JP2875394B2 - テロメラーゼ活性アッセイ - Google Patents

テロメラーゼ活性アッセイ

Info

Publication number
JP2875394B2
JP2875394B2 JP51399795A JP51399795A JP2875394B2 JP 2875394 B2 JP2875394 B2 JP 2875394B2 JP 51399795 A JP51399795 A JP 51399795A JP 51399795 A JP51399795 A JP 51399795A JP 2875394 B2 JP2875394 B2 JP 2875394B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
telomerase
primer
substrate
sample
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51399795A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH09502102A (ja
Inventor
ハーリー，カルバン・ブルース
キム，ナム・ウー
ワインリッチ，スコット・ローレンス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JERON CORP
Original Assignee
JERON CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27495974&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2875394(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/151,477 external-priority patent/US5830644A/en
Priority claimed from US08/153,051 external-priority patent/US5645986A/en
Priority claimed from US08/255,774 external-priority patent/US5989807A/en
Application filed by JERON CORP filed Critical JERON CORP
Publication of JPH09502102A publication Critical patent/JPH09502102A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2875394B2 publication Critical patent/JP2875394B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、テロメアDNA合成に関係するリボ核タンパ
ク酵素であるテロメラーゼに関するものであり、テロメ
ラーゼ活性を同定および測定するためのアッセイおよび
プロトコールを提供するものである。本発明は、分子生
物学、化学、薬理学、ならびに医学的診断および予後技
術の分野に関する方法および組成物を提供するものであ
る。
関連文献の開示 テロメアは、真核生物染色体の両端の特殊構造であ
り、染色体安定化、位置決定、および複製において機能
することが明らかである［ブラックバーン（Blackbur
n）およびショスタック（Szostak）、1984、Ann.Rev.Bi
ochem.53:163−194;ザキアン（Zakian）、1989、Ann.Re
v.Genetics23:579−604;ブラックバーン、1991ネイチャ
ー（Nature）350:569−573］。全ての脊椎動物におい
て、テロメアは、100〜1000個の５′−TTAGGG−３′配
列のタンデム重複および会合タンパクからなっている
［ブラックバーン、1991;モイジス（Moyzis）ら、198
8、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci）85:662
2−6626］。染色体末端制限フラグメント（TRF）のサザ
ンブロット分析は、細胞群における全てとテロメアの合
成長さを提供する［ハーリィ（Harley）ら、1990、ネイ
チャー（Nature）345:458−460;オールソップ（Allsop
p）ら、1992、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）89:10114−10118;バジリ
（Vaziri）ら、1993、アメリカン・ジャーナル・オブ・
ヒューマン・ジェネティクス（Am.J.Human Genentics）
52:661−667］。現在までに試験された全ての正常体細
胞において、TRF分析は、両端まで線形DNAを複製するこ
とについてのDNAポリメラーゼの無能さと一致する、染
色体が細胞分裂当たり約50〜200ヌクレオチドのテロメ
ア配列を失うことを示した［ハーリィら、1990;オール
ソップら、1992;バジリら、1993;ワトソン（Watson）、
1972、Nature New Biology 239:197−201］。
このテロメアの短縮は、細胞がそれらの分裂を数える
有糸分裂時計であることが提案され［ハーリィ（Harle
y）、1991、ミューテーション・リサーチ（Mut.Res.）2
56:271−282］、充分に短いテロメアは、正常な細胞に
おける複製老化のシグナルである［オールソップら、19
92;バジリら、1993;ハステ（Hastie）ら、1990、ネイチ
ャー（Nature）、346:866−868;リンゼー（Lindsey）
ら、1991、ミューテーション・リサーチ256:45−8;ライ
ト（Wraight）およびシャイ（Shay）、1992、Trends Ge
netics ８:193−197］。対照的に、現在までに試験さ
れた非常に多くの不死化細胞は、細胞分裂によるテロメ
ア長さまたは配列の正味の損失を示しておらず、これ
は、細胞が複製老化を免れ、無期限に増殖するためにテ
ロメアの維持が必要であることを示す［カウンター（Co
unter）ら、1992、EMBO 11:1921−1929;カウンター（C
ounter）ら、1994、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・
エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）91:2900−2940］。
固有のリボ核タンパクDNAポリメラーゼであるテロメ
ラーゼは、酵素のRNA成分内に含有される配列を鋳型と
して用いて染色体末端でテロメアDNAを合成することが
知られている唯一の酵素である［グライダー（Creide
r）およびブラックバーン（Blackburn）、1985、セル
（Cell）43:405−413;グライダー（Greider）およびブ
ラックバーン（Blackburn）、1989、ネイチャー337:331
−337;ユ（Yu）ら、1990、ネイチャー344;126−132;ブ
ラックバーン（Blackburn）、1992、Ann.Rev.Biochem.
61:113−129］。ヒトの細胞および組織に関して、テ
ロメラーゼ活性は、不死化細胞系および卵巣癌において
同定されたが、致死細胞株または正常な非生殖細胞系組
織においては検出されなかった［カウンターら、1992;
カウンターら、1994;モリン（Morin）、1989、セル（Ce
ll）59;521−529］。TRF分析と一緒に、これらの結果
は、テロメラーゼ活性がテロメア維持に直接関係してい
ることを示しており、この酵素を細胞不死化に関連付け
ている。
テロメラーゼ活性の検出方法、ならびにテロメラーゼ
活性を調節するか、またはテロメラーゼ活性に影響を及
ぼす化合物の同定方法もまた、テロメア長さもしくはテ
ロメラーゼ活性を制御または測定することによる細胞老
化および不死化の治療または診断方法と一緒に開示され
た。1993年11月25日に公開されたPCT特許公開番号93/23
572を参照のこと（出典明示により本明細書の一部とす
る）。テロメラーゼ活性に影響を及ぼす化合物の同定
は、ヒトの疾患の治療に対する試みに重要な利益を与え
る。癌細胞は、不死化のためにテロメラーゼ活性を発現
し、必要とし、正常なヒト体細胞は、検出可能なレベル
でテロメラーゼ活性を発現しないので、テロメラーゼ活
性を阻害する化合物を用いて、癌を治療することができ
る。テロメラーゼ活性を刺激または活性化する化合物を
用いて、年齢関連疾患および細胞老化に関係する他の症
状を治療することができる。
テロメラーゼ活性を調節する化合物を同定するための
新しく改良されたスクリーニング方法が開発されている
が［1994年８月10日に出願されたU.S.特許出願番号 発明者：マイケル・コズロヴスキー（Michael Kozlowsk
i）およびカレン・プロウズ（Karen Prowse）、出典明
示より本明細書の一部とする］、テロメラーゼ活性の検
出および測定のための、感度がよく信頼性のあるアッセ
イが依然として必要とされている。細胞試料においてテ
ロメラーゼ活性をアッセイするための現行法は、テロメ
ラーゼ基質中に放射性標識ヌクレオチドを組み込むこと
に依存している［モリン、1989］。慣用のアッセイは、
オリゴヌクレオチド基質、標識のために放射性デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸（dNTP）、および生成物の分
析および表示のためにゲル電気泳動を用いる。５′−TT
AGGG−３′テロメア繰返し中に第１のＧを付与すると、
テロメラーゼが失速し、DNAを放出するので、ゲル上で
の生成物の特徴的なパターンは、伸長オリゴヌクレオチ
ド基質の６ヌクレオチドラダーである。繰返しの相は、
基質の３′−末端配列に依存する；末端が繰返し中にあ
る場合、テロメラーゼが認識し、従って、合成して、隣
接する繰返し配列が得られる。テロメア配列オリゴヌク
レオチドは、効果的なイン・ビトロ基質であるが、テロ
メラーゼは、非テロメアDNA配列からなる基質を用いて
繰返しをも合成するであろう。
かかる方法を用いて、科学者らは、細胞の低張膨潤
（hypotonic swelling）および物理的分断による信頼性
のあるテロメラーゼ抽出が少なくとも107−108個の細胞
を必要とし、抽出効率が細胞のタイプにより変わること
を見いだした［カウンターら、1992;モリン、1989］。
慣用のアッセイと比較して増大した、テロメラーゼ活性
検出の感度、速度および効率を有するテロメラーゼ活性
アッセイが依然として必要とされており、本発明は、こ
の要求を満たすものである。
発明の概要 本発明は、細胞試料がテロメラーゼ活性を含有するか
の判定方法ならびに関連する試薬および当該方法に有用
な物質を提供するものである。当該方法は、 （ａ）細胞試料から細胞抽出物を調製し； （ｂ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基
質、およびテロメア繰返し配列の付加によってテロメラ
ーゼがテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができる
緩衝液からなる反応混合物中に細胞抽出物のアリコット
を入れ、 （ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する
場合にテロメア繰返しと充分に相補的な配列からなるプ
ライマーが該伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズ
し、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的コピーを
形成するような条件下、該反応混合物に該プライマーを
添加して、それに特異的にハイブリダイズさせ、次い
で、 （ｄ）伸長プライマーと結合した伸長テロメラーゼ基質
からなる二本鎖DNA分子が存在する細胞試料におけるテ
ロメラーゼ活性の存在と、二本鎖のDNA分子が存在しな
い細胞試料におけるテロメラーゼ活性の不在との相互関
係を示すことからなる。
本発明は、本発明の実施に有用な試薬および関連方法
を提供するものである。かかる関連方法の１つは、細胞
試料からのイン・ヒドロ活性の抽出に関係する。本発明
の方法によると、該抽出は、非イオンおよび／または両
性イオン界面活性剤から、ある緩衝液中で行われる。
テロメラーゼ活性抽出物を用いて、テロメラーゼ基質
伸長反応においてテロメラーゼ基質の伸長を媒介する。
本発明のテロメラーゼ活性アッセイのもう１つの重要な
工程は、オリゴヌクレオチド「プライマー」の伸長およ
びこの工程に関係する本発明の多くの有用な試薬にも関
係する。典型的には、プライマー伸長は、鋳型依存性DN
Aポリメラーゼを用いて媒介され、該プライマーは、DNA
ポリメラーゼにより、プライマーへのヌクレオチドの付
加によって伸長される。
該DNAポリメラーゼは、好ましくは、熱安定DNAポリメ
ラーゼである；かかるポリメラーゼを用いると、各サイ
クルが、（１）反応混合物を加熱して、二本鎖DNA分子
を変性させ；（２）ポリメラーゼを不活化させずに、相
補的核酸がハイブリダイズすることができ、かつ、ポリ
メラーゼがプライマーを伸長することができる温度まで
に該反応混合物を冷却することからなるプライマー伸長
の多重サイクルを行うことができる。当該方法の具体例
では、反応混合物中でPCRのための第２のプライマーと
して供する過剰量のテロメラーゼ基質を有し、５、10、
15、20、30またはそれ以上の回数の加熱および冷却工程
を行うことによる有効なポリメラーゼ連鎖反応（「PC
R」）法を利用することもできる。
別法として、プライマー伸長は、鋳型依存性DNAリガ
ーゼによって媒介されることができ、その結果、該プラ
イマーは、DNAリガーゼにより、該プライマーへのオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの付加によって伸長され
る。典型的には、DNAリガーゼは、熱安定DNAリガーゼで
あり、プライマー伸長工程は、（１）反応混合物を加熱
して、二本鎖DNA分子を変性させ；（２）相補的核酸が
ハイブリダイズすることができ、かつ、リガーゼがプラ
イマーを伸長させることができる温度までに該反応混合
物を冷却することによって行われる。当該方法のこの具
体例では、反応混合物中の伸長プライマーと相補的なオ
リゴヌクレオチド（「リゴマー」）を有することによっ
て、および、５、10、15、20、30またはそれ以上の回数
の加熱および冷却工程を行うことによって有効なリガー
ゼ連鎖反応（「LCR」）を利用することもできる。
本発明は、本発明の実施に有用なプライマーおよびオ
リゴマーなどの多くのオリゴヌクレオチドを提供するも
のである。例えば、PCRを用いて核酸を増幅させる場
合、非特異的生成物形成を回避することが必要である。
かかる生成物は、「プライマー二量体」（primer−dime
r）を形成するための方法で用いたプライマー相互作用
を会することを含む種々の方法によって形成することが
できる。本発明は、プライマー二量体形成の問題を最小
にするように特別に設計されたプライマーを提供するも
のである。もう１つの態様では、本発明は、プライマー
の５′−末端で非テロメア繰返し配列（テロメ３繰返し
配列と同一でも相補的でもない配列）からなるプライマ
ーを提供するものである。本発明における「アンカープ
ライマー」（anchored primers）と称するかかるプライ
マーの使用は、最大プライマー伸長産生物がテロメラー
ゼ基質のテロメラーゼ媒介伸長の最大産生物ほど大きく
ないテロメア繰返しを有することを確実にすることがで
きる手段を提供する。かかるプライマーなしで、プライ
マー伸長および産生物変性の多重サイクルは、反応混合
物中、テロメラーゼ伸長テロメラーゼ基質中に存在する
よりも多くのテロメア繰返しからなるプライマー伸長産
生物を生じることができる。
本発明は、テロメラーゼ活性アッセイに有用な試薬、
および当該方法の実施を促進するためのこれらの試薬か
らなるキットの新規形態を提供するものでもある。該活
性アッセイは、典型的には単一反応管中で行われ、反応
成分を包装するための好都合なフォーマットを提供す
る。例えば、プライマーが該管の下部でワックス層また
はバリヤー下で密封され、テロメラーゼ基質ならびに所
望により緩衝液およびポリメラーゼ（またはリガーゼ）
がバリヤーの上に位置するように試薬を調製することが
できる。該管をテロメラーゼ媒介テロメラーゼ基質抽出
工程の終わりに加熱すると、ワックスバリヤーが溶融
し、プライマーが他の反応成分と混合する。このフォー
マットは、非常に特異的な核酸塩基対を確実にする温度
でのみ、該プライマーをDNAポリメラーゼおよび伸長テ
ロメラーゼ基質に接近させ易くし、そこで、非特異的プ
ライマー伸長およびプライマー二量体（プライマーおよ
び非伸長テロメラーゼ基質からなる）形成を減少させ
る。かくして、本発明の１つの有用なキットは、テロメ
ラーゼ反応緩衝液（所望により熱安定オリメラーゼまた
はリガーゼを含有してもよい）が設置されているワック
スバリヤーのすぐ下で密封したプライマーを含有する反
応管からなる。
テロメラーゼ伸長テロメラーゼ基質の同定を促進させ
るように種々の試薬を標識化することもできる。かくし
て、標識ヌクレオシド三リン酸を用い、テロメラーゼ基
質またはプライマーにおける標識ヌクレオチドの組込み
をモニターすることができる。しかしながら、テロメラ
ーゼ活性のより正確な定量化のために、標識テロメラー
