JP2024054284A - ガンの処置のための結合分子 - Google Patents
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Abstract
【課題】CD137及びFAPに特異的に結合する結合分子並びにそれを含有する医薬、医薬組成物におけるその使用並びにガンの治療及び/又は予防のための薬剤としてそれを使用する方法を提供する。【解決手段】本発明の実施態様は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する結合部位を、単一の結合分子内のCD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する結合部位と低親和性結合部位と組み合わせた、二重特異性で二価の分子である。本発明の二重特異性分子は、FAPが発現される腫瘍微小環境のガン間質の状況においてのみ、T細胞上のCD137を活性化させ、それと係合する。【選択図】図1A
Description
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2021年4月22日に作成された前記ASCIIコピーは、09-0703-WO-1_SL.txtと命名され、サイズは、873,263バイトである。
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2021年4月22日に作成された前記ASCIIコピーは、09-0703-WO-1_SL.txtと命名され、サイズは、873,263バイトである。
発明の分野
本発明は、TNFRファミリーのメンバーであるCD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する結合分子並びに医薬におけるその使用、それを含有する医薬組成物並びにそれをガンの治療及び/又は予防のための薬剤として使用する方法に関する。
本発明は、TNFRファミリーのメンバーであるCD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する結合分子並びに医薬におけるその使用、それを含有する医薬組成物並びにそれをガンの治療及び/又は予防のための薬剤として使用する方法に関する。
発明の背景
ガンは、一般的には、異常な細胞増殖及びガン性細胞が全身に浸潤し又は広がる可能性に基づく疾患群である。ガンは、世界的に重篤な疾患であり、主な死因である。
ガンは、一般的には、異常な細胞増殖及びガン性細胞が全身に浸潤し又は広がる可能性に基づく疾患群である。ガンは、世界的に重篤な疾患であり、主な死因である。
外科手術、化学療法、放射線療法及びホルモン療法を含む、ガンを管理し又は場合により、ガンを処置する試みに、種々の処置方法が使用されてきた。免疫療法の近年の進歩により、ガンの処置状況が変化している。それでも、局所進行性又は転移性腫瘍を有する患者のほとんどは、疾患により死亡してしまうであろうから、新規な治療戦略の実質的な必要性が正当化される。
抗体系生体分子により、ガンの処置のための強力な治療剤である可能性が提供される。抗体は、細胞の表面上の特定のタンパク質(そのターゲット抗原)を認識し、結合するように設計されており、このようなタンパク質は、特定ガン細胞の表面上又は免疫細胞上にのみ存在する場合がある。この結合により、それらのターゲット抗原タンパク質の機能及び抗体自体の構造にも応じて、多くの異なる生物学的応答が引き起こされる場合がある。
例えば、一部の抗体により、ガン細胞に免疫細胞を引き寄せるか又は免疫系自体の活動に直接影響を及ぼすかのいずれかにより、ガン細胞を攻撃し、殺傷する免疫系が誘発される。更なるタイプの抗体系治療剤は、ガン細胞に結合して、細胞分裂を停止させ又は減少させ、このようにして、異常な細胞増殖を遅らせ、予防する。他のタイプの抗体は、それらに付着させた薬剤又は放射性粒子を有し、したがって、これらの治療剤をガン細胞自体に送達する。
FAPは、ジペプチジルペプチダーゼ(DPP)ファミリーのメンバーである(線維芽細胞活性化タンパク質アルファ、プロリルエンドペプチダーゼFAP、170kDaメラノーマ膜結合ゼラチナーゼ、膜内在性セリンプロテアーゼとも呼ばれる)。FAPは、一部の胎児間葉組織では、一過性に発現され、健康な成体組織において稀に発現される。この場合、FAPの存在は、通常、子宮内膜細胞に限定されている。また、FAPは、創傷治癒、関節リウマチ、変形性関節症、肝硬変及び肺線維症を含む活性化された間質に関連する疾患中でも発現され、多くの場合、組織に対する外傷又は損傷後に活性化された線維芽細胞において誘導される。また、FAPは、全ての種類のヒト上皮性腫瘍の腫瘍間質組織並びに種々の骨及び軟組織肉腫の悪性細胞でも発現される。FAPは、結腸直腸、卵巣、乳房、膀胱及び肺を含むヒト上皮性悪性腫瘍の90%以上で発現される。FAPは、新たに形成中の血管又は形成された血管に近接して発生し、腫瘍毛細血管内皮と実際の悪性上皮細胞及び細胞のクラスターとの間の特定の細胞区画を形成する線維芽細胞において優先的に見出される。
間質線維芽細胞は、ガン腫の発生、増殖及び転移に重要な役割を果たす。FAPの発現プロファイルから、FAPは、健康な組織への腫瘍浸潤並びに腫瘍の形成及び転移の一端を担っていることが示唆されている。FAP阻害剤、すなわち、FAPのタンパク質分解活性を減少可能又は阻害可能な物質は、全ての種類の腫瘍疾患の処置に有用な治療剤である。FAP阻害剤は、好ましくは、上皮由来の腫瘍、例えば、乳房腫瘍、非小細胞肺ガン、結腸直腸ガン及び軟組織ガンを処置するのに使用することができる。
FAP抗体は、当技術分野において公知である。例えば、シブロツズマブは、ヒト化マウスFAPであり、ヒト化後、ヒトFAPに結合されたが、マウスFAPへの検出可能な結合は示されず、マウスモデルにおいて腫瘍死滅を示さなかった(WO第1993005804号、Cheng, et al. Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer. Clin. Cancer Res., 9: 1639-1647)。少なくとも15種類の抗体が、FAPをターゲットとする商業的な前臨床又は臨床開発中である(例えば、US第8999342号、Ludwig Institute for Cancer Research(mAb/前臨床);WO第2016110598号、US第20170369592号、Mabimmune Diagnostics/Univ Zurich(mAb/前臨床);WO第2015118030号、US第10137202号、Oncomatryx(mAb-コンジュゲート/前臨床);WO第1993005804号、同第1999057151号、同第2001068708号、同第2002083171号、同第2007077173号、US第8568727号、シブロツズマブ、Boehringer Ingelheim(ヒト化マウスFAP/結腸直腸におけるPH1後に終了)を参照のこと)。
また、CD137(4-1BB、TNFRSF9、CDw137、T細胞抗原4-1BBホモロジー、T細胞抗原ILA、CD_抗原CD137)も、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーのメンバーである。CD137は、活性化されたTリンパ球で発現され、リガンドとの結合により、T細胞機能の増強がもたらされる。CD137の活性化は、レセプターのオリゴマー化により決まる。CD137は、活性化されたCD4+及びCD8+T細胞、Treg、DC、単球、マスト細胞及び好酸球上に発現される。CD137の活性化は、CD8+T細胞の活性化及び生存において重要な役割を果たす。CD137の活性化により、エフェクター機能が開始されるのではなく、持続され、増強され、TH1サイトカイン産生が優先的に支持される。CD4+T細胞では、CD137刺激により、最初に活性化が生じ、後に活性化誘導性細胞死が生じる。このことから、CD137アゴニスト抗体が何故、腫瘍免疫及び自己免疫において治療効果を有することができるのかが機構的に示唆されている。
さらに、CD137は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞及びマクロファージ上に発現され、これらの細胞種上でのCD137の刺激により、腫瘍指向性免疫をもたらすことができる免疫活性化を誘引することができる。CD137は、免疫監視において必須の役割を果たす。CD137の欠損により、ノックアウトマウスにおけるT細胞免疫応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞溶解性T細胞活性が低下する(Kwon, 2002、Narazaki, 2010)。ヒトでは、CD137の欠損は、免疫ディスレギュレーション、リンパ球反応の障害及びEBV関連リンパ腫発生と関連している(Somekh, 2019)。
また、CD137アゴニスト抗体は、腫瘍環境において内皮細胞を活性化し、ICAM-1及びVCAM-1のアップレギュレーションをもたらし、T細胞リクルートを改善することが示されている。幾つかの研究から、アゴニストCD137抗体による処置による腫瘍免疫の誘引が実証されている。これは、1997年にさかのぼる先駆的な研究である(Melero, 1997)。
CD137をターゲットとする25以上の薬剤が、現在、前臨床又は臨床開発中であるが、このターゲットの進展は遅かった。Bristol-Myers Squibbにより開発された完全ヒトIgG4抗体であるウレルマブ(BMS-66513)は、2005年に臨床に入った最初のCD137アゴニストであった。ペムブロリズマブとの併用で、メラノーマ患者に有望な有効性を示したが、肝毒性の懸念のために、幾つかの治験が中止された。ウレルマブの将来性は明らかではないが、多くのBMS支援治験が依然として進行中であるが、BMSパイプラインから脱落している。他の主なCD137アゴニストであるPfizerの完全ヒトIgG2抗体であるウトミルマブ(PF-05082566)は、種々の併用において、わずかな臨床的有効性しか示されていない。ウレルマブにより、更なる架橋なしに、T細胞を刺激することができるが、対照的に、ウトミルマブは、アゴニスト効果を開始するために、FcγR媒介性架橋が必要である(Fisher, 2012)。後者の場合、FcγR媒介性架橋は、予測可能なプロセスではなく、このプロセスは、ウトミルマブの抗腫瘍効力を制限している。2018年4月、Pfizerから、他の併用治験を進行させる場合があるが、ウトミルマブを単独療法又はペムブロリズマブとの併用として開発しなくなったと発表された。したがって、予備データから、ウトミルマブは忍容性があることが示唆されたが、ウレルマブとは対照的に、アベルマブ及びリツキシマブとの併用でも、わずかな腫瘍作用しか示さなかった。Pfizerの第III相臨床試験は、近年、500名から29名に減った。
より新しいCD137薬剤は、腫瘍抗原(例えば、HER2)を同時にターゲットとすることにより、腫瘍におけるフォーカス活性が開発され、毒性を増加させることなく、活性を向上させることができる可能性がある。CD137/Her2二重特異性PRS-343は、近年、複数の腫瘍タイプにわたって、多数の前処置を受けたガン患者を対象とした第I相試験において、有望な結果を示している。PRS-343により、腫瘍活性、腫瘍浸潤CD8+T細胞の増加及び良好な安全性プロファイルが示された。間質における腫瘍関連線維芽細胞上でのFAP発現は、ガン細胞上でのHER2の発現より安定しており、したがって、共局在化ターゲットとしてのCD137とHER2との併用は、有効性を制限する場合があると考えられる。
別の二重特異性CD137/FAP DARPin分子(AMGEN/Molecular PartnersからのMP-0310)は、一価のFAP及び一価のCD137バインダーとしてフォーマットされた別のこのような腫瘍ターゲット分子である。このフォーマットにより、in vivoでの天然CD137リガンドとの結合が可能であるかどうか又は一価のCD137エンゲージャーがCD137を架橋し、このため、T細胞を十分に活性化可能であるかどうかは明らかではない。DARPin(設計されたアンキリン反復タンパク質)は抗体ではなく、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質であり、薬剤発見及び薬剤開発におけるターゲット結合に対する抗体の代わりに利用されてきた新たなクラスの非免疫グロブリンタンパク質である(例えば、WO第2002/020565号、US第20130244940号及びLink et al.「Preclinical pharmacology of MP0310: a 4-1BB/FAP bi-specific DARPin(登録商標) drug candidate promoting tumor restricted T cell co-stimulation.」 Poster 3572(https://investors.molecularpartners.com/~/media/Files/M/Molecular-Partners/documents /201804-mp0310-pharmacology-poster-3752.pdf)。
さらに、CD137-L/FAP分子(Roche targetingからのRG-7827)は、抗体アーム結合ではない三量体化ヒトCD137リガンドである。このCD137リガンドにより、アゴニスト活性の向上に必要であると考えられるCD137の高次多量体化が可能となるかどうかは不明である。さらに、RG-7827は、内因性CD137リガンドと競合することが予想される(例えば、WO第2019175125号、同第2017055398号、同第2017060144号、US第20170114141号、同第20170247467号及びJ. Sam, C. Claus, C. Ferrara, S. Lang, V. Nicolini, S. Colombetti, V. Teichgraber, S. Evers, M. Bacac, P. Umana, C. Klein.(AACR 2018, Poster 5621, FAP-4-1BBL: A novel versatile tumor-stroma targeted 4-1BB agonist for combination immunotherapy with checkpoint inhibitors, T-cell bispecific antibodies, and ADCC-mediating antibodiesを参照のこと)。
このように、アゴニスト4-1BB抗体の全身投与は、前臨床モデルにおいて有効な腫瘍ターゲティング剤であることが示された可能性があるが、臨床開発は、相当な用量制限肝毒性又は相対的に低い効力及び/又はFcγレセプター媒介性過剰クラスタリングへの依存性に起因する可能性がある限られた臨床的有効性のいずれかにより妨げられてきた過去の第II相治験をうまく進められなかった。したがって、現在、種々の併用パートナーとの二重特異性CD137分子及びCD137分子が開発中にあるが、この抗原についての安全性及び臨床的有効性は未だ実証されていない。
ガン処置の一般的な点では、近年の大きな進歩にもかかわらず、固形腫瘍の処置が困難な一部は、利用可能な治療法;現在の標準治療である薬剤又は現在臨床試験中のより新しく、最初は有望な薬剤のいずれにも応答しない。患者が最初は応答したとしても、多くの場合、長期にわたる応答を経験せず、完全寛解又は治癒に至ることはほとんどない。例えば、非小細胞肺ガンの場合、このようなアンメットニーズの1つでは、全NSCLCの約40~50%は、第1選択治療に応答しないが、応答した別の50%は、現在の第1選択治療(例えば、抗PD1免疫療法を含む)で長期持続応答を経験しない。さらに、12か月後も無増悪を維持している患者は、30~40%未満である。以前に抗PD-L1処置を受けた第2/第3選択中の患者に対する更なる治療ための選択肢は限られており、十分に確立されていない。化学療法選択肢、例えば、ドセタキセル又はプラチナ系レジメン(第1選択で使用しない場合)は、限られた有益性のものであるためである。
利用可能な前臨床データ及び臨床データ並びにこのようなガン患者についての不良な見通しを考慮すると、より有効な治療法、特に、患者に対する忍容性が改善され、現在利用可能な治療に抵抗性である腫瘍タイプに対するターゲット化特異性を有するような治療法を特定することが明らかに必要である。したがって、異なる作用様式を有する免疫学的に活性な薬剤を含む、新規なアプローチが必要とされている。
発明の概要
本発明は、腫瘍特異的TILの腫瘍に制限された活性化がガンの処置に対する有望な様式を表わすという概念に基づいている。本発明の実施態様は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する結合部位を、単一の結合分子内のCD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する結合部位と低親和性結合部位と組み合わせた、二重特異性で二価の分子である。本発明の二重特異性分子は、FAPが発現される腫瘍微小環境のガン間質の状況においてのみ、T細胞上のCD137を活性化させ、それと係合する。
