JP2807706B2 - クロマトグラフィー用被覆媒体 - Google Patents

クロマトグラフィー用被覆媒体

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JP2807706B2 JP3503592A JP50359291A JP2807706B2 JP 2807706 B2 JP2807706 B2 JP 2807706B2 JP 3503592 A JP3503592 A JP 3503592A JP 50359291 A JP50359291 A JP 50359291A JP 2807706 B2 JP2807706 B2 JP 2807706B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は，疎水性表面へ施す親水性被覆物の製造に関
する。さらに詳細には，本発明は，蛋白質を分離するた
めのクロマトグラフィー用媒体として有用であり，且つ
蛋白質に対して相容性のある表面として有用である誘導
体化可能な親水性表面被覆物を有する疎水性物質に関す
る。
発明の背景 高性能液体クロマトグラフィーのための支持体物質
は，化学的・機械的に安定でなければならない。架橋ポ
リスチレン等の硬質不活性ポリマーを使用すると，操作
圧力と流量を増大させることが可能となる。しかしなが
ら，このような樹脂と蛋白質との間の疎水性相互作用は
かなり強力であることが多いので，蛋白質は，その吸着
時又は溶離中に変性を起こす。従って，こうしたクロマ
トグラフィー用ポリマー充填物質を蛋白質の分離に適切
に使用できるようにするためには，ポリマー充填物質の
疎水性表面に後処理を施さなければならない。
クロマトグラフィー用カラム層に液体を強制的に通す
ことがしばしば必要となる。なぜなら，液体移動相は，
重力下では流れがあまりにも遅すぎて，許容しうる分離
時間が得られないからである。この流量の問題は，分離
度を高めるのによく用いられる微粒子状充填物質を使用
するとさらに深刻となる。液体クロマトグラフィー（す
なわち高速液体クロマトグラフィー又はHPLC）では，速
やかな分離を行うためには100気圧以上の圧力を使用す
るのが普通である。ソフトゲル充填物質は，数気圧以上
の圧力には耐えられないため高圧使用には適しておら
ず，従って硬質の物質に置き換えられることが多くなっ
てきている。
ある分子の親水性部分と疎水性ポリマー上の特定部位
とを反応させて，前記疎水性ポリマーに親水性の表面特
性を付与することは，少なくとも理論的には可能であ
る。このような後被覆物質（post coated materials）
−しばしば外被保持物質（pellicular materials）ある
いは外被保持支持体（pellicular supports）とも呼ば
れている−は，ベースポリマーが，簡単に誘導体化され
た多くの反応性基を有している場合に容易につくること
ができる。このアプローチの１つの例は，スチレンをア
ルキル化し，次いで重合を行ってポリスチレン誘導体を
生成させ，引き続きポリオキシエチレンとの間に表面反
応を起こさせる，というものである。
もう１つの例は，ポリメタクリレートの誘導体を合成
することである。このポリマーの基本的な疎水性は，エ
ステル化により表面に高い親水性の基を導入すれば変え
ることができる。このような親水性基は通常ヒドロキシ
ル基及び／又はエーテル基を含み，こうした親水性基を
有する物質としては，例えば，グリセロール，エチレン
グリコール，ジエチルアミノエタノール，トリメチルエ
タノールアミノグリコール酸，及びヒドロキシエチルス
ルホン酸などがある。しかしながら，これらの物質は，
両極端のpH値（クロマトグラフィー用媒体を再生するの
に通常必要とされるpH値）にて処理されると，エステル
結合の加水分解を起こしたり，媒体の特性低下をきたし
たりする。
硬質・不活性で疎水性物質の表面が，こうした誘導体
合成を可能にするだけの充分に反応性の高い基を有して
いるとしても，一般には当該特性は，先ず第一にこのよ
うな支持体に変化させるための主要な理由と矛盾するこ
ととなる（すなわち不活性である）。しかしながら，従
来技術によれば，被覆物と支持体との間に直接共有結合
を形成させる必要なく，真に不活性のポリマー粒子上に
被覆物を与える方法が開発されている。
疎水性支持媒体の表面特性を変えるある１つの例によ
れば，水溶性の界面活性剤をシリカベースの逆相充填物
質に吸着させている〔チャング（Chang）らによる“J.C
hrom,V.319,pp.396−399,1985"を参照〕。界面活性剤
は，疎水性の長い尾（tail）と，親水性のバルキーな頭
（head）を有する。尾がいったん支持体に吸着されると
親水性の頭が疎水性の表面を覆い，従って蛋白質は結合
することができなくなる。小さな分子は疎水性区域中に
入り込むことができ，吸着された状態の被覆物は極性溶
媒中でのみ安定である。さらに，界面活性剤が吸着剤表
面から浸出したり，あるいは高疎水性の蛋白質が界面活
性剤分子に置き換わったりすることもあり，これにより
支持体の性能低下をきたすこととなる。
米国特許第4,245,005号明細書は，ポリエチレンイミ
ンの外被を有する多孔質支持体を製造するための優れた
方法を開示している。帯電したポリマー分子は，静電力
により反対電荷の支持体表面に引きつけられる。いった
ん吸着されると，ポリマー物質は当該場所において架橋
反応を行い，従って溶媒抽出,pHの変化，あるいは溶離
用緩衝液への暴露などによる浸食を受けにくくなる。こ
の方法は，カチオン樹脂（アニオンを交換する）の製造
に対しては適切であるが，他のタイプのクロマトグラフ
ィー手順に有用な，クロマトグラフィー用有機充填物質
の調製に対しては実際的ではない。
発明の要約 本発明は，誘導体化可能なクロマトグラフィー用支持
体及び蛋白質に対して相容性のある表面を，疎水性ポリ
マーから調製するための方法を提供する。本発明の方法
では，疎水性の表面に分子層を吸着させ，次いで架橋反
応を起こさせて，付着性の親水性表面を得る。このこと
は，共有結合によってフレキシブルな状態で繋がった疎
水性領域と親水性領域の両方を有する溶媒和化合物を含
有した，疎水性表面に関して親水性である比較的極性の
液体と，疎水性表面とを接触させることによって達成さ
れる。本化合物の疎水性領域は，従来の疎水性−疎水性
相互作用（hydrophobic−hydrophobic interaction）に
よって疎水性表面に結合し，また親水性領域は，表面か
ら外側に向かって比較的極性の液体相中に延びている。
これにより疎水性表面上に吸着された被覆物が得られ，
従って，埋め込まれた疎水性領域の上に重なり合った形
の親水性基からなる外側カーペットが得られる。次い
