JP2831455B2 - 新しい脂質微粒子の製法 - Google Patents

新しい脂質微粒子の製法

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JP2831455B2 JP2245991A JP24599190A JP2831455B2 JP 2831455 B2 JP2831455 B2 JP 2831455B2 JP 2245991 A JP2245991 A JP 2245991A JP 24599190 A JP24599190 A JP 24599190A JP 2831455 B2 JP2831455 B2 JP 2831455B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微結晶外観の脂質微粒子（microparticl
e）の新製法に関する。
「結晶外観」は、厳格な意味での結晶構造が必ず得ら
れることを意味するとは理解されない。
この種の微粒子は、出願人によって特に欧州特許出願
第270,460号明細書に記載されている。
より詳細には、問題の微粒子は、リン脂質に対して親
和力を有する水不溶性物質と少なくとも１種のリン脂質
とのものである。
「水不溶性物質」は、水中に不溶性または難溶性の物
質を意味することを理解すべきであり且つ「リン脂質に
対して親和力を有する物質」はより特にリン脂質と物理
化学的に相互作用することができる化学化合物を意味す
ることを理解すべきである。
これらの微粒子は、主として水相にさもなければ不溶
性の物質の、水溶液で安定な微小懸濁液（microsuspens
ion）を得、それによって特に注射可能または噴霧化可
能な形態の医薬品の場合に投与することを可能とする利
点を提供する。
更に、多分、一方で特にマクロファージに対する高め
られた標的効果のため、そして他方で有効物質に対する
漸次の放出の効果のため、微粒子の製剤は、リポソーム
型の脂質小胞よりも顕著に有利である治療活性および毒
性の結果を与える。
リポソームの調製に使用する方法をベースとするこれ
らの微粒子を製造するための比較的複雑な方法は、欧州
特許出願第270,460号明細書に記載されている。
欧州特許出願第270,460号明細書に記載の方法は、本
質上下記工程 （ａ）溶媒をクロロホルム中のリン脂質の溶液およびメ
タノール中の前記物質の溶液から蒸発し去る工程、およ
び （ｂ）前記溶媒の蒸発後に得られるフィルムを強撹拌後
に水溶液に再懸濁する工程 からなる。
得られたフィルムを工程（ｂ）で再懸濁するために、
このことは、超音波処理によって行った。
方法の工業的応用の文脈で、特に強撹拌の工程、特に
超音波処理工程の存在を有する後者の複雑さは、主要な
欠点を構成する。
本発明者等は、これらの微粒子がはるかに単純な方法
によって、はるかに良い収率で調製できることを今や発
見した。
特に、本発明の主題である方法によれば、超音波処理
工程は排除され且つクロロホルムはリン脂質を可溶化す
るためにもはや使用されない。
事実上、本発明の主題は、リン脂質に対して親和力を
有する水不溶性物質と少なくとも１種のリン脂質との微
結晶外観の脂質微粒子（微粒子は水溶液中の懸濁液中で
安定である）を製造する方法において、 （ａ）前記物質および前記の１以上のリン脂質を前記物
質および前記の１以上のリン脂質用の共通の有機溶媒に
溶解し、 （ｂ）得られた前記物質および前記の１以上のリン脂質
の溶液を不溶化が沈殿の形態で観察されるような量の水
溶液と混合し、 （ｃ）有機溶媒を除去して微粒子を含有する水溶液を微
小懸濁液の形態で回収する ことを特徴とする微結晶外観の脂質微粒子の製法であ
る。
有機溶媒の除去は、蒸発、遠心分離または限外濾過に
よって実施してもよい。
本発明に係る方法の単純さは、異なる成分が接触する
や否や物質／リン脂質複合体が多分生成される（物理化
学的相互作用から生ずる）という事実から生ずる。水溶
液を供給することは、前記複合体の微粒子の形態で沈殿
を生ずる。
本発明によれば、同様の外観、構造および大きさの微
粒子および欧州特許出願第270,460号明細書に既述の方
法によって得られたバッチと比較して有利な薬理学的性
質さえ有する微粒子のより均一な製剤が、得られる。
リポソームの製剤および初期の方法に係る微粒子の製
剤と比較して、本発明に係る方法は、はるかに単純であ
り且つ経済的である。特に、遊離物質は最終溶液には少
ししか得られず、従って、より良い収率で得られ且つ得
られた微粒子の製剤は、従来法によって得られた純度よ
りも大きい純度を有する。それらは、本質上、遊離アン
ホテリシンＢまたは遊離リン脂質を含まない。更に、得
られた微粒子は、古い方法によって得られたものと同じ
位安定であり、従って、使用の可能性をかなり限定する
不安定性をこうむるリポソームよりもはるかに安定であ
る。本発明に係る方法の利点は、事実上、調製された多
粒子のバッチの再現性および均一性に関しても注目すべ
きである。従って、本発明の主題は、本質上遊離有効物
質および遊離リン脂質を含まず且つ微粒子が大きさが均
一であることを特徴とする本発明に係る方法によって得
られた微粒子の製剤でもある。
本発明に係る方法で有用な有機溶媒としては、中間極
性の溶媒、例えば、メタノール、ジメチルホルムアミド
（DMF）、ジメチルアセトアミド（DMA）、またはプロピ
レングリコールまたはエタノールはより特に挙げられ
る。
本発明に係る方法で有用な水溶液としては、純水また
は食塩水溶液、例えば、ホスフェート緩衝液、NaClの溶
液〔例えば、濃度0.5〜１％、例えば、0.9％（重量／容
