JPS6185200A - 総コレステロールの比色測定用分析要素及び比色測定方法 - Google Patents
総コレステロールの比色測定用分析要素及び比色測定方法Info
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- JPS6185200A JPS6185200A JP60210337A JP21033785A JPS6185200A JP S6185200 A JPS6185200 A JP S6185200A JP 60210337 A JP60210337 A JP 60210337A JP 21033785 A JP21033785 A JP 21033785A JP S6185200 A JPS6185200 A JP S6185200A
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- G01N33/526—Multi-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
愈果上生程反光団
本発明は、総コレステロールの酵素分析に関する。本発
明は、特に、改良された分析要素及び生物学的液体、例
えばヒト血清中の総コレステロールを測定するため前記
分析要素を作製し、使用する方法に関する。
明は、特に、改良された分析要素及び生物学的液体、例
えばヒト血清中の総コレステロールを測定するため前記
分析要素を作製し、使用する方法に関する。
従来の技術
全血のコレステロール含有里がヒト及び動物におけるあ
る種の病気に直接関係することはかなり良く一般に確認
されている。これらの病気には、肝細胞疾患、甲状腺代
謝疾１色、胆管閉塞及びアテローム性動脈硬化症及び他
の血管障害がある。コレステロールは、血液中に遊則の
形又はそのエステルの形で存在する。遊離コレステロー
ルとは、その未反応状態のコレステロールを言う。総コ
レステロールは、遊離コレステロールとそのエステル３
ｆｆ ”Ｌ体の和である。コレステロールは、正常状態
の血清中に一定量で認められる。一般に、血清中の総コ
レステロール濃度の２５％は遊間ｌコレステロールであ
り、残りの７５％はエステルｉＭ Ｂ体の形である。
る種の病気に直接関係することはかなり良く一般に確認
されている。これらの病気には、肝細胞疾患、甲状腺代
謝疾１色、胆管閉塞及びアテローム性動脈硬化症及び他
の血管障害がある。コレステロールは、血液中に遊則の
形又はそのエステルの形で存在する。遊離コレステロー
ルとは、その未反応状態のコレステロールを言う。総コ
レステロールは、遊離コレステロールとそのエステル３
ｆｆ ”Ｌ体の和である。コレステロールは、正常状態
の血清中に一定量で認められる。一般に、血清中の総コ
レステロール濃度の２５％は遊間ｌコレステロールであ
り、残りの７５％はエステルｉＭ Ｂ体の形である。
聡コレステロールの公知の電工分析法は、遊離コレステ
ロール及びコレステロールエステルの両方を検出可能の
生成物に変える酵素を使用するものである。この６１８
法は、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ及びペルオキシダーゼの関与する下記の一連
の反応を使用する。
ロール及びコレステロールエステルの両方を検出可能の
生成物に変える酵素を使用するものである。この６１８
法は、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ及びペルオキシダーゼの関与する下記の一連
の反応を使用する。
リボ蛋白質−コレスチロールエステル錯体＋８２０コレ
スト−４−エン−３−オン ＋ Ｈ２Ｏ２着色染料 十
Ｈ２Ｏ 以下余白 第一の反応においては、すべてのコレステロールエステ
ルが加水分解されて遊離コレステロールになることが重
要である。このことは、コレステロールエステラーゼ活
性を有する酵素である一次力ｎ水分解試薬を用いて達成
することができる。この酵素は、リパーゼ、エステラー
ゼ又はコレステロールエステル加水分解酵素として知ら
れている。
スト−４−エン−３−オン ＋ Ｈ２Ｏ２着色染料 十
Ｈ２Ｏ 以下余白 第一の反応においては、すべてのコレステロールエステ
ルが加水分解されて遊離コレステロールになることが重
要である。このことは、コレステロールエステラーゼ活
性を有する酵素である一次力ｎ水分解試薬を用いて達成
することができる。この酵素は、リパーゼ、エステラー
ゼ又はコレステロールエステル加水分解酵素として知ら
れている。
しかしながら、その際、不完全な加水分解が起こって、
不正確に低いコレステロール測定値を生じうろことが知
られている。胆汁補助因子、プロテアーゼ又は非イオン
表面活性剤〔例えば、ペンシルバニア州フィラデルフィ
アのローム・アント・ハース（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａ
ｓ ）社から入手しうるトリトン（ＴＲＩＴＯＮ）表面
活性剤〕を添加することによってエステル加水分解を増
加する試みが多数なされた。
不正確に低いコレステロール測定値を生じうろことが知
られている。胆汁補助因子、プロテアーゼ又は非イオン
表面活性剤〔例えば、ペンシルバニア州フィラデルフィ
アのローム・アント・ハース（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａ
ｓ ）社から入手しうるトリトン（ＴＲＩＴＯＮ）表面
活性剤〕を添加することによってエステル加水分解を増
加する試みが多数なされた。
臨床化学の分野における最近の進歩したものは、イース
トマン・コダソク・カンバニイ ＣＥａｓ ｔｍａｎＫ
ｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ ） 、アメリカ合衆国ニュ
ーヨーク州ロチェスター在〕によって製造され、エクタ
ヘム・クリニカル・ケミストシイ・スライド（ＥＫＴＡ
ＣＨＥＭ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５
ｌｉｄｅ ） （Ｃ）ＩＯＬ）のラベルを付され、“
コダソク・エクタヘム・クリニカル・ケミストシイ・プ
ロダクツ・テスト・メソドロシイ・フォー・コレステロ
ール・アナリシス（Ｋｏｄａｋ ＥＫＴＡＣＨＥＭ Ｃ
１１ｎｉｃａｌ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ
Ｔｅ５ｔ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｈｏ
ｌｅｓｔｅｒｏｌＡｎａｌｙｓｉｓ） ”という標題
で１９８３年に発行されたコダソクの刊行物ＭＰ２３５
に記載されている総コレステロールの測定用の多層分析
要素である。この要素は、コレステロールエステルを加
水分解する試薬を含み、試験試料中の総コレステロール
を測定する。例えば、この要素は、５４０１゜ＩＪ、／
ｎ？のコレステロールエステル加水分解酵素及び１１ｇ
／ｍの非イオン表面活性剤を含む。
トマン・コダソク・カンバニイ ＣＥａｓ ｔｍａｎＫ
ｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ ） 、アメリカ合衆国ニュ
ーヨーク州ロチェスター在〕によって製造され、エクタ
ヘム・クリニカル・ケミストシイ・スライド（ＥＫＴＡ
ＣＨＥＭ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５
ｌｉｄｅ ） （Ｃ）ＩＯＬ）のラベルを付され、“
コダソク・エクタヘム・クリニカル・ケミストシイ・プ
ロダクツ・テスト・メソドロシイ・フォー・コレステロ
ール・アナリシス（Ｋｏｄａｋ ＥＫＴＡＣＨＥＭ Ｃ
１１ｎｉｃａｌ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ
Ｔｅ５ｔ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｈｏ
ｌｅｓｔｅｒｏｌＡｎａｌｙｓｉｓ） ”という標題
で１９８３年に発行されたコダソクの刊行物ＭＰ２３５
に記載されている総コレステロールの測定用の多層分析
要素である。この要素は、コレステロールエステルを加
水分解する試薬を含み、試験試料中の総コレステロール
を測定する。例えば、この要素は、５４０１゜ＩＪ、／
ｎ？のコレステロールエステル加水分解酵素及び１１ｇ
／ｍの非イオン表面活性剤を含む。
−明が解 しようと るい１占
しかしながら、前記の要素が血清試料中に存在するトリ
グリセリドの変動する濃度に鋭敏であることが観察され
た。例えば、トリグリセリド濃度が高いと、総コレステ
ロール測定値を正に偏倚することがある。この作用を減
少する利用者の試みは、希釈操作を含むものであり、こ
の操作は時間を浪費し、かつ付加的な誤差を生じやすい
。更に、要素にただ１種の試薬の量を増加して添加する
