JP3516003B2 - 総ビリルビン測定用試験紙 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、総ビリルビン測定
用試験紙に関し、詳しくは、体液中の総ビリルビン量を
正確かつ簡便に測定することが可能な総ビリルビン測定
用試験紙に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビリルビンはヘモグロビンの代謝によっ
て生成する黄色の物質で、肝臓から胆汁の色素として分
泌される。血清などの生体体液中において、ビリルビン
は主に三種類の形態で存在する。すなわち、抱合型ビリ
ルビン、非抱合型ビリルビン及びデルタビリルビンの三
種類に分類され、これらの合計が総ビリルビンと称され
る。抱合型ビリルビンは、ビリルビンが肝臓中でグルク
ロン酸抱合を受けて生成したもので、グルクロン酸が１
分子結合したモノグルクロナイド型又は２分子結合した
ジグルクロナイド型として存在し、直接型ビリルビンと
称される。

【０００３】非抱合型ビリルビンはグルクロン酸抱合を
受けておらず、間接型ビリルビン又は遊離ビリルビンと
称される。抱合型ビリルビン及び非抱合型ビリルビンは
血清中ではアルブミンと比較的緩く結合した状態で存在
する。第三の形態のデルタビリルビンは血清アルブミン
と非可逆的に結合した状態で存在する。

【０００４】通常、血中のビリルビン濃度は１ｍｇ／ｄ
Ｌ以下であり、主として抱合型ビリルビンであるが、赤
血球の崩壊速度、細網内皮系でのビリルビン形成能、肝
臓における抱合能、細胆管、胆道の透過速度などの異常
により、血中の間接型ビリルビンあるいは直接型ビリル
ビンの量が増加し、溶血性、閉塞性、肝細胞性、先天性
などの黄疸を引き起こす。したがって、総ビリルビン量
を測定することによって肝機能障害の程度や、Ｒｈ不適
合による胎児の溶血性疾患の重症度等を知ることがで
き、臨床検査において重要な測定項目の一つとなってい
る。

【０００５】従来より行われている血清ビリルビンの分
別測定法の１つとして、１９６１年に、Van der Bergh
によって紹介された反応促進剤の存在下でジアゾ反応を
行い、生成したアゾビリルビン色素の吸光度を測定する
方法がある。この方法は、血清中に存在するビリルビン
がごく少量であるために有効であり、現在でも一般によ
く使われている。そして、この原理に基づいた測定方法
として、反応促進剤にメタノ−ルを用いたMalloy-Evely
n法、カフェインと安息香酸塩を用いたJendrassik-Grof
法、ダイフィリンを用いたMichaelsson法等があり、ジ
アゾ化試薬としてはスルファニル酸と亜硝酸ナトリウム
が用いられていた。

【０００６】しかし、これらのビリルビン測定法はいず
れも、試薬調製が繁雑であり、またビリルビン測定時に
は反応液が血清蛋白により濁りを生じやすいため正確な
値が得られないという問題があった。さらに、ジアゾ化
試薬として用いられているスルファニル酸と亜硝酸ナト
リウムは極めて不安定であるために、使用時に調製する
必要があった。そのため反応促進剤やジアゾ化試薬につ
いて種々の工夫がなされてきたが、その主なものはジア
ゾ化試薬の改良であった。これまでになされたジアゾ化
試薬の改良としては、ジアゾ化合物とナフタレンスルホ
ン酸との塩、塩化亜鉛との複合塩、フッ化ホウ素酸との
塩などの固体状態で分離された安定化ジアゾニウム塩が
挙げられる。これらを使用する総ビリルビン測定方法で
は、あらかじめ作製した安定化ジアゾニウム塩粉末を緩
衝液に溶解するだけで試薬調製ができ、生成したアゾビ
リルビン色素の安定性もよく優れたものであった。