量）〕、またはスクロース１〜10％（重量／容量）の溶
液が有利に使用されるであろうし、例えば、ラクトース
またはグルコースは爾後の凍結乾燥の目的に特に好適で
あり、ラクトース６％を含有するホスフェート緩衝剤50
mMの溶液（pH7.8）は、均一な大きさの微粒子を得るの
に特に興味がある。
本発明によれば、本法で使用する１以上のリン脂質／
物質のモル比は、0.1〜10であることができる。
わかるように、本発明に係る微粒子は、多分、1:1の
範囲内のモル比の物質／リン脂質複合化から生ずる。か
くて、モル比が２以下、即ち、例えば、0.5〜２、好ま
しくは0.5〜１であるならば、特定の相互作用が得ら
れ、平均サイズが１μ未満である微粒子が最適に均一に
調製される。
本発明に係る方法によって得られる微粒子の製剤にお
いては、微粒子の大きさは、均一であり、0.1〜10μで
あるが、より一般に0.5〜２μである。
本法で有用なリン脂質としては、ホスファチジルコリ
ン、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）、ジ
ステアリルホスファチジルコリン（DSPC）、ジパルミト
イルホスファチジルコリン（DPPC）、ホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイ
ルホスファチジルセリン（DPPS）、ホスファチジルイノ
シトール、ホスファチジルグリセロール、ジミリストイ
ルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジステアリル
ホスファチジルグリセロール（DSPG）、３′−Ｏ−リシ
ルホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリ
セロールまたは或いはコレステロールエステル（単独ま
たは混合）は、使用してもよく、このリストは当然限定
するものではない。
本発明によれば、ジミリストイルホスファチジルグリ
セロールと混合されたホスファチジルコリンまたはジミ
リストイルホスファチジルコリンが、好ましくはリン脂
質として使用されるであろう。ホスファチジルコリン
は、卵黄レシチン、大豆（水素添加またはその他の方法
で）、または他の工業的レシチン源から生成してもよ
い。
若干の物質は、酸性または塩基性媒体中で且つ塩形態
で生ずる時およびイオン化する時に所定の溶媒中の有機
溶液中でより大きい溶解度を示す。
この場合には、本発明に係る微粒子は、下記方法で有
利に調製する： （ａ）前記物質および前記の１以上のリン脂質を塩基性
または酸性媒体中の共通の有機溶媒に溶解し、 （ｂ）得られた溶液を水溶液と混合して沈殿を得、それ
ぞれ酸または塩基を加えることによって、溶液を中和し
（中和は水溶液の添加前または添加後に実施することが
可能である）、 （ｃ）溶媒を除去して微粒子を含有する水相を微小懸濁
液の形態で回収する。
また、微粒子は、最大量の有機溶媒を除去するために
遠心分離と上澄み液の除去との反復サイクルによって水
洗してもよい。
工程（ａ）において、臨機応変に、物質の量と比較し
て塩基または酸１〜1.5当量は、好適な方法で導入する
であろうし且つ混合物は、それぞれ同量の酸または塩基
によって中和するであろう。
沈殿の開始は、工程（ａ）で観察されるであろう。
本発明に係る方法は、抗真菌活性も有するナイスタチ
ン、アンホテリシンＢ、それらの誘導体などのポリエン
マクロライド抗真菌性医薬品の微粒子を調製するのに特
に有利である。
本発明に係る方法においては、前記物質がアンホテリ
シンＢである時に、最良の結果が、可変モル比5:5から
9:1のホスファチジルコリン（卵レシチンまたは水素添
加大豆レシチン）またはDMPCとDMPGとの混合物を使用し
て得られた。
有効物質がアンホテリシンＢ、ナイスタチンなどのポ
リエン型マクロライドである場合には、有効物質をメタ
ノールまたはプロピレングリコールに溶解する時に、物
質とリン脂質との初期溶液は、有利には塩基性溶液、例
えば、有効物資と比較して１〜1.5当量のNaOH、KOHなど
の塩基を含有する溶液であろう。その後、溶液は、１〜
1.5当量のHClなどの酸を加えることによって中和する。
１当量は、この場合には、アンホテリシンのモルと同じ
モル数の塩基または酸を表わす。
有効物質がアンホテリシンＢ、ナイスタチンなどのポ
リエン型マクロライドである場合には、有効物質をエタ
ノールまたはDMF溶液に溶解する時に、物質とリン脂質
との初期溶液は、有利には酸性溶液、例えば、有効物資
と比較して１〜1.5当量のHClなどの酸を含有する溶液で
あろう。その後、溶液は、１〜1.5当量のNaOH、KOHなど
の塩基を加えることによって本法で中和する。
溶媒がDMAである時には、酸性溶液を使用することも
可能であり（このことは必須ではないけれども）、DMA
中のアンホテリシンＢなどのポリエンマクロライドの溶
解度は酸の使用を回避するのに十分である。アンホテリ
シンＢの溶解度は、DMA中の酸性溶液中で改善されるこ
とが真実のままである。
若干の場合には、特に溶媒の除去がより安定な微粒子
を得るために有利に加熱することによって実施しない時
に、混合物は、工程（ｃ）での溶媒の除去前に、例え
ば、少なくとも40℃、好ましくは60℃に30分間加熱す
る。
同様に、酸性または塩基性媒体中での有効物質の劣化
の危険を回避するために、可溶化は、物質を工程（ａ）
において氷浴中で冷却することによって行ってもよい。
カンジダ属およびコウジカビ属によって生ずる真菌性
感染症の治療は、困難であり且つ通常不良に許容され
