
物細胞を用いた遺伝子組み換え型OCIFの生産、遺伝子組
み換え型OCIFによるin vivo薬効（骨代謝改善効果）の
確認などに成功した。OCIFは、従来の医薬品よりも有効
性が高くかつ副作用が少ない、骨代謝異常に関連する疾
患の予防及び治療剤として期待されている。
発明の開示 本発明者らは破骨細胞形成抑制因子OCIFを用い、その
結果蛋白質の存在を鋭意探索した結果、OCIF結合蛋白質
が活性型ビタミンD3や副甲状腺ホルモン（parathyroid
hormone,PTH）などの骨吸収促進因子の存在下で培養し
た骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に発現すること
を見出した。さらに、このOCIF結合蛋白質の性質及びそ
の生理的機能を調べたところ、該蛋白質は未熟な破骨細
胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟に関与する、
いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因子と
しての生物活性を有していることを見出し、本発明を成
すに至った。さらに、本発明蛋白質につき研究を重ねた
結果、この新規な膜蛋白質は骨芽細胞様ストローマ細胞
と脾臓細胞との共培養系において、骨芽細胞様ストロー
マ細胞による未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞へ
の分化、成熟を担う重要な蛋白質であることを明らかに
した。本発明における破骨細胞の分化、成熟を支持又は
促進する因子としての蛋白質の同定及びその単離精製の
成功により、本発明蛋白質を利用した、生体の骨代謝機
構に基づいた新規な骨代謝異常症治療薬のスクリーニン
グを可能にした。
従って本発明は、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合す
る新規な蛋白質（OCIF結合分子;OBM）、及びその製造方
法を提供することを課題とする。また本発明は、該蛋白
質をコードするDNA、このDNAによりコードされるアミノ
酸配列を有する蛋白質、該蛋白質を遺伝子工学的に製造
する方法、及び該蛋白質を含有する医薬組成物を提供す
ることを課題とする。また、該蛋白質を含有する骨代謝
異常症予防及び／又は治療剤を提供することを課題とす
る。さらに本発明は、該蛋白質を及びそのDNAを用い
た、該蛋白質の発現を調節する物質、該蛋白質の生物活
性を阻害又は修飾する物質、あるいは該蛋白質と結合し
その作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、
これにより得られた物質、及び得られた物質を含有する
医薬組成物を提供することを課題とする。またさらに本
発明は、該蛋白質に対する抗体、その製造方法、それを
用いた該蛋白質の測定方法、及び抗体を含有する医薬を
提供することを課題とする。
本発明蛋白質は、以下の物理化学的性質及び生物活性
を示す。
即ち、 a.親和性：破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis
inhibitory factor;OCIF）に特異的に結合し、高い親
和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9M以下）を有
する。
b.分子量：非還元条件下におけるSDS−ポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約30,000−40,000の
分子量を示し、又、モノマータイプのOCIFとクロスリン
クさせた場合の見かけ上の分子量は、約90,000−110,00
0を示す。
c.生物活性：活性型ビタミンD3及び副甲状腺ホルモン
（PTH）などの、骨吸収促進因子の存在下でのマウス骨
芽細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養におい
て、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有
する。
破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活
性型ビタミンD3あるいはPTH存在下でのマウス由来骨芽
細胞様ストローマ細胞株、ST2とマウス脾臓細胞との共
培養系がよく知られている。本発明蛋白質の発現細胞は
活性型ビタミンD3存在あるいは非存在下でそれぞれ培養
したマウス骨芽細胞様ストローマ細胞あるいはマウス脾
臓細胞へのOCIFの結合性を試験することにより調べるこ
とができる。本発明蛋白質は、活性型ビタミンD3やPTH
のような骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様
ストローマ細胞上に特異的に誘導される蛋白質として特
定される。又、活性型ビタミンD3存在下の上記共培養系
にOCIFを添加することにより１から40ng/mlの範囲で用
量依存的に破骨細胞の形成が阻害されること、活性型ビ
タミンD3存在下でST2細胞上に誘導される本発明蛋白質
の発現の経時変化と破骨細胞形成の経時変化とがよく相
関すること、又、ST2細胞に発現される本発明蛋白質の
多寡とST2細胞による破骨細胞形成支持能の強弱が一致
し、ST2細胞上の本発明蛋白質にOCIFが結合することに
より破骨細胞形成が完全に抑制されることから、本発明
蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する生物
活性（作用）を有する蛋白質として特定される。
本発明蛋白質のOCIFに対する親和性は、OCIFを標識
し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験する
ことによって評価することができる。OCIFは、放射性同
位元素による標識や蛍光標識などのような通常の蛋白質
標識法を用いることによって標識することができる。例
えば、OCIFの放射性同位元素による標識としてはチロシ
ン残基の125I標識が挙げられ、ヨードジェン法、クロラ
ミンＴ法、及び酵素法などの標識法を利用することがで
きる。このようにして得た標識OCIFを用いた、OCIFの動
物細胞膜表面への結合性試験は常法に従い実施でき、
又、結合性試験に用いる培地に標識OCIFの100倍から400
倍濃度未標識OCIFを添加することにより、非特異的な結
合量を測定することができる。OCIFの特異的結合量は、
標識OCIFの総結合量から非特異的な結合量を差し引くこ
とにより算出される。細胞膜上に発現された本発明蛋白
質の親和性は標識OCIFの添加量を変えて試験を行い、特
異的結合量をScatchard plotで解析することによって評
価される。このようにして求められた、本発明蛋白質の
OCIFに対する親和力は約100−500pMであり、本発明蛋白
質はこのように破骨細胞形成抑制因子OCIFに高い親和性
（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9M以下）を有する
蛋白質として特定される。OBMの分子量は、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーやSDS−PAGE等を用いて測定される。
より正確に分子量を測定するためには、SDS−PAGEを用
いるのが好ましく、OBMは、還元条件下で約40,000（40,
000±4,000）の分子量を有する蛋白質として特定され
る。
本発明蛋白質は、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株
ST2、マウス前脂肪細胞株PA6、その他のヒト骨芽細胞様
細胞株、あるいはヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物
から採取し濃縮した骨芽細胞様細胞などから得ることが
できる。又、これらの細胞に本発明蛋白質を発現させる
ために必要な誘導物質としては、活性型ビタミンD3（Ca
lcitriol）、副甲状腺ホルモン（PTH）、インターロイ
キン（IL）−１、IL−６、IL−11、オンコスタチンＭ及
び白血病細胞増殖抑制因子LIF）などの骨吸収促進因子
が挙げられる。又、これらの誘導物質の添加濃度として
は、活性型ビタミンD3やPTHでは、10-8M、IL−11やオン
コスタチンＭではそれぞれ10ng/ml及び1ng/ml、IL−６
では20ng/mlのIL−６と500ng/mlのIL−６可溶性レセプ
ターを用いるのが望ましい。好ましくは、マウス骨芽細
胞様ストローマ細胞株ST2を用い、10-8M活性型ビタミン
D3、10-7Mデキサメサゾン、及び10％牛胎児血清を添加
したα−MEM中で一週間以上培養してコンフルエントに
した細胞を用いるとよい。このようにして培養した細胞
はセルスクレイパーなどを用いて剥離させ、回収すると
よい。又、回収した細胞は使用するまでの間−80℃で保
存しておくことができる。
本発明蛋白質は、このようにして回収した細胞の膜画
分から精製すると効率良く精製することができる。膜画
分の調製は、細胞内器官の分画に利用される通常の方法
に従って行うことができる。膜画分の調製に使用する緩
衝液には、好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤を添加す
るとよい。添加するプロテアーゼ阻害剤としては、例え
ばPMSF、APMSF、EDTA、Ｏ−フェナントロリン、ロイペ
プチン、ペプスタチンＡ、アプロチニン、大豆トリプシ
ンインヒビターなどのセリンプロテアーゼ阻害剤、チオ
ールプロテアーゼ阻害剤、及びメタロプロテアーゼ阻害
剤などが挙げられる。細胞の破砕には、Daunceホモジナ
イザー、ポリトロンホモジナイザー、超音波破砕装置な
どを用いることが出来る。破砕した細胞は0.5Mシュクロ
ースを加えた緩衝液に懸濁させ、600×ｇで10分間遠心
分離することにより、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分
として分離することができる。遠心分離で得た上清を15
0,000×ｇで90分間遠心分離することにより、沈殿画分
として膜画分を得ることができる。このようにして得た
膜画分を各種の界面活性剤で処理することにより、細胞
膜に存在する本発明蛋白質を効率良く可溶化し、抽出す
ることができる。可溶化に用いる界面活性剤としては、
細胞膜蛋白質の可溶化に一般的に使用されている各種界
面活性剤、例えばCHAPS（３−［（３−cholamidopropy
l）−dimethylammonio］−１−propanesulfonate）、Tr
iton X−100、Nikkol、ｎ−オクチルグリコシドなどを
用いることができる。好ましくは、0.5％CHAPSを添加し
て４℃で２時間攪拌し、本発明蛋白質を可溶化するのが
良い。このようにして調製したサンプルを、150,000×
ｇで60分間遠心分離し、その上清を可溶化膜画分として
得ることができる。
このようにして得られた可溶化膜画分からの本発明蛋
白質の精製は、OCIFを固定化したカラム、ゲル、樹脂な
どを用いて効率よく精製することができる。固定化に使
用するOCIFとしては、WO96/26217号公報記載の方法に従
って、ヒト胎児肺線維芽細胞株IMR−90の培養液から単
離したもの、あるいは遺伝子工学的手法により得られた
もの（rOCIF）を使用することができる。これらのrOCIF
は、ヒト、ラット、あるいはマウスのcDNAを常法に従っ
て発現ベクターに組み込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalw
a細胞などの動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現さ
せ、精製することによって得ることができる。このよう
にして得られたOCIFは、分子量約60kDa（モノマー型）
と120kDa（ダイマー型）の分子量を示すが、固定化に用
いるOCIFとしては、好ましくはダイマー型OCIFを用い
る。OCIFを固定化するためのゲル、樹脂としてはECHセ
ファロース4B、EAHセファロース4B、チオプロピルセフ
ァロース6B、CNBr−活性化セファロース4B、活性化CHセ
ファロース4B、エポキシ活性化セファロース6B、活性化
チオールセファロース4B（以上、ファルマシア社）、TS
Kgel AF−エポキシトヨパール650、TSKgel AF−アミノ
トヨパール650、TSKgel AF−フォルミルトヨパール65
0、TSKgel AF−カルボキシトヨパール650、TSKgel AF−
トレシルトヨパール650（以上。トーソー社）、アミノ
−セルロファイン、カルボキシ−セルロファイン、FMP
活性化セルロファイン、フォルミル−セルロファイン
（以上、生化学工業社）、アフィゲル10,アフィゲル15,
アフィプレップ10（以上、BioRad社）などを用いること
ができる。又、OCIFを固定化するためのカラムとしては
HiTrap NHS−activatedカラム（ファルマシア社）、TSK
gel Tresyl−5PW（トーソー社）などを用いることがで
きる。HiTrap NHS−activatedカラム（1ml,ファルマシ
ア社）を用いたOCIFの固定化法として、具体的には以下
の方法を挙げることができる。即ち、OCIF 13.0mgを含
む0.2M NaHCO3/0.5M NaCl（pH 8.3）溶液1mlをカラムに
添加し、室温で30分間カップリング反応させる。次い
で、0.5Mエタノールアミン/0.5M NaCl（pH 8.3）と0.1M
酢酸/0.5M NaCl（pH 4.0）を流し、再度0.5Mエタノール
アミン/0.5M NaCl（pH 8.3）に置き換え、室温で１時間
放置し、過剰な活性基を不活性化する。その後、0.5Mエ
タノールアミン/0.5M NaCl（pH 8.3）と0.1M酢酸/0.5M
NaCl（pH 4.0）で２度洗浄し、50mM Tris/1M NaCl/0.1
％CHAPS緩衝液（pH 7.5）で置換することにより、OCIF
固定化カラムを作製することができる。このようにして
作製したOCIF固定化カラムやOCIF固定化ゲルあるいは樹
脂などを用い、本発明蛋白質を効率よく精製することが
できる。本発明蛋白質の分解を抑制するために、精製に
用いる緩衝液にも上記の各種プロテアーゼ阻害剤を添加
するとよい。本発明蛋白質は、上記の可溶化膜画分をOC
IF固定化カラムに負荷する、あるいはOCIF固定化ゲル、
樹脂などと混ぜて攪拌することによって吸着させ、酸、
各種蛋白質変性剤、カコジレートバッファーなどによっ
てOCIF固定化カラム、ゲル、あるいは樹脂などから溶出
することができる。好ましくは、本発明蛋白質の変性を
最小限に抑えるため、酸を用いて溶出し直ちに中和する
とよい。溶出に用いる酸性緩衝液としては、例えば0.1M
グリシン−塩酸緩衝液（pH 3.0）、0.1Mグリシン−塩酸
緩衝液（pH 2.0）、及び0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液
（pH 2.0）などを用いることができる。
このようにして精製した本発明蛋白質は、生物試料か
らの蛋白質の精製に汎用される通常の方法を用いて、本
発明蛋白質の物理化学的性質を利用した各種の精製操作
により更に精製することができる。本発明蛋白質溶液の
濃縮には限外濾過、凍結乾燥及び塩析など、通常、蛋白
質の精製過程で用いられる手法が挙げられる。好ましく
は、Centricon−10（BioRad社）などを用いた遠心によ
る限外濾過を用いるのが良い。又、精製手段としては、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ
ィー、調製用電気泳動などを用いた通常の蛋白質の精製
に利用される各種の手法を組み合わせて用いることがで
きる。より具体的には、Superose 12カラム（ファルマ
シア社）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィーや逆
相クロマトグラフィーを組み合わせて用いることによ
り、本発明蛋白質を純化することが可能である。又、精
製過程中の本発明蛋白質の同定は、固定化OCIFとの結合
活性あるいはOCIFとの結合物を抗OCIF抗体による免疫沈
降後、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS−PAGE）
で分析することにより検出できる。
このようにして得られた本発明蛋白質は、その活性に
より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤として
の医薬、あるいは研究・診断用試薬として有用である。
また本発明は、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する
新規な蛋白質（OCIF結合分子;OBM）をコードするDNA、
そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白
質、それを用いてOCIFに特異的に結合する蛋白質を遺伝
子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代
謝治療剤に関する。さらに本発明は、OBMの発現を調節
する物質のスクリーニング方法、OBMと結合しその作用
を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、OBMと
結合しOBMの作用を伝達するレセプターのスクリーニン
グ方法、これらのスクリーニングの結果得られた物質を
含有する医薬組成物に関する。
本発明のDNAによりコードされる新規蛋白質OBMは、以
下の物理化学的性質及び生物活性を示す。
即ち、 a.破骨細胞形成抑制因子（OCIF）に特異的に結合する。
b.還元条件下におけるSDS−PAGEによる分子量測定で、
約40,000（±4,000）の分子量を示す。又、モノマータ
イプのOCIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子
量は約90,000−110,000である。
c.破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有す
る。
ものである。
本発明のOCIF結合分子、OBMをコードするDNAを同定
し、OBMの性質を評価するためのプローブとして使用す
るヒト破骨細胞形成抑制因子（OCIF）は、WO96/26217号
に従ってヒト胎児性線維芽細胞株IMR−90の培養液から
単離することができる。OBMのDNAの単離、同定には、遺
伝子組換え型ヒトOCIF、遺伝子組換え型マウスOCIF、遺
伝子組換え型ラットOCIF等を用いることもできる。これ
らの遺伝子組換え型OCIFはそれぞれのDNAを常法に従っ
て発現ベクターに組み込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalw
a細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、
精製することによって得ることができる。
目的の蛋白質をコードするcDNAを分離する（cDNAクロ
ーニング）方法としては、その蛋白質の部分アミノ酸配
列を決定しそれに対応する塩基配列をもとにハイブリダ
イゼーション法により目的のcDNAを単離する方法の他
に、蛋白質のアミノ酸配列が不明であっても発現ベクタ
ー中にcDNAライブラリーを構築し、それらを細胞中に導
入し、目的の蛋白質の発現の有無をスクリーニングする
ことにより、目的のcDNAを単離する方法（発現クローニ
ング法）がある（D'Andrea et al.:Cell 57,277−285,1
989;Fukunaga et al.:Cell 61,341−350,1990）。発現
クローニング法では、宿主細胞として細菌、酵母、動物
細胞などが目的に応じて使い分けられている。本発明の
ように動物細胞の膜表面に存在すると考えられる蛋白質
をコードするcDNAをクローニングする際には、動物細胞
を宿主とする場合が多い。又、DNAの導入効率が高く、
導入されたDNAの発現効率の高い宿主が通常使用され
る。そのような特徴を持つ細胞のひとつが、本発明で用
いたサル腎臓細胞COS−７細胞である。COS−７細胞では
SV40 large T antigenが発現しているため、SV40の複製
開始点を持つプラスミドは細胞中で多コピーのエピソー
ムとして存在するようになり、通常より高発現が期待で
きる。又、DNAを導入した時点から数日のうちに最高の
発現レベルに到達するので迅速なスクリーニングに適し
ている。この宿主細胞に高発現可能なプラスミドを組み
合わせることによって、極めて高レベルの遺伝子発現が
可能となる。プラスミド上で最も遺伝子の発現量に影響
を与える因子はプロモーターであり、高発現用のプロモ
ーターとしてSRαプロモーターやサイトメガロウィルス
由来プロモーター等がよく使用される。発現クローニン
グにより膜蛋白質のcDNAをクローニングしようとする際
のスクリーニング法として、バインディング法（bindin
g法）、パニング法（panning法）、フィルムエマルジョ
ン法などが考案されている。
本発明は、発現クローニング法とバインディング法を
組み合わせることによって得たOCIFに特異的に結合する
蛋白質（OBM）をコードするDNA及び発現蛋白質、及びDN
A又は発現蛋白質を用いた生理活性物質のスクリーニン
グに関する。本発明のDNAがコードするOBMは、OCIFを標
識し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験す
ることによって検出することができる。OCIFの標識法と
しては、放射性同位元素による標識や蛍光標識等、一般
的な蛋白質の標識法を用いることができる。例えば、OC
IFの放射性同位元素による標識としてはチロシン残基の
125I標識が挙げられ、具体的標識法としてヨードジェン
法、クロラミンＴ法及び酵素法等がある。OCIFの動物細
胞膜表面への結合性はこのようにして得た標識OCIFを用
い、常法に従った方法で試験できる。又、結合性の試験
に用いる培地に標識OCIFの100倍から400倍濃度の未標識
OCIFを添加することにより、非特異的な結合量を測定で
きる。OCIFの特異的結合量は、標識OCIFの総結合量から
非特異的な結合量を差し引くことにより算出される。
本発明者らは、破骨細胞の分化に関与する因子はOCIF
と相互作用するとの仮定のもと、遺伝子組み換え型OCIF
を用い、OCIFが結合する蛋白質を分離するため、マウス
骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2のmRNAから作製した発
現ライブラリーを以下に述べる方法でスクリーニングし
た。ST2 mRNAをもとに合成したDNAを動物細胞用発現ベ
クターに挿入し、それらをサル腎臓細胞COS−７細胞に
遺伝子導入した。125I標識したOCIFをプローブとして用
いてCOS−７細胞上に発現した目的の蛋白質をスクリー
ニングした。その結果、OCIFと特異的に結合する蛋白質
をコードするDNAを分離するに至り、このOCIF結合分子
（OCIF結合分子;OBM）をコードするDNAの塩基配列を決
定した。又、このDNAにコードされるOBMは細胞膜上でOC
IFと強くしかも特異的に結合することを見出した。
本発明でいう比較的温和な条件でのDNAハイブリダイ
ゼーションとは、例えば常法に従いナイロンメンブレン
にDNAをトランスファーし固定化した後、ハイブリダイ
ゼーション用バッファー中で放射線標識したプローブの
DNAと40〜70℃、２時間〜１晩程度ハイブリダイゼーシ
ョンさせ、0.5×SSC（0.075M塩化ナトリウム及び0.0075
Mクエン酸ナトリウム）で45℃10分洗浄する条件を言
う。具体的には、常法に従い、ナイロンメンブレンにハ
イボンドＮ（アマシャム社）を用い、DNAをトランスフ
ァーし固定化した後、Rapid Hybridization Buffer（ア
マシャム社）中で32P標識したプローブのDNAと65℃２時
間ハイブリダイゼーションさせて、0.5×SSC（0.075M塩
化ナトリウム及び0.0075Mクエン酸ナトリウム）で45℃1
0分洗浄する条件を言う。
破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活
性型ビタミンD3あるいはPTHの存在下でのマウス由来骨
芽細胞様ストローマ細胞株、ST2とマウス脾臓細胞との
共培養系がよく知られている。本発明のOBMは活性型ビ
タミンD3やPTHのような骨吸収促進因子の存在下で培養
した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に誘導される
蛋白質として特定される。更に、活性型ビタミンD3ある
いはPTH非存在下でもマウス脾臓細胞の培養系に本発明
のDNAによりコードされる蛋白質を添加することによっ
て破骨細胞の形成が促進されることから、本発明のDNA
によりコードされるOBMは破骨細胞の分化、成熟に関与
していると考えられる。
本発明のDNAを発現ベクターに挿入してOBM発現プラス
ミドを作製し、これを各種の細胞又は菌株に導入して発
現させることにより、組み換え型OBMを製造することが
できる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主としてCOS
−７、CHO、Namalwaなど、又は細菌の宿主として大腸菌
などを、用いることができる。その際、DNAの全長を用
いて膜結合型蛋白質として発現させる、あるいは膜結合
部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可
溶化型としても発現させることができる。このようにし
て製造された組み換え型OBMは、通常用いられる蛋白精
製法、例えばOCIF固定化カラムを用いたアフィニティー
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
あるいはゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせ
ることにより、効率よく精製することができる。このよ
うにして得られた本発明蛋白質は、その活性より骨代謝
異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あ
るいは研究・診断用試薬として有用である。
本発明のDNAにコードされる蛋白質OBMを利用して、
（１）OBMの発現を調節する物質のスクリーニング、
（２）OBMに特異的に結合し、OBMの生物活性を阻害、あ
るいは修飾する物質のスクリーニング、及び（３）破骨
細胞前駆細胞に存在し、OBMの生物活性を伝達する蛋白
質（OBMレセプター）のスクリーニング、更にはこのOBM
レセプターを利用したアンタゴニストやアゴニストの開
発が可能である。上述のOBMあるいはOBMレセプターを用
いたコンビナトリアルケミストリーにおいて、アンタゴ
ニストあるいはアゴニストの探索に必要なペプチドライ
ブラリーは具体的に以下の方法で作製することができ
る。その一つに、スプリット法がある（Lam et al.;Nat
ure 354,82−84,1991）。この方法は、合成担体（ビー
ズ）にそれぞれのアミノ酸（ユニット）を結合させたも
のを各ユニットごと別々に合成する。この合成された担
体を一度すべて混ぜ、次にユニットの数に等分し、次の
ユニットをまた各々結合させる。この操作をｎ回繰り返
すことにより、担体にｎ個のユニットが結合したライブ
ラリーが作製される。このように合成を行うと一つの担
体群には、１種類の配列しか合成されないので、本発明
の蛋白質を用いた上記のスクリーニング法で陽性を示し
た担体群を選びだし、そのアミノ酸配列を決定すれば、
特異的に結合するペプチドを同定することができる。
又、別の方法としてファージディスプレイ法を用いるこ
ともできる。この方法はランダムなペプチドをコードす
る合成遺伝子をファージで発現させるもので、上記合成
ライブラリーに比べ、ライブラリー中の分子数を多くで
きるという利点があるものの、ファージが嫌う配列はラ
イブラリーに存在し得ないことなどがあり、分子数当た
りの多様性が低いという欠点がある。ファージディスプ
レイ法でも同様に、本発明の蛋白質を用いたスクリーニ
ング系を利用し、それに特異的に結合するファージをパ
ニングにより濃縮し、得られた特異的結合性を有するフ
ァージを大腸菌で増幅し、そのペプチドをコードする塩
基配列を決定すればよい。更に、前記（２）及び（３）
のスクリーニング系を使用し、ペプチドライブラリーか
らOBMあるいはOBMレセプターに特異的でかつ高親和性の
ペプチドをスクリーニングしたい場合、スクリーニング
時にそれぞれOCIFやOBMを共存させ、それぞれの濃度を
上げながら、陽性を示した担体あるいはファージをスク
リーニングすることにより、特異的かつ極めて高親和性
のペプチドを得ることができる。例をあげれば、すでに
造血ホルモンであるエリスロポエチン（EPO）のレセプ
ターを用い、多様性に富んだペプチドライブラリーから
のEPO様活性を有する低分子ペプチドアゴニストのスク
リーニング及びその立体構造解析、更にはその立体構造
に基づいた有機合成展開によるEPO活性を有する低分子
物質（アゴニスト）の創製に成功している（Nicholas e
t al.:Science,273,458−463,1996）。
また本発明者らは、破骨細胞形成抑制因子OCIFを用
い、その結合蛋白質が活性型ビタミンD3や副甲状腺ホル
モン（parathyroid hormone,PTH）などの骨吸収因子の
存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2の
細胞上に特異的に発現することをすでに見出した。さら
に、該蛋白質は未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞
への分化、成熟に関与する、いわゆる破骨細胞分化、成
熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有してい
ることを見出し、該蛋白質を精製することによりその物
理化学的諸性質及びその生物活性を明らかにした。本発
明者らは、本発明のDNAにより発現される遺伝子組み換
え型蛋白質OBMと、すでに前記OCIFと特異的に結合する
精製天然型蛋白質との異同を明らかにすべく、物理化学
的性質及び生物活性を比較した。その結果、両蛋白質と
も膜結合蛋白質であり、特異的にOCIFと結合し、SD
S−PAGEでの分子量は約40,000、モノマータイプのOCI
Fとクロスリンキングさせた場合の見かけの分子量は約9
0,000−110,000であり、物理化学的諸性質がよく一致し
ていること、又、生物活性においても、両蛋白質は破骨
細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有している
ことから、両蛋白質は同一である可能性が示唆された。
さらに、本発明DNAを用いて遺伝子工学的に発現させ、
精製した蛋白質（遺伝子組み換え型OBM）で作製したウ
サギ抗OBMポリクローナル抗体は、前記の方法で得られ
る精製天然型蛋白質に交差性を有し、OBMとOCIFとの特
異的結合を阻害するのと同様に、前記の精製天然型蛋白
質とOCIFとの結合を特異的に阻害した。これらの結果か
ら、本発明のDNAにより発現される遺伝子組み換え型蛋
白質OBMは、前記OCIFに特異的に結合する天然型蛋白質
と同一であることが明らかである。
さらに本発明者らは、OCIFに特異的に結合し、天然型
あるいは遺伝子組み換え型マウスOBMと同様にマウス脾
臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活
性を有するヒト由来OCIF結合蛋白分子（以下ヒトOBMと
称する）をコードする遺伝子（cDNA）を単離するため、
前述のとおりマウスOBM cDNAから作製したプライマーを
用い、ヒトリンパ節由来cDNAを鋳型としてpolymerase c
hain reaction（PCR）を行い、得られたヒトOBM cDNA断
片をプローブとして上記cDNAライブラリーをスクリーニ
ングした。その結果、OCIFと特異的に結合するヒト由来
蛋白質をコードするcDNAを分離することに成功し、この
ヒト由来OCIF結合蛋白分子、即ちヒトOBMをコードするc
DNAの塩基配列を決定した。このcDNAにコードされるヒ
トOBMは、マウスOBMと同様に細胞膜上でOCIFと強く、し
かも特異的に結合する特性を有し、またマウス脾臓細胞
からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性
を有することを見出した。即ち、本発明は破骨細胞形成
抑制因子OCIFに結合する新規なヒト由来蛋白質であるヒ
トOBMをコードするDNA、そのDNAによりコードされるア
ミノ酸配列を有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特
異的に結合する性質を有し、マウス脾臓細胞からの破骨
細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する蛋白質
を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有す
る骨代謝異常症治療剤の提供、更にヒトOBMの発現を調
節する物質のスクリーニング方法、ヒトOBMと結合しそ
の作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、
ヒトOBMと結合しその作用を伝達するレセプターのスク
リーニング方法及びこれらのスクリーニングの結果得ら
れた物質を含有する医薬組成物を提供することを課題と
する。
本発明は、OCIFに特異的に結合する特性を有し、また
破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有す
る新規なヒト蛋白質であるヒトOBMをコードするDNA、そ
のDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白
質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する特性を有
し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活
性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び
該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤に関する。更
に、本発明はヒトOBMの発現を調節する物質のスクリー
ニング方法、ヒトOBMと結合しその作用を阻害又は修飾
する物質のスクリーニング方法、ヒトOBMと結合しOBMの
生物活性を伝達するレセプターのスクリーニング方法、
及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有
する医薬組成物、さらにヒト由来OCIF結合蛋白質に対す
る抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び／
又は治療薬に関する。
本発明のDNAによりコードされる新規ヒト由来OCIF結
合蛋白分子、即ちヒトOBMは、以下の物理化学的性質及
び生物活性を示す。
即ち、 a.破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inhibit
ory factor,OCIF）（WO 96/26217号）に特異的に結合す
る。
b.還元条件下でのSDS−PAGEによる分子量測定で、約40,
000（±5,000）の分子量を示す。又、モノマータイプの
OCIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は約
90,000−110,000である。
c.破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有
する。
ものである。
本発明のヒトOBMをコードするcDNAを分離同定するた
めの、プローブとして使用するマウス由来OCIF結合蛋白
質であるマウスOBM cDNAは、前述の方法に従って、マウ
ス骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2のcDNAライブラリ
ーから単離することができる。又、ヒトOBM cDNAを発現
することにより得られる蛋白質の特性及びその生物活性
を評価するために必要なヒト破骨細胞形成抑制因子OCIF
は、WO96/26217号記載の方法に従って、ヒト線維芽細胞
株IMR−90の培養液から単離、あるいはそのDNAを用いて
遺伝子工学的に製造することができる。ヒトOBMの特性
や生物活性の評価には、遺伝子組み換えヒトOCIF、遺伝
子組み換えマウスOCIF、遺伝子組み換えラットOCIF等を
用いることもできる。これらの遺伝子組み換え型OCIF
は、それぞれのcDNAを常法に従って発現ベクターに組み
込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalwa細胞等の動物細胞あ
るいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって
得ることができる。
目的の蛋白質をコードするヒト型のcDNAを単離する
（cDNAクローニング）方法としては、その蛋白質を精
製し、その部分アミノ酸配列を決定し、それに対応する
塩基配列を有するDNAをプローブとして用い、ハイブリ
ダイゼーション法により目的のcDNAを単離する方法、
目的の蛋白質のアミノ酸配列が不明であっても発現ベク
ター中にcDNAライブラリーを構築し、それらを細胞中に
導入し、目的蛋白質の発現の有無をスクリーニングする
ことにより、目的のcDNAを単離する方法（発現クローニ
ング法）、及びヒト由来の目的蛋白質と同じ特性及び
生物活性を有するヒト以外の哺乳動物由来の蛋白質をコ
ードする遺伝子、cDNAがクローニングしようとするヒト
由来の目的蛋白質のcDNAと高いホモロジーを有すると想
定し、前者のcDNAをプローブとし、ヒト細胞あるいは組
織から構築したcDNAライブラリーからハイブリダイゼー
ション法やpolymerase chain reaction（PCR）法により
目的のヒト蛋白質をコードするcDNAを単離する方法があ
る。
ヒトOBM cDNAは、前記マウスOBM cDNAと高い相同性を
有するとの想定のもと、ヒトOBM産生細胞あるいは組織
は後者のcDNAをプローブとして、ノーザンハイブリダイ
ゼーション法により調べることができる。ヒトOBM cDNA
は、マウスOBM cDNAから作製したマウスOBMプライマー
を用い、上記のようにして同定したヒトOBM産生組織、
例えばヒトリンパ節等から構築したcDNAを鋳型として、
PCRによりヒトOBM cDNA断片を得て、このヒトOBM cDNA
断片をプローブとし、上記の様に同定したヒトOBM産生
細胞あるいは組織のcDNAライブラリーをスクリーニング
することにより得ることができる。本発明は、このよう
にして得られたOCIFに特異的に結合する性質を有し、ま
た破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有
するヒト由来蛋白質、即ちヒトOBMをコードするDNAに関
する。本発明のDNAがコードするヒトOBMは、膜貫通領域
を有する膜結合型蛋白質をコードすることから、OCIFを
標識し、本発明のcDNAを発現した動物細胞表面へのOCIF
標識体の結合によって検出することができる。OCIFの標
識法としては、前述と同様、放射性同位元素による標識
や蛍光標識等、一般的な蛋白質の標識法を用いることが
できる。
本発明のヒトOBM cDNAにより発現される蛋白質の分子
量は、ゲル濾過クロマトグラフィーやSDS−PAGE等を用
いて測定される。より正確に分子量を測定するために
は、SDS−PAGEを用いるのが好ましく、ヒトOBMは、還元
条件下で約40,000（40,000±5,000）の分子量を有する
蛋白質として特定される。
本発明でいう比較的温和な条件でのDNAハイブリダイ
ゼーションとは、例えば常法に従いナイロンメンブラン
にDNAをトランスファーし、固定化した後、ハイブリダ
イゼーション用バッファー中で放射線標識したプローブ
のDNAと40−70℃、２時間から一夜程度ハイブリダイゼ
ーションさせ、0.5×SSC（0.075M塩化ナトリウム及び0.