だけでは、分析に多数の反応が使用されるので、トリグ
リセリドの悪影響は排除されない。
グリセリドの変動する濃度に鋭敏であることが観察され
た。例えば、トリグリセリド濃度が高いと、総コレステ
ロール測定値を正に偏倚することがある。この作用を減
少する利用者の試みは、希釈操作を含むものであり、こ
の操作は時間を浪費し、かつ付加的な誤差を生じやすい
。更に、要素にただ１種の試薬の量を増加して添加する
だけでは、分析に多数の反応が使用されるので、トリグ
リセリドの悪影響は排除されない。
。 占を ンするための
本発明は、水性液体中の総コレステロールの迅速かつ正
確な測定手段を従供する。前記の公知要素に起こる問題
点は、５ ｇ ／ ｒｒ！以上、１１ｇ／ｎ（未満の量
で存在する非イオン表面活性剤及び１，５００〜１２，
０００１．Ｕ、／ ｒＩ（の量で存在するＤＬｚステ’
ｒ：Ｊ−／ｌ／エステル加水分解酵素を含む総コレステ
ロールの比色測定用分析要素によって解決される。
確な測定手段を従供する。前記の公知要素に起こる問題
点は、５ ｇ ／ ｒｒ！以上、１１ｇ／ｎ（未満の量
で存在する非イオン表面活性剤及び１，５００〜１２，
０００１．Ｕ、／ ｒＩ（の量で存在するＤＬｚステ’
ｒ：Ｊ−／ｌ／エステル加水分解酵素を含む総コレステ
ロールの比色測定用分析要素によって解決される。
更に、水性液体中の総コレステロールの比色測定方法は
、 Ａ、？Ｆｊ、体試料全試料の分析要素と接触させて色の
変化を発生させる工程、及び Ｂ、生じた色の変化を検出する工程 を含む。
、 Ａ、？Ｆｊ、体試料全試料の分析要素と接触させて色の
変化を発生させる工程、及び Ｂ、生じた色の変化を検出する工程 を含む。
尖血皿銀
本発明は、水性液体、例えば生物学的液体中の聡コレス
テロールの測定用の分析要素を提供するものである。こ
のように分析しうる生物学的液体は、ヒト及び動物の全
血、血清、血プ？、排泄物等を含む。本明細書において
、測定とは、特に断らない限り、定性（即ち、単に検出
）、半定量又は定量分析を意味する。
テロールの測定用の分析要素を提供するものである。こ
のように分析しうる生物学的液体は、ヒト及び動物の全
血、血清、血プ？、排泄物等を含む。本明細書において
、測定とは、特に断らない限り、定性（即ち、単に検出
）、半定量又は定量分析を意味する。
この分析法は、前記の一連の反応を利用する酵素分析で
ある。この分析に利用する主な試薬は、コレステロール
エステル加水分ＭＨ素、コレステロールオキシダーゼ、
非イオン界面活性剤、ｆｉ化性化合物及び比色組成物を
含む。
ある。この分析に利用する主な試薬は、コレステロール
エステル加水分ＭＨ素、コレステロールオキシダーゼ、
非イオン界面活性剤、ｆｉ化性化合物及び比色組成物を
含む。
コレステロールエステル加水分解酵素（以下、ＣＥＨと
記す）は、前記の従来の要素には５４０Ｉ．Ｕ、／ｎ（
存在したのに対し、本発明の要素には、１５００〜１２
，０００１．Ｕ、 ／ ｍの量で存在する。本明細書に
おいて、１．Ｕ、は酵素活性に関する国際単位を表し、
ｉ ＋、ｕ、は所定の酵素に関して標Ｑｔ、 ｐ ｌ
ｌ及び温度条件下に１分当たり１マイクロモルの基質の
変換を触媒するため必要な酵素活性の量であると定義さ
れる。ＣＥＨ活性は、下記のように測定する。ＣＥＨは
、コレステロールエステルを遊離コレステロールに加水
分解する反応を触媒する酵素である。ＣＥ Ｈは、コレ
ステロールエステラーゼ又はリパーゼとしても文献に公
知である。ＣＥＨは、要素中に好ましくは２０００〜９
０００１．Ｕ。
記す）は、前記の従来の要素には５４０Ｉ．Ｕ、／ｎ（
存在したのに対し、本発明の要素には、１５００〜１２
，０００１．Ｕ、 ／ ｍの量で存在する。本明細書に
おいて、１．Ｕ、は酵素活性に関する国際単位を表し、
ｉ ＋、ｕ、は所定の酵素に関して標Ｑｔ、 ｐ ｌ
ｌ及び温度条件下に１分当たり１マイクロモルの基質の
変換を触媒するため必要な酵素活性の量であると定義さ
れる。ＣＥＨ活性は、下記のように測定する。ＣＥＨは
、コレステロールエステルを遊離コレステロールに加水
分解する反応を触媒する酵素である。ＣＥ Ｈは、コレ
ステロールエステラーゼ又はリパーゼとしても文献に公
知である。ＣＥＨは、要素中に好ましくは２０００〜９
０００１．Ｕ。
／Ｉ′＋（、更に好ましくは２５００〜７０００１．Ｕ
。
。
／ポの被覆量で存在する。
ＣＥＨは市販されているか、又は例えば米国特許第４．
２７５，１５１号明細書〔ニスダース（Ｅｓｄｅｒｓ
）らに１９８１年６月２３日に交付〕に記載されている
ように文献に公知の製造技法を使用して植物又は微生物
源から容易に製造することができる。 本発明の要素は
、非イオン表面活性剤を、前記の公知要素の１１ｇ／ｍ
以上に対して、５ ｇ／ｎ（以上、１１ｇ／ｎ（未満の
量で、好ましくは６〜８ ｇ ／ ｍの被Ｊｍｆｆｉで
含む。この新規濃度の表面活性剤では、コレステロール
エステルの加水分解は、完全であると思われるが、分析
に使用される他の反応は問題となるほど抑制されない。
２７５，１５１号明細書〔ニスダース（Ｅｓｄｅｒｓ
）らに１９８１年６月２３日に交付〕に記載されている
ように文献に公知の製造技法を使用して植物又は微生物
源から容易に製造することができる。 本発明の要素は
、非イオン表面活性剤を、前記の公知要素の１１ｇ／ｍ
以上に対して、５ ｇ／ｎ（以上、１１ｇ／ｎ（未満の
量で、好ましくは６〜８ ｇ ／ ｍの被Ｊｍｆｆｉで
含む。この新規濃度の表面活性剤では、コレステロール
エステルの加水分解は、完全であると思われるが、分析
に使用される他の反応は問題となるほど抑制されない。
広範の非イオン表面活性剤が本発明の実施に有用である
が、特に有用な非イオン表面活性剤は、ローム・アンド
・ハース０カンパニイ（（Ｒｏｈｍ ａｎｄ １ｌａａ
ｓ Ｃｏｍｐａｎｙ ） ％アメリカ合衆国ペンシルバ
ニア州フィラデルフィア在〕からトリトン（ＴＲＩＴＯ
Ｎ）の商標で市販されているアルキルフェノキシポリエ
トキシエタノールである。好ましいアルキルフェノキシ
ポリエトキシエタノールは、２０個未満のオキシエチレ
ン単位のポリオキシエチレン鎖を含み、アルキル部分に
８又は９個の炭素原子を有する。他の有用な非イオン表
面活性剤は、当業者によって決定されうる。
が、特に有用な非イオン表面活性剤は、ローム・アンド
・ハース０カンパニイ（（Ｒｏｈｍ ａｎｄ １ｌａａ
ｓ Ｃｏｍｐａｎｙ ） ％アメリカ合衆国ペンシルバ
ニア州フィラデルフィア在〕からトリトン（ＴＲＩＴＯ
Ｎ）の商標で市販されているアルキルフェノキシポリエ
トキシエタノールである。好ましいアルキルフェノキシ
ポリエトキシエタノールは、２０個未満のオキシエチレ
ン単位のポリオキシエチレン鎖を含み、アルキル部分に
８又は９個の炭素原子を有する。他の有用な非イオン表
面活性剤は、当業者によって決定されうる。
ＣＥＨ及び非イオン表面活性剤のこれらの濃度で、有害
なトリグリセリド作用は著しく減少されるが、他の酵素
反応は促進される。例えばトリグリセリドの妨害は、下
記の実施例１〜４に示したように４０■／ｄ１未満に低
減される。
なトリグリセリド作用は著しく減少されるが、他の酵素
反応は促進される。例えばトリグリセリドの妨害は、下
記の実施例１〜４に示したように４０■／ｄ１未満に低
減される。
コレステロールオキシダーゼ（以下、ＣＯＤと記す）は
、ｔｔ離コレステロールと酸素の反応によりコレステノ
ン（コレスト−４−エン−３−オンとしても公知）及び
過酸化水素を形成する反応を触媒するため使用される酵
素である。要素におけるＣＯＤの被覆量は広範に変動す
ることができるが、一般に要素中に少なくとも２００（
Ｍ、Ｕ、／ボ、好ましくは２４００〜４０００１．Ｕ、
／ｎ（の被覆量で存在する。ＣＯＤは市場で入手しう
るか又は例えば、リサーチ・ディスクロージャー（Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ ） １２６巻４
６〜５０頁（１９７４年）、メソノヅ・イン・エンツィ
モロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ ） １巻、ニューヨークのアカデミツク・プレス
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、６７８頁（１９５
５年） 、Ｊ、 Ｂｉｏｉ、 Ｃｈｅｍ、、２０６巻５
１１頁（１９５４年）及び西ドイツ特許第２，２４６，
６９５号明細吉（１９７３年３月２６日に発行）に記載
されている公知発酵技術を使用して微生物源から容易に
製造することができる。リサーチ・ディスクロージャー
は、イギリス国ｐｏｉ。
、ｔｔ離コレステロールと酸素の反応によりコレステノ
ン（コレスト−４−エン−３−オンとしても公知）及び
過酸化水素を形成する反応を触媒するため使用される酵
素である。要素におけるＣＯＤの被覆量は広範に変動す
ることができるが、一般に要素中に少なくとも２００（
Ｍ、Ｕ、／ボ、好ましくは２４００〜４０００１．Ｕ、
