JP2901194B2 - サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ配列決定法 - Google Patents

サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ配列決定法

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、サーマス・アクティクス（Thermus aqua
ticus）の熱安定性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラー
ゼ）を利用したDNA配列決定法を提供する。DNA配列決定
法は、分子生物学、遺伝学、医学の診断技術、および法
医学の領域で実際によく利用されている。DNA配列決定
法の重要性は、核酸の配列を決定するための試薬および
自動分析機の製造および販売を中心とした旺盛な商業活
動によって裏付けられている。
サンガーのジデオキシヌクレオチド法〔サンガーら、
1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467〕によるDN
A配列決定法は、新規のベクター〔ヤニッシュ−ペロン
ら、1985,Gene 33:103-119〕、塩基類似体〔ミルズら、
1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2232-2235、およびバ
ールら、1986,BioTechiniques 4:428-432〕、酵素〔タ
ボールら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4763-477
1〕、ならびにDNA配列の部分的自動解析機〔スミスら.,
1986,Nature 321:674-679、プロバーら、1987,Sceince
238:336-341およびアンソーゲら、1987,Nuc.Acids Res.
15:4593-4602〕の開発を含むかなりの洗練を近年に経
験している。この塩基配列決定のジデオキシ法は、以下
の工程からなる。（１）オリゴヌクレオチドプライマー
を適当な１本鎖または変形２本鎖DNAの鋳型にアニーリ
ングする工程、（２）４つの別個の反応でDNAポリメラ
ーゼを用いてプライマーを伸長させる工程であって、そ
れぞれの反応では、ddNTPのなかの１種類のα−標識dNT
P又はddNTP（または、標識プライマーを使用することも
できる）、各未標識dNTPの混合物、および１種類の鎖伸
長停止ジデオキシヌクレオチド−５′−トリホスフェー
ト（ddNTP）を含むもの、（３）高分解能ポロアクリル
アミド−尿素ゲル上での４種類の反応産物を解析する工
程、および（４）読み取り可能なゲルからオートラジオ
グラフィー像を得てDNA配列を指定する工程。また、蛍
光標識したプライマーまたはヌクレオチドを使用して、
反応産物を同定することができる。既知のジデオキシ配
列決定法では、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断
片、逆転写酵素または修飾T7DNAポリメラーゼといったD
NAポリメラーゼが利用される。しかし、これらの酵素を
用いた配列決定法では、Taqポリメラーゼは使われな
い。
市販のキットを使用することによって、その手法は極
めて単純なものとなり、DNA配列決定法があらゆる研究
室でルーチンの技術となった。しかし、この手法におい
ても、パリンドロームのヘアピンループなどの２次構造
を含む核酸、およびGC含量の多いDNA（フーグスティー
ン型結合の形成によってDNAの収縮を生じ得る）を対象
とした研究に都合のよい配列決定法にはまだ欠点があ
る。一般に、こういったDNAは、先行技術の配列決定法
にとって優れた材料とはいえず、配列決定を妨害する異
常なゲルの移動パターンを表すことがある。さらに、配
列決定のための１つの反応からDNAの長いセグメントのD
NA配列情報が得られる配列決定法が必要である。現在で
は、様々な配列決定法を使って、長短両方の配列決定産
物を作製しなければならない。以下に詳述するように、
本発明は、１回の配列決定反応で長短両方の配列決定産
物を作製することによって、DNA配列決定の手法に画期
的な改良をもたらすものである。
現在市販されている装置は、配列決定の支援機構を備
えている。例えば、アイソトープを使わない検出、コン
ピューターによるデータの収集および解析などである。
こういった発達によって、多くの研究者は、大規模な配
列決定計画に参画でき、ヒトの全遺伝子の配列決定も考
えられるようになった。大規模な配列決定計画の最終的
な成否は、この技術の高速化と自動化の改良にかかって
いるといえよう。これには、プロセスの前段階に関する
その他の処理法を開発することが含まれる。すなわち、
DNA鋳型の調製および配列決定反応の操作を自動化する
方法であって、本発明は、このプロセスの前段階を完全
に自動化する手段を提供するものである。
自動的にDNAを調製する理想的とみえる手法の１つ
は、ポリメラーゼを使った遺伝子増幅法（PCR）（米国
特許第4,683,202号に開示された方法）によるDNAの選択
的増幅である。PCR法では、（１）DNAの熱変性、（２）
増幅すべきDNAセグメントを挾む２つのオリゴヌクレオ
チドプライマーのアニーリング、および（３）DNAポリ
メラーゼを用いたアニーリングプライマーの伸長が行わ
れる。この方法によれば、単一コピーのゲノムDNAのセ
グメントが極めて高い特異性と忠実度をもって、100万
倍以上に増幅される。続いて、PCR産物を、配列解析に
適したベクターにサブクローン化するか、精製したPCR
産物を、エンゲルケら〔1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
85:544-548〕、ウオングら〔1987,Nature,330:384-38
6〕およびストフレットら〔1988,Science,229:491-49
4〕が記載したようにして配列決定することができる。
サイキら〔1988,Science,239:487-494〕は、TaqDNAポ
リメラーゼによってPCR法が極めて簡単な方法となるこ
とを報じている。このポリメラーゼは、75℃付近を中心
とする幅広い至適温度をもち、95℃で繰り返しインキュ
ベーションしても変性しないので、各PCRサイクル終了
後に新しい酵素を添加する必要はない。高温でのアニー
リングおよび伸長反応でTaqDNAポリメラーゼを使用する
と、特異性、収率および増幅され得る産物の長さが増
し、希少な標的配列を検出するときのPCRの感度が増大
する。