0075Mクエン酸ナトリウム）で45℃、10分間洗浄する条
件を言う。より具体的には、常法に従い、ナイロンメン
ブランにハイボンドＮ（アマシャム社）を用い、DNAを
トランスファーし、固定化した後、Rapid Hybridizatio
n Buffer（アマシャム社）中で32P標識したプローブのD
NAと65℃、２時間ハイブリダイゼーションさせて、上記
の0.5×SSCで45℃、10分間洗浄する条件を言う。
破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活
性型ビタミンD3あるいはPTHの存在下でのマウス由来骨
芽細胞様ストローマ細胞株、ST2とマウス脾臓細胞との
共培養系がよく知られている。このインビトロ培養系で
の破骨細胞形成には、骨芽細胞様ストローマ細胞と脾臓
細胞間の接着による相互作用及び活性型ビタミンD3やPT
H等の骨吸収促進因子の存在が不可欠である。このイン
ビトロ培養系において、骨吸収促進因子非存在下で、し
かも破骨細胞形成支持能のないサル腎臓細胞株であるCO
S細胞に本発明のcDNAを発現させた遺伝子組み換えCOS細
胞株は、骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2と同様に脾
臓細胞からの破骨細胞形成支持能を獲得した。また本発
明のcDNAは膜結合型蛋白質をコードすることから、この
膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌
型、可溶型として発現させることもできる。骨吸収促進
因子非存在下の上記インビトロ培養系に、この分泌型ヒ
トOBMを添加するだけで破骨細胞の形成が起こることも
確認された。これらの結果から、本発明のcDNAによりコ
ードされるヒトOBMは破骨細胞の分化、成熟に関与する
因子として特定される。
本発明のcDNAを発現ベクターに挿入してヒトOBM発現
プラスミドを作製し、これを各種の細胞または菌株に導
入して発現させることにより、組み換え型ヒトOBMを製
造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿
主としてCOS−７、CHO、Namalwa細胞などを、また細菌
の宿主として大腸菌等を用いることができる。その際、
cDNAの全長を用いて膜結合型蛋白質として発現させるこ
とができるし、また膜結合部位をコードする部分を除去
することにより分泌型、可溶化型としても発現させるこ
とができる。このようにして製造された組み換え型ヒト
OBMは、通常用いられる蛋白精製法、例えばOCIF固定化
カラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィ
ー等を組み合わせることにより効率良く精製できる。こ
のようにして得られた本発明ヒトOBMは、その活性より
骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医
薬、あるいは研究・診断用試薬として有用である。
本発明のcDNAにコードされる蛋白質、ヒトOBMを利用
することにより、ヒトOBMの発現を調節する物質のス
クリーニング、ヒトOBMに特異的に結合し、その生物
活性を阻害あるいは修飾する物質のスクリーニング、及
びヒト破骨細胞前駆細胞に存在し、ヒトOBMの生物活
性を伝達するヒト蛋白質（ヒトOBMレセプター）のスク
リーニング、さらにはこのヒトOBMレセプターを利用し
たアンタゴニストやアゴニストの開発が可能である。上
述のヒトOBMあるいはヒトOBMレセプターを用いたコンビ
ナトリアルケミストリーにおいて、アンタゴニストある
いはアゴニストの探索に必要なペプチドライブラリーは
マウスOBMを用いたスクリーニングの方法と同様の方法
で作製することができ、マウスOBMの代わりにヒトOBMを
用いて、ペプチドライブラリーを同様にスクリーニング
することにより、特異的かつ極めて高親和性のペプチド
を得ることができる。
さらにまた、前述のようにOBMは有用性の高い蛋白質
であるが、この蛋白質の測定を行うにはOBMを特異的に
認識する抗体とその抗体を用いた酵素免疫測定法の構築
が必須である。しかしながら、これまでにOBMの測定に
有用な抗体は得られていない。さらに、OBMあるいはsOB
Mの生物活性を中和する抗OBM/sOBM抗体は、OBMあるいは
sOBMの作用、即ち破骨細胞形成の促進作用を抑制するこ
とが想定され、骨代謝異常症の治療薬としての開発が期
待されるが、このような抗体も未だ得られていない。
上述の状況に鑑み本発明者らは鋭意研究の結果、破骨
細胞形成抑制因子（OCIF）に特異的に結合する膜結合蛋
白質（OCIF結合分子;OBM）及び膜結合部位を欠損した可
溶性OBM（sOBM）の両抗原を認識する抗体（抗OBM/sOBM
抗体）を見出すに至った。従って本発明は、破骨細胞形
成抑制因子OCIFに特異的に結合する膜結合蛋白質OBM及
び膜結合部位を欠損した可溶性OBM（sOBM）の両抗原を
認識する抗体（抗OBM/sOBM抗体）、その製造方法、この
抗体を用いたOBM及びsOBMの測定方法、さらにこの抗体
を有効成分とする骨代謝異常症予防及び／又は治療剤を
提供することを課題とする。
本発明は、破骨細胞形成抑制因子（Osteoclastogenes
is inhibitory factor;OCIF）に特異的に結合する膜結
合蛋白質（OCIF binding molecule;OBM）及び膜結合部
位を欠損した可溶性OBM（sOBM）の両抗原を認識する抗
体（抗OBM/sOBM抗体）、その製造方法、この抗体を用い
たOBM及びsOBMの測定方法、さらにこの抗体を有効成分
とする医薬、特に骨代謝異常症予防及び／又は治療剤に
関する。
本発明の抗体は、OBM及びsOBMの生物活性である破骨
細胞形成促進活性を中和する活性を有し、以下の性質を
持つ抗体から構成される。
即ち、 ａ）マウスOBM及びマウスsOBMの両抗原を認識するポリ
クローナル抗体（抗マウスOBM/sOBMポリクローナル抗
体） ｂ）ヒトOBM及びヒトsOBMの両抗原を認識するポリクロ
ーナル抗体（抗ヒトOBM/sOBMポリクローナル抗体） ｃ）マウスOBM及びマウスsOBMの両抗原を認識するモノ
クローナル抗体（抗マウスOBM/sOBMモノクローナル抗
体） ｄ）ヒトOBM及びヒトsOBMの両抗原を認識するモノクロ
ーナル抗体（抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体） ｅ）マウスOBM及びマウスsOBMの両抗原に交差性を有す
る抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体、から構成され
る。
マウスOBM及びマウスsOBMの両抗原を認識するポリク
ローナル抗体（以下抗マウスOBM/sOBMポリクローナル抗
体と称する）及びヒトOBM及びヒトsOBMの両抗原を認識
するポリクローナル抗体（以下抗ヒトOBM/sOBMポリクロ
ーナル抗体と称する）は、以下の手段によって得ること
ができる。免疫用抗原としての精製マウスOBMは、前述
の方法に従って得ることができる。即ち、マウス骨芽細
胞様ストローマ細胞株ST−２を活性ビタミンD3処理し、
その細胞膜上のOBMをOCIF固定化カラム及びゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより精製することにより、天然型マ
ウスOBM（nativeOBM）を得ることができる。又、前述の
マウスOBM cDNA（配列表配列番号15）又はヒトOBM cDNA
（配列表配列番号12）を常法により発現ベクターに組み
込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalwa、COS−７細胞等の動
物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などで発現させて、
上記と同様の方法で精製することにより、遺伝子組み換
えマウスOBM（配列表配列番号１）又はヒトOBM（配列表
配列番号11）を得ることができ、これを免疫用抗原とし
て用いても良い。この時、膜結合蛋白質であるマウスOB
MあるいはヒトOBMを大量かつ高度に精製するには、多大
の労力を要する。一方、膜結合型蛋白質であるOBMとそ
の膜結合部位を欠損させて得られる可溶化蛋白質である
可溶性OBM（sOBM）とは、前述のように破骨細胞の分
化、成熟促進活性において差異がないことが認められて
いる。従って、マウスsOBM及びヒトsOBMは発現及びその
高度精製が比較的容易であることから、これら可溶化蛋
白質であるsOBMを免疫用抗原として用いても良い。マウ
スsOBM（配列表配列番号16）及びヒトsOBM（配列表配列
番号17）は、マウスsOBM cDNA（配列表配列番号18）又
はヒトsOBM cDNA（配列表配列番号19）の5'上流側に他
の分泌蛋白質由来の既知シグナル配列をコードする塩基
配列を付加し、上記と同様に遺伝子工学的手法により発
現ベクターに組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、ある
いは大腸菌などを宿主として発現し、精製することによ
り、それぞれ得ることができる。このようにして得られ
た免疫用抗原を、リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）に溶
解し、必要に応じ同容量のフロイント完全アジュバント
と混合し乳化後、動物に約１週間間隔で皮下投与し、数
回免疫する。抗体価を測定し、最高の抗体価に達した時
点でブースター投与し、投与10日後に全採血を行う。得
られた抗血清を硫酸アンモニウム分画沈澱し、グロブリ
ン分画を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製す
るか、あるいは抗血清をバインディングバッファー（Bi
orad社）で２倍希釈し、その希釈抗血清をプロテインＡ
又はプロテインＧセファロースカラムクロマトグラフィ
ーにより精製することにより、目的とする抗マウス又は
抗ヒトOBM/sOBMポリクローナル型抗体を得ることができ
る。
本発明のモノクローナル抗体は、以下の方法により得
ることができる。即ち、モノクローナル抗体の作製に必
要な免疫用抗原としては、ポリクローナル抗体の時と同
様に天然型マウスOBM（nativeOBM）、遺伝子組み換えマ
ウス型又はヒトOBM、遺伝子組み換えマウス型又はヒト
型sOBMを用いることができる。それぞれの抗原により哺
乳動物を免疫するか、あるいはインビトロ法により免疫
したリンパ球細胞を骨髄腫細胞株（ミエローマ）などと
融合させ、常法によりハイブリドーマを作製する。この
ハイブリドーマ培養液について、高度に精製されたそれ
ぞれの抗原を用いて、ソリッドフェーズELISAによりそ
れぞれの抗原を認識する抗体生産ハイブリドーマを選択
する。得られたハイブリドーマをクローニングし、樹立
した安定な抗体産生ハイブリドーマをそれぞれ培養する
ことにより、目的とする抗体が得られる。ハイブリドー
マの作製に当たっては、哺乳動物を使用する場合、マウ
スやラットなどの小動物を使用するのが一般的である。
免疫は、抗原を適当な溶媒、例えば生理食塩水などで適
当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与
し、これに必要に応じてフロイント完全アジュバントを
併用投与し、動物に１〜２週間間隔で３〜４回程度投与
する方法が一般的である。このようにして免疫された動
物を最終免疫後３日目に解剖し、摘出した脾臓から得ら
れた脾臓細胞を免疫細胞として使用する。免疫細胞と細
胞融合するマウス由来のミエローマとしては、例えばp3
/x63−Ag8、p3−U1、NS−１、MPC−11、SP−2/0、FO、P
3x63 Ag8.653及びS194などが挙げられる。又、ラット由
来の細胞としては、Ｒ−210などの細胞株が挙げられ
る。ヒト型の抗体を生産する場合には、ヒトＢリンパ球
をインビトロで免疫し、ヒトミエローマ細胞やEBウイル
スにより形質転換した細胞株と細胞融合させることによ
り、ヒト型の抗体を生産することができる。免疫された
細胞とミエローマ細胞株との融合は公知の方法、例えば
KoehlerとMilsteinらの方法（Koehler et al.:Nature 2
56,495−497,1975）が一般的に使用されるが、電気パル
スを利用した電気パルス法などでも良い。免疫リンパ球
とミエローマ細胞株は、通常行われている細胞数の比率
に混合し、一般に使用される牛胎児血清（FCS）不含細
胞培養用培地にポリエチレングリコールを添加して融合
処理を行い、FCS添加HAT選択培地で培養を行い融合細胞
（ハイブリドーマ）を選別する。次に、抗体を生産する
ハイブリドーマをELISA、プラーク法、オクタロニー
法、凝集法など通常用いられる抗体の検出方法により選
択し、安定なハイブリドーマを樹立する。このようにし
て樹立されたハイブリドーマは、通常の培養方法により
継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハ
イブリドーマは常法により培養して、その培養液、また
は哺乳動物の腹腔内に移植することにより、腹水から抗
体を回収することができる。培養液あるいは腹水中の抗
体は、塩析法、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフ
ィー、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティー
クロマトグラフィーなど通常用いられる方法により精製
することができる。このような方法により、抗原として
sOBMを用いて得られたモノクローナル抗体のほとんど全
ては、sOBMだけでなくOBMをも特異的に認識できる抗体
（抗OBM/sOBMモノクローナル抗体と称する）である。こ
れらの抗体は、OBM及びsOBMのそれぞれの測定に利用す
ることができる。これらの抗体は放射性アイソトープや
酵素ラベルすることにより、ラジオイムノアッセイ（RI
A）やエンザイムイムノアッセイ（EIA）として知られて
いる測定系に用いることにより、OBM量及びsOBM量を測
定することができる。これらの測定系を用いることによ
り、血液、尿などの生体試料中のsOBM量を容易にかつ高
感度で測定することができる。また、これらの抗体を用
いることにより、組織や細胞表面に結合したOBM量をバ
インディングアッセイ等により容易にかつ高感度で測定
することができる。
得られた抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、
抗原性の問題からヒト型抗ヒトOBM/sOBM抗体を作製する
ことが望ましい。ヒト型抗ヒトOBM/sOBM抗体の作製は、
次に述べるような手法により得ることができる。即ち、
ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球を
in vitroでIL−４存在下、抗原であるヒトOBMあるいは
ヒトsOBMで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒ
トとのヘテロハイブリドーマであるK6H6/B5（ATCC CRL1
823）と細胞融合させることにより、目的の抗体産生ハ
イブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生
ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト型抗ヒトOBM/sO
BMモノクローナル抗体である。これらの抗体の中からヒ
トOBM/sOBMの活性を中和する抗体を選別する。しかしな
がら、このようにヒトリンパ球をin vitroで感作する方
法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るの
は困難である。従って、ヒトOBMおよびsOBMに高親和性
のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得
られた低親和性ヒト型抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗
体を高親和化する必要がある。それには、上記のように
して得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト
型抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体のCDR領域（特にC
DR−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発
現させてヒトOBM/sOBMを固相化したプレートを用いてフ
ァージディスプレイ法により、抗原であるヒトOBM/sOBM
に強力に結合するファージを選択し、そのファージを大
腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するCDR
のアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得ら
れたヒト型抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体をコード
する遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発
現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型
抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体が得られる。これら
の中から、ヒトOBM/sOBMの生物活性を中和し、かつ高親
和性である目的のヒト型抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル
抗体を選別することができる。また、Balb/cマウスを
用いて、本発明と同じように常法（Koehler et al.:Nat
ure 256,495−497,1975）によりマウス型抗ヒトOBM/sOB
Mモノクローナル抗体を作製し、ヒトOBM/sOBMの生物活
性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体
を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトOBM/sOBMモノ
クローナル抗体のCDR−領域（CDR−1,2および３）をヒ
トIgGのCDR領域に移植するCDR−grafting（Winter and
Milstein:Nature 349,293−299,1991）の手法を駆使す
ることによりヒト型化が可能である。上記に加え、さら
にヒト末梢血リンパ球をSevere combined immune def
iciency（SCID）マウスに移植し、この移植されたSCID
マウスはヒト型抗体を生産する（Mosier D.E.et al.:Na
ture 335,256−259,1988;Duchosal M.A.et al.:Nature
355,258−262,1992）ので、抗原としてヒトOBMあるいは
sOBMを抗原として感作し、スクリーニングすることによ
り、ヒトOBM/sOBMに特異的なヒト型モノクローナル抗体
を生産するリンパ球をそのマウスから採取することがで
きる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法
と同様に、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであ
るK6H6/B5（ATCC CRL1823）と細胞融合させ、得られた
ハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的
のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を得ることができる。このようにして得られたハイブリ
ドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクロー
ナル抗体を大量に製造でき、上述の方法と同様に精製す
ることにより精製品を得ることができる。又、目的のヒ
ト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから
cDNAライブラリーを構築し、目的のヒト型モノクローナ
ル抗体をコードする遺伝子（cDNA）をクローニングし、
この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当な発現ベクタ
ーに組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸
菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組み
換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することが
できる。得られた培養液から上述と同様の方法により精
製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗
体を大量に得ることができる。
さらに、上述の方法で得られた抗OBM/sOBMモノクロー
ナル抗体の中から、OBM/sOBMの生物活性を中和する抗体
が得ることができる。これらOBM/sOBMの生物活性を中和
する抗体は、生体内でのOBM/sOBMの生物作用、即ち破骨
細胞形成促進作用をブロックすることから、医薬とし
て、特に骨代謝異常症の予防及び／又は治療剤として期
待される。抗OBM/sOBM抗体によるOBMあるいはsOBMの生
物活性の中和活性は、in vitroでの破骨細胞形成系にお
ける破骨細胞形成の抑制活性で測定することができる。
in vitroアッセイ系として、以下の３つの方法がある。
即ち、破骨細胞形成（osteoclastogenesis）のin vitro
培養系として、活性型ビタミンD3とデキサメサゾンの
存在下、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2細胞
とマウス脾臓細胞との共培養系、サル腎臓細胞株、CO
S−７細胞上にOBMを発現させ、ホルムアルデヒドにより
固定化し、Ｍ−CSF存在下、その細胞上でマウス脾臓細
胞を培養する共培養系、遺伝子組み換えsOBM及びＭ−
CSF存在下でマウス脾臓細胞を培養する系などが挙げら
れる。これら培養系に種々の濃度で抗OBM/sOBM抗体を添
加し、破骨細胞形成に及ぼす影響を調べることにより、
抗OBM/sOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定する
ことができる。又、in vivoでの実験動物を利用した骨
吸収抑制活性により抗OBM/sOBM抗体の破骨細胞形成抑制
活性を評価することができる。即ち、破骨細胞形成が亢
進している動物モデルとして、卵巣摘出モデルがある。
この種の実験動物に抗OBM/sOBM抗体を投与し、骨吸収抑
制活性（骨密度の増強活性）を測定することにより、抗
OBM/sOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定するこ
とができる。
このようにして得られたOBM/sOBMの生物活性を中和す
る抗体は、医薬として、特に骨代謝異常症の予防及び／
又は治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこの
ような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用であ
る。本発明抗体は、製剤化して経口的あるいは非経口的
に投与することができる。本発明抗体を含む製剤は、OB
M及び／又はsOBMを認識する抗体を有効成分として含有
する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に
投与されるものである。医薬組成物の形態としては、点
滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤な
どが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質で
あることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒な
どへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学
的因子、例えば熱、pHおよび湿度等により容易に失活す
る。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、
pH調製剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加す
る。安定化剤としては、グリシン、アラニン等のアミノ
酸類、デキストラン40およびマンノース等の糖類、ソル
ビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコー
ル等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよ
い。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量に対して
0.01〜100倍、特に0.1〜10倍添加するのが好ましい。こ
れら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍
結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝
剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッフ
ァー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結
乾燥製剤の再溶解後の水溶液のpHを調整し、抗体の安定
性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例え
ば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を再溶解した後の水量
に対し、１〜10mMとするのが好ましい。界面活性剤とし
ては、好ましくはポリソルベート20、プルロニックＦ−
68、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソ
ルベート80が挙げられ、またこれらの２種以上を併用し
てもよい。抗体のような高分子蛋白質は容器の材質であ
るガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性
剤を添加することによって、液状製剤あるいは凍結乾燥
製剤の再溶解後の抗体の、容器への吸着を防止すること
ができる。界面活性剤の添加量としは、液状製剤あるい
は凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対し0.001〜1.0％
添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝
剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調
製することができるが、特に医療用又は動物薬用注射剤
として用いる場合は、浸透圧比として許容される浸透圧
比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩
化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤
中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて
適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型化抗体の
投与量は、抗体のヒトOBM/sOBMに対する親和性、即ちヒ
トOBM/sOBMに対する解離定数（Kd値）に依存し、親和性
が高い（Kd値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬
効を発現することができる。又、ヒト型抗体はヒト血中
での半減期が約20日間と長いことから、例えばヒトに対
して投与する際には、約0.1〜100mg/kgを１〜30日間に
１回以上投与すれば良い。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明実施例３のマウスOBM蛋白質のSDS−
PAGEの結果を示す。
