DE19705071A1 - Verfahren zur "Echtzeit-Analyse" von Telomeraseaktivität - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren entsprechend dem Oberbegriff der Ansprüche 1-5.

Grundlage der vorliegenden Erfindung ist ein bereits patentiertes Verfahren der Firma Geron, Corp. (International Application Nr.: PCT/US94/12951 Int. Filing Date: 10. Nov. 1994; Int. Publication Nr.: WO 95/13381; Int. Publication Date: 18. May 1995). Dort ist folgendes Verfahren beschrieben: Zur praxisgerechten Messung der Telomeraseaktivität in Extrakten aus Geweben oder aus Gebekultur-Zellen ist ein hochempfindliches, auf Signal-Amplifikation beruhendes Verfahren erforderlich. Dafür wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt.

Die bisher verfügbaren Verfahren zur Detektion der erhaltenen Produkte beruhen auf folgender Vorgehensweise:

• a) Herstellung eines geeigneten Extrakts
• b) Durch die im Extrakt enthaltene Telomeraseaktivität wird ein synthetischer Oligonukleotid-Pri­ mer verlängert. Diese verlängerten Primer sind die nachzuweisenden Telomeraseprodukte.
• c) Amplifikation der Telomeraseprodukte durch PCR unter Einsatz eines zweiten, "reversen Primers".
• d) Sichtbarmachen der PCR-Produkte.

Die vorliegende Erfindung betrifft (c) und (d).

Zu (c): Von größter Bedeutung ist das Vermeiden von falsch positiven Resultaten. Gemäß Anspruch 1 wird eine Verbesserung durch eine spezielle Eigenschaft des reversen Primers erreicht. Diese Eigenschaft ist entscheidend für eine erheblich gesteigerte Sensitivität, und insbesondere zum Nachweis von Telomeraseaktivität in Einzelzellen; sie ermöglicht eine zuverlässige Unterscheidung zwischen Negativkontrollen und schwach aktiven Proben.

Zu (d): Die bisherigen Nachweisverfahren beruhen auf Analyse der PCR-Produkte durch Gelelektrophorese oder durch Immobilisierung der Produkte und Hybridisierung mit geeigneten DNA-Sonden. Grundlage ist dabei immer die Einführung einer Markierung in die PCR-Produkte: Entweder durch markierte Nukleotidbausteine (dNTP's) oder durch markierte Primer (bzw. Sonden beim Hybridisierungsverfahren). Auf jeden Fall ist nach abgeschlossener PCR noch mindestens ein weiterer Analyseschritt erforderlich.

Gemäß Anspruch 2 kann für den Telomerasenachweis das "Taq-Man" Verfahren der Firma Perkin-Elmer genutzt werden. Hier wird das Entfernen von Markierung(en) aus einer bzw. mehreren Hybridisierungssonden nachgewiesen. Dies geschieht in "Echtzeit", direkt während der PCR-Am­ plifikation. Eine weitere Probenverarbeitung entfällt und das Meßprinzip ermöglicht ein sehr schnelles, leicht automatisierbares und gut quantifizierbares Verfahren. Es werden aber teure Instrumente benötigt.

Analoges gilt für Anspruch 3 und Anspruch 4.

Gemäß Anspruch 5 ist eine stark vereinfachte apparative Ausstattung möglich. Durch geeignet kombinierte Markierungen wird ein qualitativer Telomerase-Nachweis durch Betrachten mit einer UV-Lampe möglich. Eine quantitative Analyse erfordert nur ein einfaches Fluoreszenz-Photometer.

B: Beispielbeschreibung einer Patentanmeldung

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden im folgenden näher beschrieben.

Abb. 1: Vermeidung der Artefakt-Bildung durch versetztes Hybridisieren.