しかし、この発明以前には、TaqDNAポリメラーゼがDN
A配列決定法に用いられることはなかった。TaqDNAポリ
メラーゼは高い処理能および大きな取込み速度を示し、
そして鎖伸長を停止させるためのヌクレオチド類似体の
使用及びゲルの収縮を解決するすることができる。TaqD
NAポリメラーゼのこれらの性質は、近年Taborら〔1987,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:4767-4771〕によって記載
されたバクテリオファージの化学修飾型T7DNAポリメラ
ーゼの性質と類似している。しかし、T7DNAポリメラー
ゼとは対照的に、TaqDNAポリメラーゼは、ゲルファンド
ら（欧州特許公開第258,017号）が記載するように、高
温に極めて安定な単鎖の酵素である。Taqポリメラーゼ
は、検出可能な３′,5′−エンドヌクレアーゼ活性を有
さず、一定のdNTPおよびddNTP濃度を使用しない限り、
取込みを誤る率が高いので、従来TaqDNAポリメラーゼが
配列決定に用いられることはなかった。本発明は、DNA
配列決定のための効率的な方法を提供するものであっ
て、この方法は、PCR増幅DNAを直接配列決定するために
使用可能である。
この発明は、核酸のヌクレオチド配列を決定するため
の改良型ジデオキシヌクレオチド法を提供する。この改
良法では、使用されるプライマーの伸長に、サーマス・
アクティクス（Thermus aquaticus）からのDNAポリメラ
ーゼが利用される。この発明の方法は、改良されたまた
は非対称のポリメラーゼ連鎖反応によって生じた１本鎖
DNAを用いて、１本鎖DNAを作製する際に、特に好まし
い。
この発明の方法は、既知の配列決定法にはるかに勝る
利点を提供するのもである。これらの利点の多くは、Ta
qDNAポリメラーゼの特別な寄与から生じるのもであっ
て、これは、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断
片、リバーストランスクリプターゼまたは修飾型T7DNA
ポリメラーゼのために設計されたジデオキシ配列決定法
では正常に機能しないはずである。しかし、本発明の方
法を用いれば、その他の方法では不可能な、Taqポリメ
ラーゼによる配列情報が得られる。
例えば、本発明の配列決定反応の工程は広い温度範囲
で実施できるが、先行技術の方法は50℃を越える温度で
は操作不能であった。しかし、50℃の温度では、多くの
単鎖DNAがヘアピンループなどの２次構造を生じること
がある。これらの構造は、伸長反応における鎖の不適切
な停止と、配列決定ゲル上での異常な移動パターンの発
生の両面から、ジデオキシ法の重大な障害となり得る。
本発明が提供するように、高温（すなわち、70℃）での
伸長反応を実施できるために、上記のような２次構造を
含むDNAでの配列決定結果が著しく改善される。高温が
２次構造の安定性を奪うからである。また、この発明に
よれば高温で操作ができるので、プライマーの特異性が
増し、鮮明（バックグラウンドが少ない）で読み取りや
すい配列情報が得られる。
さらに、この発明では７−デアザグアニンなどの構造
安定化塩基類似体を利用できるために、より良い配列決
定結果が得られる。この類似体は、高GC含有DNAにおけ
るフーグスティン（Foogsteen）結合の形成を防止する
ために使用されるが、もし防止されかったとすれば、DN
Aの収縮および配列決定ゲルにおけるDNAの異常な移動パ
ターンが生じる。
この方法の別の重要な利点は、１回の配列決定反応
（上記のとおり、４つの異なった反応、すなわち、各ヌ
クレオリドの塩基A,G,C,Tごとに１つの反応がある）で
ヌクレオリドの長いセグメントに関する配列情報が得ら
れることである。Taqポリメラーゼは、反応速度が大き
く、処理能力が優れており、そして産物は、短いもの
（プライマーの30ヌクレオリド以内）でも長いもの（プ
ライマーより1000ヌクレオリドを越す）でも、均一な強
度でシグナルを発するこの発明の方法によって調製する
ことができる。この利点はオートラジオグラフィーを使
用する配列決定に限定されるものではない。むしろ、こ
の方法における伸長産物の生成の性質によって、伸長産
物の検出に用いる方法にかかわらず、１回の配列決定反
応で1000塩基以上のヌクレオチド配列を決定し得る自動
DNA配列決定装置の出現が初めて可能となった。この方
法が開発される以前のDNA配列決定装置は、１配列決定
反応でせいぜい600塩基を生じるのが限度であった。
この発明のもう一つ別の局面は、DNA配列決定装置の
設計に大きな影響をもたらすものである。PCR法が自動
化されており、配列決定のための１本鎖DNA鋳型を作製
するために非対照PCRが使用できる。Taqポリメラーゼ
は、PCRのために好都合であるが、この発明以前は、DNA
配列決定に用いるには好ましくなかった。しかし、この
発明の登場によって、配列決定の鋳型の作製および配列
決定を１回の自動化された工程で行うことができる。さ
らに、この発明は、PCR法およびこの方法の両方に使用
可能なある種のキットおよび緩衝液に関する。
この発明の理解に役立たせるために、以下の図を提示
する。第１図は、次の各産物を展開したポリアクリルア
ミド尿素ゲルのオートラジオグラフィーを示す。（Ａ）
標識化反応、（Ｂ）様々な温度で実施した配列決定反応
（伸長−停止）、および（Ｃ）長い時間の電気泳動中に
分離した配列決定反応の産物。標識化反応は、実施例４
に記載のとおりに行った。反応温度は、酵素の添加前に
上昇させた。アリコートは、0.5,1,3,5,7および10分で
採取した。伸長−停止反応は記載されているとおり実施
した。すべての反応は、ホルムアミド−EDTA停止溶液で
停止させ、80℃３分間で変性され、緩衝液勾配配列決定
ゲル上で分離を行った（ビギンら〔1983,Prpc.Natl.Aca
d.Sci.USA80:3963-3963〕の記載に従って）。泳動時間
を延ばした電気泳動（Ｃ）を、70℃/3分間の伸長−停止
配列決定反応の産物について行った。試料は、18cm×50
cm×0.4cmの７％アクリルアミドゲル（24:1架橋）上
で、7M尿素および１×TBEを使って21時間15Wで泳動し
た。マーカーは、プライマーの開始点からヌクレオリド
数での距離を表す。すべての配列決定反応セットはG,A,
T,Cである。
第２図は、塩基類似体で生じた伸長産物を比較するポ
リアクリルアミド尿素ゲルのオートラジオグラフィーを
示す。dGTPをc7dGTP（７−デアザ−２′−デオキシグア
ノシン−５′トリホスフェートは、明細書中でc7dGTPと
略記されるが、図中ではdc7GTPと略記される）またはdI
