JPH03505628A - ピロガロールを含有する還元性指示薬及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ピロガロールを含有する還元性指示薬及びその使用発明の分野 本発明は、試料中の被分析物の測定に有用な組成物、該組成物を導入するための 分析装置及び被分析物の測定法に関する。

背景及び従来技術 一分析及び診断化学の分野はここ数年間で著しく進歩した。この分野は、血液、 血清、尿等のような体液、牛乳、飲料用水のような食品及び他の液状物質の分析 に関する。この分野の用途には医学的診断、純度試験、法科学等が含まれる。

一般に、分析化学で使われる、本明細書中に記載されているタイプの装置は時々 当業者に周知である試験片、シップ・スティック又は他の用語で呼ばれている装 置でるる。該装置は、特別な被分析物又は測定すべき物質と、測定可能な又は検 出９餌なシグナルを形成しながら反応する種々の物質を導入含有する。いつもで 線ないが、しばしばこれは色である。色形成又は色の変化が、物質又は被分析物 が試Ｗ試書中に存在するかどうかについての質問に°はい／いいえ°の答えを与 えることができる。

殊に、試料を試験装置に施すか又は装置自体を浸漬するか又はそうでない場合に はＷｉ：、験拭科に接触させることができる。

試験装置を使ってかつ乾式化学で実施することのでさるアッセイ型の典型として 存在する非常に一般的な試験は血中グルコースレベルの測定でろる。勿論、これ は頻尿病及び低血糖症の患者をモニターするような多くの場合に重要でるる。試 験片は、酵素のグルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ並びに指示薬５゜ ５’、５．５’−テトラメチルベンジジン（’　ＴＭＢ　”とも呼ばれる）を含 有するように生成される。試料中にグルコースが存在する場合、それはグルコー スオキシダーゼの存在において＃！素と反応してグルコン酸と過酸化水素を形成 する。ペルオキシダーゼの存在においてペルオキシドは次に鷲と反応する。非酸 化形のＴＭＢは無色である。酸化されると、それは青色乃至紫色の囲に呈色する 。従って、グルコースが存在する場合色形成１ｎ察することによシ濃度を測定す ることがきる。この系岐被分析物に特異的である。それといのも過敏化水素は通 常の試料成分ではなく、グルコースに特異的な一累のグルコースオキシダーゼが その基質に作用する場合にだけ形成されるからである。

前記の系は勿論、乾式化学法を適用して実施することのできる種々のアッセイの １つの例に過ぎないゆ被分析物に特異的な酵素及び指示系に変更することによシ 、前記の系を使って異なる被分析物を測定できることは明らかでおる。多くの種 々の型の指示系を臨床化学者は人手することができる。１つの広範なｎ＠のその ような指示薬又は指示薬系は２つの異なる成分の酸化的カップリングに晶いて指 示薬又は染料を生成する。

このような系の典型はトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）により記載されｆ　Ｃ’Ａ ｎｎ、　Ｃ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　”　６巻、２４頁（１９６９年）〕よ うに所謂Ｃトリンダー試薬１である。この系は血清及び血しようのような体液中 のグルコース、コレステロール及び尿酸を測定するのに使われる。

トリンダー試薬は置換又は未置換のフェノールの４−アミノア７チピリン（４− ＡＡＰ　）とのカップリングを包含し、赤色染料を形成する。この反応：はアク アテ等（Ａｃｑｕａｃｉ　ｓｂ　ａｌ、）による米国譜許第４２９１１２１号明 細書に記載されてお勺、この開示内容は本明ａｖｏ　５ｉｌ１８載と関連する。

アクアチ等は、種々の置換フェノールを指示薬系のカップリング化合物として使 用できることを開示している。

アクアチ等は指示薬系における問題、即ち試験すべき試料の成分によるｌ［ｉ指 摘している。アクアチ等によるその妨害は測定すべき化合ｖＪ（コレステロール 、グルコース、尿酸等）と指示薬系Ｃ０４元剤との間の競合をもたらしかつ被分 析物に関して実際よりも低い数１直ｔもたらす。