る。ほとんどの医薬品は、これらの２種の微生物に対し
て有効ではない。
ナイスタチン、アンホテリシンＢなどのポリエンマク
ロライド抗真菌剤は、種コウジカビと種カンジダとの両
方に対する活性によって特徴づけられる最も広く使用さ
れている製品である。
アンホテリシンＢの臨床的用途は、２つの主要な欠点
によって非常に大幅に限定されている： （ａ）第一に、デオキシコール酸ナトリウム中の溶液中
での投与を必要とする大きい不溶性、 （ｂ）第二に、アンホテリシンＢ自体の毒性活性に加え
且つ腎臓および骨髄上に最も特に及ぼされるデオキシコ
ール酸ナトリウムの固有の毒性。
しかしながら、副作用に無関係に、この抗生物質は、
この治療なしで致命的な予後を有するであろう真菌感染
症において有効のままである。この文脈で、細胞内浸透
を変性することによってアンホテリシンＢの毒性を減少
することが重要であることが明らかになってきた。
事実上、一般に抗真菌剤、特にアンホテリシンＢの効
能に非常に重要な因子は、体の抗感染防衛に応答できる
宿主細胞の抗生作用と相乗する抗生作用を誘導するニー
ズである。事実上、多形核細胞およびマクロファージ
は、微生物を食菌作用し且つリソソーム系において微生
物を制御することができるので、真菌感染症を成功裡に
克服できることが実証されている。従って、抗真菌医薬
品は、細胞外媒体に存在する感染剤の増殖を減少しなけ
ればならないだけではなく、多形核細胞およびマクロフ
ァージの食胞およびリソソーム内に作用を及ぼすことが
できなければならない。事実の点で、ポリエンマクロラ
イドの細胞内浸透についてはほとんど知られておらず、
且つすべてのことは、これらの物質が細胞周囲の膜で蓄
積し、従って、表面から細胞内空間までへの膜フラック
スの結果としてのみ細胞内リソソーム区画に達するのに
成功することを更に示唆している。
本発明は、前記微粒子の懸濁液を調製するためにこの
医薬品とホスファチジルコリンとの相互作用をベースと
するアンホテリシンＢの新しい医薬剤形を提案すること
によって、これらの問題の解決法を提供した。
この医薬剤形は、第一に、デオキシコレートを使用せ
ずにアンホテリシンＢを投与することを可能にし且つ静
脈内注射後に製品の急性毒性を非常に有意に減少させる
ことを可能にする。これらの微粒子は、細胞外カンジダ
に対してデオキシコレートによって可溶化されたアンホ
テリシンと同じ活性を有し且つマクロファージを包含す
る細胞内感染症に対して生体外でより有効である。
アンホテリシンＢ微粒子の性質も、同じポリエンマク
ロライドを含有するリポソームの性質と比較して有利で
あり、アンホテリシンの副作用を減少することができる
担体としても推奨される。
例1:アンホテリシンＢとホスファチジルコリンとの微粒
子 1.アンホテリシンＢの溶解度 アンホテリシンＢは、極性である構造の部分（酸基お
よびアミン基を有する）と無極性部分との両方を有する
両性化合物である。DMSOおよびDMF中を除いて、アンホ
テリシンＢは、大抵の有機溶媒にわずかにだけ溶解す
る。しかしながら、酸およびアミン基のイオン化は、溶
解度を増大する（表１参照）。
アンホテリシンＢの２つの異なるバッチを後述の試験
のために使用した。
（ａ）局所適用のためのアンホテリシンＢ （ｂ）静脈内注射のためのアンホテリシンＢ 1.1「局所等級」アンホテリシンＢの溶解度溶媒 溶解度（mg/ml） CH3OH 0.13 CH3OH＋HCl 1.5当量 5.00★ CH3OH＋NaOH 1.5当量 5.00 ★ 2.3参照 1.2「静脈等級」アンホテリシンＢの溶解度溶媒 溶解度（mg/ml） CH3OH 0.150 CH3OH＋HCl 1.0当量 5.00★ CH3OH＋NaOH 1.0当量 5.00 ★ 溶解 2.3参照 メタノール中の酢酸およびアンモニアNH3は、前記試
薬２当量の添加後にアンホテリシンＢ（CH3OH中5mg/m
l）を溶解しない。
2.アンホテリシンＢ溶液の安定性 2.1 方法 アンホテリシンＢ溶液の安定性は、逆相カラム〔C18
ボンダパック（Bondapak）、25×0.5cm、ウォーターズ
・アソシエーツ〕を使用したHPLC分析によって記録し
た。CH3CN/10mMアセテート緩衝液（pH7）系（39:61）を
溶離剤として使用した。UV記録を404および362nmで行っ
た。流量は、2ml/分であった。アンホテリシンＢの保持
時間（RT）は、9.5分である。結果をピーク面積の％と
して表現した。
2.2 中性CH3OH溶液 濃度0.1mg/mlにおいて、アンホテリシンＢは、４℃で
数日間安定である。局所等級アンホテリシンＢは、純度
88.5％を有する（保持時間4.5分を有する汚染7.6％）。
静脈等級アンホテリシンＢは、純度94.5％を有する
（保持時間4.5分を有する汚染3.5％）。
2.3 酸性媒体中のメタノール溶液 局所等級アンホテリシンＢの場合の試験は、化合物が
メタノール性溶液中のHCl 1.5当量の存在下で濃度0.1mg
/mlにおいて安定であるが、この酸性媒体中で濃度5mg/m
lにおいて劣化されることを示した（第１図参照）。0.1
mg/mlのアンホテリシンＢ溶液の場合に得られたHPLC結
果を下記表２に記録する。中和は、pHを監視することに
よって行った。過剰のNaOHの添加は、化合物の安定性に
影響しない（表２）。
アンホテリシンＢの安定性に対する添加HClの影響を
研究するために、増大量のアンホテリシンＢ（静脈等
級）をHCl 1当量（メタノール性溶液）の存在下でメタ
ノールに溶解した。アンホテリシンＢの物質の酸性媒体
中の劣化は、アンホテリシンＢ濃度が2mg/mlよりも高い