TPで置換した影響は、M13:mp181本鎖DNA上または部分的
パリンドローム構造のクローンEK9上で行った配列決定
反応で示される。各レーンはG,A,T,Cである。EK9dGTPと
c7dGTP反応セットの間の線は、収縮された領域の上流及
び下流の同一位置を合せている。かぎ括弧は、パリンド
ローム領域の範囲を示す。この領域の正確な配列は以下
のとおりである。
相補塩基には下線を引き、dGTP反応で収縮される塩基
は引用符内に示す。
第３図は、（Ａ）M13を基礎とする１本鎖鋳型と
（Ｂ）同じ配列の非対照PCR鋳型を比較するポリアクリ
ルアミド尿素ゲルのオートラジオグラフィーを示す。M1
3クローンの配列決定は、〔32P〕−標識プライマーを使
った以下の実施例で記載したとおりに行った。非対照増
幅とその後の配列決定は、従来どおりに行い、すべての
伸長産物は、緩衝液勾配配列決定ゲル上で分離した。各
反応セットはG,A,T,Cであった。
サンガーの方法およびその他のジデオキシDNA配列決
定法は一連の４つの反応を含み、それぞれには、配列決
定の対象となる核酸（鋳型）にアニーリングされたオリ
ゴヌクレオチドプライマーの鋳型依存性伸長反応が含ま
れる。この伸長反応は、鋳型依存性重合のための試薬に
よって触媒される。鋳型DNAは１本鎖であるので、プラ
イマーはこの鋳型にアニーリング可能である。そして、
４つの伸長反応のそれぞれは、４種類のデオキシリボヌ
クレオシド−５′−トリホスフェート（dATP,dCTP,dGTP
およびdTTP）の存在下で、または１種類以上のdATP,dCT
P,dGTPもしくはdTTPの天然もしくは合成類似体および１
種類のジデオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェー
ト（ddNTP）を含む類似の混合物中で行われる。ddNTPが
取り込まれると伸長反応が停止し、反応によって鎖の長
さが様々な分子を生じるように、ddNTP濃度を調節する
ことができる。１つの反応であらゆる伸長産物がddATP
で終わり、別の反応ではddCTPで、さらに別の反応ではd
dGTPで、４番目の反応ではddTTPで終わるように、４つ
の別々の反応を利用する。標識されたプライマー、dNTP
またはddNTPの使用によって、伸長反応の産物が検出さ
れ得る。これら産物のサイズによる分離（すなわち、隣
接レーンの配列決定ゲル上で）、および伸長反応産物の
視覚化やその他の検出手段によって、鋳型の配列が容易
に調べられる。
この発明の前には、ジデオキシ配列決定法での伸長産
物は、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片、リバ
ーストラスクリプターゼ、または修飾型T7DNAポリメラ
ーゼなどの重合化試薬によって得られていた。この発明
は、サーマス・アクアティクスからのDNAポリメラーゼ
を利用して伸長反応を触媒するジデオキシヌクレオリド
配列決定のための顕著に改良された方法を提供する。
この発明は、TaqDNAポリメラーゼを用いたDNAの配列
を決定するための簡便で効果的な方法を提供する。この
方法では、５′標識プライマーまたは２段階反応での標
識の取込みに関して、方法は同様に良好に行われる。標
識を取り込む両方法は、はしご状のDNA配列像を形成す
るために用いられるが、その特徴は、バックグラウンド
バンド及び顕著な酵素の特質がみられること、強度が均
一であること、および長い距離にわたって解読可能なこ
とである。また、この発明の方法は、アルカリ変性した
２本鎖DNA鋳型の配列を決定する上で非常に明確な結果
をもたらした。
この発明の長所は、TaqDNAポリメラーゼをほとんどの
配列決定のための選択できるポリメラーゼとしたことろ
にある。この発明による配列決定の結果は、クレノー断
片またはAMVリバーストランスクリプターゼを用いて得
られた結果よりはるかに優れており、修飾型T7DNAポリ
メラーゼによる配列決定法で得られた結果より優れてい
た。これらの優れた結果が得られる理由は、これらのい
かなるポリメラーゼとも異なって、TaqDNAポリメラーゼ
が75℃を中心とした広い温度範囲で機能する点にある。
DNAの２次構造（ヘアピン）の領域は一般に遭遇され、D
NAポリメラーゼを強く妨害し、プライマーの伸長反応の
早すぎる停止を起こすことがある。この結果は、配列決
定ゲル上の４つの全配列レーンを通してバンドとして観
察され、どういった種類の伸長手段で検出しても失敗の
原因になる。その他の構造は、配列決定の上で障害とな
ることもあり、そしてフーグスティーンバンドの形成に
よる収縮の結果として高GC含量DNAにおいて共通してい
るが、見掛け上正常なDNAにおいて見られることもあ
る。TaqDNAポリメラーゼが高温および低塩濃度で作用し
得る能力をもっているために、配列決定反応の間で熱に
よりヘアピンループが不安定となり、酵素がヘアピン構
造を認識できるようになる。この発明の方法において、
７−デアザ−２′−デオキシグアノシン−５′−トリホ
スフェ−ト（c7dGTP;Barrら、BioTechniques（1986），
4,428-434を参照のこと）のような構造不安定化dGTP類
似体を併用すると、電気泳動上で完全に分離したDNAの
配列決定を困難にする配列決定産物を作り出す。
バックグランドバンドがないことおよび均一強度の放
射能活性断片はこの方法による利点である。もう一つの
利点は、TaqDNAポリメラーゼは取扱に優れているという
事実に基づく。70℃で２分以内で、Taq酵素は7.2kbの鋳
型全体を複製することができる。これは、１秒間に60ヌ
クレオリドを上回るターンオーバー速度に等しい。ま
た、TaqDNAポリメラーゼは低温で有意な活性をもち、タ
ーンオーバー速度の計算値は、55℃、37℃および22℃
で、それぞれ24,1.5および0.25ヌクレオリド／秒であ
る。ddNTPが存在しない場合、プライマー／鋳型に対す
るポリメラーゼの実質的基質過剰（モル比0.1:1）の状
態で70℃におけるTaqDNAポリメラーゼ伸長反応によっ
て、新しい基質上での再イニシエーションに先立ってほ
とんどの開始プライマーが完全に伸長することになろ
う。伸長速度は、酵素濃度と比較的無縁であって、TaqD
NAポリメラーゼが高いプロセシング能をもつことを示し
ている。また、TaqDNAポリメラーゼがプルーフリーディ
ング活性をもつとしても、それは僅かである。
Taq酵素のこういった性質によって、本発明の方法は
他の配列決定法より好ましいものとなる。この方法によ
って、２次構造を有する配列での鎖伸長に対するポリメ
ラーゼ作用の休止および早過ぎる停止が減少し、ジデオ