米国特許第４１０１３８１号明細書においてクローズ等（Ｋｌｏｓａ　ｅ仁ａ１ ．）は他の糸型、即ち１荷担持又は湯還元性“色原体を生成する指示薬系型を開 示している。この特許は、化合物６−メチル−２−（スルホニル）−ベン！チア ゾΩノとドラシン（ＭＢＴＨ８）がホルムアルデヒド及び酸化剤の存在において 反応して還元性色原体を生成することを開示している。

５．５’、５．５’−テトラメチルベンジシン（ＴＭＢ　）及びその誘導体のよ うな他の指示薬は、トリシダー試薬のように１カツプリングされた酸化物”よシ も電荷担体錯体を形成する。電荷担体列体は指示薬としても機能し、その分子が 錆化されない場合はそれは色′ｔ−持っていないか又は錯体のそれとは異なる色 を有している。

しかしながら、これらの指示薬が還元６ｒＬると、色形成しない。そｆ′Ｌ改、 そ１ｔは還元性色原体でらる。

ＴＭＢ及びＭＢＴＨの他に例は０−ゾニシゾン、グアイコール及びｏ−トリジノ でるる。

電荷担体とカップラーとの間のこの区別はカップラ等（Ｋａｔｓ：ｍｙａｍａ　 ａｔ　ａｌ、）により米１４！ｉ許第４４１８０５７号明細査に十分に記載され ており、その差異は１還元注色ぷ体−と−水素供与渾（現像主薬）及びカッグラ −の組合せ１との間にるると記載している。カップラ等は、使用される酵素が指 示薬系中でしばしば不活性化さｎて７グナルを生成する反応を緩慢にすると−う 問題があると指摘している。これを回避するために、酸化状態で−す７トール、 フェノール、ピラゾリン又はＮ、Ｎ−ゾｍ＊アニリンのよつなカップラーとカン プリングする１ピロガロ一ル誘導体を系に添加することが提案さｎている（第６ 欄、５４〜６０行）。カップラ等による実施例はすべてカップリング化合物を必 要とする。

カップラは、ピロガロール誘導体が試験系の酵素の“保存剤“とじて作用すると 記載している。換言すれば、該特許は、系中でカップｙ７グ指示薬を使用すると ストリップの保存寿命が高まると示唆している。指示薬反応は、ピロがロール誘 導体が存在しない場合と同様にして行なわれる。

しかしながら、還元性色原体と一緒に使用するとピロガロール誘導体はカップラ 等から予＃１ざｎるようには作用しないことが判明し友。還元性又は電荷担持色 原体全使用する指示薬系はピロがロールの添加前と添ｉｘＪ後１でＦｉＩ４なっ た作用をする。このことは、前記の指示薬系へのピロガロール誘導体の添加がこ のような糸の範囲を拡大するので有意でるる。これについては以下に更に詳細に 説明する。

そｒｔ収、不発明の目的は、還元性′Ｉｌｃ荷担体形成色原体及びピロガロール 誘導体を′＃家とする指示薬系を含有する。試料中の被分析物を測定するのに有 用なｍｌｌ書物開示することでろる。

本発明の他の目的は、試料中の被分析物を検出するのに使用することのできるキ ットを開示することであ夕、このキットはＦｉｔＩ記の成分を含有する。

本発明の他の目的は、前記の組成物及びキットも使用する被分析物ｔ−測測定る のに使用することのできる分析装置を開示することである。

本発明の更に他の目的は、前記の組成物、キット及び分析装置を使用する、試料 中の被分析物の測定法である。

本発明のこれら及び他の目的がどのように達成されるかは下記の説明から明らか になるでめろう。

図面の簡単な説明 第１図は阻害剤としてピロガロ−ル誘導体を使わない、被分析物（グルコース） の濃度に対してゾロツトした拡散反射率を示すグラフ図である。

第２図〜纂１１図は指示薬と共に櫨々の没食子酸エステル誘導体を使った同様の グラフ図を示す。

第１２図は本発明による優れた没食子酸エステル誘導体を示す。

浚れ友実施例の詳細な説明 する色原体及びピロガロール誘導体を含有する指示薬系を包含する。前記の議論 を参照することＫより、カッブリング化合ｇｌＪｒ必要としない指示薬系とは、 カップリングされた成分の形成なしに検出９幌なシグナルが発生するものでるる ことは理解されよう。

