JP2001178500A - 多様なｄｎａ重合酵素を用いるｄｎａ塩基配列決定及び、これに使用されるキット - Google Patents

多様なｄｎａ重合酵素を用いるｄｎａ塩基配列決定及び、これに使用されるキット

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JP2001178500A JP2000359455A JP2000359455A JP2001178500A JP 2001178500 A JP2001178500 A JP 2001178500A JP 2000359455 A JP2000359455 A JP 2000359455A JP 2000359455 A JP2000359455 A JP 2000359455A JP 2001178500 A JP2001178500 A JP 2001178500A
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翰▲吾▼ 朴
Jaehyung You
在亨 兪
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    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来のサンガー法によるＤＮＡ配列決定方法
を改良して、ＤＮＡ両末端部位の塩基配列を容易に決定
できるようにして、１回の塩基配列決定で従来の方法よ
り、もっと長鎖のＤＮＡ序列が決定できる方法及び、こ
れに使用されるキットを提供すること。 【解決手段】 サンガー法によるＤＮＡ塩基配列決定に
おいて、ｄＮＴＰに対する親和度に比して、ｄｄＮＴＰ
に対する親和度がもっと高い重合酵素と、ｄＮＴＰに対
する親和度に比して、ｄｄＮＴＰに対する親和度がもっ
と低い重合酵素を混合使用することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ配列決定方
法及びこれに使用されるキットに関するものであり、１
回のＤＮＡ配列決定を通じて、ＤＮＡ全部分の塩基配列
をより正確に決定できるＤＮＡ配列決定方法及び、これ
に使用されるキットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】現在まで知られたＤＮＡ配列決定のため
の一般の方法は、サンガーのジデオキシヌクレオチド鎖
終結法である。サンガーの方法は、ＤＮＡ重合酵素を用
いることにより、３'位置の炭素に水酸基（−OH）が結
合されたデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を基質とし
て鎖を伸長させ、３'位置の炭素に水酸基（−OH）が結
合されないジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を基
質として鎖伸長反応を終結させる。
【０００３】かかるサンガー法によるＤＮＡ配列決定方
法においては、主形ＤＮＡに相補的であるＤＮＡ断片を
構成する基質として、４種類のｄＮＴＰ即ち、デオキシ
グアノシン−３'−リンサン（ｄＧＴＰ），デオキシア
デノシン−３'−リンサン（ｄＡＴＰ）、デオキシチミ
ジン−３'−リンサン（ｄＴＴＰ）及び、デオキシシチ
ジン−３'−リンサン（ｄＣＴＰ）が使用され、相補Ｄ
ＮＡ断片の重合反応を終結させる基質として、４種類の
ｄｄＮＴＰ即ち、ジデオキシグアノシン−３'−リンサ
ン（ｄｄＧＴＰ），ジデオキシアデノシン−３'−リン
サン（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシチミジン−３'−リン
サン（ｄｄＴＴＰ）及び、ジデオキシシチジン−３'−
リンサン（ｄｄＣＴＰ）が使用される。ｄｄＮＴＰはｄ
ＮＴＰと相違して、３'位置炭素に結合された水酸基の
不存在により、ｄｄＮＴＰが生成中のＤＮＡ断片の末端
に結合される場合には、これ以上のＤＮＡ鎖伸長は起き
ない。
【０００４】従って、サンガー法によるＤＮＡ配列決定
方法においては、末端にｄｄＮＴＰが結合された多様な
長さのＤＮＡ断片が生成される。サンガー法において
は、主形ＤＮＡを構成するヌクレオチド数に相当する数
字の多様な種類の相補ＤＮＡ断片が生成され、これらを
電気泳動法を通じて、分子量順に従って分離した後、各
ＤＮＡ断片の末端塩基を決定することにより、主形ＤＮ
Ａ全体の塩基配列を決定する。
【０００５】しかし、かかるサンガーの方法が便利であ
るにもかかわらず、これまでは、相補ＤＮＡ断片生成反
応の反応進行度の限界によって、通常５００〜７００の