で，吸着された被覆における隣接分子が当該場所にて架
橋されて，疎水性表面を覆った連続的な親水性皮膜が得
られる。
吸着される化合物は，ヒドロキシル基，エポキシ基，
ハロゲン基，又は他の反応性側基を含んでもよい。本発
明の方法は，これらの側基にて連続的な親水性皮膜を誘
導してアニオン交換クロマトグラフィー，カチオン交換
クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー，サイズ
排除クロマトグラフィー，親和クロマトグラフィー，又
は他のタイプのクロマトグラフィー用の媒体を得るさら
なる工程を含んでもよい。
吸着相を付着させるのに使用される液体は，被覆用化
合物があまり溶解しないよう，その親油性／親水性を調
節して配合するのが好ましい。これによって，溶質の疎
水性領域は，疎水性表面及び溶質と相互作用を起こしや
すくなり，親水性領域が疎水性表面から外側に向かって
延びた状態で，固体／液体界面にて体積する。
架橋工程は，親水性領域，疎水性領域，又はその両方
を含んだ反応性基と架橋剤とを反応させることによっ
て，あるいは隣接した反応性基間の反応を直接促進する
触媒を導入することによって遂行することができる。吸
着用化合物は，オリゴマー；コポリマー（例えばブロッ
クコポリマーやターポリマー）等のポリマー；又は表面
上の所定の場所で重合及び架橋する，複数領域（multid
omein）をもった重合可能な化合物；のいずれであって
もよい。
吸着用化学種の親水性領域は，ヒドロキシル基，エポ
キシ基，又はエーテル結合を含んでいるのが好ましい。
疎水性領域は，ハロゲン化物又は炭化水素を含んでいる
のが好ましい。疎水性支持体は，有機物又は無機物のい
かなる疎水性物質であってもよいが，硬質で不活性の有
機合成ポリマー物質（例えばポリスチレンや架橋ポリス
チレン等）が好ましい。吸着用化学種が複数領域を有す
る重合可能な化合物である場合，本発明の方法は，表面
上で当該化合物を重合させるさらなる工程を含む。
本発明はさらに，疎水性表面を連続的な親水性皮膜
（疎水性相互作用と架橋によって表面に結合）で被覆し
て得られる支持体を含んだ，蛋白質溶液との接触におい
て有用な親水性物質を提供する。親水性区域における皮
膜の表面密度は，疎水性区域と疎水性表面を覆いかくす
に足る密度であるのが好ましい。さらに皮膜は，共有結
合部分（例えば種々の長さの炭化水素類）；カチオン基
（例えば，アミン，イミン，第四アンモニウム塩，ホス
ホニウム塩，もしくはスルホニウム塩）；アニオン基
（例えば，サルフェート，スルホネート，カルボキシ
ル，及びホスフェート）；又は結合蛋白質（例えば蛋白
質Ａ）が繋がるよう設計された部分；を含むよう誘導す
ることもできる。
本発明の目的は，浸食を受けにくく，本質的にいかな
る疎水性物質にも適用することができ，蛋白質水溶液と
の相容性があり，そしてpHが少なくとも２から11まで安
定である，疎水性支持媒体の表面上にて所定の場所で架
橋された安定な親水性層を提供することにある。本発明
の他の目的は，高い機械的強度と化学的安定性を有す
る，改良されたクロマトグラフィー用親水性支持体を提
供することにある。本発明の他の目的は，疎水性相互作
用によって支持体上に薄い層を吸着させ，そして前記層
を支持体に架橋結合させて親水性被覆物を得る方法を提
供することにある。
本発明の上記目的や他の目的及び特徴は，図面を参照
しつつ以下の説明を読めば明らかとなろう。
図面の簡単な説明 添付の図面は，本発明，及び本発明の原理を実際的に
適用する上でこれまで考案された最良の仕方に従って得
られた結果を示している。
図1Aと図1Bは，親水性溶液（Ａ）及び疎水性溶液
（Ｂ）にて疎水性表面と接触しているポリマーの概略図
であり，このときＸは疎水性部分を表わし，プラス記号
はカチオン基を表わし，そして黒丸はヒドロキシル基を
表わす。
図2A,2B,及び2Cは，疎水性支持体の存在下において溶
液中に配置されている複数領域保持部分の形態を示して
いる。低イオン強度溶液中の種々のポリマーにおける帯
電群（白ヌキ丸）の相互反発，及び疎水性領域（Ｘで示
されている疎水性部分を特徴とする）と疎水性表面との
関連に注意のこと。
図３は，注入番号とピーク高さとの関係を示したグラ
フである。使用したサンプルはリゾチームであり，ポリ
スチレン−ジビニルベンゼン支持体をエピクロロヒドリ
ン−グリシドールコポリマーで被覆したものに対してこ
のサンプルを検討した。移動相:20mM MES,pH6,流量:1ml
/分．カラム:4.6×50mm.注入容積:1mg/mlの濃度にて20
μl,全注入容積は20μｌ〜400μl. 図４は，実施例1Aに記載の方法によってつくられた強
力なカチオン交換体に関するテスト蛋白質の分離状況を
示している。移動相:A:20mM MES,pH6;B:A＋0.5M NaCl.
グラジエント:20分にて０〜100％．カラム:4.6×50mm.
流量:1ml/分．注入容積:20μl. 図５は，実施例1Bに記載の方法によってつくられた強
力なカチオン交換体に関するテスト蛋白質の分離状況を
示している。移動相:20mM MES,pH6;B:A＋0.5M NaCl.グ
ラジエント:20分にて０〜100％．カラム:4.6×50mm.流
量:1ml/分．注入容積:20μl. 図６は，実施例1Cに記載の方法によってつくられた強
力なアニオン交換体に関するテスト蛋白質の分離状況を
示している。移動相:A:20mMピペラジン,pH6;B:A＋0.35M
NaCl.グラジエント:20分にて０〜100％．カラム:4.6×
50mm.流量:1ml/分．注入容積:20μl. 図７は，実施例1Dに記載の方法によってつくられた強
力なアニオン交換体に関するテスト蛋白質の分離状況を
示している。移動相:A:20mMピペラジン,pH6;B:A＋0.35M
NaCl.グラジエント:20分にて０〜100％．カラム:4.6×
50mm.流量:1ml/分．注入容積:20μl. 図８は，ドデシル−ポリグリシドールエーテルで被覆
したポリスチレンビーズを充填したカラムに関して，ウ
シの血清アルブミン（BSA）とオボアルブミン（OVA）に
対する注入番号とピーク高さとの関係を示している。移
動相:0.05Mのリン酸塩緩衝液,pH6.8.カラム:4.6×50mm.
流量:1ml/分．注入容積:4mg/mlの濃度にて20μl. 図9Aと図9Bは，ドデシル−ポリグリシドールエーテル
で被覆したポリスチレンビーズを充填したカラムに種々
の蛋白質を通したときの，リン酸塩緩衝液のイオン強度
と保持時間との関係を表わしたグラフである。サンプ
ル：オボアルブミン（OVA），ウシの血清アルブミン（B
SA），リゾチーム（LYSO），及びシトクロムＣ（Cyto
C）。移動相：リン酸塩緩衝液,pH7.カラム:4.6×50mm.