本発明は、腫瘍特異的TILの腫瘍に制限された活性化がガンの処置に対する有望な様式を表わすという概念に基づいている。本発明の実施態様は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する結合部位を、単一の結合分子内のCD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する結合部位と低親和性結合部位と組み合わせた、二重特異性で二価の分子である。本発明の二重特異性分子は、FAPが発現される腫瘍微小環境のガン間質の状況においてのみ、T細胞上のCD137を活性化させ、それと係合する。
以下により詳細に検討されるように、本発明の分子の1つの利点は、腫瘍反応性T細胞の活性化の改善及び腫瘍微小環境に対する既存の腫瘍応答の拡大であり、従来のCD137アゴニストと比較して、安全性を改善しながら、患者における腫瘍退縮をもたらす。CD137の係合をその低い親和性のために、FAPの近位発現上で条件付けすることにより、CD137活性及びT細胞のリクルートは、多くのタイプのガンのFAP+腫瘍環境においてのみ起こる。この低い親和性係合は、他のCD137の一価アプローチを上回る改善である。本発明の二価の分子が、FAPの存在下で腫瘍帰属T細胞にのみ顕著に結合し、活性化し、それらを増殖させ、IFNγを分泌させ、これにより、より局在化した腫瘍指向性免疫応答を生じさせるためである。最終的に、CD137/FAP抗体のターゲット化活性により、従来のCD137アゴニストと比較して、忍容性が良好で、安全性プロファイルが改善された患者における腫瘍退縮がもたらされるであろう。
したがって、本発明の第1の態様は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位と、CD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位とを有する、免疫グロブリン様結合分子を提供する。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、該分子は、二重特異性かつ四価であり、CD137について二価かつFAPについて二価である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する抗原結合部位は、免疫グロブリン(Ig)分子の一部であり、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位は、好ましくは、ペプチドリンカーを介して、FcドメインのN末端に融合された1つ以上のscFvを含む。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、1つ以上のscFvは、N末端からC末端へのVL-VH配向を有する。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、1つ以上のscFvは、Ig分子の重鎖のC末端に融合される。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、Ig分子は、IgG1KOである。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、1つ以上のscFvは、ペプチドリンカー、好ましくは、約4~20個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、Ig分子に融合される。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137(4-1BB)に特異的に結合する抗原結合部位は、下記:
i)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ii)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iii)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iv)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
v)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vi)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
viii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ix)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
x)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:93(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
xi)配列番号:672(CDR1)(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)、配列番号:335(CDR2)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:336(CDR1)(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)、配列番号:337(CDR2)(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
xii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:338(CDR2)(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:669(CDR1)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)、配列番号:339(CDR2)(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
xiii)アミノ酸87~118(配列番号:352)の細胞外ドメインCRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xii)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこれらと結合について競合するCD137抗原結合分子又は
xvi)アミノ酸46~117(配列番号:356)の細胞外ドメインCRD2/CRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xvi)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこららと結合について競合するCD137抗原結合分子
を含む群から選択される。
i)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ii)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iii)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iv)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
v)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vi)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
viii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ix)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
x)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:93(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
xi)配列番号:672(CDR1)(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)、配列番号:335(CDR2)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:336(CDR1)(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)、配列番号:337(CDR2)(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
xii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:338(CDR2)(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:669(CDR1)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)、配列番号:339(CDR2)(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
xiii)アミノ酸87~118(配列番号:352)の細胞外ドメインCRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xii)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこれらと結合について競合するCD137抗原結合分子又は
xvi)アミノ酸46~117(配列番号:356)の細胞外ドメインCRD2/CRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xvi)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこららと結合について競合するCD137抗原結合分子
を含む群から選択される。
本発明の免疫グロブリン様結合分子の好ましい実施態様では、CD137(4-1BB)に特異的に結合する抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含む免疫グロブリン分子の一部であり、
ここで、VH及びVL領域は、下記:
i)配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ii)配列番号:20のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iii)配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iv)配列番号:40のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
v)配列番号:50のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:55のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vi)配列番号:60のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:65のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vii)配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
viii)配列番号:80のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:85のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ix)配列番号:90のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:95のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
x)配列番号:100のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:105のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
xi)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:672(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:335(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖並びに4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:336(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは5つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:337(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
xii)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:338(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:669(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:339(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
xiii)配列番号:10、配列番号:20、配列番号:30、配列番号:40、配列番号:50及び配列番号:60からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:15、配列番号:25、配列番号:35、配列番号:45、配列番号:55、配列番号:65からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
xiv)配列番号:70、配列番号:80、配列番号:90及び配列番号:100からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:75、配列番号:85、配列番号:95及び配列番号:105からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
xv)アミノ酸87~118(配列番号:352)の細胞外ドメインCRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xiv)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこれらと結合について競合するCD137抗原結合分子又は
xvi)アミノ酸46~117(配列番号:356)の細胞外ドメインCRD2/CRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xiv)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこららと結合について競合するCD137抗原結合分子
を含む群から選択される。
ここで、VH及びVL領域は、下記:
i)配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ii)配列番号:20のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iii)配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iv)配列番号:40のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
v)配列番号:50のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:55のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vi)配列番号:60のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:65のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vii)配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