／ｎ（の被覆量で存在する。ＣＯＤは市場で入手しう
るか又は例えば、リサーチ・ディスクロージャー（Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ ） １２６巻４
６〜５０頁（１９７４年）、メソノヅ・イン・エンツィ
モロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ ） １巻、ニューヨークのアカデミツク・プレス
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、６７８頁（１９５
５年） 、Ｊ、 Ｂｉｏｉ、 Ｃｈｅｍ、、２０６巻５
１１頁（１９５４年）及び西ドイツ特許第２，２４６，
６９５号明細吉（１９７３年３月２６日に発行）に記載
されている公知発酵技術を使用して微生物源から容易に
製造することができる。リサーチ・ディスクロージャー
は、イギリス国ｐｏｉ。
７ＤＤハンプツヤ−・エムスワース・ノース・ストリー
ト８のジ・オールド・ハーハーマスターズ（Ｔｈｅ Ｏ
ｌｄ ｔｌａｒｂｏｕｒｍａｓｔｅｒ’ｓ ） 、ケニ
ス・メーノン・パブリケイションズ・リミテッド（Ｋｅ
ｎｎｅｔｈ門ａｓｏｎ ｒ’ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、
Ｌｔｄ、 ）から入手しうる刊行物である。
ト８のジ・オールド・ハーハーマスターズ（Ｔｈｅ Ｏ
ｌｄ ｔｌａｒｂｏｕｒｍａｓｔｅｒ’ｓ ） 、ケニ
ス・メーノン・パブリケイションズ・リミテッド（Ｋｅ
ｎｎｅｔｈ門ａｓｏｎ ｒ’ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、
Ｌｔｄ、 ）から入手しうる刊行物である。
（，６コレステロールは、貨離コレステロールの酸化か
ら発生する過酸化水素と反応すると色の変化を生ずる比
色組成物を使用して本発明の実施により測定される。こ
の過酸化物反応を触媒するため過酸化物質を使用する。
ら発生する過酸化水素と反応すると色の変化を生ずる比
色組成物を使用して本発明の実施により測定される。こ
の過酸化物反応を触媒するため過酸化物質を使用する。
過酸化物質は、ペルオキシダーゼ様活性又は過酸化物活
性を示す物質である。即ち、これは過酸化水素又は別の
過酸化物による別の物質の酸化を触媒する能力を有する
化合物である。ペルオキシダーゼは、−Ｃに、鉄ポルフ
ィリンを含む共役蛋白質である。これは市場で入手しう
るか又は公知の製造操作を使用して種々のプラント若し
くは微生物源から容易に得られる。
性を示す物質である。即ち、これは過酸化水素又は別の
過酸化物による別の物質の酸化を触媒する能力を有する
化合物である。ペルオキシダーゼは、−Ｃに、鉄ポルフ
ィリンを含む共役蛋白質である。これは市場で入手しう
るか又は公知の製造操作を使用して種々のプラント若し
くは微生物源から容易に得られる。
ある種の合成ペルオキシダーゼ並びにヘミン、メトヘモ
グロビン、オキシヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモク
ロモーゲン、アルカリヘマチン、ヘミン誘導体、スルホ
シアン酸鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン化鉄、クロム
酸塩等も本発明の実施に有用である。川は変動しうるが
、要素中に」過酸化物質は一般に、少なくとも４０．０
００１．Ｕ、 ／ ｍのペルオキシダーゼ活性に等しい
量で、好ましくは６０、ＯＯＯ〜１６０，０００１．Ｕ
、 ／ ｇのペルオキシダーゼ当量活性の被覆量で存在
する。換言すれば、非酢素過酸化物質を使用する場合、
ｇ／ｄ単位の被覆量は示した酵素活性と同等の過酸化物
活性を生ずる回である。
グロビン、オキシヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモク
ロモーゲン、アルカリヘマチン、ヘミン誘導体、スルホ
シアン酸鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン化鉄、クロム
酸塩等も本発明の実施に有用である。川は変動しうるが
、要素中に」過酸化物質は一般に、少なくとも４０．０
００１．Ｕ、 ／ ｍのペルオキシダーゼ活性に等しい
量で、好ましくは６０、ＯＯＯ〜１６０，０００１．Ｕ
、 ／ ｇのペルオキシダーゼ当量活性の被覆量で存在
する。換言すれば、非酢素過酸化物質を使用する場合、
ｇ／ｄ単位の被覆量は示した酵素活性と同等の過酸化物
活性を生ずる回である。
過酸化水素及び過酸化物質の存在で検出可能な変色を生
ずる任意の適当な比色組成物を本発明の実施に使用する
ことができる。このように使用しうる代表的な物質は、
必要に応し発色剤と共に下記の物質を含む： モノアミン類、例えばアニリン及びそのｇＲ’１１体、
ジアミン類、例えば０−フェニレンジアミン、ヘンジジ
ン等、 フェノール類、フェノール、チモール、クレゾール、ナ
フトール等、 ポリフェノール類、例えばカテコール、グアヤコール、
ピロガロール等、 芳香族酸、例えばサリチル酸、没食子酸等、ロイコ染料
、例えばロイコマラカイトグリーン、米国特許第４，０
８９，７４７号明細書〔ブラソシイ（Ｂｒｕｓｃｈｉ
）に１９７８年５月１６日交付〕に記載されているトリ
アリールイミダゾール類及びトリアリールメタン類〔パ
ブ（Ｂ、 Ｅ、 Ｂａｂｂ）及びダニエル（Ｄ、 Ｓ、
Ｄａｎｉｅｌ）らの名で１９８４年５月２１日に出願
された米国特許出願第６１２，５０９号明細書に記載さ
れているものを含む〕、 石仏した染料、例えば２．６−シクロロフエノールイン
ドフエノール、 種々の生物学的物質、例えばエピネフリン、フラボン類
、チロシン等、及び その他、臨床化学における当業者に公知のもの。
ずる任意の適当な比色組成物を本発明の実施に使用する
ことができる。このように使用しうる代表的な物質は、
必要に応し発色剤と共に下記の物質を含む： モノアミン類、例えばアニリン及びそのｇＲ’１１体、
ジアミン類、例えば０−フェニレンジアミン、ヘンジジ
ン等、 フェノール類、フェノール、チモール、クレゾール、ナ
フトール等、 ポリフェノール類、例えばカテコール、グアヤコール、
ピロガロール等、 芳香族酸、例えばサリチル酸、没食子酸等、ロイコ染料
、例えばロイコマラカイトグリーン、米国特許第４，０
８９，７４７号明細書〔ブラソシイ（Ｂｒｕｓｃｈｉ
）に１９７８年５月１６日交付〕に記載されているトリ
アリールイミダゾール類及びトリアリールメタン類〔パ
ブ（Ｂ、 Ｅ、 Ｂａｂｂ）及びダニエル（Ｄ、 Ｓ、
Ｄａｎｉｅｌ）らの名で１９８４年５月２１日に出願
された米国特許出願第６１２，５０９号明細書に記載さ
れているものを含む〕、 石仏した染料、例えば２．６−シクロロフエノールイン
ドフエノール、 種々の生物学的物質、例えばエピネフリン、フラボン類
、チロシン等、及び その他、臨床化学における当業者に公知のもの。
特に有用な比色組成物は、前記のロイコ染料及び特にブ
ラ、シイの特許に記載されたトリアリールイミダゾール
である。他の好ましい比色組成物は、酸化可能な顕色化
合物と反応して色の変化を生しうる色形成発色剤を含む
。有用な色形成発色剤は、米国特許第４．２５Ｌ６２９
号（出画らに１９８１年２月１７日交付）、同第、Ｉ
、 ２６０．６７９号（１田らに１９８１年４月７日交
付）及び同第４，３９６．７１４号明細書（前田らに１
９８３年８月２日交付）、特公昭５８−２２２００号公
報（１９８３年５月７日公告）、欧州特許出願第６８．
３５６号明細書（１９８３年１月５日公告）、英国特許
第２，１０７，８６３号明細書（１９８１年１０月２２
日公告）及び特公昭５８−８９８号公ンＥ （１９８３
年１月６日公告）に記載されているものを含めて置換ア
ニリン類（即ち、トルイジン類）を含む。代表的な酸化
可能な顕色化合物は、ヘンジジン及びその同族体、ｐ−
フェニルジアミン、ｐ−アミンフェノール、アミノアン
チピリン、例えば４−アミノアンチピリン等を含む。好
ましい顕色化合物は４−アミノアンチピリンである。
ラ、シイの特許に記載されたトリアリールイミダゾール
である。他の好ましい比色組成物は、酸化可能な顕色化
合物と反応して色の変化を生しうる色形成発色剤を含む
。有用な色形成発色剤は、米国特許第４．２５Ｌ６２９
号（出画らに１９８１年２月１７日交付）、同第、Ｉ
、 ２６０．６７９号（１田らに１９８１年４月７日交
付）及び同第４，３９６．７１４号明細書（前田らに１
９８３年８月２日交付）、特公昭５８−２２２００号公
報（１９８３年５月７日公告）、欧州特許出願第６８．
３５６号明細書（１９８３年１月５日公告）、英国特許
第２，１０７，８６３号明細書（１９８１年１０月２２
日公告）及び特公昭５８−８９８号公ンＥ （１９８３
年１月６日公告）に記載されているものを含めて置換ア
ニリン類（即ち、トルイジン類）を含む。代表的な酸化
可能な顕色化合物は、ヘンジジン及びその同族体、ｐ−