流量:1ml/分． 図10は，塩濃度の増大と保持時間との関係を表わした
グラフであり，実施例３に記載の方法でつくられた被覆
樹脂の親水性を示している。カラム:4.6×50mm.流量:0.
5ml/分，検出:UV254nm. Ａ）NaCl,50mMのリン酸ナトリウム緩衝液中,pH7 Ｂ）(NH4)2SO4,50mMのリン酸ナトリウム緩衝液中,pH7 図11は，実施例３にて示した親水性の被覆ポリスチレ
ン−ジビニルベンゼンを過マンガン酸塩−過ヨウ素酸塩
で酸化することにより得られる弱いカチオン交換体に関
して,6種類の蛋白質の分離状況を示したクロマトグラム
である。カラム:5×0.41cm I.D.（1000Å,15〜25μ
ｍ）．移動相:A:0.02Mトリス及び0.02Mクエン酸緩衝液
（pH5.8）;B:A＋0.5M NaCl.流量:1.0ml/分；グラジエン
ト:20分にて０〜100％．カラム背圧:10気圧．検出:UV25
4nm.ピークの識別:1:オボアルブミン;2:ミオグロビンか
らの不純物;3:ミオグロビン;4:α−キモトリプシノゲン
A;5:リゾチーム；及び6:リゾチームからの不純物． 図12は，実施例４に記載の方法で調製した弱いカチオ
ン交換体に関して，標準的な蛋白質の分離状況を示した
クロマトグラムである。移動相:A:0.05Mのリン酸塩緩衝
液,pH7;B:A＋1M NaCl.流量:1ml/分，グラジエント:20分
にて０〜100％．カラム:4.6×50mm.流量:1ml/分．注入
容積:25μl. 説明 本発明は，疎水性の領域もしくはセグメントと親水性
の領域もしくはセグメントとを画定した形で有している
分子を，疎水性−疎水性相互作用によって疎水性支持体
の表面上に吸着させ，次いで当該場所にて架橋を起こさ
せて永久的な親水性皮膜を得る，という方法を提供す
る。こうして得られる複合物質は，不活性であり，親水
性であり，そして水に対して湿潤性である。多くの場
合，出発原料として使用される疎水性の支持体及び被覆
用化合物は，それぞれ水に対して湿潤しない，及び水に
対して溶解しない，という程度の充分な疎水性を示す。
しかしながら，こうして得られる外被保持支持体は，親
水性であって且つ水に対して湿潤性である。この見かけ
上矛盾する結果は，吸着された化学種の疎水性区域と下
側に存在する支持体の疎水性表面が，親水性部分の暴露
された連続的カーペットの下に埋め込まれた形の外被保
持物質が得られるよう，ある特定のポリマー又は重合可
能な物質の微細構造と立体的な特性を利用することによ
って達成される。こうしたアプローチにより，吸着され
た被覆物の内側の疎水性区域，及び支持体表面上の疎水
性区域の，完全又は部分的なマスキングが可能となる。
従って，水溶液がこの外被保持物質の表面を均一に湿潤
し，溶解している蛋白質の疎水性パッチ（hydrophobic
patches）は疎水性−疎水性相互作用の破壊的な影響を
受ける必要がない。
このタイプの被覆物は，被覆すべき表面に対して親水
性であり,2つの重要な化学的性質を有する溶質を含んだ
真正溶液（true solution）に疎水性表面を暴露するこ
とによって，本質的にいかなる疎水性表面に対しても調
製することができる。第一に，該溶質は，かなり高い疎
水性を有していて且つ共有結合によりフレキシブルに相
互接続されている区域もしくは領域，及びかなり高い親
水性を有している区域もしくは領域を含んでいなければ
ならない。第二に，該溶質は，その後に施される架橋反
応のための反応部位として作用する反応性部分を含んで
いなければならない。
図２は，このような溶質に暴露された疎水性表面の立
体化学を概略的に示している。疎水性側基（Ｘで表示）
を有する複数の区域もしくはブロック，及び親水性側基
（白ヌキ丸で表示）を有する複数の区域もしくはブロッ
クで構成されたポリマーを例として示している。図面か
らわかるように，溶質は，疎水性／疎水性相互作用によ
り疎水性表面にて吸着する。吸着速度は，溶質の濃度に
比例する。支持体の使用可能な表面を覆うに足る量の溶
質が溶液中に存在すれば，疎水性支持体の全暴露表面は
疎水性部分の均一な層で被覆されるであろう。溶質の親
水性部分は，疎水性区域から外側に向かって溶液中に延
びている。分子の大きさ及び溶質における親水性部分と
疎水性部分の相対量に応じて，吸着された被覆物は，疎
水性区域を効果的に覆った形の親水性部分のみを与える
か（図2B），相当程度の疎水性区域を与え続けるか（図
2C），あるいは親水性の“森（forest）”の中に小さい
が使用可能な疎水性パッチを有する表面を与える（図2
A）。
次の製造工程は，疎水性表面上に吸着された隣接分子
をその場で架橋させることであり，吸着された化学種が
互いにこれにより共有結合を起こす。この架橋反応が，
疎水性相互作用と組み合わさると，種々の溶媒及びpHの
両極端値に対して抵抗性を有する表面付着性の外被が得
られる。これらの物質は均一な親水性表面を有するよう
設計することができ，いずれの場合においても，これら
の物質は蛋白質溶液を収容するよう意図された容器やパ
イプ用の表面として適切に機能する。これらの物質はさ
らに，クロマトグラフィー用媒体として（例えばサイズ
排除クロマトグラフィーにおいて）使用することもでき
る。疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいては，疎
水性区域が露出した形で残留している物質を使用するこ
ともできる。
架橋反応を行った後において，吸着された化学種に反
応部位が露出した形で残留している場合，従来の方法と
化学を使用して，あるいは本明細書に開示の新規なアプ
ローチを使用して，これらの反応部位において被覆物を
誘導体化することができる。本発明のアプローチを使用
すると，アニオン交換樹脂やカチオン交換樹脂を得るこ
とができるだけでなく，例えば，親和クロマトグラフィ
ー，サイズ排除クロマトグラフィー，又は中性疎水性相
互作用クロマトグラフィー（neutral hydrophobic inte
raction chromatography）において有用な特殊な樹脂を
得ることもできる。
こうして得られる被覆物は，多くのタイプの混合物の
クロマトグラフィー分離に有用であるが，蛋白質の分離
に特に適しており，そして最も適しているのは，高圧・
高処理量のクロマトグラフィー手順を使用して蛋白質混
合物を分離することである。貯蔵及び船積み中，この媒
体は安定であり，表面被覆物は図1Bの折りたたみ構造に
て配置している。親水性溶液で平衡化されると，表面は