キシヌクレオチド類似体に対する識別が低下する。これ
らの利点は、この発明を自動配列決定装置で使用するに
好都合なものとする。しかし皮肉にも、Taqの関連する
３′から５′方向へのヌクレアーゼ活性を著しく欠くと
いう、配列決定のためのTaqポリメラーゼの長所の１つ
が、ゲンファルドら〔欧州特許EPO 258,017号公報〕に
よるこの酵素の精製が行われた後でさえも、Taqポリメ
ラーゼ配列決定法の発展を阻害したのは疑いのないこと
である。これは、３′から５′方向へのヌクレアーゼ活
性が欠如する結果、誤って取り込まれた塩基の除去が出
来なくなり、鎖伸長停止が生じるためである。取込みの
誤りは、先行技術で一般に使用された、非常に低く通常
のバランスを欠くヌクレオリド濃度で生じる。本発明者
らは、１種類以上のdNTPがKmより極めて低いとき、およ
び／または１種類のdNTP濃度がその他のdNTP濃度よりか
なり低いとき、配列決定速度は許容範囲を越えて上昇す
ることを見いだした。また、本発明者らは、長鎖を形成
する反応に関して高い忠実度および触媒効率に有利な条
件は、４種類のdNTPの各濃度が類似していて、それぞれ
のdNTPに対して10μＭ以上であることも見いだした。
この発明の配列決定法における鎖伸長反応は、以下に
詳述するように、PCRに適合する緩衝液中で行われる場
合が最適条件となる。したがって、TaqポリメラーゼPCR
法の緩衝液（50mM KCl、10mM Tris-HCl、pH8.4、2.5mM
MgCl2、各dNTP 200mM、およびゲラチン200μg/ml）（サ
イキら、1988,Science 239:487-494）を、本発明者らは
DNA配列決定用に改良した。サイキらによって記載され
たPCR緩衝液にはKClが含まれている。しかし、本発明の
目的にかなう最良の伸長反応は、KClの非存在下で生じ
る。本発明において、50mM KClでは酵素活性が若干阻害
され、75mM KCl以上ではTaqDNAポリメラーゼ活性は有意
に阻害される。ゼラチンはPCR反応において酵素の安定
剤として作用するが、それは存在していてもいなくて
も、配列決定反応自体に影響を与えないが、ゼラチンは
電気泳動中に歪みの生じる原因となることがある。非イ
オン系界面活性剤を酵素希釈緩衝液に添加（伸長反応で
の界面活性剤の最終濃度は、0.005％Tween20および0.05
％NP40）すると、TaqDNAポリメラーゼ活性が昴進し、酵
素からの誤った停止によるバックグラウンドが減少し
た。
TaqDNAポリメラーゼはマグネシウムイオンを必要と
し、その濃度は一般に、この発明の配列決定反応で存在
するdNTPおよびddNTP濃度より高い0.8mM以上でなければ
ならない。したがって、この発明と共に使用される好ま
しいPCR緩衝液は、KClを含まず、0.005％Tween20、0.05
％NP40および3mM（またはそれ以上）のMgCl2を含む緩衝
液である。また、この反応混合物は、プライマー、鋳
型、Taqポリメラーゼ、dNTPおよびddNTPを含む。
この発明は、特に各dNTPの濃度が10μＭを上回ると
き、多様なヌクレオリド濃度を許容する。しかし、ddNT
Pは高価であり、そして有意義な配列情報が得られるよ
うな相当dNTPに対する比で、伸長反応中に存在していな
ければならない。そのため、いかなるジデオキシ配列決
定法でも低濃度のdNTPが好ましい。４種類のdNTPそれぞ
れの濃度が５μＭ未満で、１種類のdNTPの濃度がその他
の濃度より低い場合、誤りの停止産物の高いバックグラ
ウンドが現れるが、これは、dNTPとddNTPの両者の取込
みの誤りによるものである。
したがって、各ddNTPの至適温度は、４種類のdNTPす
べて（10mM）を含む溶液で実験的に決定されたものであ
る。TaqDNAポリメラーゼは様々な効率で４種類のddNTP
を取込むが、相当するdNTPよりはるかに非効率である。
鎖伸長の停止産物の至適分布を生じた比は次の通りであ
った。すなわち、dGTP:ddGTP＝1:6、dATP:ddATP＝1:3
2、TTP:ddTTP＝1:48、およびdCTP:ddCTP＝1:16である。
TaqDNAポリメラーゼ濃度は、１本鎖DNA鋳型0.2pmol、
プライマー0.5pmol、上記濃度のdNTP:ddNTPからなる一
連の４種の反応につき１ないし20単位の範囲にあった。
一連の反応でポリメラーゼ10単位までの増加にともなっ
て、伸長産物の合成量が増加した。こういった試薬濃度
では、TaqDNAポリメラーゼ10単位は、鋳型−プライマー
より酵素がモルで約2.5倍過剰であることを示していた
が、TaqDNAポリメラーゼ：鋳型−プライマー比が1:1の
場合は、廉価であって、有効に作用する。
さらにこの発明は、配列決定反応中に標識ヌクレオリ
ドを取り込む様々な方法を含む。ある周知の方法では、
配列決定（鎖の伸長と停止）反応で標識プライマーが使
用される。別の方法では、伸長中のプライマーに標識ヌ
クレオリドが取り込まれる。クレノー型のプロトコルで
は、プライマーが伸長する間で１種類の標識ヌクレオリ
ドが他の３種類のより低濃度で存在し、dNTPおよびddNT
Pが誤って取り込まれるため、そのプロトコルはTaqDNA
ポリメラーゼを用いても有効とはいえないであろう。４
種類のdNTPのそれぞれに対する見かけのKm値は、10μＭ
ないし20μＭである。ある標識ヌクレオリド、（α−〔
35S〕チオ）dATPまたは（α−〔35S〕チオ）dCTP、の濃
度がKm（すなわち、約0.5ないし１μＭ）より有意に低
い場合、80〜500μＭのddNTPは、TaqDNAポリメラーゼに
よって高頻度に不適切に取り込まれた。１μＭを越える
〔α−35S〕標識dNTPの濃度は実際的ではない。また、T
aq酵素は３′から５′方向へのヌクレアーゼ（プルーフ
リーディング）活性を見かけ上欠くので、dNTPが誤って
取り込まれても、鎖伸長の停止は起きない。
これらの問題を克服し、TaqDNAポリメラーゼを用いた
ジデオキシ配列決定法が極めて効果的であることを理解
するために、この発明は２段階法を提供する。すなわ
ち、それは、最初に、一様に低濃度の４種類のdNTP（そ
のうちの１種類は標識）を使って低温で標識を行う工
程、続いて、ddNTPおよび高濃度のdNTPの存在下で配列
決定反応を行う工程からなる。こういった標識法によっ
て、プライマーに隣接する領域で配列データを得るため
に、低温および一定dNTP濃度を利用して、数残基から10
0残基以上の長さの放射活性伸長産物の鎖を作製するこ
とが好ましい。各標識dNTPの最低濃度0.5μＭは、この
ように一晩放射能にさらして容易に読み取れるシグナル
を得る工程で好ましい。１種類の未標識dNTPの濃度を1.