フェニルジアミン、ｐ−アミンフェノール、アミノアン
チピリン、例えば４−アミノアンチピリン等を含む。好
ましい顕色化合物は４−アミノアンチピリンである。
本明細書において、用語「色の変化」は、色かない場合
に色が発生ずる状態、一つの色から別の色へ、色の移動
が起こる状態又は前に存在する色が減少するか若しくは
完全に消失する状態に関する。一般に、前に色が存在し
ない場合には、色の変化は、着色染料の形成による。
に色が発生ずる状態、一つの色から別の色へ、色の移動
が起こる状態又は前に存在する色が減少するか若しくは
完全に消失する状態に関する。一般に、前に色が存在し
ない場合には、色の変化は、着色染料の形成による。
本発明に使用する酵素は、比較的狭いｐＨ範囲で（、ｋ
めて効率よく作用するので、一般に、分析中、即ち、液
体の試料と接触する際に要素環境を適切なｐＨに保持す
るのに充分な量で緩衝剤を要素中にに２合するのが好ま
しい。一般に、本発明には、要５；Ｌよ１種湯セの緩衝
剤を、分析の間、ｐＨを５．５〜９．５、好ましくは５
．５〜６．５に保持するのに充分な量で含む。有用な緩
衝剤及び量は、当業者によって容易に決定される。所望
の緩衝を達成する技法は、文献に公知であり、被覆前に
被覆組成物に通切な量の緩衝剤を溶解又は分散する。
めて効率よく作用するので、一般に、分析中、即ち、液
体の試料と接触する際に要素環境を適切なｐＨに保持す
るのに充分な量で緩衝剤を要素中にに２合するのが好ま
しい。一般に、本発明には、要５；Ｌよ１種湯セの緩衝
剤を、分析の間、ｐＨを５．５〜９．５、好ましくは５
．５〜６．５に保持するのに充分な量で含む。有用な緩
衝剤及び量は、当業者によって容易に決定される。所望
の緩衝を達成する技法は、文献に公知であり、被覆前に
被覆組成物に通切な量の緩衝剤を溶解又は分散する。
本発明の乾式分析要素は、前記の試薬を含む自立性吸収
性材料、即ち自立性吸収性又は吸水性材料のＹ：ｖいシ
ート、例えば口紙又は紙ストリップであってよい。この
ような要素は、文献に試験ストリップ、診断要素、ディ
ノブスティノク、診断剤等として知られている。イ１用
な吸収性材料は、紙、多孔性粒状構造体、多孔性ポリマ
ーフィルム、セルロース、木材、ガラス織♀（■、織布
及び不織布（合成及び非合成）並びに米国特許第３．０
９２．４６５号明細書（アダムス（Ａｄａｍｓ ）らに
１９６３年６月４日交付〕、同第３．８０２，８４２号
（ランテ（Ｌａｎｇｅ ）らに１９７４年４月９日交付
〕、同第３，９１５．６４７号〔ライト （Ｗｒｉｇｔ
ｌむ）に１９７５年ＩＯ月２８日交付〕、同第３．９１
７，４５３号〔ミリガン（旧１１ｉｇａｎ） らに１９
７５年１１月４日交付〕、同第３，９３６，３５７号（
ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）らに１９７６年２月３日
交付〕、同第４．１８６，２５１号〔タープトン（Ｔａ
ｒｂｕｔｔｏｎ ）に１９８０年１月２９日交付〕、同
第４，２４８．８２９号〔北島らに１９８１年２月３日
交付〕、同第４，２５５，３８４号〔北島らに１９８１
年３月１０日交付〕、同第４．２７０，９２０号〔近藤
らに１９８１年６月２日交付〕、同第４，２９Ｌ １２
１号〔アクアラティ （＾ｃｑｕａｔｉ ）らに１９８
１年９月２２日交付〕及び同第４，３１２，８３４号明
細書〔フォーゲル（Ｖｏｇｅｌ ）らに１９８２年１月
２６日交付〕及び英国特許第２．０５２．０５７号明細
書（１９８１年１月２１日公告）に例示されているもの
かろ製造することができる。
性材料、即ち自立性吸収性又は吸水性材料のＹ：ｖいシ
ート、例えば口紙又は紙ストリップであってよい。この
ような要素は、文献に試験ストリップ、診断要素、ディ
ノブスティノク、診断剤等として知られている。イ１用
な吸収性材料は、紙、多孔性粒状構造体、多孔性ポリマ
ーフィルム、セルロース、木材、ガラス織♀（■、織布
及び不織布（合成及び非合成）並びに米国特許第３．０
９２．４６５号明細書（アダムス（Ａｄａｍｓ ）らに
１９６３年６月４日交付〕、同第３．８０２，８４２号
（ランテ（Ｌａｎｇｅ ）らに１９７４年４月９日交付
〕、同第３，９１５．６４７号〔ライト （Ｗｒｉｇｔ
ｌむ）に１９７５年ＩＯ月２８日交付〕、同第３．９１
７，４５３号〔ミリガン（旧１１ｉｇａｎ） らに１９
７５年１１月４日交付〕、同第３，９３６，３５７号（
ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）らに１９７６年２月３日
交付〕、同第４．１８６，２５１号〔タープトン（Ｔａ
ｒｂｕｔｔｏｎ ）に１９８０年１月２９日交付〕、同
第４，２４８．８２９号〔北島らに１９８１年２月３日
交付〕、同第４，２５５，３８４号〔北島らに１９８１
年３月１０日交付〕、同第４．２７０，９２０号〔近藤
らに１９８１年６月２日交付〕、同第４，２９Ｌ １２
１号〔アクアラティ （＾ｃｑｕａｔｉ ）らに１９８
１年９月２２日交付〕及び同第４，３１２，８３４号明
細書〔フォーゲル（Ｖｏｇｅｌ ）らに１９８２年１月
２６日交付〕及び英国特許第２．０５２．０５７号明細
書（１９８１年１月２１日公告）に例示されているもの
かろ製造することができる。
本発明の乾式分析要素は、少な（とも一つの多孔性拡散
帯域を有するのが好ましい。この帯域は自立性吸収性材
料（即ち、その一体性を保持するのに充分に硬い材料か
らなる）であってよいが、好ましくは別の支持材料（一
般に支持体と言われる）上に支持される。このような支
持体は、任意の適当な寸法安定性及び好ましくは、２０
０〜９００ｎｍの波長の電磁線を透過する透明（即ち輻
射線透過性）材料であってよい。
帯域を有するのが好ましい。この帯域は自立性吸収性材
料（即ち、その一体性を保持するのに充分に硬い材料か
らなる）であってよいが、好ましくは別の支持材料（一
般に支持体と言われる）上に支持される。このような支
持体は、任意の適当な寸法安定性及び好ましくは、２０
０〜９００ｎｍの波長の電磁線を透過する透明（即ち輻
射線透過性）材料であってよい。
多孔性拡散帯域は、任意の適当な繊維材料若しくは非繊
維材料又はその一方若しくは両方の混合物から製造する
ことかできる。この帯域の空隙率及び平均孔径は、目的
とする用途に応じて変動する。例えば高分子遺物質を含
む全血又は他の液体試料を分析すべき場合には、空隙率
及び平均孔径は一般に、血清を分析する場合より大きい
。
維材料又はその一方若しくは両方の混合物から製造する
ことかできる。この帯域の空隙率及び平均孔径は、目的
とする用途に応じて変動する。例えば高分子遺物質を含
む全血又は他の液体試料を分析すべき場合には、空隙率
及び平均孔径は一般に、血清を分析する場合より大きい
。
有用な拡１１に帯域は、繊維材料を適当な結合剤と混合
するか又は布に織って使用して米国特許第４．２９２，
２７２号明！ＩＩＩ書（北島らに１９８１年９月２９日
交付）に記載されているように製造することができる。
するか又は布に織って使用して米国特許第４．２９２，
２７２号明！ＩＩＩ書（北島らに１９８１年９月２９日
交付）に記載されているように製造することができる。
また、拡散帯域は、ポリマー組成物（例えばブラソシボ
リマー）又は粒状材料から結合接着剤を用いるか又は用
いないで、米国特許第３．９９２．１５８号〔プルジビ
ロウィ、ツ（Ｐｒｚｙｂｙｌｏｗｉｃｚ）らに１９７６
年１１月１６日交付〕及び同第４，２５８，００１号明
細書（ピーアス（Ｐｉｅｒｃｅ）らに１９８１年３月２
４日交付〕に記載されているようにして製造する。他の
有用な拡散帯域の材料は、西ドイツ特許出願公開第３．
１５０．１０２号公報（１９８２年７月２９日公開）及
び特公昭５７−１０１７６０号公報（１９８２年６月２
４日公告）に記載されている（両方とも小西六写真に誼
渡されている）。拡散帯域は、等方性に多孔性であり、
このことは、多孔度が粒子、繊維、ポリマー糸等の間の
相互に連結される空間又は孔によって生じるように帯域
の各方向で同一であることを意味する。
リマー）又は粒状材料から結合接着剤を用いるか又は用
いないで、米国特許第３．９９２．１５８号〔プルジビ
ロウィ、ツ（Ｐｒｚｙｂｙｌｏｗｉｃｚ）らに１９７６
年１１月１６日交付〕及び同第４，２５８，００１号明
細書（ピーアス（Ｐｉｅｒｃｅ）らに１９８１年３月２
４日交付〕に記載されているようにして製造する。他の
有用な拡散帯域の材料は、西ドイツ特許出願公開第３．
１５０．１０２号公報（１９８２年７月２９日公開）及
び特公昭５７−１０１７６０号公報（１９８２年６月２
４日公告）に記載されている（両方とも小西六写真に誼
渡されている）。拡散帯域は、等方性に多孔性であり、
このことは、多孔度が粒子、繊維、ポリマー糸等の間の
相互に連結される空間又は孔によって生じるように帯域
の各方向で同一であることを意味する。
要素は、文献に公知の、総コレステロールの測定に適切
な種々の成分及び試薬を有していてよい。
な種々の成分及び試薬を有していてよい。