図1Aの膨張構造又は膨潤構造に転化される。
本発明のより狭い態様においては，本発明の被覆プロ
セスは４つの工程に分けることができる。
1.疎水性官能基を含んだ領域と親水性官能基を含んだ領
域とを有する化合物を供給する工程； 2.疎水性物質の表面に疎水性領域を付着させること，及
び極性に基づいて疎水性領域と親水性領域とを界面配向
させることを含む吸着工程； 3.吸着された隣接化学種を互いに結合させて連続的皮膜
を形成する架橋工程；及び 4.任意の誘導工程。
架橋工程を必ず吸着工程の後に行うこと以外は，これ
らの工程の順序はあまり重要ではない。２つ以上の工程
を同時に行うこともできる。上記プロセスの各工程に関
して，以下に詳細に説明する。
支持体物質 本発明は，本質的にはいかなる疎水性支持体物質を使
用しても（すなわち，有機物であっても無機物であって
も）実施することができる。好ましいのは，比較的不活
性の疎水性ポリマー物質である。最も好ましいのは，表
面積の大きい架橋した硬質粒状ポリマー支持体である。
本発明は，支持体物質の形状に関わりなくこうした支持
体物質を被覆するのに使用することができる。従って本
発明は，パイプや容器の表面にライニングを施すのに，
膜の全ての使用可能な表面積を被覆するのに，又は微粒
子状の多孔質ポリマー物質の全表面を被覆するのに使用
することができる。
クロマトグラフィー用として使用するための，現時点
における最も好ましい支持体物質はポリスチレンをジビ
ニルベンゼンで架橋したもの（PSDVB）である。ポリマ
ー化学研究者に知られている他の架橋剤を使用すること
もできる。さらに，ポリエーテル，ポリスルホン，ポリ
アミド，ポリイミド，ポリ（アリーレンオキシド），ポ
リウレタン，ポリカーボネート，ポリエステル，ポリ
（ハロゲン化ビニル），ポリ（ハロゲン化ビニリデ
ン），ポリアクリレート，ポリオレフィン，これらの誘
導体，これらのブレンド物，これらのコポリマー，又は
これらのマルチポリマー（multipolymers）も含めて，
他のタイプの樹脂を使用することもできる。
一般には，表面積の大きな粒子（例えば，公知の乳化
重合法や懸濁重合法にて得られる小さな粒子を溶融させ
ることによって造られるもの）を使用すると最良の結果
が得られる。好ましい特定のPSDVB支持体物質は，英国
シュロップシア州のPLラボラトリーズ社から市販されて
いる。
吸着用化学種 疎水性支持体に施される吸着用化学種には種々の物質
が使用可能である。被覆プロセスにおいて有用な物質の
必須特性は，短い親水性及び疎水性領域が相互分散して
いることである。好ましい有用な物質は，殆どの界面活
性剤の無極性領域より疎水性が高く，従って疎水性表面
に対して界面活性剤よりはしっかりと吸着され，しかも
疎水性支持体から浸出しにくい複数の疎水性領域を含
む。
このような複数領域保持物質の疎水性セグメントは，
極性溶液から疎水性表面へと吸着していく。吸着を起こ
すための駆動力は，疎水性表面と比較的極性の溶媒との
間の疎水性接触エリア（hydrophobic contact area）の
熱力学的最小化によるものである。極性／無極性の接触
エリアが最小になると，吸着が熱力学的に好ましいもの
となる。これとは対照的に，ポリマーの極性セグメント
の吸着に関しては，駆動力は存在しない。−（CH2CH
2O）−，−（CH2CHOHCH2O）−，−（CH2CHOH）−，又は
−（CH2CH(CH2OH)O）−等の比較的親水性のモノマーを
含有したポリマーは，たとえこうした親水性モノマーが
保持されているとしても疎水性表面にて弱く吸着される
にすぎない。これらの基を含有したセグメントが,2つの
吸着可能な疎水性セグメントの間に位置している場合，
親水性セグメントは，図面に示したように表面から離れ
てループを形成する。このループのサイズは，親水性セ
グメントのサイズに応じて異なる。吸着後の表面におけ
るポリマーの形態は，図２に概略的に示したようなルー
プと列の配列からなる形態をとっている。親水性のルー
プが水を取り込むので，被覆された支持体の水分，表面
親水性，及び水に対する湿潤性が大幅に増大し，支持体
の潜在的な疎水性接触エリアは大幅に減少する。
上記の被覆された支持体の表面特性は，親水性ループ
の大きさに関係している。親水性ループの大きさによ
り，被覆物のさらに２つの特性が決まる。すなわち,1）
高極性溶媒中での低いイオン強度における被覆物の膨潤
しやすさ（図1A参照），及び２）親水性ループ中の極性
基が下側の支持体マトリックスの疎水性特性を覆いかく
す能力（図2Aと2Bを参照）。
本明細書にて開示したような大きな親水性ループを生
成するポリマーで被覆されたPSDVB粒子を充填したカラ
ムに生ずる圧力降下の研究によれば，このようなポリマ
ーは，移動相における塩の濃度や有機溶媒の種類に対し
て非常に影響を受けやすい（特に，該被覆ポリマーがイ
オン性基をもった形で誘導されている場合にそうであ
る）。低いイオン強度において電荷を保持した基が相互
反発を起こすと，大きなループの実質的な膨張を引き起
こすことがある。このことはソフトゲル物質の通常の性
質であり，図2Aと2BにおいてPSDVB支持体に関して示し
てある。図からわかるように，短い相互分散セグメント
を有する吸着化学種に対しては，被覆物のかなりの膨潤
は困難である。
大きな親水性ループの第二の特性は，ループが表面の
疎水性部分を覆わない表面からかなり離れて広がること
ができるということである。この挙動により，疎水性の
外部をもった小さな蛋白質（例えばリゾチーム）を，被
覆された支持体の表面にて，埋め込まれてはいるが露出
している疎水性パッチに吸着させることができる。
親水性モノマーと疎水性モノマーとの比により，ポリ
マーの膨潤効率と被覆効率を調節することができる。親
水性モノマー対疎水性モノマーの比が大きすぎる場合，
該ポリマーは，疎水性表面と接触すると大きなループを
生成する。このことは，膨潤と不充分な表面被覆を引き
起こす。親水性モノマー対疎水性モノマーの比が小さす
ぎる場合，該ポリマーは，比較的親水性の溶媒に対して
溶解しなくなる。
現時点において好ましい吸着化学種としては，疎水性
領域及び親水性領域を構成する同種のモノマーのブロッ
クを含み，そしてさらに架橋反応と任意の誘導体合成に
適した複数の反応性基を含んだコポリマー，ターポリマ
ー，又はマルチポリマー等がある。これまでのところ，
エピクロロヒドリン−グリシドールコポリマーやポリア
クリル酸−グリシジルエステルコポリマー等の化学種を