ゼ基質またはプライマーを用いることができる。本発明
の目的のために種々の標識のいずれも用いることができ
る。かかる標識としては、典型的には、蛍光性標識、リ
ン光性標識、ケミルミネッセンス標識、および放射性標
識が上げられる。別法としては、標識は、単に、非標識
「タグ」であってもよく、該タグに結合する標識分子に
よって認識される。例えば、タグとしてビオチンを用い
ることができ、アビジン化ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ（「HRP」）を用いて、該タグに結合させ、次
いで、色素産生性基質（すなわち、TMB）を用いて、HRP
の存在を検出することができる。同様の形態で、該タグ
は、エピトープまたは抗原であってもよく、蛍光性標識
または放射性標識抗体を用いて、該タグに結合すること
ができる。
本発明は、また、テロメラーゼ活性のための定量的ア
ッセイを提供するための標識以外（または該標識に加え
ての）手段を提供するものである。本発明のこの態様で
は、実質的に、（５′から３′への方向で）テロメラー
ゼ基質、既知の長さ（好ましくは、３塩基）および組成
の「スタッファー」（stuffer）配列、特定の数のテロ
メア繰返し配列、ならびにプライマー伸長工程で用いら
れたプライマーと相補的な配列（該プライマーは、所望
によりアンカー配列を含有していてもよい）からなる既
知量の対照オリゴヌクレオチドを反応開始時に反応混合
物に添加する。この内部対照の使用は、アッセイが正し
く行われたかを判断し易くするだけではなく、試料中に
存在するテロメラーゼ活性を定量化し易くする。対照オ
リゴヌクレオチドは、好都合には、他の反応成分を有す
るキット中に包装することもできる。
本発明の方法は、いずれの起源からのいずれの試料中
でもテロメラーゼ活性の検出に幅広く利用できるが、該
方法は、特に、ヒトから得られた生体物質の試料中にお
けるテロメラーゼ活性の検出に有用であり、利用でき
る。かかる試料は、細胞または細胞性物質を含有し、典
型的には、癌の検出のためにヒトから得られる。テロメ
ラーゼは、正常な生後のヒト体細胞によっては発現され
ないが、ある種の体細胞および造血系の活性化細胞中で
は低レベルのテロメラーゼ活性を検出することができ、
そこで、ヒト体相組織または細胞の試料中のテロメラー
ゼ活性の存在は、ある種の癌細胞を含む不死化細胞が組
織中に存在することを示す。全ての癌細胞がテロメラー
ゼ活性を発現するわけではないが、テロメラーゼ発現
は、細胞を不死化させるために必要である。したがっ
て、テロメラーゼ活性を有する細胞の存在は、多くの型
の癌に関連しており、特定の侵食癌または転移性癌が存
在することを示すのに供することもできる。
かくして、本発明は、細胞内で高レベルのテロメラー
ゼ活性に関連する患者の病状の診断方法を提供するもの
である。該方法は、患者の細胞中でのテロメラーゼ活性
の存在または量を測定することに関係しており、したが
って、該方法は、前立腺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、卵
巣／子宮頚癌、肺癌、および白血病に関連する高レベル
のテロメラーゼ活性の検出に利用できる。該方法は、テ
ロメラーゼ基質およびプライマー伸長反応による、好ま
しくは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる細胞内でのテロ
メラーゼ活性の存在または量を測定することに関係す
る。
本発明のこれらおよび他の態様は、図面の簡単な説明
で始まる以下の記載にてより詳細に説明する。
図面の簡単な説明 第１図は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの部分で、慣用の
方法と比較して、本発明のテロメラーゼ抽出方法および
活性アッセイを用いて得られた改良された結果を示す。
第１図の部分Ａにおいて、CHAPS抽出細胞調製を慣用の
アッセイで用い、結果は、抽出物が予想通りに動くこと
を示す。以下の実施例１を参照のこと。第１図の部分Ｂ
において、テロメラーゼ基質「TS」は、TSテロメラーゼ
伸長生成物（約４個のテロメラーゼ繰返し配列を有す
る；繰返し配列の数は、伸長生成物から伸長生成物まで
変わることができる）と一緒に示され、これは、「CX」
プライマーとの二重鎖を示す（垂直線は、塩基対を示
し、星印は、プライマーと非伸長テロメラーゼ基質との
相互作用を最小にするようにプライマーの設計中に組み
込まれたミスマッチを示す）。この図における破線矢印
は、PCR工程の間に形成された陽性プライマー伸長生成
物を表す;CXプライマーの有効な伸長生成物は、実際の
および有効なTS伸長生成物間で挟まれていることを示
す。第１図の部分Ｄは、テロメラーゼ活性の特異的検出
のためのアッセイ（以下の実施例２を参照のこと）を確
認する、本発明の方法（「テロメラーゼ繰返し増幅プロ
トコール」または「TRAP」とも称される）における陽性
シグナルが、TSオリゴヌクレオチドを３個以上の５′−
TTAGGG−３′繰返して伸長させることができる不死化細
胞抽出物中のリボ核タンパクを必要とすることを示す多
重の対照実験の結果を示す。第１図の部分Ｆは、本発明
の方法（以下の実施例２を参照）の高い感度を説明する
ために異なるレベルのテロメラーゼ活性を含有する種々
の試料の分析結果を示す。
第２図は、CHAPS洗浄剤溶解法を用いる不死化細胞系
および正常体細胞培養物から調製した（以下の実施例１
および３を参照）同一の細胞抽出物10個について行った
本発明の方法（第２図の部分Ａ）および慣用のアッセイ
（第２図の部分Ｂ）の比較を示す。
好ましい具体例の説明 本発明は、テロメラーゼ活性の抽出および検出のため
の新規方法および試薬を提供するものである。同時に、
これらの改良の結果、テロメラーゼ活性の検出のための
慣用の方法よりも約104倍の改良を生じる。テロメラー
ゼは、染色体の両端でテロメアDNAを合成し、不死化細
胞の明確でない増殖のために必要であると思われる。種
々のヒトの細胞のタイプにおける染色体末端制限フラグ
メントの分析は、テロメア長さおよび配列が不死化細胞
系中で安定に維持されるが、正常な体細胞の分裂培養物
中では維持されないことを示した。テロメラーゼと不死
との関係は、標識テロメラーゼ基質伸長生成物を形成す
るためにテロメラーゼ基質中に放射性標識ヌクレオチド
を組み込むことに依存する慣用の活性アッセイの制限さ
れた感度のために確立するのが困難であった。
本発明の方法は、起源の18種類の組織を表すヒト細胞
系および正常体細胞におけるテロメラーゼ活性について
試験するために用いられた。68個の腫瘍誘発細胞系のう
ち68個、６個の形質転換細胞系のうち４個、および22個
の正常体細胞培養物のうち０個からの抽出物のテロメラ
ーゼ活性についての確実性を試験した。不死化体細胞お
よび正常体細胞間のテロメラーゼ活性の差異を少なくと
も1000倍であると評価した。これらの発見は、ヒトの細
胞におけるテロメア力学におけるテロメラーゼのための
直接的な役割を支持する。
改良されたテロメラーゼ活性アッセイを提供すること
に加えて、本発明は、低い細胞数でさえテロメラーゼ活
性の均一な抽出を提供する新規洗浄剤溶解法を提供する
ものである。該方法は、（１）細胞の試料を回収し；
（２）非イオンおよび／または両性イオン洗浄剤0.01〜
５％からなる溶解緩衝液中で該試料を溶解させ；（３）
遠心分離によって、細胞デブリを除去し、（４）該細胞
デブリから分離した上清を回収する工程を含む。当該方
法では、種々の非イオンおよび／または両性イオン洗浄
剤を用いることができる。好ましい非イオン洗浄剤とし
ては、トゥイーン20、トリトンＸ−100、トリトンＸ−1
14、Thesit、NP−40、ｎ−オクトルグルコシド、ｎ−ド
デシルクルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシ
ド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（MEGA−
８）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（MEGA−1
0）、およびイソトリデシルポリ（エチレングリコール
エーテル）ｎが挙げられ、好ましい両性イオン洗浄剤と
しては、CHAPS（３−｛３−コールアミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ｝−１−プロパン−スルホナート）、
CHAPSO（３−｛（３−コールアミドプロピル）ジメチル
−アンモニオ｝−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スル
ホナート）、Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−３−アン
モニオ−１−プロパン−スルホナート、およびジギトニ
ンが挙げられ、特に好ましい洗浄剤としては、CHAPSが
挙げられる。洗浄剤の正確な量は、限定的ではないが、
0.5％は、典型的にはテロメラーゼ活性の増強された抽
出を観察するのに充分である。
以下の実施例１は、CHAPS抽出テロメラーゼ活性が慣
用のテロメラーゼ活性アッセイにおいて予想されるよう
に機能することを示す。第１図Ａに示すように、洗浄剤
抽出活性は、テロメラーゼ活性の特性を有する伸長産生
物の６ヌクレオチドラダーを産生する（レーン１、２お
よび４）；テロメラーゼ媒介伸長について予想されるよ
うに、オリゴヌクレオチドテロメラーゼ基質の３′−配
列に依存する産生相においてシフトがある；抽出された
活性は、（ジデオキシヌクレオチド鎖読み終わり配列決
定（dideoxynucleotide chain termination sequencin
g）を用いて確認したように）５′−TTAGGG−３′繰返
しを有するテロメラーゼ基質（モリン（Morin）、199
1、ネイチャー（Nature）353:454−456;レーン４および
５）であることが予め示された非テロメラーゼオリゴヌ
クレオチドを伸長することができる；活性は、テロメラ
ーゼ活性について予想されるように、RNase処理によっ
て完全に破壊されたレーン３および5;グライダー（Grei
der）およびブラックバーン（Blackburn）、1985、セル
（Cell）43:405:413;グライダーおよびブラックバー
ン、1989、ネイチャー337:331−337;モリン、1989、セ
ル59:521−529）。
本発明のテロメラーゼ活性アッセイは、抽出物が本発
明の洗浄剤溶解方法を用いて得られる細胞試料のアッセ
イに限定されないが、かかる抽出物は、特に細胞２、３
個しか入手可能でない場合、または、試料中のテロメラ
ーゼ活性を発現する細胞の数が非常に少ない場合に、好
ましい。本発明のテロメラーゼ活性アッセイは、かかる
環境におけるテロメラーゼ活性を検出する際に慣用のア
ッセイに非常に優れており、終了するのにより早く、よ
り効率的である。この新規方法は、以下の基本的工程を
含む： （ａ）該細胞試料からの細胞抽出物を調製すること； （ｂ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基
質、および、テロメラーゼがテロメア繰返し配列の付加
によってテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができ
る緩衝液からなる反応混合物中に該細胞抽出物のアリコ
ートを入れ、 （ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する
場合に、該プライマーが伸長テロメラーゼ基質にハイブ
リダイズし、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的
なコピーを形成するような条件下、反応混合物に、テロ
メア繰返しと充分に相補的な配列からなるプライマーを
添加して特異的にハイブリダイズし； （ｄ）細胞試料中のテロメラーゼ活性の存在と、伸長プ
ライマーに結合した伸長テロメラーゼ基質からなる二本
鎖DNA分子の存在および二本鎖DNA分子が不在である細胞
試料中のテロメラーゼ活性の不在との相互関係を示す。
本発明の方法は、実質的に、２つのキー反応を含む：
（１）テロメラーゼ基質のテロメラーゼ媒介伸長；およ
び（２）テロメラーゼ伸長基質が試料中に存在するテロ
メラーゼ活性によって産生された場合のみ進行するプラ
イマー伸長反応。本発明の理解をより完全にするため
に、まず、（１）試料の性質；（２）イロメラーゼ基質
の重要な特徴；および（３）プライマー伸長反応の性質
ならびに該反応に用いたプライマーおよび伸長試薬に関
するいくつかの世界的な刊行物を考慮すべきである。
いずれのタイプの試料も当該方法によって試験するこ
とができる。特定の関心のある試料としては診断分析の
ために得られた組織または腫瘍試料であってもよい細胞
試料が挙げられる。種々の細胞におけるテロメラーゼ活
性の発現は、科学文献において研究され、検討された。
テロメラーゼは、真核細胞病原によるだけでなく、ある
種の腫瘍および癌細胞を含む不死化ヒト細胞によっても
発現されるが、正常な体（生殖細胞系に対する）組織の
細胞によっては、発現されない。しかし、低レベルのテ
ロメラーゼ活性は、幹細胞および造血系のある種の活性
化細胞において検出することができる。したがって、試
料は、テロメラーゼ発現病原または癌もしくは腫瘍細胞
が存在するかを測定するために得られる。かかる目的の
ために、該試料はしばしばヒトから得られるが、本発明
方法によって試験される試料がウシ、ウマ、ヒツジなど
の農業的に重要な哺乳動物、ネコおよびイヌのような獣
医学的に関心のある他の動物、ならびに病原の存在につ
いて試験する環境についての環境から入手することがで
きることを容易に理解することができる。
試料の起源とは無関係に、本発明を実施するために、
まず、好ましくは本発明の洗浄剤ベース抽出法を用いて
細胞抽出物を調製し、次いで、該細胞抽出物または該細
胞抽出物のアリコートを、テロメラーゼ基質およびテロ
メラーゼ活性と適合する緩衝液反応混合物中に入れる。
特に選択された適合基質は、試験するテロメラーゼ活性
のタイプまたは起源に依存して変わる。微生物によって
発現されたテロメラーゼ活性は、他の微生物によって発
現されたものとは基質特異性に関して異なる。したがっ
て、ヒト起源の癌細胞が試料中に存在するかを測定する
ために当該方法を用いる場合、ヒトテロメラーゼによっ
て認識されるテロメラーゼ基質が用いられる。
テトラヒメナ（Tetrahymena）およびヒト細胞のテロ
メラーゼについて種々の基質が知られており、他のタイ
プの細胞について容易に同定することができる。しかし
ながら、DNAポリメラーゼをベースとするプライマー伸
長工程を用いる場合、本発明方法は、テロメラーゼ基質
がテロメア繰返し配列を含まないことを要求する。当業
者は、テロメラーゼ活性によって産生したテロメア繰返
し配列がテロメラーゼの起源に依存することを認識する
であろう。例えば、テトラヒメナ（Tetrahymena）テロ
メラーゼは、テロメラーゼ基質の末端に配列５′−TTGG
GG−３′の繰返しを付加するが、ヒトテロメラーゼは、
５′−TTAGGG−３′の繰返しを付加する。かくして、ヒ
トテロメラーゼ活性についてアッセイする本発明方法を
用いる場合、テロメラーゼ基質は、配列５′−TTAGGG−
３′を欠いているヒトテロメラーゼ基質であるべきであ
る。異なる繰返し配列の存在が、以下に説明するような
過剰なプライマー二量体形成などの望ましくない結果を
生じない限り、ヒトテロメラーゼ基質が、異なる繰返し
を付加するテロメラーゼを有する微生物由来のテロメア
繰返し配列を欠いてることを要求しない。
テロメア繰返し配列を欠くためのテロメラーゼ基質に
ついてのこの要求は、本発明方法の第２反応−−非テロ
メラーゼ媒介プライマー伸長反応から生じる。この反応
では、伸長テロメラーゼ基質が存在する場合、プライマ
ーが伸長基質に結合し、次いで、酵素作用によって伸長
されるような条件下、伸長テロメラーゼ基質にのみハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを反応混
合物に添加する。テロメラーゼは、テロメア繰返しの付
加によってのみテロメラーゼ基質を伸長することができ
るので、該プライマーは、必ず、テロメア繰返しと相補
的な配列からなる。テロメラーゼ伸長反応で用いられた
テロメラーゼ基質がテロメア繰返しからなる場合、プラ
イマー伸長反応で用いたプライマーは、有効な陰性の結
果をもって、非伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズ
することができる。しかしながら、テロメラーゼ基質
は、得られた結果の有効性を傷つけることなく、テロメ
ア繰返し配列に非常に関係した配列からなることができ
る。例えば、特に好ましい本発明のヒトテロメラーゼ基
質は、ヒトテロメア繰返しの６個の塩基のうち５個と同
一であるが、テロメア繰返し配列を含有しない３′−末
端で配列を含有するTSとして知られたオリゴヌクレオチ
ドM2である。
プライマー伸長反応は、プライマーを伸長した第２シ
グナルを生じることによって試料（伸長テロメラーゼ基
質）中でテロメラーゼ活性の存在によって生じたシグナ
ルを増幅するために供する。該プライマーは、プライマ
ー伸長が生じるために伸長テロメラーゼ基質の存在を必
要とするいずれの手段によっても伸長することができ
る;2つの好ましい手段は、鋳型依存性DNAポリメラーゼ
または鋳型依存性DNAリガーゼのいずれかによって媒介
される。これらの手段のいずれかを用いて、テロメラー