〔符号の説明〕
（Ａ）：レーン1:分子量マーカー レーン2:活性型ビタミンD3とデキサメサゾン存
在下で培養したST2細胞からの部分精製標品（Gly−HCl
（pH2.0）溶出画分） レーン3:活性型ビタミンD3とデキサメサゾン非
存在下で培養したST2細胞からの部分精製標品（Gly−HC
l（pH2.0）溶出画分） （Ｂ）：レーン1:分子量マーカー レーン2:逆相高速液体クロマトグラフィーで精
製した本発明マウスOBM蛋白質（実施例３） 第２図は、実施例４の125Iで標識したOCIFの骨芽細胞
様ストローマ細胞ST2への結合試験の結果を示す。
第３図は、実施例５（１）の継代数の違う骨芽細胞様
ストローマ細胞ST2による破骨細胞形成支持能を示す。
〔符号の説明〕
1:継代数約10代のST2細胞の破骨細胞形成支持能 2:継代数約40代のST2細胞の破骨細胞形成支持能 第４図は、実施例５（２）の活性型ビタミンD3及びデ
キサメサゾン存在下での培養における骨芽細胞様ストロ
ーマ細胞膜上の本発明蛋白質発現の経時変化を示す。
第５図は、実施例５（２）の共培養系における破骨細
胞形成の経時変化を示す。
第６図は、実施例５（３）の共培養期間において、種
々の培養期間のみOCIF処理した場合の破骨細胞形成抑制
効果を示す。
第７図は、実施例６の125I標識OCIFと本発明蛋白質と
のクロスリンキング試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:125I標識OCIF−CDD1 レーン2:125I標識OCIF−CDD1とST2細胞をクロスリン
クさせたもの レーン3:400倍濃度の未標識OCIFを添加してクロスリ
ンクさせたもの 第８図は、実施例９における、SDS−PAGEの結果を示
す。
〔符号の説明〕
レーン1:pOBM291をトランスフェクトしたCOS−７細胞
の蛋白質を、OCIF無添加で免疫沈降させたもの レーン2:pOBM291をトランスフェクトしたCOS−７細胞
の蛋白質を、OCIFを添加して免疫沈降させたもの 第９図は、実施例10における、125Iで標識したOCIF
の、pOBM291をトランスフェクトしたCOS−７細胞への結
合試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン１及び2:125Iで標識したOCIFの、pOBM291をト
ランスフェクトしたCOS−７細胞への結合量 レーン３及び4:125Iで標識したOCIFの、pOBM291をト
ランスフェクしたCOS−７細胞への結合量（400倍濃度の
未標識OCIF添加時） 第10図は、実施例11における、125Iで標識したOCIFを
用いたクロスリンク試験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:125I標識OCIF レーン2:125I標識OCIFと、pOBM291をトランスフェク
トしたCOS−７細胞をクロスリンクさせたもの レーン3:400倍濃度の未標識OCIF存在下で、125I標識O
CIFと、pOBM291をトランスフェクトしたCOS−７細胞を
クロスリンクさせたもの 第11図は、実施例12における、ノーザンブロットの結
果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:ビタミンＤ及びデキサメサゾン無添加で培養
したST2細胞由来RNA レーン2:ビタミンＤ及びデキサメサゾンを添加し培養
したST2細胞由来RNA 第12図は、実施例13−（２）における、OCIF濃度を変
えた時の培養上清中蛋白質のOCIF結合能を示す。
〔符号の説明〕
○:pCEP4 ●:pCEP sOBM 第13図は、実施例13−（２）における、培養上清の割
合を変えた時の培養上清中蛋白質のOCIF結合能を示す。
〔符号の説明〕
○:pCEP4 ●:pCEP sOBM 第14図は、実施例14−（２）における、大腸菌で発現
させたチオレドキシンとマウスOBMの融合蛋白質のSDS−
PAGEの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:分子量マーカー レーン2:GI724/pTrxFus由来可溶性蛋白質画分 レーン3:GI724/pTrxOBM25由来可溶性蛋白質画分 第15図は、実施例14−（３）における、可溶性蛋白質
画分の割合を変えた時のOCIF結合能を示す。
〔符号の説明〕
□:GI724/pTrxFus ○:GI724/pTrxOBM25 第16図は、実施例14−（３）における、OCIF濃度を変
えた時の可溶性蛋白質画分（１％）のOCIF結合能を示
す。
〔符号の説明〕
□:GI724/pTrxFus ○:GI724/pTrxOBM25 第17図は、本発明のマウスOBM cDNAにより発現され精
製して得られる蛋白質マウスOBM、及び天然型の精製OCI
F結合蛋白質とOCIFとの特異的結合能の、ウサギ抗マウ
スOBM抗体による阻害結果を示す。
〔符号の説明〕
1:抗体で処理したcDNAにより発現され精製して得られ
る蛋白質、OBM＋125I−OCIF 2:抗体で処理した天然型の蛋白質＋125I−OCIF 3:抗体未処理のcDNAにより発現されて得られる蛋白
質、マウスOBM＋125I−OCIF 4:抗体未処理の天然型の
蛋白質＋125I−OCIF 5:3＋非標識OCIF（125I−OCIFの400倍量） 6:4＋非標識OCIF（125I−OCIFの400倍量） 第18図は、本発明のcDNAにより発現される蛋白質、ヒ
トOBMのSDS−PAGEの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:分子量マーカー レーン2:本発明のcDNAを含む発現ベクター、phOBMを
トランスフェクトしたCOS−７細胞の蛋白質をOCIF無添
加でウサギ抗OCIFポリクローナル抗体で免疫沈降させた
もの レーン3:本発明cDNAを含む発現ベクター、phOBMをト
ランスフェクトしたCOS−７細胞の蛋白質をOCIF添加で
ウサギ抗OCIFポリクローナル抗体で免疫沈降させたもの 第19図は、本発明cDNAを含む発現ベクター、phOBMを
トランスフェクトしたCOS−７細胞へのOCIFの結合試験
の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:phOBMをトランスフェクトしたCOS−７細胞に
125I−OCIFを添加したもの レーン2:phOBMをトランスフェクトしたCOS−７細胞に
125I−OCIFを添加し、さらに400倍量の非標識OCIFを加
えたもの 第20図は、本発明cDNAでコードされる蛋白質、ヒトOB
Mと125I−OCIF（モノマー型）とのクロスリンキング試
験の結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:125I−OCIF レーン2:125I−OCIFとphOBMをトランスフェクトしたC
OS−７細胞膜上の蛋白質とをクロスリンクさせたもの レーン3:400倍濃度の非標識OCIF存在下で、125I−OCI
FとphOBMをトランスフェクトしたCOS−７細胞膜上の蛋
白質とをクロスリンクさせたもの 第21図は、実施例23−（２）における、OCIF濃度を変
えた時の培養液上清中蛋白質（分泌型hOBM）のOCIF結合
能を示す。
〔符号の説明〕
○：分泌型ヒトOBMをコードするcDNAを含まないベク
ターのみのpCEP4をトランスフェクトした293−EBNA細胞
の培養液 ●：分泌型ヒトOBMをコードするcDNAを含む発現ベク
ターのpCEPshOBMをトランスフェクトした293−EBNA細胞
の培養液 第22図は、実施例23−（２）における、OCIF濃度を一
定にし、添加する培養液量を変えた時の培養液上清中蛋
白質（分泌型ヒトOBM）のOCIF結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：分泌型ヒトOBMをコードするcDNAを含まないベク
ターのみのpCEP4をトランスフェクトした293−EBNA細胞
の培養液 ●：分泌型ヒトOBMをコードするcDNAを含む発現ベク
ターのpCEPshOBMをトランスフェクトした293−EBNA細胞
の培養液 第23図は、大腸菌で発現させたチオレドキシンとヒト
OBMの融合蛋白質のSDS−PAGEの結果を示す。
〔符号の説明〕
レーン1:分子量マーカー レーン2:大腸菌GI724/pTrxFus由来可溶性蛋白質画分 レーン3:大腸菌GI724/pTrxhOBM由来可溶性蛋白質画分 第24図は、実施例24−（３）における、チオレドトキ
シンとヒトOBMの融合蛋白質を含む大腸菌由来可溶性蛋
白質画分の添加割合を変えた時の融合蛋白質と、OCIFと
の結合能を示す。
〔符号の説明〕
○：大腸菌GI724/pTrxFus由来可溶性蛋白質画分 ●：大腸菌GI724/pTrxshOBM由来可溶性蛋白質画分 第25図は、実施例24−（３）における、OCIF濃度を変
えた時の大腸菌由来可溶性蛋白質画分中のチオレドトキ
シンとヒトOBMの融合蛋白質と、OCIFとの結合能を示
す。
〔符号の説明〕
○：大腸菌GI724/pTrxFus由来可溶性蛋白質画分 ●：大腸菌GI724/pTrxshOBM由来可溶性蛋白質画分 第26図は、本発明のウサギ抗ヒトOBM/sOBMポリクロー
ナル抗体を用いたサンドイッチELISAによる、ヒトOBM及
びsOBMの測定結果を示す。
〔符号の説明〕
□：ヒトOBM ●：ヒトsOBM 第27図は、本発明の抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗
体を用いたサンドイッチELISAによる、ヒトOBM及びsOBM
の測定結果を示す。
〔符号の説明〕
□：ヒトOBM ●：ヒトsOBM 第28図は、本発明のマウスOBM及びsOBMにも交差性を
有する抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体を用いたサン
ドイッチELISAによる、マウスOBM及びsOBMの測定結果を
示す。
〔符号の説明〕
□：マウスOBM ●：マウスsOBM 第29図は、チオレドトキシンとマウスOBMの融合蛋白
質によるヒト破骨細胞様細胞形成の促進活性を示す。
第30図は、ビタミンD3刺激による骨吸収活性の、抗OB
M/sOBM抗体による抑制を示す。
第31図は、プロスタグランジンE2（PGE2）刺激による
骨吸収活性の、抗OBM/sOBM抗体による抑制を示す。
第32図は、副甲状腺ホルモン（PTH）刺激による骨吸
収活性の、抗OBM/sOBM抗体による抑制を示す。
第33図は、インターロイキン１α（1L−１）刺激によ
る骨吸収活性の、抗OBM/sOBM抗体による抑制を示す。
発明を実施するための最良の形態 〔実施例〕 以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、
これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによ
って何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕 本発明蛋白質の製造 （１）ST2細胞の大量培養 マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2（RIKEN CELL
BANK,RCB0224）は、10％牛胎児血清を含むα−MEM培地
を用いて培養した。付着細胞用225cm2Tフラスコでコン
フルエントになるまで培養したST2細胞を、トリプシン
処理してＴフラスコから剥がし洗浄した後、５枚の225c
m2Tフラスコに移し、10-8M活性型ビタミンD3（Calcitri
ol）、10-7Mデキサメサゾン、及び10％牛胎児血清を添
加したα−MEM培地各々60mlを加えてCO2インキュベータ
ー中で７−10日間培養した。培養したST2細胞はセルス
クレイパーを用いて回収し、使用するまで−80℃で保存
した。
（２）膜画分の調製と膜結合蛋白質の可溶化 225cm2Tフラスコ80枚を用いて培養した実施例１−
（１）記載のST2細胞（容量約12ml）に、プロテアーゼ
阻害剤（2mM APMSFP,2mM EDTA,2mM o−phenanthroline,
1mM leupeptin,1μg/ml pepstatin A及び100units/ml a
protinin）を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 7.2）を
３倍容量（36ml）加えた。ボルテックスミキサーを用い
て30秒間この細胞を激しく攪拌した後、氷中で10分間放
置した。ホモジナイザー（DOUNCE TISSUE GRINDER,A sy
rindge,WHEATON SCIENTIFIC社）を用い、細胞を破砕し
た。この細胞破砕液に、上記のプロテアーゼ阻害剤、0.
5Mシュクロース、0.1M塩化カリウム、10mM塩化マグネシ
ウム、及び2mM塩化カルシウムを加えた10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH 7.2）の等量（48ml）を加え、攪拌した
後、４℃、600×ｇで10分間遠心した。この遠心分離に
より、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分として分離し
た。遠心分離で得た上清を４℃、150,000×ｇで90分間
遠心し、沈殿画分としてST2細胞の膜画分を得た。この
膜画分に、上記のプロテアーゼ阻害剤、150mM塩化ナト
リウム、及び0.1Mシュクロースを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（pH 7.2）8mlを加えた後、20％ CHAPS（３−
［（３−cholamidopropyl）−dimethylammonio］−１−
propanesulfonate、Sigma社）200μｌを加え、４℃で２
時間攪拌した。この液を４℃、150,000×ｇで60分間遠
心し、その上清を可溶化膜画分として得た。
〔実施例２〕 本発明蛋白質の精製 （１）OCIF固定化アフィニティーカラムの調製 HiTrap NHS−activatedカラム（1ml,ファルマシア
社）内のイソプロパノールを1mM塩酸で置換した後、WO9
6/26217号公報記載の方法で調製した遺伝子組み換え型O
CIF 13.0mgを含む0.2M NaHCO3/0.5M NaCl（pH 8.3）溶
液1mlをシリンジ（5ml,テルモ社）を用いカラムに添加
した。室温で30分間カップリング反応させた後、過剰な
活性基を不活性化する為、0.5Mエタノールアミン/0.5M
NaCl（pH 8.3）と0.1M酢酸/0.5M NaCl（pH 4.0）を3ml
ずつ交互に３回流し、再度0.5Mエタノールアミン/0.5M
NaCl（pH 8.3）に置き換え室温で１時間放置した。その
後、0.5Mエタノールアミン/0.5M NaCl（pH 8.3）と0.1M
酢酸/0.5M NaCl（pH 4.0）で２度洗浄し、50mM Tris/1M
NaCl/0.1％CHAPS緩衝液（pH 7.5）に置換した。
（２）OCIF固定化アフィニティーカラムによる本発明蛋
白質の精製 OCIF結合蛋白質の精製は、特に断らない限り４℃で行
った。前述のOCIF固定化アフィニティーカラムを、実施
例１−（２）記載のプロテアーゼ阻害剤、0.15M塩化ナ
トリウム、及び0.5％ CHAPSを加えた10mMトリス−塩酸
緩衝液（pH 7.2）で平衡化した。このカラムに、実施例
１−（２）項記載の可溶化膜画分約8mlを流速0.01ml/分
で負荷した。このカラムに、上記のプロテアーゼ阻害
剤、0.15M塩化ナトリウム、及び0.5％ CHAPSを加えた10
mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.2）を流速0.5ml/分で100分
間流してカラムを洗浄した。次に、プロテアーゼ阻害
剤、0.2M塩化ナトリウム、及び0.5％CHAPSを加えた0.1M
グリシン−塩酸緩衝液（pH 3.3）を流速0.1ml/分で50分
間流し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。同様に、
プロテアーゼ阻害剤、0.2M塩化ナトリウム、及び0.5％C
HAPSを加えた0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0）
を流速0.1ml/分で50分間流し、カラムに吸着した蛋白質
を溶出した。溶出液は0.5ml/フラクションにて分取し
た。分取した画分には、2Mトリス溶液を加え、直ちに中
和した。各緩衝液で溶出したフラクション（溶出液量1.
0−5.0ml）の各々をセントリコン−10（Centricon−10,
Amicon,USA）を用いて50から100μｌに濃縮した。濃縮
した各フラクションの一部を分取し、それぞれにOCIFを
添加後、OCIFポリクローナル抗体で免疫沈殿させた。そ
の沈殿画分をSDS化して後、SDS−PAGEにかけてOCIFに特
異的な結合能を有する蛋白質のバンドが出現するフラク
ション（Fr.No.3−10）を本発明蛋白質画分とした。
（３）ゲル濾過による本発明蛋白質の精製 実施例２−（２）記載の方法で精製し、濃縮したOCIF
結合蛋白質（0.1Mグリシン−塩酸緩衝液、pH 3.3及び0.
1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH 2.0溶出画分）を10mM
Tris−HCl,0.5M NaCl,0.5％CHAPS（pH7.0）で平衡化し
たSuperose 12 HR10/30カラム（ファルマシア社、1.0x
30cm）にかけ、平衡化緩衝液を移動相として用い流速0.
5ml/minで展開させ、0.5mlづつの画分を集めた。上記と
同様にして本発明蛋白質画分（Fr.No.27−32）を同定
し、各々のフラクションをCentricon−10（Amicon）で
濃縮した。
（４）逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製 前述のゲル濾過で精製したOCIF結合蛋白質を0.1％ト
リフルオロ酢酸（TFA）,30％アセトニトリルで平衡化し
たC4カラム（2.1x250mm、Vydac,USA）に負荷した。最初
の50分間でアセトニトリル濃度を30％から55％に、次の
10分間でアセトニトリル濃度を80％にする勾配、流速0.
2ml/minで溶出を行い、溶出された蛋白質のピークを215
nmで検出した。溶出された各ピークの蛋白質を分取し本
発明蛋白質のピークを同定することにより、高度に精製
された本発明蛋白質を得た。
〔実施例３〕 精製された本発明蛋白質のSDS−PAGE まず、活性型ビタミンD3存在下あるいは非存在下で培
養したST2細胞から調製した膜可溶化画分を上記のよう
にOCIF固定化アフィニティーカラムで精製し、その精製
標品をSDS−PAGEにかけた。第１図（Ａ）に示したよう
に、活性型ビタミンD3存在下で培養したST2細胞からの
精製標品のみに、約30,000−40,000のメジャーな蛋白質
バンドが検出され、OCIF固定化アフィニティーカラムに
より、OCIFに特異的に結合する蛋白質、即ち本発明蛋白
質が選択的に濃縮、精製されることが明らかになった。
しかしながら、本発明蛋白質以外にOCIF固定化カラムの
担体やスペサーなどに非特異的に結合した数種の蛋白質
バンドが両精製サンプル中に共通して検出された。これ
らの本発明蛋白質以外の蛋白質を上記のようにゲル濾過
及びC4逆相クロマトグラフィーで除去し、得られた高度
精製本発明蛋白質のSDS−PAGEを第１図（Ｂ）に示し
た。高度精製本発明蛋白質は電気泳動的に均一であり、
その分子量は約30,000−40,000であった。
〔実施例４〕 OCIFの骨芽細胞への結合試験 （１）125I標識OCIFの調製 OCIFはヨードジェン（Iodogen）法により125I標識し
た。即ち、2.5mg/ml Iodogen−クロロホルム溶液20μｌ
を1.5mlエッペンドルフチューブに移し、40℃でクロロ
ホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブ
を調製した。このチューブを0.5Mリン酸ナトリウム緩衝
液（Na−Pi,pH 7.0）400μｌで３回洗浄した後、0.5M N
a−Pi,pH7.0,5μｌを加えた。このチューブにNa−125I
溶液（Amersham社、NEZ−033H20）1.3μｌ（18.5MBq）
を加えた後、直ちに1mg/ml rOCIF溶液（モノマー型ある
いはダイマー型）10μｌを加え、ボルテックスミキサー
で攪拌した後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予
め10mg/mlヨウ化カリウム、0.5M Na−Pi,pH 7.0溶液80
μｌと５％牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水
５μｌを添加しておいたチューブに移し攪拌した。この
溶液を0.25％牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩
水溶液で平衡化しておいたスピンカラム（1ml,G−25 fi
ne,ファルマシア社）に負荷し、2,000rpmで５分間遠心
した。カラムから溶出された画分に0.25％牛血清アルブ
ミンのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液400μｌを加え攪拌
した後、２μｌを取り、その放射能をガンマーカウンタ
ーで測定した。このようにして調製した125I標識OCIF溶
液の放射化学純度は10％ TCAにより沈殿する画分の放射
能を測定することにより求めた。又、125I標識OCIF溶液
のOCIF生物活性は、WO96/26217号公報記載の方法に従い
測定した。又、125I標識OCIF濃度は以下のようにELISA
により測定した。
（２）125I標識OCIF濃度のELISAによる測定 WO96/26217号公報記載の抗OCIFウサギポリクローナル
抗体を２μg/mlになるように溶解させた50mM NaHCO3（p
H 9.6）100μｌづつを96ウェルイムノプレート（MaxiSo
rpTM、Nunc社）の各ウェルに加えて４℃で一夜放置し
た。この液を吸い取った後、ブロックエース（雪印乳
業）／リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（25/75）300μｌづ
つを各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を
吸い取った後、各ウェルを0.01％ポリソルベート80を含
むリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｐ−PBS）で３回洗浄し、
次いで125I標識OCIFサンプルあるいはOCIF標準品を添加
したブロックエース／リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（25
/75）300μｌづつを各ウェルに加え、室温で２時間放置
した。この液を吸い取った後、Ｐ−PBS 200μｌで各ウ
ェルを６回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ
抗OCIFポリクローナル抗体を含むブロックエース（雪印
乳業）／リン酸塩緩衝生理食塩水溶液（25/75）100μｌ
づつを各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液
を吸い取った後、Ｐ−PBS 200μｌで各ウェルを６回洗
浄した。TMB溶液（TMB Soluble Reagent,High Sensitiv
ity,Scytek社）100μｌづつを各ウェルに加え、室温で
２−３分放置した後、停止液（Stopping Reagent,Scyte
k社）100μｌづつを各ウェルに加えた。各ウェルの490n
mにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し
た。OCIF標準品を用いて作製した検量線より、125I標識
OCIFの濃度を求めた。
（３）OCIFの骨芽細胞あるいは脾臓細胞への結合試験 マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2あるいは脾臓
細胞をそれぞれ4x104cell/ml及び2x106cell/mlの濃度に
なるように、10-8M活性型ビタミンD3（Calcitriol）及
び10-7Mデキサメサゾン添加あるいは無添加の10％牛胎
児血清（FBS）を含むα−MEM培地に懸濁させ、この培地
1mlずつを24ウェルマイクロ プレートに播種した。細
胞をCO2インキュベーター中で４日間培養しα−MEM培地
で洗浄した後、上記の125I標識OCIF（モノマー型又はダ
イマー型）20ng/mlを加えた結合試験用培地（0.2％牛血
清アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.2％ NaN3を加えた
α−MEM培地）200μｌを各ウェルに加えた。又、別のウ
ェルには、８μg/mlrOCIF（400倍濃度）を更に添加した
結合試験用培地を200μg/ml加え、非特異的吸着量測定
に供した。CO2インキュベーター中で１時間培養した
後、1mlのリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで３回洗浄した。
この際、脾臓細胞は浮遊細胞であるため、24ウェルプレ
ートを遠心分離しながら、各ウェルの細胞を洗浄した。
洗浄後、0.1N NaOH溶液500μｌを各ウェルに加え、室温
に10分間放置することにより細胞を溶解させ、細胞に結
合したRI量をガンマーカウンターで測定した。125I標識
OCIFは、培養した脾臓細胞には結合せず、第２図に示し
たように、活性型ビタミンD3で培養した骨芽細胞様スト
ローマ細胞にのみ特異的に結合した。このことから、本
発明蛋白質は活性型ビタミンD3とデキサメサゾンにより
骨芽細胞様ストローマ細胞上に誘導される膜結合蛋白質
であることが明らかになった。
〔実施例５〕 本発明蛋白質の生物活性 （１）骨芽細胞様ストローマ細胞の破骨細胞形成支持能 骨芽細胞の破骨細胞形成支持能は、形成される破骨細
胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（TRAP活性）
を測定することによって評価した。即ち、ddyマウス
（８−12週齢）の脾臓細胞（2x105 cells/100μl/wel
l）とマウス骨芽細胞様ストローマ細胞ST2（5x103 cell
s/100μl/well）を10-8M活性型ビタミンD3、10-7Mデキ
サメサゾン、及び10％牛胎仔血清を加えたα−MEM培地
に懸濁させ、96ウェルプレートに播種した。CO2インキ
ュベーター中で１週間培養した後、各ウェルをリン酸塩
緩衝生理食塩水で洗浄し、更に100μｌのエタノール／
アセトン（1:1）を加えて、室温で１分間固定した。固
定後、5.5mM p−nitrophenol phosphateと10mM酒石酸ナ
トリウムを含む50mMクエン酸緩衝液、pH 4.5、100μｌ
を各ウェルに加え、室温で15分間反応させた。反応後、
0.1N NaOH溶液を各ウェルに添加し、405nmの吸光度をマ
イクロプレートリーダーで測定した。RIKEN CELL BANK
から購入した後の継代数約10代のST2細胞と継代数約40
代のST2細胞の破骨細胞形成支持能を試験した結果を第
３図に示す。この結果から、継代数の多いST2細胞は破
骨細胞形成支持能が高いことが明らかになった。
（２）活性型ビタミンD3及びデキサメサゾン存在下での
培養における骨芽細胞様ストローマ細胞膜上の本発明蛋
白質発現の経時変化と共培養系における破骨細胞形成の
経時変化 実施例４−（３）と同様に、骨芽細胞様ストローマ細
胞株ST2を活性型ビタミンD3及びデキサメサゾン存在下
で７日間培養した。OCIF結合試験は、実験例４−（１）
に記載した125I標識OCIF（モノマータイプ）を用いて行
った。非特異的結合は400倍濃度の非標識OCIFを用いて
125I標識OCIFのST2細胞への結合を競合させることによ
り測定した。その結果、活性型ビタミンD3とデキサメサ
ゾンにより、培養日数の経過と共に125I標識OCIFの特異
的結合量が上昇した。即ち、第４図及び第５図に示した
ように本発明蛋白質は活性型ビタミンD3によりST2細胞
の表面に培養日数と共に発現し、その発現は培養４日目
に最大に達した。一方、マウス脾臓細胞とST2細胞の共
培養を活性型ビタミンD3存在下で行うことにより、破骨
細胞様の細胞が形成される。破骨細胞のマーカー酵素で