【０００７】しかしながら、安定化ジアゾニウム塩もｐ
Ｈ値が高くなると不安定になることから、上記試薬調製
時のｐＨは低く押さえられており、それにより測定時に
おいて安定化ジアゾニウム塩と間接型ビリルビンとの反
応性が悪くなるという問題があった。つまり、体液中の
総ビリルビン量を測定するにあたっては、直接ビリルビ
ン、間接ビリルビン、デルタビリルビンの総量を求める
ことが必要であるが、これら全てのビリルビンをジアゾ
化させることが可能な至適ｐＨ範囲は、中性付近であ
り、ｐＨ値が低い環境では間接ビリルビンはジアゾ反応
を起こしにくいが、中性付近で安定してジアゾ反応を実
施できるような安定化ジアゾニウム塩は得られなかっ
た。

【０００８】そこで、中性付近のｐＨ範囲で実施できる
総ビリルビン測定方法として、特定のジアゾニウム塩を
ビリルビンのカップリング成分とし、試験溶液を弱酸性
乃至中性にして生じたアゾビリルビンによる着色の吸光
度を測定する方法（特開昭５９−２３２５３号）が提案
されているが、ジアゾニウム塩の存在下でｐＨ値を上げ
るために、やはりジアゾニウム塩が不安定になることは
避けられないという問題があった。そこでさらに、ｐＨ
を中性付近に調整した反応促進化試薬を第１試薬として
検体と混合し、間接型ビリルビンがジアゾ反応しやすい
状態とした上でジアゾ化試薬を加える測定方法（特公平
７−２３８９４号）が提案され、この方法によれば総ビ
リルビン量はある程度まで正確に測定することが可能と
なった。

【０００９】ところで、従来より行われているジアゾ反
応による測定法ではいずれも、上記ジアゾ化試薬の安定
化、測定精度、特に間接型ビリルビン量の測定精度など
の問題の他に、測定時に試験液を調製する等の操作の煩
雑さやそれに伴う測定誤差等の問題がありこれを解消す
る方法として、試験紙を用いる総ビリルビン量測定法が
知られている。この様な試験紙の研究開発に際しても、
上記ジアゾ化試薬の安定化、間接型ビリルビン量の測定
精度の問題は同様であり、例えば、従来用いられている
安定化ジアゾニウム塩を含有する試験紙を作製したとし
ても、ｐＨ値が高くなるとジアゾニウム塩は不安定にな
り、ｐＨ値が低くなると間接型ビリルビンの反応性が悪
くなるという問題はあった。

【００１０】そこで、特公平７−２３８９４号の測定方
法を応用する形で試験紙を２層にするという試みもあ
る。例えば、試験紙を、ジアゾ化試薬を含有する層と反
応促進剤及び緩衝剤を含有する層とを積層した２層構造
の試験紙とし、反応促進剤及び緩衝剤を含有する層に試
料を点着してその層内でジアゾ反応を行わせて総ビリル
ビン測定を行う総ビリルビン測定用試験紙が公知である
が、この試験紙ではジアゾニウム塩を含有する層に酸性
側に緩衝能をもつ緩衝剤を使用しているため、反応促進
剤及び緩衝剤を含有する層までもｐＨが低下し、結果と
して、測定時に間接ビリルビンとの反応性が悪くなり総
ビリルビン濃度が正確に測定できないという問題があっ
た。

【００１１】この様に、総ビリルビン測定用の試験紙に
おいては、体液中の総ビリルビン濃度を正確に測定する
ための、ジアゾ化試薬の安定保持、測定時の至適ｐＨ等
の条件を満足させるものは得られておらず、この様な条
件を満たす総ビリルビン測定用の試験紙が切望されてい
た。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、保存時はもちろんのこと測定時
においてもジアゾ化試薬を安定に保持しながら、測定時
に間接型ビリルビンの反応性が低下しないようなｐＨ範
囲を維持することが可能な、体液中の総ビリルビン濃度
を正確かつ簡便に測定できる総ビリルビン測定用試験紙
を提供することを課題とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、まず、ジアゾ化試薬を含有する層
（試薬層）と反応促進剤及び緩衝剤を含有する層（試料
保持層）とが隣接する２層構造の総ビリルビン測定用試
験紙であって、反応促進剤及び緩衝剤を含有する層に試
料を点着してその層内でビリルビンのジアゾ反応を行わ
せ、試験紙上に現れたアゾビリルビン色素による色の変
化を測定することで総ビリルビン量を測定する総ビリル
ビン測定用試験紙において、ジアゾ化試薬を含有する層
は強酸性にしたまま、試料保持層の緩衝剤を８〜１０程
度のｐＫ_a値を有する緩衝剤として試料保持層のｐＨを
高く保持することで、測定時の間接ビリルビンとの反応
性を改善して正確な総ビリルビン量を測定しようと試み
たが、この試験紙では２層の接触部分のｐＨが高くなり
ジアゾニウム塩が不安定になって、総ビリルビン濃度を
正確に測定できないという問題があることがわかった。