ゼ活性が試料中に存在する場合、伸長テロメラーゼ基質
が形成され、次いで、プライマーにハイブリダイズし、
プライマー伸長産生物を産生するためにDNAポリメラー
ゼまたはDNAリガーゼについての基質を提供する。
プライマー伸長産生物が形成された後、伸長基質から
の伸長プライマーを解離することができる（典型的に
は、加熱よるが、ヘリカーゼによる処理などの酵素的ま
たは科学的プロセスを用いることもできる）。さらなる
プライマーおよびプライマー伸長試薬が試料中に存在す
る場合、新しいプライマー／伸長テロメラーゼ基質複合
物は、形成することができ、別の伸長プライマーの産生
を導く。所望のシグナルの量に依存して、プライマー伸
長および変性のプロセスを何回も繰り返すことができ
る。典型的には、プライマー伸長および伸長プライマー
／伸長テロメラーゼ基質複合物の変性は、少なくとも
５、10、15、20〜30回以上行われる。さらにまた、伸長
プライマーの３′−末端と相補的な第２のプライマーが
反応混合物中に存在する場合、シグナル（伸長プライマ
ーおよびらなる伸長テロメラーゼ基質）を劇的に増加さ
せることができる。プライマー伸長工程の間に反応混合
物中に存在する非伸長テロメラーゼ基質は、第２のプラ
イマーとして機能することができる。
当業者は、プライマー伸長試薬がDNAポリメラーゼで
あり、第２プライマーが存在する場合、適当な緩衝液お
よびヌクレオシド三リン酸が反応混合物に存在するとの
条件で、U.S特許第4,683,195号および第4,683,202号に
さらに充分に記載される、ポリメラーゼ連鎖反応のため
の必要な成分を有する。PCR増幅は、本発明のプライマ
ー伸長反応工程を行うための好ましいモードであり、劇
的に、慣用のアッセイと比較して、テロメラーゼ活性検
出の感度、速度、および効率を増加させる。該プロトコ
ールは、テロメア繰返し増幅プロトコールについて「TR
AP」と称され、実施例２および第１図Ｂ−Ｅに説明され
る。本発明のこの具体例では、テロメラーゼ基質は、PC
Rプライマーとしても供される（「上流プライマー」と
称される）。低レベルのプライマー／テロメラーゼ基質
アニーリングでさえテロメラーゼ産生物と同一の初期の
サイクルPCR産生物（すなわち、TS＋（５′−TTAGGGG−
３′）ｎ）を得ることができるので、他のプライマーの
配列は、テロメラーゼ基質およびプライマーのアニーリ
ングを回避するように選択される。その後のサイクルで
は、これらの産生物は、間違った陽性を生じるPCR産生
物の産生のための鋳型として供する。
本発明は、本発明のPCRに基づく具体例で用いるため
の種々のオリゴヌクレオチドプライマーおよびテロメラ
ーゼ基質を提供するものである。かかるプライマー
（「下流プライマー」と称する）は、「CX」と称され、
３つの不完全なテロメア繰返しおよび１つの完全な繰返
しと相補的な配列からなる（５′−（CCCTTA）3CCCTAA
−３′）。３個の繰返しにおける単一のヌクレオチド差
異は、（前記のような、テロメア繰返しの６個のヌクレ
オチドのうち５個を含有する）テロメラーゼ基質TSにア
ニーリングするCXの能力を傷つけ、これにより、プライ
マー二重体などの非特異的PCR産生物の形成を最小にす
る。テロメア配列相補性によって核をなすこれらのプラ
イマー（CXおよびTS）間の可能な配列は、中断された
３′ヌクレオチドがミスマッチされる二本鎖に導き、ポ
リメラーゼによって効率的には伸長されない。
CXプライマーが示すように、および、当業者がこの記
載のリビューにより認識するように、「テロメア繰返し
に相補的な」配列を有するプライマーは、該プライマー
がハイブリダイズすることを示すテロメラーゼ基質伸長
産生物に関する１個以上のミスマッチ塩基を含有するプ
ライマーを含む。この定義内で許容することができるミ
スマッチの数は、プライマーの長さおよび配列組成、PC
R工程の間に用いた温度および反応条件、アッセイが行
われる目的、および所望の結果に依存して変わることが
できる。
プライマーCXに加えて、本発明は、本発明の利益を得
るのに必要ではないが、本発明の特異性、感度および効
率を非常に増大させる基本的なPCRのいくつかの変更例
を提供する。例えば、１つの重要な変更は、緩衝液に関
係する：本発明は、テロメラーゼ活性およびDNAポリメ
ラーゼ活性の両方を観察することができる緩衝液を提供
するものである。かかる緩衝液の使用は、熟練者に、同
一反応容器（典型的には、管：実施例２および第１図Ｃ
を参照）中でテロメラーゼ基質伸長反応およびプライマ
ー伸長反応の両方を行わせしめる。
他の変更は、反応混合物におけるテロメラーゼ基質ま
たはプライマーと相補的である短いオリゴヌクレオチド
の使用に関係する、これらの短いオリゴヌクレオチド
は、プライマー伸長工程で用いられるプライマーのアニ
ーリング温度よりも約10℃低い溶解温度（短いオリゴヌ
クレオチドがハイブリダイズするプライマーまたはテロ
メラーゼ基質に関する）を有し、プライマー二量体形成
および／または非特異的プライマー伸長を防止するよう
に設計される。短いオリゴヌクレオチドは、低い非特異
的な温度で不適切なプライマー伸長を防止するプライマ
ー伸長工程のための理想的なアニーリング温度以下の温
度でそれらの相補的なオリゴヌクレオチドから溶出し
た。短いオリゴヌクレオチドがテロメラーゼ基質にハイ
ブリダイズするように設計される場合、充分な一本鎖領
域（約３塩基）は、テロメラーゼ媒介伸長を生じせしめ
るために短いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする
場合、テロメラーゼ基質の３′−末端で残存しなければ
ならない。短いオリゴヌクレオチドがDNA合成のために
プライマーとして供することを意図しないと仮定すれ
ば、短いオリゴヌクレオチドの３′−末端をブロックし
て、ヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドへの付加を
防止することができる。短いオリゴヌクレオチドがプラ
イマーにハイリダイズするように設計される場合、短い
オリゴヌクレオチドの３′−末端をブロックして（すな
わち、ビオチンまたはアミノ基で）、短いオリゴヌクレ
オチドがテロメラーゼ基質として供することを防止すべ
きである。
実施例２に説明するように、種々の他の試薬およびフ
ォーマットを用いて、（１）テロメラーゼ媒介伸長反応
の最後に反応混合物を加熱した後にのみ溶融するワック
スバリヤーによるプライマーの他の反応成分からの分
離；（２）T4遺伝子32タンパク（クローンテック（Clon
tech）の使用そよび（３）TaqStartTM抗体の使用を含
む、高度な特異性を確実にすることができる。当業者
は、実施例２に記載の結果を生じるために用いられる試
薬が商業的に入手可能であるが、または、オリゴヌクレ
オチドの場合、商業的に入手可能な計測を用いて調製す
ることができることおよび種々のDNAポリメラーゼ、抗
体および一本鎖DNA結合タンパクが当該方法で用いられ
ることを認識するであろう。
実施例２および第１図に示す結果によって示されるよ
うに、TRAPアッセイによって評価するように、CHAPS抽
出について104個の細胞の実施例において用いられた条
件について低い限界を伴って（レーン４）ヒト293腎臓
細胞からのテロメラーゼポジティブ抽出物を105個の細
胞から慣用的に産生した（第１図Ｅ、レーン３）。103
個の細胞を表す抽出物の量（105個の細胞からの抽出物
の１％）は、再現可能に、テロメラーゼ活性の検出のた
めの102個の細胞等価物の実施例において用いられた条
件についての低い限界を伴って（レーン４）、TRFPアッ
セイにおいて明確なポジティブシグナルを与えた（第１
図Ｅ、レーン３）。これらの結果は、慣用の方法と比較
すると、伸長効率およびテロメラーゼ活性検出の両方に
おける少なくとも100倍を示し、一緒に104のファクター
によってテロメラーゼ活性の現行の検出可能性を増大さ
せる。102個の不死化細胞（第１図Ｅ、レーン４）にお
ける検出は、不死化細胞および正常な体細胞間のテロメ
ラーゼ活性における差異が少なくとも３桁の大きさであ
ることを示すが、105個のBJ細胞（レーンン１）におい
ては、示さない。
当業者は、前記検出限界が慣用的な方法を単に用いる
場合にのみ適用され、本発明方法を用いて、典型的に考
慮されるルーチンであるものよりも多少大きな試みを使
用するのに同意することを条件として、単一細胞におい
てテロメラーゼ活性を検出することができることを認識
するであろう。例えば、テロメラーゼ媒介伸長工程の時
間を増加させ、プライマー伸長サイクルの数を増加させ
て、２、３個の細胞または単一の細胞におけるテロメラ
ーゼ活性を検出するためのアッセイの感度を増加させる
ことができる。
実施例２のテロメラーゼ活性アッセイ法を用いて、種
々の組織および個体からの種々の不死化細胞系および正
常な体細胞培養物におけるテロメラーゼ活性について試
験した。第２図は、CHAPS洗浄剤溶解法（以下の実施例
１および３）を用いて調製した同一の10個の細胞抽出物
について行われるTRAPアッセイ（第２図Ａ）および慣用
アッセイ（第２図Ｂ）の比較を示す。いくつかの細胞系
（293、MCF−7/ADR−RES、NCI−H23、OVCAR−３、COLO2
05、M14）は、両方のアッセイにおいて活性を示し、他
（AsPC−１およびPC−３）は、TRAPアッセイにおいての
み活性を示し、正常な体細胞培養物（BJ、IMR−90およ
び31YO）は、いずれのアッセイによっても検出可能な活
性を示さない。これらの結果は、TRAP法が慣用的なアッ
セイによってネガティブを試験する抽出物におけるテロ
メラーゼ活性を検出することができることを示す。
18種類の組織からの合計74個の不死化細胞系および22
個の正常な体細胞培養物を含むように、この観測を拡大
し、結果を第１表にまとめて示す（以下の実施例３を参
照）。正常な体細胞培養物は、TRAPアッセイにおいて検
出可能なテロメラーゼ活性を示した。74個の不死化細胞
系のうち68個は、腫瘍誘発系であり、６個は、ウイルス
腫瘍タンパクと形質転換した細胞形であった。68個の腫
瘍系の全ては、テロメラーゼ活性を含有した。６個の形
質転換系のうち２個は、テロメラーゼ活性についてネガ
ティブを試験した。これらの２個の系が不死である場
合、検出可能なテロメラーゼ活性の欠失は、予想されな
い。しかしながら、これらの系におけるテロメア長さの
研究は、テロメラーゼが、系が誘導された正常な体細胞
のものよりも長いことを示し、これは、細胞がテロメラ
ーゼ活性の一時的爆発を経験したことを示す。テロメラ
ーゼ活性が再開されない場合、細胞は、無限の複製能を
有しない。
前記結果および以下の実施例１〜３に示すとおり、本
発明のPCRベースの具体例は、試料中のテロメラーゼ活
性を測定するための現在利用可能な方法よりも有意な改
良を提供する。しかしながら、本発明方法の他の新しい
変形法は、有意な長所をも提供する。特に、本発明方法
を用いて、単位時間当たりに生じたテロメラーゼ産生物
の数を提供することによって、試料中のテロメラーゼ活
性を定量化することができる。しかしながら、これらの
改良の性質を理解するために、まず、第１図および第２
図に示すように、実施例２において示すアッセイを用い
て得られた結果をより注意深く考慮する。これらの図面
から判明するように、アッセイされた試料のゲル電気泳
動で生じたバンドのラダーは、ゲルまで伸びる。かかる
結果は、テロメラーゼ媒介伸長反応の間にテロメラーゼ
によって添加した繰返しの数を反映するか、または、PC
R増幅の間にプライマーのスタッガード結合（staggered
binding）により生じる。
「スタッガード結合」なる用語は、伸長テロメラーゼ
基質３′末端を中断したままであり、したがって、DNA
ポリメラーゼによる伸長のために利用可能な方法で伸長
テロメラーゼ基質における配列へのプライマーの結合を
意味する。したがって、DNAポリメラーゼは、ヌクレオ
チドを伸長テロメラーゼ基質の３′末端に付加すること
ができ、テロメラーゼ媒介伸長工で生じたものよりも長
い分子を生じる。スタッガード結合が実施例２に記載す
るように反応で生じるかを測定するために、別々のテロ
メラーゼ伸長産生物を代表する合成オリグヌクレオチ
ド、例えば、TS＋４（TS＋４個のテロメア繰返し）を用
いて、特異的な増幅条件を研究した。高いストリンジェ
ンシー下でさえ、下流のプライマーのスタッカードアニ
ーリングが生じた（例えば、４個の繰返しのうち３個に
よるアニーリング）。故に、別々のテロメラーゼ伸長産
生物のPCR増幅は、PCR産生物の６ヌクレオチドラダーを
生し、ゲル分割の限界までサイズを増大させた。かくし
て、CXなどのプライマーを用いて産生されたTRAPアッセ
イ産生物は、プライマー伸長反応の間のプライマーの鋳
型のスタッガード結合のために、該アッセイにおいて生
じたテロメラーゼ産生物の長さ分布を直接的に反映して
いない。
かかる相互作用が基質に添加したテロメラーゼよりも
多い繰返しを有する産生物を生じることを防ぐために、
アッセイにおいて下流プライマーとして本発明の新規
「アンカー」プイマーを用いることができる。オリゴヌ
クレオチドACT（実施例４を参照）は、その５′末端で
の６ヌクレオチドアンカー配列およびCTR（Ｃ−リッチ
テロメア繰返し）配列（５′−CTAACC−３′）の３個の
繰返しからなる24ヌクレオチドオリゴヌクレオチドプラ
イマーである。本発明の目的のために、アンカー配列
は、テロメア繰返し配列と相補的でなく、かつ、同一で
はなく、プライマー対TS/CTR4またはTS/CXを用いる場合
に観察されるような自体での「増殖」からPCR産生物を
防止するPCRプライマーの５′末端配列である。
種々のアンカー配列を用いることができる。１つの具
体例では、アンカー配列は、「TS−アンカー」プライマ
ーを提供する当該方法のテロメラーゼ媒介伸長工程で用
いられたテロメラーゼ基質の配列である。かくして、ア
ンカープライマーは、５′から３′への方向で、テロメ
ラーゼ基質配列、および、テロメア繰返し配列の２個以
上の相相補的コピーからなる。かかるプライマーを用い
ることによって、プライマー伸長の第１ラウンド後、反
応混合物における過剰の非伸長テロメラーゼ基質がプラ
イマー伸長の第１ラウンドの結果として形成された複合
物の両方の鎖の合成をプライムすることができるので、
実質的に「−プライマー」モードである本発明の方法を
行うことができる。
TRAアッセイにおけるプライマーTSおよびACT（また
は、別のアンカープライマー）を用いることによって、
所定の抽出物におけるテロメラーゼのモースト・プロセ
ッシブ・プロダクト（Most Processive Product）（MP
P）を論理的に推論することができる。ACTなどのアンカ
ープライマーの使用は、PCRの間の長いバージョンへの
テロメラーゼ産生物の増殖を防止する。ACTプライマー
について、最も遅い移動バンドは、PCR前の初期テロメ
ラーゼ産生物のMPPの長さを直接反映する。ACTプライマ
ーは、TSとCXおよびCTR4などのプライマーとの間で見ら
れる当該タイプのプライマー二量体相互作用に対して耐
性である点で本発明の目的のために特に好ましい。
本発明のPCRベースの具体例は、前記で詳述され、以
下の実施例において例示されているが、本発明方法は、
プライマー伸長のいずれの方法を用いても行うことがで
きる。PCRは、プライマー伸長産生物の指数累積のため
に提供するが、プライマー伸長産生物の直線的累積は、
有用な結果を与えることができる。かくして、単一のプ
ライマーを用いることができ、単に、PCRを用いる場合
に産生される二本鎖核酸の単一の鎖の多くのコピーを作
製する。
さらにまた、かかるコピーは、ポリメラーゼ媒介プラ
イマー伸長以外のものによって作製することができる、
好適な方法としては、リガーゼ連鎖反応「バラニィ（Ba
rny）、1991、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）88:189−193］、核酸配列
ベース増幅［コンプトン（Compton）、1991、ネイチャ
ー（Nature）350:91−92］、自給配列複製［ギャテリィ
（Guatelli）ら、1990、プロシーディングズ・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エ
ス・エイ87:1874−1878］、鎖置換増幅［ウォーカー（W
alker）ら、1992、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・
エイ89:392−396］、および分枝鎖状DNAシグナル増幅
［アーディア（Urdea）、1994年９月12日、バイオ／テ
クノロジー（Bio/Tech.）12:926−928］が挙げられる
が、後者の方法は、標的核酸とのプローブハイブリタイ
ゼーションにより産生されたシグナルの増幅に関係す
る。１つの実施例として、DNAリガーゼを用いて、鋳型
核酸とハイブリダイズした２個のオリゴヌクレオチドと
一緒に結合することができる。PCRにおけると同様に二
本鎖核酸が変性される場合、結合および変性のプロセス
を何回も繰り返して、初期の鋳型、すなわち、伸長テロ
メラーゼ基質の多くの相補的コピーを累積することがで
きる。さらに、伸長テロメラーゼ基質上での最初の２個
のオリゴヌクレオチドの結合によって産生されたコピー
と相補的な２個の他のオリゴヌクレオチドを添加し、DN
Aリガーゼがこの２個と結合して、初期の伸長テロメラ
ーゼ基質のコピーを形成することができるようなこれら
のオリゴヌクレオチドを選択する場合、LCRの基本的な
成分を有する。
説明するために、以下の４個のオリグヌクレオチド
「リゴマー」を用いる本発明の方法でLCRを用いること