0μＭに高めると、非常に鮮明なシグナルが得られる。
この利点は、どのdNTPが増加したかとは関係ないようで
あるが、１種類より多くを増加させる必要はない。
標識ヌクレオリドが読み取り可能なレベルまで取り込
まれた後、各dNTPの一定量（≧10μＭ）およびddNTPの
添加によって配列決定反応が開始される。本方法では、
配列決定反応の間での温度上昇および高dNTP濃度によっ
て、至適プロセッシング能および忠実度が得られる。配
列決定反応は広い温度範囲で成立する。55℃での反応は
小さい速度で進行し、上記の伸長速度と一致するが、70
℃と比較した場合、忠実度に顕著な差は認められなかっ
た。これらの条件下では、極めて均一なバンド強度が得
られ、特異的バンドパターンは検出されなかった。さら
に、同一の反応条件は、長短両方のゲル泳動に適用す
る。第１図（Ｃ）に見られるように、この方法によって
は、プライミング部位から1000ヌクレオリドを越えるDN
A配列情報は得られる。
さらに、この方法は、高GC含有DNAの配列を決定し、
そしてバンドの収縮を除くために、塩基類似体７−デア
ザ−２′−デオキシグアノシン−５′−トリホスフェー
ト（c7dGTP）を用いて高温で行うことができる。ある種
のバンドのゲル上での異常な移動によって生じるバンド
の収縮は、高GC含有DNA鋳型でしばしば見られ、塩基組
成に見かけ上異常の見られないクローン化DNA配列でも
生じる。そういった収縮は、配列決定ゲルの不確実また
は誤った読み取りにつながることがある。dGTPの代わり
にdITPまたはc7dGTPを用いると、既知の配列決定法にお
ける収縮の人為的結果の分離にいくらか効果的である。
本方法におけるTaqポリメラーゼによる上記のヌクレオ
リドトリホスフェート類似体の取込みは、第２図に示す
ように、M13:mp18鋳型、またはM13にクローン化された
高GC含有２本鎖対称部分を含む挿入片を使って研究され
た。TaqDNAポリメラーゼはdGTPと基本的に同じカイネチ
クスをもってc7dGTPを取り込み、高反応温とc7dGTPとの
組み合わせは様々な配列を分離するのに非常に効果的で
ある。
対照的に、イノシン含有反応は、dGTPに比べて４倍高
レベルのdITPを必要とし、その標識反応は４分間を要
し、dITPに対するddGTPの比は、dGTPに比べて20倍減少
した。ジデオキシイノシン−５−トリホスフェート（dI
TP）は混乱て塩基対合するので、２次構造の領域で高頻
度の鎖伸長−停止反応がdITPによって起きる。したがっ
て、dITPはこの発明の目的に好ましくない。イノシンに
よって起こされる停止反応は、その他のdNTPに比較して
読取りの誤り率が高いこと、およびTaqDNAポリメラーゼ
が３′から５′方向へヌクレアーゼ活性（誤って取り込
まれた塩基を修復するために必要）を欠くという事実に
よっている。dITPによって起こされる停止反応は、反応
が70℃で始まる場合は極めて減少する。
PCR法の嚆矢以来、PCR産物の配列を直接決定する方法
の開発が求められている。本発明によって得られたDNA
配列決定の顕著な結果は、PCR法と本発明の方法が適合
したものであって、本発明をPCR産物を直接解析する理
想的な方法とした（第３図参照）。この方法によってク
ローン化されたPCR産物の配列決定は分析が示唆すると
ころによれば、50〜200μＭの各dNTPを使ったPCRの忠実
度は著しく（35回のPCR反応を経てPCR産物をクローン化
したのちに、配列決定された4000ヌクレオリドのうち取
込みの誤りは約１つ）、PCR法にその他のDNAポリメラー
ゼを用いて認められた値に匹敵する。さらに、PCR反応
で生じるほとんどの取込みの誤りは鎖の伸長停止を生さ
せ、欠陥分子の増幅を防いでいる。
本方法は、最初に増幅させてから、任意の挿入片から
１本鎖DNA（ssDNA）を作製するために予定された濃度で
プライマーを用いた非対照PCR反応で使用するとき、特
に好ましい。非対照PCR法と呼ばれる方法によって１本
鎖DNAが生じる事は、ジレンシュテンおよびエールリッ
ヒ〔1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7652-7656〕によ
って記載されている。この発明では、DNAをM13/pUC-lac
Zポリリンカーにクローン化して非対照PCR法でssDNAを
作製する態様を挙げた。以下の実施例で記載するよう
に、１方のオリゴヌクレオチドプライマーをその他方よ
り100倍添加して非対照PCR法を行った。その結果、２つ
のPCRプライマーの一方は、初期の加熱反応の間で欠落
した。この反応で他方のプライマーから１本鎖の産物が
生じた。
この方法による非対照PCR法で生じた鋳型の配列決定
は、産物の精製を必要としない。１本鎖産物の推定回収
量１μＭに基づくと、最初に添加された2nmolの各dNTP
の1/2ないし1/3が、このPCR反応によって消費される。
さらに、PCR反応中でのdNTPの安定性は、60回の反応の
後に約50％であると決定された。したがって、この方法
で使用される停止混合物は、配列決定反応での最終濃度
約10μＭ以上にdNTPを補充し、上記で定めたように適当
な濃度で特定のdNTPを供給し、そして追加のDNAポリメ
ラーゼ加えるように配合された〔32P〕標識配列決定プ
ライマーを、PCR産物の精製段階を除き、配列決定法を
１工程の伸長−停止反応に単純化するために使用するこ
とができる。また、蛍光標識した１種類または多種類の
配列決定プライマーをこの方法に使用することもできよ
うし、その産物を自動DNA配列決定装置で解析すること
ができる。
非対照PCR法で生じた鋳型または鋳型としてM13:mp18
にクローン化された同じDNA挿入片を用いて、TaqDNAポ
リメラーゼによって得られたDNA配列を比較した。得ら
れたはしご型の配列は、Taqで生じた配列のシグナルの
特徴ともいえる鮮明さおよび均一性を表していた。PCR
熱反応の間で生じることがある酵素またはdNTPのいかな
る分解も、鮮明な配列のデータに影響を与えることはな
いようである。35回のPCR反応での１本鎖DNA鋳型の合成
は、初期のDNA濃度とはおおよそ無関係であった。非対
照PCR法は、0.1ないし100ngのM13:mp10ssDNAまたは水10
0μｌに直接入れられたM13ファージプラークを使って行
われ、この発明の方法によって配列が決定された。
この発明は、M13/pUCベクターにクローン化された挿
入片の配列決定によって以下に詳述されるが、この方法
は、λファージやその他のいかなるクローニングベクタ
ーの直接配列決定にも応用できる。非対照PCR法におけ
るssDNAの収率の変化が、様々なプライマー対および比
について認められる場合もあり、特定のプライマー対お
よび鋳型核酸に関する最適の結果が得られるように各増
幅系の反応条件を調整する必要があろう。また、PCR法
でのdNTP濃度も、様々なサイズの産物および／または増
幅効率に応じて変える必要があろう。さらに、選定した
ゲルの切片からの溶出物を電気泳動で分離して再増幅す
ることによって、ゲノムDNAから得られたPCR産物の均一
性を増加させた研究者もいる。この発明の配列決定法
は、変形PCR法に容易に応用できる。方法のいかんに拘
らずDNAから得られたPCR産物を直接配列決定することに
よって、コンセンサス配列が生じる。なお、分子の大部
分の一定位置で生じるこれらの塩基は、オートラジオグ
ラフィー上で最も鮮明な部分であろうし、いかなる低頻
度のエラーも検出されないであろう。この発明によるそ