【００１４】そこで、上記試験紙において、試薬層をジ
アゾ化試薬を強酸性下に保持する構成とし、試料保持層
をｐＫ_a値が中性付近の緩衝剤及び反応促進剤を含有す
る構成としたところ、総ビリルビン量測定時に、ジアゾ
反応が終了するまでのｐＨ値を中性付近に保つことがで
き、間接ビリルビンを含む総ビリルビン量を正確に測定
することが可能となり、かつ、上記２層の接触部分付近
の試薬層においてｐＨ値が高くならないようにしてジア
ゾ化試薬を安定に保持できることを見出し本発明を完成
させた。

【００１５】すなわち本発明は、強酸性下にジアゾ化試
薬を保持する試薬層と、ｐＫ_a値が中性付近の緩衝剤及
び反応促進剤を含有し前記試薬層の全部又は少なくとも
一部に接する試料保持層と、を有することを特徴とする
体液中の総ビリルビン測定用試験紙である。

【００１６】上記本発明の総ビリルビン測定用試験紙に
はｐＫ_a値が中性付近の緩衝剤が用いられるが、緩衝剤
のｐＫ_a値は好ましくは６.０〜８.０程度である。この
様な緩衝剤として具体的には、ＭＥＳ（２-(Ｎ-モノホ
リノ)エタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ-ビス(２ーヒ
ドロキシエチル)ー２ーアミノエタンスルホン酸）、ＨＥ
ＰＥＳ（Ｎー２ーヒドロキシエチルピペラジンーＮ'ーエタ
ンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（２ーヒドロキシー３ー
［４ー(２ーヒドロキシエチル)ー１ーピペラジニル］プロパ
ンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（３ー［４ー(２ーヒドロキシエ
チル)ー１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸）等が挙
げられる。

【００１７】また、本発明の総ビリルビン測定用試験紙
の試料保持層における緩衝剤の含有量であるが、試験紙
に試料が吸収された時に緩衝剤濃度が１〜３モル／Ｌと
なる量にすることが好ましい。

【００１８】上記本発明の総ビリルビン測定用試験紙に
用いるジアゾ化試薬は、試料中のビリルビンをジアゾ化
することが可能な試薬であれば特に制限されるものでは
なく、また、反応促進剤は、前記ビリルビンのジアゾ反
応を促進する作用を有する薬剤であれば特に制限される
ものではなく、これらの薬剤として、例えば、総ビリル
ビン量測定用として従来公知の薬剤をそれぞれ用いるこ
とが可能である。試薬層において強酸性下にジアゾ化試
薬を保持する方法についても、酸性物質をジアゾ化試薬
の量に対して大量に添加する等の、通常の方法で行われ
る。さらに、試験紙の作製も従来の２層型ビリルビン試
験紙同様に行えばよい。

【００１９】本発明の総ビリルビン測定用試験紙におい
ては、強酸性下にジアゾ化試薬を保持する試薬層と、ｐ
Ｋ_a値が中性付近の緩衝剤及び反応促進剤を含有する試
料保持層とを有するが、ジアゾ化試薬の安定化の観点か
らいえば、保存時においてジアゾ化試薬は強酸性下で安
定に保持される。また、測定時においては、試料保持層
界面付近でｐＨが高くなるとジアゾ化試薬が不安定にな
るが、試料保持層にｐＫ_a値が中性付近の緩衝剤を含有
させることで界面付近のｐＨが極端に高くならないよう
にしてジアゾ化試薬の不安定化を防いでいる。