あるTRAP陽性の単核前破骨細胞様細胞は培養３、４日目
には形成され、さらに分化、成熟したTRAP陽性の多核細
胞は培養５、６日目に形成される。本発明蛋白質の発現
の経時変化と破骨細胞形成のそれとは良く相関している
ことが明らかになった。
（３）共培養期間において、種々の培養期間のみOCIF処
理した場合の破骨細胞形成抑制効果 本発明蛋白質が破骨細胞形成に関与する因子であるこ
とを更に明確にするために、前述の実施例５−（２）に
おける６日間の共培養期間において、種々の培養期間
（各２日間、但し５日目のみ１日間）の細胞を、100ng/
mlのOCIFで処理した。その結果、第６図に示したよう
に、ST2細胞上に最も本発明蛋白質が発現される培養48
−96時間目でのOCIF処理が最も効果的に破骨細胞の形成
を抑制した。即ち、OCIFは本発明蛋白質を介してST2細
胞に結合することにより、破骨細胞形成を抑制すること
が明らかになった。
以上の結果から、本発明蛋白質は活性型ビタミンD3と
デキサメサゾンにより骨芽細胞様ストローマ細胞膜上に
誘導され、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因
子としての生物活性（作用）を有することが明らかにな
った。
〔実施例６〕125 I標識OCIFと本発明蛋白質とのクロスリンキング試験 本発明蛋白質の存在をさらに確認するため、125I標識
OCIFと本発明蛋白質とのクロスリンキングを行った。実
施例４−（３）と同様にマウス骨芽細胞様細胞株ST2を
活性型ビタミンD3及びデキサメサゾン存在下及び非存在
下で４日間培養した。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水1m
lで洗浄した後、上記の125I標識OCIF（モノマー型）25n
g/ml、又はWO96/26217号公報にある配列表配列番号76記
載の蛋白質を動物細胞で発現させ上記の方法で標識する
ことにより得られた125I標識OCIF−CDD1 40mg/mlを加え
た結合試験用培地（0.2％牛血清アルブミン、20mM Hepe
s緩衝液、0.2％ NaN3、及び100μg/mlヘパリンを加えた
α−MEM培地）200μｌを添加した。又、別のウェルに
は、400倍濃度のOCIFを更に添加した結合試験用培地を
添加し、非特異的吸着試験に供した。CO2インキュベー
ター中で１時間培養した後、100μg/mlヘパリンを加え
たリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで３回洗浄した。これら
のウェルに100μg/mlのクロスリンキング剤、DSS（Disu
ccinimidyl suberate、Pierce社）を溶解させリン酸塩
緩衝生理食塩水500μｌを加え、０℃で10分間反応させ
た。これらのウェルの細胞を０℃に冷却したリン酸塩緩
衝生理食塩水1mlで２回洗った後、１％ Triton X−10
0、2mM PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride）、10μ
M pepstatin、10μM leupeptin、10μM antipain、及び
2mM EDTAを加えた20mM Hepes緩衝液100μｌを各ウェル
に加え室温で30分間放置して細胞を溶解させた。これら
のサンプル15μｌを常法により非還元条件下でSDS化し
た後、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動用ゲル（４−2
0％ポリアクリルアミドグラジエント、第一化学社）を
用いて泳動させた。泳動後、ゲルを乾燥させ、BioMax M
Sフィルム（Kodak社）とBioMax MS増感スクリーン（Kod
ak社）を用いて−80℃で24時間感光させた。感光させた
フィルムを常法により現像した。125I標識OCIF（モノマ
ー型、60kDa）を用いた場合には分子量約90,000−110,0
00のクロスリンクされた蛋白質が検出された。又、125I
標識OCIF−CDD1（31 kDa）を用いた場合、第７図に示す
ように約70−80kDa（平均78 kDa）のクロスリンクされ
た蛋白質が検出された。
〔実施例７〕 ST細胞上に発現する本発明蛋白質のScatchard Plotによ
る解析 上記の125I標識OCIF（モノマー型）を1,000pMになる
ように加えた結合試験用培地（0.2％牛血清アルブミ
ン、20mM Hepes緩衝液、0.2％ NaN3を加えたα−MEM培
地）を調製し、結合試験用培地を用い、1/2希釈倍率で
段階的に希釈した。又、非特異的な結合を求めるため、
これらの溶液に更に400倍濃度の未標識モノマー型OCIF
を添加した溶液を調製した。調製したこれらの溶液200
μｌを10-8M活性型ビタミンD3（Calcitriol）と10-7Mデ
キサメサゾン存在下で４日間培養した上記のST2細胞
（約10継代目）のウェルに加え、実施例４−（３）と同
様の方法で125I標識OCIFの結合を試験した。得られた結
果を常法に従ってScatchard Plotし、OCIFとOCIF結合蛋
白質の解離定数とST2細胞当たりのOCIF結合蛋白質の個
数（サイト数）を求めた。その結果、OCIFと本発明蛋白
質の解離定数は280pM、ST2細胞当たりのOCIF結合蛋白質
のサイト数は約33,000個／細胞であった。又、実施例５
−（１）で記載したように、約40継代培養したST2細胞
は破骨細胞形成支持能が10継代培養したST2細胞よりも
高かったことから、前者のST2細胞上に発現した本発明
蛋白質のサイト数を測定したところ、サイト数が58,000
個／細胞であり、明らかに10継代培養したST2細胞より
も多く、本発明蛋白質の発現量の多寡がST2細胞による
破骨細胞形成支持能の強弱に繋がっていることが明らか
になった。このことは、本発明蛋白質は破骨細胞の分
化、成熟を支持又は促進する因子であることを示す。
〔実施例８〕 OBMcDNAのクローニング （１）マウスST2細胞からのRNAの抽出 マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2（RIKEN CELL
BANK,RCB0224）は、10％牛胎児血清を含むα−MEM培地
（ギブコBRL社）を用いて培養した。付着細胞用225cm2T
−フラスコでコンフルエントになるまで培養したST2細
胞を、トリプシン処理してＴ−フラスコから剥がし洗浄
した後、５枚の225cm2T−フラスコに移し、10-8M活性化
ビタミンD3（Calcitriol、和光純薬社）、10-7Mデキサ
メサゾン、及び10％牛胎児血清を添加したα−MEM培地
を各々60mlづつ加えてCO2インキュベーター中で５日間
培養した。培養したST2細胞からISOGEN（和光純薬社）
を用いて総RNAを抽出した。総RNA約600μｇからOligo
（dT）−celluloseカラム（5'−3'Prime社）を用いてポ
リA+RNAを調製した。約８μｇのポリA+RNAを得た。
（２）発現ライブラリーの構築 実施例８−（１）で得られたポリA+RNA2μｇからGrea
t Lengths cDNA Synthesis kit（Clontech社）を用い、
その説明書に従い二本鎖cDNAを合成した。即ち、ポリA+
RNA2μｇとOligo（dT）25（dN）プライマーを混合し蒸
留水を加え最終容量を6.25μｌとし、70℃で３分保温
後、氷中で２分冷却した。この溶液に蒸留水2.2μｌ、5
X First−strand buffer 2.5μｌ、100mM DTT（ジチオ
スレイトール）0.25μｌ、PRIME RNase Inhibitor（1U/
ml）（5'−3'Prime社）0.5μｌ、５倍希釈した［α−32
P］dCTP（アマシャム社、3000Ci/mmol、２μCi/μｌ）
0.5μｌ、dNTP（各20mM）0.65μｌ、MMLV（RNaseH-）逆
転写酵素1.25μｌ（250ユニット）を加え、42℃で90分
保温した。さらに、蒸留水を62.25μｌ、5X second−st
rand buffer 20μｌ、dNTP（各20mM）0.75μｌ、Second
−strand enzyme cocktail 5μｌを添加し、16℃で２時
間保温した。この反応液にT4DNA polymerase 7.5ユニッ
トを加え、16℃でさらに30分保温後0.2M EDTA 5μｌ添
加して反応を停止し、フェノール・クロロフォルム処理
後、エタノール沈殿を行った。この二本鎖cDNAの末端に
EcoR I−Sal I−Not Iリンカー（Clontech社）を付加し
末端をリン酸化した。サイズフラクショネーション用カ
ラムにより500bp以上のcDNAを分離し、エタノール沈殿
を行った。沈殿したDNAを水に溶解し、あらかじめ制限
酵素EcoR I（宝酒造社）切断及びCIAP（ウシ小腸アルカ
リフォスファターゼ、宝酒造社）処理して調製したpcDL
−SR α296（Molecular and Cellular Biology,Vol.8,p
p466−472,1988）に挿入した。
（３）OCIFとの結合を指標とした発現ライブラリーのス
クリーニング 実施例８−（２）で得られたDNAを用い大腸菌、XL2 B
lue MRF'（東洋紡社）を形質転換し、１ウェルあたり約
100コロニーとなるように細胞培養用24ウェルプラスチ
ックプレートに調製したＬカーベニシリン寒天培地（１
％トリプトン、0.5％イーストエキス、１％NaCl、60μg
/mlカーベニシリン、1.5％寒天）上に増殖させた。各ウ
ェル中の形質転換株を3mlのTerrific Brothアンピシリ
ン培地（1.2％トリプトン、2.4％イーストエキス、0.4
％グリセロール、0.017M KH2PO4、0.072M K2HPO4,100μ
g/mlアンピシリン）に懸濁し、37℃で一晩振盪培養し
た。遠心により集菌しQIAwell kit（QIAGEN社）を用い
てプラスミドDNAを調製した。260nmにおける吸光度によ
りDNA含量を測定し、エタノール沈殿により濃縮し、200
ng/μｌとなるように蒸留水に溶解した。この様にして
それぞれ約100個のコロニーから由来するDNAプールを50
0プール調製し、COS−７細胞（RIKEN CELL BANK,RCB053
9）へのトランスフェクションに用いた。COS−７細胞を
24ウェルプレートに8X104細胞／ウェルとなるように播
種し、10％牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて、CO2イ
ンキュベーター中で37℃にて一晩培養した。翌日、培地
を除いた後、無血清DMEM培地で細胞を洗浄した。トラン
スフェクション用試薬リポフェクトアミン（ギブコ社BR
L社）添付のプロトコールに従い、予めOPTI−MEM培地
（ギブコBRL社）を用いて希釈しておいた前記プラスミ
ドDNAとリポフェクトアミン（ギブコBRL社）を混合し、
15分後この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用いたDN
A及びリポフェクタミンの量はそれぞれ１μｇ及び４μ
ｌとした。５時間後、培地を除去し、1mlの10％牛胎児
血清を含むDMEM培地（ギブコBRL社）を添加し、CO2イン
キュベーター中（５％CO2）、37℃で２−３日培養し
た。上記の様にトランスフェクトし２−３日培養したCO
S−７細胞を無血清DMEM培地で洗浄した後、125I標識し
たOCIF 20ng/mlを加えた結合試験用培地（0.2％牛血清
アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.1mg/ml heparin及び
0.02％ NaN3を加えた無血清DMEM培地）200μｌを各ウェ
ルに加えた。CO2インキュベーター中（５％CO2）で37℃
１時間培養した後、細胞を0.1mg/ml heparinを含むリン
酸塩緩衝生理食塩水500μｌで２回洗浄した。洗浄後、
0.1N NaOH溶液500μｌを各ウェルに加え、室温に10分間
放置することにより細胞を溶解させ、各ウェル中の125I
の量をガンマーカウンター（パッカード社）で測定し
た。計500プールをスクリーニングすることにより、OCI
Fと特異的に結合する蛋白質をコードするcDNAを含むDNA
プール１つを分離した。さらに本発明のcDNAを含むDNA
プールを細分化し、前記と同様のトランスフェクション
とスクリーニング操作を繰り返すことにより、OCIFと結
合する蛋白質をコードするcDNAを単離した。このcDNAを
含むプラスミドをpOBM291を名付けた。このプラスミド
を含む大腸菌は、pOBM291として通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP−5953とし
て平成９年５月23日に寄託されている。OCIFの125I標識
ならびにELISAによる125I標識OCIFの定量法を以下に示
す。OCIFはヨードジェン（Iodogen）法により125I標識
した。2.5mg/ml Iodogen−クロロホルム溶液20μｌを1.
5mlエッペンドルフチューブに移し、40℃でクロロホル
ムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調
製した。このチューブを0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液
（Na−Pi,pH 7.0）400μｌで３回洗浄した後、0.5M Na
−Pi,pH 7.0,5μｌを加えた。このチューブにNa−125I
溶液（Amersham社、NEZ−033H20）1.3μｌ（18.5MBq）
を加えた後、直ちに1mg/ml OCIF溶液（モノマー型ある
いはダイマー型）10μｌを加え、ボルテクスミキサーで
攪拌した後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め
10mg/ml沃化カリウム、0.5M Na−Pi,pH 7.0溶液80μｌ
と５％牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水
（BSA−PBS）５μｌを添加しておいたチューブに移し攪
拌した。この溶液をBSA−PBSで平衡化しておいたスピン
カラム（1ml,G−25fine,ファルマシア社）に負荷し、2,
000rpmで５分間遠心した。カラムから溶出された画分に
BSA−PBSを400μｌ加え攪拌した後、２μｌを取り、そ
の放射能をガンマーカウンターで測定した。このように
して調製した125I標識OCIF溶液の放射化学純度は10％ T
CAにより沈殿する画分の放射能を測定することにより求
めた。また、125I標識OCIF溶液のOCIF生物活性は、WO96
/26217号公報記載の方法に従い測定した。また、125I標
識OCIF濃度は、以下のようにしてELISAにより測定し
た。即ち、WO96/26217号公報記載のウサギ抗OCIFポリク
ローナル抗体を２μg/mlになるように溶解させた50mM N
aHCO3,pH 9.6を100μｌずつ96ウェルイムノプレート（N
unc,MaxiSorpTM）の各ウェルに加えて４℃で一夜放置し
た。この液を吸い取った後、ブロックエース（雪印乳
業）とリン酸塩緩衝生理食塩の混合水溶液（混合比25:7
5）（Ｂ−PBS）を200μｌずつ各ウェルに加え、室温で
２時間放置した。この液を吸い取った後、各ウェルを0.
01％ Polysorbate80を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｐ
−PBS）で３回洗浄し、次いで125I標識OCIFサンプルあ
るいはOCIF標準品を添加したＢ−PBSを100μｌずつ各ウ
ェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取っ
た後、Ｐ−PBS 200μｌで各ウェルを６回洗浄した。パ
ーオキシダーゼ標識したウサギ抗OCIFポリクローナル抗
体をＢ−PBSで希釈した溶液を100μｌずつ各ウェルに加
え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、Ｐ
−PBS 200μｌで各ウェルを６回洗浄した。TMB溶液（TM
B Soluble Reagent,High Sensitivity,Scytek社）を100
μｌずつ各ウェルに加え、室温で２−３分放置した後、
停止液（Stopping Reagent,Scytek社）を100μｌずつ各
ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマ
イクロプレートリーダーで測定した。OCIF標準品を用い
て作製した検量線より125I標識OCIFの濃度を求めた。
（４）OBMの全アミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配
列の決定 実施例８−（３）で得られたOBMcDNAの塩基配列を、
タックダイデオキシターミネーターサイクルシークエン
シングキット（パーキンエルマー社）を用いて決定し
た。即ち、pOBM291を鋳型とし、直接挿入断片の塩基配
列を決定した。また、pOBM291を制限酵素EcoR Iで切断
し得られた約1.0kbならびに約0.7kbの断片をプラスミド
pUC19（宝酒造社）のEcoR I部位に挿入し、それらの断
片の塩基配列も決定した。用いたプライマーは、pcDL−
SR α296の挿入断片DNAの塩基配列を決定するためのプ
ライマーSRR2、プラスミドpUC19の挿入断片DNAの塩基配
列を決定するためのプライマーM13PrimerM3、M13Primer
RV（ともに宝酒造社）及びOBMcDNAの塩基配列に基づい
て設計された合成プライマーOBM＃８である。これらプ
ライマーの配列を配列表配列番号３〜６に示す。
また、決定されたOBMcDNAの塩基配列を配列番号２
に、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１
にそれぞれ示す。
〔実施例９〕 本発明cDNAにコードされる蛋白質の発現 プラスミドpOBM291を６ウェルプレートの各ウェル中
でCOS−７細胞にリポフェクトアミンを用いトランスフ
ェクションし、10％牛胎児血清を含むDMEM培地中で２日
間培養した。５％透析牛胎児血清を添加した、システイ
ン・メチオニン不含DMEM（大日本製薬社）に培地交換し
（800μl/well）15分培養した後、Express Protein Lab
eling Mix（NEN社、10mCi/ml）を14μｌ添加した。４時
間培養後、10％牛胎児血清を含むDMEM培地を200μｌ加
え１時間培養した。細胞をPBSで２回洗浄後、１％ Trit
onX−100、１％ bovine hemoglobin、10μg/ml leupept
in、0.2TIU/ml aprotinin、1mM PMSFを含むTSAバッファ
ー（0.14M NaCl、0.025％ NaN3を含む10mM Tris−HCl
（pH 8.0））を0.5ml加え、氷上１時間静置した。ピペ
ッティングにより細胞を破砕した後、４℃で3000Xg10分
間遠心分離し上清を得た。この上清100μｌに200μｌの
希釈バッファー（0.1％ TritonX−100、0.1％ bovine h
emoglobin、10μg/ml leupeptin、0.2TIU/ml aprotini
n、1mM PMSFを含むTSAバッファー）を加え、protein A
Sepharose（50μｌ）とともに４℃で１時間振とうさせ
た後、４℃で1500Xgにて１分間遠心分離し上清を回収す
ることにより、protein A Sepharoseに非特異的に吸着
する分画を除いた。この上清にOCIF（１μｇ）を加え、
４℃で１時間振とうさせながらOBMとOCIFを結合させた
後、抗OCIFポリクローナル抗体（50μｇ）を加えて４℃
で１時間振とうした。これにprotein A Sepharose（10
μｌ）を加えさらに４℃で１時間振とうした。４℃で15
00Xgにて１分間遠心分離し沈澱画分を回収した。４℃、
1500Xgで１分間の遠心分離による沈澱の洗浄を、希釈バ
ッファーで２回、bovine hemoglobinを含まない希釈バ
ッファーで２回、TSAバッファーで１回、50mM Tris−HC
l（pH 6.5）で１回行った。洗浄後、沈澱に10％βメル
カプトエタノールを含むSDSバッファー（0.125M Tris−
HCl、４％ドデシル硫酸ナトリウム、20％グリセロー
ル、0.002％ブロモフェノールブルー、pH 6.8）を加
え、100℃で５分加熱後SDS−PAGE（12.5％ポリアクリル
アミドゲル、第一化学社）を行った。常法によりゲルを
固定した後、Amplify（アマシャム社）により、アイソ
トープのシグナルを増強した後、Bio Max MRフィルム
（KODAK社）を用いて−80℃で感光させた。結果を第８
図に示す。本発明cDNAにコードされる蛋白質の分子量は
約40,000であることが示された。
〔実施例10〕 本発明cDNAにコードされる蛋白質とOCIFとの結合 プラスミドpOBM291を24ウェルプレートの各ウェル中
でCOS細胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェ
クトし、その細胞を２−３日培養したのち無血清DMEM培
地で洗浄し、これに125I標識したOCIF20ng/mlを加えた
結合試験用培地（0.2％牛血清アルブミン、20mM Hepes
緩衝液、0.1mg/ml heparin、0.2％ NaN3を加えた無血清
DMEM培地）200μｌを加えた。また別のウェルには、125
I標識したOCIF20ng/mlに加えて８μg/mlの非標識OCIFを
更に添加した結合試験用培地を200μｌ加えて実験を行
った。CO2インキュベーター中（５％ CO2）で37℃にて
１時間培養した後、細胞を0.1mg/mlのheparinを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水500μｌで２回洗浄した。洗浄後、
0.1N NaOH溶液500μｌを各ウェルに加え、室温に10分間
放置することにより細胞を溶解させ、ウェル中の125Iの
量をガンマーカウンターで測定した。その結果、第９図
に示したようにプラスミドpOBM291をトランスフェクト
した細胞にのみ125I標識したOCIFが結合することが確認
された。また、その結合は、400倍濃度のOCIFを添加す
ることで著しく阻害されることが確認された。以上の結
果から、プラスミドpOBM291上のcDNAにコードされる蛋
白質、OBMは、COS−７細胞表面でOCIFと特異的に結合す
ることが明らかとなった。
〔実施例11〕125 I標識したOCIFと本発明cDNAにコードされる蛋白質と
のクロスリンキング試験 本発明cDNAにコードされる蛋白質の性質をさらに詳し
く解析するため、125I標識したモノマー型OCIFと本発明
cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行っ
た。実施例８−（３）に記載の方法に従ってプラスミド
pOBM291をCOS−７細胞にトランスフェクトした後、上記
の125I標識したOCIF（25ng/ml）を加えた結合試験用培
地200μｌを添加した。また、別のウェルには、125I標
識したOCIFに加え400倍濃度の非標識OCIFをさらに添加
した結合試験用培地を加えた。CO2インキュベーター中
（５％ CO2）で37℃１時間培養した後、細胞を0.1mg/ml
heparinを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500μｌで２回
洗浄した。この細胞に100μg/mlのクロスリンキング
剤、DSS（Disuccinimidyl suberate,Pierce社）を溶解
させたリン酸塩緩衝生理食塩水500μｌを加え、０℃で1
0分間反応させた。これらのウェルの細胞を０℃に冷却
したリン酸緩衝生理食塩水1mlで２回洗った後、この細
胞に１％ Triton X−100（和光純薬社）、2mM PMSF（ph
enylmethylsulfonyl fluoride、シグマ社）、10μM pep
statin（和光純薬社）、10μM leupeptin（和光純薬
社）、10μM antipain（和光純薬社）、及び2mM EDTA
（和光純薬社）を含む20mM Hepes緩衝液100μｌを加
え、室温に30分間放置して細胞を溶解させた。これらの
サンプル15μｌを常法により還元条件下でSDS化した
後、SDS−電気泳動用ゲル（４−20％ポリアクリルアミ
ドグラジエント、第一化学社）を用いて泳動した。泳動
後、ゲルを乾燥させ、BioMax MSフィルム（Kodak社）と
BioMax MS増感スクリーン（Kodak社）を用いて−80℃で
24時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現
像した。この結果、125I標識モノマー型OCIFと本発明cD
NAによりコードされる蛋白質をクロスリンクさせること
により、第10図に示すように分子量約90,000−110,000
のバンドが検出された。
〔実施例12〕 ノーザンブロットによる解析 付着細胞用25cm2Tフラスコでコンフルエントになるま
で培養したST2細胞を、トリプシン処理してＴフラスコ
から剥がし洗浄した後、１枚の225cm2Tフラスコに播種
し、10-8M活性化ビタミンD3、10-7Mデキサメサゾン、及
び10％牛胎児血清を添加したα−MEM培地各々60mlを加
えてCO2インキュベーター中で４日間培養した。培養し
たST2細胞からISOGEN（和光純薬社）を用いて総RNAを抽
出した。また、活性化ビタミンD3とデキサメサゾン非存
在下で培養したST2細胞からも上記の方法で総RNAを抽出
した。各総RNA20μｇ（4.5μｌ）にそれぞれ2.0μｌの5
Xゲル泳動緩衝液（0.2Mモルホリノプロパンスルホン
酸、pH 7.0、50mM酢酸ナトリウム、5mM EDTA）、3.5μ
ｌのホルムアルデヒド及び10.0μｌのホルムアミドを加
え55℃で15分保温後、電気泳動に供した。電気泳動用の
ゲルは1.0％アガロース、2.2M脱イオン化ホルムアルデ
ヒド、40mMモルホリノプロパンスルホン酸pH 7.0、10mM
酢酸ナトリウム、1mM EDTAの組成で調製した。また、電
気泳動は40mMモルホリノプロパンスルホン酸、pH 7.0、
10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTAの緩衝液中で行った。電
気泳動後、RNAをナイロンメンブレンにトランスファー
した。pOBM291を制限酵素EcoR Iで切断して得られた、
約1.0kbのDNA断片を、メガプライムDNAラベリングキッ
ト（アマシャム社）及びα−32P−dCTP（アマシャム
社）を用いて標識したものをプローブとしてハイブリダ
イゼーションを行った。その結果、第11図に示すよう
に、ST2細胞では活性化ビタミンD3とデキサメサゾンの
存在下で培養した場合に、本発明cDNAにコードされる蛋
白質（OBM）の遺伝子発現が強く誘導されていることが
明らかとなった。
〔実施例13〕 本発明cDNAにコードされる蛋白質の破骨細胞形成支持能 実施例８−（３）に記載の方法でCOS細胞にpOBM291を
トランスフェクトした。３日後トリプシナイズした細胞
をリン酸塩緩衝生理食塩水で一回遠心洗浄したのち、１
％パラフォルムアルデヒドを含むPBSに細胞をサスペン
ドしながら室温で５分間固定し、PBSにて６回遠心洗浄
した。10-8M活性化ビタミンD3、10-7Mデキサメサゾン、
10％牛胎児血清を含むα−MEM培地にて調製した1X106個
/mlのマウス脾臓細胞及び4x104個/mlのST2細胞を24ウェ
ルプレートにそれぞれ700μｌ、350μｌ添加したのちTC
インサート（Nunc社）を各ウェルにセットした。上記培
地にて段階希釈した固定化COS細胞（350μｌ）及びOCIF
（50μｌ）をTCインサート中に添加して37℃で６日間培
養した。この結果、OCIFによる破骨細胞形成阻害活性
が、本発明cDNAにコードされる蛋白質により抑制される
ことが明らかとなった。
〔実施例14〕 分泌型OBMの発現 （１）分泌型OBM発現プラスミドの構築 OBM HF（配列表配列番号７）とOBM XR（配列表配列番
号８）をプライマー、pOBM291を鋳型としPCR反応を行っ
た。この生成物を、アガロースゲル電気泳動で精製した
後、制限酵素Hind III、EcoR Iで切断し、さらにアガロ
ースゲル電気泳動で精製した。この精製断片（0.6kb）
を、pSec TagA（インビトローゲン社）のHind III/EcoR
V断片（5.2kb）と、OBM cDNAのEcoR I/PmaC I断片（0.