時にはメタノール性溶液中のHClの添加を０℃で実施し
た時にさえ（汚染31％）、大幅に増大する（第１図参
照）。アンホテリシンＢの劣化なしに濃度5mg/mlでのア
ンホテリシンB/HCl溶液を得るためには、アンホテリシ
ンＢを濃度2mg/mlにおいてHCl 1当量の存在下でメタノ
ールに溶解した。次いで、溶媒を蒸発し去り、アンホテ
リシンＢと酸との塩を必要な容量のアルコールに再溶解
した。
2.4 塩基性CH3OH溶液 増大量のアンホテリシンＢ（静脈等級）をNaOH 1当量
（メタノール性溶液）の存在下でメタノールに溶解し
た。次いで、これらの溶液をHPLCによって分析した。第
２図からわかるように、アンホテリシンＢは、濃度5mg/
mlまでメタノール性NaOH溶液中で良好な溶解度を有す
る。メタノール性HClでの中和は、製品の安定性に対し
て影響を有していない。
3.アンホテリシンＢの検定 アンホテリシンＢをUV分析によって検定するために、
Ｅ値は、DMFに溶解された増大量のアンホテリシンＢに
関して404nmでの吸光度を測定することによって求め
た。
アンホテリシンＢ（mg/ml）：（Abs./49.8）×希釈ファ
クター 好適なコントロールは、リン脂質およびスクロースが
アンホテリシンＢの検定を妨害しないことを示した。
4.微粒子の製剤 4.1 序論 微粒子の製剤を改善する目的で、異なる方法を比較し
た。数個のパラメーターを評価した。
（ａ）メタノール中のアンホテリシンＢの溶解度を増大
するためのNaOHまたはHClの添加、 （ｂ）アンホテリシンＢのメタノール性溶液の添加前に
リン脂質をクロロホルムに溶解する効果、 （ｃ）アンホテリシンＢのメタノール性溶液の添加前に
リン脂質のフィルムを形成する効果。
密度勾配遠心分離は、微粒子の品質を測定するための
分析法として選んだ。
4.2 材料および方法 ★材料 Ｌ−α−ホスファチジルコリンを卵黄レシチン（純度
99％；モル質量789）または大豆レシチンから生成し
た。アンホテリシンＢは、静脈等級のものであった（純
度94％；モル質量924）。ブチ（Buchi）回転蒸発器型の
蒸発器（特に断る場合を除いて）を使用して、蒸発を行
った。
★調製法 後述のすべての製剤は、最終濃度5mg/mlのアンホテリ
シンＢを含有していた。
方法1:アンホテリシンＢ懸濁液の調製 アンホテリシンB 25mgをメタノールに溶解した（0.1m
g/ml）。溶媒を蒸発し去り、乾燥残渣をホスフェート緩
衝化食塩水溶液（pH7.4）（PBS）5mlに取り上げた。試
料を超音波処理した。
方法2: クイックフィット（QUICKFIT）ライジング（rising）
フィルム蒸発器を使用して、アンホテリシンＢの微粒子
の製剤を調製した。
５の三角フラスコにおいて、アンホテリシンB 1gお
よびＬ−α−ホスファチジルコリン（卵レシチン、99％
よりも高い純度）0.85gをクロロホルム／メタノール混
合物（容量で1:1）1.5に溶解し、溶液が透明である時
に0.9％NaOH 100mlを加える。
溶媒を真空下でライジングフィルム蒸発器中で除去す
る。蒸発器の上部における溶液の最高温度は、35〜45℃
である。相分離後、微粒子を含有する水相を回収し、第
二蒸発サイクルに付す。
蒸留水を使用して系をすすぎ、回転蒸発器を使用して
最終容量を200mlとし、蒸発器の加熱浴は40℃を超えな
い。
アンホテリシンの82〜86％が、一般に、濃度４〜5mg/
mlで微粒子の懸濁液の形態で回収される。
方法３ アンホテリシンB 25mgをNaOH 1当量（0.132Mメタノー
ル性溶液205μ）の存在下でメタノールに溶解した（5
mg/ml）。ホスファチジルコリン21.2mgを混合物に導入
した。これは、アンホテリシンＢ対ホスファチジルコリ
ンのモル比1:1に対応する。溶解が完了するまで、製剤
を撹拌した。0.9％（重量％）NaCl 5mlを加えた。黄色
の沈殿の形成が、観察される。次いで、混合物は、酸１
当量（メタノール中のHClの0.88M溶液30.7μ）を加え
ることによって中和する。次いで、メタノールを蒸発し
去り、最終容量を0.9％（重量％）NaCl溶液で5mlに調整
した。
方法４ ホスファチジルコリン21.2mgをリン脂質のクロロホル
ム溶液からのクロロホルムの回転蒸発によって500mlの
丸底フラスコの底でフィルムの形態で析出した。フィル
ムをメタノール中のアンホテリシンＢの溶液250mlに可
溶化し（0.1mg/mlで25mg）、薄膜が得られるまで、回転
蒸発器中で再度蒸発した。PBS溶液5mlの添加後、混合物
を0.5時間超音波処理した。
方法５ アンホテリシンＢ溶液の添加前にリン脂質をクロロホ
ルムに溶解したという事実以外は「方法３」と同じ方法
に従った。この場合には、沈殿は、PBS水溶液（2ml）の
添加後に観察されなかった。しかしながら、黄色の固体
が、溶媒の蒸発時に沈殿する。
方法６ 卵黄レシチンの代わりに大豆レシチンを使用して、
「方法４」と同一の方法に従った。
方法７ 卵黄レシチンの代わりに水素添加大豆レシチンを使用
して、「方法３」と同一の方法に従った。
方法８ 0.9％NaCl溶液の代わりに水を使用して、「方法３」
と同一の方法に従った。
方法９ 0.9％NaCl溶液の代わりに５％ラクトース溶液を使用
して、「方法３」と同一の方法に従った。
方法10 0.9％NaCl溶液1mlのみを溶液に加えたという事実以外
は「方法３」と同一の方法に従った。この場合には、沈
殿は、水溶液を導入する時に完了しなかった。この沈殿
は、中和段階で完了した。
方法11 0.9％NaCl溶液の添加前にメタノール性溶液中のHCl 1