【００２０】次に、間接型ビリルビンについての反応性
の問題については、試料保持層に反応促進化剤及びｐＫ
_a値が中性付近の緩衝剤を含有させることにより、試料
保持層が測定時（ビリルビンのジアゾ反応時）に、強酸
性下でジアゾ化試薬を保持する試薬層の影響を強く受け
ないようにして解決している。つまり、試料（総ビリル
ビンを測定しようとする体液）は、試料保持層に点着さ
れ、ここで体液中のビリルビンがジアゾ化されアゾビリ
ルビン色素となるが、ジアゾ反応が行われている間、試
薬保持層内は上記緩衝剤の作用により中性付近の反応至
適ｐＨに保たれるので、間接型ビリルビンを含む全ての
ビリルビンが短時間で十分に反応して正確に総ビリルビ
ン量を測定することが可能となる。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。本発明の総ビリルビン測定用試験紙は、強酸性下
にジアゾ化試薬を保持する試薬層と、ｐＫ_a値が中性付
近の緩衝剤及び反応促進剤を含有し前記試薬層の全部又
は少なくとも一部に接する試料保持層とを有する２層構
造の試験紙である。まず、本発明の試験紙が含有する各
薬剤について説明する。

【００２２】上記本発明の総ビリルビン測定用試験紙に
用いるｐＫ_a値が中性付近の緩衝剤とは、言い換えれ
ば、総ビリルビン測定時に、試薬層のジアゾ化試薬を、
詳しくは試料保持層との界面付近に存在するジアゾ化試
薬を安定に保持しながら、試料保持層において間接型ビ
リルビンを含む全てのビリルビンを短時間で十分にジア
ゾ反応させることのできる至適ｐＨをもたらすことが可
能な緩衝剤であり、緩衝剤の具体的なｐＫ_a値を示せ
ば、ｐＫ_a値は６.０〜８.０であることが好ましく、よ
り好ましくはｐＫ_a値は６.０〜７.０である。

【００２３】この様な緩衝剤としては、ＭＥＳ（２-(Ｎ
-モノホリノ)エタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ-ビ
ス(２ーヒドロキシエチル)ー２ーアミノエタンスルホン
酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎー２ーヒドロキシエチルピペラジン
ーＮ'ーエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（２ーヒドロキ
シー３ー［４ー(２ーヒドロキシエチル)ー１ーピペラジニル］
プロパンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（３ー［４ー(２ーヒドロ
キシエチル)ー１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸）
等が挙げられ、これらのうちでもｐＫ_a値６.１５のＭＥ
Ｓ等が好ましく用いられる。

【００２４】本発明の総ビリルビン測定用試験紙の試料
保持層に、上記緩衝剤とともに用いられる反応促進剤で
あるが、測定試料中のビリルビンのジアゾ化反応を促進
する作用を有する薬剤であれば特に制限されるものでは
なく、総ビリルビン量測定用として従来公知の薬剤を用
いることが可能であり、例えば、トリトン（Triton）Ｘ
−１００、トリトンＸ−４０５、ツイーン（Tween）−
２０、ツイーン−８０等の界面活性剤、カフェインと安
息香酸の混合物、ダイフィリン（７-(２，３-ジヒドロ
キシプロピル)テオフィリン）、酢酸ナトリウム等が挙
げられ、好ましくは、ダイフィリン等が挙げられる。

【００２５】また、本発明の総ビリルビン測定用試験紙
の試料保持層には、必要に応じて上記緩衝剤、反応促進
剤以外の成分、例えば、ポリビニルピロリドン、アクリ
ルアミドポリマー、アガロース、酸加水分解ゼラチン等
のポリマー材料、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−４
０５、ツイーン−２０、ツイーン−８０等の界面活性剤
等を含有させることも可能である。

