JP4852681B2 - 腸管内細胞溶解活性抑制剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を有効成分とする腸管内での細胞溶解活性抑制剤に関する。また、本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を配合して腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した医薬又は飲食品に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来の日本型の食事は、人間にとって理想的な食事に近いことから世界的に注目されてきている。しかし、近年、日本人の食事は、従来の日本型から西洋型へと変化してきており、そのことが問題視されてきている。つまり、西洋型の食事は、一般的に肉や脂肪が多く、野菜や穀物が少ない高脂肪・低カルシウムであるからである。
【0003】
先に Lapreらは、高脂肪・低カルシウムの食事を摂取すると腸管の内容物に含まれる水溶性の胆汁酸と脂肪酸が共に増加し、この水溶性の胆汁酸と脂肪酸が界面活性剤として作用するので、腸粘膜を構成する細胞を破壊すると報告している(Lapre,J.A., De Vries,H.T., Termont,D.S.M.L., Kleibeuker,J.H., De Vries,E.G.E. and Van der Meer,R., Cancer Research, vol.53, pp.248-253, 1993)。なお、 Lapreらは、水溶性の胆汁酸と脂肪酸の作用について、赤血球の溶血反応を利用した細胞溶解活性を測定することにより評価している。
【0004】
また、遺伝的素因により大腸癌を発病するリスクの高い人々においては、高脂肪・低カルシウムの食事を取り続けることにより腸粘膜の損傷が起こり、大腸癌を発病するリスクがさらに高まる恐れがあることが報告されている(Lipkin,M., Blattner,W.E., Fraumeni,J.F.Jr., Lynch,H.T., Deschner,E. and Winawer,S., Cancer Research, vol.43, pp.1899-1904, 1983; Newmark,H.L., Lipkin,M. and Maheshwari,N., Journal of National Cancer Institute, vol.82, pp.491-496, 1990)。
【0005】
このように、高脂肪・低カルシウムの食事を取ると、腸管の内容物に含まれる水溶性の胆汁酸と脂肪酸が増加し、腸粘膜が損傷を受け易い腸内環境を誘発することになる。
【0006】
一方、高脂肪・低カルシウムの食事に起因する腸粘膜の損傷は、カルシウムを大量に経口摂取することにより緩和されることが、前述した Lapreらの報告から知られている。しかし、その有効なカルシウムの摂取量は、一日当たり 1,422mgであり、成人一日当りのカルシウム所要量といわれる 600mgの2倍以上を必要とするものである。したがって、大量のカルシウムを通常の食事で摂取し続けるということは困難であり、腸粘膜を保護するにはカルシウム製剤等に頼らざるを得ないという問題があった。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記の現状を鑑み、食生活を大きく変えることなく、安全に腸粘膜を保護することができる安価な食品素材を求めて鋭意研究を進めていたところ、従来より食用として使用され、安全性が立証されている微生物であるビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体が腸管内での細胞溶解活性を抑制する作用を有することを見出した。そして、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物であるビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis) 、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) 、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)及びビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacterium breve)の菌体も同様に腸管内での細胞溶解活性を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を有効成分とする腸管内細胞溶解活性抑制剤に関する。また、本発明は、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を配合して腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した医薬又は飲食品に関する。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明で有効成分として使用するビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物は、発酵乳等のスターターとして使用されており、腸管に定着して感染や腐敗の防止、下痢の予防等に役立っていることが知られている。
【0009】
このビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体は、例えば、培養基として合成培地等を使用し、嫌気的条件下で培養した後、遠心分離等の処理により生菌体を回収し、そのまま利用することもできるし、また、この生菌体を洗浄した後、凍結乾燥等の処理により乾燥菌体として利用することもできる。
【0010】
なお、本発明で有効成分として使用することのできるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) 、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis) 、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) 、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacterium breve)等を例示することができる。
【0011】
【発明の実施の形態】