当量を加えることによって混合物を中和した以外は「方
法３」と同じ方法。
方法12 余りに多い劣化なしに医薬品5mg/mlを含有する溶液を
得る目的で、アンホテリシンB 25mgを濃度2mg/mlでメタ
ノール性溶液中のHCl 1当量の存在下で溶解した。溶媒
を蒸発し去り、化合物を必要な容量のメタノールに溶解
した。卵黄ホスファチジルコリン21.2mgを混合物に導入
した。溶解が完了するまで、製剤を撹拌した。0.9％NaC
l溶液5mlを加えた。黄色の沈殿の形成が、観察された。
混合物は、酸１当量を加えることによって中和した。メ
タノールを蒸発し去り、最終容量を0.9％NaCl溶液で5ml
に調整した。
方法13 0.9％NaCl溶液添加前にメタノールに溶解されたNaOH
1当量を加えることによって混合物を中和した以外は
「方法12」と同じ方法。
方法14 アンホテリシンＢ溶液の添加前にリン脂質をクロロホ
ルムに溶解した以外は「方法13」と同じ方法。沈殿は、
0.9％NaCl（2ml）の添加後に観察されなかった。黄色の
沈殿は、溶媒の蒸発時に現われる。
方法15 レシチンを1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−３
−ホスホコリン（12.84mg）と1,2−ジミリストイル−sn
−グリセロ−３−ホスホ−１−rac−グリセロール（5.5
9mg）との混合物に取り替える以外は「方法３」と同じ
方法。
方法16 メタノール500mlに懸濁されたアンホテリシンB 2g
は、メタノールに溶解されたNaOH 1当量を加えることに
よって溶解する。卵レシチン1.7g（１当量）を透明溶液
に加える。脂質の溶解が完了するまで、溶液を撹拌す
る。強撹拌下に、水300〜500mlを加えた後、溶液のpHを
pH7.8に調整することは、微粒子の沈殿を生ずる。ライ
ジングフィルム蒸発器（クイックフィット）を使用し
て、メタノールを真空下で蒸発し去る。蒸発カラムの上
部における最高温度は、35〜45℃である。
★方法 密度勾配遠心分離 （A.S.ジャノフ、L.T.ボニ、M.C.ポペスク、S.R.ミンチ
ー、P.R.クリス、T.D.マデン、T.タラシ、S.M.グルーナ
ー、E.シャムサンダー、M.W.テート、R.メンデルゾーン
およびD.ボナー、Proc.Nat.Acad.Sci USA85,6122−6126
（1988）） 試料500μを連続スクロース勾配（ｄ＝1.0〜1.18g/
ml）上で150mM NaCl/20mM HEPES溶液（pH7.4）中で析出
した。勾配を22℃においてSW−41ローター〔ベックマン
（Beckman）〕中で230,000Gにおいて21時間遠心分離し
た。遠心分離後、勾配を0.53mlの画分（fraction）に分
別し、アンホテリシンＢおよびリン脂質含量に関して検
定する。
リン脂質の検定 （M.タカヤマ、S.イトム、T.ナガサキ、I.タニミズ、Cl
inica Chimica Acta,79（1977）93−98「血清コリン含
有リン脂質の測定のための新しい酵素法」） 常法において、試料20μを酵素（ベーリンガー・マ
ンハイムGmbH、キット691844）の溶液3mlと混合し、37
℃で10分間インキュベーションした。試料の吸光度を50
0nmで測定した。塩化コリン溶液（PC3mg/mlに対応）を
コントロールとして使用した。
4.3 結果 4.3.1 微粒子中のリン脂質の測定 微粒子を卵レシチン4.15mgとアンホテリシンB 5mgと
から調製した。微粒子を１％Doc溶液に懸濁し、合計リ
ン脂質含量に関して検定した。
微粒子の数種の希釈液を１％Doc溶液（pH11.3）中で
調製し、リン脂質含量に関して検定した。検定は、リン
脂質0.1mg/mlから少なくとも5mg/mlまで正確である。
4.3.2 密度プロフィールの正確さ LKB勾配ジェネレーターを使用してスクロース０〜41
重量％のスクロース勾配が得られた（合計容量11ml）。
管を0.53mlのアリコートに分別し、異なる画分の密度を
重量分析で求めた。１〜1.18g/mlに広がる線形勾配が現
われる。コントロール実験は、密度プロフィールが230,
000Gでの遠心分離後に同じであることを示した。
4.3.3 方法１〜５に従って得られた微粒子中のリン脂
質およびアンホテリシンＢの検定 下記表３からわかるように、アンホテリシンおよびリ
ン脂質は、従う方法に無関係にほとんど完全に回収され
る。
4.3.4 スクロース密度勾配遠心分離プロフィール 第３図〜第16図は、アンホテリシンＢの14個の製剤の
等密度スクロース密度プロフィールを示す。方法３およ
び10（それぞれ第５図および第12図）で得られた微粒子
は、アンホテリシンＢが単一バンド（1.13〜1.15g/ml）
中のホスファチジルコリンと厳密に関連づけられる密度
プロフィールを生ずる。層は、薄く且つ管の底から明ら
かに離れている。これらの単一バンドの密度およびアン
ホテリシンB/リン脂質のモル比は、アンホテリシンB/脂
質複合体が本当に生成されていることを示唆する。これ
らの異なる方法の場合に観察された微粒子の層の幅およ
びアンホテリシンB/リン脂質のモル比を下記表４に記録
する。
方法１（第３図）においては、アンホテリシンは、管
の底に移行した。この結果は、密度勾配遠心分離がアン
ホテリシンB/リン脂質の微粒子を遊離アンホテリシンＢ
の凝集体と区別するのに有用であることを示す。
方法５（第７図）、方法６（第８図）および方法14
（第16図）に従って得られた微粒子は、非常に類似の二