塩基対のＤＮＡしか正確に決定できないという問題があ
る。例えば、人間の相補ＤＮＡは平均２Kb程度なのに、
これを完全に決定するためには、分割して、３回以上の
塩基配列決定過程を通さなければならないので、多くの
時間と努力及び、費用が必要とされる。
【０００６】また、大規模遺伝体の塩基配列決定の方法
として知られているショッドガン法即ち、長鎖のＤＮＡ
を多数のＤＮＡ断片に分割して塩基配列を決定した後、
これらをコンピューター上で重複部位を対比して、全体
遺伝子の塩基配列を決定する方法においても、1回の配
列決定過程で決定できるＤＮＡ断片の長さをもっと長く
させたら全体ＤＮＡ塩基配列の決定する時間を短縮する
ことができる。
【０００７】通常的なサンガーの終結法においては、単
一のＤＮＡ重合酵素が使用されるため、主形ＤＮＡの２
０〜３０番目の塩基対に対応される比較的短鎖の相補Ｄ
ＮＡ断片と、主形ＤＮＡの６００〜７００番目の塩基対
に対応される比較的長鎖の相補ＤＮＡ断片は少なく生成
され、通常４０〜５００番目の塩基対に対応する相補Ｄ
ＮＡ断片が多く生成される。
【０００８】従って、比較的短鎖のＤＮＡ断片と、比較
的長鎖のＤＮＡ断片の濃度が低いから、ＤＮＡの中間部
位の塩基配列に比して両末端部位の塩基配列は決定しが
たいので、サンガー法によって１回の塩基配列決定を通
じて決定できるＤＮＡの長さの制限がある。だから、主
形ＤＮＡの両末端部位塩基配列をより正確に決定できる
ようにして、１回の配列決定を通じて完全に決定できる
ＤＮＡの長さをより長くできる方法の開発が必要であ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる従来
の問題点を解決するためのもので、その目的は、従来の
サンガー法によるＤＮＡ配列決定方法を改良し、ＤＮＡ
両末端部位の塩基配列を容易に決定できるようにして、
１回の塩基配列決定で従来の方法より、もっと長鎖のＤ
ＮＡ序列が決定できる方法及び、これに使用されるキッ
トを提供するものである。従って、前記の本発明の目的
は、従来のジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いるＤ
ＮＡ配列決定方法において、通常的なＤＮＡ重合酵素よ
り、ｄｄＮＴＰに対する親和度が高いＤＮＡ重合酵素
と、通常的なＤＮＡ重合酵素より、ｄｄＮＴＰに対する
親和度が低いＤＮＡ重合酵素からなる２種以上のＤＮＡ
重合酵素を混合使用するＤＮＡ配列決定方法を提供する
ことにより果たされる。
【００１０】即ち、ｄｄＮＴＰに対する親和度が高い重
合酵素は、比較的短鎖のＤＮＡ断片を多く生成させ、ｄ
ｄＮＴＰに対する親和度が低い重合酵素は、比較的長鎖
のＤＮＡ断片を多く生成させる。だから、ｄｄＮＴＰに
対する親和度が相違な重合酵素を混合使用してＤＮＡ塩
基配列を決定すると、主形ＤＮＡの１０〜１０００塩基
対以上までに対応する多様な長さの相補ＤＮＡ断片がほ
ぼ均等に生成され、より長鎖のＤＮＡ配列決定が可能に
なる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、サンガ
ー法によるＤＮＡ塩基配列決定において、ｄＮＴＰに対
する親和度に比して、ｄｄＮＴＰに対する親和度がもっ
と高い重合酵素と、ｄＮＴＰに対する親和度に比して、
ｄｄＮＴＰに対する親和度がもっと低い重合酵素を混合
使用することを特徴とするものである。従来のサンガー
法によるＤＮＡ塩基配列決定に使用される重合酵素のｄ
ＮＴＰに対する親和度と、ｄｄＮＴＰに対する親和度間
の比率は約３０００であり、ｄＮＴＰが重合酵素によっ
て鎖伸長反応が進行中の相補ＤＮＡ断片の末端に反応す
る頻度が、ｄｄＮＴＰが重合酵素によって鎖伸長反応が
進行中の相補ＤＮＡ断片の末端に反応して鎖伸長を終結
させる頻度の３０００倍に相当される。
【００１２】本発明においての「酵素親和度」は特定重
合酵素が、鎖伸長反応が進行中のＤＮＡ断片末端にｄｄ
ＮＴＰまたは、ｄＮＴＰが結合する反応頻度に寄与する
程度を相対的数値で現れたことを意味とする。本発明で
は、（株）バイオにアで生産するＴｏｐＴＭＤＮＡ重合
酵素のｄｄＮＴＰ及びｄＮＴＰに対する酵素親和度を基
準ですることにより、使用される酵素のｄｄＮＴＰとｄ
ＮＴＰに対する親和度を説明することである。
【００１３】本発明の方法においては、鎖伸長反応に寄
与するｄＮＴＰの反応結合頻度が鎖伸長反応の終結に寄
与するｄｄＮＴＰの反応結合頻度に比して、３０００倍
未満、好ましくは１０００倍以下、より好ましくは０.５
倍以下の重合酵素と、鎖伸長反応に寄与するｄＮＴＰの