殊に重要なかつ優れ九試薬系は下記の５．５’、５゜５′−テトラメチルベンジ シン（’ＴＭＢ’）及び６−アミび鵞ヒドロクロリド塩のようなその塩である。

ＴＭＢは、形成される電荷錯体に相応して青色、赤色又は紫色からｏ可ｐｔスペ クトル範囲の色であるシグナルを形成するために他の化合物にカップリングしな い指示薬である。

ＴＭＢはグルコースを測定するための検出系で使われる代表的なものである。該 系では一対の反応が起こる。

グルコースを含有する試料を、酸素の存在においてグルコースをガンマ−Ｄ−グ ルコノラフトノ及び過酸化水素に酸化する酵素のグルコースオキシダーＪｅ（Ｇ ＯＤ）を含有する系に接触させる。過酸化水素が酸化されていないＴＭＢと、一 般にペルオヤシダーゼ（ＰＯＤ）　Ｏ存在に２いて反応して、色を持つＴＭＢの 電荷移動錯体を形成する。グルコース測定の場合、この色は青色である。

酸化されていないＴＭＢは無色である。それ故宵色の存在及び／又は強さは所定 のｖＣ′＃＋中のグル；−スの量の尺度である。

前記の反応ｔ−次のように示すことができる：電荷移ｉｔｈ錯体 ＋２Ｈ，Ｏ ＴＭＢについては既に説明しかつ以下の実施例はこの指示薬を使っているが、電 荷移動錯体の形成（Ｃれはカップリングとは異なる）を介して操作する多くの指 示薬系が存在することは明らかである。一般に１ベンジルから誘導される指示薬 はカップリングせず、この例にはｏ−トｖジン、ＭＢＴＨ、ＭＢＴＨ８及びそれ らの誘導体並びにＴＭＢの誘導体が包含さｎる。以下ＴＭＢはこの詳類の指示薬 を例示するが、記載された本発明で有効であると予測でれる唯一の指示薬ではな いことは明らかでるる。

ＴＭＥだけを記載の系で使用する。この系は視覚的に観察することができ、かつ グルコースの存在及び／又は濃度をこのように測定することができるが、優れた 測定法は、その操作については以下に記載されている反射率光度計による。

以下の実施例ではＴＭＢを、以下登録商標名”ＡＰＡＣ’で記載する化合物６− アミノ−９（ガフマーアミノゾロピル）カルバゾールと一緒に使用する。

ＴＭＢ又は他の類似の指示薬を使用する場合の問題が第１図に示されている。第 １図は、−８をグルコース濃度ｔ−測定する前記の系で使用する場合に得られる １拡散反射率”を示す、＠拡散反射率−とは、物質を測定するのに使われる試験 片又は他の装置から反射さする光蓋に関する。高い反射率は殆んど色形成されな いことを表わし、かつ同様にして低い数値はよシ強い色を表わす。

第１図からは、約１００ｗ１ｄｔｏｌＡＫマテハＴＭＢに関しては滑らかな曲線 が得らｎることが明らかである。しかしこの点でグラフは平坦になり、かつ反射 率は１００１１９／ｄ／　〜５００ｒｎ９／ｄ４テすヘテノ数値が殆んど同一で める。１００ＩＩ９／ｄ４は皿中グルコースの正常範囲内でおるが、１４０１１ ｇ／ｄ４又はそれ以上の数値（空腹後）は糖尿病の倣候である。第１図のグラフ から、ＴＭＢだけを使用する糖尿病の診断が禁忌であることが認められる。