viii)配列番号:80のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:85のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ix)配列番号:90のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:95のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
x)配列番号:100のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:105のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
xi)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:672(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:335(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖並びに4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:336(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは5つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:337(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
xii)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:338(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:669(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:339(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
xiii)配列番号:10、配列番号:20、配列番号:30、配列番号:40、配列番号:50及び配列番号:60からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:15、配列番号:25、配列番号:35、配列番号:45、配列番号:55、配列番号:65からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
xiv)配列番号:70、配列番号:80、配列番号:90及び配列番号:100からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:75、配列番号:85、配列番号:95及び配列番号:105からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
xv)アミノ酸87~118(配列番号:352)の細胞外ドメインCRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xiv)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこれらと結合について競合するCD137抗原結合分子又は
xvi)アミノ酸46~117(配列番号:356)の細胞外ドメインCRD2/CRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(xiv)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこららと結合について競合するCD137抗原結合分子
を含む群から選択される。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位は、下記:
i)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ii)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iii)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iv)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
v)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vi)配列番号:319(CDR1)、配列番号:341(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:691(CDR1)(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)及び配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vii)配列番号:694(CDR1)(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)、配列番号:342(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:343(CDR3)(ここで、X1は、N又はEから選択される)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)及び配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
を含むscFvの群から選択される。
i)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ii)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iii)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iv)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
v)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vi)配列番号:319(CDR1)、配列番号:341(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:691(CDR1)(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)及び配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vii)配列番号:694(CDR1)(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)、配列番号:342(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:343(CDR3)(ここで、X1は、N又はEから選択される)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)及び配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
を含むscFvの群から選択される。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位は、下記:
i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ii)配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iii)配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iv)配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
v)配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vi)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSから選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vii)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:694(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:342(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH3 配列番号:343(ここで、X1は、N又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
viii)配列番号:106、配列番号:115及び配列番号:124からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:110、配列番号:119及び配列番号:128からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
viv)配列番号:133及び配列番号:142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:137及び配列番号:146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL
を含むscFvの群から選択される。
i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ii)配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iii)配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iv)配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
v)配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vi)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSから選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vii)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:694(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:342(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH3 配列番号:343(ここで、X1は、N又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
viii)配列番号:106、配列番号:115及び配列番号:124からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:110、配列番号:119及び配列番号:128からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
viv)配列番号:133及び配列番号:142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:137及び配列番号:146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL
を含むscFvの群から選択される。
本発明の免疫グロブリン様結合分子の好ましい実施態様は、下記:
i)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
ii)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
iii)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
iv)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
v)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(vi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(vii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(viii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(ix)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(x)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xiii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xiv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xvi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xvii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xviii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xix)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xx)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:111(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:121(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxiii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxiv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxvi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:111(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxvii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxviii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxix)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxx)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxi)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxiii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxiv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxvi)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxvii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxviii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxix)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xl)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xli)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xliii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xliv