【００２６】上記本発明の総ビリルビン測定用試験紙の
試薬層に含有させるジアゾ化試薬としては、試料中のビ
リルビンをジアゾ化してアゾビリルビンすることが可能
な試薬であれば特に制限されるものではなく、総ビリル
ビン量測定用として従来公知の薬剤を用いることが可能
であり、例えば、スルファニル酸と亜硝酸ナトリウムを
ジアゾ化試薬として、あるいは、ジアゾ化合物とナフタ
レンスルホン酸との塩、塩化亜鉛との複合塩、フッ化ホ
ウ素酸との塩等の安定化ジアゾニウム塩をジアゾ化試薬
として挙げることができる。安定化ジアゾニウム塩とし
て具体的には、２，４−ジクロロフェニルジアゾニウム
塩、ｐ−クロロ−４−ニトロフェニルジアゾニウム塩、
ｐ−スルホベンゼンジアゾニウム−１−５−ナフタレン
ジスルホン酸等が挙げられる。また、これらのうちでも
本発明においては、スルファニル酸と亜硝酸ナトリウム
をジアゾ化試薬としたもの、そのジアゾ化合物とフッ化
ホウ素酸との塩等が好ましいジアゾ化試薬として用いら
れる。

【００２７】本発明の総ビリルビン測定用試験紙の試薬
層において上記ジアゾ化試薬は強酸性下に保持される
が、そのために、試薬層に酸性物質をジアゾ化試薬の量
に対して大量に添加する等の方法が取られる。この様な
酸性物質としては、スルホフタル酸、スルホサリチル
酸、スルファミン酸、ヘキサミン酸、ｐ−トルエンスル
ホン酸及びそれらの誘導体等を挙げることができる。

【００２８】また、本発明の総ビリルビン測定用試験紙
の試薬層には、必要に応じて上記ジアゾ試薬、酸性物質
以外の成分、例えば、ポリビニルピロリドン、アクリル
アミドポリマー、アガロース、酸加水分解ゼラチン等の
ポリマー材料、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−４０
５、ツイーン−２０、ツイーン−８０等の界面活性剤等
を含有させることも可能である。

【００２９】本発明の総ビリルビン測定用試験紙におけ
る上記各薬剤の含有量であるが、まず、緩衝剤に関して
は、試験紙に試料が吸収された時に緩衝剤濃度が１〜３
モル／Ｌとなるような量で含有させることが好ましい。
測定時に緩衝剤濃度が１モル／Ｌ未満となるような含有
量では、試料保持層との界面付近に存在するジアゾ化試
薬を安定に保持しながら、試料保持層において間接型ビ
リルビンを含む全てのビリルビンを短時間で十分にジア
ゾ反応させることのできる至適ｐＨ値をもたらすことが
できないことがあり、また、測定時の緩衝剤濃度が３モ
ル／Ｌを越えるような量の緩衝剤を用いても、効果は変
化せず経済的でない。

【００３０】ジアゾ化試薬、反応促進剤の含有量に関し
ては、従来の試験紙と同程度の含有量とすればよい。つ
まり、測定時に試験紙に吸収される試料量に対して十分
かつ適当量の含有量であればよい。また、試薬層におい
てジアゾ化試薬を強酸性下に保持するために添加される
酸性物質の量は、添加する酸性物質にもよるが、概ね、
ジアゾ化試薬の重量に対して２〜５倍の量であればよ
い。例えば、ジアゾ化試薬としてスルファニル酸と亜硝
酸ナトリウムを、酸性物質としてスルホフタル酸を用い
る場合には、スルファニル酸と亜硝酸ナトリウムの合計
重量に対して２〜３倍量のスルホフタル酸を用いること
で、ジアゾ化試薬は十分安定に保持される。

【００３１】次に、本発明の総ビリルビン測定用試験紙
の製造方法であるが、通常の２層型ビリルビン試験紙同
様に行えばよい。例えば、通常の試験紙用のマトリック
ス体に上記適量の酸性物質とジアゾ化試薬を含有させた
試薬層と、同様なマトリックス体に上記緩衝剤及び反応
促進剤の適量を含有させた試料保持層とを、通常、試験
紙を作製する要領でそれぞれ別々に作製し、これらを通
常の方法で積層する等の方法を取ればよい。