ところが、指示薬系にビロガ四−ル誘導体を導入すると０曲線が滑らかにな夛１ かつ診断可能な数値範囲が拡がることが判明した。

本発明で使われるピロガロール縫導体は式：〔式中Ｘは水素又はＯ−ＣＯＹであ Ｍ、ｙは水素又は（ＣＨ，）ＡＣＨＢＤ　（Ａは整数０〜１７であり、かつＢ及 びＤは同じものを表わしかつ水素か又はメチルである）である〕によシ表わされ る。Ｘが水素である化合物（ピロガロール）；Ｘが０鴫ＣＯＹであシかつＹが水 素である化合物（没食子酸）：ＡがゼロでありかつＢ及びＣが水素でめる化合物 （没食子酸メチル）；Ａが２でｂシかつＢ及びＣが水系である化合物（没食子酸 ゾロビル）；Ａが３．７．１１．１５又は１７であシかつＢ及びＣが水系でおる 化合′ａ（没食子酸ｎ−デデルエステル、没食子酸オクチル、没食子酸ラウリル 、没食子酸セチルエステル、没食子酸ステリルエステル）；及びＡが１又は２で ６ＤかつＢ及びＣがメチルである化合物（没食子酸インデチルエステル及び没食 子酸イノアミルエステル）が殊に重要でるる０便利なように、この１１個の優れ た化合物は第１２図に図示されている。

次の実施例によシ本発明の操作を詳説するが、これに限定されるものではない。

例　　１ この実験では５．５’、５．５’−テトラメチルベンジジン及び＃　ＡＰＡＣ− だけで含浸した試験片を、既知量のグルコースを含有する試料中のグルコースの 濃度を測定するのに使用した。この試験片ｉ、ＴＭＢによシ生じる呈色シグナル の形成に導く反応を加速するようにグルコースオキクダーゼ及びベルオ午りダー ゼも含有する試薬で含浸した。

所定濃度のグルコースの試料を記載したように試験片に施すと、１２０秒後に反 射率光度計で、環境により惹起される妨讐が補正されて読み暇られた。

反射率光度計では、非吸収性材料から反射される光の強さく白色）と試料から反 射さルる尤との間の差を測定する。

この実験及び次の実験において、反射率をグルコース減産に対してグラフ表示ｆ ｂ。

第１図はこれらの実験の結乗を我わしかつこの系による問題は直ちに明らかとな る。グルコース濃度０で反射率が７０チであることに注意すべきでめる。

正常範囲のグルコース濃度（即ち７０〜１１０９／ｃｌｌ　）ではＢ緘において 若干の傾きがろ夛、°低い正常値１試料（７０”ｉ＆／ｄｊ）を１高い正常値− 試料（１１０ｈ９７ｄｌ　）から区別すのには十分である。しかし、一般に楯尿 病の低いレベル範囲であると考えられている１４０１！１９／ｄＪの数値と比べ ると、１森は１１０〜１４０ａ９／ｄｔで殆んど直線であシ、それ故糖尿病の状 態を診断することはほぼ不可能である。同じような平坦さが５００１１９／ｄ／ までの数値すべてで認められる。数値を区別することはできない。

例２〜６ 次の実施例ではグルコースの検定を、ＴＭＢ及びそれぞれピロガロール誘導体（ イン１ミルエステル２０■、ｎ−ブチルエステル２０■、イソブチルエステル２ ０〜、ステアリルエステル４０ｒｎ９及びセチルエステル４０■）と−緒にＡＰ ＡＣ（前記）を使って行なった。

次の組成物ｔポリスチレンフィルム上に塗布しかつ乾燥して最終厚さ１５０μの にして試験片全生成した二試験片用溶液の組成 ゾロピオファン７０−Ｄ　　　　　　　　　７５　ｌｉｔノニル硫赦ナトリウム 　　　　　　　　１．６ｙアルギン酸ナトリウム　　　　　　　　　１．５ｇＡ ＰＡＣ０，１５ｆ／ ＴＭＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．１’ＫＥ、Ｐｏ、　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５−０１Ｎａ２ＨＰＯ４０，７ＥＩ ＧＯＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，２０１ＰＯ Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，２５ｇピロガ ロール誘導体　　　　　　　　　前記アセトン　　　　　　　　　　　　　　　 ５ｄＨ２０１１５ｄ 試液は例１に記載したように行ない、かつその結果は第２図〜第６図にグラフで 示し、これらもまた指示薬系の呈色を表わす。各濃度に対して２つの試験を行な った。