ができる： LCおよびCLTリゴマーは、伸長テロメラーゼ基質にア
ニーリングし、次いで、DNAリガーゼと結合して、LTSお
よびLGリゴマーの結合のために鋳型を形成した。これら
のリゴマーは、２個のリゴマーがアニーリングして、DN
Aリガーゼの平滑末端結合活性によって混合物中の別の
二本鎖核酸に結合することができる二本鎖核酸を形成す
ることができないように選択した。本発明の方法のプラ
イマー伸長工程がリガーゼ活性によって媒介される場合
に、テロメラーゼ基質がテロメア繰返し配列を含まない
ことを必要としない。当該方法で種々のかかるリゴマー
を用いて、鋳型依存性産生物形成を最小にすることがで
きる。テロメラーゼ伸長産生物のLCR増幅は、均一サイ
ズの増幅産生物を生じ、そこで、定量的分析に行われ
る。
本発明は、試料中のテロメラーゼの量を定量化するた
めの種々の手段を提供するが、ほとんどの目的のため
に、定量的結果（テロメラーゼ活性が存在または不在）
は、充分である。定量的情報を得るための１つの重要な
手段は、以下の実施例４で説明するように、公知の量で
各反応混合物に添加した対照オリゴヌクレオチド鋳型の
使用である。
本発明の実施となる対照オリゴヌクレオチドは、５′
から３′への順序で、テロメラーゼ基質配列、スペーサ
ー配列（任意：スペーサー配列の存在、好ましくは、３
塩基、ヌクレオチドの配列または長さであるが、テロメ
ラーゼ陽性試料から産生された反応生成物の電気泳動に
よって生じたラダーの間隔を変更することができる）、
テロメア繰返し配列（典型的には、複数存在、すなわ
ち、２〜50コピー）、およびアッセイにおいて用いられ
たプライマーと相補的な配列（簡単にはテロメア繰返し
配列の一部である、プライマーがアンカー配列を含む場
合、所望により、アンカー配列と相補的な配列）からな
る。もちろん、前記で定義した対照配列と相補的なオリ
ゴヌクレオチドは、対照配列として供することができ、
二本鎖対照核酸を用いることもできる。この内部対照の
使用は、アッセイが適正に行われたかの決定を容易にす
るだけでなく、試料中に存在するテロメラーゼ活性の定
量化を容易にする。
別法としては、公知の量で反応混合物にいずれの配列
の対照核酸をも添加することができ、伸長テロメラーゼ
基質を増幅するために用いたものと異なるプライマーで
対照を増幅することもできる。対照オリゴヌクレオチド
を増幅させるために用いた対照オリグヌクレオチドおよ
び／またはプライマーを、テロメラーゼ伸長産生物を標
識するために使用されるラベルと同様にまたは別に標識
することができる。対照オリゴヌクレオチドは、好都合
には、他の反応成分を有するキット中に包装することも
できる。
さらにまた、種々のタイプのオリグヌクレオチドを対
照としてまたは当該方法の工程で用いることができる。
前記検討および以下の実施例は、デオキシリボオリゴヌ
クレオチドテロメラーゼ基質、対照およびプライマーま
たはリゴマーを用いて得られた結果を用いておよびDNA
リガーゼまたはポリメラーゼを用いて本発明を説明する
が、本発明は、限定されるものではない。かくして、プ
ライマー伸長工程で１個以上の修飾（すなわち、合成ま
たは非天然）ヌクレオチドからなるリボオリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチドを用いることができる。
同様に、プライマーを伸長するため、および、伸長テロ
メラーゼ基質をコピーするためにRNAポリメラーゼを用
いることができる。本発明のこれらおよび他の変更は、
本発明のこの説明を考慮して、当業者に明白であろう。
プライマー伸長反応の性質と無関係に、種々の試薬を
標識して、反応混合物におけるテロメラーゼ伸長テロメ
ラーゼ基質の同定を容易にすることができる。当業者
は、本発明の方法が試料におけるテロメラーゼ活性の、
伸長プライマーにアニーリングした伸長テロメラーゼ基
質からなる二本鎖核酸の形成（反応混合物に存在する）
との相互関係を含むが、（１）伸長テロメラーゼ基質；
（２）伸長プライマー；または（３）（１）および
（２）の両方からなる二本鎖核酸の存在下によってかか
る分子の存在を推論することができることに基づくであ
ろう。しかしながら、如何なる場合も、典型的には、１
個以上の反応生成物中に組み込まれた標識を介して伸長
テロメラーゼ基質および／またはプライマーの存在を検
出することによってこの相互関係を作成するであろう。
例えば、標識ヌクレオシド三リン酸、標識プライマ
ー、または標識テロメラーゼ基質（または、同一のもの
との組合せ）を用いることができ、および標識のテロメ
ラーゼ基質またはプライマー伸長産生物中への組込みを
モニターすることができる。対照は、同一または異なる
標識で標識化される。本発明の目的のために種々の標識
を用いることができる。かかる標識としては、典型的に
は、蛍光標識、リン光標識、ケミルミネッセンス標識お
よび放射性標識が挙げられる。別法としては、該標識
は、単に非標識「tag」であってもよく、次いで、tagに
結合する標識分子によって認識される。例えば、tagと
いてビオチンを用いることができ、アビジニル化ホース
ラディッシュペルオキシダーゼ（「HRP」）を用いてtag
に結合させ、次いで、色素産生性基質（すなわち、TM
B）を用いてHRPの存在を検出することができる。同様
に、tagは、エピトープまたは抗原として用いることが
でき、蛍光性または放射性標識抗体を用いてtagに結合
させることができる。
標識の検出は、実施者の要求および用いた特定の標識
または検出手段に依存してさらなる工程を含んでもよ
い。いくつかの場合、実写は、まず、以下に例示するよ
うに、ゲル電気泳動を用いてお互いから反応生成物を分
離する。他の分離方法、すなわち、クロマトグラフィー
を用いることもできるが、いくつかの目的のために、分
離は、行われず、伸長テロメラーゼ基質および／または
プライマーの検出は、反応が行われた容器から反応混合
物を取り出さずに行われるであろう。本発明の１つの重
要な長所は、当該方法の、関心のある検出フォーマット
への適用性である。
用いた方法および試薬のこの説明を有すると、研究お
よび診断適用を含む本発明のテロメラーゼアッセイのた
めの適用を考慮することができる。アッセイが迅速かつ
簡素であり、単一管反応およびin situ検出に従うの
で、テロメラーゼ陽性細胞を検出することを必要とする
研究および臨床実験装置において該アッセイを用いるこ
とができる。かかる適用としては、限定されないが、
（ｉ）陽性癌細胞の同定のための腫瘍検体における不死
化細胞の検出；（ii）不死化剤（例えば、オンコジー
ン）を含むテロメラーゼを活性化、抑制解除、阻害、ま
たは抑制する能力を有する薬剤またはテロメラーゼおよ
び伸長テロメラーゼおよび細胞の複製寿命を活性化する
化合物の細胞ベースまたは無細胞スクリーンにおける同
定；（iii）培養系で、または、テロメラーゼ活性を有
する体細胞または初期の始原細胞のイン・ビボでの同
定；（iv）分化および発育の間のテロメラーゼ調節の試
験；（ｖ）テロメラーゼの精製の間に生じたテロメラー
ゼ陽性フラクションの同定；（vi）原生動物または真菌
類感染の同定；および（vii）テロメラーゼ活性の不在
によって特徴付けられるある種のタイプの不妊の診断が
挙げられる。
本発明の診断方法は、起源の細胞または組織タイプと
一緒に用いことができ、細胞がテロメラーゼ活性を示す
とすれば、起源の不死化細胞を検出するために用いるこ
とができる。ヒトの試料について、典型的には、不死化
細胞の検出を用いて、限定されないが以下に挙げる充実
性（solid）腫瘍および白血病を含む種々のタイプのい
ずれの癌細胞の存在も検出することができる；アプドマ
（apudoma）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候
群、カルチノイド心臓病、癌（例えば、ウォーカー癌、
基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピース（Brow
n−Pearce）癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス
２、メルケル細胞、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細
胞腫、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原生癌、
扁平上皮癌、および移行上皮癌）、組織球障害、白血病
（例えば、Ｂ−細胞性白血病、混合型白血病、ヌル細胞
性白血病、Ｔ−細胞性白血病、Ｔ−細胞性慢性白血病、
HTLV−II−関連白血病、リンパ性急性白血病、リンパ性
慢性白血病、肥満細胞性白血病、および骨髄性白血
病）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖症（im
munoproliferative small）、非ホジキンリンパ腫、プ
ラスマ細胞腫、細網組織増殖症、黒色腫、軟骨芽細胞
腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、
組織球腫、脂肪腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、
骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ
腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、末分化胚細胞腫、過
誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメ
ント質腫、葉牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫、腺癌、
腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺腫、顆
粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫、ヘパトーム、汗腺腫、膵
島細胞腫、ライディヒ細胞腫、乳頭腫、セルトーリ細胞
腫、胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、
筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞
腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神
経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経
腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、角化血管
腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性
血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮芽細胞
腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、
リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉
腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪
肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋
筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、実験肉腫、カ
ポージ肉腫、および肥満細胞肉腫）、新生物（例えば、
骨、胸、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、睾
丸、眼窩、頭部および頚部、中枢神経系、聴覚、骨盤、
気道、および尿生殖器）、神経線維腫症、および子宮頚
部形成異常。
本発明の診断方法では、該アッセイは、高いレベルの
テロメラーゼが存在するかを決定するために行われるで
あろう。「高いレベル」なる用語は、特定細胞における
テロメラーゼ活性の絶対的レベルがその個体における正
常な体細胞と比較して、また、病状に悩んでいない他の
個体における正常な体細胞と比較して上昇していること
を意味する。一般的に、テロメラーゼ活性の検出可能な
レベルは、正常な生後ヒト体細胞組織からの細胞におい
て上昇したと考えられる。高いレベルのテロメラーゼ活
性は、生殖細胞中に存在し、低レベルのテロメラーゼ活
性は、幹細胞およびある腫の造血系細胞において検出す
ることができるが、かかる細胞は、本発明方法の実施者
についての問題を提供しない。生殖細胞は、ヒト体組織
試料から容易に区別および／または分離することがで
き、幹細胞およびある種の造血細胞中に存在するテロメ
ラーゼ活性は、体組織試料中に存在する２、３のかかる
細胞がテロメラーゼ活性アッセイからの偽陽性シグナル
を生じないように低いレベルで存在する。体細胞におけ
るテロメラーゼ活性の検出は、あるタイプの癌細胞のよ
うな不死化細胞の存在を示し、該検出を用いて、細胞が
病理学によって非癌性であると分類される場合でさえ測
定を行うことができる。かくして、本発明の方法は、細
胞が肉眼的に癌性になる前に高い信頼性をもって癌性症
状を検出させる。
当業者は、細胞抽出物の使用がほとんどの目的のため
に好ましいが、無傷細胞を用いることができるような方
法を変更できることをも認識するであろう。この具体例
では、無傷細胞をテロメラーゼ基質オリゴヌクレオチド
で処理し、次いで、細胞が機能性テロメラーゼ活性を有
する場合にオリゴヌクレオチドが伸長される。次いで、
ポリメラーゼまたはリガーゼ、プライマー、およびヌク
レオシド三リン酸（ポリメラーゼを用いる場合）を用い
る確立したin situ PCRおよびLCR法の固定化細胞上で用
いて、テロメラーゼ伸長基質オリゴヌクレオチドを増幅
する。次いで、例えば、プライマー伸長の間の標識ヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドの組込みを用いて顕
微鏡によってテロメラーゼ陽性細胞を検出することがで
きる。
本発明の診断試験は、他の診断試験と組み合わせて行
うこともできる。いくつかの場合、かかる組合せ試験
は、疾患の進行に関する有用な情報を提供することがで
きるが、テロメラーゼ活性について試験するための本発
明の方法は、これに関して非常に有用な情報を提供す
る。本発明の方法を用いて患者試料の癌細胞の存在を検
出するが、テロメラーゼ活性の存在を用いて、患者な疾
患の進行過程にある場合に、特定の腫瘍が隣接組織を侵
すと思われるか、または、離れた位置に転移すると思わ
れるか、および癌の発生が再発するかを測定することが
できる。本発明の方法と組み合わせるさらなる情報を提
供する試験としては、エストロゲンレセプター、プロゲ
ステロンレセプター、DNA倍数性、Ｓ期における細胞の
フラクション、結節性状態、Her−2/neu遺伝子産生物、
p53、p16、p21、ras、および他のオンコジーンについて
の診断試験が挙げられる。
本発明は、本発明の診断方法を行うためのキットを提
供するものでもある。かかるキットは、容易に入手可能
な物質および試薬から調製することができ、種々の具体
例で機能することができる。例えば、かかるキットは、
１種類以上の以下の物質のからなり得る：反応管、緩衝
液、洗浄剤、オリグヌクオレチドテロメラーゼ基質、対
照試薬、オリゴヌクレオチドプライマー、および指示
書。本発明の特に好ましいキットは、テロメラーゼ基質
およびプライマーを入れた反応管からなる。このキット
の好ましい形態は、プライマーがワックスバリヤーによ
って他の反応成分から分離されるような管からなる。種
々のキットおよび成分は、キットの予定された使用者お
よび該使用者の個々の要求に依存して、本発明に従って
調製することができる。
以下の実施例は、本発明を説明するための本発明の特
定の態様を記載し、当業者のために本発明の説明を提供
する。該実施例は、単に、本発明の理解および実施にお
いて有用な特定の方法を提供するものなので、該実施例
は、本発明を限定しようとするものではない。
実施例１ CHAPS抽出テロメラーゼの調製 この実施例では、本発明の両性イオン洗浄剤ベース抽
出方法を用いて調製した細胞抽出物を、慣用のテロメラ
ーゼアッセイを用いてテロメラーゼ活性について試験し
た。
該細胞抽出物は、テロメラーゼ活性を発現することが
知られている、アデノウイルスタイプ5DNAのフラグメン
トと形質転換したヒト胚体腎臓細胞由来の不死化293細
胞から調製した。該細胞を、５％〜10％ウシ胎児血清を
含有するジョクリク（Jokjik）培地中で増殖させ、次い
で、遠心分離により回収し（特記しない限り、以下、該
方法は、約１×106個の細胞を回収したと仮定する）、P
BS中で１回洗浄し、４℃で１分間、10,000Xgでペレット
化し、氷冷洗浄緩衝液［10mM HEPES−KOH（pH7.5）、1.
5mM MgCl2、10mM KCl、1mM DTT、DEPC処理水］1mL中に
再懸濁させた。該細胞を再度ペレット化し、氷冷溶解緩
衝液［10mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM MgCl2、1mM EGT
A、1mM PMSF、5mM β−メルカプトエタノール、DEPC処
理水、0.5％CHAPS［ピアス（Pierce）より入手］、10％
グリセロール］中に細胞104−106個当たり溶解緩衝液20
μｌの濃度（実験の目的に依存する）で再懸濁させた。