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlvi)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlvii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlviii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlix)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(l)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(li)(a)配列番号:672(CDR1)(ここで、X1は、A又はSである)、配列番号:335(CDR2)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:336(CDR1)(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)、配列番号:337(CDR2)(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:341(CDR2)(ここで、X1は、D又はEから選択される)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:691(CDR1)(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)及び配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(lii)(a)配列番号:672(CDR1)(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)、配列番号:335(CDR2)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:336(CDR1)(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)、配列番号:337(CDR2)(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:694(CDR1)(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)、配列番号:342(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:343(CDR3)(ここで、X1は、N又はEから選択される)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(liii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:338(CDR2)(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:669(CDR1)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)、配列番号:339(CDR2)(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:341(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:691(CDR1)(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(lix)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:338(CDR2)(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:669(CDR1)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)、配列番号:339(CDR2)(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:694(CDR1)(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)、配列番号:342(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:343(CDR3)(ここで、X1は、N又はEから選択される)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位
を含む群より選択される、CD137(4-1BB)に特異的に結合する第1の抗原結合部位及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する第2の抗原結合部位を含む。
i)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
ii)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
iii)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
iv)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
v)(a)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(vi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(vii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(viii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(ix)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(x)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xiii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xiv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xvi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xvii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xviii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xix)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xx)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:111(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:121(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxiii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxiv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxv)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxvi)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:111(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxvii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxviii)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxix)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxx)(a)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxi)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxiii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxiv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxvi)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxvii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxviii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xxxix)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xl)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xli)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xliii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xliv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlv)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlvi)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlvii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlviii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(xlix)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(l)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(li)(a)配列番号:672(CDR1)(ここで、X1は、A又はSである)、配列番号:335(CDR2)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:336(CDR1)(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)、配列番号:337(CDR2)(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:341(CDR2)(ここで、X1は、D又はEから選択される)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:691(CDR1)(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)及び配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(lii)(a)配列番号:672(CDR1)(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)、配列番号:335(CDR2)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:336(CDR1)(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)、配列番号:337(CDR2)(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:694(CDR1)(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)、配列番号:342(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:343(CDR3)(ここで、X1は、N又はEから選択される)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(liii)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:338(CDR2)(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:669(CDR1)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)、配列番号:339(CDR2)(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:319(CDR1)、配列番号:341(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:691(CDR1)(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位又は
(lix)(a)配列番号:308(CDR1)、配列番号:338(CDR2)(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:669(CDR1)(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)、配列番号:339(CDR2)(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むCD137結合部位並びに
(b)配列番号:694(CDR1)(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)、配列番号:342(CDR2)(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)及び配列番号:343(CDR3)(ここで、X1は、N又はEから選択される)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRを含むFAP結合部位
を含む群より選択される、CD137(4-1BB)に特異的に結合する第1の抗原結合部位及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する第2の抗原結合部位を含む。
本発明の更なる態様は、下記:
(i)配列番号:151のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:152のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(ii)配列番号:153のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:154のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(iii)配列番号:155のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:156のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(iv)配列番号:157のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:158のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(v)配列番号:159のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:160のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(vi)配列番号:164のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:165のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(vii)配列番号:169のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:170のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(viii)配列番号:174のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:175のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(ix)配列番号:179のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:180のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(x)配列番号:184のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:185のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xi)配列番号:189のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:190のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xii)配列番号:194のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:195のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xiii)配列番号:199のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:200のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xiv)配列番号:204のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:205のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xv)配列番号:209のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:210のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvi)配列番号:214のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:215のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvii)配列番号:219のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:221のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xviii)配列番号:224のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:225のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xix)配列番号:229のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:230のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xx)配列番号:234のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:235のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvii)配列番号:239のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:240のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xviii)配列番号:244のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:245のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xix)配列番号:249のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:250のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xx)配列番号:254のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:255のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxi)配列番号:259のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:260のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxii)配列番号:264のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:265のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxiii)配列番号:269のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:270のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxiv)配列番号:274のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:275のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxv)(a)配列番号:151のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:672(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:335(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメインを含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なり、前記FAP VLは、2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:336(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは5つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:337(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:152のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖ドメイン(VL)を含む第2のポリペプチド又は
(xxvi)(a)配列番号:155のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:672(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:335(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)とは異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメイン(VL)を含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:694(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:342(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH3 配列番号:343(ここで、X1は、N又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:336(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは5つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:337(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、S又はYからなる群より選択され、X3は、S又はYからなる群より選択され、X4は、Y又はQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:156のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖を含む第2のポリペプチド又は
(xxvii)(a)配列番号:153のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:338(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメインを含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なり、前記FAP VLは、2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:669(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:339(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:154のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖を含む第2のポリペプチド又は
(xxviii)(a)配列番号:153のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:338(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメイン(VL)を含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なり、前記FAP VLは、2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:669(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:339(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:154のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖を含む第2のポリペプチド
を含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。
(i)配列番号:151のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:152のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(ii)配列番号:153のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:154のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(iii)配列番号:155のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:156のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(iv)配列番号:157のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:158のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(v)配列番号:159のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:160のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(vi)配列番号:164のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:165のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(vii)配列番号:169のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:170のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(viii)配列番号:174のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:175のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(ix)配列番号:179のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:180のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(x)配列番号:184のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:185のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xi)配列番号:189のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:190のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xii)配列番号:194のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:195のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xiii)配列番号:199のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:200のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xiv)配列番号:204のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:205のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xv)配列番号:209のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:210のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvi)配列番号:214のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:215のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvii)配列番号:219のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:221のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xviii)配列番号:224のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:225のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xix)配列番号:229のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:230のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xx)配列番号:234のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:235のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvii)配列番号:239のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:240のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xviii)配列番号:244のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:245のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xix)配列番号:249のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:250のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xx)配列番号:254のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:255のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxi)配列番号:259のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:260のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxii)配列番号:264のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:265のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxiii)配列番号:269のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:270のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxiv)配列番号:274のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:275のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxv)(a)配列番号:151のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:672(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:335(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメインを含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なり、前記FAP