反応結合頻度が鎖伸長反応の終結に寄与するｄｄＮＴＰ
の反応結合頻度に比して、３０００倍超過し、好ましく
は５０００倍以上、より好ましくは８０００倍以上であ
る重合酵素を用いる。
【００１４】従って、本発明の方法は、サンガー法によ
るＤＮＡ塩基配列決定方法において、ｄＮＴＰに対する
親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００倍
未満、好ましくは１０００倍以下、より好ましくは０．
５倍以下の重合酵素とｄＮＴＰに対する親和度がｄｄＮ
ＴＰに対する親和度に比して３０００倍超過し、好まし
くは５０００倍以上、より好ましくは８０００倍以上の
重合酵素を共に含むヌクレオチド混合物を製造する段
階；前記ヌクレオチド混合物の各々に塩基配列を決定し
ようとするＤＮＡを添加して相補ＤＮＡ断片を生成させ
る段階；また、前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従って
分離し、末端に結合された塩基を決定して前記ＤＮＡの
塩基配列を認識する段階を含むことを特徴とする。
【００１５】本発明のまた他の目的のＤＮＡ配列決定用
キットは、ｄＮＴＰに対する親和度が、ｄｄＮＴＰに対
する親和度に比して３０００倍未満、好ましくは１００
０倍以下、より好ましくは０．５倍以下の重合酵素と、
ｄＮＴＰに対する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に
比して３０００倍超過し、好ましくは５０００倍以上、
より好ましくは８０００倍以上の重合酵素を共に含むヌ
クレオチド混合物が満たされた４種の密閉容器で構成さ
れる。即ち、ｄｄＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、緩衝溶液、安定化剤、ｄｄＮＴＰに対す
る親和度が、ｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００
倍未満、好ましくは１０００倍以下、より好ましくは
０．５倍以下の重合酵素及び、ｄｄＮＴＰに対する親和
度が、ｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００倍超過
し、好ましくは５０００倍以上、より好ましくは８００
０倍以上の重合酵素で満たされた密閉容器；ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、緩衝溶
液、安定化剤、ｄｄＮＴＰに対する親和度が、ｄＮＴＰ
に対する親和度に比して３０００倍未満、好ましくは１
０００倍以下、より好ましくは０．５倍以下の重合酵素
及び、ｄｄＮＴＰに対する親和度がｄＮＴＰに対する親
和度に比して３０００倍超過し、好ましくは５０００倍
以上、より好ましくは８０００倍以上の重合酵素で満た
された密閉容器；ｄｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＴＴＰ、緩衝溶液、安定化剤とｄｄＮＴＰに
対する親和度がｄＮＴＰに対する親和度に比して３、０
００倍未満、好ましくは１０００倍以下、より好ましく
は０．５倍以下の重合酵素及びｄｄＮＴＰに対する親和
度がｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００倍超過
し、好ましくは５０００倍以上、より好ましくは８００
０倍以上の重合酵素で満たされた密閉容器で構成され
る。
【００１６】ｄｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、緩衝溶液、安定化剤と、ｄｄＮＴＰに対
する親和度がｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００
倍未満、好ましくは１０００倍以下、より好ましくは
０．５倍以下の重合酵素及び、ｄｄＮＴＰに対する親和
度がｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００倍超過
し、好ましくは５０００倍以上、より好ましくは８００
０倍以上の重合酵素で満たされた密閉容器で構成され
る。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明の
構成をより具体的に説明するが、本発明の普通の範囲が
下記実施例の内容に限定されるものではない。
【００１８】実施例１ ３μＭのｄＧＴＰ，３０μＭのｄＡＴＰ、３０μＭのｄ
ＴＴＰ、３０μＭのｄＣＴＰと１５０ｎＭのｄｄＧＴＰ
を含むヌクレオチド混合物と、３μＭのｄＧＴＰ，３０
