JP2807213B2

JP2807213B2 - フィブリンの検出方法

Info

Publication number: JP2807213B2
Application number: JP8179239A
Authority: JP
Inventors: ガリー・アール・マツエダ; エドカー・ハバー
Original assignee: JENERARU HOSUPITARU CORP ZA
Current assignee: JENERARU HOSUPITARU CORP ZA
Priority date: 1986-04-14
Filing date: 1996-07-09
Publication date: 1998-10-08
Anticipated expiration: 2013-10-08
Also published as: JPH02502603A; WO1987006263A1; JPH09127108A; US4916070A; EP0249007A2; EP0249007A3; JP2664913B2

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【発明の属する技術分野】この発明は、フィブリンクロ
ット特異的モノクローナル抗体のスクリーン方法および
この方法によりスクリーンされたモノクローナル抗体に
関する。【０００２】【従来の技術および発明が解決しようとする課題】血栓
およびフィブリン沈積のインビボ免疫検出は依然として
重要な臨床的課題である。ひとにおける、深静脈血栓お
よび冠状動脈血栓の検出および局在化は、２つの臨床的
に重要な問題である。【０００３】トロンビンがフィブリノゲンから２対の小
ペプチドを開裂してフィブリンモノマーが形成される
と、血液は凝固する[ブロンバックおよびベスターマー
ク、「アルク・ケミ」１２:１７３(１９５８年)およびド
ゥーリトル、「アドバンシーズ・イン・プロテイン・ケ
ミストリー」２７:１(１９７３年)]。フィブリンモノマ
ーは自然にアグリゲートして不溶性ゲルを形成し、次い
で因子XIIIにより共有結合的に安定する。両者は劇的に
相異するが、フィブリンは、フィブロゲンの元の共有構
造の９８％を保持している。すなわち、抗フィブリン血
清はフィブリノゲンと強く交差反応すること、および一
例のみフィブリン特異的血清が生成された場所が知られ
ていることが理解できる[ボスンヤコビック等、「ランセ
ット」、２:４５２(１９７７年)]。【０００４】フィブリンまたはフィブリノゲンに対して
生じたポリクローナル抗体は、様々な腫よう、特に急成
長型の腫ようの局在化に利用されてきた[デイ等、「ジャ
ーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテ
ュート」、２２:４１３(１９５８年)、ベール等、「キャ
ンサー・リサーチ」、２０:１４８８(１９６０年)、プレ
スマン、「キャンサー・リサーチ」、４０:２９６５(１９
８０年)]。しかしながら、これらの抗体は全てある程度
までフィブリノゲンとの交差反応性を示した。【０００５】フィブリン−フィブリノゲン、フィブリノ
ゲン単独または両ポリペプチドの減成生成物に対するポ
リクローナル抗体は、ひとにおける静脈血栓の検出用に
開発されてきた[ライヒ等、「サージェリー」、６０(６):
１２１１、スパー等、「サーキュレーション・リサー
チ」、XVII３２２(１９６５年)、およびステファン等、
米国特許第４１４７７６５号]。ライヒ等およびスパー
等(前出)の場合、放射能標識抗体はかなりの程度のフィ
ブリン−フィブリノゲン交差反応性を有していた。ステ
ファン等の場合を参照すると、抗血清は、フィブリンお
よびフィブリノゲンに対するプラスミンの作用により形
成されたフィブリンおよびフィブリノゲン初期減成生成
物を用いた免疫学的攻撃により顕在化され、文献にはフ
ィブリノゲンＳ(fg−Ｘ)およびフィブリノゲンＹ(fg−
Ｙ)として示された。【０００６】フィブリノゲンの放射性ヨウ素化による深
静脈血栓の異なる検出方法が、ナイト等[「ジャーナル・
オブ・ニュクリアー・メディシン」、１９(８):８９１
(１９７８年)]により企てられた。しかしながら、この
方法は、深静脈血栓症における血栓の局在化に関して
¹¹¹Ｉnを用いた血小板の標識方法よりも劣ることが判っ
た。【０００７】プラスミノゲンが活性化物質により血しょ
うの活性フィブリン加水分解酵素、プラスミンに変換さ
れると、プラスミンは、その基質、フィブリンに対する
著しい親和性を発現する。オウチおよびワレン、[「サー
ジェリー」、５１(１):４２(１９６２年)]は、放射性同
位元素によりプラスミノゲンを標識し、それをトレーサ
ーとして用いて血管内の血餅を検出するという方式でこ
の親和性が利用され得ることを発見した。しかしなが
ら、¹³¹Ｉ−標識プラスミノゲンのフィブリン加水分解
活性は幾分乏しいものであった(２８.６％)。【０００８】米国特許第４２４５０４０号においてピル
ゲラムは、循環フィブリン初期検出方法に関する改良を
示した[ローランド、「フィブリノゲン・アンド・フィブ
リン・ターンオーバー・オブ・クロッティング・ファク
ターズ」、コラー編、シャッタウエル・フェルラークシ
ュテュッツガルト、１９６３年、並びにキスカーおよび
ラッシュ、『ディテクション・オブ・イントラバスキュ
ラー・クロッティング』、「ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスティゲーション」、５０:２２３５(１９
７１年)]。ピルゲラムの改良は、因子XIII含有グリシン
−Ｃ¹⁴エチルエステルにより放射性標識を可溶性循環フ
ィブリンに結合させる点に存した。しかしながら、フィ
ブリノゲンと交差反応する抗フィブリン抗体の使用は制
限されることが判っている。【０００９】フィブリンに対して特異的なモノクローナ
ル抗体は、ヒュイ等による「サイエンス」、２２２巻、１
１２９頁(１９８３年)に記載されている。さらに同じタ
イプの抗体が、「フィブリン−スペシフィック・モノク
ローナル・アンティボディーズ・ラッキング・フィブリ
ノゲン・クロスリアクティビティー」と題する一般譲渡
された共に出願中の米国特許出願第８２４２２８号(１
９８６年１月３０日付)に記載されている。血栓に対す
る特異性を有する抗体の他の例としては、クドリュク
等、「モレキュラー・イミュノロジー」、２１巻、８９頁
(１９８４年)、ヨーロッパ特許出願第１４６０５０号
(カレベールト、１９８５年６月２６日公開)、発明の名
称「サイト・セレクティブ・プラスミノゲン・アクティ
ベーター・アンド・メソッド・オブ・メイキング・アン
ド・ユージング・レイム」、並びにオーストラリア国特
許出願ＡＶ−Ａ−２５３８７／８４(ブンデセン等)、発
明の名称「モノクローナル・アンティボディーズ・ウイ
ズ・スペシフィシティー・フォー・クロスリンクト・フ
ィブリン・アンド・ゼア・ダイアグノスティック・ユー
ジィズ」が挙げられる。【００１０】高特異性抗フィブリンモノクローナル抗体
およびそれらの非フィブリノゲン交差反応性抗体を産生
し得る合成エピトープ性ペプチド類が要望され続けてい
る。それらの抗体は、血栓のインビボ検出に有用であ
る。【００１１】【課題を解決するための手段】この発明は、フィブリン
特異抗体のスクリーン方法およびこの方法によりスクリ
ーンされたフィブリン-クロット特異性モノクローナル
抗体に関する。【００１２】フィブリン特異抗体のスクリーン方法は、
凝固したフィブリンに優先的に結合する抗体の選択を目
的として完全に交差結合したフィブリンを使用する。こ
の方法によりスクリーンされたフィブリン-クロット特
異性モノクローナル抗体は、フィブリノゲン交差反応性
を伴わない、フィブリンに対するモノクローナル抗体を
産生し得るハイブリドーマセルラインから産生される。
発明者等は、交差結合したフィブリンクロットを使用す
ると、インビトロおよびインビボ血栓との高い結合性を
有するフィブリン-クロット特異性モノクローナル抗体