【００３２】上記試験紙の作製に用いる各層のマトリッ
クス体としては、通常の試験紙作製に用いられるマトリ
ックス体が使用でき、例えば、濾紙、木綿紙、ガラス布
又はガラス繊維の不織布、石綿紙又は石綿布、ナイロ
ン、ポリエステル等の合成繊維からなる布又は不織布等
を挙げることができる。また、試薬層、試料保持層に
は、上述の様に、ポリビニルピロリドン、アクリルアミ
ドポリマー、アガロース、酸加水分解ゼラチン等のポリ
マー材料を含有させることも可能であるが、これらポリ
マー材料はそれ自体がマトリックス体を構成する材料と
なり得るので、試薬層、試料保持層の各層が上記ポリマ
ー材料を含有する場合には、さらに上記濾紙等の材料を
用いないこともある。マトリックス体として上記濾紙等
の材料を用いた場合でも、ポリビニルピロリドンの様な
ポリマー材料を用いた場合でも、その厚さは、概ね１０
０〜３００μｍである。

【００３３】この様なマトリックス体に薬剤を含有させ
る方法としては、やはり一般的な方法を用いればよく、
例えば、含有させたい薬剤を溶液状にしてトレーに入
れ、これにマトリックス体を漬けて直接含浸させる方
法、ポリエチレンテレフタレート（以下「ＰＥＴ」と省
略する）等の剥離性のよい樹脂フィルム上に一定の厚さ
で薬剤の溶液を塗工し、その上へマトリックス体をのせ
て吸い込ませ乾燥後、樹脂フィルムと分離する方法、薬
剤の溶液をスプレー等によりマトリックス体に噴霧する
方法等が挙げられる。また、この様にマトリックス体に
薬剤の溶液を含浸させる処理では、含浸処理後、マトリ
ックス体が薬剤の溶液を１００〜３００ｇ／ｍ²の割合
で含有する状態になることが好ましい。含浸後の乾燥
は、通常の方法で行われるが、本発明の総ビリルビン測
定用試験紙を構成する各層の作製においては乾燥温度３
０〜５０℃で乾燥が行われることが好ましい。

【００３４】また、上記ポリマー材料のみでマトリック
ス体を形成させる場合には、例えば、含有させたい薬剤
とポリマー材料を含む溶液を作製し、これをＰＥＴ等の
樹脂フィルム上に適当な濡れ厚さで塗工して乾燥後、樹
脂フィルムと分離する方法が取られる。なお、試薬層を
この方法で作製する場合には、樹脂フィルムは必要に応
じてそのまま残すことも可能である。

【００３５】この様にして、本発明の試験紙を構成す
る、適量の酸性物質とジアゾ化試薬をマトリックス体に
含有させた試薬層と、所定量のｐＫ_a値６.０〜８.０の
緩衝剤及び適量の反応促進剤をマトリックス体に含有さ
せた試料保持層とが得られるが、この２層を積層するこ
とにより本発明の総ビリルビン測定用試験紙となる。積
層の方法は、例えば、測定に悪影響を与えないような接
着剤を用いて上記２層を点接着等で部分接着させて積層
する方法や、また、試薬層、試料保持層に上記ポリマー
材料が含有する場合には、その一方の層の表面を少量の
水で湿らせてもう一方の層と密着させることでポリマー
材料を接着剤的に使用して積層する方法等が挙げられ
る。

【００３６】試験紙類の製造は、通常マトリックス体を
原型のまま用いて薬剤を含浸処理し、その後これを使用
サイズに裁断する方法が取られるが、本発明の試験紙に
おいても作業性からいってこの製造方法に準じた方法、
つまり、含浸、積層、裁断の順の製造方法が好ましく用
いられる。また、試験紙には、ＰＥＴフィルム等の支持
体などが取り付けられることもあるが、本発明の総ビリ
ルビン測定用試験紙に支持体等を取り付ける場合には、
本発明の試験紙において測定用試料が試料保持層に点着
されるため、通常、支持体等は試薬層側に取り付けられ
る。