項密度分布を示した。大部分のアンホテリシンＢは、一
部分の脂質と共に管の底に配置された。残りのリン脂質
は、オパール状層の形態で浮上した。これらの試料の場
合には、微粒子の存在を実証することは困難である。
大豆および水素添加大豆レシチン（それぞれ方法７、
第９図、および方法８、第10図）を使用して得られた結
果は、方法３および10に従って得られた微粒子の場合に
観察された結果と非常に類似であるが、微粒子は、わず
かに均一である。
より少量の0.9％NaClを加えた時（方法11、第13
図）、中和が0.9％NACl水溶液添加前に生じた時（方法1
3、第15図）またはアンホテリシンＢを酸性媒体に溶解
した時（方法14、第16図）、微粒子が得られた。
5.凍結乾燥 微粒子を凍結乾燥形態で貯蔵する。水溶液中への微粒
子の懸濁液の凍結乾燥後の還元は、凍結乾燥前のものと
同じ物理化学的特徴および生物学的特徴を有する粒子を
生ずる。
微粒子の一体性を保存するためには、凍結乾燥は、グ
ルコース、ラクトース、ホスフェート緩衝液、トリス、
アルブミン、カルボキシメチルセルロースなどの各種の
賦形剤の存在下で実施すべきである。
6.結論 最も均一な製剤は、方法３および10、即ち、塩基１当
量の存在下での濃度5mg/mlでのアンホテリシンＢの溶
解、卵黄ホスファチジルコリンの使用および混合物の中
和前の0.9％NaClまたは５％ラクトース溶液（1ml/アン
ホテリシンB 5mg）の添加に従って得られた。大豆レシ
チンまたは水素添加大豆レシチンをベースとする製剤
は、均一性がわずかにより低かった。
また、微粒子は、0.9％NaCl溶液の添加前の混合物の
中和により、またはHCl 1当量を使用してアンホテリシ
ンをメタノールに溶解することにより調製した。後者の
方法によれば、混合物は、0.9％NaCl溶液の添加前また
は添加後に中和した。すべてのこれらの製剤において
は、微粒子は、スクロース勾配遠心分離によって示すよ
うに、均一性がより低かった。
クロロホルムを使用して卵黄レシチンのフィルムを予
備形成するかアンホテリシンＢの塩基性メタノール性溶
液の添加前にリン脂質を溶解する時には、微粒子は、得
られなかった。
例2:他の溶媒を使用して調製した微粒子 Ａ）DMFの使用 アンホテリシンB 50mgをメタノール中のHCl 1当量
（0.87M溶液47μ）の存在下でジメチルホルムアミド1
mlに０℃で溶解する。ホスファチジルコリン42.5mg（１
当量）を溶液に導入する。溶解が完了するまで、製剤を
撹拌し、水1mlの添加は微粒子の沈殿を生ずる。溶液
は、NaOH 1当量を加えることによって中和する。ジメチ
ルホルムアミドを遠心分離／上澄み液の除去／水溶液へ
の再懸濁の３サイクルによって大部分除去する。
Ｂ）1,2−プロパンジオールの使用 アンホテリシンB 1gをKOH 1当量（エタノール中のKOH
の0.1M溶液10ml）の存在下で1,2−プロパンジオール250
mlに溶解する（4mg/ml）。エタノール3mlに溶解された
ホスファチジルコリン850mgを溶液に導入する。このこ
とは、アンホテリシンＢとホスファチジルコリンとの間
のモル比1:1に対応する。溶液を800rpmで室温において
撹拌し、0.1M HCl 10ml（１当量）を使用して中和し、H
2O 250mlを混合物に加えて、微粒子の沈殿を生ずる。1,
2−プロパンジオールの除去を接線濾過によって行っ
た。
ｃ）ジメチルホルムアミド（DMA）の使用 DMA中のアンホテリシンＢの溶解度（6mg/ml）は、塩
基または酸の使用を回避するのに十分である。
アンホテリシンB 300mgをDMA 50mlに溶解する（6mg/m
l）。エタノール（1ml）中の卵レシチン255mgを溶液に
加える。混合物を1000rpmで撹拌し、水75mlを混合物に
加えて、微粒子の沈殿を生ずる。DMAを濾過膜とDMAとの
不相容性に鑑みて遠心分離によって除去する。
スクロース勾配遠心分離 スクロース勾配遠心分離は、DMF、1,2−プロパンジオ
ールおよびDMA中で得られた製剤の場合には、管の半分
ぐらい下がったところに配置され且つアンホテリシンB/
リン脂質のモル比0.8〜1.4によって特徴づけられるバン
ドを示す。
遊離アンホテリシンＢまたは遊離リン脂質の痕跡は、
観察されない。
例3:アンホテリシンＢおよびリン脂質の各種の混合物の
微粒子 例３−１ アンホテリシンB 1g（1.1ミリモル）をNaOH 1当量の
存在下で、氷浴中で冷却されたメタノール250mlに溶解
した。メタノール80mlに溶解されたDMPC 0.367g（0.5当
量）とDMPG 0.373g（0.5当量）との混合物を氷浴中で冷
却されたアンホテリシンＢ溶液に加えた。アンホテリシ
ンB/リン脂質のモル比は、1:1である。微粒子は、ホス
フェート50mMラクトース６％緩衝液300mlを加え、混合
物を中和した後に沈殿によって得られた。混合物を60℃
で30分間加熱する。メタノールをライジングフィルム上
での蒸発によって除去する。
例３−２ アンホテリシンＢと比較して計算されたDMPC 0.35当
量およびDMPG 0.15当量で出発する以外は例１に記載の
方法と同じ方法。従って、アンホテリシンB/リン脂質の
モル比は、2:1である。
例３−３ アンホテリシンＢと比較して計算されたDMPC 0.75当
量およびDMPG 0.08当量で出発する以外は例１に記載の
方法と同じ方法。このことは、アンホテリシンB/リン脂
質のモル比は1.2:1に対応する。
例３−４ アンホテリシンＢと比較して計算された卵レシチン0.
7当量およびDMPG 0.3当量で出発する以外は例１に記載