の得られることを発見した。一般にスクリーン方法で
は、精製クロット全体を固体支持体に固定化する。フィ
ブリン特異性モノクローナル抗体を含むハイブリドーマ
培養培地を固定化クロットと接触させる。次いでフィブ
リン特異性モノクローナル抗体が検出され、放射線免疫
検定法または固相酵素免疫検定法(ＥＬＩＳＡ)によりス
クリーンされ得る。【００１３】この方法によりスクリーンされたフィブリ
ン-クロット特異抗体は、ひとおよび動物における血栓
およびフィブリン沈積のインビトロおよびインビボ検出
に有用である。これらのモノクローナル抗体はまた血栓
溶解剤との複合体として使用され得る。【００１４】【発明の実施の形態】この発明の方法に従いスクリーン
され得る抗体は、フィブリン特異性であり、かつ実質的
にフィブリノゲン交差反応性を伴わない抗体であれば全
て使用され得る。例えば、その特異性を有する抗体は、
ヒュイ等、「サイエンス」、２２２巻１１２９−１１３１
頁(１９８３年)に記載されている。さらに同じタイプの
抗体が、マツエダ等による「フィブリン−スペシフィッ
ク・モノクローナル・アンティボディーズ・ラッキング
・フィブリノゲン・クロスリアクティビティー」と題す
る一般譲渡された共に出願中の米国特許出願第８２４２
２８号(１９８６年１月３０日付)に記載されている。他
のタイプのフィブリン特異性モノクローナル抗体には、
クドリュク等、前出、カレベールト、前出およびベンデ
セン等、前出の抗体があり、前記参考の全部を引用して
説明の一部とする。【００１５】例えば、前述の共に出願中の特許出願は、
この発明において望ましい特異性を有する抗体、および
それらの抗体を産生し得るペプチド類を供給することに
よる前記抗体の製造方法を記載している。一般にこれら
のペプチドは、式Ｈ₂Ｎ−Ａ−Ｂ−Ｃ-Ｄ-Ｅ-Ｆ-Ｇ-ＣＯＲ¹ [式中、ＡはＧly、ＢはＨisまたはＰro、ＣはＡrg、Ｄ
はＰroまたはＶal、ＥはＬeuまたはＶal、ＦはＡspまた
はＧlu、およびＧはＬysまたはＡrgであり(明らかに当
技術分野の熟練者の理解するところであるが、これらの
残基は保護または非保護形であり得る。適当なアミノま
たはカルボキシル保護基が使用され得る(下記参
照)。)、Ｒ¹はＲ²、lys−ＣＯ−Ｒ²、−lys−arg−ＣＯ
−Ｒ²または−lys−arg−glu−ＣＯ−Ｒ²、Ｒ²は−cys
−ＣＯＲ³、ＯＨ、ＯＭまたはＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｒ³はＯＨ、Ｏ
ＭまたはＮＲ⁴Ｒ⁵であり、Ｍは医薬的に許容し得るカチ
オンまたは低級(Ｃ₁-Ｃ₆)分枝状または非分枝状アルキ
ル基であり、Ｒ⁴、Ｒ⁵は同一または異なって、Ｈまたは
低級アルキル基から成る群から選ばれる。]を有するも
のである。【００１６】要するに、これらの化合物は、７〜１１個
の上記アミノ酸残基を含むペプチド類である。好ましい
化合物は、７〜８個のアミノ酸残基を有するペプチド類
[ただし、Ｒ¹＝Ｒ²＝ＯＨ、ＯＭもしくは−ＮＲ⁴Ｎ⁵、
またはＲ¹＝Ｒ²＝cys−ＣＯ−Ｒ³(ただし、Ｒ³はＯＨ、
ＯＭまたは−ＮＲ⁴Ｒ⁵である)]である。Ｃ−末端残基が
システインである場合、これの−Ｓ原子は免疫原性蛋白
質、例えばアルブミンまたはヘモシアニンと置換され得
る。好ましい置換は、マレイミドベンゾイルまたはマレ
イミドベンゾイル-キーホール・リンペット・ヘモシア
ニンによるものである。【００１７】有用なカチオンＭは、アルカリ金属または
アルカリ土類金属カチオン類(すなわち、Ｎa、Ｋ、Ｌ
i、１／２Ｃa、１／２Ｂa等)またはアミンカチオン類
(すなわち、テトラアルキルアンモニウム、トリアルキ
ルアンモニウム、ただしアルキルはＣ₁-Ｃ₁₂であり得
る)である。可変鎖長ペプチド類は、遊離アミン類(Ｎ−
末端上)またはそれらの酸付加塩の形態をとり得る。一
般的な酸付加塩は、ハロゲン化水素(hydrohalic)酸塩
類、すなわちＨＢr、ＨＩ、またはさらに好ましくはＨ
Ｃlである。この発明の可変鎖長ペプチド類は、直鎖形
態であり得、またはさらにそれらは環状ペプチド形態で
あり得る。【００１８】この発明において免疫原として使用される
代表的ペプチド類は、Ｈ₂Ｎ−Ｇly−Ｈis−Ａrg−Ｐro−Ｌeu−Ａsp−Ｌys−ＯＨＨ₂Ｎ−Ｇly−Ｐro−Ａrg−Ｖal−Ｖal−Ｇlu−Ａrg−ＯＨである。【００１９】これらのペプチド類は、０.１−１.０ミリ
モルのアミン／ｇ(ポリマー)を含むコポリ(スチレンジ
ビニルベンゼン)を用いた、メリフィールド[「ジャーナ
ル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ
ー」、８５:２１４９(１９６２年)]並びにスチュワート
およびヤング[「ソリッド・フェーズ・ペプタイズ・シン
セシス」(フリーマン、サンフランシスコ、１９６９年)
２７−６２頁]により記載された公知の固相ペプチド合
成法により合成され得る。化学合成が完了すると、ペプ
チドは、０℃で約１／４−１時間、液体ＨＦ−１０％ア
ニソール処理により脱保護され、ポリマーから開裂され
得る。試薬を蒸発させた後、１％酢酸溶液によりペプチ
ドをポリマーから抽出し、次いで凍結乾燥すると、粗材
料が得られる。これは通常、例えば溶媒として５％酢酸
を用いたセファデックスＧ−１５ゲルろ過技術により精
製され得る。カラムの適当なフラクションの凍結乾燥に
より、均一なペプチドまたはそれらの誘導体を得、次い
でアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体ク
ロマトグラフィー、紫外線吸収分光法、モル旋光度、溶
解度によりそれらの特性を明らかにし、固相エドマン減
成により定量化する[マツエダ、ハーバーおよびマルゴ
リーズ、「バイオケミストリー」２０巻、２５７１頁(１
９８１年)]。【００２０】合成および単離技術は前述の参考文献およ
び米国特許第４２６７８２７号に充分記載されており、
それらを引用して説明の一部とする。ただし、合成中ま
たは合成後、好ましくはシステインは３,４−ジメチル
ベンジル(ＤＭＢ)、アルギニンおよびヒスチジンはトシ
ル(p−トルエンスルホニル、ＴＯＳ)により、アスパラ
ギン酸およびグルタミン酸はベンジル(Ｂzl)により、並
びにリジンは２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル
(２−ＣＢＺ)によりそれぞれブロックされ得るものとす
る。他の保護ブロック基もよく知られており、この発明
で使用され得る。【００２１】感作および／または免疫化、細胞融合、腹
水生成、混合ハイブリドーマの選択またはモノクローナ
ルハイブリドーマのサブクローニングの技術は一般的に
当技術分野においてよく知られている。例えば、コプロ
ブスキー等、米国特許第４１７２１２４号、コプロブス
キー等、米国特許第４１９６２６５号、ワンズ等、米国
特許第４２７１１４５号またはデュイラールおよびホフ
マン、「コンペンディウム・オブ・イミュノロジー」、第
II巻中、『ベーシック・ファクツ・アバウト・ハイブリ
ドーマズ』、シュワルツ編、(１９８１年)参照(これら
を引用して説明の一部とする)。【００２２】一般的に、フィブリン特異性配列を含む精
製エピトープ性ペプチド類は、Ｃ−末端でシステインに
結合することにより、結合架橋、例えばマレイミドベン
ゾイル化(ＭＢ)−キーホール・リンペット・ヘモシアニ
ン(ＫＬＨ)を介した免疫原蛋白質との合成ペプチドの単
一指向性結合を可能にする。他の免疫原性コンジュゲー
トもまた使用され得る(例、アルブミン等)。生成した構
造は、蛋白質の１分子に結合した幾つかのペプチド構造
を有し得る。【００２３】合成ペプチドに対して免疫化された体細胞
株は、任意の適当な免疫化技術により製造され得る。任
意の適当な方法、好ましくは腹腔内、静脈内もしくは皮
下注射または足内パッドを用いて、通常、前述の蛋白質
コンジュゲート形態の抗原を投与することにより宿主を
感作する。アジュバントは免疫化プロトコルに含まれ得