VLは、2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:336(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは5つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:337(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、Y又はSからなる群より選択され、X3は、R又はLからなる群より選択され、X4は、Y及びQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:152のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖ドメイン(VL)を含む第2のポリペプチド又は
(xxvi)(a)配列番号:155のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:672(ここで、X1は、A又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:335(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択され、X2は、D又はEからなる群より選択され、X3は、G又はAからなる群より選択され、X4は、T又はKからなる群より選択され、X5は、L又はVからなる群より選択され、X6は、D又はEからなる群より選択され、X7は、L又はVからなる群より選択され、X8は、S又はGからなる群より選択される)とは異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメイン(VL)を含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH1 配列番号:694(ここで、X1は、S又はNからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:342(ここで、X1は、D又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH3 配列番号:343(ここで、X1は、N又はEからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)4つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:336(ここで、X1は、K又はRからなる群より選択され、X2は、D又はSからなる群より選択され、X3は、V又はIからなる群より選択され、X4は、S又はTからなる群より選択され、X5は、V及びLからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは5つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:337(ここで、X1は、S又はAからなる群より選択され、X2は、S又はYからなる群より選択され、X3は、S又はYからなる群より選択され、X4は、Y又はQからなる群より選択され、X5は、S又はTからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:156のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖を含む第2のポリペプチド又は
(xxvii)(a)配列番号:153のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:338(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメインを含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なり、前記FAP VLは、2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:669(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:339(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:154のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖を含む第2のポリペプチド又は
(xxviii)(a)配列番号:153のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチドであって、CD137に特異的に結合する可変重鎖部は、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:338(ここで、X1は、Y又はIからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なり、ここで、前記scFvは、重鎖ドメイン(VH)及び軽鎖ドメイン(VL)を含むFAP結合scFvであり、ここで、前記FAP VHは、1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRH2 配列番号:341(ここで、X1は、D又はEから選択される)とはアミノ酸配列が異なり、前記FAP VLは、2つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:691(ここで、X1は、N、R又はSからなる群より選択され、X2は、N又はSからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる第1のポリペプチド並びに
(b)1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL1 配列番号:669(ここで、X1は、N又はQからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なりかつ/もしくは1つ以下のアミノ酸のアミノ酸置換によりCDRL2 配列番号:339(ここで、X1は、L又はGからなる群より選択される)とはアミノ酸配列が異なる配列番号:154のアミノ酸配列を含むCD137に特異的に結合する軽鎖を含む第2のポリペプチド
を含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。
このため、更なる態様では、本発明は、
(i)CD137に特異的に結合可能なポリペプチドがそれぞれ、
(a)配列番号:10、配列番号:20、配列番号:30、配列番号:40、配列番号:50及び配列番号:60からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域VH並びに配列番号:15、配列番号:25、配列番号:35、配列番号:45、配列番号:55、配列番号:65からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
(b)配列番号:70、配列番号:80、配列番号:90及び配列番号:100からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:75、配列番号:85、配列番号:95及び配列番号:105からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL
を含み、
(ii)FAPに特異的に結合可能なポリペプチドがそれぞれ、
(a)配列番号:106、配列番号:115及び配列番号:124からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:110、配列番号:119及び配列番号:128からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
(b)配列番号:133及び配列番号:142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:137及び配列番号:146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
(i)CD137に特異的に結合可能なポリペプチドがそれぞれ、
(a)配列番号:10、配列番号:20、配列番号:30、配列番号:40、配列番号:50及び配列番号:60からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域VH並びに配列番号:15、配列番号:25、配列番号:35、配列番号:45、配列番号:55、配列番号:65からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
(b)配列番号:70、配列番号:80、配列番号:90及び配列番号:100からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:75、配列番号:85、配列番号:95及び配列番号:105からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL
を含み、
(ii)FAPに特異的に結合可能なポリペプチドがそれぞれ、
(a)配列番号:106、配列番号:115及び配列番号:124からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:110、配列番号:119及び配列番号:128からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL又は
(b)配列番号:133及び配列番号:142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域VH並びに配列番号:137及び配列番号:146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域VL
を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明の更なる態様は、本発明の免疫グロブリン様結合分子をコードする1つ以上の核酸分子又はこのような核酸分子を含有する1つ以上の発現ベクターを提供する。「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現構築物」と同義であり、ターゲット細胞において操作可能に関連する特定の遺伝子を導入し、その発現を指示するのに使用されるDNA分子を指す。この用語は、自己複製核酸構築物としてのベクター及びそれが導入されたホスト細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。「発現カセット」という用語は、ターゲット細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを伴ってリコンビナントに又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。リコンビナント発現カセットをプラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウイルス又は核酸フラグメントに組み込むことができる。典型的には、発現ベクターのリコンビナント発現カセット部は、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含み、典型的には、本発明の免疫グロブリン様結合分子の種々の部分(例えば、重鎖及び軽鎖は、異なる発現ベクターでコードされる)をコードする複数の発現ベクターが、同時に同じホスト細胞にトランスフェクションされる。発現ベクターにより、大量の安定なmRNAの転写が可能となる。発現ベクターが、ターゲット細胞内に入ると、遺伝子によりコードされるリボ核酸分子又はタンパク質は、細胞の転写及び/又は翻訳装置により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクター又はベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセット又はカセットを含む。
本発明の更なる態様は、発現制御配列と機能的に会合した本発明の核酸分子を含有する、ホスト細胞を提供する。「ホスト細胞」、「ホスト細胞系統」及び「ホスト細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞(このような細胞の子孫を含む)を指す。ホスト細胞は、「トランスフォーマンと」及び「トランスフォーメーションされた細胞」を含み、これは、継代回数に関係なく、トランスフォーメーションされた初代細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含量において親細胞と完全に同一ではない場合があり、突然変異を含む場合がある。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされ又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫が本明細書に含まれる。ホスト細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するのに使用することができる任意のタイプの細胞系である。ホスト細胞は、培養細胞、例えば、ほ乳類培養細胞、例えば、CHO細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞を含み、ほんの数例を挙げると、トランスジェニック動物又は動物組織内に含まれる細胞も含む。
本発明の更なる態様は、本明細書に記載された本発明の結合分子の製造方法であり、
(a)本発明のホスト細胞を該分子の発現を可能にする条件下で培養する工程と、
(b)該分子を回収する工程とを含む、方法を提供する。
(a)本発明のホスト細胞を該分子の発現を可能にする条件下で培養する工程と、
(b)該分子を回収する工程とを含む、方法を提供する。
本発明の更なる態様は、薬剤に使用するための、本発明の免疫グロブリン様結合分子を提供する。
