JP2749484B2 - ビフィドバクテリウム増殖促進物質及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビフィドバクテリウム
の増殖を促進する作用を有する物質、及びその製造法に
関するものである。本発明の物質は、医薬品・食品など
の添加剤、ビフィズス菌培養における増殖促進剤等とし
て有用である。

【０００２】

【従来の技術】腸内細菌に関する研究はここ数年来急速
な発展をつづけており、腸内細菌叢と生体との間には親
密な関係があることが明らかにされている。このような
腸内細菌の中で、乳酸菌の一種であるビフィドバクテリ
ウムは、宿主が何らかの原因で異常をきたした場合に急
激に変動する菌種として知られ、また健康のバロメータ
ーとして重要な細菌の一つであるとされている。また、
ビフィドバクテリウムを助長させる効果のあるビフィズ
スファクター（ビフィズス因子）、例えば各種オリゴ糖
が、整腸を目的とした医薬品・健康食品・機能性食品等
として汎用されている。このオリゴ糖には、フラクトオ
リゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖等があり、
これらはビフィズス菌に対して選択的に作用し、他の細
菌に対しては増殖効果を示し難いことを最大の特徴とし
ていることが知られている。

【０００３】一方、下痢・便秘などの便通異常を改善す
る生菌製剤として、本出願人は、三種類の生菌、具体的
にはストレプトコッカス フェカーリス(Streptcoccus
faecalis) 、クロストリジウム ブチリカム(Clostridi
um butyricum) 、バチルス メッセンテリカス(Bacillus
mesentericus) （バチルス ズブチリス(Bacillus subti
lis) ）を含有した整腸製剤（「ビオスリー」：商品
名）を提案し（特願昭６３−６３６２０号）、臨床応用
されている。この３種の菌からなる整腸製剤は、その投
与により、低ビフィズス菌体質とされる人工栄養児のビ
フィズス菌が増加傾向を示すこと、またＳＤ系ラットに
この整腸製剤を投与した場合に、大腸菌群の有意な低下
とビフィドバクテリウムの増加傾向が認められるなど、
整腸作用の一端を裏付けする効果が確認されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところで、本発明者等
は、上記整腸製剤の作用の研究を重ねる過程で、バチル
ス(Bacilus) 属細菌の代謝産物の中に、ビフィズス菌の
増殖を選択的に速める作用を有し、かつ増殖効果を高め
る物質が存在することを見出した。

【０００５】本発明はかかる知見に基づいてなされたも
のであり、その目的は、ビフィズス菌の増殖を選択的に
速める作用を有し、かつ増殖効果を高めることができる
物質を提供し、またその物質の製造法を提供するところ
にある。

【０００６】

【課題を解決する手段及び作用】上記目的を達成するた
めに本発明者は上記特許請求の範囲の各請求項に記載し
た発明を完成した。本発明のビフィズス菌増殖促進物質
は、例えばバチルス メッセンテリカス(Bacilus mesen
tericus)の代謝産物を含む細菌培養液から、分画分子量
８００〜９００の画分として分画された液に含まれ、溶
媒抽出法により蛋白質及び糖類を実質的に除去して得ら
れる。上記分画分子量８００〜９００の画分を含む液
は、細菌培養液を遠心分離して菌体と分離した上清を、
限外濾過（ＭＷ１０００）で固体不純物を濾去し、得ら
れた濾液を、分画分子量８００〜９００の画分を分画す
るゲル濾過により得ることができる。また、この分画処
理の前または後において、溶媒抽出法により、活性蛋白
質及び糖類を実質的に除去することができる。

【０００７】ビフィズス菌増殖促進物質を産生する細菌
としては、例えばバチルス属に属する菌株、バチルス
ズブチリス IFO 13719，バチルス ズブチリス IFO 300
9 ，バチルス ズブチリス IFO 3034 ，バチルス メッ
センテリカス(Bacilus mesentericus)（現在はバチルス
ズブチリス と改名されている；Bergeys' Manualof
Determinative Bacteriology 8th Edition より）等を
挙げることができる。これらの菌株はいずれも公知の入
手可能な菌株である。

【０００８】細菌の培養は、バチルス属の培養に用いら
れている通常の方法を用いることができる。例えば、培
地組成として通常の培地組成、即ち炭素源としてシュー
クロース、グルコース、澱粉等、窒素源としてぺプト
ン、牛肉エキス、獣肉エキス、肉エキス、酵母エキス、
ＣＳＬ等、ミネラルとして塩化ナトリウム等を用いて、
培養を行なうことができる。

【０００９】培地から菌体を分離するには、特に限定さ
れるものではないが、遠心分離機により例えば１０００
０Ｇで遠心して菌体と上清とに分離する通常の方法を用
いればよい。得られた上清は、セルロースフィルターな
どにより除菌濾過し、更に必要に応じ適宜濃縮すること
も好ましい。