μＭのｄＡＴＰ、３０μＭのｄＴＴＰ、３０μＭのｄＣ
ＴＰと１．７５４μＭのｄｄＡＴＰを含むヌクレオチド
混合物と３μＭのｄＧＴＰ，３０μＭのｄＡＴＰ、３０
μＭのｄＴＴＰ、３０μＭのｄＣＴＰと３．０２μＭの
ｄｄＴＴＰを含むヌクレオチド混合物と、３μＭのｄＧ
ＴＰ，３０μＭのｄＡＴＰ、３０μＭのｄＴＴＰ、３０
μＭのｄＣＴＰと１μＭのｄｄＣＴＰを含むヌクレオチ
ド混合各々に、ｄｄＮＴＰに対する親和度が高い重合酵
素として、Ｔｈｅｒm o Sｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ社
製、ｄＮＴＰに対する酵素親和度がｄｄＮＴＰに対する
酵素親和度に比して０．５倍の重合酵素）、ｄｄＮＴＰ
に対する酵素親和度が低い重合酵素として、Ｔｆｉ ｍu
ｔａnｔＤＮＡ重合酵素（韓国特許出願第98−１３４０
８号、ｄＮＴＰに対する酵素親和度がｄｄＮＴＰに対す
る酵素親和度に比して８０００倍の重合酵素）を添加し
た。また、対照用として、前記ヌクレオチド混合物の各
々にｄｄＮＴＰに対する通常の親和度を有する重合酵素
として、トップＤＮＡ重合酵素（ＴＯＰ ＤＮＡ ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ；（株）バイオにア製、ｄＮＴＰに対す
る酵素親和度がｄｄＮＴＰに対する酵素親和度に比して
３０００倍の重合酵素）を添加した。
【００１９】このように製造された混合物に主形ＤＮＡ
とプライマーを添加して相補ＤＮＡ断片生成反応を進行
させてから、生成された相補ＤＮＡ断片を分子量順に従
って分離して末端塩基を決定した。主形ＤＮＡとしては
１．５μｇのｐUC１９プラスミドＤＮＡ、プライマーと
してはＭ13 Ｕｎｉｖｅｒｓｉａｌ Ｆｏｒｗａｒｄ １
７ｍｅｒ(5'-ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ、３
０ｐｍｏｌｅｓ)、及び、蒸留水を加えて40μｇの相補
ＤＮＡ断片生成反応用混合物を製造した。相補ＤＮＡ断
片の生成反応を順次に９４℃で２４０秒、９４℃で30
秒、５０℃で30秒、７２℃で６０秒を30回繰り返して、
最後に７２℃で３００秒間、もう1回進行させた。終結
溶液（２．５％ブロムフェノールブ−ル、２．５％キシ
レンシアノール、１０ｍＭ ＮａＯＨ）を４０μｌ加えて
相補ＤＮＡ断片の生成反応を終結させた。このように製
造された相補ＤＮＡ断片を８Ｍの尿素(Urea)、６％アク
リルアミドゲルを使用して電気泳動法で分子量順に従っ
て分離させた後、銀染色法(sｉｌｖｅｒｓｔａｒ ｓｔ
ａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ；(株)バイオニア製)で塩基配列を
決定した。
【００２０】実施例2 １０倍に希釈させた緩衝溶液(５００ｍＭ トリス-ＨＣ
ｌ, 20ｍＭ ＭｇＣｌ2),5Ｍべタイン(Betain)安定化
剤、Ｔｈｅｒm o Sｅｑｕｅｎａｓｅ２．５ユニット
と、Ｔｆｉ ｍuｔａnｔＤＮＡ重合酵素２．５ユニット
の混合物５ユニット（１ユニットは３７℃、１時間でＤ
ＮＡ１μｇを反応させられる量を意味とする。）、３μ
ＭのｄＧＴＰ、３０μＭのｄＡＴＰ、３０μＭのｄＴＴ
Ｐ、３０μＭのｄＣＴＰからなるｄＮＴＰの混合物と、
１５０ｎＭのｄｄＧＴＰを密閉容器に満たして；１０倍
に希釈させた緩衝溶液(５００ｍＭ トリス-ＨＣｌ, 20
ｍＭ ＭｇＣｌ2),5Ｍべタイン(Betain)安定化剤、Ｔｈ
ｅｒm o Sｅｑｕｅｎａｓｅ２．５ユニットと、Ｔｆｉ
ｍuｔａnｔＤＮＡ重合酵素２．５ユニットの混合物５ユ
ニット、３μＭのｄＧＴＰ、３０μＭのｄＡＴＰ、３０
μＭのｄＴＴＰ、３０μＭのｄＣＴＰからなるｄＮＴＰ
の混合物と１．７５４μＭのｄｄＡＴＰを密閉容器に満
たして；１０倍に希釈させた緩衝溶液(５００ｍＭ トリ
ス-ＨＣｌ, 20ｍＭ ＭｇＣｌ2)、 5Ｍべタイン(Betain)
安定化剤、Ｔｈｅｒm o Sｅｑｕｅｎａｓｅ２．５ユニ
ットと、Ｔｆｉ ｍuｔａnｔＤＮＡ重合酵素２．５ユニ
ットの混合物５ユニット、３μＭのｄＧＴＰ、３０μＭ
のｄＡＴＰ、３０μＭのｄＴＴＰ、３０μＭのｄＣＴＰ
からなるｄＮＴＰの混合物と３．０２μＭのｄｄＴＴＰ
を密閉容器に満たして；また、１０倍に希釈させた緩衝
溶液(500ｍＭ トリス- ＨＣｌ, 20ｍＭ ＭｇＣｌ 2)、5
Ｍベタイン安定化剤、Ｔｈｅｒm o Sｅｑｕｅｎａｓｅ
２．５ユニットと、Ｔｆｉ ｍuｔａnｔＤＮＡ重合酵素
２．５ユニットの混合物５ユニット、３μＭのｄＧＴ
Ｐ、３０μＭのｄＡＴＰ、３０μＭのｄＴＴＰ、３０μ