本明細書で使用する場合、「ガン」という用語は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ球性白血病、肺ガン、非小細胞肺(NSCL)ガン、細気管支肺胞細胞肺ガン、骨ガン、膵臓ガン、皮膚がん、頭頸部のガン、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮ガン、卵巣ガン、直腸ガン、肛門部のガン、胃ガン(stomach cancer)、胃ガン(gastric cancer)、結腸ガン、乳ガン、子宮ガン、卵管のガン、子宮内膜のガン、子宮頸部のガン、膣のガン、外陰のガン、ホジキン病、食道のガン、小腸のガン、内分泌系のガン、甲状腺のガン、副甲状腺のガン、副腎のガン、軟組織の肉腫、尿道のガン、陰茎のガン、前立腺ガン、膀胱のガン、腎又は尿管のガン、腎細胞ガン、腎盂のガン、中皮腫、肝細胞ガン、胆道ガン、中枢神経系(CNS)の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮ガン、下垂体腺腫及びユーイング肉腫(上記ガンのいずれかの難治性版を含む)又は上記ガンのうちの1つ以上の組み合わせを含む。本発明の更なる態様は、ガン、好ましくは、結腸直腸ガン(CRC)(例えば、結腸直腸腺ガン)、胃ガン(GC)(例えば、胃腺ガン)、膵臓ガン(PAC)(例えば、膵臓腺ガン)及び肺ガン(LC)(例えば、肺扁平上皮ガン、肺腺ガン)の治療に使用するための、本発明の免疫グロブリン様結合分子を提供する。
本発明の更なる態様は、本発明の実施態様のいずれか1つ記載の免疫グロブリン様結合分子を薬学的に許容し得る担体並びに場合により、1種以上の更なる有効成分、例えば、科学療法剤、放射線及び/又はガン免疫療法に使用するための他の薬剤と共に含む、医薬組成物を提供する。
一態様では、T細胞応答の刺激、活性化されたT細胞の生存及び/もしくはリクルートの支持、免疫細胞のサプレッション及び/又はアネルギーの予防;感染の処置、ガンの処置、ガンの進行の遅延並びに/又はガンを患っている患者の生存の延長に使用するための、記載された実施態様のいずれか1つ記載の二重特異性免疫グロブリン様結合分子又は本発明の前記免疫グロブリン様結合分子を含む医薬組成物が提供される。
本発明の更なる態様は、有効量の本発明の免疫グロブリン様結合分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、ガンの処置方法を提供する。
発明の詳細な説明
CD137は、造血コンパートメント及び非造血コンパートメント全体:活性化されたT細胞、レギュラトリーT細胞、NK細胞、樹状細胞、活性化された単球、好中球、好酸球、マスト細胞、活性化されたB細胞、リードシュテルンベルク細胞及び血管壁(内皮層及び血管平滑筋細胞上)等にわたって広く発現される。前臨床試験で示されたように、強力な単特異性CD137アゴニスト抗体であるウレルマブの臨床試験では、死亡を含む重度の肝毒性が報告されている。肝臓常在性T細胞上のFcγRを介した高いCD137親和性と高クラスター化との両方が、ウレルマブ媒介性肝毒性に寄与すると考えられている。
CD137は、造血コンパートメント及び非造血コンパートメント全体:活性化されたT細胞、レギュラトリーT細胞、NK細胞、樹状細胞、活性化された単球、好中球、好酸球、マスト細胞、活性化されたB細胞、リードシュテルンベルク細胞及び血管壁(内皮層及び血管平滑筋細胞上)等にわたって広く発現される。前臨床試験で示されたように、強力な単特異性CD137アゴニスト抗体であるウレルマブの臨床試験では、死亡を含む重度の肝毒性が報告されている。肝臓常在性T細胞上のFcγRを介した高いCD137親和性と高クラスター化との両方が、ウレルマブ媒介性肝毒性に寄与すると考えられている。
本発明のCD137/FAP分子は、より低いCD137結合親和性、減少したFcγR結合のためのLALA突然変異並びに活性のためのCD137及び腫瘍間質特異的FAPへの同時結合の必要性を有するように操作されている。FAP(線維芽細胞活性化タンパク質)は、アンカーターゲットである。FAPは、腫瘍間質内に位置する活性化された線維芽細胞にのみ発現される。したがって、FAP二重特異性分子は、T細胞活性化及び活性化された線維芽細胞と物理的に密接に接触しているガン細胞の殺傷を促進するためにのみ機能するであろう。活性化された線維芽細胞と直接接触していない腫瘍細胞は、この処置により影響を受けず、増殖し続けるであろう。したがって、腫瘍部位のみでCD137レセプター誘導活性化及びT細胞浸潤を媒介するためのアンカーターゲットとしてFAPを使用することには明確な利点がある。
発明者らは、腫瘍におけるCD137とFAPとの共局在性発現を見出した。直結腸ガン(CRC)、胃ガン(GC)及び膵臓ガン(PAC)の大規模サブセットにおける共局在性発現の出現率を調査している。高い出現率が、CRCにおいて、CD137の発現(88~100%)及びFAPの発現(87~100%)について一貫して示された。GCでは、CD137についても。全症例の56~90%で実証され、びまん型と比較して腸型で顕著に高頻度であった。一方、FAPは、原発性及び転移性胃ガンにおいて、高レベルで恒常的に発現されることが示されている。PACでは、CD137発現を全症例の50~82%、FAPを81%で示すことができた。
したがって、CD137及びFAPは、各種の腫瘍において共局在性発現を示し、非ガン性細胞では、ほとんど又は全く共発現を示さない。特に、FAPは、CD137活性化に対する報告された感受性を有する正常肝組織又は肝細胞では検出できなかった。
本明細書において具体的に定義されていない用語は、本開示及び文脈を考慮して、当業者によりそれらに与えられるであろう意味を与えられるべきである。ただし、本明細書で使用する場合、反対に指定されない限り、下記用語は、示された意味を有し、下記慣例が遵守される。
本発明の第1の態様は、CD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位(ここで、CD137(4-1BBリガンドレセプター)に特異的に結合する抗原結合部位は、免疫グロブリン(Ig)分子の一部である)と、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位(ここで、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位は、2つのscFvを含む)とを有する、免疫グロブリン様結合分子を提供する。各タンパク質及びそれらに関連する遺伝子は、当技術分野において公知であり、生物学的データベースにおいて十分に表わされている。
「ヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)」は、NCBI:NP_001552及びUniprot:Q07011で提供されるタンパク質(配列番号:1)及びそのタンパク質をコードする核酸配列として定義される。細胞外ドメイン(ECD)の種々のCRD領域を規定するアミノ酸は、以下の表1に規定されるとおりである。免疫化キャンペーンにおいて免疫原として使用されるヒトCD137及びカニクイザルCD137についてタグ化されたヒト-Fc-Hisタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号:335及び343に対応し、表1に含まれる。「カニクイザルCD137(4-1BB、TNFRSF9)」は、Uniprotアクセッション番号F6W5G6で提供されるタンパク質(配列番号:2)及びそのタンパク質をコードする核酸配列として定義される。「マウスCD137(4-1BB、TNFRSF9)」は、UniprotアクセッションP20334で提供されるタンパク質(配列番号:3)及びそのタンパク質をコードする核酸配列として定義される。
「ヒト線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)」は、NCBI:NP_004451及びUniprot:Q12884で提供されるタンパク質(配列番号:4)並びにそのタンパク質をコードする核酸配列として定義される。また、「線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)」という用語は、プロリルエンドペプチダーゼFAP又はセプラーゼ(EC 3.4.21)としても公知である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び/又はカニクイザルFAPに特異的に結合可能である。ヒトFAPの細胞外ドメイン(ECD)は、26位から760位までのアミノ酸に広がっている。マウスFAPのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号P97321(配列番号:4)又はNCBI RefSeq NP_032012.1で示される。マウスFAPの細胞外ドメイン(ECD)は、26位から761位までのアミノ酸に広がっている。好ましくは、本発明の抗FAP結合分子は、FAPの細胞外ドメインに結合する。
本発明は、少なくとも2つの異なる部位についての結合特異性を有する結合分子に関する。本発明に関して、免疫グロブリン様結合分子は、抗体に由来する。結合分子を調製するための技術は、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖ペアのリコンビナント同時発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO第93/08829号及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照のこと)及び「ノブインホール」操作(例えば、US第5,731,168号を参照のこと)を含むが、これらに限定されない。また、本発明の免疫グロブリン様結合分子を、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を調製するための静電ステアリング効果を操作すること(WO第2009/089004号)、2つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること(例えば、US第4,676,980号及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照のこと)、二重特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al., Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)を参照のこと)、二重特異性抗体フラグメントを調製するための「ディアボディ」技術を使用すること(例えば、Hollinger et al., PNAS. USA, 90:6444- 6448 (1993)を参照のこと)及び一本鎖Fv(sFv)二量体を使用すること(例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと)並びに例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されるような三重特異性抗体を調製することによっても調製することができる。
本明細書で使用する場合、「抗原結合部位」という用語は、抗体に由来する重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブな抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、一般的には、類似する構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)及び3つの超可変領域を含む。このような場合、VH及びVLの各可変ドメインは、超可変領域又はループを構成する3つの相補性決定領域(CDR)を含む。一般的には、ネイティブな4本鎖抗体は、VHに3つ(H1、H2、H3)及びVLに3つ(L1、L2、L3)の、6つの超可変領域を含む。抗原結合特異性を付与するのに、1つのVH又はVLドメインで十分である場合がある。一態様では、本発明の抗原結合部位又はタンパク質の特定の部分は、一般的には、抗体に由来する。抗体又は免疫グロブリン分子の一般化された構造は、当業者に周知である。
「抗原結合分子」又は「抗原結合ポリペプチド」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子又はポリペプチドの例は、抗体及び抗体フラグメントである。
「抗体」又は「免疫グロブリン分子」(免疫グロブリンとしても公知である、Igと略される)は、脊椎動物の血液又は他の体液中に見出すことができるガンマグロブリンタンパク質であり、異物、例えば、細菌及びウイルスを特定し、中和するために、免疫系により使用される。それらは、典型的には、例えば、1つの単位を有する単量体、2つの単位を有する二量体又は5つの単位を有する五量体を形成するための基本的な構造単位で構成され、それぞれ、2つの大きな重鎖及び2つの小さな軽鎖を有する。抗体は、非共有相互作用により、抗原として公知の他の分子又は構造に結合することができる。この結合は、抗体が高い親和性で特定の構造にのみ結合するであろうという意味で特異的である。抗体により認識される抗原の固有の部分は、エピトープ又は抗原決定基と呼ばれる。エピトープに結合する抗体の部分は、パラトープと呼ばれる場合もあり、抗体のいわゆる可変ドメイン又は可変領域(Fv)に存在する。可変ドメインは、フレームワーク領域(FR)により離間された3つのいわゆる相補性決定領域(CDR)を含む。「免疫グロブリン様結合分子」は、免疫グロブリン分子に類似する抗原結合特徴を有し、抗体分子の同じ機能的戦略を使用する、すなわち、それらは、抗原に特異的に結合可能であり、少なくとも1つの抗原結合領域を有する。ただし、免疫グロブリン様分子は、天然に見出されるような構造及び配列には限定されない。
「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が少なくとも2つの区別できる抗原決定基に特異的に結合可能であることを意味する。「価」という用語は、1つの区別できる抗原決定基について、抗原結合分子中の1つの区別できる抗原決定基に特異的な特定数の結合部位の存在を指す。したがって、「二価」という用語は、抗原結合分子中の特定の抗原決定基それぞれに特異的な2つの結合部位の存在を示す。本発明の特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、各抗原決定基について二価でもあり、これは、その文脈において、それらがCD137に特異的な2つの結合部位及びFAPに特異的な2つの結合部位を有することを意味する。
「相補性決定領域」及び「CDR」という用語は、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことが、当技術分野において公知である。一般的には、各重鎖可変領域に3つのCDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)が存在し、各軽鎖可変領域に3つのCDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)が存在する。
所定のCDRのアミノ酸配列境界を、Kabat et al. (1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(「Kabat」ナンバリングスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948(「Chothia」ナンバリングスキーム)、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,」 J. Mol. Biol. 262, 732-745.(「Contact」ナンバリングスキーム)、Lefranc M P et al.,「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,」 Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(1):55-77(「IMGT」又は「CCG」ナンバリングスキーム)及びHonegger A and Pltickthun A, 「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,」 J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3):657-70を含む、多くの公知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。
所定のCDRの境界は、命名規則に応じて変化する場合がある。CDR及びFRに割り当てられるアミノ酸位置を例えば、ナンバリングシステムに従って定義することができる。ここで、本発明の抗体の可変領域の特定のアミノ酸は、分子のアミノ酸「1」としてのN末端から始まり、分子のC末端で終わる配列においてナンバリングされ、ここで、CDRの境界は、以下のアミノ酸ナンバリングにより定義される。