該懸濁液を氷上で30分間インキュベートし、次いで、４
℃で30分間、100,000Xgで微小超遠心分離（microultrac
entrifuge）で回転させた。上清を別の管に取り出し、
ドライアイスで急速冷凍させ、−70℃で貯蔵した。これ
らの抽出物は、典型的には、５〜10mg/mlの全タンパク
濃度を含有しており、テロメラーゼ活性は、多重冷凍−
解凍に対して安定であった。
慣用のテロメラーゼアッセイのための方法およびその
条件は、1mMの濃度でオリグヌクレオチド基質を用い
て、以下の文献の記載に従った：カウンター（Counte
r）ら、1992;カウンターら、1994、ヨーロピアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガニゼイション・ジャー
ナル（EMBO J.）11:1921−1929;およびカウンターら、1
994、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）68:
3410−3414。モリン（Morin）、1989、セル（Cell）59:
521−529も参照のこと。該生成物を８％ポリアクリルア
ミド配列決定ゲル上で分離し、PhosphorimagerTMスクリ
ーン［モレキュラー・ダイナミクス（Molecular Dinami
cs）、カリファルニア州サニーベイル］に一晩暴露し
た。結果を第１図Ａに示す。異なるゲル寸法のために、
第１図Ａと第２図Ｂとの間で生成物分析が異なることに
注意する。慣用のアッセイで用いたテロメラーゼ基質
は、５′−GTTAGGGTTAG GGTTAGG−３′（「GTTAG
G）３」と略記する；第１図Ａのレーン１を参照）;5′
−TTAGGGTTAGGGTTAGGG−３′（「TTAGGG）３」と略記す
る；第１図Ａのレーン２および３を参照）および５′−
AATCCGTCGAGCAGAGTT−３′（「TS」）と略記する；第１
図Ａのレーン４および５を参照）であった。第１図Ａの
レーン３および５で用いた抽出物は、テロメラーゼのRN
A成分を分解し、活性を完全に破壊するRNase（DNase不
含、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannhei
m））0.5μｇと一緒に抽出物10μｌを25℃で10分間イン
キュベートすることによってRNaseで前処理した。テロ
メラーゼは、Ｇトリプレットの最初のＧを添加した後に
小休止し、そこで、最初の小休止前に添加したヌクレオ
チドの数（かくして、ラダーのフェージング）は、（GT
TAGG）３については５であり（レーン１）、（TTAGGG）
３については４であり（レーン２）、TSオリゴヌクレオ
チドについては２である（レーン4;TS伸長産生物の線図
については、第１図Ｂを参照）。
第１図Ａによって示されるように、CHAPS抽出テロメ
ラーゼ活性は、ヒトテロメラーゼについて予想されるよ
うに機能した。該物質は、用いた種々のテロメラーゼ基
質の各々について予想されるバンドパターンを生じ、該
バンドパターンは、該抽出物のRNaseによる前処理で完
全に破壊された。
実施例２ テロメラーゼ伸長産生物のPCR増幅 この実施例は、DNAポリメラーゼを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応におけるプライマー伸長反応を媒介させる本
発明のテロメラーゼアッセイ法を説明する。第１図Ｂに
示すように、反応成分は、テロメラーゼがテロメア繰返
し（第１図Ｂにおいて小文字配列によって示される）を
合成することによって伸長し、PCR工程において上流プ
ライマーとしても機能するテロメラーゼ基質TS（その配
列は、前記実施例１に記載されている）、および構造が
配列５′−（CCCTTA）3CCCTAA−３′によって定義され
る下流プライマーCXを含む。PCRの間のDNA合成は、第１
図Ｂにおいて破線矢印で示され、CXプライマーの最適な
アニーリングは、垂直線を用いて示され、星印は、CXプ
ライマー／伸長テロメラーゼ基質において設計されたミ
スマッチを示し、これは、CXプライマーと非伸長TSオリ
ゴヌクレオチドテロメラーゼ基質との間の相互作用を減
少させ、故に、プライマー二量体（より正確には、CXプ
ライマー/TS二量体形成）を最小にする。
前記のように、テロメラーゼは、TSオリグヌクレオチ
ドのような非テロメア配列のオリグヌクレオチドを伸長
することが知られており［モリン（Morin）、1991、ネ
イチャー（Nature）353:454−456］、オリグヌクレオチ
ド基質TSを用いて、PCRプライマー相補性による非特異
的増幅を回避した。プライマー相互作用を回避するため
の別の変更として、下流プライマーCXにおけるミスマッ
チ、一本鎖結合タンパクT4遺伝子32タンパク、ホットス
タートPCR、および50℃のアニーリング温度を用いて、
この実施例に記載するテロメラーゼ活性アッセイを行っ
た。これらの条件下、特異的増幅は、オリグヌクレオチ
ド基質が３個以上の５′−TTAGGG−３′繰返しで伸長し
た場合にのみ生じ、ヌクレオチド40個（最初の増幅可能
なテロメラーゼ産生物）からゲル分析の限界まで伸長す
るTRAPアッセイ産生物の６ヌクレオチドラダーを生じ
る。
本発明方法の容易さおよび効率を非常に改良するもう
１つの重要な変更は、テロメラーゼおよびDNAポリメラ
ーゼの両方が機能することができる新規反応緩衝液の研
究に関係する。この緩衝液の使用により、第１図Ｃに示
すような、TRAPアッセイのための単一管装置またはフォ
ーマットが用いられる。この変更により、CXプライマー
が、最初に、ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件を媒介する高温でのみ溶融するワックスバリヤーに
より反応混合物の残部から分離されるので、プライマー
伸長の特異性が増加する。該アッセイ管は、CXプライマ
ー（0.1μｇ）の懸濁液（50ng/μｌ）２μｌを添加し、
該管の下部に回転させ、Speed−VacTM遠心分離器中で乾
燥するまで蒸発させることによって調製した。
痕跡量のブロモフェノールブルーをCXプライマー懸濁
液に添加して、サーマルサイクリング前にワックスバリ
ヤーを通る起こり得る漏出をモニターした。この目的の
ための色素の添加は、本発明の実施のために決して必要
なわけではないが、色素添加は、製造工程の完全性をモ
ニターするための慣用方法である。次いで、管を70℃で
加熱し、溶融ワックス［AmpliwaxTM、パーキン−エルマ
ー（Perkin−Elmera）］７−10μｌを該管中にピペット
で移した。該ワックスを室温で固化した後、該管を４℃
で貯蔵した。管は、使用前に室温に加温した。アッセイ
パフォーマンスに対する影響は、２カ月間まで４℃で貯
蔵した調製管を用いても観察されなかった；かかる管
（およびこれを含むキット）の予想される半減期は、室
温でさえ少なくとも１年であると予想される。
反応は、典型的には、ワックスバリヤーの上方でのTR
AP反応溶液50μｌの添加によって行われる。該反応溶液
は、20mMトリス−HCl（pH8.3）、1.5mM MgCl2、63mM KC
l、0.005％トゥイーン20、1mM EGTA、各50μM dNTP、TS
オリゴヌクレオチド0.1μｇ、0.5mM T4遺伝子32タンパ
ク、0.1mg/ml BSA、Taq DNAポリメラーゼ２ユニット
（所望により、クローンテック（Clontech）から入手し
た同量のTaqStartTM抗体で処理したTaq2ユニットを用い
て、ホットスタートPCRを行ってもよい）、およびCHAPS
細胞抽出物１−２μｌを含有した。生成物の放射性標識
のために、該反応物に10μCi/μl32P−dGTPおよび／ま
たは32P−dCTP（3000Ci/mmol）0.2〜0.4μｌを添加し
た。テロメラーゼによるオリグヌクレオチドTSの伸長の
ために20℃で10分後、該管をサーマルサイクラー（96ウ
エルSingleblockTMシステム、エリコンプ（Ericomp））
に移して、各サイクルのインキュベーション温度および
時間が94℃で30秒間、50℃で30秒間、および72℃で30秒
〜1.5分間であるサイクルを27サイクル行った。ワック
スバリヤーが〜70℃で溶融すると、CXプライマー（0.1
μｇ）が遊離された。当業者は、この実施例に記載した
反応時間、温度、および緩衝液が実施者の要求、用いた
特定の基質およびプライマー、ならびに抽出物およびDN
Aポリメラーゼの供給源によって変わり得ることを認識
しているであろう。
例えば、テロメラーゼ伸長反応は、テロメラーゼの供
給源に依存して、約10〜約42℃の範囲の温度で行うこと
ができる。テロメラーゼ反応時間は、用いたプライマー
伸長工程の数、試料中にあることが予想されるテロメラ
ーゼの量、および実施者に利用可能な時間に依存して、
非常に広範囲に変わり得る。典型的には、テロメラーゼ
反応時間は、５〜60分であるが、この時間は、数時間ま
でであってもよい。同様に、PCRサイクルは、幅広く変
わるサイクル時間および温度からなってもよい。最も簡
単なPCRサイクルは、二本鎖核酸変性工程、続く、プラ
イマーアニーリングおよび伸長工程からなる。変性は、
典型的には、反応混合物を加熱することによって行われ
るが、ヘリカーゼ処理などの他の方法を用いることがで
き、該加熱方法自体は、広範囲の温度で、DNAを損傷さ
せないが変性させるのに充分な時間行うことができる。
同様に、プライマーアニーリングの時間および温度は、
反応緩衝液およびプライマー配列、濃度、および組成、
ならびに実施者によって必要とされる特異性に非常に大
きく依存し、一方、プライマー伸長工程の時間および温
度は、用いたDNAポリメラーゼのタイプに非常に大きく
依存する。当業者は、本発明が時間、温度、緩衝液のバ
リエーションならびに該方法で用いることができる他の
反応成分によって限定されないと認識し理解するであろ
う。
試料の分析のため、反応混合物の半分を、15％ポリア
クリルアミド非変性ゲル上で、0.5X TBE中、電気詠動に
付すことによって分析した。生成物の視覚化は、ゲルの
臭化エチジウム染色、銀染色、オートラジオグラフィ
ー、またはPhosphorimagerTM分析［モレキュラー・ダイ
ナミックス、カリフォルニア州サニーベイル］によるも
のであった。この実施例に記載のアッセイの第１のセッ
トの結果を第１図Ｄに示す。アッセイのこのセットは、
テロメラーゼ活性のためのTRAPアッセイの特異性を試験
するように設計した。
第１図Ｄのレーン１は、TSオリゴヌクレオチドを省略
した対照試料を含有する；レーン２は、細胞抽出物を省
略した対照試料を含有する；レーン３は、不死化293細
胞抽出物のTRAPアッセイ試料を含有する；レーン４は、
65℃で10分間インキュベートすることにより前処理して
テロメラーゼを加熱不活化した293抽出物の試料を含有
する；レーン５は、25℃で、RNase（DNase不含、ベーリ
ンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim））と一緒
に10分間インキュベートすることにより前処理してテロ
メラーゼのRNA成分を破壊した293抽出物の試料を含有す
る；レーン６は、フェノール抽出293抽出物の試料（同
量のフェノール：クロロホロム混合物（1:1）中で混合
し、30秒間撹拌し、遠心分離して相を分離させ、水性相
を回収することによる）を含有する；レーン７は、抽出
物（50μｌ）をブロメラインプロテアーゼ［ベーリンガ
ー・マンハイム］５μｇと一緒に37℃で10分間インキュ
ベートすることによってプロテアーゼで前処理し、同量
の担体固定化α２−マクログロブリン［ベーリンガー・
マンハイム］と一緒に25℃で30分間撹拌しつつインキュ
ベートし、次いで、10,000Xgで10分間遠心分離し（α２
−マクログロブリン／ブロメライン複合物をペレット化
する）、分析のために上清を回収することによってブロ
メラインプロテアーゼを除去した293抽出物の試料を含
有する；レーン８は、テロメラーゼ活性を欠いているべ
きである正常な線維芽細胞BJ細胞抽出物を含有する；レ
ーン９は、DEAEクロマトグラフィー［モリン、1991、ネ
イチャ（Nature）353:454−456］によってテロメラーゼ
を富化した細胞抽出物を含有する。
第１図Ｄに示すように、これらの多重対照実験の結果
は、TRAPアッセイにおける陽性シグナルが、TSオリゴヌ
クレオチドを２個以上の５′−TTAGGG−３′繰返しで伸
長させる能力を有する不死化細胞抽出物においてリボ核
タンパクを必要とすることを示し、テロメラーゼ活性の
特異的検出のためのアッセイを確認する。
TRAPアッセイの感度をより厳密に試験するために、ア
ッセイのもう１つのセットを行って、用いた条件下で洗
浄剤抽出およびTRAP検出の限界を試験した。種々の個数
の細胞の抽出のために、溶解緩衝液の量を100μｌで一
定に維持した。これらのアッセイの結果を第１図Ｅに示
す。レーン１は、107個の正常線維芽細胞BJ細胞の抽出
物からの約105個の細胞等価物をアッセイした結果を示
す；バンドのラダーの不在によって示されるように、活
性は観察されなかった。レーン２は、106個の不死化293
細胞の抽出物からの約104個の細胞等価物をアッセイし
た結果を示す；テロメラーゼ活性は観察された。レーン
３は、105個の293細胞の抽出物からの約103個の細胞等
価物をアッセイした結果を示す；テロメラーゼ活性は観
察された。レーン４は、104個の293細胞の抽出物からの
約102個の細胞等価物をアッセイした結果を示す；テロ
メラーゼ活性は観察された。レーン５は、103個の293細
胞の抽出物からの約10個の細胞等価物をアッセイした結
果を示す；活性は観察されなかった。レーン６は、溶解
緩衝液のみを有する対照をアッセイした結果を示す；活
性は観察されなかった。
106個の293細胞からの抽出物の連続希釈のTRAPアッセ
イによって、102個の細胞におけるテロメラーゼ検出の
限界を確認した。この限界は、用いたTRAPアッセイ条件
の関数であり、現行法の感度の絶対的限界よりもむしろ
所定の条件下での実施限界を考慮すべきである。また、
例えば、CXの代わりにプライマーCTR3［５′−CCCTAA−
３′）３］またはCTR4［（５′−CCCTAA−３′）４］の
使用は、感度を増大させるが、これらのプライマーは、
非伸長TSプライマーと相互に作用すると思われる。感度
の限界は、合成テロメラーゼ産生物TS＋４（ロリゴヌク
レオチドTSに続いて４個のテロメア繰返しを含有する）
の滴定によっても分析された。TS＋４オリゴヌクレオチ
ドの希釈物を熱処理（テロメラーゼ不活化）293抽出物
と混合し、TRAPアッセイで分析した。この分析におい
て、該アッセイは、TS＋４の106個の分子からの明らか
な陽性シグナルを与えた。さらに、慣用アッセイによる
マウステロメラーゼがほとんど非プロセッシブであるこ
とを示す場合でさえ［すなわち、単一の繰返しだけを付
加する；プロウズ（Prowse）ら、1993、プロシーディン
グズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）9
0:1493−1497］、マウス組織（テロメラーゼ活性は、マ
ウスの体細胞中に存在する）および細胞抽出物からのテ
ロメラーゼ活性は、TRAPアッセイによって検出された。
これは、TRAPアッセイが、慣用アッセイによって視覚化
することができない非常に低レベルのプロセッシブマウ
ステロメラーゼ活性を検出することを示す。
実施者の便宜のため、以下の産生情報が提供される。
反応管は、ロビンズ・サイエンティフィック（Robbins
Scientific）（カリフォルニア州サニーベイル）からの
0.2mlのStrip−easeTM管であり、使用前にオートクレー
ブ処理した。全てのオリゴデオキシリボヌクレオチド
は、キーストーン・ラボラトリー（Keystone Laborator
y）（カリフォルニア州メンロ・パーク）から入手した
超高純度であり［HPLC精製した］、1mg/mlの濃度でDEPC
処理H2Oに懸濁させた。TaqDNAポリメラーゼ、トゥイー
ン20、およびT4遺伝子32タンパクは、ベーリンガー・マ
ンハイムから購入した。放射性同位体は、エヌイーエヌ
−デュポン（NEN−Dupont）から購入した。dNTPは、フ
ァルマシア（Pharmacia）から購入し、アリコットに分
け、−20℃で貯蔵し、使用前に解凍した（２回以下）。
全ての他の反応成分は、分子生物学用であり、特記しな
い限り、シグマ（Sigma）から購入した。ジエチルピロ
カルボネート（DEPC）処理し、脱イオン化し、滅菌した
H2Oを慣用的に用いた。
実施例３ TRAPおよび慣用テロメラーゼアッセイの相対的な感度−
−正常な体細胞および不死化細胞におけるテロメラーゼ
活性のアッセイ この実施例は、不死化細胞系および正常な体細胞培養
物の細胞試料について行ったテロメラーゼアッセイを記
載する。BJ細胞などの粘着細胞培養物、ヒト皮膚線維芽
細胞の正常の体細胞培養物は、抽出物調製前に集密度80
％まで増殖した。該アッセイ（反応当たり105個の細胞
等価物）は、前記実施例１および２の記載に従って行
い、アッセイの結果を第２図ＡおよびＢならびに下記第
１表に示す。TRAPアッセイの結果を第２図Ａに示す；慣
用アッセイの結果を第２図Ｂに示す。アッセイは、CHAP
S洗浄剤溶解法（前記実施例１および２を参照）を用い
て調製した同一の10個の細胞抽出物について行った。
第２図Ａにおいて、偶数レーンは、試料中のテロメラ
ーゼ活性を除去すべきであるRNaseで前処理した抽出物
についての結果を示す。レーン１および２は、乳癌系MC