る。ウイルス、細菌または他の細胞もまた使用され得
る。【００２４】蛋白質結合抗原による最初の免疫化の後、
数週間の間隔で定期的に数回のブースター注射が行なわ
れ得る。次に、当技術分野の熟練者の間で公知の手順に
従い、免疫化体細胞が宿主から定期的に得られる。次い
で、各宿主の血しょうに含まれる抗体は、そのフィブリ
ン特異性および／またはフィブリノゲン交差反応性の欠
如に関して試験され得る。高い抗フィブリン応答性を有
する宿主は、通常抗体産生体細胞のドナーとして最も望
ましい。追加量のペプチド−蛋白質コンジュゲートの静
脈内および／または腹腔内注射を繰り返すことにより、
超免疫化することができる。【００２５】次いで、免疫化体細胞、好ましくはひ臓細
胞を別のセルラインと融合することにより、フィブリノ
ゲンと交差反応しない抗フィブリン特異抗体を産生し得
るハイブリドーマを製造しなければならない。融合を目
的とする別のセルラインの選択に際して考慮すべき要素
には、急速で均一な成長特性、成長培地の特定成分での
成長に関する代謝不足、および良好な融合頻度の可能性
も含まれる。悪性細胞は融合に特に適していることが判
った。それらのセルラインが由来する種類もまた重要な
要素である。マウス、ラット、ハムスターおよびひとミ
エローマ株を含む幾つかのセルラインが入手可能であ
り、ハイブリドーマの製造に好ましい。様々な融合剤が
細胞融合の誘発に使用され得る。ポリエチレングリコー
ルおよびウイルス誘発融合は特に有効であり、好ましい
成分である。【００２６】体細胞融合およびハイブリドーマセルライ
ンの確立に好ましい条件は、コーラーおよびミルシュタ
インにより、「ネイチャー」(ロンドン)２５６:４９６(１
９７５年)で報告された条件であり、それらを引用して
説明の一部とする。体細胞の製造に好ましい宿主は、マ
ウス、特にＢＡＬＢ／cまたはＡＪである。体細胞融合
によるハイブリドーマセルライン確立という目的に特に
適した悪性細胞は、ミエローマセルライン、特にＳp２
／０およびＮＳ−１株である。【００２７】所望のモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマの迅速な確認は、全ハイブリドーマ工程にお
いて鍵を握る段階である。既にフィブリン特異性ハイブ
リドーマは特にフィブリンモノマーを用いてスクリーン
されている。発明者らは、交差結合フィブリンクロット
を用いてハイブリドーマ抗体のスクリーニングを行うこ
とによりフィブリンに対して特異的なモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを選択すると、高いフィブ
リン特異性を有する抗体が選択されることを発見した。
この明細書で使用されているクロット抗原は、「交差結
合フィブリンクロット」または「ミニクロット」として示
されている。この発明による方法では、スクリーニング
検定は次の段階で構成される。第１に、クロットを支持
体上で固定させる形で交差結合フィブリンクロット抗原
により適当な表面支持体を被覆する。第２に、固定され
たクロットを、産生されたモノクローナル抗体を含むハ
イブリドーマ培養培地と接触させる。第３に、検出可能
な標識手段の使用によりクロット抗原／モノクローナル
-フィブリン特異抗体複合体をスクリーニングする。こ
の発明で使用され得る検出可能な標識手段としては、放
射線免疫検定法、酵素免疫検定法、蛍光免疫検定法およ
び化学発光免疫検定法が挙げられるが、これらに限定さ
れる訳ではない。これらの検定法は当業界ではよく知ら
れている。検出可能な標識については後述する。【００２８】例えば、放射線免疫検定法の場合、クロッ
ト全体をマイクロタイターウェルに固定する。ハイブリ
ドーマ抗体試料をクロット被覆ウェルと接触させる。イ
ンキュベーションおよび洗浄後、クロット抗原／抗体複
合体を放射能標識抗Ｆab断片抗体と接触させる。ウェル
をリンスし、乾燥後、放射能をガンマカウンターで測定
する[クリンマン等、「アン・イムノル」(パリ)、１２７
Ｃ:４８９(１９７６年)、この内容を引用して説明の一
部とする]。【００２９】精製全クロットに対するハイブリドーマ抗
体の検出に関する固相酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)もま
たこの発明の方法において使用され得る。一般的に、使
用される酵素は抗Ｆab断片抗体とコンジュゲートしたペ
ルオキシダーゼである。精製全クロットをマイクロタイ
ター・ウェルに固定する。ハイブリドーマ抗体培養流体
を各クロット抗原ウェルに加える。インキュベーショ
ン、続いて洗浄サイクル後、適当な希釈率のペルオキシ
ダーゼ-コンジュゲート抗Ｆab断片を加える。カラー試
薬、例えばＨ₂Ｏ₂およびo−ジアニシジン溶液を用いて
酵素結合免疫グロブリン結合を検出する。次いで、光度
計を用いて色の強度が測定され得る。【００３０】フィブリン特異的モノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマ細胞をスクリーンした後、陽性フ
ィブリン特異的ハイブリドーマセルラインが選択され、
ハイブリドーマクローンが培養され得る。クローニング
(クローン)の語は、単一親細胞からのセルラインの成
長、すなわちモノクローンの拡大を達成するプロセスを
包含する。そのようなクローニングは、任意の適当な技
術、例えばアガロース技術等により達成され得る。【００３１】組織培養フラスコで培養された抗体産生ハ
イブリッドは、様々な抗体濃度(普通約１−３０μｇ／
ｍｌの範囲)を有する上清を生じさせる。従って、好ま
しくは炎症性腹水を呈する動物にハイブリッドを移すこ
とにより、高い収量が達成される。好ましくはハイブリ
ドーマの腹腔内注射または他の適当な方法により腹水を
誘発する。ハイブリドーマの保存は重要であり、任意の
適当な技術により達成され得る。好ましい方法は、融合
後、早期に適量のハイブリドーマをサブクローニングま
たは冷凍し、必要に応じて細胞集団を再クローンするこ
とによるものである。【００３２】この明細書で使用されている「ハイブリド
ーマ」の語は、明細書に記載されている体細胞融合技術
により得られたハイブリッド細胞を包含する。こうして
得られたハイブリッドは、フィブリノゲン交差反応性を
欠く抗フィブリン特異抗体の産生能力を有する。【００３３】この明細書で使用されている「フィブリン-
クロットモノクローナル抗体」の語は、単一親ハイブリ
ドーマに由来し、交差結合フィブリンクロットを用いて
この発明の方法によりスクリーンされた、クローン細胞
コロニーの均一株により産生された抗体を包含する。【００３４】一旦選択されたハイブリドーマをクローン
すると、ハイブリドーマから産生または分泌されたフィ
ブリン特異性モノクローナル抗体の単離は、当業界では
常用的な処理工程である。公知技術、例えば塩沈澱、ゲ
ルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー等を用いて実質的
に純粋形態の抗体を得ることができる。【００３５】「実質的に純粋形態」の語は、抗体が本質的
に非モノクローナル抗体不純物、例えば他の蛋白質、異
なる特異性を有する他の抗体、核酸、多糖類、細胞断片
等を含んでいないことを意味する。抗体は可溶性形態で
使用され得るか、または抗体を水性可溶性固相に固定し
て不溶化抗体を得ることができる。【００３６】この明細書で使用されている「エピトープ」
の語は蛋白質固有の特異的アミノ酸配列を指し、この場
合固有の立体配置で並べられた配列は、前記配列に特異
的に結合する抗体をそれらが現れる立体配置で顕現させ
得(例、フィブリン分子)、前記抗体は同じアミノ酸配列
でもそれが異なる立体配置で現れる場合にはその配列と
は結合し得ない(例、フィブリノゲン分子)。【００３７】この発明の方法に従いスクリーンされたフ
ィブリン-クロット特異的抗体は、フィブリンまたはプ
ラスミン断片によりスクリーンされた抗体よりもインビ
トロおよびインビボ血栓との高い結合度を呈する。前記