【００１０】上記のようにして得られた原料濾液から、
活性成分中の蛋白質、糖類を、溶媒抽出法により除去
し、更にゲル濾過して、分子量８００〜９００の画分を
分画して本発明の目的物質を回収する。溶媒抽出法は、
例えば原料濾液に、水飽和処理したフェノールを同量づ
つ混ぜて激しく振盪させ、放置したのちフェノール層と
分離した水層を採取し、クロロホルムを加えて振盪させ
る方法を例示することができるが、特にこれに限定され
るものではない。本発明の増殖促進物質は、活性成分中
の総蛋白質として５〜７ｍｇ／ｍｌ、全糖量として１３
〜１７ｍｇ／ｍｌ程度を含有してもよい。

【００１１】

【実施例】以下本発明を、実施例に基づいて更に詳細に
説明するが、本発明がこれに限定されるものでないこと
は当然である。

【００１２】実施例細菌の培養，濾液の回収 バチルス メッセンテリカス（微工研寄託番号第８９３
４）を通常の方法により培養した。

【００１３】すなわち、バチルス メッセンテリカス
を、培地組成として、シュークロースｌ０ｇ，ペプトン
１０ｇ，獣肉エキスｌ０ｇ，酵母エキス２ｇ，塩化ナト
リウム５ｇ（初発ｐＨ７．０）（ｌリットル）のＢＭ培
地を用いて、３７℃で培養した。

【００１４】活性成分中の蛋白質及び糖類の除去 次ぎに、増殖用培地から、遠心分離機により１００００
Ｇで遠心して菌体と上清とを分離し、上清１０００ｍｌ
を回収した。

【００１５】このようにして得られた上清１０００ｍｌ
を、セルロースフィルターで除菌濾過して無菌溶液約１
０００ｍｌを得、この溶液をロータリーエバポレーター
を用いて濃縮液１００ｍｌとした。尚、濃縮の度合いを
１０分の１とした。

【００１６】次ぎに前記濃縮溶液１００ｍｌと、水飽和
処理したフェノールを同量混ぜて激しく振盪させ、数分
間放置したのちフェノール層と水層が完全に分離した
ら、水層を採取し、これに残留するフェノールを除去す
る目的で同量のクロロホルムを加え、激しく振盪させ、
数分間放置した。クロロホルム層と水層が完全に分離し
たら水層を採取し、９０ｍｌ程度の溶媒抽出液を得た。

【００１７】ゲル濾過 上記で得られた溶媒抽出液９０ｍｌを、限外濾過膜（Ｐ
ＣＡＣＯＬＣＰ２（公称分子量限界１０００））で分子
量ｌ０００前後で篩い分けて、分子量が１０００以下の
物質のみが存在している濾液８０ｍｌを得、次いで、こ
の濾液をさらに精製するため、以下の条件でゲル濾過し
た。

【００１８】使用ゲルはＢｉｏｇｅｌ Ｐ−２（バイオ
ラッド（ＢＩＯＲＡＤ）社製）を用い、流速を１ｍｌ／
分，カラムサイズは１００×１．５ｃｍ，溶出液は超純
水、分画サイズは試験管一本あたり４〜５ｍｌとした。

【００１９】この条件で得られた、図１に示すようなＦ
−１分画Ｎｏ．１０〜２０までの分画を採取した。

【００２０】以上の如くして得られた画分は、バシトラ
シン（分子量１４１１）、Ｍｅｔ−エンケファリン（分
子量５７４）を対照として分子量を概算すると約９００
であった。

【００２１】また、本分画をローリー法により総蛋白量
を測定すると検出限界以下、また液体クロマトグラフィ
ーにより糖構成成分を検出するとグルコース０．１９
％，フラクトース０．２７％であり、その他の単糖、オ
リゴ糖などは検出されなかった。