32kb）とともにライゲーションキットver.2（宝酒造
社）を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を
用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシ
リン耐性株より、アルカリSDS法によりプラスミドを精
製し、制限酵素で切断することによりpSec TagAに0.6Kb
と0.32kbの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。
さらにこのプラスミドにつきダイターミネーターサイク
ルシークエンシングFSキット（パーキン−エルマー社）
を用いてシークエンスを行い、このプラスミドが分泌型
OBMをコードする配列（塩基配列：配列表配列番号２の3
38〜1355番、アミノ酸配列：配列表配列番号１の72〜31
6番）を持っていることを確認した。このプラスミドを
制限酵素Nhe I、Xho Iで切断した後、分泌型OBM cDNAに
相当する断片（1.0kb）をアガロースゲル電気泳動で回
収した。この断片をライゲーションキットを用いて発現
ベクターpCEP4（インビトローゲン社）のNhe I/Xho I断
片（10.4kb）に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌
DH5 αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株よ
り、アルカリSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵
素で切断して解析することにより、目的の構造を持った
分泌型OBM発現プラスミド（pCEP sOBM）を持つ大腸菌株
を選び出した。pCEP sOBMを持つ大腸菌株を培養し、キ
アフィルタープラスミドミディキット（キアゲン社）を
用いてpCEP sOBMを精製した。
（２）分泌型OBMの発現 293−EBNA細胞を10％FCSを含むIMDM（IMDM−10％FC
S）に懸濁し、コラーゲンコートした24ウェルプレート
（住友ベークライト社）に2x105個/2ml/ウェルになるよ
うに播種し、一晩培養した。この細胞に１μｇのpCEP s
OBM又はpCEP4をリポフェクトアミン（ギブコ社）４μｌ
を用いて形質導入し、0.5mlの無血清IMDM又はIMDM−10
％FCS中でさらに２日間培養し、その培養上清を回収し
た。分泌型OBMの培養上清中での発現は、以下のように
して確認した。培養上清に最終濃度0.1Mになるよう炭酸
水素ナトリウムを加えた後、培養液を96ウェルプレート
に添加し、４℃で一晩放置し、培養上清中のOBMを96ウ
ェルプレートに固相化した。このプレートをPBSで４倍
希釈したブロックエース（雪印乳業社）溶液（Ｂ−PB
S）で室温に２時間放置しブロッキングした後、Ｂ−PBS
で希釈した３−100ng/mlのOCIFを各ウェルに100μｌず
つ加えて37℃で２時間放置した。0.05％ Tween 20を含
むPBS（PBS−Ｔ）でプレートを洗浄した後、Ｂ−PBSで
希釈したWO96/26217号記載のパーオキシダーゼ標識ウサ
ギ抗OCIFポリクローナル抗体を各ウェルに100μｌずつ
添加し、37℃で２時間放置した。PBS−Ｔで各ウェルを
６回洗浄した後、TMB溶液（TMB Soluble Reagent,High
Sensitivity,Scytek社）を100μｌずつ各ウェルに加
え、室温で約10分放置した後、停止液（Stopping Reage
nt,Scytek社）を100μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェ
ルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー
で測定した。結果を第12図に示す。pCEP sOBMを形質導
入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加
したOCIFの濃度に依存して450nmの吸収が増加したが、
ベクターpCEP4を形質導入した細胞の培養上清を固定化
した場合は吸収の増加はみられなかった。又、固定化に
用いる培養上清の割合を５−90％の範囲で種々に変化さ
せ、一定濃度のOCIF（50ng/ml）を添加した際の実験の
結果を第13図に示す。pCEP sOBMを形質導入した細胞の
培養上清を固相化したプレートでは、培養上清の割合が
高くなるほど450nmの吸収が増加したが、ベクターpCEP4
を形質導入した細胞の培養上清を固定化したプレートで
は、吸収の増加は見られなかった。以上の結果より、分
泌型OBMが、pCEP sOBMを形質導入した細胞の培養上清中
に生産されていることが確認された。
〔実施例15〕 チオレドキシン−OBM融合蛋白質（Trx−OBM）の発現 （１）チオレドキシン−OBM融合蛋白質（Trx−OBM）発
現ベクターの構築 10μｌの10X ExTaqバッファー（宝酒造社）、８μｌ
の10mMdNTP（宝酒造社）、77.5μｌの滅菌蒸留水、２μ
ｌのpOBM291水溶液（10ng/μｌ）、１μｌのプライマー
OBM3（100pmol/μｌ、配列表配列番号９）、１μｌのプ
ライマーOBMSalR2（100pmol/μｌ、配列表配列番号1
0）、0.5μｌのExTaq（5u/μｌ）（宝酒造社）を混合し
マイクロ遠心管中でPCR反応を行った。95℃５分、50℃
１秒、55℃１分、74℃１秒、72℃５分の反応後、96℃１
分、50℃１秒、55℃１分、74℃１秒、72℃３分の反応を
25サイクル行った。１％アガロースゲル電気泳動によ
り、反応液全量から約750bpのDNA断片をQIAEX II gel e
xtraction kit（QIAGEN社）を用いて精製した。精製し
たDNA断片全量を制限酵素Sal I,EcoR I（宝酒造社）で
切断した後、1.5％アガロースゲル電気泳動を行い約160
bpのDNA断片（断片１）を精製し20μｌの滅菌蒸留水に
溶解した。同様に、４μｇのpOBM291を制限酵素BamH I,
EcoR I（宝酒造社）で切断し得られた約580bpのDNA断片
（断片２）、及び２μｇのpTrXFus（InVitrogen社）を
制限酵素BamH I,Sal I（宝酒造社）で切断し得られた約
3.6kbのDNA断片（断片３）をそれぞれ精製し、それぞれ
を20μｌの滅菌蒸留水に溶解した。DNA断片の精製にはQ
IAEX II gel extraction kitを用いた。断片１、断片
２、断片３をDNAligation kit ver.2（宝酒造社）を用
い、16℃で２時間30分保温することにより結合させた。
ライゲーション反応液を用い大腸菌GI724株（インビト
ローゲン社）をThioFusion Expression System（インビ
トローゲン社）添付のInstruction Manualに記載の方法
で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株
の中から、制限酵素切断により得られるDNA断片地図の
解析並びにDNA配列の決定により、OBMcDNA断片（塩基配
列：配列表配列番号２の350〜1111、アミノ酸配列：配
列表配列番号１の76〜316）がチオレドキシン遺伝子に
同じ読み枠で結合しているプラスミドを持つ菌株を選び
出した。得られた菌株をGI724/pTrxOBM25と名付けた。
（２）大腸菌でのOBMの発現 GI724/pTrxOBM25株及びpTrxFusを持つGI724株（GI724
/pTrxFus）それぞれを2mlのRMG−Amp培地（0.6％Na2HPO
4,0.3％KH2PO4,0.05％NaCl,0.1％NH4Cl1.2％カザミノ酸
（Difco社）、１％グリセロール、1mM MgCl2、100μg/m
lアンピシリン（Sigma社）pH7.4）で30℃で６時間振と
う培養した。菌液0.5mlを50mlのInduction培地（0.6％
Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、0.2
％カザミノ酸、0.5％グルコース、1mM MgCl2、100μg/m
lアンピシリン、pH 7.4）に添加し、30℃で振とう培養
した。OD600nmでの値が約0.5になった時点で最終濃度が
0.1mg/mlになるようにＬ−トリプトファンを添加し、さ
らに30℃での振とう培養を６時間継続した。菌液を3000
×ｇで遠心し菌体を集め、12.5mlのPBS（10mMリン酸バ
ッファー、0.15M NaCl、pH7.4）に懸濁した。懸濁液を
超音波発生装置（Ultrasonics社）にかけ菌体を破砕
し、7000×ｇで30分遠心して上清を集め可溶性蛋白質画
分とした。この可溶性蛋白質画分液10μｌずつを還元条
件下でのSDSポリアクリルアミド（10％）電気泳動に供
した。この結果、GI724/pTrxOBM25の可溶性蛋白質画分
液にはGI724/pTrxFusの可溶性蛋白質画分液には見られ
ない分子量約40kDaのバンドが検出された（第14図）。
よって、チオレドキシンとOBMの融合蛋白質（Trx−OB
M）が大腸菌中で発現していることが確認された。
（３）Trx−OBMのOCIFとの結合能 発現させたTrx−OBMがOCIFと結合することを以下の実
験により確認した。即ち、96ウェルイムノプレート（Nu
nc社）の各ウェルに10mM炭酸水素ナトリウム水溶液で50
00倍に希釈した抗チオレドキシン抗体（インビトローゲ
ン社）を100μｌずつ添加し４℃で一晩放置した。各ウ
ェル中の液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業社）
をPBSで２倍希釈した溶液（BA−PBS）を各ウェルに200
μｌずつ添加し室温で１時間放置した。液を捨てた後、
各ウェルにBA−PBSで段階希釈した上記GI724/pTrxOBM25
由来及びGI724/pTrxFus由来可溶性蛋白質画分液を100μ
ｌずつ添加し室温で２時間放置した。PBS−Ｔで各ウェ
ルを３回洗浄した後、BA−PBSで希釈したOCIF（100ng/m
l）を各ウェルに100μｌずつ添加し室温で２時間放置し
た。PBS−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、BA−PBSで20
00倍希釈したWO96/26217号記載のパーオキシダーゼ標識
ウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を各ウェルに100μｌ
ずつ添加し、２時間室温で放置した。PBS−Ｔで各ウェ
ルを６回洗浄した後、TMB溶液（TMB Soluble Reagent,H
igh Sensitivity,Scytek社）を100μｌずつ各ウェルに
加え、室温で約10分放置した後、停止液（Stopping Rea
gent,Scytek社）を100μｌずつ各ウェルに加えた。各ウ
ェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダ
ーで測定した。結果を第15図に示す。GI724/pTrxFus由
来可溶性蛋白質画分液を添加したものでは添加しなかっ
たものと比べて吸光度に差は認められなかったが、GI72
4/pTrxOBM25由来可溶性蛋白質画分液を添加したもので
は、その添加濃度の増加に依存して吸光度が上昇した。
又、添加する可溶性画分液の希釈割合を一定（１％）に
し、BA−PBSで段階希釈したOCIF（０−100ng/ml）を添
加した場合の実験結果を第16図に示す。GI724/pTrxFus
由来可溶性蛋白質画分液を用いたものではOCIF濃度に係
わりなく吸光度は低いままであったが、GI724/pTrxOBM2
5由来可溶性蛋白質画分液を用いたものでは添加したOCI
F濃度に依存して吸光度が上昇した。この結果より、GI7
24/pTrxOBM25で生産されるTrx−OBMは、OCIFと結合する
能力があることが確認された。
（４）Trx−OBMを生産する大腸菌の大量培養 GI724/pTrxOBM25をRMG−Amp寒天培地（0.6％Na2HP
O4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、２％カザ
ミノ酸、１％グリセロール、1mM MgCl2、100μg/mlアン
ピシリン、1.5％寒天、pH7.4）に白金耳で塗まつし、30
℃で一晩培養した。菌を10mlのInduction培地に懸濁
し、5mlずつを500mlのInduction培地のはいった2L用三
角フラスコ計２本に添加し、30℃で振とう培養した。OD
600nmでの値が約0.5になった時点で最終濃度が0.1mg/ml
になるようにＬ−トリプトファンを添加し、さらに30℃
で振とう培養を６時間継続した。菌液を3000×ｇで20分
間遠心分離して菌体を集め、菌体を160mlのPBSに懸濁し
た。懸濁液を超音波発生装置（Ultrasonics社）にかけ
菌体を破砕し、7000×ｇで30分間遠心して上清を集め可
溶性蛋白質画分とした。
（５）OCIF固定化アフィニティーカラムの調製 TSKgel AF−トレシルトヨパール650（東ソー社）2gと
WO96/26217号に記載の方法で調製した遺伝子組み換え型
OCIF35.0mgを含む1.0Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）4
0mlとを混合し４℃で一晩ゆっくり振とうしカップリン
グ反応を行った。過剰な活性基を不活性化する為、遠心
分離により上清を除去した後、40mlの0.1Mトリス塩酸緩
衝液（pH 7.5）を沈殿した担体に加え、室温で１時間お
だやかに振とうした。0.01％ Polysorbate 80と0.2M Na
Clを含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（pH 3.3）及び0.01
％ Polysorbate 80と0.2M NaClを含む0.1Mクエン酸ナト
リウム緩衝液（pH 2.0）を通液しカラムを洗浄した後、
0.01％ Polysorbate 80を含む10mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH 7.4）で２度洗浄し、平衡化した。
（６）OCIF固定化アフィニティーカラムによるTrx−OBM
の精製 Trx−OBMの精製は、特に断らない限り４℃で行った。
上記のOCIF固定化アフィニティー担体（10ml）と上記実
施例15−（４）記載の可溶性蛋白質画分液（120ml）と
を混合液、50ml遠心管（４本）中で、ローターを用いて
４℃で一晩おだやかに振とうした。この混合液中の担体
をエコノカラム（バイオラッド社、内径1.5cm長さ15c
m）に充填した。0.01％ Polysorbate 80を含むPBS 300m
l、0.01％ Polysorbate 80と2M NaClを含む10mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH 7.0）100ml、及び0.01％ Polyso
rbate 80と0.2M NaClを含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝液
（pH 3.3）100mlを順次通液してカラムを洗浄した。次
に、0.01％ Polysorbate 80と0.2M NaClを含む0.1Mクエ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0）を通液し、カラムに吸
着した蛋白質を溶出した。溶出液は5mlずつ分取した。
分取した画分には、10％容量の2Mトリス溶液（pH 8.0）
を加え、直ちに中和した。溶出液各画分中のTrx−OBMの
有無を上記実施例15−（３）記載の方法（OCIFとの結合
能）により調べた。Trx−OBMを含む画分を集めさらに精
製した。
（７）ゲル濾過によるTrx−OBMの精製 上記実施例15−（６）のTrx−OBMフラクション約25ml
を、Centriplus 10及びCentricon 10（amicon社）を用
いて、約0.5mlに遠心濃縮した。このサンプルを、予め
0.01％Polysorbate 80を含むPBSで平衡化したSuperose
12 HR 10/30カラム（1.0x30cm、ファルマシア社）にか
けた。分離には、0.01％ Polysorbate 80を含むPBSを移
動相として用い、流速0.25ml/minで展開した。カラムか
らの溶出液は0.25mlずつ分取した。分取した画分のTrx
−OBMは、実施例15−（３）記載の方法及びPhast Syste
m（ファルマシア社）を用いたSDS−ポリアクリルアミド
電気泳動（10−15％ポリアクリルアミドゲル、ファルマ
シア社）と銀染色で検出した。純化されたTrx−OBMを含
むフラクション（Fr.20−23）を集め、Trx−OBMの蛋白
質濃度を測定した。蛋白質濃度の測定は、ウシ血清アル
ブミンを標準品として用いDC−protein assay kit（バ
イオラッド社）で行った。
〔実施例16〕 OBMの破骨細胞形成誘導活性 pOBM291及びpcDL−SR α296をリポフェクトアミン
（ギブコ社）を用いてCOS−７細胞にそれぞれトランス
フェクトした。それぞれの細胞を10％FCSを含むDMEMで
１日培養後トリプシン処理し、カバーグラス（15mm丸
形、マツナミ社）を敷いた24ウェルプレートに１ウェル
あたり5X104個の細胞を播種し、さらに２日間培養し
た。培養プレートをPBSで１回洗浄したのち、１％パラ
フォルムアルデヒドを含むPBSを加えて室温で８分間イ
ンキュベートし細胞を固定した。細胞を固定したプレー
トをPBSにて６回洗浄したのち、10-8M活性型ビタミン
D3、10-7Mデキサメサゾン、10％牛胎児血清を含むα−M
EMにて1X106個/mlに懸濁したマウス脾臓細胞を１ウェル
あたり700μｌ添加した。各ウェル上にMillicell PCF
（ミリポア社）をセットし、上記培地にて4x104個/mlに
懸濁したST2細胞をMillicell PCF中に700μｌ添加し37
℃、６日間培養した。培養終了後、Millicell PCFを取
り除き、プレートをPBSで１回洗浄後、アセトン−エタ
ノール溶液（50:50）で１分間細胞を固定した後、LEUKO
CYTE ACID PHOSPHATASEキット（シグマ社）を用いて破
骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファ
ターゼ活性（TRAP活性）を示す細胞のみを染色した。顕
微鏡観察の結果、pcDL−SR α296をトランスフェクトし
たCOS−７細胞を固定したウェル中にはTRAP活性を示す
細胞は全く検出されなかったのに対し、pOBM291をトラ
ンスフェクトした細胞を固定したウェル中には45±18個
（平均±標準偏差、ｎ＝３）のTRAP陽性細胞が観察され
た。又、これらのTRAP陽性細胞に、カルシトニンが結合
することも確認された。これより、OBMには破骨細胞形
成を誘導する活性があることが明らかとなった。
〔実施例17〕 Trx−OBM及び分泌型OBMによる破骨細胞形成誘導活性 マウス脾臓細胞を10-8M活性型ビタミンD3、10-7Mデキ
サメサゾン、10％牛胎児血清を含むα−MEMに2X106個/m
lになるように懸濁し、この懸濁液を24ウェルプレート
に１ウェルあたり350μｌ添加した。精製したTrx−OBM
を上記培地で希釈した溶液（40ng/ml）、pCEP sOBM又は
pCEP4を形質導入した293−EBNA細胞をIMDM−10％FCSで
培養した培養上清を上記培地にて10倍希釈した溶液、又
は上記培地のみをそれぞれ350μｌ上記のウェルに添加
した後、Millicell PCF（ミリポア社）を各ウェルにセ
ットし、上記培地にて懸濁した4x104個/mlのST2細胞をM
illicell PCFに600μｌ添加した。６日間培養した後、M
illicell PCFを取り除き、プレートをPBSで一回洗浄
後、アセトン−エタノール溶液（50:50）で１分間細胞
を固定したのち、LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASEキット
（シグマ社）を用いて酒石酸耐性酸性フォスファターゼ
活性（TRAP活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観
察の結果、Trx−OBMを添加しなかったウェル中にはTRAP
活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、Trx
−OBMを添加したウェルには106±21個（平均±標準偏
差、ｎ＝３）のTRAP陽性細胞が観察された。同様にpCEP
4で形質導入された293−EBNAの培養上清を添加したウェ
ル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったの
に対し、pCEP sOBMで形質導入された293−EBNAの培養上
清を添加したウェルには120±31個（平均±標準偏差、
ｎ＝３）のTRAP陽性細胞が観察された。又、これらのTR
AP陽性細胞に、カルシトニンが結合することも確認され
た。これより、Trx−OBM及び分泌型OBMには、破骨細胞
形成を誘導する活性があることが明らかとなった。
〔実施例18〕 本発明のcDNAにより発現される蛋白質OBMと本発明の天
然型のOCIF結合蛋白質との同一性 （１）ウサギ抗OBMポリクローナル抗体の作製 雄性日本白色ウサギ（体重2.5−3.0kg、北山ラベス社
より入手）３羽に、実施例14−（６）及び（７）記載の
方法により得られた精製OBM（チオレドキシン−OBM融合
蛋白質）200μg/mlをフロイント完全アジュバント（DIF
CO社）と等量混合してエマルジョンとしたものを、１回
1mlずつ皮下免疫した。免疫は１週間間隔で合計６回行
い、最終免疫後10日目に全採血を行った。分離した血清
から抗体を以下の様に精製した。即ち、PBSで２倍希釈
した抗血清に最終濃度が40％（w/v ％）となるように硫
酸アンモニウムを添加して４℃で１時間放置後、8000xg
で20分間遠心分離を行い、沈殿を得た。沈殿を少量のPB
Sに溶解し、PBSに対して４℃で透析した後、Protein G
−Sepharoseカラム（ファルマシア社製）に負荷した。P
BSで洗浄後、0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（pH 3.0）で吸
着した免疫グロブリンＧを溶出し、直ちに1.5Mトリス−
塩酸緩衝液（pH 8.7）で中性pHとした。溶出蛋白質画分
をPBSに対して透析後、280nmにおける吸光度を測定し。
その濃度を決定した（Ｅ１％ 13.5）。西洋ワサビパー
オキシダーゼ標識した抗OBM抗体は、マレイミド活性化
パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて作製し
た。即ち、1mgの精製抗体に80μｇのＮ−スクシンイミ
ド−Ｓ−アセチルチオ酢酸を添加し、室温で30分間反応
させた。これに5mgのヒドロキシルアミンを添加して脱
アセチル化した後、修飾された抗体をポリアクリルアミ
ド脱塩カラムにて分画した。蛋白質画分を1mgのマレイ
ミド活性化パーオキシダーゼと混合し、室温で１時間反
応させ酵素標識抗体を得た。
（２）ウサギ抗OBMポリクローナル抗体による本発明のc
DNAにより発現される蛋白質（OBM）あるいは本発明の天
然型の蛋白質とOCIFとの特異的結合能の阻害 実施例15−（６）及び（７）記載の方法で得られた精
製OBM（チオレドキシン−OBM融合蛋白質）及び実施例２
−（４）の天然型精製OCIF結合蛋白質をそれぞれ0.1M炭
酸水素ナトリウムに２μg/mlとなるように溶解し、それ
ぞれの溶液100μｌずつを96ウェルイムノプレート（Nun
c社製）の各ウェルに加え、４℃で一夜放置した。各ウ
ェルに50％濃度のブロックエースを200μｌずつ加え、
室温で１時間放置した。各ウェルを0.1％ポリソルベー
ト20を含むPBS（P20−PBS）で３回洗浄した後、P20−PB
Sで希釈した25％濃度のブロックエースにウサギ抗OBM抗
体を200μg/mlとなるように溶解し、その抗体溶液ある
いは抗体を含まない25％濃度のブロックエース溶液を10
0μｌずつ各ウェルに添加し、37℃、１時間インキュベ
ートした。各ウェルをP20−PBSで３回洗浄した後、実施
例８−（３）記載の125I標識したOCIF20ng/mlを加えた
結合試験溶液（0.2％牛血清アルブミン、20mM Hepes、
0.1mg/mlヘパリンを加えたP20−PBS）を100μｌずつ各
ウェルに添加した。又、別のウェルには、125I標識した
OCIF 20ng/mlに加えて８μg/mlの非標識OCIFを含む結合
試験溶液を100μｌ加えて実験を行った。そのイムノプ
レートを37℃、１時間インキュベートした後、各ウェル
をP20−PBSで６回洗浄した。各ウェル中の125Iの量をガ
ンマーカウンターで測定した。結果を第17図に示す。図
に示したように、本発明cDNAにより発現され、精製して
得られるOBM及び本発明の天然型のOCIFに特異的に結合
する蛋白質は、ウサギ抗OBMポリクローナル抗体で処理
することによって、125I標識したOCIFとの結合は全く起
こらなかった。一方、抗体処理しなかった両蛋白質に
は、125I標識OCIFが結合することが確認された。又、そ
れらの結合は400倍濃度の非標識OCIF（８μg/ml）を添
加することにより顕著に阻害されることから、両蛋白質
のOCIFへの結合は特異的結合であることが明らかになっ
た。以上の結果から、ウサギ抗OBMポリクローナル抗体
は、本発明cDNAにより発現される蛋白質であるOBM及び
本発明の天然型のOCIF結合蛋白質を共に認識し、両蛋白
質とOCIFとの特異的結合を阻害することが明らかになっ
た。
〔実施例19〕 ヒトOBMcDNAのクローニング （１）マウスOBMプライマーの調製 ヒトOBMcDNAのスクリーニングには、上記の実施例の
方法に従い調製したマウスOBMプライマー、OBM＃３及び
OBM＃８を用いた。それぞれの配列を配列表配列番号９
及び６に示す。
（２）PCRによるヒトOBMcDNA断片の取得 ヒトリンパ節由来cDNAライブラリーとしてHuman Lymp
h Node Marathon ready cDNA（クロンテック社）を鋳型
として、上記（１）で調製したマウスOBMcDNAプライマ
ーを用いて、PCRを行いヒトOBMcDNA断片を取得した。
以下に用いたPCRの条件を示す。
10×EX Taqバッファー（宝酒造社） 2 μｌ 2.5mM dNTP 1.6μｌ cDNA溶液 1 μｌ EX Taq（宝酒造社） 0.2μｌ 蒸留水 14.8μｌ 40μＭプライマーOBM＃３ 0.2μｌ 40μＭプライマーOBM＃８ 0.2μｌ 上記溶液をマイクロフュージチューブ中で混合後、以
下の条件でPCRを行った。95℃で２分間前処理し、95℃3