方法を用い、この発明の方法によりスクリーンされたハ
イブリドーマセルライン、５Ｄ７は、メリーランド、ロ
ックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(ＡＴＣＣ)へ１９８４年４月１４日に寄託され、
ＨＢ９０８７の番号を割り当てられている。【００３８】この発明の方法により製造された抗体は、
それらの抗体に関して通常記載されている多様な適応例
において利用され得る。例えば、これらの抗体は、フィ
ブリノゲンまたは他の蛋白質の存在下、フィブリンに関
する放射線免疫検定法または固相酵素免疫検定法の開発
において使用され得る。それらは最も好ましくはフィブ
リン精製用免疫アフィニティリガンドとして使用され得
る。それらはまた、臨床試料におけるフィブリンのイン
ビトロ検出、血管の血栓またはフィブリン沈積のインビ
ボ局在化、薬剤とのリンケージ(結合)等に使用され得
る。【００３９】１種またはそれ以上の本発明によるモノク
ローナル抗体は、特にインビトロおよびインビボ免疫診
断における使用に適している。インビトロ診断の場合、
抗体は液相中または固相担体に結合した状態で使用され
得る。さらに、これらの免疫検定法においてモノクロー
ナル抗体は様々な方法で検出可能な標識を付され得る。【００４０】この発明のモノクローナル抗体と結合可能
であり、フィブリンの存在の検出に使用され得る多くの
担体が存在する。よく知られた担体には、ガラス、ポリ
スチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラ
ン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロー
ス、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱があ
る。担体の性質は、この発明の用途に適うべくある程度
可溶性または不溶性であり得る。当業界の熟練者の間で
は、モノクローナル抗体との結合に適した他の多くの担
体も知られており、また常用の実験法を用いてそれらを
確かめることも可能である。【００４１】この発明で使用されている「抗体」の語は、
抗原を結合し得るインタクト分子およびそれらの断片、
例えばＦabおよびＦ(ab')₂を包含するものとする。当業
界の一般的熟練者によく知られた多くの相異なる標識お
よび標識方法が存在する。この発明で使用され得る標識
のタイプの例としては、酵素、放射性同位元素、蛍光化
合物、化学発光性化合物、生物発光性化合物および金属
キレート類が挙げられる。当業界の一般的熟練者の間で
は、モノクローナル抗体に結合する他の適当な標識も知
られており、また常用の実験法を用いてそれらを確かめ
ることも可能である。さらに、これらの標識とモノクロ
ーナル抗体との結合は、当業界の通常熟練者に一般的な
標準技術を用いて行なわれ得る。【００４２】この発明のモノクローナル抗体を検出可能
な形で標識し得る手段の一つは、モノクローナル抗体と
酵素の結合による方法である。この場合この酵素は、後
でその基質に曝されると、この基質と反応することによ
り、例えば分光測光または蛍光測定手段により検出され
得る化学部分を生成する。検出可能な標識に使用され得
る酵素の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタ
フィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド
イソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アル
ファ-グリセロ燐酸デヒドロゲナーゼ、トリオース燐酸
イソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ
性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアー
ゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−燐酸デ
ヒドロゲナーゼ、グリコアミラーゼおよびアセチルコリ
ンエステラーゼがある。【００４３】また検出可能に標識されたモノクローナル
抗体の存在は、放射性同位元素でモノクローナル抗体を
標識することにより検出され得る。次に、放射性同位元
素の存在は、ガンマカウンターまたはシンチレーション
計数管の使用といった手段により測定され得る。特に有
用な同位体は、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、
¹⁴Ｃ、⁵¹Ｃr、³⁶Ｃl、⁵⁷Ｃo、⁵⁸Ｃo、⁵⁹Ｆe、⁷⁵Ｓeであ
る。【００４４】またモノクローナル抗体を蛍光化合物で標
識することにより検出可能に標識されたモノクローナル
抗体の結合を検出することも可能である。蛍光標識され
たモノクローナル抗体を適当な波長の光に曝すと、色素
の蛍光によりその存在が検出され得る。最も一般的に使
用される蛍光標識化合物としては、フルオレセイン、イ
ソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フ
ィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデ
ヒドおよびフルオレスカミンがある。【００４５】またこの発明のモノクローナル抗体は、蛍
光放出金属例えば¹⁵²Ｅuまたはランタン系列の他の金属
を用いて検出可能に標識され得る。これらの金属は、金
属キレート基、例えばジエチレントリアミン５酢酸(Ｄ
ＴＰＡ)またはエチレンジアミン４酢酸(ＥＤＴＡ)を用
いて抗体分子に結合され得る。モノクローナル抗体を検
出可能に標識し得る別の方法は、それと化学発光化合物
との結合によるものである。次に、化学反応進行中に生
じるルミネセンスの存在を検出することにより、化学発
光性標識モノクローナル抗体の存在を測定する。特に有
用な化学発光性標識化合物の例としては、ルミノール、
イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミ
ダゾール、アクリジニウム塩およびしゅう酸エステルが
挙げられる。【００４６】同様に、生物発光性化合物もまたモノクロ
ーナル抗体の標識に使用され得る。生物発光は、生物系
において見出される化学発光の特別のタイプであり、こ
の場合触媒性蛋白質が化学発光反応の効率を高める。生
物発光標識モノクローナル抗体の存在は発光の存在を検
出することにより測定される。標識を目的とする重要な
生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよび
エクオリンである。この発明の用途に関すると、この発
明の抗体により検出されるフィブリンは生物学的流体お
よび組織に存在し得る。検出可能であるが未知の量のフ
ィブリンを含有する試料は全て使用され得る。通常、試
料は液体、例えば尿、唾液、髄液、血液、血清等、また
は固体もしくは半固体、例えば組織、糞等である。【００４７】高い感度を提供し得る別の技術は、抗体と
低分子量ハプテンとの結合で構成される。次にこれらの
ハプテンは、第２反応段階により特異的に検出され得
る。例えば一般的には、この方法で上記ハプテン、例え
ばビオチン(アビジンと反応する)またはジニトロフェニ
ル、ピリドキサルおよびフルオレスカミン(特異的抗ハ
プテン抗体と反応する)を使用する。診断インビボイメ
ージングの場合、入手可能な検出器具のタイプは、所定
の放射性核種の選択における主要素である。選択された
放射性核種は、所定のタイプの器具において検出可能な
タイプの崩壊性を有するものでなくてはならない。【００４８】インビボ診断に用いる放射性核種の選択に
おける別の重要な要素は、放射性核種の半減期が、標的
による最大取り込みの時点においてまだ検出可能である
程度には長いが、診断後望ましくない放射能が宿主に残
存する程には長くないことである。理想的には、インビ