の方法と同じ方法。このことは、アンホテリシンB/リン
脂質のモル比1:1に対応する。
例３−５ アンホテリシンＢと比較して計算された水素添加大豆
レシチン0.7当量およびDMPG 0.3当量で出発する以外は
例１に記載の方法と同じ方法。このことは、アンホテリ
シンB/リン脂質のモル比1:1に対応する。
例３−６ アンホテリシンB 1.85（２ミリモル）をNaOH 1当量
（10N NaOH溶液200μ）の存在下で1,2−プロパンジオ
ール500mlに溶解した。1,2−プロパンジオール100mlに
溶解されたDMPC 0.45g（0.33当量）とDMPG 0.46g（0.33
当量）とを含有する溶液をアンホテリシンＢ溶液に加え
た。DMPGの1,2−プロパンジオールへの溶解は、溶液を6
0℃に加熱することによって実施する。アンホテリシンB
/リン脂質のモル比は、1.5:1である。
微粒子は、50mMホスフェート６％ラクトース緩衝液１
を加え、混合物を中和した後に（1N HCl溶液2mlの添
加）沈殿によって得られた。
混合物を60℃に30分間加熱した後、1,2−プロパンジ
オールを接線濾過によって除去する。
例３−７ アンホテリシンB/リン脂質のモル比2:1で出発する以
外は例６に記載の方法と同じ方法。
例３−８ アンホテリシンB/リン脂質のモル比1:1で出発する以
外は例６に記載の方法と同じ方法。
例３−９ DMPC 0.35当量およびDPPS 0.15当量で出発する以外は
例６に記載の方法と同じ方法。このことは、アンホテリ
シンB/リン脂質のモル比2:1に対応する。
例３−10 アンホテリシンB 1.85g（２ミリモル）をHCl 1当量
（1N HCl溶液2ml）の存在下で、氷浴中で冷却されたエ
タノール400mlに溶解した。1N HCl 2mlを含有するエタ
ノール100mlに溶解されたDMPC 0.45g（0.33当量）とDMP
G 0.46g（0.33当量）とを含有する溶液を氷浴中で冷却
されたアンホテリシンＢ溶液に加えた。アンホテリシン
B/リン脂質のモル比は、1.5:1である。微粒子は、水１
を撹拌下に加え、混合物を中和した後に（1N NaOH溶
液4mlの添加）沈殿によって得られた。混合物を60℃に3
0分間加熱した後、エタノールを接線濾過により、また
はライジングフィルム上での蒸発により除去する。
例３−11 アンホテリシンB 1.85g（２ミリモル）をHCl 1当量
（1N HCl溶液2ml）の存在下で、氷浴中で冷却されたエ
タノール400mlに溶解した。1N HCl 2mlを含有するエタ
ノール中の吉草酸コレステロール2.85g（３当量）とDMP
G 0.689g（0.3当量）との溶液を氷浴中で冷却されたア
ンホテリシンＢ溶液に加える。アンホテリシンB/レシチ
ンのモル比は、0.3:1である。混合物を強撹拌し、微粒
子は、水１を加え、混合物を中和した後に（1N NaOH
4mlの添加）沈殿によって得られた。混合物を60℃に30
分間加熱した後、エタノールを接線濾過により、または
ライジングフィルム上で除去する。
例３−１〜３−11のこれらの製剤は、均一であり且つ
溶血効果の不在、フンギゾン（Fungizone）の生体外活
性と等しいかわずかに大きいカンジダ・トロピカリス
（Candida tropicalis）に対する生体外活性およびフン
ギゾンの毒性と比較してOF1マウス上での生体内で測定
した毒性の減少を示す。30よりも大きいLD50が、若干の
場合には観察される。
DSPC、DSPGおよびDPPSの使用は、カンジダ・トロピカ
リスに対する良好な生体外活性（フンギゾンのED50と等
しいかわずかにより良いED50）を有し且つフンギゾンの
形態で使用したアンホテリシンＢと比較してOF1マウス
上での生体内で測定した急性毒性の減少を示しさえする
微粒子の非常に均一な製剤を生ずる。
表５ OF1マウス上で測定されたLD50 例 LD50 ３−１ 25.06 ３−２ ＞30 ３−３ 27.06 ３−４ ＞30 ３−５ ＞30 ３−６ 29.5 ３−７ 21.7 ３−８ 29.5 ３−９ 19 ３−10 ＞30 ３−11 ＞30
【図面の簡単な説明】 第１図および第２図は各種の濃度および室温でのそれぞ
れ酸性および塩基性媒体中のアンホテリシンＢの場合の
安定性曲線を示すグラフ、第３図〜第16図はそれぞれ方
法１〜14に係るアンホテリシンＢ製剤の異なる画分の場
合のスクロース密度勾配遠心分離プロフィールを示すグ
ラフである。
フロントページの続き (72)発明者 アンリー、ワンティエ ベルギー国ドゥール、リュ、ドゥ、ラ、 ドレーブ、24 (72)発明者 アンドレ、トルーエ ベルギー国ビンクスル／ヘレント、プル ディクヘレンベルグ、29 (56)参考文献 特開 昭63−208515（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−504642（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 9/107 A61K 9/127

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リン脂質に対して親和力を有する水不溶性
    物質と少なくとも１種のリン脂質との微結晶外観の脂質
    微粒子（微粒子は水溶液中の懸濁液中で安定である）を
    製造する方法において、 （ａ）前記物質および前記の１以上のリン脂質を前記物
    質および前記の１以上のリン脂質用の共通の有機溶媒に
    溶解し、 （ｂ）前記物質および前記の１以上のリン脂質の溶液を