生成させるのに，アクリル樹脂とポリエーテルの化学を
使用して最良の結果が得られている。オリゴマー物質も
使用することができ，架橋反応後においては，同等のモ
ノマー組成を有するより大きな化学種とほぼ同等の性質
をもつ。オリゴマー物質は，溶解させやすい点からも好
ましい物質である。ポリマーやオリゴマーではないが，
疎水性表面上にて重合及び／又は架橋させることのでき
る化学種も，使用することができる。例えば，親水性領
域を構成する親水性反応性基が側面に位置している炭化
水素鎖又はハロゲン化炭化水素鎖から構成される疎水性
コア区域を含む化合物である。これらのタイプの物質
は，疎水性支持体表面にて吸着されると，所定の場所に
て架橋反応を起こして，均一で且つpHによる影響を受け
にくい外被を生成することができる。この外被により，
前述の特性をもった膨潤性の親水性表面が得られる。こ
のような物質の特定の例は低級アルキルジグリシジルエ
ーテルであり，本化合物は，例えば三フッ化ホウ素を使
用して架橋や重合を起こさせることができる。
吸着 複数領域を含んだ化学種を真正溶液（true solutio
n）から疎水性支持体上に吸着させることによって最良
の結果が得られる。本発明の態様によれば，疎水性領域
をもった被覆用化合物の溶解を可能にするだけの充分な
疎水性を保持しつつ，親水性／親油性のバランスを有す
るような溶媒が選択される。このような溶媒に対して
は，本化合物はごくわずかしか溶解しない。このアプロ
ーチは，疎水性表面への疎水性領域の分配傾向が最大と
なるにつれて吸着を促進し，このとき同時に親水性領域
を可溶化する。水性溶媒が好ましい。被覆用化合物の可
溶化を達成するために，種々の量の水混和性有機溶媒を
水に加えることができる。水混和性有機溶媒の例として
は，ポリエチレングリコール，プロパノール，メタノー
ル，アセトニトリル，及びアセトン等がある。現時点に
おいて好ましい溶媒系は水／ポリエチレングリコール／
プロパノール系である。これらの化合物は，いかなる割
合においても水と混和しうる。このような混合溶媒系を
使用すると，吸着工程を最適化することができる。しか
しながら，吸着工程に対しては満たさなければならない
要件がある。すなわち，溶媒が表面に関して親水性であ
って（表面より疎水性が低いこと），且つ被覆用化合物
を溶解する能力を有することである。
架橋 架橋工程は一般には，隣接分子間に真の共有結合を生
成させるために，当業者に公知の化学反応と処理方法を
使用して行われる。架橋反応の詳細は，吸着化学種の性
質と選択により異なる。架橋反応は，被覆物の誘導体化
のために表面基が残存するよう，比較的低い架橋密度を
与えるように行われる。現時点において好ましい架橋方
法としては，三フッ化ホウ素触媒によりエポキシ基を反
応させてエーテル架橋結合とヒドロキシル側基を生成さ
せる方法；ハロゲン基とヒドロキシル基を強塩基中で反
応させてエーテル架橋結合を生成させる方法（ウイリア
ムソンのエーテル合成）；及びジビニル又は不飽和結合
を複数含んだ他の化合物と，アクリレート，メタクリレ
ート，又は他の不飽和側基とを反応させる方法；等があ
る。
誘導体化 本発明の外被被覆物に対し必要に応じて誘導体化を試
みて，サイズ排除クロマトグラフィー，疎水性相互作用
クロマトグラフィー，金属キレートクロマトグラフィ
ー，強力もしくは温和なアニオン交換クロマトグラフィ
ー，強力もしくは温和なカチオン交換クロマトグラフィ
ー，又は親和クロマトグラフィー等に有用な，種々のタ
イプのクロマトグラフィー媒体を得ることができる。通
常は，これら種々のタイプの分離に有用な基が，当業者
に周知で且つ他のタイプのポリマー支持体を誘導化する
のに用いられる化学を利用して，使用しうるヒドロキシ
ル側基，ハロゲン側基，又はエポキシ部分の形で，架橋
した外被被覆物上に結びつけられている。被覆物上の塩
素基又は臭素基は，例えば以下のような化合物で処理し
て以下のような物質を得ることができる（但しこれらの
例に限定されない）。すなわち,1）種々の長さのポリエ
ーテルで処理して，支持体表面から延びた膨潤性の親水
性触手状物を得る;2）アルカノールで処理して，例えば
C4〜C20の種々の長さのエーテル結合炭化水素を得る;
3）ポリエチレンイミンで処理して，それ自体さらに誘
導体合成のできるカチオン樹脂（アニオン交換体）を得
る;4）第三級アミン〔例えば：N(CH3)2〕で処理して，
強力なアニオン交換樹脂を得る;5）ジエタノールアミン
で処理して，温和なアニオン交換樹脂を得る:6）α−ヒ
ドロキシアルキルスルホネートで処理して，強力なカチ
オン交換樹脂を得る;7）ヒドロキシ酢酸で処理して，温
和なカチオン交換樹脂を得る;8）イミノ二酢酸で処理し
て，金属キレート樹脂を得る；及び９）上記処理の種々
の組み合わせ。ヒドロキシル基やエポキシ基の場合も，
同様な方法で誘導体を合成することができる。抗体や他
の結合蛋白質を，それ自体公知の方法を使用して，免疫
化学的に，静電気的に，又は共有結合的に，被覆物に繋
げることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する
が，本発明がこれらの実施例によって限定されることは
ない。
実施例１ 本実施例の被覆プロセスは,2種のエポキシモノマー，
すなわちエピクロロヒドリンとグリシドールをベースと
している。三フッ化ホウ素を使用してモノマーを重合さ
せて，比較的疎水性のエポキシポリマーを得る。
BF3を使用してエポキシ化合物を重合させると，上記式
に示した線状ポリマーの他に環状ポリマーも形成され
る。モノマー比，すなわちx/y比を変えることにより，
線状エポキシポリマー又は環状エポキシポリマーの疎水
性を変えることができる。本実施例では,0.5〜10の範囲
の比が使用される。x/y比が0.5〜３のコポリマーは，水
に対する溶解性が低い。ポリエチレングリコール／プロ
パノールを含有した水中にコポリマーを分散させ，次い
で英国シュロップシア州のPLラボラトリーズ社から販売
されている，クロマトグラフィー用のジビニルベンゼン
架橋したポリスチレンビーズと混合する。
より具体的に説明すると，“Y"mlのエピクロロヒドリ
ンと“X"mlのグリシドールを15mlのジクロロメタン中に
溶解する。Ｘ＋Ｙを2mlの一定量に保持し，（X:Y）比を
0.5〜５の範囲で変える。好ましい比は0.5である。モノ
マーを溶解した後,50μｌの三フッ化ホウ素を混合物に
加える。室温で24時間重合反応を行った後，溶媒を蒸発