F−7/ADR−RESについての結果を示す；レーン３および
４は、膵臓癌系AsPC−１についての結果を示す；レーン
５および６は、前立腺癌系PC−３についての結果を示
す；レーン７および８は、黒色腫系M14についての結果
を示す；レーン９および10は、正常包皮線維芽細胞培養
BJについての結果を示す；レーン11および12は、肺癌系
NCI−H23についての結果を示す；レーン13および14は、
正常間質線維芽細胞培養31YOについての結果を示す；レ
ーン15および16は、正常肺線維芽細胞培養IMR−90につ
いての結果を示す；レーン17および18は、卵巣癌系OVCA
R−３についての結果を示す；レーン19および20は、結
腸癌系COLO205についての結果を示す；レーン21および2
2は、不死化腎臓細胞系293についての結果を示す。第２
図Ｂには、慣用アッセイについての結果（反応当たり10
6個の細胞等価物）を示す。レーン１は、不死化細胞系2
93についての結果を示す；レーン２は、RNase前処理293
についての結果を示す；レーン３−12は、第２図Ａにお
ける奇数レーン１−19と同じである。
いくつかの不死化細胞系（293、MCF−7/ADR−RES、NC
I−H23、OVCAR−３、COLO205、M14）は、両方のアッセ
イで活性を示し、その他（AsPC−１およびPC−３）は、
TRAPアッセイでのみ活性を示し、正常体細胞培養物（B
J、IMR−90および31YO）は、いずれのアッセイによって
も検出可能な活性を示さない。これらの結果は、TRAP法
が慣用アッセイによって陰性を試験する抽出物における
テロメラーゼ活性を検出することができることを示す。
この測定は、18種類の組織からの74個の不死化細胞系
および22個の正常体細胞培養物の合計を含むように膨ら
ませられ、結果を以下の第１表にまとめて示す。各分裂
細胞培養物を洗浄剤抽出し、TRAPアッセイを用いてテロ
メラーゼ活性について試験した。特異的な不死化細胞系
および正常体細胞培養物は、起源の組織によって記載さ
れる。試験した不死化細胞系および正常体細胞培養物
は、以下のものであった：（１）皮膚−−黒色腫（LOXI
MVI、M14、Malme−3M、UACC−62）、正常線維芽細胞（G
FS、S37b、Malmep3、BJ）、正常ケラチノサイト（１
包皮；）（２）結合組織−−線維肉腫（HT−1080）；
（３）脂肪−−脂肪肉腫（SW872）；（４）乳房−−腺
癌（MCF7、MCF−7/ADR−RES、MDA−MB−231）、腺管癌
（T 47 D、MDA−MB−435）、癌（MDA−MB−157、MDA−M
B−175−VI、MDA−MB−436、MDA−MB−468、ZR−75−
１、ZR−75−30、UACC−812、UACC−893、BT−20、BT−
474、BT−483、BT−549、HS578T、SK−BR−３、SCC70、
SCC38、SCC202）、正常上皮および体細胞（HME:15、1
7、31、32、35）；（５）肺−−癌（MCI−H522、NCI−H
23、A549、EKVK、1299、H146、H69、NCI−H460、H358、
H182）、形質転換したSV40T抗原（IDH4、SW26−IG、SW
−26−C4）、正常胎児線維芽細胞（GFL、IMR−90、Wi3
8）；（６）胃−−胃癌（KATO−III）；（７）膵臓−−
腺管癌（SU.86.86）、腺癌（AsPC−１、Capan−１）；
（８）卵巣−−癌（OVCAR−３、OVCAR−５、IGROV−
１）、腺癌（OVCAR−８）；（９）頚−−癌（HeLa S3、
Ｃ−33 A、HT−３）、正常１ 上皮細胞；（10）子宮−
−正常な１子宮内膜細胞；（11）腎臓−−癌（A498、CA
KI−１）、Ad5−形質転換胚体腎臓細胞（293）；（12）
膵胱−−癌（5637）、移行上皮癌（T24）、扁平上皮癌
（SCaBER）、正常胎児（FHs 738B1）；（13）結腸−−
腺癌（COLO205、SW−620、HCT−116）；（14）前立腺−
腺癌（PC−３、DU145）、SV40形質転換BPH線維芽細胞
（BPH−１）、正常間質線維芽細胞（31YO）、BPH線維芽
細胞（S52）；（15）CNS−−癌（U251、SNB−75）、神
経膠芽細胞腫（SF268）；（16）血液−−白血病（Molt
4、HEL）、Ｔ−細胞白血病（ジャーカット）、急性前骨
髄球性白血病（HL−60）、慢性骨髄性白血病（Ｋ−56
2）、細網肉腫（Ｕ−937）；（17）網膜−−SV40形質転
換色素上皮（AGO6096A）；および（18）関節：正常な滑
膜線維芽細胞（HSF）。
正常体細胞培養物のうち、TRAPアッセイにおいて検出
可能なテロメラーゼ活性を示すものはなかった。74個の
不死化細胞系のうち68個は、腫瘍誘導系であり、６個
は、腫瘍タンパク（oncoprotein）で形質転換された細
胞系であった。68個の腫瘍系の全ては、テロメラーゼ活
性を含有していた。６個の形質転換系のうち２個は、テ
ロメラーゼ活性について陰性を試験した。これらの２つ
の系が不死化である場合、検出可能なテロメラーゼ活性
の欠失は、予想外である。しかしながら、これらの系に
おけるテロメア長さの研究は、テロメアが、系を誘導し
た正常体細胞のものよりも長かったことを示した。これ
は、該細胞がテロメラーゼ活性の瞬間的なバーストを経
験したことを示す。テロメラーゼ活性が再び起こらない
場合、該細胞は、無期限には複製しないであろう。
実施例４ テロメア繰返し増幅プロトコール（TRAP）のための標準
的な操作方法 この実施例は、５つの部分；（Ａ）ワークステーショ
ン装備；（Ｂ）プレコーション；（Ｃ）微量抽出；
（Ｄ）定量化アッセイ；および（Ｅ）分析における本発
明のTRAPアッセイを行うための段階的なプロトコールを
提供する。記載された方法は、活性の定量化分析のため
に準備し、多くの推奨がなされるが、当業者は、用いた
条件および望まれる結果の性質に依存して、全ての情況
において全ての推奨に従う必要は全くない。
A.ワークステーション装備 TRAPアッセイの装備における重要な因子は、最初の反
応混合物がPCR工程前に調製される環境である。理想的
な環境は、各々、間違った陰性および陽性の結果を生じ
得るリボヌクレアーゼおよびPCR増幅DNA生成物の汚染を
含まない。主なPCR産生物（およびRNase）汚染源は、実
験を行う人であり、高い標準の個人衛生を維持し、PCR
産生物を開放する際もしくはピペットで移す際、または
PCR産生物の電気泳動後にゲル緩衝液を処分する際にPCR
産生物のエアゾールの発生を回避すべきである。試料を
超えて研究者に向かって濾過空気を送風するポジティブ
空気置換フード（positive air displacement hood）が
理想的である。分離溶液、ピペット、管、およびチップ
は、常に、フードの内側で用い、保持すべきである。作
業空間は、反応のセットアップ前に10％ブリーチで拭く
べきであり、該フードは、使用しない場合には、慣用的
に、UV照射すべきである。ピペットのバレルもまた、エ
アロゾル耐性チップを用いる場合でさえ、10％ブリーチ
中に定期的に浸漬すべきである。研究者は、グローブお
よび弾性リストストラップを有する使い捨て実験コート
を身につけるべきである；該実験コートは、定期的に変
えるべきである。
TRAP反応をセットアップするための専用作業空間は、
標準的なカビィホール型デスク上に、VWRからの45.7cm
（Ｌ）×30.5cm（Ｗ）×61cm（Ｈ）サイズのアクリル製
シールド（カタログ番号＃56615−848）を置くことによ
って作製することができる。該テスクの上部は、厚板ま
たは重い布によって覆われ、前面は、該シールドによっ
てブロックされている。この配置は、保温隙間を作り出
し、この場合、汚染物質が外部から作業空間中へ入るの
を防ぎ、該試料は、研究者から物理的に遮断される。全
ての溶液、ピペット、チップおよび管は、ステーション
の内側に維持され、作業空間は、慣用的に、該ステーシ
ョンの上部に設置した短波UVランプによってUV照射され
る［ブラック・レイ・ユーブイ・ランプ（Black Ray UV
lamp）、XX−15S、VWRカタログ番号＃36575−059］。
（Ｂ）プレコーション 前記のように、および、TRAPアッセイがPCR増殖およ
びリボ核タンパク（テロメラーゼ）のイン・ヒドロ活性
の使用の両方を取り入れているので、共に該アッセイに
不利益となり得るPCR産生物汚染（DNA）およびRNase汚
染を防止するように厳重な注意が必要である。テロメラ
ーゼ抽出およびPCR増幅工程を含むアッセイプロトコー
ルの全ての工程において以下の基本的なプレコーション
を行い、問題を回避することができる：（１）全ての溶
液についてDEPC処理H2Oを使用し、使用前に少量の溶液
をアリコートに分取する；（２）該アッセイ溶液（PCR
緩衝液、CHAPS抽出緩衝液、dNTP、Taqポリメラーゼな
ど）を実験室中の他の試薬から分離させておく；（３）
グローブを身につける；（４）アッセイのためにピペッ
ターおよびエアゾール耐性チップ（ART）の専用セット
を使用する；および（５）該試料を調製すると同一の空
間中で増幅試料を分析しない（すなわち、アッセイ試薬
およびピペット／チップが置かれている同一のベンチ上
でのPCR増幅後にPCR管を開放しない；代わりに、PCRベ
ンチから離れた位置で他のピペッター（所望により、AR
Tを有しない）を使用する）。
（Ｃ）微量抽出 微量抽出工程で用いる溶解緩衝液についての物質要求
条件を以下に示す。
溶解緩衝液（0.5％CHAPS＊またはCHAPSO＊） ＊CHAPSまたはCHAPSO洗浄剤は、溶解緩衝液の使用直
前に添加すべきである。さらに、抽出工程を行う直前
に、溶解緩衝液1mlに0.1M PMSF（１μｌ）およびβ−メ
ルカプトエタノール（0.35μｌ）を添加すべきである。
微量抽出工程は、以下の工程を含む： 1.細胞計数を確立させ、該細胞をペレット化させ、該細
胞をPBS（CaおよびMgを含まない）中で２回洗浄し、再
ペレット化し、PBSを除去する。
2.洗浄緩衝液に細胞を懸濁させ、該細胞を再ペレット化
する。
3.洗浄緩衝液を除去し、細胞106−104個当たり溶解緩衝
液20μｌ（適用に依存する）に細胞ペレットを再懸濁さ
せる。
4.氷上で30分間細胞をインキュベートする。
5.4℃で20分間、10000Xgでマイクロセントリフュージ
［エッペンドルフ（Eppendorf）］中で細胞を回転させ
る。
6.別の管の抽出物を取り出し、TRAPアッセイ当たり１〜
２μｌを用いる；所望により、ドライアイス上で残存物
を急速冷凍し、−70℃で貯蔵することができる。
（Ｄ）定量アッセイ 当該アッセイのために以下の物質を推奨する:TRAPワ
ックスバリヤー反応管;ACTプライマー（５′−GCGCGG
［CTAACC］３−３′、100ng/管）;2.5mM dNTP［ファル
マシア（Pnarmacia）］；末端標準TSプライマー（M2、
0.1mg/ml）;Taqポリメラーゼ［ベーリンガー・マンハイ
ム］；および10X TRAP緩衝液。
10X TRAP緩衝液 成分 5mlについて 200mMトリス−HCl、pH8.3 1ml（1Mトリス−Cl、pH8.3） 15mM MgCl2 75μｌ（1M MgCl2） 630mM KCl 3.15ml（1M KCl） 0.05％トゥイーン20 25μｌ［ヘーリンガー・マンハイ
ム］ 10mM EGTA 500μｌ（0.1M EGTA） 1mg/ml BSA 250μｌ（20mg/ml） ACT−IC0.77〜1.54pg（５〜10amol/50μｌ反応混合物） ACT−ICは、特に、M2（TS）テロメラーゼ基質（およ
びPCRプライマー）およびACTプライマーについて設計さ
れた配列:5′−AATCCGTCGAGCAGAGTTAGCCCGGTTAGGGTTAGG
GTTAGCCGCGC−３′の内部対照オリゴヌクレオチドであ
る。アンカー配列と相補的な配列の存在が任意であるこ
と、内部対照中に存在するこの配列を有しないのが望ま
しい場合があることに注意すべきである。このオリゴヌ
クレオチド内部対照の存在（ACT−ICの最終量は、TRAP
反応50μｌ当たり５〜10amol［10-3fmol］であろう）
は、RNase処理または非抽出物対照に関係なく、TRAPア
ッセイの第１および第２産生物の間にゲル上にバンドと
して出現する特異的なPCR増幅産生物を生じる。この内
部対照バンドを用いて、種々の試料からのPCR増幅を標
準化し、末端標識TSオリゴヌクレオチド基質／プライマ
ーと合わせて用いた場合に生じたテロメラーゼ産生物の
数を算出することができる（以下の分析を参照）。
反応混合物を調製するために、以下の物質を、ワック
スバリヤー下に乾燥ACTプライマー0.1μｇを含有するTR
AP反応管中で混合する。物質 合計容量50μｌについて 10X TRAP緩衝液 ５μｌ 2.5mM dNTP［ファルマシア］ １μｌ ＊ プライマー（0.1mg/ml TS） １μｌ Taq［ベーリンガー・マンハイム］ 0.4μｌ（２ユニッ
ト） テロメラーゼ抽出物 ２μｌ H2O 40.6μｌ ＊定量的TRAPアッセイについて、用いられる特定の検
出および定量化系に依存して、TS基質／プライマーを、
例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［32P］
−ガンマ−ATPで、または、５′−ビオチン、ジゴキシ
ゲニン、フルオレセインまたは別のフルオロフォアなど
の他の試薬で末端標識することができる。
任意成分としては、T4遺伝子32タンパク（5mg/ml、ヘ
ーリンガー・マンハイムから入手可能）0.2μｌおよびT
aqStartTM抗体（クローンテック（Clontech）から入手
可能）0.4μｌが挙げられる。当該反応は、以下の工程
に従って行われる： 1.室温（20℃）で10分間、反応混合物をインキュベート
する； 2.以下の温度で所定の時間:94℃/30秒、60℃/30秒、お
よび72℃/30秒、反応混合物をインキュベートして、PCR
を行い；この３工程サイクルを20〜30回、好ましくは27
回繰り返す； 3.ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを
含有する充填染料を添加し、ブロモフェノールブルーが
ゲルを流し出すまで、試料を0.6X TBE中に10〜15％非変
性PAGEに付す（ベーリンガー・マンハイムからの分子マ
ーカーＶは、このゲルについての良好なDNAマーカーで
ある）； 4.例えば、PhoshorimagerTMスクリーン（放射性標識の
ため）または他の適当の検出手段によって産生物形成を
観察する。
（Ｅ）分析 前記に概略記載したプロトコールを用い、内部対照を
テロメラーゼ基質抽出産生物と同一の効率で増幅させる
と仮定し、式（Ｔ＝レーン当たりの合計数）：［（T TR
AP産生物−T ACT−IC）/T ACT−IC）×（添加したACT−
ICの分子数） に従って、所定の反応で生じたテロメラーゼ分子の数を
評価することができる。得られた数は、所定のインキュ
ーベーション時間（通常、10分）に生じたテロメラーゼ
産生物の分子の数である。この計算は、TS基質が末端標
識された場合にのみ有効であり、（ACTプライマーおよ
び内部対照が用いられる場合でさえ）放射性dNTPの直接
組込みが検出のために用いられるTRAPプロトコールに適
用されない。これらの条件は、試料間のPCR増幅で起こ
り得る変化について考慮し、そこで、標準的な測定法を
提供する。
抽出物が非常に高レベルのテロメラーゼ活性を有する
場合、ACT−ICからのシグナルは、検出をするのがより
困難になり得る。というのは、この方法は、テロメラー
ゼ産生物と内部対照とが共に同一プライマーについて競
争する「競合PCR」に関係するからである。すなわち、
該プライマーは、正確に言うと、定量分析のための鋳型
よりも過剰に存在すべきである。したがって、試料が非
常に高レベルのテロメラーゼ活性を有する場合、PCRプ
ライマーが制限されないように抽出物を希釈することが
できる。別法として、既知量で該反応混合物にいずれの
配列の対照核酸を添加することもでき、該対照を、伸長
テロメラーゼ基質を増幅するために用いられたものと異
なるプライマーで増幅させることができる。対照オリゴ
ヌクレオチドを増幅するために用いられる対照オリゴヌ
クレオチドおよび／またはプライマーを、テロメラーゼ
伸長産生物を標識化するために用いられた標識と同一に
または該標識とは異なって標識することができる。
前記実施例は、本発明の種々の態様および本発明が実
施され得る方法を記載している。該実施例は、本発明の
多くの異なる具体例の完全な記載を提供するものではな
い。前記の全ての刊行物および特許出願は、出典明示に
より本明細書の一部とする。かくして、前記発明は、理
解の明瞭さのために説明および実施例により多少詳細に
記載されるが、ある種の変化および変更が以下の請求の
範囲の精神または範囲から逸脱せずに行われることは、
本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかであろ
う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ２５５，７７４ (32)優先日 1994年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ３１５，２１４ (32)優先日 1994年９月28日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 早期審査対象出願 (72)発明者 ワインリッチ，スコット・ローレンス アメリカ合衆国94123カリフォルニア州、 サンフランシスコ、ゴーフ・ナンバー ５・2929番