0秒、57℃30秒及び72℃２分30秒間の３段階の反応を40
回繰り返した後、72℃で５分間保温した。反応液の一部
をアガロース電気泳動に供したところ、上記マウスOBMc
DNAプライマーで増幅される約690bpのDNA断片が検出さ
れた。
（３）PCRにより増幅されたヒトOBMcDNA断片の精製と塩
基配列の決定 実施例19−（２）で得られたヒトOBMcDNA断片をアガ
ロース電気泳動により分離し、さらにQIAEXゲルエクス
トラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。
この精製されたヒトOBMcDNA断片を鋳型として、再度上
記マウスOBMcDNAプライマーを用いてPCRを行い、このヒ
トOBMcDNA断片を大量に調製し、同様にQIAEXゲルエクス
トラクションキットにより精製した。精製されたヒトOB
McDNA断片の塩基配列を、OBM＃３及びOBM＃８（配列表
９及び６）をプライマーとして、タックダイデオキシタ
ーミネーターサイクルシークエンシングFSキット（Taq
Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing FS kit;パー
キンエルマー社）を用いて決定した。このヒトOBMcDNA
断片の塩基配列は、マウスOBMcDNAの相当する領域と比
較した結果、80.7％の相同性を示した。
（４）約690bpのヒトOBMcDNA断片をプローブとしたハイ
ブリダイゼーション法による全長ヒトOBMcDNAのスクリ
ーニング 実施例19−（３）で精製された約690bpのヒトOBMcDNA
断片をメガプライムDNAラベリングキット（アマシャム
社）を用いて［α32P］dCTPで標識し、全長のヒトOBMcD
NAをスクリーニングした。スクリーニングの対象として
は、Human Lymph Node 5'−STRETCH PLUS cDNAライブラ
リー（クロンテック社、USA）を用いた。同社のプロト
コールに従い、組み換えファージを37℃で15分間大腸菌
C600 Hflに感染させた後、その大腸菌を45℃に加温した
LB寒天培地（１％トリプトン、0.5％イーストエキス、
１％NaCl、0.7％寒天）に添加し、1.5％寒天を含むLB寒
天培地プレート上に流し込んだ。37℃で一夜培養後、プ
ラークの生じたプレート上にハイボンドＮ（アマシャム
社）を約３分間密着させた。このフィルターを常法に従
いアルカリ変性処理した後、中和し、２×SSC溶液に浸
した後、UVクロスリンク（ストラタジーン社）によりDN
Aをフィルターに固定した。得られたフィルターをRapid
−hybバッファー（アマシャム社）に浸漬し、65℃で15
分間前処理した後、熱変性した上記ヒトOBMcDNA断片
（約690bp、５×105cpm/ml）を添加した上記バッファー
に移し替え、65℃で一夜ハイブリダイゼーションさせ
た。反応後、フィルターをそれぞれ0.1％ SDSを含む２
×SSC、１×SSC及び0.1×SSCで順次１回ずつ65℃で15分
間洗浄した。得られたいくつかの陽性クローンをさらに
２回スクリーニングを繰り返すことにより純化した。そ
れらの中から、約2.2kbのインサートを持つクローンを
選択し、以下の実験に用いた。この純化したファージを
λhOBMと名付けた。純化したλhOBMからQIAGEN Lambda
キット（キアゲン社）のプロトコールに従い、約10μｇ
のDNAを得た。このDNAを制限酵素Sal Iで消化した後、
アガロース電気泳動により約2.2kbのhOBMインサートcDN
Aを分離した。QIAEXゲルエクストラクションキット（キ
アゲン社）を用いて精製したこのDNA断片を、あらかじ
め制限酵素Sal Iで切断し、脱リン酸化しておいたプラ
スミドpUC19（MBI社）にDNAライゲーションキットver.2
（宝酒造社）を用いて挿入した。得られたDNA断片を含
むpUC19で大腸菌DH 5α（ギブコBRL社）を形質転換させ
た。得られた形質転換株はpUC19hOBMと名付け、これを
増殖させ、約2.2kbのヒトOBMcDNAが挿入されたプラスミ
ドを常法により精製した。
（５）ヒトOBMの全アミノ酸配列をコードするcDNAの塩
基配列の決定 実施例19−（４）で得られたヒトOBMcDNAの塩基配列
を、タックダイデオキシターミネーターサイクルシーク
エンシングFSキット（パーキンエルマー社）を用いて決
定した。即ち、pUC19hOBMを鋳型とし、挿入断片の塩基
配列を決定した。プライマーとして、pUC19の挿入断片D
NAの塩基配列を決定するためのプライマー、M13PrimerM
3及びM13 PrimerRV（ともに宝酒造社）、及びヒトOBMcD
NA断片（約690bp）の塩基配列に基づいて設計した合成
プライマーヒトOBM＃８を用いた。用いたプライマー、M
13PrimerM3及びM13PrimerRVの配列を、それぞれ配列表
配列番号４及び５に示す。これにより決定された、ヒト
OBMcDNAの塩基配列から推定されるヒトOBMのアミノ酸配
列を配列表配列番号11、又、ヒトOBMcDNAの塩基配列を
配列表配列番号12に、それぞれ示す。
得られたヒトOBMcDNAを含むプラスミド、pUC19hOBMで
形質転換した大腸菌は、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に受託番号FERM BP−6058として平成９
年８月13日に寄託されている。
〔実施例20〕 OCIFの125I標識ならびにELISAによる125I標識OCIFの定
量 OCIFはヨードジェン（Iodogen）法により125I標識し
た。2.5mg/ml Iodogen−クロロホルム溶液20μｌを1.5m
lエッペンドルフチューブに移し、40℃でクロロホルム
を蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製
した。このチューブを0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液（Na
−Pi,pH 7.0）400μｌで３回洗浄した後、５μｌの0.5M
Na−Pi,pH 7.0を加えた。このチューブにNa−125I溶液
（アマシャム社、NEZ−033H）1.3μｌ（18.5MBq）を加
えた後、直ちに1mg/ml OCIF溶液（モノマー型あるいは
ダイマー型）10μｌを加え、ボルテックスミキサーで攪
拌した後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め10
mg/ml沃化カリウムを含む0.5M Na−Pi（pH 7.0）溶液80
μｌと５％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩
水（BSA−PBS）５μｌを添加しておいたチューブに移し
攪拌した。この溶液をBSA−PBSで平衡化したスピンカラ
ム（1ml,G−25 Sephadex fine,ファルマシア社）に負荷
し、2,000rpmで５分間遠心した。カラムから溶出された
画分にBSA−PBSを400μｌ加え攪拌した後、２μｌを取
り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。この
ようにして調製した125I標識OCIF溶液の放射化学純度は
10％トリクロロ酢酸（TCA）により沈殿する画分の放射
能を測定することにより求めた。
125I標識OCIFのOCIF生物活性は、WO96/26217号記載の
方法に従い測定した。又、125I標識OCIF濃度は、以下の
ようにELISAにより測定した。即ち、WO96/26217号公報
記載のウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を２μg/mlにな
るように溶解した50mM NaHCO3,pH 9.6を100μｌずつ96
ウェルイムノプレート（Nunc社、MaxiSorpTM）の各ウェ
ルに加えて、４℃一夜放置した。この溶液を捨てた後、
ブロックエース（雪印乳業社）とリン酸塩緩衝生理食塩
水との混合水溶液（混合比25:75）（Ｂ−PBS）を200μ
ｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液
を捨てた後、各ウェルを0.01％ Polysorbate 80を含む
リン酸塩緩衝生理食塩水（Ｐ−PBS）で３回洗浄し、次
いで125I標識OCIFサンプルあるいはOCIF標準品を添加し
たＢ−PBSを100μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間
放置した。この液を捨てた後、Ｐ−PBS 200μｌで各ウ
ェルを６回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ
抗OCIFポリクローナル抗体をＢ−PBSで希釈した溶液を1
00μｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。こ
の溶液を捨てた後、Ｐ−PBS 200μｌで各ウェルを６回
洗浄した。TMB溶液（TMB Soluble Reagent,High Sensit
ivity,Scytek社）を100μｌずつ各ウェルに加え、室温
で２〜３分間放置した後、停止液（Stopping Reagent,S
cytek社）を100μｌずつ各ウェルに加えた。各ウェルの
450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測
定した。OCIF標準品を用いて作成した検量線より125I標
識OCIFの濃度を求めた。
〔実施例21〕 本発明cDNAにコードされる蛋白質の発現 （１）動物細胞用hOBM発現ベクターの構築 pUChOBMを制限酵素Sal Iで切断し、約2.2kbのDNA断片
を１％アガロース電気泳動により精製し、DNAブランテ
ィングキット（宝酒造社）により末端を平滑化した（平
滑化hOBMcDNA断片）。発現プラスミドpcDL−SRα296（M
olecular and Cellar Biology,Vol 8,pp466−472（198
8））を制限酵素EcoR Iで切断し、ブランティングキッ
トにより末端を平滑化したものと、平滑化したhOBMcDNA
断片とをDNAライゲーションキットver.2により結合させ
た。ライゲーション反応液を用い大腸菌DHαを形質転換
した。得られたアンピシリン耐性形質転換株から、制限
酵素切断により得られるDNA断片地図の解析並びにDNA配
列の決定により、SRαプロモーターによる転写方向に対
してhOBMcDNAの転写方向が順向きに挿入されているプラ
スミド、phOBMを持つ菌株を選びだし、DH5 α/phOBMと
名付けた。
（２）COS−７細胞でのヒトOBMの発現 大腸菌、DH5 α/phOBMを培養し、キアフィルタープラ
スミドミディキット（キアゲン社）を用い、プラスミド
phOBMを精製した。phOBMを６ウェルプレートの各ウェル
中でCOS−７細胞にリポフェクトアミンを用いてトラン
スフェクションし、10％牛胎児血清を含むDMEM中で２日
間培養した。５％透析牛胎児血清を添加した、システイ
ン・メチオニン不含DMEM（大日本製薬社）に培地交換し
（88μl/well）15分間培養した後、Express Protein La
beling Mix（NEN社、10mCi/ml）を14μｌ添加した。４
時間培養後、10％牛胎児血清を含むDMEMを200μｌ加え
１時間培養した。細胞をPBSで２回洗浄後、１％ Triton
X−100、１％牛ヘモグロビン、10μg/mlロイペプチン
（leupeptin）、0.2 TIU/mlアプロチニン（aprotinin）
及び1mM PMSFを含むTSAバッファー（0.14M NaCl、0.025
％ NaN3を含む10mMトリス−塩酸、pH 8.0）を0.5ml加
え、氷上で１時間静置した。ピペッティングにより細胞
を破砕した後、４℃、3,000×ｇ、10分間遠心し上清を
得た。この上清100μｌに200μｌの希釈バッファー（0.
1％ Triton X−100、0.1％牛ヘモグロビン、10μg/mlロ
イペプチン、0.2TIU/mlアプロチニン及び1mM PMSFを含
むTSAバッファー）を加え、Protein A Sepharose（50μ
ｌ）とともに４℃で１時間振盪させた後、４℃、1,500
×ｇで１時間遠心分離し上清を回収することにより:Pro
tein A Sepharoseに非特異的に吸着する蛋白質を除去し
た。この上清にOCIF（１μｇ）を加え、４℃で１時間振
盪させながらヒトOBMとOCIFを結合させた後、ウサギ抗O
CIFポリクローナル抗体（50μｇ）を加えて４℃で１時
間振盪した。この溶液にProtein A Sepharose（10μ
ｌ）を加え、更に４℃で１時間振盪した。４℃、1,500
×ｇで１分間遠心分離し沈殿画分を回収した。４℃、1,
500×ｇで１分間遠心分離して得られた沈殿を希釈バッ
ファーで２回、牛ヘモグロビンを含まない希釈バッファ
ーで２回、TSAバッファーで１回、50mMトリス−塩酸（p
H 6.5）で１回、それぞれ洗浄後、沈殿に10％βメルカ
プトエタノールを含むSDSバッファー（0.125Mトリス−
塩酸、４％ドデシル硫酸ナトリウム、20％グリセロー
ル、0.002％ブロモフェノールブルー、pH 6.8）を加
え、100℃で５分間加熱後、SDS−PAGE（12.5％ポリアク
リルアミドゲル、第一化学社）にかけた。常法によりゲ
ルを固定、乾燥させ、Amplify（アマシャム社）によ
り、アイソトープのシグナルを増強した後、Bio Max MR
フィルム（コダック社）を用いて−80℃で感光させた。
結果を第18図に示す。この結果、本発明のcDNAにコード
される蛋白質の分子量は、約40,000であることが明らか
となった。
〔実施例22〕 本発明cDNAにコードされる蛋白質とOCIFとの結合 実施例21−（２）と同様に精製されたphOBMを24ウェ
ルプレートの各ウェル中でCOS−７細胞にリポフェクト
アミンを用いてトランスフェクトし、その細胞を２〜３
日間培養した後、無血清DMEMで洗浄し、これに125I標識
したOCIF 20ng/mlを加えた結合試験培地（0.2％牛血清
アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.1mg/mlヘパリン、0.
2％ NaN3を加えた無血清DMEM）200μｌを加えた。また
別のウェルには、125I標識したOCIF 20ng/mlに加えて更
に８μg/mlの非標識OCIFを添加した結合試験培地を200
μｌ加えて実験を行った。CO2インキュベーター中（５
％ CO2）、37℃で１時間培養した後、細胞を0.1mg/mlの
ヘパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500μｌで２回
洗浄した。洗浄後、0.1N NaOH溶液500μｌを各ウェルに
加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解さ
せ、ウェル中の125Iの量をガンマーカウンターで測定し
た。この結果、第19図に示したように、phOBMをトラン
スフェクトした細胞にのみ125I標識したOCIFが結合する
ことが確認された。又、その結合は400倍濃度の非標識O
CIF（８μg/ml）を添加することにより、顕著に阻害さ
れることが確認された。以上の結果から、phOBM上のcDN
Aにコードされる蛋白質ヒトOBMは、COS−７細胞表面でO
CIFに特異的に結合することが明らかとなった。
〔実施例23〕125 I標識したOCIFと本発明cDNAにコードされる蛋白質と
のクロスリンキング試験 本発明cDNAにコードされる蛋白質の性質を更に詳しく
解析するため、125I標識したモノマー型OCIFと本発明cD
NAにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行っ
た。即ち、実施例21−（１）及び（２）に記載した方法
に従って、それぞれ発現ベクターをphOBMを構築し、COS
−７細胞にトランスフェクトした後、上記の125I標識し
たOCIF（25ng/ml）を加えた結合試験用培地を200μｌず
つ各ウェルに添加した。又、別のウェルには、125I標識
したOCIFに加え400倍濃度の非標識OCIFを更に添加した
結合試験用培地を加えた。CO2インキュベーター中（５
％ CO2）、37℃で１時間培養した後、細胞を0.1mg/mlの
ヘパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500μｌで２回
洗浄した。この細胞に100μg/mlのクロスリンキング
剤、DSS（Disuccinimidyl suberate,Pierce社）を溶解
させたリン酸塩緩衝生理食塩水500μｌを加え、０℃で1
0分間反応させた。これらのウェルの細胞を０℃に冷却
したリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで２回洗浄した後、こ
の細胞に１％ Triton X−100（和光純薬社）、2mM PMSF
（phenylmethylsulfonyl fluoride、シグマ社）、10μ
Ｍペプスタチン（和光純薬社）、10μＭロイペプチン
（和光純薬社）、10μＭアンチパイン（antipain,和光
純薬社）及び2mM EDTA（和光純薬社）を含む20mM Hepes
緩衝液100μｌを加え、室温に30分間放置して細胞を溶
解させた。これらのサンプル15μｌを常法により還元条
件下でSDS化した後、SDS−電気泳動用ゲル（４−20％ポ
リアクリルアミドグラジエント、第一化学社）を用いて
泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、BioMAX MSフィル
ム（コダック社）とBioMax MS増感スクリーン（コダッ
ク社）を用いて−80℃で24時間感光させた。感光させた
フィルムを常法により現像した。この結果、125I標識モ
ノマー型OCIFと本発明cDNAによりコードされる蛋白質を
クロスリンクさせることにより、第20図に示すように、
分子量約90,000−110,000の蛋白質バンドが検出され
た。
〔実施例24〕 分泌型ヒトOBMの発現 （１）分泌型ヒトOBM発現プラスミドの構築 ヒトOBM SF（配列表配列番号13）とマウスOBM ＃８
（配列表配列番号６）をプライマー、pUC19hOBMを鋳型
としてPCR反応を行った。この生成物をアガロースゲル
電気泳動で精製した後、制限酵素SPl I、Hind IIIで切
断し、さらにアガロースゲル電気泳動で精製して、0.27
kbの断片を得た。ヒトOBM cDNAを制限酵素Dra Iで部分
消化し、一ヶ所切断された断片をアガロース電気泳動で
精製し、その精製断片をさらに制限酵素Hind IIIで切断
した。0.53kbのDra I/Hind III断片をアガロース電気泳
動で精製し、この精製断片と上記のPCR生成物のSpl I,H
ind III断片（0.27kb）をpSec Tag A（インビトローゲ
ン社）のSPl I/EcoR V断片（5.2kb）と共にライゲーシ
ョンキットver.2（宝酒造社）を用いてライゲーション
を行い、その反応生成物を用いて大腸菌DH5 αを形質転
換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリSD
S法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断するこ
とによって、pSec Tag Aに0.27kbと0.53kbの断片が挿入
されたプラスミドを選び出した。さらに、このプラスミ
ドをタックダイデオキシターミネーターサイクルシーク
エンシングFSキット（パーキンエルマー社）を用いてシ
ークエンスを行い、このプラスミドが分泌型ヒトOBMを
コードする配列を持っていることを確認した。このプラ
スミドを制限酵素Nhe I、Xho Iで切断した後、分泌型ヒ
トOBM cDNAに相当する断片（0.8kb）をアガロースゲル
電気泳動で回収した。この断片をライゲーションキット
を用いて発現ベクターpCEP4（インビトローゲン社）のN
he I/Xho I断片（10.4kb）に挿入し、その反応生成物を
用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシ
リン耐性株より、アルカリSDS法によりプラスミドを精
製し、制限酵素で切断することにより、目的の構造を持
った分泌型ヒトOBM発現プラスミド（pCEPshOBM）を持つ
大腸菌株を選択した。pCEPshOBMを持つ大腸菌株を培養
し、キアフィルタープラスミドミディキット（キアゲン
社）を用いてpCEPshOBMを精製した。
（２）分泌型OBMの発現 293−EBNA細胞を10％ FCSを含むIMDM（IMDM−10％ FC
S）に懸濁し、コラーゲンコートした24ウェルプレート
（住友ベークライト社）に２×105細胞/2ml/ウェルにな
るように播種し、一夜培養した。この細胞に１μｇのpC
EPshOBM及びpCEP4のそれぞれをリポフェクトアミン（ギ
ブコ社）４μｌを用いて形質導入し、0.5mlの無血清IMD
MまたはIMDM−10％ FCS中で更に２日間培養し、その培
養上清を回収した。分泌型ヒトOBMの培養上清中での発
現は、以下のようにして確認した。即ち、培養上清に最
終濃度が0.1Mになるように炭酸水素ナトリウムを加えて
４℃で一夜放置し、培養上清中のヒトOBMを96ウェルプ
レートに固相化した。このプレートをPBSで４倍希釈し
たブロックエース（雪印乳業社）溶液（Ｂ−PBS）で室
温に２時間放置しブロッキングした後、Ｂ−PBSで希釈
した３−100ng/mlのOCIFを加えて37℃で２時間放置し
た。0.05％ Polysorbate 20を含むPBS（Ｐ−PBS）でプ
レートを洗浄した後、Ｂ−PBSで希釈したWO96/26217号
記載のパーオキシダーゼ標識抗OCIF抗体を各ウェルに10
0μｌずつ添加し、37℃で２時間放置した。Ｐ−PBSで各
ウェルを６回洗浄した後、TMB溶液（TMB Soluble Reage
nt,High Sensitivity,Scytek社）を100μｌずつ各ウェ
ルに加え、室温で約10分間放置した後、停止液（Stoppi
ng Reagent,Scytek社）を100μｌずつ各ウェルに加え
た。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレー
トリーダーで測定した。結果を第21図に示す。pCEPshOB
Mを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレート
では、添加したOCIFの濃度に依存して450nmの吸光度が
増加した。一方、ベクターのみのpCEP4を形質導入した
細胞の培養上清を固相化した場合には、その吸光度の増
加は見られなかった。又、固相化に用いる培養上清量の
割合を５〜90％の範囲で種々変化させ、一定濃度のOCIF
（50ng/ml）を添加した際の結果を第22図に示す。pCEPs
hOBMを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレー
トでは、添加する培養上清量の増加につれて450nmにお
ける吸光度が増加したが、ベクターpCEP4を形質導入し
た細胞の培養上清を固相化したプレートでは、吸光度の
増加は見られなかった。これらの結果により、分泌型ヒ
トOBMがpCEPshOBMを形質導入した細胞の培養上清中に発
現していることが確認された。
〔実施例25〕 チオレドキシン−ヒトOBM融合蛋白質（Trx−hOBM）の発
現 （１）チオレドキシン−ヒトOBM融合蛋白質（Trx−hOB
M）発現ベクターの構築 10μｌの10×ExTaqバッファー（宝酒造社）、８μｌの1
0mM dNTP（宝酒造社）、77.5μｌの滅菌蒸留水、２μｌ
のpUC19hOBM水溶液（10ng/μｌ）、１μｌのプライマー
マウスOBM ＃３（配列表配列番号９）（100pmol/μ
ｌ）、１μｌのプライマーhOBM SalR2（配列表配列番号
14）（100pmol/μｌ）、0.5μｌのExTaq（5u/μｌ）
（宝酒造社）を混合しマイクロ遠心管中でPCR反応を行
った。95℃５分、50℃１秒、55℃１分、74℃１秒、72℃
５分の反応後、96℃１分、50℃１秒、55℃１分、74℃１
秒、72℃３分の反応を25サイクル行った。反応液全量か
ら約750bpのDNA断片を精製した。精製したDNA断片（全
量）を制限酵素Sal I（宝酒造社）及びBspH I（ニュー
イングランドバイラブズ社）で切断した後、１％アガロ
ース電気泳動を行い、約320bpのDNA断片（断片１）を精
製し20μｌの滅菌蒸留水に溶解した。同様に、実施例19
−（３）記載のpUC19hOBM 4μｇを制限酵素BamH I,BspH
I（宝酒造社）で切断して得られた約450bpのDNA断片
（断片２）、及び２μｇのpTrxFus（インビトロジェン
社）を制限酵素BamH I,Sal I（宝酒造社）で切断して得
られた約3.6kbのDNA断片（断片３）をそれぞれ精製し、
それぞれを20μｌの滅菌蒸留水に溶解した。DNA断片の
精製にはQIAEX II gel extraction kitを用いた。断片
１、断片２、及び断片３をDNA ligation kit ver.2（宝
酒造社）を用い、16℃で２時間30分保温することにより
結合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌GI724
株（インビトロジェン社）をThioFusion Expression Sy
stem（インビトロジェン社）添付のInstruction Manual
に記載の方法で形質転換した。得られたアンピシリン耐
性形質転換株の中から、制限酵素切断により得られるDN
A断片地図の解析並びにDNA配列の決定により、hOBM cDN
A断片がチオレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合して
いるプラスミドを持つ菌株を選択した。得られた菌株を
GI724/pTrxhOBMと名付けた。
（２）大腸菌でのTrx−hOBMの発現 GI724/pTrxhOBM株及びpTrxFusを持つGI724（GI724/pT
rxFus）をそれぞれ2mlのRMG−Amp培地（0.6％ Na2HP
O4、0.3％ KH2PO4、0.05％ NaCl、0.1％ NH4Cl、２％カ
ザミノ酸、１％グリセロール、1mM MgCl2、100μg/mlア
ンピシリン、pH 7.4）中、37℃で６時間振盪培養した。
菌液0.5mlを50mlのInduction培地（0.6％ Na2HPO4、0.3
％ KH2PO4、0.05％ NaCl、0.1％ NH4Cl、0.2％カザミノ
酸、0.5％グルコース、1mM MgCl2、100μg/mlアンピシ
リン、pH 7.4）に添加し、30℃で振盪培養した。OD
600nmにおける値が約0.5になった時点で、最終濃度が0.