【００３７】この様にして得られる本発明の総ビリルビ
ン測定用試験紙を用いて体液中の総ビリルビン量が測定
される。総ビリルビン量測定は、具体的には、総ビリル
ビン測定用試験紙の試料保持層に適量の検体をピペット
等を用いて、あるいは専用測定機を用いる場合にはその
点着機能等を用いて点着し、所定の時間（概ね３〜５
分）が経過した後、アゾビリルビン色素により色が変化
した試験紙の反射率を反射率計や積分球を付属した分光
光度計等により測定し、この測定値と総ビリルビン濃度
既知の検体の反射率の測定により予め作成された検量線
から、検体の総ビリルビン量を算定することで行われ
る。また、上記反射率の替わりに、次式により反射率か
ら求められたＫ／Ｓ値を用いて同様に総ビリルビン量測
定を行うことも可能である。

【００３８】

【数１】Ｋ／Ｓ値＝（１−Ｒ）²／２Ｒ Ｒ：反射率（％）

【００３９】また、上記測定に際しては、必要に応じて
血清等の検体に、上述した反応促進剤、例えば、ダイフ
ィリンや酢酸ナトリウム等を加える等の処理を施すこと
も可能である。

【００４０】

【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。実施例の
総ビリルビン測定用試験紙を、以下の方法で、試料保持
層及び試薬層をそれぞれ別々に作製し、これを積層、次
いで試験紙へと加工することで作製した。

【００４１】（１）試料保持層の作製 ロール状に巻かれた巾３０ｃｍ、厚さ１５０μｍのマト
リックス体（ザヴィーナ・ミニマックス；（株）鐘紡の
商標；ナイロンとポリエステルの編み物）を順次引き出
しながら、トレーに入れた表１に示す組成の水溶液（緩
衝剤としてＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスル
ホン酸）、反応促進剤としてダイフィリンを使用）中
に、溶液含浸量が１５０ｇ／ｍ²となるようにして浸漬
した後、４０℃の乾燥機内で５分間乾燥させて、試料保
持層を得た。

【００４２】

【表１】

【００４３】（２）試薬層の作製 ロール状に巻かれた巾３０ｃｍ、厚さ１００μｍのＰＥ
Ｔフィルムを順次引き出しながら、そのフィルム上に濡
れ厚さ１５０μｍで表２に示す組成の水溶液（ジアゾ化
試薬としてスルファニル酸と亜硝酸ナトリウムを使用）
を塗工し、４０℃の乾燥機内で５分間乾燥させて、ＰＥ
Ｔフィルム付きの試薬層を得た。

【００４４】

【表２】

【００４５】（３）積層及び試験紙への加工 上記（１）で得られた試料保持層に、蒸留水２００ｇに
トリトンＸ−１００を０.５ｇの割合で含有する溶液を
３０ｇ／ｍ²になるように噴霧し、試料保持層の表面が
湿った状態で、上記（２）で得られたＰＥＴフィルム付
き試薬層の試薬層面を接触させた。両層が接触した状態
で４０℃の乾燥機内で５分間乾燥させた。この処理によ
り、試料保持層の湿気が試薬層のポリビニルピロリドン
をほんの少しだけ溶かし、これが接着剤的役割を果たす
ことで２層は積層された。積層後、ロール状の試験紙を
３０ｃｍ×３０ｃｍサイズにカットし試験紙原反とし
た。

【００４６】この様にして得られた試験紙の原反（３０
ｃｍ×３０ｃｍ）を、さらに使用サイズである５×７ｍ
ｍに裁断し、この試験紙を支持体である５×８０ｍｍの
スティック状のＰＥＴフィルム（厚さ０.５ｍｍ）に、
試料保持層を上にして両面テープで貼り付けることで総
ビリルビン測定用試験紙を得た。この様にして得られた
総ビリルビン測定用試験紙の側面図を図１に示す。

【００４７】また、緩衝剤を上記ＭＥＳからｐＨ３.０
〜５.０で緩衝能の高いクエン酸３ナトリウムに換えた
以外は全て上記と同様にして比較例の総ビリルビン測定
用試験紙を作製した。得られた各試験紙の各層における
薬剤含有量（ｇ／ｍ²）を表３に示す。