    不溶化が沈殿の形態で生ずるような量の水溶液と混合
    し、 （ｃ）溶媒を除去して微粒子を含有する水溶液を微小懸
    濁液の形態で回収する ことを特徴とする微結晶外観の脂質微粒子の製法。
  2. 【請求項２】１以上のリン脂質対前記物質のモル比が、
    ２未満、好ましくは0.5〜１である、請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】前記物質が、ポリエンマクロライド抗真菌
    剤から選ばれる、請求項１ないし２のいずれか１項に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】前記物質が、ナイスタチン、アンホテリシ
    ンＢおよびおよびそれらの抗真菌性誘導体から選ばれ
    る、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】リン脂質が、ホスファチジルコリン、ジミ
    リストイルホスファチジルコリン（DMPC）、ジステアリ
    ルホスファチジルコリン（DSPC）、ジパルミトイルホス
    ファチジルコリン（DPPC）、ホスファチジルエタノール
    アミン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスフ
    ァチジルセリン（DPPS）、ホスファチジルイノシトー
    ル、ホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホス
    ファチジルグリセロール（DMPG）、ジステアリルホスフ
    ァチジルグリセロール（DSPG）、３′−Ｏ−リシルホス
    ファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロー
    ルまたは或いはコレステロールエステル、例えば、吉草
    酸コレステロール（単独または混合）である、請求項１
    ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】リン脂質が、モル比5:5から9:1のホスファ
    チジルコリンまたはジミリストイルホスファチルコリン
    とジミリストイルホスファジルグリセロールとの混合物
    である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】リン脂質と前記物質との溶液の有機溶媒
    が、中間極性の有機溶媒、例えば、メタノール、DMF、D
    MA、プロピレングリコールまたはエタノールから選ばれ
    る、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】水溶液が、純水、食塩水溶液または糖の溶
    液である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】水溶液が、１〜10重量％、特に５重量％の
    ラクトースの溶液である、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】水溶液が、リン酸ナトリウム６％ラクト
    ース緩衝液である、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】物質が酸または塩基でイオン化された時
    に有機溶液中でより大きい溶解度を示す時には、 （ａ）前記物質および前記の１以上のリン脂質を塩基性
    または酸性媒体中の共通の有機溶媒に溶解し、 （ｂ）得られた溶液を水溶液と混合して沈殿を得、 （ｃ）それぞれ酸または塩基を加えることによって、溶
    液を中和し、 （ｄ）溶媒を除去して微粒子を含有する水相を微小懸濁
    液の形態で回収する、 請求項１ないし10のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記物質がアンホテリシンＢ、ナイスタ
    チンなどのポリエン型マクロライド抗真菌剤から選ば
    れ、工程（ａ）において塩基性媒体中のメタノール性溶
    液またはプロピレングリコール溶液中または酸性媒体中
    のDMFまたはエタノール溶液中、または或いは中性また
    は酸性媒体中のDMA溶液中に溶解する、請求項11に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】工程（ａ）において酸または塩基の使用
    量が、有効物質の量と比較して酸または塩基１〜1.5当
    量であり且つ工程（ｃ）においてそれぞれ同量の塩基ま
    たは酸を使用して中和を実施する、請求項11または12に
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】混合物を工程（ｄ）前に加熱する、請求
    項１ないし13のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記物質および前記の１以上のリン脂質
    からなることを特徴とする請求項１ないし14のいずれか
    １項に記載の方法によって得られた微粒子。
  16. 【請求項１６】本質上遊離有効物質および遊離リン脂質
    を含まず且つ微粒子は大きさが均一であることを特徴と
    する請求項１ないし15のいずれか１項に記載の方法によ
    って得られる微粒子の製剤。
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