1mg/mlになるようにＬ−トリプトファンを添加し、更に
30℃で６時間振盪培養した。菌液を3,000×ｇで遠心し
菌体を集め、12.5mlのPBSに懸濁した。懸濁液を超音波
発生装置（Ultrasonics社）にかけ菌体を破砕し、7,000
×ｇで30分間遠心して上清を集めて可溶性蛋白質画分と
した。これらの画分溶液10μｌずつを還元条件下でのSD
S−PAGE（10％ポリアクリルアミド）に供した。この結
果、第23図に示すように、GI724/pTrxOBMの可溶性蛋白
質画分には、GI724/pTrxFusの可溶性蛋白質画分には見
られない分子量約40,000の蛋白質のバンドが検出され
た。以上の結果から、チオレドキシンとヒトOBMの融合
蛋白質（Trx−hOBM）が大腸菌中で発現していることが
確認された。
（３）Trx−hOBMのOCIFとの結合能 発現させたTrx−hOBMがOCIFと結合することを、以下
の実験により確認した。即ち、96ウェルイムノプレート
（Nunc社）の各ウェルに10mM炭酸水素ナトリウム水溶液
で5000倍に希釈した抗チオレドキシン抗体（インビトロ
ジェン社）を100μｌずつ添加し４℃で一夜放置した。
各ウェル中の液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業
社）をPBSで２倍希釈した溶液（BA−PBS）を各ウェルに
200μｌずつ添加し室温で１時間放置した。液を捨てた
後、各ウェルをＰ−PBSで３回洗浄した。各ウェルにBA
−PBSで段階希釈した上記GI724/pTrxhOBM由来及びGI724
/pTrxFus由来可溶性蛋白質画分溶液を100μｌずつ添加
し室温で２時間放置した。Ｐ−PBSで各ウェルを３回洗
浄した後、BA−PBSで希釈したOCIF（100ng/ml）を各ウ
ェルに100μずつ添加し室温に２時間放置した。Ｐ−PBS
で各ウェルを３回洗浄した後、BA−PBSで2000倍に希釈
したWO96/26217号記載のパーオキシダーゼ標識した抗OC
IF抗体を各ウェルに100μｌずつ添加し、室温で２時間
放置した。Ｐ−PBSで各ウェルを６回洗浄した後、TMB溶
液を100μｌずつ各ウェルに加え、室温で約10分間放置
した後、停止液（Stopping Reagent）を100μｌずつ各
ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマ
イクロプレートリーダーで測定した。結果を第24図に示
す。GI724/pTrxFus由来可溶性蛋白質画分溶液を添加し
たもの、添加しなかったものの間で吸光度には差異は見
られなかったが、GI724/pTrxhOBM由来可溶性蛋白質画分
溶液を添加したものでは、その添加濃度が増加するにつ
れて吸光度が上昇した。又、添加する可溶性蛋白質画分
溶液の希釈割合を一定（１％濃度）にし、BA−PBSで段
階希釈したOCIF（０−100ng/ml）を添加した場合の実験
結果を第25図に示す。GI724/pTrxFus由来可溶性蛋白質
画分溶液を用いたものでは、OCIFの濃度に係わりなく吸
光度は低値であったが、GI724/pTrxhOBMに由来可溶性蛋
白質画分溶液を添加したものでは、OCIF濃度が増加する
につれて吸光度が増加した。これらの結果から、GI724/
pTrxhOBMで生産されるTrx−hOBMには、OCIFと結合する
能力があることが確認された。
（４）Trx−hOBMを生産する大腸菌の大量培養 GI724/pTrxhOBMをRMG−Amp寒天培地（0.6％ Na2HP
O4、0.3％ KH2PO4、0.05％ NaCl、0.1％ NH4Cl、２％カ
ザミノ酸、1.5％寒天、pH 7.4）に白金耳で塗抹し、30
℃で一夜培養した。菌体を10mlのInduction培地に懸濁
し、5mlずつを500mlのInduction培地の入った21用三角
フラスコ計２本に添加し、30℃で振盪培養した。OD
600nmでの吸光度が約0.5になった時点で最終濃度が0.1m
g/mlとなるようにＬ−トリプトファンを添加し、更に30
℃で６時間振盪培養した。菌液を3,000×ｇで20分間遠
心分離して菌体を集め、菌体を160mlのPBSに懸濁した。
懸濁液を超音波発生装置（Ultrasonics社）にかけ菌体
を破砕し、7,000×ｇで30分間遠心分離して上清を集め
可溶性蛋白質画分とした。
（５）OCIF固定化アフィニティーカラムの調製 TSKgel AF−トレシルトヨパール650（東ソー社）2g
と、WO96/26217号公報記載の方法で調製した遺伝子組み
換え型OCIF 35.0mgを含む1.0Mリン酸カリウム緩衝液（p
H 7.5）40mlとを混合し、４℃で一夜緩やかに振盪する
ことによりカップリング反応を行った。過剰な活性基を
不活性化するため、遠心分離により上清を除去した後、
40mlの0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を沈殿した担
体に加え、室温で１時間穏やかに振盪した。0.01％ Pol
ysorbate 80と0.2M NaClを含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝
液（pH 3.3）及び0.01％ Polysorbate 80と0.2M NaClを
含む0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0）を通液し
カラムを洗浄した後、0.01％ Polysorbate 80を含む10m
Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）で２回洗浄し、カ
ラムを平衡化した。
（６）OCIF固定化アフィニティーカラムによるTrx−hOB
Mの精製 Trx−hOBMの精製は、特に断らない限り４℃で行っ
た。上記のOCIF固定化アフィニティー担体（10ml）と上
記実施例25−（４）記載の可溶性蛋白質画分溶液（120m
l）とを混合後、50ml遠心管（４本）中で、ローテータ
ーを用いて４℃で一夜穏やかに振盪した。この混合液中
の担体をエコノカラム（内径1.5cm×長さ15cm、バイオ
ラッド社）に充填した。0.01％ Polysorbate 80を含むP
BS 300ml、0.01％ Polysorbate 80及び2.0M NaClを含む
10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）100ml、0.01％ Polysorbat
e 80及び0.2M NaClを含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（p
H 3.3）100mlを順次通液してカラムを洗浄した。次に、
0.01％ Polysorbate 80及び0.2M NaClを含む0.1Mクエン
酸ナトリウム緩衝液（pH 2.0）を通液し、カラムに吸着
した蛋白質を溶出した。溶出液は5mlずつ分取した。分
取した画分には、10％容量の2Mトリス溶液（pH 8.0）を
加えて直ちに中和した。溶出液各画分中のTrx−hOBMの
有無を、実施例25−（３）記載の方法により調べた。
又、Trx−hOBMを含む画分を集め、更に精製を進めた。
（７）ゲル濾過によるTrx−hOBMの精製 上記実施例25−（６）記載のTrx−hOBMフラクション
約25mlをCentriplus 10及びCentricon 10（Amicon社）
を用いて、約0.5mlに遠心濃縮した。この濃縮サンプル
を予め0.01％ Polysorbate 80を含むPBSで平衡化したSu
perose 12 HR 10/30カラム（1.0×30cm、ファルマシア
社）に負荷した。移動相として0.01％ Polysorbate 80
を含むPBSを用い、流速0.25ml/minでカラムを展開し
た。カラムからの溶出液は0.25mlずつ分取した。分取し
た画分のTrx−hOBMは、実施例25−（３）記載の方法及
びSDS−PAGEにより検出した。純化されたTrx−hOBMを含
むフラクションを集め、Trx−hOBMの蛋白質濃度を測定
した。蛋白質濃度は牛血清アルブミンを標準品として用
い、DC−protein assay kit（バイオラッド社）で測定
した。
〔実施例26〕 hOBMの破骨細胞形成誘導活性 phOBM及びpcDL−SRα296をリポフェクトアミン（ギブ
コ社）を用いてCOS−７細胞にそれぞれトランスフェク
トした。それぞれの細胞を10％ FCSを含むDMEMで１日間
培養後トリプシン処理し、カバーグラス（15mm丸形、マ
ツナミ社）を敷いた24ウェルプレートに１ウェル当たり
５×104個の細胞を播種し、さらに２日間培養した。培
養プレートをPBSで１回洗浄した後、１％パラフォルム
アルデヒドを含むPBSを加えて室温で８分間インキュベ
ートし細胞をカバーグラス上に固定化した。細胞を固定
化したプレートをPBSで６回洗浄した後、10-8M活性化ビ
タミンD3、10-7Mデキサメサゾン、10％牛胎児血清を含
むα−MEMにて１×106個/mlになるように懸濁したマウ
ス脾臓細胞を１ウェル当たり700μｌずつ添加した。各
ウェル上にMillicell PCF（ミリポア社）をセットし、
上記培地にて４×104個/mlに懸濁したST2細胞をMillice
ll PCF中に700μｌずつ添加し、37℃で６日間培養し
た。培養終了後、Millicell PCFを取り除き、プレート
をPBSで１回洗浄後、アセトン−エタノール溶液（50:5
0）で１分間細胞を固定した後、LEUKOCYTE ACID PHOSPH
ATASEキット（シグマ社）を用いて破骨細胞特異的マー
カーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（TRAP
活性）を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、
ヒトOBM cDNAを含まないベクターのみのpcDL−SR α296
をトランスフェクトしたCOS−７細胞を固定化したウェ
ル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったの
に対し、phOBMをトランスフェクトした細胞を固定化し
たウェル中には65±18個（ｎ＝３、平均値±標準偏差）
のTRAP陽性細胞が観察された。又、これらのTRAP陽性細
胞は125I−標識サケカルシトニン（アマシャム社）と特
異的結合を示したことから、カルシトニンレセプターを
発現していることが確認された。これらの結果から、本
発明cDNAによりコードされる蛋白質であるヒトOBMは破
骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなっ
た。
〔実施例27〕 Trx−hOBM及び分泌型ヒトOBMによる破骨細胞形成誘導活
性 マウス脾臓細胞を10-8M活性型ビタミンD3、10-7Mデキ
サメサゾン、10％牛胎児血清を含むα−MEMに２×106個
/mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに１ウェル
あたり350μｌ添加した。精製したTrx−hOBMを上記培地
で希釈した溶液（40ng/ml）、pCEPshOBMまたはpCEP4を
形質導入した293−EBNA細胞をIMDM−10％FBSで培養した
培養上清を上記培地にて10倍希釈した溶液または上記培
地のみをそれぞれ350μｌ添加した後、Millicell PCF
（ミリポア社）を各ウェルにセットし、上記培地にて懸
濁した４×104個/mlのST2細胞をMillicell PCFに600μ
ｌ添加した。６日間培養した後、Millicell PCFを取り
除き、プレートをPBSで１回洗浄後、アセトン−エタノ
ール溶液（50:50）で１分間細胞を固定した後、LEUKOCY
TE ACID PHOSPHATASEキット（シグマ社）を用いて酒石
酸耐性酸性フォスファターゼ活性（TRAP活性）を示す細
胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、Trx−hOBMを添
加しなかったウェル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検
出されなかったのに対し、Trx−hOBMを添加したウェル
には115±19個（ｎ＝３、平均値±標準偏差）のTRAP陽
性細胞が観察された。同様に、pCEP4で形質導入された2
93−EBNAの培養上清を添加したウェル中にはTRAP活性を
示す細胞は全く検出されなかったのに対し、pCEPshOBM
で形質導入された293−EBNAの培養上清を添加したウェ
ルには125±23個（ｎ＝３、平均値±標準偏差）のTRAP
陽性細胞が観察された。又、これらTRAP陽性細胞は125I
標識したサケカルシトニン（アマシャム社）と特異的結
合を示しことから、カルシトニンレセプターを発現して
いることが確認された。これらの結果から、Trx−hOBM
及び分泌型OBMには、破骨細胞形成を誘導する活性があ
ることが明らかとなった。
〔実施例28〕 ポリクローナル抗体の作製 免疫抗原として用いるマウスsOBM又はヒトsOBMは、前
記の方法に従って得た。即ち、マウスsOBM cDNA（マウ
スOBMのＮ末端から72番目までのアミノ酸を欠損させた
膜結合部位を持たないマウスsOBM（配列表配列番号16）
をコードするcDNA、配列表配列番号18）又はヒトOBM cD
NA（ヒトOBMのＮ末端から71番目までのアミノ酸を欠損
させた膜結合部位を持たないヒトsOBM（配列表配列番号
17）をコードするcDNA、配列表配列番号19）を、イムノ
グロブリンのκ−チェーンのシグナルペプチドをコード
する塩基配列を含む発現ベクターpSec TagA（インビト
ローゲン社）のHind III/EcoR V断片（5.2kb）と、OBM
cDNAのEcoR I/PmaC I断片（0.32kb）とともにライゲー
ションキットver.2（宝酒造社）を用いてライゲーショ
ンを行い、その反応生成物を用いて大腸菌DH5 αを形質
転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカリSD
S法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断するこ
とによりpSec TagAに0.6Kbと0.32kbの断片が挿入された
プラスミドを選び出した。このプラスミドをダイターミ
ネーターサイクルシークエンシングFSキット（パーキン
−エルマー社）を用いてシークエンスを確認した結果、
このプラスミドがマウス又はヒトsOBMをコードする配列
を有することを確認した。このプラスミドを制限酵素Nh
e I、Xho Iで切断した後、分泌型OBM cDNAに相当する断
片（1.0kb）をアガロースゲル電気泳動で回収した。こ
の断片をライゲーションキットを用いて発現ベクターpC
EP4（インビトローゲン社）のNhe I/Xho I断片（10.4k
b）に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌DH5 αを
形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカ
リSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断し
て解析することにより、目的の構造を持った分泌型OBM
発現プラスミド（pCEP sOBM）を持つ大腸菌株を選び出
した。pCEP sOBMを持つ大腸菌株を培養し、キアフィル
タープラスミドミディキット（キアゲン社）を用いてpC
EP sOBMを精製した。次に、293−EBNA細胞を10％FCSを
含むIMDM（IMDM−10％FCS）に懸濁し、コラーゲンコー
トした24ウェルプレート（住友ベークライト社）に2x10
5個/2ml/ウェルになるように播種し、一夜培養した。こ
の細胞に１μｇのpCEP sOBM又はpCEP4をリポフェタミン
（ギブコ社）４μｌを用いて形質導入し、0.5mlの無血
清IMDM又はIMDM−10％FCS中でさらに２日間培養し、そ
の培養上清を回収した。遺伝子組み換えマウス可溶性OB
M（msOBM）あるいはヒト可溶性OBM（hsOBM）の高生産細
胞株を以下のようにスクリーニングした。msOBMあるい
はhsOBMを含むと見られる培養上清に最終濃度が0.1Mに
なるように炭酸水素ナトリウムを添加後、それぞれの培
養上清を100μｌづつ96ウェルイムノプレート（Nunc
社）の各ウェルに添加し、４℃で一夜放置して培養上清
中のmsOBMあるいはhsOBMを各ウェルに固相化した。この
プレートの各ウェルにPBSで４倍希釈したブロックエー
ス（雪印乳業社）溶液（Ｂ−PBS）を200μｌ加え、室温
で２時間放置した。0.1％polysprbate 20を含むPBS（Ｐ
−PBS）で３回洗浄後、Ｂ−PBSで段階的に希釈した遺伝
子組み換えOCIF（rOCIF）溶液（３〜100ng/ml）を100μ
ｌずつ各ウェルに添加し、37℃で２時間放置した。その
プレートをPBSで３回洗浄した後、Ｂ−PBSで希釈したパ
ーオキシダーゼ標識抗OCIFポリクローナル抗体（WO96/2
6217号）を100μｌずつ各ウェルにに添加し、37℃で２
時間放置した。Ｐ−PBSで各ウェルを６回洗浄後、TMB溶
液（TMBSoluble Agent,High sensitivity,Scytek社）を
100μｌずつ各ウェルに加え、室温で約10分間放置した
後、停止液（Stopping Reagent,Scytek社）を100μｌず
つ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度
をマイクロプレートリーダーで測定した。msOBMあるい
はhsOBMの生産細胞株の培養上清を固相化したプレート
では、OCIFの添加濃度に比例して、吸光度が顕著に増加
した。msOBMあるいはhsOBMの生産細胞株について、その
吸光度の増加の割合の高い生産株を、それぞれ高生産株
として選択した。このように選択されたmsOBMあるいはh
sOBM高生産293−EBNA細胞をそれぞれ５％FCSを含有する
IMDMを培地として用い、Ｔ−フラスコ（Ｔ−225）を25
枚用いて大量培養した。コンフルエントに達した後、新
鮮な培地をＴ−225フラスコ１枚当たり100mlずつ加え、
３〜４日間培養して、培養上清を回収した。この操作を
４回繰り返して、msOBMあるいはhsOBmを含む培養上清を
それぞれ10リットル得た。実施例25−（６）及び（７）
記載の方法に従い、rOCIF固定化カラムを用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより精製することにより、これら培養上清か
らSDS−ポリアクリルアミド電気泳動的に均一（分子量3
2kDa）な精製msOBM及びhsOBMをそれぞれ約10mg及び12mg
得た。このようにして得られた精製標品を、それぞれ免
疫抗原として用いた。得られた各抗原を、リン酸塩緩衝
生理食塩水（PBS）に200μg/mlになるように溶解し、等
容量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化後、日
本白色ウサギ各３羽に約１週間間隔で1mlを皮下投与し
免役した。抗体価を測定し、抗体価が最高に到達した時
点で、ブースター投与し、投与10日後に全採血した。抗
血清をプロテインＡセファロースクロマトグラフィー用
バインディングバッファー（BioRad社）で２倍希釈し、
同バッファーで平衡化したプロテインＡカラムに負荷し
た。同バッファーでカラムを充分洗浄後、カラムに吸着
した抗sOBM抗体をエルーションバッファー（BioRad社）
あるいは0.1Mグリシン−HClバッファー、pH 2.9−3.0で
溶出した。抗体溶出液を直ちに中和する目的で、1.0M T
ris−HCl,pH 8.0を少量含む試験管を用いて溶出溶液を
分画した。抗体溶出液をPBSに対して４℃、一夜透析し
た。抗体溶液の蛋白質をウシIgGをスタンダードとしてL
owry法により測定した。このようにして、本発明のポリ
クローナル抗体を含む精製イムノグロブリン（IgG）
が、ウサギ抗血清1ml当たり約10mg得られた。
〔実施例29〕 ポリクローナル抗体を用いたELISAによるOBM及びsOBMの
測定 実施例28で得られたウサギ抗ヒトsOBMポリクローナル
抗体を、固相抗体及び酵素標識抗体としたサンドイッチ
ELISAを構築した。酵素標識は、石川らの方法（Ishikaw
a et al.:J.Immunoassay,Vol.4,209−327,1983）に従い
パーオキシダーゼ（POD）標識した。実施例28で得られ
た抗ヒトsOBMポリクローナル抗体を２μg/mlとなるよう
に0.1M NaHCO3溶液に溶解し、96−ウェルイムノプレー
ト（Nunc社）の各ウェルに100μｌずつ添加、室温で一
夜放置した。次いで、各ウェルに200μｌずつ50％ブロ
ックエース（雪印乳業社）を加え、室温で１時間放置
し、各ウェルを0.1％ polysorbate 20を含むPBS（洗浄
バッファー）で３回洗浄した。実施例26の方法と同様に
ヒトOBMを発現し実施例２の方法で精製することにより
得られた精製ヒトOBM、及び実施例28で得られた精製ヒ
トsOBMをそれぞれ一次反応用バッファー（40％ブロック
エース、0.1％ polysorbate 20を含む0.2M Tris−HClバ
ッファー、pH 7.2）で段階希釈した溶液を、100μｌず
つ各ウェルに加えた。室温で２時間放置後、各ウェルを
上記洗浄バッファーで３回洗浄した。実施例26の方法と
同様にヒトOBMを発現し実施例２の方法で精製すること
により得られた精製ヒトOBM、及び実施例28で得られた
精製ヒトsOBMをそれぞれ一次反応用バッファー（40％ブ
ロックエース、0.1％ polysorbate 20を含む0.2M Tris
−HClバッファー、pH 7.2）で段階希釈した溶液を、100
μｌずつ各ウェルに加えた。室温で２時間放置後、各ウ
ェルを上記洗浄バッファーで３回洗浄した。二次反応用
バッファー（25％ブロックエース、0.1％ polysorbate
20を含む0.1M Tris−HClバッファー、pH 7.2）で1000倍
希釈したPOD標識抗ヒトsOBMポリクローナル抗体を100μ
ｌずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した後、各ウ
ェルを３回洗浄バッファーで洗浄した。各ウェルに酵素
基質溶液（TMB,ScyTek社）を100μｌずつ添加し、室温
で10分間放置後、反応停止液（Stopping reagent,ScyTe
k社）を100μｌずつ各ウェルに加えて酵素反応を停止さ
せた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレ
ートリーダーを用いて測定した。結果を第26図に示す。
ウサギ抗ヒトsOBMポリクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチELISAは、ヒトsOBM（分子量約32kDa）及びヒトOBM
（分子量約40kDa）をほぼ等しく認識し、それぞれの測
定感度は約12.5×10-3pmol/ml（ヒトOBMで約500pg/ml、
ヒトsOBMで約400pg/ml）であった。実施例28で得られた
ウサギ抗マウスsOBMポリクローナル抗体を用いたELISA
によるマウスsOBM及びマウスOBMの測定は上記と同様に
実施でき、それぞれの測定感度も同程度で極めて微量の
マウスsOBMあるいはマウスOBMを測定できることが明ら
かとなった。
以上のように、実施例28で得られた本発明抗ヒトsOBM
ポリクローナル抗体は、ヒトsOBM及びヒトOBMの両抗原
を等しく認識することから、抗ヒトOBM/sOBMポリクロー
ナル抗体を名付けた。又、実施例28で得られた抗マウス
sOBMポリクローナル抗体は、同様にマウスsOBM及びマウ
スOBMの両抗原を等しく認識することから、抗マウスOBM
/sOBMポリクローナル抗体と名付けた。
〔実施例30〕 モノクローナル抗体の作製 免疫用抗原には、実施例28で得られた精製ヒトsOBMを
用いた。精製ヒトsOBMを10μg/mlになるように生理食塩
水に溶解した。このようにして調製したヒトsOBM溶液
に、同容量のフロイント完全アジュバントを加え良く乳
化した後、それぞれの抗原をBalb/cマウス一匹当たり腹
腔内に200μｌずつ１週間間隔で３回投与し、マウスを
免疫した。次に、ヒトsOBMを５μg/ml含む生理食塩水に
同容量のフロイント不完全アジュバントを添加し、充分
乳化したものを上記Balb/cマウス一匹あたり200μｌず
つ、１週間間隔で４回追加免疫した。４回目の追加免疫
の１週間後、ブースターとしてヒトsOBMを10μg/ml含む
生理食塩水をBalb/cマウス１匹当たり100μｌずつ静脈
内に投与した。最終免疫後３日目に脾臓を摘出、脾臓細
胞を分離し、マウスミエローマ細胞P3x63−AG8.653とを
公知の方法（Koehler,G.and Milstein,C.,Nature,256,4
95（1975））に従い細胞融合した。融合終了後、細胞懸
濁液をヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミヂンを
含むHAT培地中で10日間培養した。ミエローマ細胞が死
滅し、ハイブリドーマが出現した後、HAT培地からアミ
ノプテリンを除いたHT培地に培地交換し、培養を継続し
た。
〔実施例31〕 ハイブリドーマの選択及びクローニング 実施例30の細胞融合及び培養を開始して10日後にハイ
ブリドーマの出現を認めたので、下記に記載した改良ソ
リッドフェーズELISAにより、ヒトsOBMを認識する高親
和性抗体及びその抗体を産生するハイブリドーマの選択
を行った。又、ヒトsOBMとマウスsOBMの両方を認識する
抗OBMモノクローナル抗体を選択するために、ソリッド
フェーズELISA用抗原として、ヒトsOBM以外に実施例27
で得られたマウスsOBMも使用した。ヒトsOBM及びマウス
sOBMをそれぞれ５μg/mlになるように0.1M炭酸水素ナト
リウム溶液に溶解し、それぞれの抗原溶液を50μｌずつ
96−ウェルイムノプレート（Nunc社）の各ウェルに加
え、４℃で一夜静置しそれぞれの抗原を固相化した。各
ウェル中の抗原溶液を捨て、各ウェルに50％ブロックエ
ース（雪印乳業社）を200μｌずつ加え、室温で１時間
放置してブロッキングした。各ウェルを0.1％ polysorb
ate 20を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS−Ｐ）で洗
浄し、各ウェルに40μｌの牛血清（ハイクローン社）を
加えた。次いで、各ウェルに10μｌのハイブリドーマ培
養上清を加え、80％血清濃度下、室温で２時間反応させ
た。80％血清存在下でのソリッドフェーズELISAの目的
は、高濃度の蛋白質及び血清由来の免疫反応妨害物質等
の存在中でも微量のヒトsOBMあるいはマウスsOBMと結合
できる抗体、即ちヒトsOBMあるいはマウスsOBMに対して
高親和性の抗体生産ハイブリドーマを選択するためであ
る。室温で２時間反応後、プレートをPBS−Ｐで洗浄
し、25％ブロックエースを含む生理食塩水で5000分の１
に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG（KPL社）
を各ウェルに50μｌ加え、室温で２時間反応させた。プ
レートをPBS−Ｐで３回洗浄した後、各ウェルに50μｌ
の酵素基質溶液（TMB,ScyTek社）を加え、室温で５分間
反応させた。次いで、反応停止液（stopping reagent,S
cyTek社）50μｌを加えて酵素反応を停止させた。各ウ
ェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダ
ー（イムノリーダーNJ2000、日本インターメッド社）を
用いて測定し、ヒトsOBMあるいはマウスsOBMを認識する
抗体生産ハイブリドーマを選択した。特に高い吸光度
（OD450nm）を示すそれぞれの抗体生産ハイブリドーマ
を選択し、それらを限界希釈法により３〜５回クローニ
ングを繰り返すことにより、安定な抗体生産ハイブリド
ーマを樹立した。得られた抗体生産株の中から、さらに
抗体の生産性が高いハイブリドーマ株を選別した。
〔実施例32〕 モノクローナル抗体の生産及び精製 実施例31で得られた抗体、即ち高親和性でヒトsOBMを
認識する抗体生産ハイブリドーマ及びマウスsOBMにも交
差性を有する抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ
培養し、マウス一匹当たりそれぞれのハイブリドーマを
１×106細胞ずつ、約１週間前にプリスタン（アルドリ
ッチケミカル社）を投与しておいたBalb/c系マウスの腹
腔内に移植した。約２〜３週間後、蓄積した腹水を採取
し、本発明のヒトsOBMあるいはヒトsOBM及びマウスsOBM
を認識するモノクローナル抗体を含む腹水を得た。実施
例28に記載したプロテインＡカラムによる抗OBM/sOBMポ
リクローナル抗体の精製法に準じて、プロテインＡカラ
ム（ファルマシア社）クロマトグラフィーにより腹水か
ら精製モノクローナル抗体を得た。
〔実施例33〕 モノクローナル抗体の抗原特異性 ヒトsOBMを特異的に認識するモノクローナル抗体並び
にヒトsOBM及びマウスsOBMにも交差性を有するモノクロ
ーナル抗体について、ヒトsOBM、膜結合部位を有するin
tactなヒトOBM、マウスsOBM、及び膜結合部位を有するi
ntactなマウスOBMを抗原とした時の抗原特異性について
調べた。30数種類のモノクローナル抗体を得たが、それ
らのうち代表的なモノクローナル抗体についての結果を
第１表に示す。この結果、ヒトsOBMを特異的に認識する
抗ヒトsOBMモノクローナル抗体のほとんど全ては膜結合
部位を有するintactなヒトOBMも認識するが、マウスsOB
M及び膜結合部位を有するintactなマウスOBMは認識しな
いことが明らかとなった。
一方、ヒトsOBM及びマウスsOBMも認識するモノクロー
ナル抗体も得られたが、その数は極めて少なく、これら
の抗体はヒトOBM並びにマウスOBMにも交差性を有してい
ることがわかった。これらの結果は、ヒトOBMとマウスO
BMには共通した抗原認識部位、即ちエピトープが存在し
ていることを示すものである。ヒトsOBMを免疫抗原とし
て作製した抗ヒトsOBMモノクローナル抗体は、膜結合型
のintactな蛋白質であるヒトOBMも等しく認識すること
から、抗ヒトsOBMモノクローナル抗体を抗ヒトOBM/sOBM
モノクローナル抗体と名付けた。
〔実施例34〕 モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスの検定 本発明のモノクローナル抗体のクラス及びサブクラス
を、イムノグロブリンクラス及びサブクラス分析キット
（アマシャム社）を用いて検定した。検定は、キットに
指示されているプロトコールに従い実施した。代表的な
モノクローナル抗体についての結果を第２表に示す。抗
ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体の大多数はIgG1であ
り、その他IgG2a及びIgG2bも存在していた。又、いずれ
の抗体もライトチェーンはκ鎖であった。
〔実施例35〕 モノクローナル抗体の解離定数（KD値）の測定 公知の方法（Betrand Friguet et al.:Journal of Im
munological Methods,77,305−319,1986）に従い、モノ
クローナル抗体の解離定数を測定した。即ち、実施例32
で得られた精製抗体を5ng/mlに40％ブロックエース、0.