本発明の分析は、人為的又は自動的に行うことができる
。一般に、供給ロール、チップパケット等から要素を取
り、これを分析すべき液体の試料（例えば１〜１００μ
ｉ）と接触させることによって聡コレステロールを測定
する。このような接触は、任意の適当な方法で、例えば
要素を試料中に浸漬するか又は好ましくは適当な分散手
段を用いて要素に手又は典械により一滴の試料を滴下す
ることによって達成することができる。
。一般に、供給ロール、チップパケット等から要素を取
り、これを分析すべき液体の試料（例えば１〜１００μ
ｉ）と接触させることによって聡コレステロールを測定
する。このような接触は、任意の適当な方法で、例えば
要素を試料中に浸漬するか又は好ましくは適当な分散手
段を用いて要素に手又は典械により一滴の試料を滴下す
ることによって達成することができる。
試料を通用した後、要素を任意のコンディショニング、
例えばインキュベーション、加熱等、試験結果を得るの
を早めるか若しくは促進するために望ましいコンディシ
ョニング処理に付す。
例えばインキュベーション、加熱等、試験結果を得るの
を早めるか若しくは促進するために望ましいコンディシ
ョニング処理に付す。
聡コレステロールの測定は、惹起する色の変化（例えば
着色染料の形成）が検出される場合に達成される。この
変化を、肉眼で又は適当な分光光度測定装置及び操作を
用いて検出することができる。一般に、着色染料を測定
する場合、染料の吸光度をその吸収ピーク（λｍａｘ
）又はその付近で測定するが、若干の場合には吸収ピー
クから離れたところで吸光度を測定するのが有利である
。吸光度は要素及び分光光度測定装置の型に応じて透過
密度又は反射密度から／ｌｌｌ＋定することができる。
着色染料の形成）が検出される場合に達成される。この
変化を、肉眼で又は適当な分光光度測定装置及び操作を
用いて検出することができる。一般に、着色染料を測定
する場合、染料の吸光度をその吸収ピーク（λｍａｘ
）又はその付近で測定するが、若干の場合には吸収ピー
クから離れたところで吸光度を測定するのが有利である
。吸光度は要素及び分光光度測定装置の型に応じて透過
密度又は反射密度から／ｌｌｌ＋定することができる。
下記の実施例は、本発明の詳細な説明するためのもので
あり、例中に使用する材料は下記のようにして得られた
ものである二マイルス・ラボラトリイーズ（Ｍｉｌｅｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） （アメリカ合衆国イ
ンジアナ州ニルカート）からペルオキシダーゼ、エンザ
イム・デヘロノプメント・コーポレイション（Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ、） （ア
メリカ合衆国ニューヨーク州ニューヨーク）がらコレス
テロールエステル加水分解酵素、アップジョン・コーポ
レイション（［Ｉｐｊｏｈｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
） （アメリカ合衆国ミシガン州力うマズー）がらコ
レステロールオキシデーゼ、グツドリッチ（Ｂ、Ｆ。
あり、例中に使用する材料は下記のようにして得られた
ものである二マイルス・ラボラトリイーズ（Ｍｉｌｅｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） （アメリカ合衆国イ
ンジアナ州ニルカート）からペルオキシダーゼ、エンザ
イム・デヘロノプメント・コーポレイション（Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ、） （ア
メリカ合衆国ニューヨーク州ニューヨーク）がらコレス
テロールエステル加水分解酵素、アップジョン・コーポ
レイション（［Ｉｐｊｏｈｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
） （アメリカ合衆国ミシガン州力うマズー）がらコ
レステロールオキシデーゼ、グツドリッチ（Ｂ、Ｆ。
Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ） （アメリカ合Ｒ国オハイオ州
クリーブランド）からポリウレタン樹脂、ローム・アン
ド−／”ｔ−ス（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ ）
（アメリカ合衆国ペンシルバニア州フィラデルフィア）
からトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） （商標）χ−１００
及びトリトン（商標）Ｘ−２００Ｅ及ヒオリン・マチツ
ク・カンパニイ （Ｏｌｉｎｌａｔｈｉｅｓｏｎ Ｃ
ｏ、） （アメリカ合衆国コ不りティカノト州スタン
フォード）からサーファクタント１０Ｇ （Ｓｕｒｆ
ａｃｔａｎｔ ＩＯＧ、商標）。他の試薬及び材料−ま
ずべて、常用の操作を用いてその場で製造するか又はイ
ーストマン・オーガニック・ケミカルス（Ｅａｓｔｍａ
ｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） （ア
メリカ合衆国ニューヨーク州ロチェスター）から得られ
る。
クリーブランド）からポリウレタン樹脂、ローム・アン
ド−／”ｔ−ス（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ ）
（アメリカ合衆国ペンシルバニア州フィラデルフィア）
からトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） （商標）χ−１００
及びトリトン（商標）Ｘ−２００Ｅ及ヒオリン・マチツ
ク・カンパニイ （Ｏｌｉｎｌａｔｈｉｅｓｏｎ Ｃ
ｏ、） （アメリカ合衆国コ不りティカノト州スタン
フォード）からサーファクタント１０Ｇ （Ｓｕｒｆ
ａｃｔａｎｔ ＩＯＧ、商標）。他の試薬及び材料−ま
ずべて、常用の操作を用いてその場で製造するか又はイ
ーストマン・オーガニック・ケミカルス（Ｅａｓｔｍａ
ｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） （ア
メリカ合衆国ニューヨーク州ロチェスター）から得られ
る。
不明Ｉｉｌ書において、コレステロールエステル加水分
解酵素（ＣＥ Ｈ）の活性は、下記の一般的操作によっ
て測定できる： コレステリルリルエート （アメリカ合衆国ニューヨー
ク州ロチェスターのイーストマン・オーガニック・ケミ
カルスから入手しうる、分子量６４７のもの）２００ｍ
ｇ、）リドンＸ−１００非イオン表面活性剤５ｍｌ及び
脱イオン水９５ｍ１を用いて穏やかに攪拌し、加熱しな
がら基質溶液を製造する。
解酵素（ＣＥ Ｈ）の活性は、下記の一般的操作によっ
て測定できる： コレステリルリルエート （アメリカ合衆国ニューヨー
ク州ロチェスターのイーストマン・オーガニック・ケミ
カルスから入手しうる、分子量６４７のもの）２００ｍ
ｇ、）リドンＸ−１００非イオン表面活性剤５ｍｌ及び
脱イオン水９５ｍ１を用いて穏やかに攪拌し、加熱しな
がら基質溶液を製造する。
脱イオン水１ｍｌに酵素５■を添加することによってＣ
Ｅ Ｈ酵素溶液を製造する。
Ｅ Ｈ酵素溶液を製造する。
基質溶液０．１ｍｌ、０．０５モル燐酸塩緩衝液（ｐｌ
（７）２．５ｍｌ、ペルオキシダーゼｌ容７夜（５ｗ／
ｍ１Ｈ２０） ０．０３８１１１Ｌコレステロールオキ
シダーゼ？容液（６ｗ／ｍ１Ｈ２０） Ｏ，Ｏｌ ５ｍ
ｌ、ジメトキシヘンジジンジ塩酸塩（５ｍｇ／ｍ１Ｈ２
０） ０．０４ｍｌ及び脱イオン水を混合して容１３ｍ
１にすることによって試薬溶液試料を製造する。
（７）２．５ｍｌ、ペルオキシダーゼｌ容７夜（５ｗ／
ｍ１Ｈ２０） ０．０３８１１１Ｌコレステロールオキ
シダーゼ？容液（６ｗ／ｍ１Ｈ２０） Ｏ，Ｏｌ ５ｍ
ｌ、ジメトキシヘンジジンジ塩酸塩（５ｍｇ／ｍ１Ｈ２
０） ０．０４ｍｌ及び脱イオン水を混合して容１３ｍ
１にすることによって試薬溶液試料を製造する。
４種の試薬溶液の試料（それぞれ３ｍ１）を３７″Ｃで
５分加温し、バックグラウンドの吸光度を常用の分光光
度計で４３０ｎｍで測定する。ＣＥＨ酵素溶液、を脱イ
オン水で１：２０に希釈する。
５分加温し、バックグラウンドの吸光度を常用の分光光
度計で４３０ｎｍで測定する。ＣＥＨ酵素溶液、を脱イ
オン水で１：２０に希釈する。
希釈したＣ Ｅ Ｈ酵素溶液の既知量（２５μ君）を各
試薬溶液の試料に添加して４種の試験試料を作り、各試
験試料における生ずる染料の変色の吸光度を常用の分光
光度計で１２分４３０ｎｍで測定する。
試薬溶液の試料に添加して４種の試験試料を作り、各試
験試料における生ずる染料の変色の吸光度を常用の分光
光度計で１２分４３０ｎｍで測定する。
最後の５分の分析の間、吸光度の変化（ΔＡ）を測定し
、下記の式により活性（ｕ／■）を４１１定する： ゛ 以下余白 この活性（ｕ／ｍｇ）を公知の計算法により１．ｔｌ。