ボイメージングに使用される放射性核種は微粒子放射性
を欠くが、１４０−２００ＫeＶ範囲の多数の光子を生
じる。インビボ診断および／またはイメージングの場
合、放射性核種は中間官能基を用いることにより直接的
または間接的に結合され得る。抗体に金属カチオンとし
て存在する放射性同位元素を結合させるのにしばしば使
用される中間基としてはＤＴＰＡがある。抗体分子と結
合し得、インビボ診断で使用され得る金属カチオンの代
表例には、^99mＴc、¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉn、⁹⁷Ｒu、⁶⁷
Ｃu、⁶⁷Ｇa、⁶⁸Ｇa、⁷²Ａs、⁸⁹Ｚrおよび²⁰¹Ｔlがあ
る。【００４９】この発明のモノクローナル抗体はまた、イ
ンビボ診断用途において常磁性同位体により標識され得
る。この方法において特に有用な(磁気共鳴イメージン
グ(ＭＲＩ)技術の場合と同様)元素の例としては、¹⁵⁷Ｇ
d、⁵⁵Ｍn、¹⁶²Ｄy、⁵²Ｃrおよび⁵⁶Ｆeがある。抗体投与
における用量範囲は、血栓の存在を検出し得る程度に充
分大きい範囲である。用量は、有害な副作用、例えば望
ましくない交差反応およびアナフィラキシー反応等の原
因となるほど大きくてはならない。一般的に用量は、患
者の年令、状態、性別および疾病範囲、計器の表示度
数、(あるとすれば)、免疫的寛容性および個々の医者が
調節すべきその他の変数により異なる。用量は０.０１m
g／kg〜５００mg／kg、好ましくは０.０１mg／kg〜２０
０mg／kgの範囲で変化し得る。抗体(複数も可)は注射ま
たは時間をかけた漸進的潅流により非経口投与され得
る。また抗体は、静脈内、腹膜内、筋肉内または皮下経
路により投与され得る。【００５０】非経口投与用製剤は、滅菌水性または非水
性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒
の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレング
リコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能
な有機エステル類、例えばエチルオレエートがある。水
性担体には、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコ
ール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液がある。
非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデ
キストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、
乳酸リンガー溶液または固定油がある。静脈内賦形剤と
しては、流体および栄養補給剤、電解質補給剤、例えば
リンガーデキストロースに基づく薬剤等が含まれる。保
存剤および他の添加剤もまた存在し得、例えば抗菌薬、
酸化防止剤、キレート剤および不活性気体等がある。全
体的としては、「レミントンズ・ファーマシューティカ
ル・サイエンス」、第１６版、マック編(１９８０年)参
照。【００５１】この発明のモノクローナル抗体はキットの
製造に理想的に適している。前記キットは、１個または
それ以上の容器手段、例えばガラス瓶、管等を密閉した
状態で収容すべく区画されたキャリヤ手段を含み得、前
記容器手段は各々使用されるべき免疫検定またはイメー
ジング方法の個別成分を含み得る。キット形態に組み込
まれ得る免疫検定のタイプは多い。この発明の抗体を使
用し得る免疫検定の幾つかの代表例は、きっ抗的免疫検
定およびイムノメトリックまたはサンドイッチ免疫検定
である。【００５２】インビボ用途におけるこの発明のモノクロ
ーナル抗体は、検出可能な手段で標識された形態でキッ
ト中に存在し得るか、またはある程度後の時点で検出可
能な手段により標識され得る。例えば、前記キットは、
この発明のモノクローナル抗体をキレート基、例えば、
ＤＴＰＡと結合させた形で含み得、使用時点でこれらの
抗体を金属イオン、例えば^99mＴcと混合することにより
モノクローナル抗体を検出可能な形で標識する。こうし
て、短い半減期を有する放射性同位元素をさらに効率良
く経済的に使用することができる。また、この発明のフ
ィブリン-クロット特異的抗体を用いて、抗体を血栓溶
解剤に結合させることにより得られる治療用製品を製造
することもできる。【００５３】この明細書で使用されている「血栓溶解剤」
の語は、血栓の溶解に使用される薬剤またはそれを誘発
もしくは開始させる薬剤を全て広い範囲に亙って包含す
るものとする。最も一般的な薬剤は、ウロキナーゼ、ス
トレプトキナーゼおよび組織型プラスミノゲン活性剤
(ＴＰＡ)である。しかしながら、この発明で使用する抗
体により観察される優れた選択性の達成は、他のいかな
る血栓溶解剤でも使用され得ることを示している。【００５４】この明細書で使用されている「結合(coupl
e)」の語は、血栓溶解剤と抗体との安定した結合を広い
範囲で含むものとする。前記結合は共有または非共有で
あり得るが、好ましくは共有結合である。２成分の結合
は、直接結合、または最も一般的には結合剤またはコン
ジュゲート剤による結合であり得る。使用可能な幾つか
の分子内交差結合試薬が存在する[例えば、ミーンズお
よびフィーニー、「ケミカル・モディフィケーション・
オブ・プロテインズ」、ホールデン-デイ、１９７４年、
３９−４３頁参照]。これらの試薬には、例えば、Ｎ−
スクシンイミジル・３−(２−ピリジルジチオ)プロピオ
ネート(ＳＰＤＰ)またはＮ−Ｎ'−(１,３−フェニレン)
ビスマレミド(両者共、メルカプト基に対して高い特異
性を示し、不可逆結合を形成)、Ｎ−Ｎ'−エチレン−ビ
ス−(ヨードアセトアミド)または６個および１１個の炭
素メチレン架橋を有するその他の試薬(メルカプト基に
対して比較的特異性を示す)、１,５−ジフルオロ−２,
４−ジニトロベンゼン(アミノおよびチロシン基と不可
逆結合を形成)、p,p'−ジフルオロ−m,m'−ジニトロジ
フェニルスルホン(アミノおよびフェノール基と不可逆
的交差結合を形成)、ジメチルアジピミデート(アミノ基
に対して特異的)、フェニル−２,４−ジスルホニルクロ
リド(主としてアミノ基と反応)、ヘキサメチレンジイソ
シアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾ
フェニル−p−ジイソシアネート(主としてアミノ基と反
応)、グルタルアルデヒド(幾つかの異なる側鎖と反応)
およびビスジアゾベンジジン(主としてチロシンおよび
ヒスチジンと反応)がある。これらは使用可能な幾つか
の交差結合剤のごく一部にすぎない。【００５５】この発明の抗体／血栓溶解剤結合の達成に
有用な状態および濃度は、当業界の熟練者が公知文献を
参照するかまたは単なる慣用実験法を用いることにより
容易に調節され得る。血栓溶解剤対抗体のモル比は１:
１０〜１００:１、好ましくは１:１〜１００:１の範囲
で変化し得る。【００５６】この発明の結合生成物は、所望の生成物の
血栓溶解量を薬理学的に適当な担体と一緒に含ませるこ
とにより適当な医薬組成物に製剤化され得る。一般的に
は、これらの担体は、水性またはアルコール性／水性溶
液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば食塩水および緩
衝媒質を含む。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶
液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩
化ナトリウム、乳酸リンガー溶液または固定油がある。
静脈内賦形剤には、流体および栄養補給剤、電解質補給
剤、例えばリンガーデキストロースに基づく薬剤等があ
る。保存剤および他の添加剤もまた存在し得、例えば、
抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性気体等があ
る。全体的としては、「レミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンス」、第１６版、マック編(１９８０
年)参照。【００５７】この発明の結合生成物は、血栓溶解治療を
必要とする患者全てに投与され得る。投与は、任意の適
当な方法、例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹膜内経
路、または好適にはカテーテルによる直接注入、例え
ば、冠状動脈内投与により行なわれ得る。投与の用量お
よび頻度は、患者の年令、性別および状態、他の薬剤の
同時投与、計器の表示度数および臨床医が考慮すべき他
のパラメーターにより異なる。【００５８】投与の用量および頻度は、先行技術におい
て血栓溶解剤に使用された値と同等であり得る。しかし
ながら、用量は、一般的には血栓溶解剤単独に関して通
常使用される用量の約０.００１〜０.２倍である。【００５９】例えば、ウロキナーゼ／抗体複合体の場
合、７５キログラムのヒトにおける全身的フィブリン溶
解(肺塞栓症)投与用量は、次の通りである。１．負荷用量：広い範囲：１０分間に亙り１５０−６６
０００単位、中間範囲：１０分間に亙り３３０−３００
００単位。２．維持用量：広い範囲：１２〜２４時間１８７.５−
６６０００単位／時、中間範囲：１２〜２４時間３３０
−３７５００単位／時、結果として合計２４００−１６
５００００単位[シャルマ等、「エヌ・イー・ジェイ・エ
ム」３０６巻、１２６８−１２７６頁(１９８２年)]。【００６０】ウロキナーゼ／抗体複合体の場合、冠状動
脈内投与用量は次の通りである。１．負荷用量無し。２．６０−１２０分間６−１２００単位／分、結果とし
て合計３６０−１４４０００単位の溶液(１.５−３００
単位／ml)[テナント等、「サーキュレーション」、６９巻
７５６−７６０頁(１９８４年)]。【００６１】ストレプトキナーゼ／抗体複合体の場合、
全身的冠状動脈内投与用量は次の通りである。１．負荷用量：２５０−５００００単位。２．維持用量：２４時間１００−２００００単位／時、
または３０〜６０分間に亙り５０００−３０００００単
位のボラス(boluf)注射。【００６２】ストレプトキナーゼ／抗体複合体の場合、
冠状動脈内投与用量は次の通りである。１．負荷用量 : ２分間に亙り５％デキストロース３ml
中０.０１〜６００単位。２．維持用量 : ５％デキストロース１ml中５−１００
０単位〜最大用量(５００−１０００００単位)[ラッフ
ェルおよびブラウンワルド、「エヌ・イー・ジェイ・エ
ム」、３１１巻、７１０−７１７頁(１９８４年)]。【００６３】上述の用量に関する記載において、「単位」
の語は、先行技術における血栓溶解剤の活性に関して使
用された公知で確立された定義を指す。またこの発明の
フィブリン-クロット特異抗体を用いることにより、共
に出願中の米国特許出願第８５１５５４号(本件と同時
出願)に記載されたヘテロ２価抗体を製造することが可
能である。【００６４】この発明に関する総括的記載を行ったが、
後記具体例によりこの発明に関する理解がさらに容易に
なると思われる。ただし、それらの具体例は説明のみを
目的としており、特記しない限り限定を意図するもので
はない。【００６５】【実施例】実施例１フィブリノゲン、可溶性３４０００ダルトンの血しょう
蛋白質をトロンビンにより酵素開裂すると、血液凝固に
おける一次事象として不溶性フィブリンゲルが形成され
る。ゲル形成中、クロット(血餅)は別の酵素、因子XIII
aにより共有結合的に安定化し、隣接するフィブリン(モ
ノマー)分子間でエプシロン(ガンマ−グルタミル)リジ
ル結合を形成する。この変化については広範に研究され
てきたが、交差結合マトリックス内の隣接するフィブリ
ン分子の詳細な指向性は依然として未知である。【００６６】フィブリンモノマーとの結合能力に関して
選択された抗フィブリン抗体は完全に交差結合したフィ
ブリンと最適には結合し得ないという前提に基づいて、
異なる免疫化学戦略を採用した。抗体選択工程において
解離したフィブリンモノマーを抗原として用いる代わり
に、完全に交差結合したフィブリンを、凝固したフィブ
リンに優先的に結合する抗体の選択に用いた。【００６７】この目的のため、精製ひとフィブリノゲン
(カビ、グレードＬ)溶液を因子XIIIaの存在下うしトロ
ンビンにより凝固させた。操作を容易にするために、ク
ロットを可撓性マイクロタイタープレート(ベクトン-デ
ィッキンソンからのファルコン商標)のウェル内で形成
させた。クロット形成後、抗体含有試験溶液を、交差結
合ひとフィブリン「ミニクロット」を含むウェルに注意深
くピペットで移し取った。各抗体の特異性を評価するた
め、抗体試験溶液の相異なる部分をフィブリノゲンと混
合し、同様にフィブリンミニクロット上に置いた。過剰
の試験抗体を洗浄により除去後、第２指標抗体を加え
た。この特定の抗体はマウス免疫グロブリンのＦabまた
は抗原結合断片に特異的に結合し、これを放射性ヨウ素
標識することにより各試験抗体の定量化が可能となっ
た。【００６８】(交叉結合フィブリン検定）完全に交叉結
合したひとフィブリンミニクロットを形成するために
は、２種の溶液を必要とした。７．５０mlの水、０.１
００mlの２モル塩化カルシウム、うしトロンビン０.０
１ml(トロンボスタット、５０％グリセリン５mlにより
再構成、パーク-デービス)および０.１００mlの因子XII
I(１単位、日本国、緑十字社の記載に従い１mlの水に再
構成)を混合することにより、第１の溶液を製造した。
３５mgのひとフィブリノゲン蛋白質(カビ、グレードＬ)
を７mlの１０％グリセリン(水中)に溶かすことにより、
第２の溶液を製造した。まずピペットで２５μlのトロ
ンビン−因子XIIIa溶液を可撓性検定用プレート(ファロ
ン商標、ベクトン-ディッカーソンから３９１１)の各ウ
ェル中に移し取ることにより、ミニクロットを形成させ
た。続いて、２５μlのフィブリノゲン溶液を各々、各
ウェルの底部にピペットでそれを移し取ることによりこ
の溶液の下に敷くよう特別に注意しながら加えた。フィ
ブリノゲン溶液はグリセリンを含有していたため、トロ
ンビンとはあまり混合していない状態であったが、４５
分間に亙り充分量の酵素混合物をフィブリノゲン層中に
拡散させることにより流体層の下でのフィブリンの完全
な交差結合を触媒させた。(クロットを直接空気に曝す
の避けることが重要であった。それは、試験抗体の非特
異結合に関するレベルを高める原因となるためである。)
クロット形成の１時間後、２００μlのブロック溶液を
加えることにより、各ウェルの壁への抗体吸着を最小限
にした。このブロック溶液は、５０mlのガンマ-グロブ
リン不含有うま血清(ギブコ・ラボラトリーズ)を、１ml
当たり０.０５モルのトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン、pＨ７.４、０.１４モルの塩化ナトリウム、０.
００３モルのアジ化ナトリウム、０.００３モルのフェ
ニルメチルスルホニルフルオリド並びに２０カリクレイ
ン阻害単位のアプロチニンおよび２０単位のヘパリンか
ら成る組成の溶液４５０mlと混合することにより製造さ
れた。【００６９】可撓性検定用プレートを逆さにし、過剰の
溶液を吸取紙で吸い取らせることによりブロック溶液を
除去後、抗体含有試験溶液５０μlを３つの個別ウェル
に加えて３通りのデータを得た。各抗体の特異性を評価
するため、等容量の所定の抗体溶液を水で１０倍希釈し
たブロック緩衝液、水中２mg／mlのひとフィブリノゲン
(カビ)および８mg／ml濃度のひとフィブリノゲンと混合
することにより３つの試験溶液を製造した。１５分後、
抗体を含有する溶液および緩衝液のみを含有する陰性対
照をミニクロットウェルに加え、室温で２時間インキュ
ベーションした。この期間の終了時点で、プレートを再
び逆さにして試験溶液を除去した。ミニクロットを０.