ＭのｄＣＴＰからなるｄＮＴＰの混合物と、１μＭのｄ
ｄＣＴＰを密閉容器に満たして、４種類の密閉容器で構
成された本発明のＤＮＡ塩基配列決定キットを製作し
た。
【００２１】このように製造されたＤＮＡ配列決定キッ
ト各々の密閉容器に主形ＤＮＡとしてはｐUＣ 19 プラ
スミドＤＮＡ、１．５μｇ, プライマーとしてはＭ13 Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉａｌ Ｆｏｒｗａｒｄ １７ｍｅｒ(5'-ｇ
ｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ、３０ｐｍｏｌｅ
ｓ)、及び、蒸留水を加えて40μｇの相補ＤＮＡ断片生
成反応用混合物を製造した。このように製造された混合
物を実施例１の方法によって相補ＤＮＡ断片を生成さ
せ、塩基配列を決定した。
【００２２】図１は、ｄｄＮＴＰに対する通常的な親和
度を有する従来のＤＮＡ重合酵素（Top DNA polymeras
e, 5ユニット）を含む混合物を使用して生成させた相補
ＤＮＡ断片を電気で分離させた結果である。
【００２３】図２は、ｄｄＮＴＰに対する親和度が高い
ＤＮＡ重合酵素（Tfi mutant, 5ユニット）を含む混合
物を使用して生成させた相補ＤＮＡ断片を電気泳動で分
離させた結果である。
【００２４】図３は、ｄｄＮＴＰに対する親和度が低い
ＤＮＡ重合酵素（Theremo Sequnase, 5 ユニット）を含
む混合物を使用して生成させた相補ＤＮＡ断片を電気泳
動で分離させた結果である。
【００２５】図４は、ｄｄＮＴＰに対する親和度が相違
な３種のＤＮＡ重合酵素（図１〜図３で使用された酵
素）を各々2ユニット,2ユニット,１ユニットずつ同時に
含む混合物を使用して生成させた相補ＤＮＡ断片を電気
泳動で分離した結果である。
【００２６】図５は、ｄｄＮＴＰに対する親和度が相違
する２種のＤＮＡ重合酵素（図２、図３で使用された酵
素）を各々２．５ユニットずつ同時に含む混合物を使用
して生成させた相補ＤＮＡ断片を電気泳動で分離した結
果である。
【００２７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の方法及び
キットを使用したら、１０〜１０００塩基対を有するＤ
ＮＡの塩基配列を容易に決定でき、１回の塩基配列決定
を通じて従来の方法に比して、もっと長鎖のＤＮＡ塩基
配列の決定ができ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｄｄＮＴＰに対する通常的な酵素親和度を有
する従来のＤＮＡ重合酵素（ｄＮＴＰに対する親和度が
ｄｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００倍の重合酵
素）を使用して生成させた相補ＤＮＡ断片を電気泳動で
分離させた結果である。
【図２】 ｄｄＮＴＰに対する酵素親和度が高いＤＮＡ
重合酵素（ｄＮＴＰに対する親和度がｄｄＮＴＰに対す
る親和度の０．５倍の重合酵素）を使用して生成させた
相補ＤＮＡ断片を電気泳動で分離させた結果である。
【図３】 ｄｄＮＴＰに対する酵素親和度が低いＤＮＡ
重合酵素（ｄＮＴＰに対する親和度がｄｄＮＴＰに対す
る親和度の８０００倍の重合酵素）を使用して生成させ
た相補ＤＮＡ断片を電気泳動で分離させた結果である。
【図４】 前記図１~図３のｄｄＮＴＰに対する酵素親
和度が互いに異なる３種のＤＮＡ重合酵素を同時に含む
ＤＮＡ重合酵素混合物を使用して生成させた相補ＤＮＡ
断片を電気泳動で分離した結果である。
【図５】 前記図２、図３のｄｄＮＴＰに対する酵素親
和度が互いに異なる２種のＤＮＡ重合酵素を同時に含む
ＤＮＡ重合酵素混合物を使用して生成させた相補ＤＮＡ
断片を電気泳動で分離した結果である。

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用い
    るＤＮＡ配列決定方法において、ｄＮＴＰに対する親和
    度が、ｄｄＮＴＰに対する親和度に比して、３０００倍
    未満の重合酵素と、ｄＮＴＰに対する親和度が、ｄｄＮ
    ＴＰに対する親和度に比して、３０００倍超過する重合
    酵素を含むヌクレオチド混合物を製造する段階；前記混
    合物に、塩基配列を決定しようとするＤＮＡとプライマ
    ーを添加するにより、相補ＤＮＡ断片を生成させる段
    階；また、前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従って分離