、下記の式により活性（ｕ／■）を４１１定する： ゛ 以下余白 この活性（ｕ／ｍｇ）を公知の計算法により１．ｔｌ。
活性に変換することができる。この試験を使用すると、
本発明に有用なＣＥＨの活性は、一般に、１５００〜６
０００１．１１．／ｍである。別の出所（アメリカ合衆
国ミズーリ州セントルイスのシグマ、ケミカル・カンパ
ニイ（Ｓｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、 ） ）か
らのＣＥＨ基質を使用するか又は前記の１より多量の基
質を使用すると、１５００〜１２０００Ｉ．Ｕ．／ｍ２
の広い範囲内で酵素活性が変化する。
本発明に有用なＣＥＨの活性は、一般に、１５００〜６
０００１．１１．／ｍである。別の出所（アメリカ合衆
国ミズーリ州セントルイスのシグマ、ケミカル・カンパ
ニイ（Ｓｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、 ） ）か
らのＣＥＨ基質を使用するか又は前記の１より多量の基
質を使用すると、１５００〜１２０００Ｉ．Ｕ．／ｍ２
の広い範囲内で酵素活性が変化する。
本発明に有用な他の酵素（ペルオキシダーゼ及びコレス
テロールオキシダーゼ）の活性は、常用の操作を使用し
て測定することができる。
テロールオキシダーゼ）の活性は、常用の操作を使用し
て測定することができる。
これらの実施例は、前記のコダフク刊行物ＭＰ２−３５
に記載されている対照として確認された公知要素と本発
明の改良された要素とを比較するものである。試験の結
果は、本発明の要素が著しく改良された性質を有するこ
とを示す。これらの結果は、特に、本発明により行った
ｔ３．％コレステロールの分析が試験イ（女体中に存在
するトリグリセリドによって無視しうる程度の影響し乃
・受けないことを示す。対照要素は、試験／８液中のト
リグリセリドによって許容できない程、影響を受ける。
に記載されている対照として確認された公知要素と本発
明の改良された要素とを比較するものである。試験の結
果は、本発明の要素が著しく改良された性質を有するこ
とを示す。これらの結果は、特に、本発明により行った
ｔ３．％コレステロールの分析が試験イ（女体中に存在
するトリグリセリドによって無視しうる程度の影響し乃
・受けないことを示す。対照要素は、試験／８液中のト
リグリセリドによって許容できない程、影響を受ける。
評価した要素は、下記の型及び成分を有するものであっ
た。下記の第１表は、各要素に関して異なる試薬の濃度
を示す。
た。下記の第１表は、各要素に関して異なる試薬の濃度
を示す。
以下余白
ン゛９−
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ ） 第１表参照コレステ
ロールエステル 〃 加水分解酵素（ＣＥＨ） コレステロールオキシダー 〃 ゼ（ＣＯＤ） 燐酸カリウム緩衝液（ｐ）１５．５〜 ６、５ ） １．５ ｇ ／
ｒｄ拡＃ｌｋ／ トリトン（商標） Ｘ−１００表面
試薬 活性剤 第１表参照層
硫酸バリウム １０８ｇ／ｍ酢酸セルロ
ース ９ｇ／ポ５．５−ジメチル−１，３
−シクロ ヘキサンジオン ０．４ｇ／ｍ２− （３，
５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル） −４，５
−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾール ロイコ染料 １．６ｇ／ｍポリウレタン
ｌ’ １．０．／ｍ下塗 ポリ （ｎ−
イソプロピルアクリ戸 ルアミド）Ｑ、４／ｍ 親水 ゼラチン（硬化） １８ｇ／ｍ性
結 燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ５，５合剤 〜６．
５ ） ０．３３ ｇ ／ ｍ層
トリトン（商標） Ｘ−２００Ｅ表面活性剤
０．０１ｇ／ｍ表面活性剤１０Ｇ Ｏ，
００６／ｍポリ （エチレンテレフタレート） 本 以１：全白 ］ＬＬ及 要素 被覆用 １ １．１０，０００ １６
２０ ６．５３６．５ ４ １００．０００ ３０００ ２７０
０ ８．５下記の方法で要素を評価した。
ロールエステル 〃 加水分解酵素（ＣＥＨ） コレステロールオキシダー 〃 ゼ（ＣＯＤ） 燐酸カリウム緩衝液（ｐ）１５．５〜 ６、５ ） １．５ ｇ ／
ｒｄ拡＃ｌｋ／ トリトン（商標） Ｘ−１００表面
試薬 活性剤 第１表参照層
硫酸バリウム １０８ｇ／ｍ酢酸セルロ
ース ９ｇ／ポ５．５−ジメチル−１，３
−シクロ ヘキサンジオン ０．４ｇ／ｍ２− （３，
５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル） −４，５
−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾール ロイコ染料 １．６ｇ／ｍポリウレタン
ｌ’ １．０．／ｍ下塗 ポリ （ｎ−
イソプロピルアクリ戸 ルアミド）Ｑ、４／ｍ 親水 ゼラチン（硬化） １８ｇ／ｍ性
結 燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ５，５合剤 〜６．
５ ） ０．３３ ｇ ／ ｍ層
トリトン（商標） Ｘ−２００Ｅ表面活性剤
０．０１ｇ／ｍ表面活性剤１０Ｇ Ｏ，
００６／ｍポリ （エチレンテレフタレート） 本 以１：全白 ］ＬＬ及 要素 被覆用 １ １．１０，０００ １６
２０ ６．５３６．５ ４ １００．０００ ３０００ ２７０
０ ８．５下記の方法で要素を評価した。
予めアヘルーケンダル（Ａｂｅｌｌ−Ｋｅｎｄａｌｌ
）法（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、１９５を３５７
頁１９５２年）によって４８０■／ｄｌの総コレステロ
ールを含むことを測定したヒト血清を２つのフラクショ
ン（Ｉ及び■）に分割した。フラクションｌ中にトリグ
リセリド９５０ｍｇ１ｄｌを添加した。各フラクション
の１０マイクロリツトルを各要素の拡散／試薬層にそれ
ぞれ施し、エクタヘム（ＥＫＴＡＣＨＥＭ） ＋ａ床化
学分析装置〔アメリカ合衆国ニューヨーク州ロチェスタ
ーの１゛−ストマン・コダソク・カンパニイ （Ｅａｓ
ｔｍａｎＫｏｄａｋ Ｃｏ、 ）から入手：を使用し
、常用の操作を使用して（反射濃度を５４０ｎｎ＋で観
察）、分析した。
）法（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、１９５を３５７
頁１９５２年）によって４８０■／ｄｌの総コレステロ
ールを含むことを測定したヒト血清を２つのフラクショ
ン（Ｉ及び■）に分割した。フラクションｌ中にトリグ
リセリド９５０ｍｇ１ｄｌを添加した。各フラクション
の１０マイクロリツトルを各要素の拡散／試薬層にそれ
ぞれ施し、エクタヘム（ＥＫＴＡＣＨＥＭ） ＋ａ床化
学分析装置〔アメリカ合衆国ニューヨーク州ロチェスタ
ーの１゛−ストマン・コダソク・カンパニイ （Ｅａｓ
ｔｍａｎＫｏｄａｋ Ｃｏ、 ）から入手：を使用し
、常用の操作を使用して（反射濃度を５４０ｎｎ＋で観
察）、分析した。
各要素に関して、フラクションｌのコレステロールの測
定値をフラクションＨの測定値から差し引いた。この差
は、Δコレステロール（■／８）と認められ、分析に対
する高トリグリセリドの影響の尺度である。これらの数
値を下記の第０表に示す。
定値をフラクションＨの測定値から差し引いた。この差
は、Δコレステロール（■／８）と認められ、分析に対
する高トリグリセリドの影響の尺度である。これらの数
値を下記の第０表に示す。
これらの二式験を、それぞれ３６０■／ｄｌのコレステ
ロール並びに１００及び４００ｍｇ／ｄｔのトリグリセ
リドを含む２種の血清を使用し、同し要素を使用して行
った。対照要素のコレステロール測定は、トリグリセリ
ドの存在によって不利に影響されるが、本発明の要素を
使用しての測定は影響されない。
ロール並びに１００及び４００ｍｇ／ｄｔのトリグリセ
リドを含む２種の血清を使用し、同し要素を使用して行
った。対照要素のコレステロール測定は、トリグリセリ
ドの存在によって不利に影響されるが、本発明の要素を
使用しての測定は影響されない。
（以下余白）
第■表
１玉 Δコレステロール（■／ ｄｉ ）対照
８９ 災工 本１明の要素における改−されたネ°セ１間の
再】ニー この実施例は、前記の公知要素に対比して本発明の要素
を用いて得られる改良された被覆間（ｃｏａｔｉｎｇ−
ｔｏ−ｃｏａｔｉｎｇ）の再現性を示す。
８９ 災工 本１明の要素における改−されたネ°セ１間の
再】ニー この実施例は、前記の公知要素に対比して本発明の要素
を用いて得られる改良された被覆間（ｃｏａｔｉｎｇ−
ｔｏ−ｃｏａｔｉｎｇ）の再現性を示す。
例１〜４のものと同様の型を有する２個の分析要素を本
発明により製造した。前記実施例の対照要素と同様にし
て２個の他の要素を製造した。すべての”Ｗ素に種々の
量のコレステロール及びトリグリセリドを含む数種の常