Das Hauptproblem beim PCR-Nachweis von Telomeraseprodukten beruht auf der repetitiven Sequenz, die durch Telomerase addiert wird: bei Vertebraten besteht sie aus Hexamer-Repeats der Sequenz TTAGGG. Es ist völlig unvermeidbar, daß Primer-Dimere aus Telomerprimer TS und reversem Primer RP gebildet werden (Abb. 1A, 1C). Durch versetztes Hybridisieren mit RP ("staggered annealing") können diese Dimere "wachsen" und ein positives Ergebnis vortäuschen. Als erste Gegenmaßnahme wurde eine zusätzliche Sequenz am 5'-Ende von RP angefügt (Y in Abb. 1). Nach versetztem Hybridisieren mit dem entsprechenden Dimer-Produkt ist eine Verlängerung, und damit ein Wachsen des Primers TS nicht mehr möglich. Dies wurde bereits im Patent der Firma Geron und in unserer in Kürze erscheinenden Publikation beschrieben (Anlage: Manuskript von Krupp et al., 1997).

Ein zusätzliches Problem ist aber die Verlängerung des zweiten Primers RP. Dies kann durch einen oder mehrere interne Mismatch-Basenpaare in RP verhindert werden. Als ein mögliches Beispiel wurden zwei interne T:T Mismatche gezeigt (Abb. 1B). Die verschiedenen Möglichkeiten zum Versetzen Hybridisieren sind in Abb. 1D dargestellt. Immer wird weiteres "Wachstum der Dimere" via Elongation von RP durch zwei terminale A:A Mismatche verhindert (Abb. 1D). Der reverse Primer kann auch weniger als die dargestellten vier Hexamer-Repeats enthalten.

Abb. 2: Analoges Vorgehen bei anders gewählten RP-Sequenzen. Als weiteres Beispiel wurden interne G:T Paare eingeführt. Nach versetzter Hybridisierung entstehen hier A:C Mismatche (Abb. 2A bis 2D). Der reverse Primer kann auch weniger als die dargestellten dreieinhalb Hexamer-Repeats enthalten.

Abb. 3: Ergänzend wurde hier die Verwendung der bereits von Kim et al. (1994) publizierten Sequenz des reversen Primers CX dargestellt. CX ergibt einen terminalen T:T mismatch, um die Bildung von Primer-Dimeren zu unterdrücken (Patent der Geron Corp.). Bei versetzter Hybridisierung führt dies zufällig zu einem A:A Mismatch an der vorletzten Position des 3'-Endes. Dies haben wir bereits dargestellt (Anlage: Manuskript von Krupp et al., 1997).

Abb. 4: Ausführungsbeispiel für den "Echtzeit-Nachweis" der Telomeraseaktivität.

Das grundsätzliche Verfahren erfolgt gemäß der Taq-Man (Wz. der Firma Perkin-Elmer) Technologie. Neben den PCR-Primern TS und RP wird ein drittes Oligonukleotid OLS als Sonde eingesetzt. OLS wird nicht elongiert und sein 3'-Ende ist durch irgendeine geeignete Modifikation blockiert, z. B. durch eine Aminogruppe, eine Didesoxyribose oder durch eine Phosphatgruppe blockiert. Analog zum reversen Primer RP enthält auch OLS eine kurze 5'-terminale Sequenz "Y". Die Sonde OLS enthält mindestens einen vollständigen Hexamer-Repeat, kann aber auch mehr enthalten, z. B. drei wie in Abb. 4 gezeigt. In der Nähe oder direkt am 5'-Ende des hybridisierenden Bereichs enthält OLS einen Fluoreszenzfarbstoff R als "Reporter", ein Derivat von Fluorescein. Zusätzlich enthält OLS einen zweiten Farbstoff Q als Quencher, ein Derivat von Rhodamin. Intaktes OLS emittiert kein, bzw. nur ein geringes Fluoreszenzsignal vom Farbstoff R, denn dies wird durch Farbstoff Q gequencht. Farbstoff Q emittiert dagegen ein sehr starkes Signal mit einer ähnlichen Wellenlänge wie Farbstoff R, aber durch apparativen und rechnerischen Aufwand sind beide Signale unterscheidbar. Mit den nachzuweisenden PCR-Produkten können RP und OLS hybridisieren. Im Verlauf der PCR wird RP verlängert und OLS abgebaut. Dadurch wird der Farbstoff R freigesetzt und kann jetzt sein spezifisches Signal emittieren.