1％ polysorbate 20を含む0.4M Tris−HCl pH7.4（１次
バッファー）で希釈し、これに実施例28で得られた精製
ヒト可溶性OBM（hsOBM）を6.25ng/ml〜10μg/mlになる
ように１次バッファーで希釈したものを等容量混ぜ、４
℃で15時間静置することによりhsOBMとモノクローナル
抗体を結合させた。15時間後、hsOBMと未結合の抗体をh
sOBM（10μg/ml、100μl/ウェル）を固相化したソリッ
ドフェーズELISAにて測定することにより、モノクロー
ナル抗体のhsOBMに対する解離定数を算定した。又、hsO
BMに対するモノクローナル抗体でありながら、マウス可
溶性OBM（msOBM）にも交差する抗体のmsOBMに対する親
和性についても、上記のhsOBMの代わりにmsOBMを使用す
ることにより同様に測定した。特に、各抗原に高い親和
性を示し、酵素免疫測定法やその他バインディングアッ
セイ等に有用な抗体についての結果を第３表に示す。
この結果、ヒト可溶性OBM（hsOBM）に特異的な抗体で
あるＨ−OBM 1及びＨ−OBM 4は解離定数（Kd）が10-11M
オーダーで、hsOBMに極めて高い親和性を有しているこ
とが明らかになった。一方、hsOBM及びマウス可溶性OBM
（msOBM）の両方を認識する抗体、Ｈ−OBM 9のKd値は、
msOBMに対しては10-8Mオーダーであり、hsOBMに対して
は10-9Mオーダーであった。又、第１表に記載の両抗原
を認識する他の抗体、Ｈ−OBM 13の両抗原に対する解離
定数は、Ｈ−OBM 9と差異はなく、両抗体はサブクラス
も一致していることから、同じエピトープを認識する同
一抗体である可能性が示唆された。
〔実施例36〕 抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体を用いたサンドイッ
チELISAによるヒトOBM及びsOBMの測定方法 実施例35で得られた２種類の高親和性モノクローナル
抗体、Ｈ−OBM 1及びＨ−OBM 4をそれぞれ固相抗体と酵
素標識抗体として、サンドイッチELISAを構築した。抗
体の標識は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット
（ピアス社）を用いて行った。Ｈ−OBM 1抗体を10μg/m
lになるよう0.1M炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、100
μｌずつ96−ウェルイムノプレート（Nunc社）の各ウェ
ルに加え、４℃で一夜静置し固相化した。各ウェルの溶
液を捨て、50％濃度のブロックエース300μｌを加え、
室温で２時間静置しブロッキングした。ブロッキング
後、プレートを0.1％ polysorbate 20を含むリン酸塩緩
衝生理食塩水（PBS−Ｐ）で洗浄した。ヒト可溶性sOBM
及びヒトOBMをそれぞれ40％ブロックエース（雪印乳業
社）及び0.1％ polysorbate 20（和光純薬社）を含む0.
4M Tris−HC（pH 7.4）（１次反応バッファー）に溶
解、希釈し、種々の濃度の被験溶液を調製した。種々の
濃度に調製したそれぞれの被験溶液を100μｌずつ各ウ
ェルに加え、室温で２時間反応させた。２時間後、プレ
ートをPBS−Ｐで洗浄し、25％ブロックエース及び0.1％
polysorbate 20を含む0.2M Tris−HCl（pH7.4）（２次
反応バッファー）で希釈したPOD標識Ｈ−OBM 4抗体を各
ウェルに100μｌ加え、室温で２時間反応させた。プレ
ートをPBS−Ｐで洗浄した後、各ウェルに100μｌの酵素
基質溶液（TMB,ScyTek社）を加えて発色させた後、反応
停止液（stopping reagent,ScyTek社）を100μｌずつ各
ウェルに加えて酵素反応を停止した。各ウェルの450nm
における吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測
定した。結果を第27図に示す。
この結果、実施例35で得られた２種類の高親和性抗ヒ
トOBM/sOBMモノクローナル抗体、Ｈ−OBM 1及びＨ−OBM
4を用いて構築したサンドイッチELISAは、ヒトOBM及び
ヒトsOBMを等しく認識し、その測定感度は約1.25−2.5
×10-3pmol/ml（分子量約40kDaのヒトOBMでは約50−100
pg/ml、分子量約32kDaのヒトsOBMでは約40−80pg/ml）
で極めて微量のヒトOBM及びヒトsOBMを測定できること
が明らかとなった。尚、これら２種類の抗ヒトOBM/sOBM
モノクローナル抗体、Ｈ−OBM 1及びＨ−OBM 4を生産す
るハイブリドーマをＨ−OBM1及びＨ−OBM4と命名し、ま
たマウスOBM及びマウスsOBMも認識し、破骨細胞形成抑
制活性を発揮する抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体、
Ｈ−OBM 9を生産するハイブリドーマをＨ−OBM9と命名
した。これらのハイブリドーマは、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP−6264
（Ｈ−OBM1）、FERM BP−6265（Ｈ−OBM4）、及びFERM
BP−6266（Ｈ−OBM9）として、平成９年11月５日にそれ
ぞれ寄託されている。
〔実施例37〕 マウスOBM及びマウスsOBMを認識する抗ヒトOBM/sOBMモ
ノクローナル抗体を用いたマウスOBM及びマウスsOBMの
測定 実施例33及び35で得られたマウスOBM及びマウスsOBM
も認識する抗ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体、Ｈ−OB
M9を固相抗体とし、実施例28で得られた抗マウスOBM/sO
BMポリクローナル抗体を酵素標識抗体とするサンドイッ
チELISAを構築した。マウスOBM及びマウスsOBMをそれぞ
れ実施例35と同様に一次反応用バッファーで段階的に希
釈し、実施例36と同様の方法によりマウスOBM及びマウ
スsOBMを測定した。結果を第28図に示す。この結果、本
発明のマウスOBM及びsOBMも認識する本発明の抗ヒトOBM
/sOBMモノクローナル抗体、Ｈ−OBM 9を使用することに
より、マウスOBM及びマウスsOBMを同様に測定できるこ
とが確認された。実施例35の結果に示すように、この抗
ヒトOBM/sOBMモノクローナル抗体、Ｈ−OBM 9はマウスs
OBMに対する解離定数が高い、即ちマウスsOBMに対する
親和性が比較的低いことから、本ELISAによるマウスOBM
（分子量約40kDa）及びマウスsOBM（分子量約32kDa）の
測定感度は、約25×10-3pmol/ml（マウスOBMでは約1ng/
ml、マウスsOBMでは約0.8ng/ml）程度であった。
〔実施例38〕 抗OBM/sOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性試験 マウス脾細胞とST2細胞（マウス骨髄由来間質細胞）
とのco−cultureでosteoclast−like cell（OCL）が誘
導されることが知られている（Endocrinology,125,1805
−1813（1989））。そこで、OBM/sOBM抗体をこのco−cu
ltureに添加した時、OCL誘導を抑制するか否かを検討し
た。このco−culture系においてはマウスOBMが発現して
いるので、実施例に使用する抗体はマウスOBMを認識す
るウサギ抗マウスOBM/sOBMポリクローナル抗体、及びヒ
トOBM及びマウスOBMの両抗原を認識するヒト抗OBM/sOBM
モノクローナル抗体、Ｈ−OBM 9を用いた。10％ FCSを
含むαMEMにて段階希釈したそれぞれのOBM抗体を24well
plate（ヌンク社）に700μl/well、上記培地にて懸濁
した雄マウス脾細胞（２×106/ml）を350μl/well添加
した。次いでトリプシナイズしたST2細胞を４×10-8M V
itamin D3及び4X10-7M Dexamethazoneを含む上記培地に
懸濁し（８×104cells/ml）350μl/well添加し、37℃で
６日間培養した。培養プレートをPBSにて１回洗浄した
のち、50％エタノール、50％アセトンの混合液にて室温
で１分間固定した。プレートを風乾した後、LEUKOCYTE
ACID PHOSPHATASEキット（シグマ社）のプロトコールに
従い基質液を500μl/well添加し、37℃で55分間反応さ
せた。この反応により破骨細胞特異的マーカーである酒
石酸耐性酸性フォスファターゼ活性（TRAP活性）を示す
細胞のみが染色される。プレートを蒸留水で１回洗浄し
た後風乾してTRAP陽性細胞数をカウントした。結果を第
４表に示す。この結果、ウサギ抗マウスOBM/sOBMポリク
ローナル抗体及びマウスOBMを認識する抗ヒトOBM/sOBM
モノクローナル抗体、Ｈ−OBM 9とも抗体濃度に依存し
てOCL誘導を阻害することがわかった。これらの抗体
は、破骨細胞形成因子、OCIF/OPGと同様に破骨細胞形成
抑制活性を有し、骨代謝異常症治療薬として有望である
ことが明らかになった。
〔実施例39〕 Trx−OBMのヒト破骨細胞形成誘導活性 成人健常者より静脈採取した全血から、Histopaque
（sigma社）を用い、添付のプロトコールに従いdensity
gradient法によって単核細胞を調製した。この単核細
胞を10-7Mデキサメサゾン、200ng/mlマクロファージコ
ロニー刺激因子（ミドリ十字社）、10％牛胎児血清及び
実施例15で得られた精製されたTrx−OBM（０−100ng/m
l）を含むα−MEMに1.3X106/mlになるように懸濁し、こ
の懸濁液を48ウェルプレートに１ウェルあたり300μｌ
添加し３日間37℃で培養した。培養液を上記培地で交換
後、さらに４日間37℃で培養した。培養した細胞を実施
例５に示した方法で酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活
性（TRAP活性）を示す細胞を選択的に染色し、染色され
た多核細胞の数を顕微鏡観察により測定した。結果を第
29図に示す。この結果、Trx−OBMを添加しなかったウェ
ル中にはTRAP活性を示す細胞はほとんど検出されなかっ
たのに対し、Trx−OBMを添加すると濃度依存的にTRAP陽
性多核細胞が出現した。又、これらのTRAP陽性多核細胞
は破骨細胞のマーカーであるビトロネクチンレセプター
も陽性であった。さらに、同様の培養を48ウェルプレー
トに静置した象牙質切片上で行うと、Trx−OBM存在下で
のみ象牙質切片上に吸収窩が形成された。これより、Tr
x−OBMにはヒト破骨細胞形成を誘導する活性があること
が明らかとなった。
〔実施例40〕 抗OBM/sOBM抗体による骨吸収抑制活性 妊娠15日目のddYマウス（日本SLC社）に［45Ca］−Ca
Cl2溶液（Amersham社）を１匹あたり25μCi皮下注射
し、胎仔の骨を45Caでラベルした。翌日、マウスを屠殺
し開腹して、子宮から胎仔を取り出した。胎仔より前肢
を摘出して、皮膚及び筋肉を剥がし長管骨を摘出し、さ
らに軟骨を除去して長管骨の骨幹部のみにした。骨幹部
は24穴プレートに入れた0.5mlの培養液（0.2％牛血清ア
ルブミン（sigma社）を含むBGJb medium（GIBCO BRL
社））に１本ずつ浮かべ、37℃,5％CO2存在下で24時間
培養した。前培養終了後、各種骨吸収因子（ビタミン
D3、プロスタグランジンE2、副甲状腺ホルモン、インタ
ーロイキン１α）、及び正常ウサギIgG（100μg/ml;対
照として）又は実施例28で得られたウサギ抗OBM/sOBMポ
リクローナル抗体を含む新しい培養液（0.5ml）に長管
骨を移し、さらに72時間培養した。培養終了後、長管骨
は0.5mlの５％トリクロロ酢酸水溶液（和光純薬社）に
入れ、室温で３時間以上処理して脱灰した。培養液及び
トリクロロ酢酸抽出液（共に0.5ml）にシンチレーター
（AQUASOL−２、PACKARD社）5mlを加え、45Caの放射活
性を測定し、骨吸収により培養液中に遊離した45Caの割
合を算出した。結果を第30図〜第33図にそれぞれ示す。
この結果、ビタミンD3（10-8M）は骨吸収活性を上昇さ
せたが、ウサギ抗OBM/sOBMポリクローナル抗体を加える
ことにより、濃度依存的にビタミンD3による骨吸収を抑
制し、100μg/mlの濃度において完全に抑制した（第30
図）。又、プロスタグランジンE2（10-6M）あるいは副
甲状腺ホルモン（100ng/ml）は骨吸収活性を上昇させた
が、ウサギ抗OBM/sOBMポリクローナル抗体の添加（100
μg/ml）により、プロスタグランジンE2及び副甲状腺ホ
ルモンによる骨吸収をほぼ完全に抑制した（第31図及び
第32図）。一方、陽性対照として用いた正常ウサギIgG
（100μg/ml）は、プロスタグランジンE2及び副甲状腺
ホルモンによる骨吸収に対して影響しなかった。又、イ
ンターロイキン１α（10ng/ml）によっても骨吸収が引
き起こされたが、ウサギ抗OBM/sOBMポリクローナル抗体
（100μg/ml）により有意に抑制された（第23図）。こ
れらの結果より、本発明抗体は骨吸収抑制物質として優
れていることが明らかとなった。マウス抗ヒトOBM/sOBM
抗体であるＨ−OBM 9についても同様の実験を行った結
果、ウサギ抗OBM/sOBMポリクローナル抗体とほぼ同等の
骨吸収抑制活性があることが確認された。
産業上の利用可能性 本発明により、破骨細胞形成抑制因子（Osteoclastog
enesis inhibitory factor;OCIF）に結合する新規な蛋
白質、その製造方法、この蛋白質を用いて該蛋白質の発
現を調節する物質のスクリーニング方法、該蛋白質の作
用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、該蛋
白質と結合してその作用を伝達するレセプターのスクリ
ーニング方法、及びこれらのスクリーニング方法により
得られた物質を含有する医薬組成物、該蛋白質に対する
抗体、及びその抗体を用いた骨代謝異常治療剤が提供さ
れる。
また、本発明により、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結
合する新規な蛋白質（OCIF結合分子）をコードするDN
A、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋
白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する蛋白質
を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有す
る骨代謝治療剤が提供される。更に、OCIF結合分子の発
現を調節するスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合
しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方
法、OCIF結合分子と結合しその作用を伝達するレセプタ
ーのスクリーニング方法、これらのスクリーニングの結
果得られた物質を含有する医薬組成物が提供される。
さらに、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規な
ヒト蛋白質（ヒト由来OCIF結合分子、ヒトOBM）をコー
ドするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を
有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合す
る性質を有し、破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する
生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方
法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤が提供
される。OCIF結合分子の発現を調節する物質のスクリー
ニング方法、OCIF結合分子と結合し、その作用を阻害又
は修飾する物質のスクリーニング方法、OCIF結合分子と
結合し、その生物作用を伝達するレセプターのスクリー
ニング方法、及びこれらのスクリーニングの結果得られ
た物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来OCIF結合
蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症
の予防及び／又は治療薬が提供される。
またさらに、本発明により、OCIFに特異的に結合する
膜結合分子（OCIF binding molecule;OBM）蛋白質及び
膜結合部位を欠損した可溶性OBM（sOBM）の両抗原を認
識する抗体（抗OBM/sOBM抗体）、その製造方法、この抗
体を用いたOBM及びsOBMの測定方法、さらにこの抗体を
有効成分とする骨代謝異常症予防及び／又は治療剤が提
供される。
本発明により得られた蛋白質あるいは抗体は、医薬あ
るいは研究又は試験用試薬として有用である。
寄託された微生物への言及 （１）微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名； 通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5） 寄託機関に寄託した日付 平成９年５月23日 寄託機関に寄託について付した受託番号 FERM BP−5953 （２）微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名； 通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5） 寄託機関に寄託した日付 平成９年８月13日 寄託機関に寄託について付した受託番号 FERM BP−6058 （３）微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名； 通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5） 寄託機関に寄託した日付（原寄託日） 平成９年11月５日 寄託機関に寄託について付した受託番号 FERM BP−6264 （４）微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名； 通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5） 寄託機関に寄託した日付（原寄託日） 平成９年11月５日 寄託機関に寄託について付した受託番号 FERM BP−6265 （５）微生物を寄託した寄託機関の名称及び宛て名； 通商産業省工業技術院生命工業工学技術研究所 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5） 寄託機関に寄託した日付（原寄託日） 平成９年11月５日 寄託機関に寄託について付した受託番号 FERM BP−6266 配列表 配列番号:1 配列の長さ:316 配列の型：アミノ酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 配列番号:2 配列の長さ:1538 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列： 配列番号:3 配列の長さ:21 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:4 配列の長さ:17 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:5 配列の長さ:17 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:6 配列の長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:7 配列の長さ:26 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:8 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:9 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:10 配列の長さ:33 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:11 配列の長さ:317 配列の型：アミノ酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 配列番号:12 配列の長さ:954 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列： 配列番号:13 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:14 配列の長さ:34 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:15 配列の長さ:951 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列： 配列番号:16 配列の長さ:244 配列の型：アミノ酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 配列番号:17 配列の長さ:246 配列の型：アミノ酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 配列番号:18 配列の長さ:735 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列： 配列番号:19 配列の長さ:741 配列の型：核酸 鎖の数:1 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列：
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 19/10 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/715 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 特願平9−224803 (32)優先日 平成９年８月21日(1997．8．21) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平9−332241 (32)優先日 平成９年12月２日(1997．12．2) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６６ 早期審査対象出願 (72)発明者 木野崎 雅彦 栃木県河内郡上三川町ゆうきが丘53―８ (72)発明者 津田 英資 栃木県河内郡南河内町祇園２―13―１ ダイアパレス自治医大５番館407 (72)発明者 後藤 雅昭 栃木県下都賀郡石橋町下古山456―１ (72)発明者 矢野 和樹 栃木県下都賀郡石橋町石橋578―15 西 浦ハイツ３―１ (72)発明者 友保 昌拓 栃木県下都賀郡石橋町大松山１―３―３ Ｅ ＳＫマンション (72)発明者 小林 文枝 栃木県河内郡河内町下岡本3777―４ (72)発明者 鷲田 向洋 栃木県下都賀郡石橋町花の木３―４―12 (72)発明者 高橋 研 栃木県下都賀郡石橋町石橋578―15 西 浦ハイツ１―４ (72)発明者 森永 伴法 栃木県下都賀郡壬生町幸町３―11―12 (72)発明者 東尾 侃二 埼玉県川越市山田1769―10 (56)参考文献 特表2001−526532（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｎｏｖ．13，1997，Ｖ ｏｌ．390，ｐｐ．175−179 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/395 - 39/44 C07K 14/00 - 16/46 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の（ａ）乃至（ｅ）に記載の性質を有
    する蛋白質に結合し、且つ、下記のイ）乃至ハ）の少な
    くとも一つに記載の中和活性を有する抗体を有効成分と
    して含有する骨代謝異常を伴う疾患の治療剤： （ａ）破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inh
    ibitory factor;OCIF）に特異的に結合する； （ｂ）SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、約30,
    000−40,000の分子量を示す； （ｃ）モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた複合
    蛋白質が、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、
    約90,000−110,000の分子量を示す； （ｄ）骨吸収促進因子存在下での骨芽細胞様ストローマ
    細胞と脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟
    を支持又は促進する活性を示す； （ｅ）骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ス
    トローマ細胞上に発現する； イ）上記（ａ）乃至（ｅ）に記載の性質を有する蛋白質
    による破骨細胞形成活性を抑制する活性； ロ）骨吸収抑制活性； ハ）上記（ａ）乃至（ｅ）に記載の性質を有する蛋白質
    とOCIFの結合を阻害する活性。
  2. 【請求項２】抗体が、100ng/ml以下の濃度において、下
    記の（ａ）乃至（ｅ）に記載の性質を有する蛋白質によ
    る破骨細胞形成活性を抑制する活性を示す抗体であるこ
    とを特徴とする、請求項１に記載の治療剤； （ａ）破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inh
    ibitory factor;OCIF）に特異的に結合する； （ｂ）SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、約30,
    000−40,000の分子量を示す； （ｃ）モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた複合
    蛋白質が、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、
    約90,000−110,000の分子量を示す； （ｄ）骨吸収促進因子存在下での骨芽細胞様ストローマ
    細胞と脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟
    を支持又は促進する活性を示す； （ｅ）骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ス
    トローマ細胞上に発現する。
  3. 【請求項３】抗体が、10ng/ml以下の濃度において、下
    記の（ａ）乃至（ｅ）に記載の性質を有する蛋白質によ
    る破骨細胞形成活性を抑制する活性を示す抗体であるこ
    とを特徴とする、請求項２に記載の治療剤； （ａ）破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inh
    ibitory factor;OCIF）に特異的に結合する； （ｂ）SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、約30,
    000−40,000の分子量を示す； （ｃ）モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた複合
    蛋白質が、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、
    約90,000−110,000の分子量を示す； （ｄ）骨吸収促進因子存在下での骨芽細胞様ストローマ
    細胞と脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟
    を支持又は促進する活性を示す； （ｅ）骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ス
    トローマ細胞上に発現する。
  4. 【請求項４】配列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列
    からなる蛋白質に結合する抗体であり、且つ、下記の
    イ）乃至ハ）の少なくとも一つに記載の中和活性を有す
    る抗体を有効成分として含有する骨代謝異常を伴う疾患
    の治療剤： イ）配列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列からなる
    蛋白質による破骨細胞形成活性を抑制する活性； ロ）骨吸収抑制活性； ハ）配列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列からなる
    蛋白質とOCIFの結合を阻害する活性。
  5. 【請求項５】抗体が、100ng/ml以下の濃度において、配
    列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
    による破骨細胞形成活性を抑制する活性を示す抗体であ
    ることを特徴とする、請求項４に記載の治療剤。
  6. 【請求項６】抗体が、10ng/ml以下の濃度において、配
    列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
    による破骨細胞形成活性を抑制する活性を示す抗体であ
    ることを特徴とする、請求項５に記載の治療剤。
  7. 【請求項７】骨代謝異常を伴う疾患が、骨粗鬆症、高カ
    ルシウム血症、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、慢
    性関節リューマチ及び変形性関節炎から選択される一つ
    または複数であることを特徴とする、請求項１乃至請求
    項６のいずれか一つに記載の治療剤。
  8. 【請求項８】抗体が、モノクローナル抗体であることを
    特徴とする、請求項１乃至請求項７のいずれか一つに記
    載の治療剤。
  9. 【請求項９】抗体が、下記の（ａ）乃至（ｅ）に記載の
    性質を有する蛋白質、又は、配列表の配列番号11に記載
    のアミノ酸配列からなる蛋白質との結合において、10-8
    以下の解離定数を示す抗体であることを特徴とする、請
    求項１乃至請求項８のいずれか一つに記載の治療剤； （ａ）破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inh
    ibitory factor;OCIF）に特異的に結合する； （ｂ）SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、約30,
    000−40,000の分子量を示す； （ｃ）モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた複合
    蛋白質が、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、
    約90,000−110,000の分子量を示す； （ｄ）骨吸収促進因子存在下での骨芽細胞様ストローマ
    細胞と脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟
    を支持又は促進する活性を示す； （ｅ）骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ス
    トローマ細胞上に発現する。
  10. 【請求項１０】抗体が、下記の（ａ）乃至（ｅ）に記載
    の性質を有する蛋白質、又は、配列表の配列番号11に記
    載のアミノ酸配列からなる蛋白質との結合において、10
    -11乃至10-8の解離定数を示す抗体であることを特徴と
    する、請求項９に記載の治療剤； （ａ）破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inh
    ibitory factor;OCIF）に特異的に結合する； （ｂ）SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、約30,
    000−40,000の分子量を示す； （ｃ）モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた複合
    蛋白質が、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、
    約90,000−110,000の分子量を示す； （ｄ）骨吸収促進因子存在下での骨芽細胞様ストローマ
    細胞と脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟
    を支持又は促進する活性を示す； （ｅ）骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ス
    トローマ細胞上に発現する。
  11. 【請求項１１】抗体が、下記の（ａ）乃至（ｅ）に記載
    の性質を有する蛋白質、又は、配列表の配列番号11に記
    載のアミノ酸配列からなる蛋白質との結合において、10
    -11乃至10-10の解離定数を示すことを特徴とする、請求
    項10に記載の治療剤； （ａ）破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inh
    ibitory factor;OCIF）に特異的に結合する； （ｂ）SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、約30,
    000−40,000の分子量を示す； （ｃ）モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた複合
    蛋白質が、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、
    約90,000−110,000の分子量を示す； （ｄ）骨吸収促進因子存在下での骨芽細胞様ストローマ
    細胞と脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟
    を支持又は促進する活性を示す； （ｅ）骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ス
    トローマ細胞上に発現する。
  12. 【請求項１２】抗体のクラスがIgGであり、かつ、軽鎖
    がκ鎖であることを特徴とする、請求項１乃至請求項11
    のいずれか一つに記載の治療剤。
  13. 【請求項１３】抗体のサブクラスがIgG1又はIgG2である
    ことを特徴とする、請求項12に記載の治療剤。
  14. 【請求項１４】以下の工程１）乃至２）を含む工程によ
    り得られる抗体を有効成分として含有する骨代謝異常を
    伴う疾患の治療剤： １）配列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列からなる
    蛋白質に結合する抗体を作製する工程； ２）下記のイ）乃至ハ）のうち少なくとも一つの活性を
    有する抗体を選抜する工程； イ）配列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列からなる
    蛋白質による破骨細胞形成活性を抑制する活性； ロ）骨吸収抑制活性； ハ）配列表の配列番号11に記載のアミノ酸配列からなる
    蛋白質とOCIFの結合を阻害する活性。
  15. 【請求項１５】骨代謝異常を伴う疾患が、骨粗鬆症、高
    カルシウム血症、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、
    慢性関節リューマチ及び変形性関節炎から選択される一
    つまたは複数であることを特徴とする、請求項14に記載
    の治療剤。
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