用の校正液のスポットをそれぞれつげた。各要素におい
て、前記のエクタヘム分析装置でコレステロールを４（
す定した。
発明により製造した。前記実施例の対照要素と同様にし
て２個の他の要素を製造した。すべての”Ｗ素に種々の
量のコレステロール及びトリグリセリドを含む数種の常
用の校正液のスポットをそれぞれつげた。各要素におい
て、前記のエクタヘム分析装置でコレステロールを４（
す定した。
本発明の要素は、２個の本発明の要素間のコレステロー
ル分析値の差が極めて小さいことによって示されるよう
に、改良された被ｆｌ’ｌの再現性を示した。しかしな
がら、対照の２個の要素は、コレステロール分析値に著
しい差を示し、低い被；Ｗ間の再現性を示した。
ル分析値の差が極めて小さいことによって示されるよう
に、改良された被ｆｌ’ｌの再現性を示した。しかしな
がら、対照の２個の要素は、コレステロール分析値に著
しい差を示し、低い被；Ｗ間の再現性を示した。
例６
下記の第■表に示すように異なる頃のコレステロールエ
ステル加水分解酵素及びトリトンＸ−１００を含む以外
は、例１〜４に記載したようにして数種の分析要素を製
造した。対照要素は本発明の範囲外の試薬濃度を有して
いた。これらの要素Ｑこおいては、ただ１種の試薬を変
えたが、本発明の要素では、２種の試薬を変えた。
ステル加水分解酵素及びトリトンＸ−１００を含む以外
は、例１〜４に記載したようにして数種の分析要素を製
造した。対照要素は本発明の範囲外の試薬濃度を有して
いた。これらの要素Ｑこおいては、ただ１種の試薬を変
えたが、本発明の要素では、２種の試薬を変えた。
６００１Ｔ１１−／ｄｌのコレステロール及び２５０■
／〃のトリグリセリドを含む血・清拭材を使用して、例
１〜４に記載したように要素を試験し、反射７１７！度
（ＤＲ）を１０分後にエクタヘム分析装置を用いて測定
した。下記の第■表に示したように、対照要素のＤＲは
著しく低く、このことは分析の反応が不完全てあったこ
とを意味”４−る。本発明の°ＳＳｊ素の分析は高いＤ
Ｒを生し、このことは聡コレス斗［１−ル測定に必要な
シ￥素反応が完全であったことを示す。
／〃のトリグリセリドを含む血・清拭材を使用して、例
１〜４に記載したように要素を試験し、反射７１７！度
（ＤＲ）を１０分後にエクタヘム分析装置を用いて測定
した。下記の第■表に示したように、対照要素のＤＲは
著しく低く、このことは分析の反応が不完全てあったこ
とを意味”４−る。本発明の°ＳＳｊ素の分析は高いＤ
Ｒを生し、このことは聡コレス斗［１−ル測定に必要な
シ￥素反応が完全であったことを示す。
第■表
ＣＥ）（） リ ト ンＸ−１００ＤＲ１要−４：
（１，Ｕ、 ／ ｍ ）（且ｙ＝＞ ＜去
ωヨ□て）（ンリ６ ６０００
８ １．６７対照Ａ ５１１
Ｏ１１１，４６ 対ｊｊＱＢ ＋６２０ １１ １．３３
況ｌ脇Ｃ３７８０１１１，３５ 対町％Ｄ ５４０ ６．５ １．２７
対］！αＥ ５ ＩＩ Ｏ８−１，−１４２」■
じ塀果 本発明の分析は、試験試料中のトリグリセリドの存在に
よって不利に影響されない。従って、本発明は従来の分
析で遭遇する問題点を回避する。
（１，Ｕ、 ／ ｍ ）（且ｙ＝＞ ＜去
ωヨ□て）（ンリ６ ６０００
８ １．６７対照Ａ ５１１
Ｏ１１１，４６ 対ｊｊＱＢ ＋６２０ １１ １．３３
況ｌ脇Ｃ３７８０１１１，３５ 対町％Ｄ ５４０ ６．５ １．２７
対］！αＥ ５ ＩＩ Ｏ８−１，−１４２」■
じ塀果 本発明の分析は、試験試料中のトリグリセリドの存在に
よって不利に影響されない。従って、本発明は従来の分
析で遭遇する問題点を回避する。
更２こ、本発明は改良された再現保持性及び被覆間の再
現性を有する要素を生じる。
現性を有する要素を生じる。
臨床化学におけるこれらの顕著な改良は、限定型の試薬
を含む改良された分析要素の使用によって」ヱ成される
。こり、らの乎のコレステロールエステル加水分解こ￥
素及び非イオン表面活性剤を使用すると、トリグリセリ
ドの不利な＋Ｆｊ ｌ：Ｔを５０％以北低戚ずろ。また
、ベルオキノダーゼ又はコレステロールオキシダーセの
計を；、■１節°−で １１ソ素を史Ｑこ改良すること
ができる。
を含む改良された分析要素の使用によって」ヱ成される
。こり、らの乎のコレステロールエステル加水分解こ￥
素及び非イオン表面活性剤を使用すると、トリグリセリ
ドの不利な＋Ｆｊ ｌ：Ｔを５０％以北低戚ずろ。また
、ベルオキノダーゼ又はコレステロールオキシダーセの
計を；、■１節°−で １１ソ素を史Ｑこ改良すること
ができる。
特詐出卓１人
イーストマン コダ７・イア カンパニー特許出１９，
０代理人
０代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、５ｇ／ｍ＾２以上、１１ｇ／ｍ＾２未満の量で存在
する非イオン表面活性剤及び１，５００〜１２，０００
Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２の量で存在するコレステロールエステ
ル加水分解酵素を含む総コレステロールの比色測定用分
析要素。 ２、Ａ、５ｇ／ｍ＾２以上、１１ｇ／ｍ＾２未満の量で
存在する非イオン表面活性剤及び１，５００〜１２，０
００Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２の量で存在するコレステロールエ
ステル加水分解酵素を含む総コレステロールの比色測定
用分析要素と液体試料とを接触させて色の変化を発生さ
せる工程、及び Ｂ、生じた色の変化を検出する工程 を含む水性液体中の総コレステロールの比色定量方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US654590 | 1984-09-26 | ||
| US06/654,590 US4680259A (en) | 1984-09-26 | 1984-09-26 | Analytical element and method for colorimetric determination of total cholesterol |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6185200A true JPS6185200A (ja) | 1986-04-30 |
| JPH0452120B2 JPH0452120B2 (ja) | 1992-08-20 |
Family
ID=24625469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60210337A Granted JPS6185200A (ja) | 1984-09-26 | 1985-09-25 | 総コレステロールの比色測定用分析要素及び比色測定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4680259A (ja) |
| EP (1) | EP0176357B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6185200A (ja) |
| CA (1) | CA1235052A (ja) |
| DE (1) | DE3570927D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03505628A (ja) * | 1988-05-25 | 1991-12-05 | ベーリンガー マンハイム コーポレーシヨン | ピロガロールを含有する還元性指示薬及びその使用 |
| EP0708335A3 (en) * | 1994-10-19 | 1996-08-28 | Fuji Photo Film Co Ltd | Dry, analytical element with an ampholyte |
| JP2013542731A (ja) * | 2010-10-23 | 2013-11-28 | ポップ テスト エルエルシー | 体液内の特定の成分のレベルを検出、検査、および監視するための装置および調合物、ならびに方法 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0244825B1 (en) * | 1986-05-09 | 1992-10-07 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Dry-type analytical element for cholesterol |
| JPH0687777B2 (ja) * | 1986-07-08 | 1994-11-09 | 第一化学薬品株式会社 | ３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法 |