これらのグラフから、異なるグルコース濃度値の間の明瞭な区別が達成されるこ とが明らかである。１直線化１は、ピロがロール誘導体を使わずかつ１ｏｏＩＩ ９／ｄ／で既に直線化した系に比べて、約３００１１９／ｄｊの濃度までは起シ 始めなし。滑らかで一様の曲線が得られた。セチルエステル及びステアリルエス テルの場合には、開始値は９０％に遅し、それに引続く曲組社非常に清らかで、 指示薬組成物中のこれらの化合物は−ｎている。

例　　７ 例２〜６で行なった様にして実験を行なったが、但し浸亥子酸エステル誘導体は 没食子酸５０ｖ９ｔ−使用し友。得られた数値曲線を第７図に示す。

この実験で重要なことは、没食子酸が非常に高いレベルで、例２〜６で便用した 没食子酸エステル誘導体では一直線化１し始めたレベルで区別を可能にすること である。このことは、非常に高いグルコースレベルを指示する２つの試験片系を 使用できることを示役する。侠言すれば、初めに例２〜６０没食子酸エステル誘 導体の１つで試験をし、かつ非常に高いレベルの数［（例えば６００ｉｉｖ／ｄ ＩＩ又はそれ以上）が指示される場合には、没食子酸を使って第２の試験を実施 することができる。

例８及び９ 没食子酸メチル及び−ゾロビルを使って、前記と同様にして一組の実験を行なつ 之。２つの異なる量の誘導体を使用しくそれぞれ６０ダ及び４０η）、かつその 結果ｔ−第８図及び第９図に図示した。

没食子酸エステル鱈導体が、異なる濃度を明瞭に示しながら、色形成において望 ましい均−性金もたらしたことがここでも明らかでらる。没食子酸プロピルがほ ぼ理想的な給米、即ち均一な下向きの傾きの線をもたらすことＫａ目すべきであ る。

例１０及び１１ オクチル−及びラクリル誘導体（それぞれ５０１ｖ）を使って付加的な実施例を 行なった。それ以外はその組成は前記と同じである。

これらの実験の結果を表わす第１０図及び第１１図は、グルコース濃度の増加に 応じた望ましい滑らかな曲線を示す。味に没食子酸オクチルはほぼ理想的な曲線 を示し、殆んど均一な下問きの傾きを有する−である。このことは、これらの化 合習もｌた指示薬組成物の形成に優ルていることを表わす。

前記０例１〜１１は、構出可能なシグナルの制御された形成が指示薬組成物中に 没食子酸エステル誘導体を包含させることによシ達成された。試験したすべての 没食子酸エステル誘導体で実施可能でおるが、優れた没食子酸エステルはプロピ ル及びオクチル誘導体である。これらの化合物全部並びに他のものを第１２図に 表示する。

本発明０１つの局面は、指示薬として有用である組成物であることが認められる であろう。該組成物は、検出すべき被分析物の存在においてカップリングされた 生成物を形成しない指示薬分子（即ち還元性色原体Ｊ及び没食子酸エステル銹導 体を含有する。没食子酸エステル誘導体を、指示薬系の分子の操作性を妨害する ことなく指示薬系に直接添加することができることは明らかでるる。しかし、１ 単ＷＩ”試薬又は組成物が本発明の唯−ＯＯＪ能な実施形でなめことに当業者に 明らかである。オツドを設計し、組成物の異なる成分を別々の容器中に装入し、 その後で研死者がその使用前に成分を一緒にする。例えば、代置的なキットはプ ロピル−又はオクチルエステルのような没食子酸エステル酵導体、５．５’、５ ．５’−テトラメチルベンジクンＯような丼カンプリン指示薬系及びＡＰＡＣを 含有し、そルぞれ別々の容器中に存在し、かつ場合によりＧＯＤ及びＰＯＤのよ うな酵素、対熱溶液及び被検物を測定するために使われる試験片のような分析装 置を包含する。

本発明が、没大子散エステル誘導体金含めて種々の指示ギ系成分を含浸されてい るか又は導入されている含浸紙のような担体から成る試験片のような分析要素に 関することも明らかである。