【００２２】また本分画は、１２１℃、１５分の加熱後
も後述のビフィドバクテリウム増殖促進効果の確認方法
により測定してもその活性は失活しなかった。

【００２３】ビフィドバクテリウム増殖促進の確認試験 前記の処理によって得られた各画分について、次の二通
りの方法により、ビフィズス菌の増殖促進作用を確認し
た。

【００２４】（確認試験１）第一法として、肉エキス３
ｇ、肝臓エキス５ｇ、酵母エキス５ｇ、プロテオーゼペ
プトン１０ｇ、トリプトン５ｇ、ソイペプトン３ｇ、可
溶性デンプン０．５ｇ、プドウ糖１０ｇ、リン酸２カリ
ウム１ｇ、リン酸ｌカリウム１ｇ、硫酸マグネシウム
０．２ｇ、塩化ナトリウム０．０１ｇ、硫酸マンガン
０．００６７４ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．５ｇ、硫
酸第１鉄０．０１ｇ、ポリソルベート８０１ｇ（ｐＨ
７．２±）のＢＬ培地を２分の１の濃度にし、その９ｍ
ｌにセルロースフィルターで除菌濾過した各分画１ｍｌ
を混合し、ビフィドバクテリウムの前培養液を接種し
た。菌株はビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobac
teium longum) Ｍ１０１−２を用い、その前培養液を１
０⁶ cells ／ｍｌとなるように接種し、３７℃で嫌気培
養し、経時的に６００ｎｍで光学密度を測定し、増殖曲
線を作成した。

【００２５】同様の操作により２分の１の濃度のＢＬ液
体培地に前述のＢＭ液体培地１ｍｌを加えたものを対照
とした。

【００２６】有効性は培養２０時間後の光学密度を測定
し対照区との相対的な比較から判定した。この測定方法
により、ビフィドバクテリウムの増殖促進効果を判定
し、分画番号Ｎｏ．１０〜２０までの間に活性を認めた
（Ｆ−１）（図１）。

【００２７】（確認試験２）次に、第一法により活性の
認められたＦ−１について、第二法を用いて再検討し
た。

【００２８】即ち０．５％グルコースを加えたトリプチ
ケ−スペプトン（ＢＢＬ）１０ｇ，酵母エキス５ｇ，フ
ィルデス血液消化液４０ｍｌ，塩類溶液４０ｍｌ（塩化
カルシウム２６５ｍｇ，硫酸マグネシウム２００ｍｇ，
炭酸水素ナトリウムｌ０ｇ，塩化ナトリウム２ｇ、リン
酸ｌカリウムｌｇ，リン酸２カリウム（１リット
ル）），Ｌ−システイン塩酸塩０．５ｇ，蒸留水９２０
ｍｌ（ｐＨ７．２）のＰＹＦ液体培地で増菌したビフィ
ドバクテリウムを、白金耳で０．２％グルコースを加え
たＰＹＦ液体培地に接種し、３７℃、４８時間嫌気培養
した。この前培養液を菌数１０⁶ cells ／ｍｌとなるよ
うに除菌濾過した分画を含むＰＹＦ液体培地３ｍｌに接
種し、３７℃、１２〜４８時間嫌気培養した。

【００２９】利用性の判定は０．５％グルコース添加Ｐ
ＹＦ液体培地での生育を基準として行った。即ち０．５
％グルコースを加えたＰＹＦ液体培地および糖無添加Ｐ
ＹＦ液体培地にＦ−１分画液を添加して上述と同様に培
養後、光岡らの方法（ネオシュガー研究会報告，学会誌
刊行センター，ｐ８８，１９８２）に従い６３０ｎｍの
光学密度（Ｏ．Ｄ．）（濁度）により下記の式から求め
られるグルコースでの生育を基準とした生育比率（RG:r
elative groth ）で表した。

【００３０】

【数１】

【００３１】なお、本試験に供したインヂケーターは、
ビフィドバクテリウム ビフィダム(Bifidobacterium b
ifidum) ＤＳＭ２００８２、ビフィドバクテリウム ア
ドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis)ＡＴ
ＣＣ ｌ５７０３、ビフィドバクテリウム アドレッセ
ンティス(Bifidobacterium adolescentis)ＤＳＭ２００
８７、ビフィドバクテリウム インファンティス(Bifid
obacterium infantis)ＡＴＣＣ １５６９７、ビフィド
バクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve) ＡＴ
ＣＣ ｌ５７００、ビフィドバクテリウム ブレーベ(B
ifidobacterium breve) ＡＴＣＣ ３００１０、ビフィ
ドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)Ａ
ＴＣＣ ｌ５７０７、ビフィドバクテリウム シュード
ロンガム(Bifidobacterium pseudolongum)ＡＴＣＣ ２
５５２６、ビフィドバクテリウムサーモフィラム(Bifid
obacterium thermophirum)ＡＴＣＣ ｂｌ４−４４ｇ
ｂ，ビフィドバクテリウム ズブチル(Bifidobacterium
subtile) Ｆ３８４ １２／７З、とした。

【００３２】上記方法で試験した結果を表ｌに示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】

【表２】

【００３５】表１及び表２に示されるように、供試菌を
接種後ｌ２〜２４時間のＲＧ値は、ほとんどすべての供
試菌においてグルコース添加よりも高く、したがって供
与した成分はビフィドバクテリウムに対する炭素源とは
ならない増殖促進物質であり、従来のオリゴ糖のような
エネルギー代謝に影響を及ぼすものではないことが明ら
かとなった。