ういったPCR法の実施例では、得られる配列データは、
増幅産物と同様に鮮明であろう。不均一産物がはしご型
の組み合わせ像を呈するのは当然であろう。
TaqDNAポリメラーゼはPCR法に極めて有用であるの
で、この発明は、PCR法による鋳型の調製と直接配列決
定とを連結する。この利点は、この発明の方法は匹敵す
る配列決定反応性能の両者を自動化することが今や可能
でである点において意義がある。
当該分野の技術者には、DNA配列情報の取得が望まれ
る様々な状況でこの方法を利用できることは容易に理解
できよう。以下の実施例は、この発明を詳述するために
挙げられるものであって、この請求の範囲を限定するも
のではない。実施例４はこの発明の好ましい具体例を示
すものである。
実施例１ アニーリング、標識化、および伸長−停止反応 以下の方法で使用される材料は、次のように入手し
た。T4感染大腸菌細胞からのポリヌクレオチドキナーゼ
は、フォルマシア社から購入した。１サブユニット酵素
のTaqDNAポリメラーゼは、サーマス・アクアティカYT-1
株（ACTT＃2543）から精製した。最近では、TaqDNAポリ
メラーゼは、パーキンエルマー・セツスインスツメンツ
社より購入した。このポリメラーゼ（５〜80単位/ml）
は、20mM Tris-HCl（pH8.0）、100mM KCl、0.1mM EDT
A、1mM DTT、オートクレーブした200μg/mlゲラチン、
0.5％NP40、0.5％Tween20および50％グリセリン中で−2
0℃にて保存した。この酵素は、約200,000単位/mgの比
活性をもつが、その１単位は、サケの活性化精子DNAを
用いて30分間で合成された産物10nmolに相当する。２′
−デオキシおよび２′,3′−デオキシヌクレオリド−
５′−トリホスフェート（dNTPおよびddNTP）は、ファ
ルマシア社より購入した。７−デアザ−２′−デオキシ
グアニジン−５′−トリホスフェート（c7dGTP）はベー
リング・マンハイム社より購入した。（α−〔35S〕チ
オ）dATP（650Ci/mmol）はアマシャム社から、γ−〔32
P〕dATPはニューイングランド・ヌクレアー社から購入
した。配列決定のためのオリゴヌクレオチドプライマー
は、シアノエチルホスホラミヂドの化学反応によってバ
イオサーチ8600DNA合成装置で合成した。オリゴヌクレ
オチドプライマーには、γ−〔32P〕dATPおよびT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼで５′末端標識（３×106cpm/pmo
l）を行った（マキシムおよびギルバート、1980.Method
s Enz.,65:499-560）。１本鎖のM13 DNA鋳型は、ジンダ
ーら〔1982,Gene,19:1-10〕の記載するとおりに調製し
た。
１本鎖のアニーリングおよび標識反応は、４種類の配
列反応ごとに1.5mlの微小遠心管（microfuge）中で行っ
た。このアニーリング混合物には、６×Taq配列決定用
緩衝液（室温で、TSB、10mM MgCl2および10mM Tris-HC
l;pH8.0）中のオリゴヌクレオチドプライマー（0.1pmol
/μｌ）５μｌ、および鋳型DNA（0.05ないし0.5pmol）
５μｌが含まれていた。
この10μｌのアニーリング反応後に、標識混合物（pH
8.0の10mM Tris-HClに溶けた10μM dGTP、５μM dCTPお
よび５μM TTP）２μｌ、（α−〔35S〕チオ）dATP（pH
8.0の10μM Tris-HClで３倍希釈したのちの５μＭ）２
μｌ、TaqDNAポリメラーゼ（希釈緩衝液−pH8.0の10μM
Tris-HCl、0.5％Tween20および0.5％NP40−中で５単位
/ml）２μｌならびにH2O 4μｌを加えた。標識反応液
は、37℃で１分間のインキュベーションした。５′標識
プライマーとの配列決定反応では、（α−〔35S〕チ
オ）dNTP、標識混合物および標識反応液の添加は省略
し、容量はpH8.0の10μM Tris-HClで調節した。
４種の別個の配列決定（伸長−停止）反応は、各標識
鋳型に対して96穴マイクロタイタープレート（ファルコ
ン＃3911）中で行った。その際、以下のような濃縮デオ
キシ／ジデオキシ混合物を使用した、−「Ｇ混合物」
（各dNTP 30μＭ、0.25mM ddGTPおよび1.12mM MgC
l2）、「Ａ混合物」（各dNTP 30μＭ、1.0mM ddATPおよ
び1.12mM MgCl2）、「Ｔ混合物」（各dNTP 30μＭ、1.5
mM ddTTPおよび1.62mM MgCl2）ならびに「Ｃ混合物」
（各dNTP 30μＭ、0.5mM ddCTPおよび0.62mM MgCl2）。
この標識反応液から４μｌのアリコートを、２μｌの適
当な停止混合物を含む穴に室温で加えた。反応液には10
μｌの鉱油を積層して蒸発を防ぎ、１ないし３分間70℃
でインキュベーションした。反応は、0.1％ブロモフェ
ノールブルー、0.1％キシレンシアノールおよびEDTA（p
H7.0）を含む95％脱イオンホルムアミド２μｌを添加し
て停止させた。ビギンら〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:
3963-3965〕が記載するように、試料は80℃で３分間加
熱してから、１ないし２μｌを緩衝液勾配配列決定ゲル
に充填した。結果を第１表に示す。
実施例２ 非対照遺伝子増幅法 この実施例では、この発明の配列決定法によってDNA
がどのように生じるかについて記載する。非対照PCR法
の鋳型は、ポリリンカーのEcoRI部位で400塩基挿入片を
含む１本鎖のM13:mp10 DNAであった。オリゴヌクレオチ
ド（20塩基対）を、共通の「20」および「逆」配列プラ
イマーの結合部位のすぐ外側でこのポリリンカーに隣接
するように合成した。そして、これらのプライマーはそ
れぞれ、設計したRG05（５′AGGGTTTTCCCAGTCACFAC
3′）およびRG02（５′GTGGAATTGTGTGAGCGGAT3′）であ
った。各PCR反応物には、総量100μｌ中に、１プライマ
ー20pmolおよび他のプライマー0.2pmol、各dNTP 20μ
Ｍ、DNA 1ないし10ng、１×修飾PCR緩衝液（pH8.0の10
μM Tris-HCl、30μM MgCl2およびそれぞれ0.05％のTwe
en20およびNP40）、ならびにTaqDNAポリメラーゼ2.5単
位が含まれていた。
反応物は、パーキンエルマー・セツスサーマルサイク
ラーを使って、0.5ml微小遠心管中で反応させた。プロ
グラム化した温度プロフィルは93℃で30分間の変性にと
もなって生じ、プライマーのアニーリングには50℃で１
分間冷却し、1.5分間で72℃の伸長温度まで加熱した。
このプロフィルを35回繰り返し、最後の72℃のインキュ
ベーションは10分間に延長した。
実施例３ PCR産物の配列決定 PCR反応物のアリコートをジデオキシ鎖伸長−停止の
配列反応に直接取り込ませた。４種類の、塩基特異的鎖
伸長−停止配列決定混合物を、１×修飾PCR緩衝液およ
び20μＭの各dNTP中で調製した。各混合物は、250μM d
dNTP、1.28mM ddATP、1.92mM ddTTP、または640mM ddCT
Pを含むものであった。配列決定の対象となる各PCR産物
に対して、96穴マイクロタイタープレートの４つの穴に
「Ｇ」、「Ａ」、「Ｔまたは「Ｃ」とラベルし、各穴に
適当な配列決定の停止混合物2.5μｌを添加した。各PCR
反応物のアリコート20μｌを1.5μｌの微小遠心管に移