    して、末端に結合された塩基を決定し、前記ＤＮＡの塩
    基配列を認識する段階を含むことを特徴とする、ＤＮＡ
    塩基配列決定方法。
  2. 【請求項２】 前記ヌクレオチド混合物が、ｄＮＴＰに
    対する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して１０
    ００以下の重合酵素と、ｄＮＴＰに対する親和度がｄｄ
    ＮＴＰに対する親和度に比して５０００倍以上の重合酵
    素を含むことを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ塩基
    配列決定方法。
  3. 【請求項３】 前記ヌクレオチド混合物が、ｄＮＴＰに
    対する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して０．
    ５倍以下の重合酵素と、ｄＮＴＰに対する親和度がｄｄ
    ＮＴＰに対する親和度に比して８０００倍以上の重合酵
    素を含むことを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ塩基
    配列決定方法。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチド混合物がｄＮＴＰに対
    する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して３００
    ０倍の重合酵素を追加でもっと含むことを特徴とする、
    請求項１記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド混合物が、ｄＮＴＰに
    対する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して１０
    ００倍〜５０００倍の重合酵素を追加で、もっと含むこ
    とを特徴とする、請求項２記載のＤＮＡ塩基配列決定方
    法。
  6. 【請求項６】 前記ヌクレオチド混合物が、ｄＮＴＰに
    対する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して０．
    ５倍〜８０００倍の重合酵素を追加で、もっと含むこと
    を特徴とする、請求項３記載のＤＮＡ塩基配列決定方
    法。
  7. 【請求項７】 前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従って
    分離することにおいて、電気泳動法を用いることを特徴
    とする、請求項１記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  8. 【請求項８】 前記相補ＤＮＡ断片の末端に結合された
    塩基を決定することにおいて、銀染色法を用いることを
    特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  9. 【請求項９】 前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従って
    分離することにおいて、電気泳動法を用いることを特徴
    とする、請求項２記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  10. 【請求項１０】 前記相補ＤＮＡ断片の末端に結合され
    た塩基を決定することにおいて、銀染色法を用いること
    を特徴とする、請求項２記載のＤＮＡ塩基配列決定方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従っ
    て分離することにおいて、電気泳動法を用いることを特
    徴とする、請求項３記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  12. 【請求項１２】 前記相補ＤＮＡ断片の末端に結合され
    た塩基を決定することにおいて、銀染色法を用いること
    を特徴とする、請求項３記載のＤＮＡ塩基配列決定方
    法。
  13. 【請求項１３】 前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従っ
    て分離することにおいて、電気泳動法を用いることを特
    徴とする、請求項４記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  14. 【請求項１４】 前記相補ＤＮＡ断片の末端に結合され