【００３６】次に、Ｆ−１分画液を添加したＰＹＦ液体
培地におけるビフィドバクテリウムアドレッセンティス
(Bifidobacterium adolescentis)ＤＳＭ２００８７の増
殖曲線を図２に示す。

【００３７】図２から明らかなように、本発明のビフィ
ドバクテリウム増殖促進物質を添加すると、増殖促進物
質を添加しない場合に比較して、ビフィドバクテリウム
の増殖の速度が速いことが増殖曲線の傾きから明かであ
る。

【００３８】表１、２及び図２の結果から、本発明のビ
フィドバクテリウム増殖促進物質は、ビフィズス菌に資
化されることがなく、ビフィドバクテリウムの細胞分裂
を促進させる触媒的作用を有していることが分かる。

【００３９】（確認試験３）次に、本発明の有効成分を
生体内に投与し、その効果を判定する試験を行った。

【００４０】本試験は実験動物として生後４週令（１０
０ｇ）のＳＤ系雄ラットを用い、本発明により得られた
活性分画を混餌投与により２８日間飼育後屠殺し、腸内
細菌叢を検索した。即ち、本発明により得られた活性成
分２リットルに対し、２００ｇのデキストリンを混合
し、凍結乾燥後１００メッシュの篩を通過させた。飼料
に対し本発明の有効成分の乾燥粉末を１０％の割合で混
合し、ラットに対し２８日間自由摂取させた。２８日間
飼育後屠殺して、剖検し腸内細菌叢を検索した。検索し
た細菌叢は総菌数、大腸菌群、ビフィドバクテリウム、
バチルス、ラクトバチルス、クロストリジウム、クロス
トリジウム バ−フリンゲンス、バクテロイデス、スト
レプトコッカス、ユウバクテリウム、バイロネラ、ペプ
トコッカスであった。

【００４１】ビフィドバクテリウムの菌数、相対比率共
に、コントロール群に比較し増加傾向が認められた（表
３、４）。

【００４２】

【表３】

【００４３】

【表４】

【００４４】

【効果】本発明の物質は、ビフィドバクテリウムの増殖
促進作用を有する有用な物質で有り、以下のような応用
が可能である。

【００４５】 本発明のビフィドバクテリウム増殖促
進物質は熱的に安定であり、多岐にわたる剤型・食品形
態に加工し、医薬品、食品などの添加剤としての応用が
可能である。

【００４６】 本発明の物質は、ビフィズス菌の細胞
分裂に対し促進的させる触媒的作用を有していることか
らビフィズス菌を大量培養する工業生産に応用が可能で
ある。さらに、安定した菌株の管理（保存）、種菌の増
殖性向上などの安定剤、増殖促進剤としての応用が可能
である。

【００４７】 ビフィズス菌は元来家畜や人（特に乳
幼児）などの糞便由来の菌種であるが、医薬品・食品と
して利用されるビフィズス菌は、増殖性、宿主依存性な
どを鑑み腸内においてその有用性を発揮する菌株でなけ
ればならない。自然界には 元々わずかしか存在しない
ものや、増殖活性などが著しく低い菌株ではあるけれど
生体にとっては有益な菌株を分離し、育種する目的で本
発明物質のビフィズス菌に対する増殖促進作用は大いに
期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】溶媒抽出液を分画した各供試を添加した培地中
におけるビフィドバクテリウムロンガム（Bifidobacter
ium longum）の２０時間培養後の光学密度（Ｏ．Ｄ．６
００ｎｍ）を表すグラフ。

【図２】Ｆ−１分画液を添加したＰＹＦ培地におけるビ
フィドバクテリウム アドレッセンティス（Bifidobact
erium adolescentis）ＤＳＭ２００８７の増殖曲線を表
すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス(Bacillus)属細菌の代謝産物で
   あって、前記細菌の培養濾液から分画された分画分子量
   ８００〜９００の画分に含まれ、かつ蛋白質及び糖類を
   実質的に含有しない、ビフィドバクテリウムの増殖促進
   作用を有するビフィドバクテリウム増殖促進物質。
2. 【請求項２】 請求項１において、ビフィドバクテリウ
   ムに増殖促進作用を有する産物を代謝する細菌が、バチ
   ルス メッセンテリカス(Bacillus mesentericus) であ
   ることを特徴とするビフィドバクテリウム増殖促進物
   質。
3. 【請求項３】 バチルス(Bacillus)属細菌の培養液を濾
   過した後、溶媒抽出法により得た濾液中から蛋白質及び
   糖類を除去し、次いでゲル濾過により分画分子量８００
   〜９００の画分を分画することを特徴とするビフィドバ
   クテリウムの増殖促進作用を有するビフィドバクテリウ
   ム増殖促進物質の製造法。