し、調製したてのTaqポリメラーゼ（48単位／μｌ）0.5
μｌ、１μｌの適当な〔32P〕標識M13の順方向または逆
方向配列決定プライマー（５′GTAAAACGACGGCCAGT3′、
および５′AACAGCTATGACCATG3′、それぞれ1.2pmol/m
l）ならびに１×修飾PCR緩衝液10.5μｌとともに混合し
た。PCR/プライマー調製物は、停止混合物を含む穴で7.
5μｌのアリコート中に直ちに分散し、ピペッターで混
合させた。試料には10μｌの鉱油を積層し、そのプレー
トを回転させて反応混合物を集め、鉱油を均一層の穴に
分散させた。反応物を70℃で２分間インキュベーション
し、pH8.0の20mM EDTA、ならびに各0.05％のキシレンシ
アンールおよびプロモフェノールブルーとともに91％の
ホルムアミド４μｌを添加して反応を停止させた。これ
ら反応物５μｌを75℃で５分間加熱し、その１ないし２
μｌを緩衝液勾配配列決定ゲルに充填した。結果を第３
図に示す。
実施例４ 好ましい配列決定法 A.鋳型とプライマーとのアニーリング 1.5mlの微小遠心管中に、鋳型DNA（0.5pmol）５μ
ｌ、プライマー（0.5pmol）１μｌおよび５×配列決定
緩衝液４μｌを集める。総量は10μｌとすべきであっ
て、DNAの容量を少なくすれば、水の量を変えることに
なる。この遠心管を70℃で３分間、続いて42℃で10分間
加熱する。
B.標識反応 TaqDNAポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で1:10に希釈し
て、5U/mlとして氷上に保つ。アニーリングした鋳型／
プライマーに以下のものを添加する。標識混合物（dGTP
またはc7dGTP）２μｌ、（α−〔35Sチオ〕dATP（＞600
Ci/mmol、pH8.5の10μM Tris-HClで10μＭに希釈）１μ
ｌ、およびTaqDNAポリメラーゼ希釈液（5U/ml）２μ
ｌ。短時間攪拌して、微小遠心機でこの管を遠心して試
料を集め、37℃で２分間インキュベーションする。
c7dGTPを配列決定反応で用いるならば、c7dGTP標識混
合物を使用すべきである。ゲルに収縮が生じるような配
列を分離するには、c7dGTPの使用を薦める。停止混合物
のアリコートを、標識反応の開始に先立って、マイクロ
タイタープレートに分けるべきである。標識プライマー
を配列決定に使用するならば、（α−〔35S〕チオ）dAT
P、標識混合物、および標識反応のインキュベーション
は省略し、pH8.5の10μM Tris-HClで容量を20μｌとす
る。
C.停止反応 配列決定の停止反応は、マイクロタイタープレート
（ファルコン＃3911）中でG,A,TおよびＣとラベルした
１鋳型／プライマーに対して４穴を使って行うこともで
きる。Ｇとラベルした穴にddGTP停止混合物２μｌを入
れる。同様に、２μｌのddATP,ddTTPおよびddCTP停止混
合物を適切なラベルをほどこした穴に入れる。標識反応
にc7dGTPを用いるならば、c7dGTP停止混合物を使用すべ
きである。
標識反応が終了すると同時に、G,A,TおよびＣとラベ
ルした４つの穴のそれぞれにアリコート4mlを移す。穴
の側面にこれらを滴下し、停止混合物とともに混合して
沈降させる。すべての穴をすべての反応物で充填したな
らば、マイクロタイタープレートを短時間回転させ、標
識反応物と停止混合物との混合が完了したことを確認す
る。
穴の底が接触するような断熱材を使って、このマイク
ロタイタープレートを70℃で２分間インキュベーション
する。この時間で、長さ1500bpを上回る伸長産物が得ら
れる。インキュベーション時間を長くすると、過剰の蒸
発が生じる。
D.反応の終止 断熱材から反応物を除き、室温におく。反応終止溶液
２μｌを各穴の側面に注ぐ。短い時間マイックロタイタ
ープレートを回転させ、終止溶液を混合する。試料は７
日間−20℃で保存可能であって、分解は最低限度に止ま
る。
E.試薬 TaqDNAポリメラーゼ配列決定緩衝液（５倍濃度）は、
pH8.5の50mM Tris-HClおよび30mM MgCl2である。
酵素希釈緩衝液は、pH8.0の10μM Tris-HCl、0.5％ T
ween20および0.5％ NP40である。
標識混合物（c7dGTP）は、10μM c7dGTP、５μM dCTP
および５μM dTTPである。
標識混合物（dGTP）は、10μM dGTP、５μM dCTPおよ
び５μM dTTPである。
ddG停止混合物（c7dGTPに対して）は、60μM c7dGT
P、30mMの各dATP,TTPおよびdCTPならびに180μM ddGTP
である。
ddG停止混合物（dGTPに対して）は、30μＭの各dNTP
および180μM ddGTPである。
ddA停止混合物（c7dGTPに対して）は、60mM c7dGTP、
30mMの各dATP,TTPおよびdCTPならびに１μM ddATPであ
る。
ddA停止混合物（dGTPに対して）は、30μＭの各dNTP
および１μM ddATPである。
ddT停止混合物（c7dGTPに対して）は、60mM c7dGTP、
30mMの各dATP,TTPおよびdCTPならびに1.5μM ddTTPであ
る。
ddT停止混合物（dGTPに対して）は、30μＭの各dNTP
および1.5μM ddTTPである。
ddC停止混合物（c7dGTPに対して）は、60mM c7dGTP、
30mMの各dATP,TTPおよびdCTPならびに500μM ddCTPであ
る。
ddC停止混合物（dGTPに対して）は、30μＭの各dNTP
および500μM ddCTPである。
TaqDNAポリメラーゼは、50U/μｌの濃度で保存する。
終止溶液は、95％ホルムアミド、20μM EDTA、0.1％
ブロモフェノールブルーおよび0.1％キシレンシアノー
ルである。
上記のこの発明の実施例に関する他の変形例は、分子
生物学、医学的診断技術、生化学および関連分野で通常
の知識を有する者には自明であって、当然この発明の請
求の範囲に入る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲルファンド，デイビッド エイチ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，チェルトン ド ライブ 6208 (72)発明者 ブロウ，メリー アン ディー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94618，オークランド，ヒレガス アベ ニュ 6142 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．333，Ｐ．477 −478（1988) Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏ ｌ．４，Ｎｏ．５，Ｐ．428−432 （1986) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．85，ｐ．544−548 （1988) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ジデオキシヌクレオシド−５′−トリホス
    フェート鎖伸長停止反応によって核酸セグメントのヌク
    レオチド配列を決定する方法であって、 （ａ）オリゴヌクレオチドプライマーを、単鎖の又は変
    性された２本鎖のDNA鋳型にアニールせしめ；そして （ｂ）前記プライマーをDNAポリメラーゼにより４個の