上記のようにして得られたビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体は、そのまま使用しても良いし、あるいは、乳糖等の賦形剤を加え、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の医薬としても良い。また、各種飲食品、例えば、清涼飲料水、果汁飲料、発酵飲料、ゼリー、アイスクリーム、ガム、キャンディー等に配合して使用することもできる。
【0012】
なお、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体に腸管内での細胞溶解活性抑制作用を発揮させるには、成人の場合、一日当たり乾燥菌体重量として0.5g〜5gを摂取する必要がある。
以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明する。
【0013】
【実施例1】
表1に組成を示した培地12リットルに、同様の培地で前培養したビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) SBT-2928 (FERM P-10657) を5重量%接種した後、37℃で16時間、嫌気的条件下で循環培養して、菌体を増殖させた。なお、この培養は、6Nアンモニア溶液を断続的に添加することによりpHが 6.5となるよう調整しながら行った。
【0014】
【表1】
───────────────────────────────
プロテオースペプトン(雪印乳業製) 10 (g/リットル)
酵母エキス粉末(アサヒビール薬品製) 10
D−グルコース 10
リン酸水素二カリウム 5
リン酸二水素カリウム 1
L−アスコルビン酸ナトリウム 1
───────────────────────────────
【0015】
培養終了後、この培養液に 0.9%塩化ナトリウム溶液60リットルを通液して菌体を洗浄し、限外濾過膜処理して溶液が7リットルとなるまで濃縮した後、遠心分離(8,000×g 、15分間、4℃) し菌体及び菌体を含んだスラリーを回収した。そして、菌体を含んだスラリーには凍結保護剤として最終濃度1%のグルタミン酸ナトリウムと最終濃度5%のショ糖を添加し、溶解した。そして、菌体とグルタミン酸ナトリウムとショ糖を溶解したスラリーとを混合し、凍結乾燥した後、粉砕してビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体80g を得た。なお、この菌体中の生菌数は3×1011cfu/g であった。
【0016】
【実施例2】
実施例1と同様の条件で、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis) JCM-7046、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) JCM-1210、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum) JCM-7004 及びビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacterium breve) JCM-7016 を培養し、同様に処理して各菌体を得た。
【0017】
【試験例1】
実施例1及び2で得られたビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の各菌体を使用し、動物実験により、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を調べた。
【0018】
1,2−ジメチルヒドラジン・2塩酸を体重1kg当たり40mgとなるよう調整して8週齢のWistar系雄ラット16匹に皮下注射した。なお、実験動物に1,2−ジメチルヒドラジン・2塩酸を注射すると大腸癌を発病し易い遺伝的素因が誘導される。そして、これらのラットを群間において体重が等しくなるように配慮しながら1群8匹の2群に分け、表2に示した飼料を15日間自由摂取させると共に、イオン交換水も自由摂取させた。なお、対照飼料及び本発明飼料に配合した脂肪は標準飼料(American Institute of Nutrition: Journal of Nutrition, vol.107, pp.1340-1348, 1977)の4倍であり、対照飼料及び本発明飼料に配合したカルシウムは標準飼料の 1/5であって、高脂肪・低カルシウムとなっている。
【0019】
そして、15日間の飼育期間中、各群共に体重増加量及び摂取カロリーに有意差は認められなかった。
【0020】
【表2】
【0021】
また、飼料に配合した塩類混合の組成を表3に、ビタミン混合の組成を表4にそれぞれ示す。
【0022】
【表3】
───────────────────────────
リン酸水素カルシウム・2水和物 12.3 (重量%)
塩化ナトリウム 7.4
塩化カリウム 7.7
炭酸水素カリウム 10.0
硫酸カリウム 5.2
酸化マグネシウム 2.4
硫酸マンガン・5水和物 0.73
硫酸第一鉄・7水和物 0.51
炭酸亜鉛 0.16
炭酸水酸化第二銅・1水和物 0.03
セレン酸ナトリウム・5水和物 0.001
ヨウ素酸カリウム 0.001
クロムミョウバン 0.055
────────────────────────────────────
ショ糖で全量を 100%とした。
【0023】
【表4】
──────────────────────
ビタミンE・アセテート 750IU/100g
ビタミンK3 5mg/100g
ビタミンB1 60mg/100g
ビタミンB2 60mg/100g
ビタミンB6 70mg/100g
ビタミンB12 0.1mg/100g
D−ビオチン 2mg/100g
葉酸 20mg/100g
パントテン酸カルシウム 160mg/100g
ニコチン酸 300mg/100g
──────────────────────
ショ糖で全量を100gとした。
【0024】
飼料摂取を開始して11〜14日目に、糞を定量的に回収し、凍結乾燥した後、粉砕した。そして、この粉砕した糞1.2gに超純水 3.6mlを加えてペースト状にし、37℃で1時間加温した後、遠心分離 (15,000×g 、10分間) して水溶性画分を分離、回収し、この水溶性画分の細胞溶解活性を測定した。
【0025】
また、飼育が終了したラットはエーテル麻酔下で解剖し、大腸遠位部の内容物を回収し、凍結乾燥して水分(%)を測定した。
【0026】