実施例は、本発明が、被分析物を含有する試料を指示薬系及びガロール誘導体と 、指示薬系による検出可能なシグナルの発生を促進する条件下に接触させ、次に シグナルを検出又は測定することにより測定する方法を開示していることも示す 。グルコースを測定すべき物質として例示したが、異なる被分析物を測定するこ ともできる。当業者に公矧であるように、種々の体液及び浸出液（血液、尿、ｎ Ｉ液、排泄物、膿汁、涙等）のような種々の物質をしばしば種々の物質（４，剤 及びその副腫物、不正薬剤、蛋白質、種々の炭水化物、トキシン等）、又は前記 の化合物、例えば胆汁ＴＲ酵導体：尿酸；コレステロール；　ＨＤＬ及びＬＤＬ 　；血液成分：種々の酵素、サクロシン及びその誘導体、例えばクレアチン及び クレアチニン；カフェイン号に関して試験する。選択により又は好適な指示薬系 により、符別な抗原を紳」定することができる。非カップリング指示薬系が使用 される場合には、所望のシグナルの早い時期の形成を阻止するのに使用すること ができる。本明細曹及び実施例は本発明を詳説するものでろるが、こｎに限定さ れるものではなく、本発明の趣旨並びに範囲内の他の実施例が当業者に明らかで あることは理解されよう。

回　昇　冊 匣　芹　冊 回　味　冊 瞑　芹　冊 閾　苺　冊 眺　在　研 昭　非　俯 国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．被分析物の存在において検出可能なシグナルを形成する指示薬系を包含し、 該指示薬が非カップリング在又は還元性色原体及びピロガロール誘導体を含有す る、試料中の被分析物を測定するのに有用な組成物。
2. ２．指示薬糸が電荷移動錯体を形成する色原体である請求項１記載の組成物。
3. ３．ピロガロール誘導体が没食子酸である請求項１記載の組成物。
4. ４．ピロガロール誘導体が没食子酸メチルである請求項１記載の組成物。
5. ５．ピロガロール誘導体が没食子酸プロピルである請求項１記載の組成物。
6. ６．ピロガロール誘導体が没食子酸オクチルである請求項１記載の組成物。
7. ７．ピロガロール誘導体が没食子酸ラウリルである請求項１記載の組成物。
8. ８．ピロガロール誘導体がステアリン酸ピロガロールである請求項１記載の組成 物。
9. ９．ピロガロール誘導体が没食子酸ローブチルエステルである請求項１記載の組 成物。
10. １０．ピロガロール誘導体が没食子酸セチルエステルである請求項１記載の組成 物。
11. １１．ピロガロール誘導体が没食子酸イソブチルエステルである請求項１記載の 組成物。
12. １２．ピロガロール誘導体が没食子酸インアミルエステルである請求項１記載の 組成物。
13. １３．指示薬系ガ３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンを含有する請求 項１記載の組成物。
14. １４．更に、指示薬系がペルオキシダーゼ及ビグルコースオキシダーゼを含有す る請求項１３記載の組成物。
15. １５．更に、指示薬系が３−アミノ−９−（ガンマーアミノプロピル）カルバゾ ールを含有する請求項１４記載の組成物。
16. １６．ｏ−トリジンを含有する請求項１記載の組成物。
17. １７．被分析物の存在において検出可能なシグナルを形成する指示薬系及びピロ ガロール誘導体をそれぞれ別々の部分に含有する、試料中の被分析物を測定する のに有用なキット。
18. １８．指示薬系がペルオキシダーゼ、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジ ジン及び３−アミノ−９−（ガンマーアミノプロピル）カルバゾールを含有する 請求項１７記載のキット。
19. １９．吸収性担体中に導入された請求項１記載の組成物を包含する、試料中の被 分析物を測定するための分析要素。
20. ２０．試料を請求項１記載の組成物と、検出可能なシグナルの発生を促進する条 件下に接触させ、かつ該シグナルを被分析物の尺度として検出する、試料中の被 分析物を測定する方法。