Claims (98)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞試料がテロメラーゼ活性を含有するか
    の判定方法であって、 （ａ）細胞試料から細胞抽出物を調製し； （ｂ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基
    質、およびテロメア繰返し配列の付加によってテロメラ
    ーゼがテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができる
    緩衝液からなる反応混合物中に細胞抽出物のアリコット
    を入れ； （ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する
    場合にテロメア繰返しと充分に相補的な配列からなるプ
    ライマーが該伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズ
    し、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的コピーを
    形成するような条件下、該反応混合物に該プライマーを
    添加して、それに特異的にハイブリダイズさせ；次い
    で、 （ｄ）伸長プライマーと結合した伸長テロメラーゼ基質
    からなる二本鎖DNA分子が存在する細胞試料におけるテ
    ロメラーゼ活性の存在と、二本鎖DNA分子が存在しない
    細胞試料におけるテロメラーゼ活性の不在との相互関係
    を示す；工程からなることを特徴とする、細胞試料がテ
    ロメラーゼ活性を含有するかの判定方法。
  2. 【請求項２】工程（ｃ）が、さらに、 （１）反応混合物を加熱して、二本鎖DNA分子を変性さ
    せ；次いで、 （２）相補的核酸がハイブリダイズすることができ、か
    つ、伸長テロメラーゼ基質が存在する場合にプライマー
    が伸長することができる温度に該反応混合物を冷却する
    工程を含む請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】加熱および冷却工程が少なくとも５回繰り
    返され、該プライマーが各冷却工程の間に伸長プライマ
    ーの形成のために充分な量で存在する請求項２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】鋳型依存性DNAポリメラーゼが反応混合物
    中に存在し、プライマーが、DNAポリメラーゼにより、
    ヌクレオチドのプライマーへの付加によって伸長される
    請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】鋳型依存性DNAリガーゼが反応混合物中に
    存在し、プライマーが、DNAリガーゼにより、オリゴヌ
    クレオチドリゴマーのプライマーへの結合によって伸長
    される請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】熱安定性鋳型依存性DNAポリメラーゼが反
    応混合物中に存在し、プライマーが、DNAポリメラーゼ
    により、ヌクレオチドのプライマーへの付加によって伸
    長される請求項２または３記載の方法。
  7. 【請求項７】熱安定性鋳型依存性DNAリガーゼが反応混
    合物中に存在し、プライマーが、DNAリガーゼにより、
    オリゴヌクレオチドリゴマーのプライマーへの結合によ
    って伸長される請求項３記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞抽出物が非イオンまたは両性イオン洗
    浄剤からなる緩衝液中で細胞試料中の細胞を溶解させる
    ことによって調製される請求項３記載の方法。
  9. 【請求項９】細胞試料がヒトの細胞試料である請求項３
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】プライマーが、最初に、ワックスバリヤ
    ーによって細胞抽出物と分離されており、次いで、反応
    混合物が加熱されて、該ワックスバリヤーが溶融され、
    該プライマーが反応混合物に添加される請求項２、３ま
    たは６記載の方法。
  11. 【請求項１１】反応混合物が標識テロメラーゼ基質を含
    有する請求項２、３、６または10記載の方法。
  12. 【請求項１２】反応混合物が標識プライマーを含有する
    請求項２、３、６、10または11記載の方法。
  13. 【請求項１３】反応混合物が標識または非標識のヌクレ
    オチド三リン酸を含有する請求項２、３、６、10、11ま
    たは12記載の方法。
  14. 【請求項１４】標識が蛍光性原子、放射性原子、リン光
    性原子およびケミルミネッセンス標識からなる群から選
    択される請求項11、12または13記載の方法。
  15. 【請求項１５】標識がビオチン、エピトープおよび抗原
    からなる群から選択される請求項11、12または13記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】テロメラーゼ基質およびプライマーが、
    プライマー伸長工程の間に該基質と該プライマーとの二
    量体を形成するような結合を実質的に行わない配列を有
    する請求項６記載の方法。
  17. 【請求項１７】プライマーが該プライマーの５′−末端
    で非テロメア繰返し配列を有する請求項６記載の方法。
  18. 【請求項１８】プライマーが少なくとも２個のテロメア
    繰返し配列を有する請求項６記載の方法。
  19. 【請求項１９】テロメア繰返し配列を欠いているテロメ
    ラーゼ基質がオリゴヌクレオチドTSである請求項２、
    ３、６、10、11、12または13記載の方法。
  20. 【請求項２０】プライマーがCXである請求項２、３、
    ６、10、11、12、13または19記載の方法。
  21. 【請求項２１】テロメラーゼ活性測定用試薬であって、 （ａ）試験すべきテロメラーゼの起源に依存するテロメ
    ア繰返し配列を欠いている標識または非標識テロメラー
    ゼ基質；および （ｂ）テロメア繰返し配列に充分に相補的な配列からな
    る標識または非標識プライマーからなる、テロメラーゼ
    活性測定用試薬。
  22. 【請求項２２】ワックスバリアーを含有する請求項21記
    載の試薬。
  23. 【請求項２３】標識または非標識のヌクレオチド三リン
    酸を含有する請求項21または22記載の試薬。
  24. 【請求項２４】DNAポリメラーゼを含有する請求項21、2
    2または23記載の試薬。
  25. 【請求項２５】試験すべきテロメラーゼの起源に依存す
    るテロメア繰返し配列がヒトテロメア繰返し配列である
    請求項21記載の試薬。
  26. 【請求項２６】ヒトテロメア繰返し配列が５′−TTAGGG
    −３′である請求項25記載の試薬。
  27. 【請求項２７】細胞試料がテロメラーゼ活性を含有する
    かの判定方法であって、 （ａ）細胞試料から細胞抽出物を調製し： （ｂ）試験すべきテロメラーゼの起源に依存するテロメ
    ア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基質、およびテ
    ロメア繰返し配列の付加によってテロメラーゼがテロメ
    ラーゼ基質の伸長を触媒することができる緩衝液からな
    る反応混合物中に細胞抽出物のアリコットを入れ； （ｃ）伸長テロメラーゼ基質が反応混合物中に存在する
    場合にテロメア繰返しと充分に相補的な配列からなるプ
    ライマーが該伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズ
    し、伸長して、伸長テロメラーゼ基質の相補的コピーを
    形成するような条件下、該反応混合物に該プライマーを
    添加して、それに特異的にハイブリダイズさせ；次い
    で、 （ｄ）伸長プライマーと結合した伸長テロメラーゼ基質
    からなる二本鎖DNA分子が存在する細胞試料におけるテ
    ロメラーゼ活性の存在と、二本鎖DNA分子が存在しない
    細胞試料におけるテロメラーゼ活性の不在との相互関係
    を示す；工程からなることを特徴とする、細胞試料がテ
    ロメラーゼ活性を含有するかの判定方法。
  28. 【請求項２８】細胞試料がヒト由来の細胞試料であっ
    て、試験すべきテロメラーゼの起源がヒトテロメラーゼ
    である請求項27記載の方法。
  29. 【請求項２９】試験すべきテロメラーゼの起源に依存す
    るテロメア繰返し配列が５′−TTAGGG−３′である請求
    項28記載の方法。
  30. 【請求項３０】テロメラーゼ基質の配列が５′−TTGGGG
    −３′からなる請求項28記載の方法。
  31. 【請求項３１】細胞試料が、医学的症状を有すると思わ
    れる個体から得られた細胞試料である請求項６記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】該症状が癌であって、試料におけるテロ
    メラーゼ活性の存在が癌の診断である請求項31記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】該症状が感染であって、試料におけるテ
    ロメラーゼ活性の存在がテロメラーゼ活性を示す原生動
    物または真菌類の感染因子の存在の診断である請求項31
    記載の方法。
  34. 【請求項３４】該症状が不妊であって、試料におけるテ
    ロメラーゼ活性の不在が不妊の診断である請求項31記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】該症状が不妊であって、試料におけるテ
    ロメラーゼ活性の存在が生殖能力の診断である請求項31
    記載の方法。
  36. 【請求項３６】細胞試料がテロメラーゼ活性を含むこと
    が知られていて、工程（ａ）の前またはその間に、細胞
    抽出物に化合物を添加してテロメラーゼ活性に対するそ
    の影響を判定する請求項６記載の方法。
  37. 【請求項３７】細胞試料がテロメラーゼ活性を含むこと
    が知られていて、細胞抽出物が精製テロメラーゼの供給
    源として調製される請求項６記載の方法。
  38. 【請求項３８】細胞試料が個体から得られ、テロメラー
    ゼ活性を測定してテロメラーゼ陽性細胞が試料中に存在
    するかの判定をする請求項６記載の方法。
  39. 【請求項３９】テロメラーゼ陽性細胞が始原細胞である
    請求項38記載の方法。
  40. 【請求項４０】テロメラーゼ陽性細胞が幹細胞である請
    求項38記載の方法。
  41. 【請求項４１】試料がテロメラーゼ活性を含有するかの
    判定方法であって、 （ａ）テロメア繰返し配列の付加によってテロメラーゼ
    が試験すべきテロメラーゼの起源に依存するテロメア繰
    返し配列を欠いているテロメラーゼ基質の伸長を触媒す
    ることができるような条件下、該テロメラーゼ基質を含
    む反応混合物中で試料をインキュベートし； （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって伸長テロメラーゼ
    基質を複製させ； （ｃ）複製された伸長テロメラーゼ基質が存在する試料
    におけるテロメラーゼ活性の存在と、複製された伸長テ
    ロメラーゼ基質が存在しない試料におけるテロメラーゼ
    活性の不在との相互関係を示す：工程からなることを特
    徴とする、試料がテロメラーゼ活性を含有するかの判定
    方法。
  42. 【請求項４２】試料が細胞試料である請求項41記載の方
    法。
  43. 【請求項４３】細胞試料が無傷細胞の試料であって、複
    製工程がイン・サイチュ（in situ）で行われる請求項4
    2記載の方法。
  44. 【請求項４４】無傷細胞が固定化細胞である請求項43記
    載の方法。
  45. 【請求項４５】試料が細胞抽出物である請求項41記載の
    方法。
  46. 【請求項４６】試料がテロメラーゼ活性を含有するかの
    判定方法であって、 （ａ）テロメア繰返し配列の付加によってテロメラーゼ
    がテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができるよう
    な条件下、該テロメラーゼ基質を含む反応混合物中で試
    料をインキュベートし； （ｂ）リガーゼ連鎖反応によって伸長テロメラーゼ基質
    を複製させ； （ｃ）複製された伸長テロメラーゼ基質が存在する試料
    におけるテロメラーゼ活性の存在と、複製された伸長テ
    ロメラーゼ基質が存在しない試料におけるテロメラーゼ
    活性の不在との相互関係を示す；工程からなることを特
    徴とする、試料がテロメラーゼ活性を含有するかの判定
    方法。
  47. 【請求項４７】試料が細胞試料である請求項46記載の方
    法。
  48. 【請求項４８】細胞試料が無傷細胞の試料であって、複
    製工程がイン・サイチュ（in situ）で行われる請求項4
    7記載の方法。
  49. 【請求項４９】無傷細胞が固定化細胞である請求項48記
    載の方法。
  50. 【請求項５０】試料が細胞抽出物である請求項46記載の
    方法。
  51. 【請求項５１】テロメラーゼ基質がテロメア繰返し配列
    を欠いており、複製工程が鋳型−依存性DNAポリメラー
    ゼと、反応混合物中に伸長テロメラーゼ基質が存在する
    場合に該伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズし、該
    DNAポリメラーゼによって伸長されて該伸長テロメラー
    ゼ基質の相補的コピーを形成するプライマーとを該反応
    混合物に添加することからなることを特徴とする請求項
    41記載の方法。
  52. 【請求項５２】試料中のテロメラーゼ活性の存在を判定
    するアッセイを行うためのキットであって、 （ａ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基
    質；および、 （ｂ）テロメア繰返しに相補的なオリゴヌクレオチド；
    および （ｃ）鋳型依存性DNAポリメラーゼ；を含むことを特徴
    とする、試料中のテロメラーゼ活性の存在を判定するア
    ッセイを行うためのキット。
  53. 【請求項５３】試料が細胞試料である請求項52記載のキ
    ット。
  54. 【請求項５４】試料が細胞抽出物である請求項52記載の
    キット。
  55. 【請求項５５】さらに、対照オリゴヌクレオチドを含む
    請求項53または54記載のキット。
  56. 【請求項５６】テロメラーゼ基質が配列５′−AATCCGTC
    GAGCAGAGTT−３′を含むオリゴヌクレオチドである請求
    項52記載のキット。
  57. 【請求項５７】オリゴヌクレオチドが配列５′−CCCTTA
    CCCTTACCCTTACCCTAA−３′を含むオリゴヌクレオチドプ
    ライマーである請求項52記載のキット。
  58. 【請求項５８】試料中のテロメラーゼ活性の存在を判定
    するアッセイを行うためのキットであって、 （ａ）テロメラーゼ基質； （ｂ）テロメア繰返しに相補的な２以上のオリゴヌクレ
    オチド；および （ｃ）DNAリガーゼ；を含むことを特徴とする、試料中
    のテロメラーゼ活性の存在を判定するアッセイを行うた
    めのキット。
  59. 【請求項５９】試料が細胞試料である請求項58記載のキ
    ット。
  60. 【請求項６０】試料が細胞抽出物である請求項58記載の
    キット。
  61. 【請求項６１】さらに、対照オリゴヌクレオチドを含む
    請求項59または60記載のキット。
  62. 【請求項６２】テロメラーゼ基質が配列５′−AATCCGTC
    GAGCAGAGTT−３′を含むオリゴヌクレオチドである請求
    項58記載のキット。
  63. 【請求項６３】試料中に存在するテロメラーゼ活性の量
    を定量化することができる請求項３記載の方法。
  64. 【請求項６４】さらに、内部対照からなる請求項63記載
    の方法。
  65. 【請求項６５】内部対照が、核酸増幅方法を用いて伸長
    テロメラーゼ基質およびその相補的コピーを増幅するこ
    とによって増幅した対照オリゴヌクレオチドからなる請
    求項64記載の方法。
  66. 【請求項６６】対照オリゴヌクレオチドが、５′から
    ３′の順序で、テロメラーゼ基質配列、伸長テロメラー
    ゼ基質またはその相補体の単一単位のテロメア繰返し配
    列の長さとは異なる長さを有するスペーサー配列、少な
    くとも１個のテロメア繰返しを含むテロメア繰返し配
    列、およびプライマーと実質的に相補的なヌクレオチド
    配列からなる請求項65記載の方法。
  67. 【請求項６７】プライマーおよびリゴマーが、最初に、
    ワックスバリアーによって細胞抽出物と分離されてお
    り、次いで、反応混合物が加熱されて、該ワックスバリ
    ヤーが溶融され、該プライマーが反応混合物に添加され
    る請求項７記載の方法。
  68. 【請求項６８】プライマーがヌクレオチド配列５′−
    （CCCTTA）3CCCTAA−３′を有するCX、またはヌクレオ
    チド配列５′−GCGCGG（CTAACC）３−３′を有するACT
    である請求項２、３、６、10、11、12、13または19記載
    の方法。
  69. 【請求項６９】該症状が乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺
    癌、腎臓癌、卵巣癌および子宮頚癌からなる群から選択
    される癌である請求項31記載の方法。
  70. 【請求項７０】該症状が白血病である請求項31記載の方
    法。
  71. 【請求項７１】該症状が真核細胞病原によって引き起さ
    れる請求項31記載の方法。
  72. 【請求項７２】該個体がヒトである請求項31記載の方
    法。
  73. 【請求項７３】細胞内で高レベルのテロメラーゼ活性に
    関連する疾病の予後方法であって、請求項１記載の方法
    を行うことを特徴とする予後方法。
  74. 【請求項７４】テロメラーゼ活性を検出するためのキッ
    トであって、 （ａ）試験すべきテロメラーゼの起源に依存するテロメ
    ア繰返し配列を欠いている標識テロメラーゼ基質； （ｂ）テロメア繰返し配列に相補的な配列からなるプラ
    イマー； （ｃ）鋳型依存性DNAポリメラーゼ；および （ｄ）指示書：を含むことを特徴とする、テロメラーゼ
    活性を検出するためのキット。
  75. 【請求項７５】さらに、細胞溶解緩衝液およびアッセイ
    緩衝液を含む請求項74記載のキット。
  76. 【請求項７６】テロメラーゼ活性を検出するためのキッ
    トであって、 （ａ）標識テロメラーゼ基質； （ｂ）テロメア繰返し配列に相補的な配列からなるプラ
    イマー； （ｃ）DNAリガーゼ；および （ｄ）指示書：を含むことを特徴とする、テロメラーゼ
    活性を検出するためのキット。
  77. 【請求項７７】さらに、細胞溶解緩衝液およびアッセイ
    緩衝液を含む請求項76記載のキット。
  78. 【請求項７８】テロメラーゼ調節剤をスクリーニングす
    る方法であって、 （ａ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基
    質、潜在的なテロメラーゼ調節剤、およびテロメア繰返
    し配列の添加によってテロメラーゼがテロメラーゼ基質
    の伸長を触媒することができる緩衝液からなる反応混合
    物中でテロメラーゼをインキュベートし； （ｂ）伸長テロメラーゼ基質を複製させ；次いで、 （ｃ）潜在的なテロメラーゼ調節剤が反応混合物中に存
    在しない場合に対して、複製された伸長テロメラーゼ基
    質の量を測定することから判定されるごとき、テロメラ
    ーゼ調節剤の存在と反応混合物中のテロメラーゼ活性の
    レベルの変化との相互関係を示す；工程からなることを
    特徴とする、テロメラーゼ調節剤をスクリーニングする
    方法。
  79. 【請求項７９】テロメラーゼが細胞試料中に存在する請
    求項78記載の方法。
  80. 【請求項８０】テロメラーゼが細胞抽出物中に存在する
    請求項78記載の方法。
  81. 【請求項８１】テロメラーゼ調節剤がテロメラーゼの活
    性化剤または抑制解除剤であって、レベルの変化がテロ
    メラーゼ活性の上昇である請求項78記載の方法。
  82. 【請求項８２】テロメラーゼ調節剤がテロメラーゼの阻
    害剤または抑制剤であって、レベルの変化がテロメラー
    ゼ活性の低下である請求項78記載の方法。
  83. 【請求項８３】複製工程が、ポリメラーゼ連鎖反応から
    なる請求項78記載の方法。
  84. 【請求項８４】さらに、テロメア繰返し配列に相補的な
    標識プローブを含む請求項74または75記載のキット。
  85. 【請求項８５】プローブおよび／またはテロメラーゼ基
    質が、放射性標識、蛍光性標識、リン光性標識、色素産
    生物質、酵素、酵素基質、ビオチン、アビジンまたはジ
    ゴキシゲニンで標識されている請求項84記載のキット。
  86. 【請求項８６】さらに、テロメア繰返し配列に相補的な
    標識プローブを含む請求項76または77記載のキット。
  87. 【請求項８７】プローブおよび／またはテロメラーゼ基
    質が、放射性標識、蛍光性標識、リン光性標識、色素産
    生物質、酵素、酵素基質、ビオチン、アビジンまたはジ
    ゴキシゲニンで標識されている請求項86記載のキット。
  88. 【請求項８８】伸長テロメラーゼ基質の存在が、分枝鎖
    状DNAプローブを用いて検出される請求項83記載の方
    法。
  89. 【請求項８９】複製工程が、熱安定性鋳型依存性DNAリ
    ガーゼ、伸長テロメラーゼ基質にハイブリダイズするオ
    リゴヌクレオチドリゴマー、および伸長テロメラーゼ基
    質にハイブリダイズし、反応混合物中に伸長テロメラー
    ゼ基質が存在する場合にDNAリガーゼにより、オリゴヌ
    クレオチドリゴマーの当該プライマーへの結合によって
    伸長されるプライマーを反応混合物に添加することから
    なる請求項78記載の方法。
  90. 【請求項９０】リゴマーが、蛍光性標識、蛍光消光剤、
    放射性標識、シンチラントまたは酵素で標識されている
    請求項89記載の方法。
  91. 【請求項９１】テロメラーゼ基質が５′−AATCCGTCGAGC
    AGAGTT−３′である請求項74記載のキット。
  92. 【請求項９２】プライマーが、 ５′−CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA−３′；および ５′−GCGCGGCTAACCCTAACCCTAACC−３′から選択される
    請求項74記載のキット。
  93. 【請求項９３】さらに、プライマー伸長についてのオリ
    ゴヌクレオチド対照を含む請求項74記載のキット。
  94. 【請求項９４】対照オリゴヌクレオチドが、５′から
    ３′への順序で、テロメラーゼ基質配列、スペーサー配
    列、および少なくとも２コピーのテロメア繰返し配列を
    含む請求項93記載のキット。
  95. 【請求項９５】さらに、テロメラーゼの供給源としての
    細胞ペレットまたは細胞抽出物を含む請求項74記載のキ
    ット。
  96. 【請求項９６】テロメラーゼ基質が５′−AATCCGTCGAGC
    AGAGTT−３′である請求項76記載のキット。
  97. 【請求項９７】さらに、テロメラーゼの供給源としての
    細胞ペレットまたは細胞抽出物を含む請求項76記載のキ
    ット。
  98. 【請求項９８】試料中のテロメラーゼ活性の測定方法で
    あって、 （ａ）テロメア繰返し配列を欠いているテロメラーゼ基
    質、およびテロメア繰返し配列の付加によってテロメラ
    ーゼがテロメラーゼ基質の伸長を触媒することができる
    緩衝液を試料に添加し； （ｂ）伸長テロメラーゼ基質が工程（ａ）で形成した反
    応混合物中に存在する場合にテロメア繰返しと充分に相
    補的な配列からなるプライマーが該伸長テロメラーゼ基
    質にハイブリダイズし、伸長して、伸長テロメラーゼ基
    質の相補的コピーを形成するような条件下、該反応混合
    物に該プライマーを添加して、それに特異的にハイブリ
    ダイズさせ、それによって伸長プライマーと結合した伸
    長テロメラーゼ基質からなる分子を形成させ；次いで、 （ｃ）伸長プライマーと結合した伸長テロメラーゼ基質
    からなる分子が存在する試料におけるテロメラーゼ活性
    の存在と、該分子が存在しない試料におけるテロメラー
    ゼ活性の不在との相互関係を示す；工程からなることを
    特徴とする、試料中のテロメラーゼ活性の測定方法。
JP51399795A 1993-11-12 1994-11-10 テロメラーゼ活性アッセイ Expired - Lifetime JP2875394B2 (ja)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/151,477 US5830644A (en) 1992-05-13 1993-11-12 Method for screening for agents which increase telomerase activity in a cell
US08/153,051 1993-11-12
US08/151,477 1993-11-12
US08/153,051 US5645986A (en) 1992-05-13 1993-11-12 Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US08/255,774 US5989807A (en) 1992-05-13 1994-06-07 Detecting cancerous conditions by assaying for telomerase activity
US255,774 1994-09-28
US315,214 1994-09-28
US08/315,214 US5629154A (en) 1993-11-12 1994-09-28 Telomerase activity assays
US153,051 1994-09-28
US08/315,214 1994-09-28
US08/255,774 1994-09-28
US151,477 1994-09-28