【００４８】

【表３】

【００４９】＜本発明の総ビリルビン測定用試験紙の評
価＞上記で得られた実施例の総ビリルビン測定用試験紙
と比較例の総ビリルビン測定用試験紙を用いて下記検体
１、２の総ビリルビン量を測定し、評価した。

【００５０】（１）検体の調製 検体１は、プール血清（ネコバイオ社製）にビリルビン
IX（シグマ社製）を添加し、総ビリルビン濃度２０.０
ｍｇ／ｄＬに調整したものである。ビリルビンIXは間接
型ビリルビンであることから、検体１は高濃度間接型ビ
リルビン検体である。検体２は、プール血清（ネコバイ
オ社製）にジタロウビリルビン（フナコシ社製）を添加
し、総ビリルビン濃度２０.０ｍｇ／ｄＬに調節した。
ジタウロビリルビンは直接型ビリルビンの疑似物質であ
ることから、検体２は高濃度直接型ビリルビン検体であ
る。

【００５１】（２）総ビリルビン量の測定 上記で得られた実施例、比較例の総ビリルビン測定用試
験紙を各６枚ずつ用意し、その試料保持層に検体１を、
専用測定機（ポータブル反射率測定機スポットケムＳＰ
−４４１０；（株）京都第一科学の商標）の点着機能で
自動的に５.０μｌずつ点着し、４分間放置した後、試
験紙面の検体点着部分の反射率を上記専用測定機で測定
した。得られた反射率を、既知濃度の検体によりあらか
じめ作成しておいた検量線に代入し、総ビリルビン量を
求めた。また、検体２についても同様に総ビリルビン量
を測定した。表４にその結果を示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】この結果から、試料保持層に、６.０〜８.
０のｐＫ_a値を有する緩衝剤ではなく、３.０〜５.０の
ｐＫ_a値を有する緩衝剤を含有する比較例の総ビリルビ
ン測定用試験紙では、高濃度直接型ビリルビン検体であ
る検体２の総ビリルビン量測定は正確に行えるが、高濃
度間接型ビリルビン検体である検体１の総ビリルビン量
測定は正確に行えていないのに比べ、本発明の総ビリル
ビン測定用試験紙は、検体１及び検体２の両方の検体の
総ビリルビン量を正確に測定できることが明らかであ
る。

【００５４】

【発明の効果】本発明の総ビリルビン測定用試験紙は、
試験紙の特徴である測定の簡便性を有すると共に、保存
時はもちろんのこと測定時においてもジアゾ化試薬を安
定に保持しながら、測定時に間接型ビリルビンの反応性
が低下しないようなｐＨ範囲を維持することができるの
で、体液中の総ビリルビン濃度を正確に測定することが
可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の総ビリルビン測定用試験紙の１実施
例を示す側面図。

【符号の説明】

１．試料保持層 ２．試薬層 ３．ＰＥＴフィルム ４．支持体（ＰＥＴフィルム）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−171864（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−169796（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−322903（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−23253（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−71363（ＪＰ，Ａ) 特公 平７−23894（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】強酸性下にジアゾ化試薬を保持する試薬層
   と、pK_a値が６ . ０〜８ . ０である緩衝剤及び反応促進剤
   を含有し前記試薬層の全部又は少なくとも一部に接する
   試料保持層と、を有することを特徴とする体液中の総ビ
   リルビン測定用試験紙。
2. 【請求項２】 緩衝剤が、ＭＥＳ（２-(Ｎ-モノホリノ)
   エタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ-ビス(２-ヒドロ
   キシエチル)-２-アミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥ
   Ｓ（Ｎ-２-ヒドロキシエチルピペラジン-Ｎ'-エタンス
   ルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（２-ヒドロキシ-３-［４-
   (２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジニル］プロパンス
   ルホン酸）、ＥＰＰＳ（３-［４-(２-ヒドロキシエチ
   ル)-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸）から選ば
   れる請求項１記載の総ビリルビン測定用試験紙。
3. 【請求項３】 試料保持層における緩衝剤の含有量が、試
   験紙に試料が吸収された時に緩衝剤濃度が１〜３モル／
   Ｌとなる量である請求項１又は２に記載の総ビリルビン
   測定用試験紙。