除去する。10mlの水,7mlのポリエチレングリコール，及
び30mlのイソプロパノールを含んだ混合溶媒中に，高粘
度の残留ポリマーを溶解する。溶液を濾過し,3gのポリ
スチレンジビニルベンゼン粒子を加える。こうして得ら
れる懸濁液を短時間超音波処理してから,14時間攪拌す
る。
エポキシポリマーが疎水性表面に吸着される。疎水性
の−CH2Cl基がPSDVB表面に向かって配向し，一方，親水
性の−CH2OH基は溶液に向かって外向きに配向し，下記
に示すように溶媒和されている。
最も満足できる被覆物は,3未満のx/y比を使用すると
得られた。５〜10の比では，あまり満足できるものは得
られなかった。５〜10個のヒドロキシル基が１列になっ
て現れると，これらの親水性セグメントは表面から外に
向かってループを形成するようである。
被覆プロセスの次の工程は，以下の反応に従って，強
塩基中においてエーテル結合を形成させることによって
架橋を起こさせることである。
−CH2Cl＋−CH2OH−CH2−Ｏ−CH2−＋HCl及び／又は 反応時間により，反応中において消費される−CH2Cl
の量が決まる。すべての−CH2Clが消費される前に反応
を停止して被覆物中に−OH基と−Cl基の両方を残存させ
ることができ，これによりこれらの官能基のいずれかを
介してさらなる基を結びつけることができる。
さらに詳細に説明すると，粒子を濾過し，そして50ml
の水で洗浄する。次いでこの湿潤粒子を50mlの3M KOH中
に懸濁し，短時間超音波処理し，そして室温で24時間攪
拌する。粒子を濾過し，水，イソプロパノール，及びア
セトンで順次洗浄し，そして減圧下にて60℃で３時間乾
燥する。
こうして得られる粒子は容易に懸濁する。図３は，リ
ゾチームに対するピーク高さと注入番号（サンプルの累
積容積）との関係を示している。ピーク高さが一連の注
入にわたって大幅には変化しないという点に留意すべき
であり，このことは，媒体の表面上に疎水性パッチが存
在していないことを示している。
固定相配位子を伴った親水性被覆物は，以下に説明す
る当業界に公知の方法を使用して誘導合成することがで
きる。
誘導体化 Ａ）3gのヒドロキシエタンスルホン酸を含有した8mlの3
M KOH中に1gの被覆物質を80℃で14時間懸濁した後，濾
過し，水で洗浄し，次いでイソプロパノールで洗浄する
ことによって，強力なカチオン交換体を得ることができ
る。次いでこの粒子を,3gのブロモエタンスルホン酸を
含有した8mlの3M KOH中にて80℃で14時間懸濁する。溶
液を濾過し，水，イソプロパノール，及びアセトンで洗
浄し，そして自然乾燥させる。図４は，この誘導体物質
を使用したときの，蛋白質試験混合物の典型的なクロマ
トグラフィー分離を示している。
Ｂ）1mlの三臭化リンを含有した30mlの乾燥ジクロロメ
タン中にて1gの被覆物質を懸濁することによって，他の
強力なカチオン交換体を得ることができる。この溶液を
14時間懸濁した後，濾過し，ジクロロメタンで洗浄し，
アセトンで洗浄し，そして自然乾燥させる。次いでこの
乾燥粒子を,3gのヒドロキシエタンスルホン酸を含有し
た3M KOH中にて80℃で14時間懸濁する。溶液を濾過し，
水，イソプロパノール，及びアセトンで洗浄し，そして
自然乾燥させる。図５は，この強力なカチオン交換体を
使用したときの，標準的な蛋白質混合物に対するクロマ
トグラフィー分離の結果を示している。
Ｃ）メタノール中にジメチルエタノールアミンを10％
（v/v）溶解して得られる溶液30mlにて1gの臭素化粒子
を懸濁することにより，強力なアニオン交換体を得るこ
とができる。この溶液を14時間還流した後，粒子を濾過
し，メタノール，水，メタノール，及び最後にアセトン
で順次洗浄し，そして自然乾燥させる。図６は，この強
力なアニオン交換体を使用したときの，標準的な蛋白質
混合物に対するクロマトグラフィー分離を示している。
Ｄ）強力なアニオン交換体を製造する他の方法は,10％
（w/v）のポリエチレンアミンを含有した30mlメタノー
ル中にて1gの臭素化物質を懸濁することを含む。本溶液
を14時間還流した後，濾過し，そしてメタノール，水,
0.1N NaOH,水，及びメタノールで順次洗浄する。次いで
この粒子を,1mlのヨウ化メチルと500μｌのペンタメチ
ルピペリジンを含有した8mlのジメチルホルムアミド混
合物中にて,60℃で14時間懸濁する。溶液を濾過し，ジ
メチルホルムアミド，メタノール，及びアセトンで順次
洗浄し，そして自然乾燥させる。図７は，この強力なア
ニオン交換体を使用したときの，クロマトグラフィー分
離の結果を示している。
実施例２ 2.5mlのドデカノール（ウィスコンシン州ミルウォー
キーのアルドリッチ社）を2.5mlの塩化メチレン中に溶
解することによってドデシルポリグリシドールエーテル
界面活性剤が得られる。数滴の三フッ化ホウ素−エーテ
ル付加物（アルドリッチ社）を加えて，次いで2.5mlの
グリシドール（アルドリッチ社）を，約1.5日〜３日に
わたって反応混合物に徐々に加える。この時間中，本混
合物をRH−SYシンクロナス・ラブ・ポンプ（Synchronou
s Lab Pump）〔ニューヨーク州オイスターベイのフルイ
ド・メータリング社（Fluid Metering Inc.,）〕で連続
的に攪拌する。グリシドールをゆっくり加えることによ
り，それ自身と反応するよりむしろドデカノールと反応
する機会が増大する。反応が進行するにつれて，不混和
性で粘稠な残留物が形成される。グリシドールの添加が
完了した後，塩化メチレン溶液を遠心分離用チューブに
注ぎ込み，粘稠な残留物を塩化メチレンで３〜４回抽出
する。不透明の塩化メチレン洗浄溶液を，最初の反応混
合物と共に遠心分離用チューブに一緒に入れ,1000Gにて
約20分回転させる。これにより，塩化メチレン溶液の透
明な下側層と，粘稠シロップのわずかな上側層が得られ
る。上側層を廃棄し，塩化メチレンを蒸発除去して別の
粘稠残留物を生成させ，次いでジエチルエーテルで３〜
４回抽出して疎水性成分を除去する。ジエチルエーテル
抽出後に残留する無色透明の界面活性剤生成物を減圧乾
燥して，溶媒を除去する。この手順により約1.5gの生成
物が得られる。反応物と溶媒の量，及び反応時間を適切
に調節することによって，生成物の量を変えることがで
きる。
エピクロロヒドリンとの反応によって，架橋可能な部
分を界面活性剤に結びつける。典型的な変性は,1.0gの
界面活性剤を16mlの塩化メチレン中に混合したものに1.