１５モル塩化ナトリウムで５回洗浄することにより過剰
の抗体を除去した。７５０００cpmを含む放射性ヨウ素
標識したやぎ抗(マウスＦab断片)５０μlを加えること
により、特異結合した抗体を定量した。プローブの比放
射能は５０μg当たり約０.６ミリキュリーであった。６
０分後、０.１５モルの塩化ナトリウムで５回洗浄する
ことにより過剰の放射性抗体を除去した。個々のウェル
をはさみで切ることにより分離し、４mlの食塩水を加え
た使い捨てのポリカーボネートチューブ(ザルステッ
ト、１２×７５mm)に入れた。１８時間後、食塩水を吸
引し、残留放射能をガンマカウンターで測定した。抗体
試験溶液の代わりに１０％ブロック緩衝液を用いること
により基線を確立した。このレベルは通常約１０００cp
mであった(マイクロメディックス４／６００オートガン
マカウンター)。結合度の大きさが基線標準偏差の大き
さの２倍より大きい場合、免疫反応性が顕著であるとみ
なした。【００７０】ミニクロット実験の一例を第１図に示す。
少なくとも３日間クローンしたハイブリドーマセルライ
ンとインキュベーションしておいた組織培養培地を除去
することにより抗体試験溶液が得られた。前述の通り、
抗体培養上清の３つの個別アリコートを等容量の緩衝
液、２ｍｇ／ｍｌフィブリノゲン溶液および８ｍｇ／ｍ
ｌフィブリノゲン溶液と個別に混合した。フィブリノゲ
ンの最終濃度はそれぞれ０、１および４ｍｇ／ｍｌであ
った。１５分後、各混合溶液の５０μｌアリコート３種
を、ミニクロットを含む３つのウェル中にピペットで移
した。前記と同様に検定を完了し、データを用いて標準
偏差を計算し、第１図に示す通り図に表した。これらの
特定検定は、５Ｄ７と称する抗体がミニクロットに最も
強く結合することを立証した。５Ｄ７の結合レベルは、
ミニクロットの代わりにフィブリンモノマーを用いた選
択工程から誘導された最も特異的な抗フィブリン抗体と
考えられている５９Ｄ８の２倍に近かった。データは、
１ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンの存在下において、５９
Ｄ８はミニクロットにあまり結合し得なかったが、５Ｄ
７は同じ条件下でもミニクロットとの結合を維持してい
たことを示す。５９Ｄ８と比較すると、他の抗体でミニ
クロットに結合したものも存在し、例えば１Ｄ４、１Ｇ
１、２Ｃ７、６Ｂ９および７Ｆ５が挙げられるが、特に
７Ｆ５は１および４ｍｇ／ｍｌの両濃度のフィブリノゲ
ンの存在下でミニクロットに結合した。【００７１】実施例２第２図に示した装置を用いて、ひと血餅における放射性
ヨウ素標識抗フィブリンの取り込みを第３図に示す通り
測定した。実験開始時に、試験抗体溶液をシステムに加
え、３７℃で３つの血餅上に循環させた。異なる時間間
隔で、血餅を個々に試料チャンバから除き、緩衝液でリ
ンスし、１２５−ヨウ素について計数した。結合した抗
体の量は、標識抗体の比放射能および標識抗体対非標識
抗体の割合(常に１:１９)から計算され得た。この計算
に使用された式を後に示す。第３図におけるデータは、
前記抗体が５９Ｄ８の約２倍およびレファレンス抗体、
６４Ｃ５の５倍の効率で結合したことを示す。６４Ｃ５
は、インビボでの血餅の局在化を目的として本発明者ら
により使用されたものである[カウ等、『¹¹¹Ｉnラベル
ド・モノクローナル・アンティ(フィブリン・スペシフ
ィック)アンティボディー: ディテクション・オブ・プ
ルモナリー・エンボリ』、「ジャーナル・オブ・ニュク
リアー・メディシン」、２６巻、２１頁(１９８５年)、
要約]。これらの結果は、ミニクロットスクリーニング
検定により選択された抗フィブリンが実験的血栓に有効
に結合することを確認している。【００７２】(ひと血餅の製造)静脈穿刺により得られた
ひと血液を直ちにアプロチニン(シグマ、セントルイ
ス、ミズーリ)、１００カリクレイン阻害単位(ＫＩＵ)
／ｍｌ(血液)と混合した。１.０ｍｌの血液を１３×１
００ｍｍガラス試験管に入れ、凝固させることにより、
標準血餅を形成させた。血餅を室温で４時間熟成させ、
４℃で１８時間貯蔵した。この熟成工程後、単にガラス
試験管を逆さにすることにより収縮した血餅を移すこと
ができた。【００７３】(抗フィブリンモノクローナル抗体の放射
性ヨウ素化)フィブリン様ペプチド、ベータ(１−７)ペ
プチドリガンドに対するアフィニティクロマトグラフィ
ーにより精製した抗フィブリンモノクローナル抗体５０
μｇを、クロラミン−Ｔ方法により１mＣiのナトリウム
−ヨージド１２５で放射性ヨウ素化した[グリーンウッ
ド等、『ザ・プレパレーション・オブ・¹³¹Ｉ−ラベル
ド・ヒューマン・グロース・ホルモン・オブ・ハイ・ス
ペシフィック・ラジオアクティビティー』、「バイオケ
ミカル・ジャーナル」、８９巻:１１４−２３頁(１９６
３年)]。蛋白質の平均回収率は７５％であったため、う
しアルブミン処理Ｇ−２５セファデックスカラム(ファ
ルマシア社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)か
ら溶出した第１ピークの全放射能を測定後、比放射能を
計算した。【００７４】(抗体とひと血餅のインビトロ結合)３個の
プラスチックチャンバ(内径１３ｍｍ、長さ６６ｍｍの
１２ｍｌ使い捨て注射器の筒)に多孔質ポリエチレンデ
ィスク(カタログ番号ＢＢ２０６２−３５Ａ、ボラブ、
レイク・ハバス、アリゾナ)を取り付け、ぜん動ポンプ
(イスコ社、リンカーン、ネブラスカ)に連続的に接続し
た。ゴム栓を用いることにより、チャンバの気密性を保
った。各栓からゲージ１９の針を挿入し、手術用リュー
エル調整部品によりシリコンゴムチュービングで隣接す
るチャンバに連結した。放射性標識抗体と表面との結合
を最小限にするため、システムを１８時間０.０５モル
のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、０.１５モ
ルＮaＣ２、０.０２％ＮaＮ₃で１:１０に希釈したうま
血清により潅流した。【００７５】実験開始時、７００ＫＩＵのアプロチニン
を含有する燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ:塩化ナトリウム０.
１５モル、燐酸成分０.０１モル、pＨ７.４０)７ｍｌを
各チャンバに加えた。ヨウ素化抗フィブリン濃度は６０
nｇ／ｍｌであった。この値は非標識抗体を加えること
により増加し、最終濃度は１.２μｇ／ｍｌであった。
次に、試験抗体溶液を一定速度、２ｍｌ／分、３７℃で
チャンバからポンプでくみ出した。溶液を３０分間循環
させた後、１つのひと血餅を各チャンバに入れた。【００７６】各実験の開始時、最初の６時間は１時間間
隔および最後は２４時間後に、血餅および溶液の放射能
をガンマカウンター(マイクロメディック・システムズ
・オートマティック・ガンマ・カウンター・モデル４／
６００、ホーシャム、ペンシルベニア)で測定した。各
時間間隔において、血餅を注意深くチャンバから除き、
計数前にＰＢＳで３回洗浄した。循環している試験溶液
の喪失を避けるため、２つの３方向コック栓を備えた各
チャンバに追加の１２ｍｌ注射器を取り付けた。簡潔に
するため、これらの一時的レザーバーについては第２図
に示さない。計数後、血餅をチャンバに戻し、さらにイ
ンキュベーションを行った。下式を用いて各血餅に結合
した抗体の量を計算した。【数１】血餅に結合した抗体の量＝血餅の数×加えられ
た抗体の合計量／溶液における最初の合計数【００７７】実施例３第４図では、実験的静脈血栓用インビボうさぎモデルを
用いて放射性抗フィブリン５Ｄ７の取り込みを抗体６４
Ｃ５の取り込みと比較した。非特異的対照抗体は、「Ｄi
g−２６」、無関係な特異性を有するねずみモノクローナ
ル抗体であった。このモデルは、コレン等により、『ト
ロンボリシス・ウィズ・ヒューマン・エクストリンシッ
ク(ティシュー・タイプ)・プラスミノゲン・アクティベ
ーター・イン・ラビッツ・ウィズ・エクスペリメンタル
・ジャギュラー・ベイン・トロンボシス』、「ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション」、７
１巻、３６８−７６頁(１９８３年)に記載されたうさぎ
血栓モデルから適合させたものであり、これに関しては
後で詳述する。各群において４羽のうさぎを使用した。
誤差バーは各群における標準偏差を表す。【００７８】(インビボ抗体結合)コレン等の記載(前出)
に従い、幾つかの修正を加えてうさぎにおける実験を行
った。ケタミン水酸化物(１００ｍｇ／ｍｌ、ケタラ
ー、パーク-デービス、モリス・プレインズ、ニュージ
ャージー)およびアセプロマジンマレエート(１０ｍｇ／
ｍｌ、フォート・ドッジ・ラボラトリーズ、インコーポ
レイテッド、フォート・ドッジ、アイオワ)の５:１混合
物の筋肉内注射により体重３〜５ｋｇのニュージーラン
ド白うさぎに麻酔をかけた。この最初の用量は体重１ｋ
ｇ当たり０.５ｍｌであり、以後毎時間体重１ｋｇに対