    た塩基を決定することにおいて、銀染色法を用いること
    を特徴とする、請求項４記載のＤＮＡ塩基配列決定方
    法。
  15. 【請求項１５】 前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従っ
    て分離することにおいて、電気泳動法を用いることを特
    徴とする、請求項５記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  16. 【請求項１６】 前記相補ＤＮＡ断片の末端に結合され
    た塩基を決定することにおいて、銀染色法を用いること
    を特徴とする、請求項５記載のＤＮＡ塩基配列決定方
    法。
  17. 【請求項１７】 前記相補ＤＮＡ断片を分子量順に従っ
    て分離することにおいて、電気泳動法を用いることを特
    徴とする、請求項６記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
  18. 【請求項１８】 前記相補ＤＮＡ断片の末端に結合され
    た塩基を決定することにおいて、銀染色法を用いること
    を特徴とする、請求項６記載のＤＮＡ塩基配列決定方
    法。
  19. 【請求項１９】 緩衝溶液、安定化剤、ｄＡＴＰ、ｄＧ
    ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、ｄｄＡＴＰ及び重合酵素
    が満たされた密閉容器；緩衝溶液、安定化剤、ｄＡＴ
    Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、ｄｄＧＰＴび重
    合酵素が満たされた密閉容器；緩衝溶液、安定化剤、ｄ
    ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、ｄｄＣＴＰ
    及び重合酵素が満たされた密閉容器、緩衝溶液、安定化
    剤、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、ｄｄ
    ＴＴＰ及び重合酵素が満たされた密閉容器からなるＤＮ
    Ａ配列決定キットにおいて、前記重合酵素が、ｄＮＴＰ
    に対する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して３
    ０００倍未満の重合酵素と、ｄＮＴＰに対する親和度が
    ｄｄＮＴＰに対する親和度に比して３０００倍超過する
    重合酵素混合物からなることを特徴とする、ＤＮＡ配列
    決定キット。
  20. 【請求項２０】 前記重合酵素が、ｄＮＴＰに対する親
    和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して１０００倍以
    下の重合酵素と、５０００倍以上の重合酵素 の混合物
    からなることを特徴とする、請求項１９記載のＤＮＡ配
    列決定キット。
  21. 【請求項２１】 前記重合酵素が、ｄＮＴＰに対する親
    和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して０．５倍以下
    の重合酵素と、８０００倍以上の重合酵素混合物からな
    ることを特徴とする、請求項１９記載のＤＮＡ配列決定
    キット。
  22. 【請求項２２】 前記重合酵素混合物が、ｄＮＴＰに対
    する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して３００
    ０倍の重合酵素を追加で、もっと含むことを特徴とす
    る、請求項１９記載のＤＮＡ配列決定キット。
  23. 【請求項２３】 前記重合酵素混合物が、ｄＮＴＰに対
    する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して１００
    ０倍〜５０００倍の重合酵素を追加で、もっと含むこと
    を特徴とする、請求項２０記載のＤＮＡ配列決定キッ
    ト。
  24. 【請求項２４】 前記重合酵素混合物が、ｄＮＴＰに対
    する親和度がｄｄＮＴＰに対する親和度に比して０．５
    倍〜８０００倍の重合酵素を追加でもっと含むことを特
    徴とする請求項２１記載のＤＮＡ配列決定キット。
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