0mlのエピクロロヒドリン（ニューヨーク州ロチェスタ
ーのイーストマン社）を加えることにより達成される。
これにより不透明な溶液が得られる。数滴の三フッ化ホ
ウ素−エーテル付加物を加え，反応混合物を24時間振と
うすると，反応混合物と透明になる。次いで塩化メチレ
ンを蒸発除去し，粘稠な残留物をジエチルエーテルで３
〜４回抽出してエピクロロヒドリンの重合物を除去す
る。これにより約0.5gのエピクロロヒドリン変性界面活
性剤が得られる。この場合，エピクロロヒドリンを使用
して誘導体化が過剰に進みすぎると，ジエチルエーテル
に完全に溶解してしまう変性界面活性剤が得られるとい
うことに留意しなければならない。
イソプロパノール／水系の溶液中にて，ポリ（スチレ
ン−ジビニルベンゼン）HPLC充填物をエピクロロヒドリ
ン変性界面活性剤で被覆する。2.2gの充填物を被覆する
ための典型的な手順は，約2.2gの変性界面活性剤を30ml
のイソプロパノール中に溶解することによって始まる。
界面活性剤溶液が不透明となるまで，水を徐々に加える
（約29mlの水）。次いで充分な量のイソプロパノール
（aml未満）を加えて透明な溶液とする。本溶液中に粒
状PSDVBを分散させ，攪拌しながら一晩放置した。濾過
し,50〜75mlの水で洗浄することによって，粒状充填物
を単離する。次いで，被覆された粒子を50mlの3M NaOH
水溶液中に加えることによって，被覆物の架橋を起こさ
せる。架橋反応は24時間進行する。濾過と洗浄を行う前
に，架橋反応混合物をその沸点近くまで短時間加熱して
もよいが，充分な架橋を達成するのに必ずしも必要では
ないようである。次いで充填物を濾過により単離し，
水，そして水／イソプロパノールの75/25,50/50,25/75,
及び0/100混合物の各100mlで洗浄する。
図８と図９は，本実施例に従って調製した粒子の表面
特性を示している。図８は,2種の蛋白質の量が増大して
もピーク高さが一定であることを示しており，このこと
は，媒体の疎水性が極めて低いことを表わしている。図
9Bは，正に帯電した蛋白質が低いイオン強度にて良好に
結合することを示しており，このことは，媒体がアニオ
ン性であることを表わしている。図9Aは，負に帯電した
蛋白質がイオン強度に関係なく短い一定の保持時間を有
することを示しており，このことは，実質的な正電荷が
存在していないことを表わしている。
実施例３ 450mgのエチレングリコールジグリシジルエーテル（E
DGE）を5mlのジエチルエーテル中に溶解し，この溶液に
1gのマクロポーラスな（macroporous）PSDVB粒子（10μ
ｍ粒子,1000Åポアー）を加える。減圧下で溶媒を蒸発
除去する。得られる生成物は乾燥白色粉末である。EDGE
で被覆された乾燥吸着剤をガラス濾過器に加える。5ml
の三フッ化ホウ素−エーテル付加物を乾燥吸引フラスコ
に加え，モノマー被覆吸着剤を含有したガラス濾過器を
フラスコの上部に取りつける。吸引フラスコのサイドア
ームを介して導入される窒素流れによって，三フッ化ホ
ウ素−エーテル付加物の蒸気を吸着剤を通して上方に穏
やかに吹き流す。４時間後に吸着剤を水に加えることに
よって，架橋反応を停止させる。４時間の酸性（pH1〜
２）水溶液の洗浄により，残留エポキシ基が加水分解す
る。次いで吸着剤をメタノールとアセトンで順次洗浄
し，デシケーター中減圧下にて乾燥する。
表面の親水性を増大させるために，またヒドロキシル
基の数を増大させるために，ヒドロキシル含有表面にグ
リシドール処理を施すことができる。この処理は,2mlの
グリシドールを含有した20mlのメチレン中に1gの当該物
質を分散させることによって行われる。反応容器中の混
合物を攪拌しながら，BF3−エーテル付加物の少量のア
リコートを懸濁液中に加える。２〜３分後に塊状物が生
成し，そして15分後に，樹脂をメタノールと水で順次洗
浄する。
被覆された樹脂粒子を誘導調製するには,1gの樹脂を1
0mlの水中に懸濁する。0.5gのK2CO3を含有した40mlの水
中に,2gのNaIO4と30mgのKMnO4を溶解する。次いで懸濁
液と酸化剤との混合物を，水，濃塩酸，及び再び水で順
次洗浄して中性pHにする。イオン性基のpKaと容量（cap
acity）を求めるのにHCl−NaOH逆滴定が使用される。酸
化条件を調節することによって，約0.5meq/gのカルボキ
シル基が生成される。
図10に記載のデータにおいて，被覆ビーズの親水性が
示されている。誘導調製された充填物のクロマトグラフ
ィー能力が図11に示されている。図10Aは,NaClの濃度が
最大2.0Mまで増大しても,2種の負に帯電した蛋白質に対
する保持容量が一定であるということを示しており，こ
のことは，樹脂上に正電荷が存在していないことを表わ
している。図10Bは,6Mの硫酸アンモニウムに対して保持
容量が一定であることを示しており，媒体の表面上には
実質的な疎水性が保持されていないことを表わしてい
る。
実施例４ PSDVBをベースとした温和なカチオン交換体を調製す
るため,6mlのCH2Cl2（４Åのモレキュラーシーブ上にて
乾燥）を50mlの丸底フラスコ中に移す。1mlのグリシジ
ルメタクリレートを加えて穏やかに攪拌する。試験管中
において,5μｍのBF3−エーテル付加物を2mlのCH2Cl2に
加えることによって，BF3−エーテル付加物の溶液を調
製する。BF3−エーテル付加物溶液を，グリシジルメタ
クリレート溶液に攪拌しながら滴下する。丸底フラスコ
をアルミニウム箔で包み込み，室温で24時間振とうす
る。次に,3mlのイソプロパノールと3mlの水をフラスコ
に加えて反応を停止させる。減圧下にて溶媒を除去し，
やや不透明の溶液が得られるようになるまでPEGと水を
プレポリマーの溶液に加える（約８μｍのPEGと約8mlの
水）。この時点にて,1gのPSDVB粒子をプレポリマー溶液
に加える。５分間超音波処理して脱気した後，この系を
37℃で24時間振とうする。
濾過して50mlのH2Oで３回洗浄した後，プレポリマー
で被覆されたPSDVBをメタクリレート酸性溶液（20ml,1.