し０.１２ｍｌ／ｋｇの追加を行った。【００７９】首の片側を５ｃｍ切開して頚静脈を露出さ
せた。顔面静脈を除く全ての支脈を永久的に結さつし
た。頚静脈を顔面静脈片側支脈に対して３ｃｍ近位およ
び２ｃｍ遠位の場所で一時的に結さつした。顔面静脈に
ゲージ２２カテーテル(イントラカタ、デザート・メデ
ィカル・インコーポレイテッド、サンデイ、ユタ)を用
いてカテーテル挿入を行った。これにより血液を除去
し、摘出された頚静脈片の洗浄を行った。【００８０】うさぎ血液を末梢耳静脈から採取し、うさ
ぎ血液１ｍｌ対フィブリノゲン１.８ｍｇの割合でひと
フィブリノゲンと混合した(グレードＬ、カビ・ディア
グノスティカ、ストックホルム、スエーデン)。１０Ｎ
ＩＨ単位のうしトロンビン(１０００単位／ｍｌ、トロ
ンボスタット、パーク-デービス)をカテーテルにより注
入し、次いで摘出片が僅かに膨張するまでうさぎ血液−
ひとフィブリノゲン混合物を注入した。１時間のインキ
ュベーションにより血餅を熟成させた後、頚静脈の一時
的結さつを解除した。【００８１】次に、体重１ｋｇに対し４８μｇの用量で
端部の耳を介して抗フィブリン抗体６４Ｃ５(連続的２
−４％¹²⁵Ｉ−６４Ｃ５)を静脈内注射しすることによ
り、血しょう濃度を１.２μｇ／ｍｌとした。抗体注射
直後、反対側の耳静脈から血液を採取して計数を行っ
た。６時間後、うさぎを殺し、実験用血栓を頚静脈から
迅速に摘出した。血餅を容器の壁から剥がし、等張食塩
水で洗浄し、計数した。非標識抗体による標識抗体の希
釈を考慮に入れた後、血餅に結合した抗体を計算した。
第４図はインビボ抗体結合の結果を示す。【００８２】本発明に関して、理解を明確にするための
実例および実施例を用いて幾分詳細に記載したが、後記
請求の範囲から逸脱しない限り、ある程度の変形および
修正が発明の範囲内で実施され得ることは明白である。

【図面の簡単な説明】【図１】完全に交差結合したフィブリンと効果的に結
合する抗フィブリン抗体の選択に関する交差結合フィブ
リン-クロット検定から得られた結果を示す。【図２】インビトロスクリーニング・テストに使用さ
れる装置の概略図を示す。【図３】ひと交差結合フィブリン-クロットに対する
抗フィブリンモノクローナル抗体のインビトロ結合を示
す。【図４】実験用うさぎ血栓に対する交差結合フィブリ
ン-クロットスクリーンモノクローナル抗体５Ｄ７のイ
ンビボ局在化を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献Ｓｃｉｅｎｃｅ，222（1983）ｐ. 1129−1132 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．フィブリノゲン交差反応性を欠く、交差結合フィブ
リンクロット特異性モノクローナル抗体であって、当該
モノクローナル抗体は交差結合フィブリンクロットを使
用するスクリーニングにより得ることが出来るものであ
り、かつ、その交差結合フィブリンクロット結合親和性
はフィブリンモノマーを使用するスクリーニングにより
得ることが出来る、フィブリノゲン交差反応性を欠く、
モノクローナル抗体のそれよりも高いものである、モノ
クローナル抗体。２．検出可能な手段で標識された、請求項１記載のモノ
クローナル抗体。３．試料を下記のモノクローナル抗体と接触させて、当
該抗体が交差結合フィブリンクロットに結合しているか
否かを確認することを特徴とする、上記試料中の交差結
合フィブリンクロットの検出方法：フィブリノゲン交差
反応性を欠く、交差結合フィブリンクロット特異性モノ
クローナル抗体であって、検出可能な手段で標識されて
いるもの；ただし、当該モノクローナル抗体は交差結合
フィブリンクロットを使用するスクリーニングにより得
ることが出来るものであり、かつ、その交差結合フィブ
リンクロット結合親和性はフィブリンモノマーを使用す
るスクリーニングにより得ることが出来る、フィブリノ
ゲン交差反応性を欠く、モノクローナル抗体のそれより
も高いものである。４．検出がインビボで行なわれる、請求項３記載の検出
方法。５．標識が放射性同位元素である、請求項３記載の検出
方法。６．同位元素が^99mＴc、¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉn、⁹⁷Ｒ
u、⁶⁷Ｃu、⁶⁷Ｇa、⁶⁸Ｇa、⁷²Ａs、⁸⁹Ｚrおよび²⁰¹Ｔlか
ら成る群から選ばれる、請求項５記載の検出方法。７．標識が非放射性のものである、請求項３記載の検出
方法。８．非放射性標識が¹⁵⁷Ｇd、⁵⁵Ｍn、¹⁶²Ｄy、⁵²Ｃrおよ
び⁵⁶Ｆeから成る群から選ばれる、請求項７記載の検出
方法。９．検出がインビトロで行なわれる、請求項３記載の検
出方法。１０．検出が拮抗的免疫検定法により行なわれる、請求
項９記載の検出方法。１１．検出がイムノメトリック検定により行なわれる、
請求項９記載の検出方法。１２．標識が放射性同位元素である、請求項９記載の検
出方法。１３．同位元素が³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴
Ｃ、⁵¹Ｃr、³⁶Ｃl、⁵⁷Ｃo、⁵⁸Ｃo、⁵⁹Ｆeおよび⁷⁵Ｓeか
ら成る群から選ばれる、請求項１２記載の検出方法。１４．標識が蛍光性化合物である、請求項９記載の検出
方法。１５．蛍光性化合物がフルオレセイン、イソチオシアネ
ート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニ
ン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよび
フルオレスカミンから成る群から選ばれる、請求項１４
記載の検出方法。１６．標識が蛍光放出金属である、請求項９記載の検出
方法。１７．蛍光放出金属が¹⁵²Ｅuである、請求項１６記載の
検出方法。１８．標識が化学発光性化合物である、請求項９記載の
検出方法。１９．化学発光性化合物がルミノール、イソルミノー
ル、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、ア
クリジニウム塩およびしゅう酸エステルから成る群から
選ばれる、請求項１８記載の検出方法。２０．標識が生物発光性化合物である、請求項９記載の
検出方法。２１．生物発光性化合物がルシフェリン、ルシフェラー
ゼおよびエクオリンから成る群から選ばれる、請求項２
０記載の検出方法。２２．標識が酵素である、請求項９記載の検出方法。２３．酵素はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコ
ッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラ
ーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ-グ
リセリン燐酸デヒドロゲナーゼ、トリオース燐酸イソメ
ラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホス
ファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウ
レアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロ
ゲナーゼ、グリコアミラーゼおよびアセチルコリンエス
テラーゼから成る群から選ばれる、請求項２２記載の検
出方法。２４．１個またはそれ以上の容器を密閉状態で収容すべ
く区画されたキャリアを含む、交差結合フィブリンクロ
ットの検出に有用なキットであって、前記容器が下記の
モノクローナル抗体を担体に結合または非結合の状態で
含んでいる、キット：フィブリノゲン交差反応性を欠
く、交差結合フィブリンクロット特異性モノクローナル
抗体；ただし、当該モノクローナル抗体は交差結合フィ
ブリンクロットを使用するスクリーニングにより得るこ
とが出来るものであり、かつ、その交差結合フィブリン
クロット結合親和性はフィブリンモノマーを使用するス
クリーニングにより得ることが出来る、フィブリノゲン
交差反応性を欠く、モノクローナル抗体のそれよりも高
いものである。２５．モノクローナル抗体が検出可能な手段で標識され
ている、請求項２４記載のキット。２６．フィブリンに反応性を有する第２のモノクローナ
ル抗体を担体に結合または非結合の状態で含む第２の容
器を有している、請求項２５記載のキット。２７．下記のモノクローナル抗体を含んで成る、交差結
合フィブリンクロットの画像形成剤：フィブリノゲン交
差反応性を欠く、交差結合フィブリンクロット特異性モ
ノクローナル抗体であって、検出可能な手段で標識され
ているもの；ただし、当該モノクローナル抗体は交差結
合フィブリンクロットを使用するスクリーニングにより
得ることが出来るものであり、かつ、その交差結合フィ
ブリンクロット結合親和性はフィブリンモノマーを使用
するスクリーニングにより得ることが出来る、フィブリ
ノゲン交差反応性を欠く、モノクローナル抗体のそれよ
りも高いものである。