In Abb. 4 wird an Hand eines Beispiels die Vorgehensweise beim Telomerasenachweis dargestellt. Als kritisch erwies sich bei der Auswahl von geeigneten OLS-Sequenzen: (a) sie müssen einen Bereich von TS und der repetitiven Telomersequenz enthalten; (b) der Farbstoff Q sollte außerhalb des Abschnitts mit der TS-Sequenz liegen. In Abb. 4B ist als Beispiel ein Telomeraseprodukt mit 9 Hexamer-Repeats gezeigt. In Abb. 4C ist illustriert, daß Primer-Dimer kein oder nur sehr wenig Signal ergeben kann. Entsprechende, quantitative Resultate sind in Tabelle 1 aufgeführt. In Abb. 4D ist eine weitere Vorkehrung illustriert. Der Farbstoff Q sollte möglichst nahe am 5'-Ende von OLS liegen, am besten innerhalb der ersten 7 Nukleotide. Dadurch werden mögliche Störungen durch Dimerbildung ausgeschlossen: Nach vollständiger Hybridisierung von OLS mit längeren Telomeraseprodukt muß noch ausreichend Raum für Hybridisierung mit RP verbleiben, nur dann kann ein Signal entstehen. Bei Hybridisierung von OLS mit Dimer verbleibt nur noch ein sehr kurzer Bereich für Hybridisierung mit RP. Dies ist unzureichend zur Bildung eines Signals.

Weiterhin kann eine interne Kontrolle mitamplifiziert werden (nicht gezeigt). Im einfachsten Fall enthält diese Kontroll-DNA an den Enden die Sequenzen der Primer TS und RP. Die davon eingeschlossene Sequenz ist eine frei wählbare, aber nichtrepetitive Sequenz. Die entsprechende Sonde OLS-K kann wie OLS einen Teil von TS enthalten, oder nur mit der zusätzlichen Sequenz der Kontroll-DNA hybridisieren. Sie sollte aber einen anderen Reporterfarbstoff enthalten der eine Unterscheidung der Signale von OLS und OLS-K ermöglicht. Dies ermöglicht die Kontrolle des ordnungsgemäßen Ablaufs der PCR-Amplifikation und verbessert die Quantifizierung.

Als weitere Möglichkeit kann in der Kontroll-DNA auch einer oder beide Primer (TS und RP) durch zwei neue Sequenzen ersetzt werden. Das weitere Vorgehen ist analog.

Abb. 5: Alternatives Ausführungsbeispiel für den "Echtzeit-Nachweis" der Telomeraseaktivität.

Statt wie in Abb. 4 Quencher und Reporterfarbstoff in einer Sonde zu kombinieren, können beide auch getrennt werden. Der Primer Q-TS enthält den Quencher Q, und die Sonde RLS enthält den Reporterfarbstoff R, der nahe dem Q-haltigen Nukleotid im komplementären Q-TS positioniert wird. Nach Hybridisierung mit Telomeraseprodukt kann Primer RP elongiert werden. Dadurch wird Sonde RLS verdrangt und der freie Reporter kann ein Fluoreszenzsignal emittieren (Abb. 5B). Die Sonde RLS kann ebensoviele Hexamer-Repeats enthalten wie der reverse Primer RP, dadurch wird die Signalentstehung mit Primer-Dimer verhindert (Abb. 5C).

Weiterhin kann analog zur Beschreibung in Abb. 4 eine interne Kontrolle mitamplifiziert und mit einer entsprechenden Sonde RLS-K nachgewiesen werden.