7％w/v）中に移し,0.5gの過硫酸アンモニウムを加え
る。N2気流下にて24時間連続的に攪拌しながら反応を行
う。20μｌのテトラメチルエチレンジアミンを加え，反
応をさらに30分継続する。反応は,10μｌのヒドロキノ
ンを加えることにより停止する。濾過し，水（３×30m
l），メタノール（３×20ml），及びCH2Cl2（50ml）で
洗浄した後，粒子を減圧下で一晩乾燥する。
本物質のクロマトグラフィー特性を，図12に記載のデ
ータにより示す。
本発明は，本発明の精神と範囲を逸脱することなく，
他の種々の態様にて具現化することができる。こうした
他の実施態様も以下に記載の特許請求の範囲内に含まれ
る。
フロントページの続き (72)発明者 ヤン，ヤン・ボ アメリカ合衆国インディアナ州47906, ウェスト・ラファイエット，ニミッツ・ ドライブ 113―５ (72)発明者 クック，スティーヴン・イー アメリカ合衆国デラウェア州19809，ウ ィルミントン，イース・ヘイヴェン・ロ ード 3136 (72)発明者 レグニア，フレッド・イー アメリカ合衆国インディアナ州47906, ウェスト・ラファイエット，タッカホ ー・レーン 1219 (56)参考文献 特開 昭62−176547（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−55348（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−28972（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−71837（ＪＰ，Ａ) 米国特許4551435（ＵＳ，Ａ) 米国特許4794002（ＵＳ，Ａ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】疎水性表面を有するクロマトグラフイー用
    媒体上に親水性被覆物を形成する方法であって、 疎水性ポリスチレンポリマー又はコポリマーの表面を有
    する微粒子状ビーズを用意し； 前記疎水性表面と、当該疎水性表面に関して親水性の水
    よりも極性が低く且つ溶媒和化合物を含有する液相とを
    接触させる工程、ここで、前記溶媒和化合物の分子は親
    水性領域に共有的に且つフレキシブルに結合した疎水性
    領域及び架橋性部位を有し、それにより、前記表面上に
    前記溶媒和化合物の分子が付着し、これによって、疎水
    性表面において当該化合物の分子が疎水性表面に最も近
    くて且つ疎水性表面に吸着された前記疎水性領域と、疎
    水性表面から外側に向かって前記液相中に延びる前記親
    水性領域とで配向される；そして 前記架橋性部位において互いに隣接する分子を架橋して
    前記疎水性表面上に付着性の皮膜を形成する工程； を含む前記方法。
  2. 【請求項２】前記領域の少なくとも１つが誘導体化可能
    な部分を含み、前記方法が前記付着性皮膜を誘導化する
    さらなる工程を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記化合物の疎水性領域の前記疎水性表面
    への分配を促進するために、前記化合物が前記液相中に
    わずかしか溶解しないよう前記液相が調製される、請求
    の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記架橋工程が、前記疎水性領域のサブセ
    ットを反応させることによって行われる、請求の範囲第
    １項に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記架橋工程が、前記親水性領域のサブセ
    ットを反応させることによって行われる、請求の範囲第
    １項に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記溶媒和化合物の分子が、前記疎水性表
    面を覆うに足る分子寸法の親水性領域を有する、請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記親水性領域が、ヒドロキシル基又はエ
    ーテル結合を有する部分を含む、請求の範囲第１項に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】前記疎水性領域が、ハロゲン化物又は炭化
    水素を有する部分を含む、請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】前記化合物がマルチポリマーを含み、この
    とき前記疎水性領域が複数の結合した疎水性モノマーを
    含み、前記親水性領域が複数の結合した親水性モノマー
    を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記クロマトグラフイー用媒体がジビニ
    ルベンゼンで架橋したポリスチレンである、請求の範囲
    第１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記化合物がモノマーであり、前記方法
    が、前記モノマーを前記表面上の所定の場所にて重合さ
    せる工程をさらに含む、、請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】前記親水性領域がエポキシ基を含有し、
    前記架橋工程が、隣接分子において存在する前記エポキ
    シ基を反応させることによって行われる、請求の範囲第
    １項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記架橋工程が、前記分子の一方におい
    て存在するハロゲン基と前記分子の他方において存在す
    るヒドロキシル基とを反応させることによって行われ
    る、請求の範囲第１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記架橋工程が、複数の反応性基を含ん
    だ架橋用化合物と前記分子において存在する反応性基と
    を反応させることによって行われる、請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】疎水性表面を有する微粒子状媒体を含
    み、溶液中の蛋白質を分離するのに有用な親水性クロマ
    トグラフイー用媒体であって、当該媒体は、 ポリスチレンポリマー及びポリスチレンコポリマーから
    なる群から選択されるポリマー、及び疎水性相互作用に
    より当該ポリマーに付着している被覆状連続皮膜を含
    み、当該皮膜の個々の分子は親水性領域に共有的に且つ
    フレキシブルに結合した疎水性領域及び架橋性部位を含
    み、このとき前記分子が疎水性−疎水性相互作用によっ
    て前記疎水性表面に吸着され、前記親水性領域が前記疎
    水性表面から外側に向かって配置されそして前記個々の
    分子が前記架橋性部位にて架橋されている、前記親水性
    クロマトグラフィー用媒体。
  16. 【請求項１６】前記親水性領域が、前記疎水性領域と前
    記疎水性ポリマーを覆うに足る表面密度を前記皮膜内に
    て有する、請求の範囲第15項に記載の親水性クロマトグ
    ラフィー用媒体。
  17. 【請求項１７】前記クロマトグラフイー用媒体がポリス
    チレンを含む、請求の範囲第15項に記載の親水性クロマ
    トグラフィー用媒体。
  18. 【請求項１８】前記クロマトグラフイー用媒体が、ジビ
    ニルベンゼンで架橋したポリスチレンを含む、請求の範
    囲第15項に記載の親水性クロマトグラフィー用媒体。
  19. 【請求項１９】前記領域の少なくとも１つが誘導体化し
    得る部位を有する、請求の範囲第15項に記載の親水性ク
    ロマトグラフィー用媒体。
  20. 【請求項２０】前記クロマトグラフイー用媒体が誘導体
    化されている、請求の範囲第15項に記載の親水性クロマ
    トグラフィー用媒体。
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