    別々の反応混合物中で伸長せしめ、ここで前記各反応混
    合物は、４種類のデオキシリボヌクレオシド−５′−ト
    リホスフェート（dNTP）すなわちdATP,dCTP,dGTP及びTT
    P、並びに１種類の鎖停止用ジデオキシヌクレオシド−
    ５′−トリホスフェート（ddNTP）の混合物、あるいは
    １又は複数のデオキシリボヌクレオシド−５′−トリホ
    スフェートがdATP,dCTP,dGTP又はTTPの天然又は合成類
    似体により置き換えられている類似の混合物を含有し； Taq DNAポリメラーゼが使用され、そして上記段階
    （ｂ）における前記デオキシリボヌクレオシド−５′−
    トリホスフェートが類似の濃度で存在する、ことを特徴
    とする方法。
  2. 【請求項２】前記類似の濃度が、各デオキシリボヌクレ
    オシド−５′−トリホスフェート（dNTP）について10μ
    Ｍ以上である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記類似の濃度が、各デオキシリボヌクレ
    オシド−５′−トリホスフェート（dNTP）について５μ
    Ｍ〜30μＭである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】dATP:ddATPの比が1:32であり、そして／又
    はdCTP:ddCTPの比が1:16であり、そして／又はdGTP:ddG
    TPの比が1:6であり、そして／又はTTP:ddTTPの比が1:48
    である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】段階（ｂ）の反応を、50℃より高温で行う
    ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】段階（ｂ）の反応を、55℃〜70℃において
    行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】段階（ｂ）の反応を、約75℃を中心とする
    Taqポリメラーゼの至適温度において行うことを特徴と
    する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】段階（ｂ）で使用されるプライマーが標識
    されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】前記標識が蛍光標識である、請求項８に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】段階（ｂ）において使用される４種類の
    dNTP又はddNTPのいずれか１つが標識されている、請求
    項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記dNTPが、 dATP,dCTP,c7dGTP及びTTP;あるいは dATP,dCTP,dITP及びTTP、 である、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】鎖伸長停止に先立って標識付与段階を行
    い、該標識付与段階を、始期の低温において、且つ４種
    類すべてのdNTPの均一に低い濃度での存在下に行い、該
    dNTPの１種が標識されている、ことを特徴とする、請求
    項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記始期の低温が37℃である、請求項12
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】標識されたdNTPの濃度が0.5μＭであ
    る、請求項12又は13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】１種類の標識されていないdNTPの濃度を
    1.0μＭに上げる、請求項12〜14のいずれか１項に記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】前記鎖伸長停止に先立って行われる標識
    付与段階に、構造不安定化塩基類似体７−デアザグアニ
    ン（c7dGTP）がさらに存在する、請求項12〜15のいずれ
    か１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記核酸セグメントがポリメラーゼ連鎖
    反応により生成されたものである、請求項１〜16のいず
    れか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記ポリメラーゼ連鎖反応が、非対称ポ
    リメラーゼ連鎖反応である、請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記Taqポリメラーゼの活性が非イオン
    性界面活性剤の存在により刺激される、請求項１〜18の
    いずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記Taqポリメラーゼの活性が0.05％のT
    ween 20及び0.05％のNP40の存在により刺激される、請
    求項１〜18のいずれか１項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】段階（ｂ）の反応混合物中のKClの濃度
    が75mM未満である、請求項１〜20のいずれか１項に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】段階（ｂ）の反応混合物中のKClの濃度
    が50mM未満である、請求項１〜21のいずれか１項に記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】段階（ｂ）の反応混合物中にKClが存在
    しない、請求項１〜22のいずれか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】段階（ｂ）の反応混合物中にMgCl2が3mM
    以上の濃度で存在する請求項１〜23のいずれか１項に記
    載の方法。
  25. 【請求項２５】ジデオキシヌクレオシド−５′−トリホ
    スフェート鎖伸長停止法により核酸セグメントのヌクレ
    オチド配列を決定するためのキットであって、Taq DNA
    ポリメラーゼ及び４種類の異る鎖伸長停止混合物を含ん
    で成り、各鎖伸長停止混合物が、ddATP,ddCTP,ddGTP及
    びddTTPから成る群から選択された鎖伸長停止ジデオキ
    シヌクレオシド−５′−トリホスフェート（ddNTP）並
    びに類似の濃度の４種類のデオキシヌクレオシド−５′
    −トリホスフェート（dNTP）すなわちdATP,dCTP,dGTP及
    びTTPを含んで成る、ことを特徴とするキット。
  26. 【請求項２６】非イオン性界面活性剤を含んで成る酵素
    希釈緩衝剤をさらに含んで成る、請求項25に記載のキッ
    ト。
  27. 【請求項２７】前記非界面活性剤が、0.5％のTween 20
    及び0.5％のNP40である、請求項26に記載のキット。
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