Abb. 6: Weiteres alternatives Ausführungsbeispiel für den "Echtzeit-Nachweis" der Telomeraseaktivität. Anstatt eine Sonde zu verwenden, die am 3'-Ende von TS hybridisiert, kann auch an einen Primer eine zusätzliche, 5'-terminale Sequenz angehängt werden. In diesem Bereich Z enthält eines der Nukleotide einen Quencher. Die dazu komplementäre Sonde Z' enthält einen Reporterfarbstoff; sie kann auch einen Teil der TS-Sequenz einbeziehen. Nach Hybridisierung mit Telomeraseprodukt kann Primer RP elongiert werden. Dadurch wird Sonde Z' verdrängt und der freie Reporter kann ein Fluoreszenzsignal emittieren (Abb. 6B).

Das Vorgehen ist für Primer TS gezeigt; entsprechend kann auch für Primer RP vorgegangen werden.

Statt zwei getrennte Oligonukleotide zu verwenden, z. B. Primer Z-TS und Sonde Z', können beide Funktionen auch in einem Oligonukleotid vereint werden. Hier werden die beiden terminalen Sequenzen Z und Z' durch eine nichthybridisierende Sequenz verbunden, so daß ein Hairpin entsteht. Die 3'-terminale TS-Sequenz ist dabei ganz oder nur teilweise überstehend und somit einzelsträngig.

Weiterhin kann auch hier analog zur Beschreibung in Abb. 4 eine interne Kontrolle mitamplifiziert werden.

Als weitere Maßnahme können analog zu Abb. 4-6 zwei andersartige Markierungen eingesetzt werden: Ein Farbstoff R als Reporter, und ein Quencher QS. Aber QS ist kein Fluoreszenzfarbstoff, so daß die aufwendige Unterscheidung der Signale von R und Q entfällt. Mehrere Paare mit diesen Eigenschaften sind bekannt, z. B. EDANS und DABCYL; oder Anthranilamid und Nitrotyrosin. Die Anwendung des Paares EDANS und DABCYL in reinen Hybridisierungssonden wurde bereits beschrieben (Anlage: Tyagi & Kramer, 1996). Der qualitative Nachweis erfolgt mit einer einfachen UV-Lampe, quantitative Analysen können mit handelsüblichen Fluoreszenz-Photometern durchgeführt werden.

Tabelle 1 Nachweis eines synthetischen Telomeraseprodukts mit neun Hexamer-Repeats, der Quotient aus Reporter- und Quenchersignal ist die relevante Meßgröße

Tabelle 1

Claims (5)

1. Ein Telomerase-Nachweisverfahren mit hoher Zuverlässigkeit und sehr geringer Nachweisgrenze, dadurch gekennzeichnet, daß die interne Sequenz des reversen Primers so gestaltet wird, daß mit den artefiziell gebildeten Primer-Dimeren keine längeren Produkte durch versetztes Hybridisieren entstehen können (Abb. 1-2).

2. Eine Echtzeit-Analyse von Telomeraseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß entsprechend gestaltete Sonden OLS und OLS-K die Anwendung der Taq-Man Technologie (Wz. der Firma Perkin-Elmer) ermöglichen (Abb. 4). Dies kann in Kombination mit nach Anspruch 1 gestalteten reversen Primern erfolgen.

3. Eine Echtzeit-Analyse von Telomeraseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß entsprechend gestaltete Sonden RLS und RLS-K eingesetzt werden (Abb. 5).

4. Eine Echtzeit-Analyse von Telomeraseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß entsprechend gestaltete Primer (Z-TS bzw. Z-RP) und Sonden (Z') eingesetzt werden (Abb. 6).

5. Apparativ einfaches Verfahren zur Echtzeit-Analyse von Telomeraseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß Quencher QS eingesetzt werden, die keine Eigenfluoreszenz aufweisen. Die Verwendung von Primern und Sonden erfolgt analog zu Anspruch 2-4.