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10273689A Division JPH11243998A (ja) 1993-11-12 1998-09-28 テロメラーゼ活性アッセイ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH09502102A JPH09502102A (ja) 1997-03-04
JP2875394B2 true JP2875394B2 (ja) 1999-03-31

Family

ID=27495974

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51399795A Expired - Lifetime JP2875394B2 (ja) 1993-11-12 1994-11-10 テロメラーゼ活性アッセイ
JP10273689A Pending JPH11243998A (ja) 1993-11-12 1998-09-28 テロメラーゼ活性アッセイ

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10273689A Pending JPH11243998A (ja) 1993-11-12 1998-09-28 テロメラーゼ活性アッセイ

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5629154A (ja)
EP (1) EP0728207B1 (ja)
JP (2) JP2875394B2 (ja)
AT (1) ATE193554T1 (ja)
AU (1) AU682082B2 (ja)
CA (1) CA2173872C (ja)
DE (1) DE69424797T2 (ja)
DK (1) DK0728207T3 (ja)
ES (1) ES2147602T3 (ja)
GR (1) GR3034249T3 (ja)
HK (1) HK1011384A1 (ja)
PT (1) PT728207E (ja)
WO (1) WO1995013381A1 (ja)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693474A (en) * 1992-05-13 1997-12-02 Board Of Regents, University Of Texas System Methods for cancer diagnosis and prognosis
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US5863726A (en) * 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5804380A (en) * 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5876979A (en) * 1994-07-07 1999-03-02 Cold Spring Harbor Laboratory RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
US6013468A (en) * 1994-07-07 2000-01-11 Cold Spring Harbor Laboratory RNA component of telomerase
US5698686A (en) * 1994-10-20 1997-12-16 Arch Development Corporation Yeast telomerase compositions
US5840490A (en) * 1995-06-07 1998-11-24 Mcmaster University Telomerase activity associated with hematological and colorectal malignancies
US5741677A (en) * 1995-06-07 1998-04-21 Geron Corporation Methods for measuring telomere length
WO1997015687A1 (en) * 1995-06-07 1997-05-01 Geron Corporation Telomerase activity assays
US6004939A (en) * 1995-07-06 1999-12-21 Ctrc Research Foundation Board Of Regents Methods for modulation and inhibition of telomerase
WO1997002279A1 (en) * 1995-07-06 1997-01-23 Ctrc Research Foundation Methods and compositions for modulation and inhibition of telomerase
US5856096A (en) * 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
DE19644302A1 (de) * 1995-11-28 1997-06-05 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität
JPH09262100A (ja) * 1996-03-27 1997-10-07 Mount Sinai School Medicine City Univ New York テロメラーゼ活性の存在を測定することによる尿試料中のヒト膀胱癌細胞の検出方法
JPH1052300A (ja) * 1996-06-03 1998-02-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 細胞内テロメラーゼ活性の測定法
US6489097B2 (en) 1996-06-28 2002-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for the detection of telomerase activity
JPH1028600A (ja) * 1996-07-17 1998-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd テロメラーゼ活性の測定法
BR9711844A (pt) 1996-10-01 2000-01-18 Geron Corp Preparação de proteìna isolada, substancialmente pura ou recombinante, proteìna de trt isolada, substancialmente pura ou recombinante protéina de trt isolada, substancialmente pura ou recombinante, protéina de trt isolada ou uma sua variante, ou um seu fragmento, polinucleotìdeo, sintético, substancialmente puro ou recombinante, ácido nucléico isolado, codificando uma proteìna de trt, vetor de expressão, célula transfectada, animal não-humano, ou sua progênie, animal não-humano transgênico, anticorpo ou seu fragmento de ligação, anticorpo, especificamente imunorreativo sob condições imunologicamente reativas, para uma proteìna de trt ou seu fragmento imunogênico, processos de determinar se um composto ou tratamento é um modulador de uma atividade ou expressão de trt, de determinar se um composto de teste é um modulador de uma atividade de trt, de preparar telomerase recombinante, de detectar um produto genético de trt em uma amostra, de detectar a presença de pelo menos uma célula humana positiva de telomerase em uma amostra biológica compreendendo células humanas, de diagnosticar uma condição relacionada com a telomerase em um mamìfero, para aumentar a capacidade proliferativa de uma célula de vertebrado in vitro, para detectar a presença de yuma sequência de polinucleotìdeo codificando pelo menos uma parte de uma trt em uma amostra bilógica, para produzir um polinucleotìdeo, para detectar a expressão ou presença de uma trt em uma amostra biológica, usos de ummpolinucleotìdeo, de um agente que aumenta a expressão ou atividade de uma trt, de um inibidor da expressão ou atividade de telomerase de uma proteìna, variante ou fragmento, composição farmacêutica, polipeptìdeo substancialmente purificado, sequência de polinucleotìdeo isolado, complexo de telomerase, composição, telomerase substancialmente pura, polipeptìdeo de trt isolado, ácido nucléico isolado.
EP1164203B1 (en) * 1996-11-06 2007-10-10 Sequenom, Inc. DNA Diagnostics based on mass spectrometry
US7390891B1 (en) 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
CA2274586A1 (en) 1996-12-20 1998-07-02 Geron Corporation Methods for detecting and inhibiting the rna component of telomerase
US5846723A (en) * 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
DE19705071A1 (de) * 1997-02-11 1998-08-13 Guido Dr Krupp Verfahren zur "Echtzeit-Analyse" von Telomeraseaktivität
US6210915B1 (en) 1997-12-31 2001-04-03 University Of Texas Systems Telomerase extraction method
DE19804372A1 (de) * 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
EP1068296B1 (en) 1998-03-31 2011-08-10 Geron Corporation Compositions for eliciting an immune response to a telomerase antigen
US6017709A (en) * 1998-04-29 2000-01-25 University Of Houston DNA replication templates stabilized by guanine quartets
JP4013333B2 (ja) * 1998-06-05 2007-11-28 株式会社Ｂ＆Ｃラボラトリーズ 皮膚の老化度の測定方法および測定用キット
US6664046B1 (en) 1999-12-16 2003-12-16 Roche Molecular Systems, Inc. Quantitation of hTERT mRNA expression
EP1170378A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Method for monitoring the effect of cancer therapies
US20020045219A1 (en) * 2000-08-02 2002-04-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Production of human monoclonal antibodies
US6428962B1 (en) 2001-02-12 2002-08-06 Dna Analysis, Inc. Nucleic acid collection barrier method and apparatus
EP1321768A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-25 Roche Diagnostics GmbH Diagnosis of endometriosis from menstrual blood
AU2003208580A1 (en) * 2002-02-05 2003-09-02 Technion Research And Development Foundation Ltd Lineage committed stem cells selected for telomerase promoter activity
US20030232409A1 (en) * 2002-03-11 2003-12-18 Regents Of The University Of Minnesota Immortal porcine cells
AU2003290722A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 Allied Biotech, Inc. Methods and compositions for detecting telomerase activity
ES2716528T3 (es) * 2003-06-23 2019-06-13 Telomerase Activation Sciences Inc Composiciones para aumentar la actividad telomerasa
WO2005000248A2 (en) 2003-06-25 2005-01-06 Geron Corporation Compositions and methods for skin conditioning
US20070122501A1 (en) * 2003-06-27 2007-05-31 Hong Kong University Of Science And Technology Formulations containing astragalus extracts and uses thereof
MXPA06002660A (es) 2003-09-09 2006-09-04 Geron Corp Oligonucleotidos modificados para inhibicion de telomerasa.
EP1866647B1 (en) * 2005-04-01 2015-04-22 Medvet Science Pty. Ltd. A method of diagnosis and treatment and agents useful for same
WO2006113470A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
DK2101789T3 (en) 2006-10-30 2015-03-23 Geron Corp Combined telomerase inhibitor and gemcitabine for the treatment of cancer
KR101560844B1 (ko) 2007-06-04 2015-10-15 벤-구리온 유니버시티 오브 더 네게브 리서치 앤드 디벨럽먼트 어쏘러티 트라이-아릴계 화합물 및 이를 포함하는 조성물
US8374838B2 (en) * 2007-10-22 2013-02-12 The Wistar Institute Method for identifying a compound that modulates telomerase activity
SI2437606T1 (sl) 2009-05-18 2016-10-28 Telomerase Activation Sciences, Inc. Sestavki in postopki za povečanje telomerazne aktivnosti
US20120070842A1 (en) * 2009-06-01 2012-03-22 Harley Calvin B Assay for Telomerase Activity Using Microfluidic Device
WO2011106671A1 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Geron Corporation Assay for telomerase activity
CN103328652B (zh) † 2010-04-16 2016-12-28 宙斯科学有限公司 测量用于测定未纯化的样品中细胞生活力的酶活性的方法
JP6113185B2 (ja) 2011-12-22 2017-04-12 ジェロン・コーポレーションＧｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ テロメラーゼ基質およびテロメア長作用因子としてのグアニンアナログ
WO2015048558A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Geron Corporation Phosphorodiamidate backbone linkage for oligonucleotides
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
WO2018146689A1 (en) 2017-02-12 2018-08-16 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Telomerase activating compounds for use in fertility and related applications
IT201800002511A1 (it) 2018-02-08 2019-08-08 Univ Degli Studi Cagliari Metodo per la misurazione dell’attività della telomerasi

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS528443B2 (ja) * 1974-10-09 1977-03-09
JPS60135753A (ja) * 1983-12-23 1985-07-19 Koa Sangyo Kk 非接触水分検知装置
JPS60161554A (ja) * 1984-02-01 1985-08-23 Furuno Electric Co Ltd 塩分濃度計
JPS60502114A (ja) * 1983-09-02 1985-12-05 ツエルヴエ−ゲル　ウステル　アクチエンゲゼルシヤフト 測定器および調整器をプログラミングする方法および装置

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4424279A (en) * 1982-08-12 1984-01-03 Quidel Rapid plunger immunoassay method and apparatus
US5310652A (en) * 1986-08-22 1994-05-10 Hoffman-La Roche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerase-high temperature reverse transcription
US5188963A (en) * 1989-11-17 1993-02-23 Gene Tec Corporation Device for processing biological specimens for analysis of nucleic acids
US5334499A (en) * 1989-04-17 1994-08-02 Eastman Kodak Company Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme
US5413924A (en) * 1992-02-13 1995-05-09 Kosak; Kenneth M. Preparation of wax beads containing a reagent for release by heating
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5523389A (en) * 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS528443B2 (ja) * 1974-10-09 1977-03-09
JPS60502114A (ja) * 1983-09-02 1985-12-05 ツエルヴエ−ゲル　ウステル　アクチエンゲゼルシヤフト 測定器および調整器をプログラミングする方法および装置
JPS60135753A (ja) * 1983-12-23 1985-07-19 Koa Sangyo Kk 非接触水分検知装置
JPS60161554A (ja) * 1984-02-01 1985-08-23 Furuno Electric Co Ltd 塩分濃度計

Also Published As

Publication number Publication date
HK1011384A1 (en) 1999-07-09
PT728207E (pt) 2000-11-30
CA2173872A1 (en) 1995-05-18
DE69424797D1 (de) 2000-07-06
WO1995013381A1 (en) 1995-05-18
AU1209095A (en) 1995-05-29
DK0728207T3 (da) 2000-10-02
EP0728207B1 (en) 2000-05-31
ATE193554T1 (de) 2000-06-15
CA2173872C (en) 2001-08-28
JPH11243998A (ja) 1999-09-14
US5629154A (en) 1997-05-13
GR3034249T3 (en) 2000-12-29
EP0728207A1 (en) 1996-08-28
JPH09502102A (ja) 1997-03-04
ES2147602T3 (es) 2000-09-16
DE69424797T2 (de) 2000-12-28
AU682082B2 (en) 1997-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2875394B2 (ja) テロメラーゼ活性アッセイ
US5863726A (en) Telomerase activity assays
US5837453A (en) Telomerase activity assays
US5804380A (en) Telomerase activity assays
US5648215A (en) Telomerase diagnostic methods
Wright et al. Modifications of a telomeric repeat amplification protocol (TRAP) result in increased reliability, linearity and sensitivity.
McCarthy et al. Rapid method for distinguishing clonal from polyclonal B cell populations in surgical biopsy specimens.
Brady et al. Representative in vitro cDNA amplification from individual hemopoietic cells and colonies
Van Steensel et al. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions
US5645986A (en) Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
AU688262B2 (en) Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US6007989A (en) Methods of screening for compounds that derepress or increase telomerase activity
US6787133B2 (en) Using purified telomerase to identify telomerase activators and inhibitors
Harada et al. Telomerase activity in primary and secondary glioblastomas multiforme as a novel molecular tumor marker
US5693474A (en) Methods for cancer diagnosis and prognosis
JPH09500272A (ja) 無限増殖能または腫瘍形成能を有するヒト細胞および動物細胞を同定する方法
JPH11507839A (ja) テロメラーゼ活性検定
US5840490A (en) Telomerase activity associated with hematological and colorectal malignancies
US5830644A (en) Method for screening for agents which increase telomerase activity in a cell
EP1563096A2 (en) Methods and compositions for detecting telomerase activity
Cheng et al. Polymerase chain reaction‐based enzyme immunoassay for quantitation of telomerase activity: Application to colorectal cancers
US6545133B1 (en) Methods for purifying telomerase
AU723767B2 (en) Telomerase activity assays
Müller et al. Telomerase activity in malignant and benign renal tumors
US6210915B1 (en) Telomerase extraction method

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080114

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090114

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090114

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100114

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110114

Year of fee payment: 12

S802 Written request for registration of partial abandonment of right

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R311802

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110114

Year of fee payment: 12

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110114

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120114

Year of fee payment: 13

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130114

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130114

Year of fee payment: 14

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term