一方、13週齢Wistar系雄ラット1匹をエーテル麻酔下で開腹し、後大静脈より血液5mlを回収し、ヘパリン処理した後、遠心分離(1,000×g 、10分間、4℃) し、上清とバフィコートをパスツールピペットで除去して残渣を赤血球画分とした。次に、この赤血球画分に3倍体積量のN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液(pH7.4、1.5mM HEPES及び 0.9%塩化ナトリウム含有) を添加し、赤血球膜を壊さないよう良く撹拌した後、遠心分離(1,000×g 、10分間、4℃) し、上層とバフィコートを除去するという操作を4回繰り返し、赤血球を洗浄した。そして、このようにして得られた赤血球に3倍体積量の 0.9%塩化ナトリウム溶液を添加、混合し、糞の水溶性画分の細胞溶解活性を測定する際に使用した。
【0027】
糞の水溶性画分の細胞溶解活性を測定するに際しては、以下のような検体を調製して使用した。
検体1 糞の水溶性画分 40μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 120μl
検体2 糞の水溶性画分 80μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 80μl
検体3 糞の水溶性画分 120μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 40μl
検体4 糞の水溶性画分 160μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 0μl
標準検体1 超純水 0μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 160μl
標準検体2 超純水 40μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 120μl
標準検体3 超純水 80μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 80μl
標準検体4 超純水 120μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 40μl
標準検体5 超純水 160μl + 0.9%塩化ナトリウム溶液 0μl
【0028】
まず、検体1〜4に 0.9%塩化ナトリウム溶液に混合した赤血球40μl を添加した後、1分間に 100回のストロークで振とうしながら37℃で2時間加温した。また、検体ブランクとして、糞の水溶性画分 160μl と 0.9%塩化ナトリウム溶液40μl を混合したものを同様に加温した。さらに、標準検体1〜5に 0.9%塩化ナトリウム溶液に混合した赤血球40μl を添加した後、同様に加温した。
【0029】
この加温した検体1〜4、検体ブランク及び標準検体1〜5をそれぞれ遠心分離 (10,000×g 、5分間) し、上清を回収した後、この上清 150μl に超純水6mlを添加し、原子吸光分析機(日立製作所製、180-80型)で鉄濃度を測定した。
【0030】
そして、以下のような計算により細胞溶解活性を算出した。
(1)次式により、標準検体1〜5の鉄濃度から標準の面積を求めた。
標準の面積=(B-A)×1/2 +((B-A)+(C-A))×1/2 +((C-A)+(D-A))×1/2 +((D-A)+(E-A))×1/2
標準検体1の鉄濃度 (μg/ml) : A
標準検体2の鉄濃度 (μg/ml) : B
標準検体3の鉄濃度 (μg/ml) : C
標準検体4の鉄濃度 (μg/ml) : D
標準検体5の鉄濃度 (μg/ml) : E
【0031】
(2)次式により、検体1〜4及び検体ブランクの鉄濃度から検体の面積を求めた。
検体の面積=(F-J/4)×1/2 +((F-J/4)+(G-J/2))×1/2 +((G-J/2)+(H-3J/4)) ×1/2 +((H-3J/4)+(I-J)) ×1/2
検体1の鉄濃度 (μg/ml) : F
検体2の鉄濃度 (μg/ml) : G
検体3の鉄濃度 (μg/ml) : H
検体4の鉄濃度 (μg/ml) : I
検体ブランクの鉄濃度 (μg/ml) : J
【0032】
(3)次式により、糞の水溶性画分の細胞溶解活性を求めた。
細胞溶解活性(%)=検体の面積× 100×3×(100/(各群の大腸内容物の平均水分含量(%)-1)/標準の面積
その結果を表5に示す。
【0033】
【表5】
【0034】
本発明の有効成分であるビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の各菌体は、1,2−ジメチルヒドラジン・2塩酸を注射することにより大腸癌を発病し易い遺伝的素因を誘導し、さらに高脂肪・低カルシウム飼料を摂取させたラットから排泄される糞の水溶性画分の細胞溶解活性を対照群に比べ有意に低下させることが判った。
【0035】
【実施例3】
実施例1で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体 40gに乳糖900gとコーンスターチ574gを加え、V型混合機で混合し、混合粉末を得た。そして、ヒドロキシプロピルセルロース 16gに滅菌精製水 150mlを加えて撹拌し溶解した溶液とこの混合粉末とを双軸練合機で練合し、押し出し造粒機で造粒した後、通気乾燥機を使用して60℃で30分間乾燥することにより整粒し、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した顆粒状薬剤1,480gを製造した。
【0036】
【実施例4】
実施例1で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum) の菌体500g、リンゴ冷凍濃縮果汁25kg、グラニュー糖92kg、リンゴ酸 2.5kg、クエン酸 0.5kg、アップルアロマ3kg及びエッセンス1kgに水 900kgを加えて混合し溶解することにより、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を賦与した清涼飲料 1,000kgを製造した。
【0037】
【発明の効果】
ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体は、腸管内での細胞溶解活性抑制作用を有するので、結果的に腸粘膜を保護する効果を発揮し、大腸癌等の発病を予防することが期待される。
Claims (1)
- ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物の菌体を有効成分とする腸管内細胞溶解活性抑制剤。
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