| US4784945A (en) * | 1986-10-30 | 1988-11-15 | Board Of Governors Of Wayne State University | Method for determining lipids |
| JPS63158000A (ja) * | 1986-12-18 | 1988-06-30 | Fuji Photo Film Co Ltd | 総コレステロ−ル定量用一体型多層分析要素 |
| US5589347A (en) * | 1986-12-18 | 1996-12-31 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Multilayer analysis elements for the determination of total cholesterol |
| CA1338734C (en) * | 1988-05-17 | 1996-11-26 | Elazar Rabbani | Assay device with gradient-regulated localized signal |
| WO1990002200A1 (en) * | 1988-08-30 | 1990-03-08 | Cholestech Corporation | Self-corrected assay device and method |
| US5156954A (en) * | 1989-03-08 | 1992-10-20 | Cholestech Corporation | Assay device and method using a signal-modulating compound |
| US5171688A (en) * | 1988-08-30 | 1992-12-15 | Cholestech Corporation | Self-corrected assay device |
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| JPH07155196A (ja) * | 1993-12-10 | 1995-06-20 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 生体成分の測定法 |
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| DE602008002825D1 (de) * | 2007-01-09 | 2010-11-11 | Cholestech Corp | Vorrichtung und verfahren zur messung des ldl-assoziierten cholesterols |
| US8841131B1 (en) * | 2012-10-09 | 2014-09-23 | Ifeanyi Nzeribe | Cholesterol measuring apparatus and associated use thereof |
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| US3869349A (en) * | 1974-03-25 | 1975-03-04 | Eastman Kodak Co | Method for the enzymatic hydrolysis of cholesterol esters |
| US3983005A (en) * | 1974-03-25 | 1976-09-28 | Eastman Kodak Company | Integral element for the analysis of cholesterol |
| US4042329A (en) * | 1974-12-18 | 1977-08-16 | Becton, Dickinson And Company | Method and device for detecting cholesterol |
| USRE30267E (en) * | 1975-06-20 | 1980-05-06 | Eastman Kodak Company | Multilayer analytical element |
| US4275152A (en) * | 1977-02-03 | 1981-06-23 | Eastman Kodak Company | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
| US4275151A (en) * | 1977-02-03 | 1981-06-23 | Eastman Kodak Company | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
| DE2910134A1 (de) * | 1979-03-15 | 1980-09-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostisches mittel zum nachweis von bestandteilen von koerperfluessigkeiten |
| US4291121A (en) * | 1979-04-13 | 1981-09-22 | Miles Laboratories, Inc. | Bilirubin-resistant determination of uric acid and cholesterol |
| DE3065827D1 (en) * | 1979-08-23 | 1984-01-12 | Ivan Endre Modrovich | Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor |
| US4378429A (en) * | 1979-08-23 | 1983-03-29 | Modrovich Ivan Endre | Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum |
| US4409326A (en) * | 1980-07-10 | 1983-10-11 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum |
| US4503146A (en) * | 1980-10-01 | 1985-03-05 | Technicon Instruments Corporation | Method for eliminating turbidity in a biological fluid and reagent therefor |
| DE3046241A1 (de) * | 1980-12-08 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin |
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-
1984
- 1984-09-26 US US06/654,590 patent/US4680259A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-01-02 CA CA000471293A patent/CA1235052A/en not_active Expired
- 1985-09-25 EP EP85306806A patent/EP0176357B1/en not_active Expired
- 1985-09-25 JP JP60210337A patent/JPS6185200A/ja active Granted
- 1985-09-25 DE DE8585306806T patent/DE3570927D1/de not_active Expired
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| EP0708335A3 (en) * | 1994-10-19 | 1996-08-28 | Fuji Photo Film Co Ltd | Dry, analytical element with an ampholyte |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0176357A1 (en) | 1986-04-02 |
| JPH0452120B2 (ja) | 1992-08-20 |
| CA1235052A (en) | 1988-04-12 |
| EP0176357B1 (en) | 1989-06-07 |
| DE3570927D1 (en) | 1989-07-13 |
| US4680259A (en) | 1987-07-14 |
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