例えば、CD137 #1~6についてのKabat規則によれば、VH CDRは、以下のように配置される:残基31~35(CDR1)、50~66(CDR2)及び99~108(CDR3)。また、CD137 #1~6についてのKabatナンバリングシステムによれば、VL CDRは、以下のように配置される:残基24~34(CDR1)、50~56(CDR2)及び89~97(CDR3)。CD137 VH #7~10についてのKabat規則によれば、VH CDRは、以下のように配置される:残基31~35(CDR1)、50~65(CDR2)及び98~107(CDR3)。また、CD137 #7~10についてのKabatナンバリングシステムによれば、VL CDRは、以下のように配置される:残基24~39(CDR1)、55~61(CDR2)及び94~102(CDR3)。
本発明の文脈内では、CDRへの言及は、Kabat規則の定義に基づくが、本開示は、任意の1つのナンバリングシステムにより定義されたFR及びCDRには限定されず、上記検討されたものを含む全てのナンバリングシステムを含む。
このため、特に断りない限り、所定の抗体又はその領域、例えば、可変領域の「CDR」及び「相補性決定領域」という用語及び個々のCDR(例えば、CDR-H1、CDR-H2)並びに抗体又はその領域のフレームワーク領域(FR)は、本明細書において上記された公知のスキームのいずれかにより定義される各領域(例えば、相補性決定領域)を包含すると理解されたい。場合によっては、特定の1つ以上のCDR、例えば、Kabat、Chothia、CCG、IMGT又は当技術分野において公知の他の方法により定義されるCDRを特定するためのスキームが指定される。他の場合には、CDRの特定のアミノ酸配列が与えられる。本発明の各CDR領域についての代替的な命名規則は、以下の表3A~表3Hにある。
抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。「アミノ酸配列変異体」という用語は、親抗原結合分子(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的には、更なる研究のために選択される得られた変異体は、意図された機能に適した特定の生物学的特性における改変を有するであろう。これらの改変は、親抗原結合分子に対する特定の生物学的特性における「改善」、例えば、親和性の向上又は免疫原性の低下を含むことができるが、これらに限定されずかつ/又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。アミノ酸配列変異体を、抗体変異体をコードする核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することにより又はペプチド合成により調製することができる。このような改変は、例えば、抗体変異体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は同配列への残基の挿入及び/又は同残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが、最終構築体に到達されるようになされる。ただし、最終構築体は、所望の特徴を保有するという条件である。また、アミノ酸変化により、抗体変異体の翻訳後プロセシングを変化させる場合もある(例えば、グリコシル化部位の数又は位置の変化)。
例えば、1、2、3、4、5又は6個のアミノ酸を各CDR(当然、それらの長さに応じて)において挿入し、置換し又は欠失させることができ、一方、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は25個のアミノ酸を各FRにおいて挿入し、置換し又は欠失させることができる。好ましくは、抗体構築物へのアミノ酸配列挿入は、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の残基から100以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合及び/又はカルボキシル末端融合並びに1つ又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。さらに、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の残基の長さの範囲の、アミノ末端領域及び/又はカルボキシ末端領域での抗体構築物からのアミノ酸配列欠失は、ターゲット抗原に結合するその能力に加えて、抗体構築物において所望される特徴を最大化しかつ/又は何らかの方法で改変することが企図される。
置換突然変異誘発に最も興味深い部位は、重鎖及び/又は軽鎖のCDR、特に、超可変領域を含む(が、これらに限定されない)が、重鎖及び/又は軽鎖におけるFR改変も意図される。置換は、好ましくは、本明細書に記載されるような保存的置換である。好ましくは、CDR又はFRの長さに応じて、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸をCDRにおいて置換することができ、一方、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は25個のアミノ酸をフレームワーク領域(FR)において置換することができる。例えば、CDR配列が、6個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの1個、2個又は3個が置換されることが想定される。同様に、CDR配列が、15個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの1、2、3、4、5又は6個が置換されることが想定される。
一般的には、アミノ酸が、重鎖及び/又は軽鎖のCDRの1つ以上又は全てにおいて置換される場合、得られた「置換」配列は、「元の」CDR配列と少なくとも60%又は65%、より好ましくは、70%又は75%、さらにより好ましくは、80%又は85%、特に好ましくは、90%又は95%同一であることが好ましい。これは、CDRが「置換」配列とどの程度同一であるかはCDRの長さにより決まることを意味する。例えば、5個のアミノ酸を有するCDRは、好ましくは、少なくとも1つの置換されたアミノ酸を有するために、その置換配列と80%同一である。したがって、抗体構築物のCDRは、それらの置換配列に対して種々の程度の同一性を有する場合があり、例えば、CDRL1は、80%を有する場合があり、一方、CDRL3は、90%を有する場合がある。
抗体の「Fc部分」は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のFc部分」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン開裂に基づいて定義される。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMのクラスに分けられる。重鎖定常領域に従って、免疫グロブリンの種々のクラスはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。これらのうちの幾つかをサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgGl、IgG2、IgG3及びIgG4、IgAl及びIgA2にさらに分けることができる。抗体のFc部分は、補体活性化、Clq結合及びFcレセプター結合に基づいて、ADCC(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害)及びCDC(補体依存性細胞傷害)に直接関与する。補体活性化(CDC)は、ほとんどのIgG抗体サブクラスのFc部分に補体因子Clqが結合することにより開始される。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Clqへの結合は、Fc部分における規定された結合部位により引き起こされる。このような結合部位は、当技術分野において公知であり、例えば、Boakle et al., Nature 282 (1975) 742-743、Lukas et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560、Brunhouse and Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917、Burton et al., Nature 288 (1980) 338-344、Thommesen et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004、Idusogie et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184、Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161- 12168、Morgan et al., Immunology 86 (1995) 319-324、EP第0307434号に記載されている。このような結合部位は、例えば、L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及びP329(KabatのEUインデックスに従ってナンバリング)である。IgG1におけるC1q及びFcガンマレセプター結合を媒介するのにおいてこれらの残基の中で最も重要なものは、L234及びL235である(Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161- 12168)。サブクラスIgGl及びIgG3の抗体は、通常、補体活性化並びにClq及びC3結合を示し、一方、IgG2及びIgG4は、補体系を活性化せず、Clq及びC3と結合しない。
本発明の実施態様では、本発明における結合分子による補体産物であるC1q又はFcガンマレセプターへの結合は、234位及び235位(ヒトIgG1配列番号:283及びヒトIgG1KO配列番号:284のアミノ酸117及び118に対応)でのLからAへの突然変異誘発を伴うIgG1定常領域の利用により除去される。
当技術分野では、抗体がさらに開発され、抗体は、医学及び技術における多目的に使用できるツールとなっている。このため、本発明の文脈において、「抗体分子」又は「抗体」(本明細書において同義的に使用される)という用語は、例えば、2つの軽鎖及び2つの重鎖又はラクダ種におけるような2つの重鎖だけを含む天然に見出すことができる抗体を含むだけでなく、抗原に対する結合特異性及び免疫グロブリンの可変ドメインに対する構造的類似性を有する少なくとも1つのパラトープを含む全ての分子をさらに包含する。
このため、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体フラグメント、特に、Fv、Fab、Fab’又はF(ab’)2フラグメント、一本鎖抗体、特に、一本鎖可変フラグメント(scFv)、小型モジュール免疫医薬品(SMIP)、ドメイン抗体、ナノボディ、ディアボディを含むことができる。
モノクローナル抗体(mAb)は、アミノ酸配列が同一の単特異性抗体である。それらを、特異的抗体産生B細胞とメラノーマ(B細胞ガン)細胞との融合物のクローンを表わすハイブリッド細胞系統(ハイブリドーマと呼ばれる)からハイブリドーマ技術により産生することができる(Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256:495-7.)。代替的には、モノクローナル抗体をホスト細胞におけるリコンビナント発現により産生することができる(Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). 「Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.」 J Immunol Methods 204 (1): 77-87、以下も参照のこと)。
ヒトへの適用のために、他の種、例えば、元はマウスに由来する抗体の免疫原性を減少させることが望ましい場合が多い。これをキメラ抗体の構築により又は「ヒト化」と呼ばれるプロセスにより行うことができる。この文脈において、「キメラ抗体」は、異なる種(例えば、ヒト)に由来する配列部分(例えば、定常ドメイン)に融合されたある種(例えば、マウス)に由来する配列部分(例えば、可変ドメイン)を含む抗体であると理解される。「ヒト化抗体」は、元は非ヒト種に由来する可変ドメインを含む抗体であり、ここで、特定のアミノ酸が、その可変ドメインの全体配列をヒト可変ドメインの配列により密接に類似させるように変異されている。抗体のキメラ化及びヒト化の方法は、当技術分野において周知である(Billetta R, Lobuglio AF. 「Chimeric antibodies」. Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76、Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). 「Reshaping human antibodies for therapy」. Nature: 332:323)。
さらに、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて、例えば、ファージディスプレイ又はトランスジェニック動物の使用により、抗体を作製するための技術が開発されている(WO第90/05144号、D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) 「By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.」 J.Mol.Biol., 222, 581-597、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000、S. Carmen and L. Jermutus, 「Concepts in antibody phage display」. Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203、Lonberg N, Huszar D. 「Human antibodies from transgenic mice」. Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.、Bruggemann M, Taussig MJ. 「Production of human antibody repertoires in transgenic mice」. Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.)。このような抗体は、本発明の文脈において、「ヒト抗体」である。
また、抗体は、抗原結合特性を保持する免疫グロブリンフラグメント、例えば、Fab、Fab’又はF(ab’)2フラグメントも含むことができる。このようなフラグメントを例えば、タンパク質分解消化による免疫グロブリンのフラグメント化により又はこのようなフラグメントのリコンビナント発現により得ることができる。例えば、免疫グロブリン消化を、例えば、パパイン又はペプシンを使用して、ルーチンな技術により達成することができる(WO第94/29348号)。抗体のパパイン消化により、典型的には、2つの同一の抗原結合フラグメント、いわゆる、Fabフラグメントが産生され、それぞれが、1つの抗原結合部位及び残留Fcフラグメントを有する。ペプシン処理により、F(ab’)2が生成される。Fab分子において、可変ドメインはそれぞれ、好ましくは、ヒト起源の免疫グロブリン定常ドメインに融合される。このため、重鎖可変ドメインをCH1ドメイン(いわゆる、Fdフラグメント)に融合させることができ、軽鎖可変ドメインをCLドメインに融合させることができる。Fab分子をホスト細胞における各核酸のリコンビナント発現により産生することができる。以下を参照のこと。
免疫グロブリンの可変ドメイン又はこのような可変ドメインに由来する分子を異なる分子的状況に置くための多くの技術が開発されている。これらは、本発明の「免疫グロブリン様」分子である。一部の例では、これらの免疫グロブリン様分子は、天然に存在する免疫グロブリンと比較してサイズがより小さくすることができ、例えば、1つのアミノ酸鎖又は複数のアミノ酸鎖を含むことができる。例えば、一本鎖可変フラグメント(scFv)は、短いリンカー、通常、セリン(S)又はグリシン(G)と共に連結された免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合物である(WO第88/01649号、同第91/17271号、Huston et al; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195 - 217)。「単一ドメイン抗体」又は「ナノボディ」は、1つのIg様ドメインに抗原結合部位を有する(WO第94/04678号、同第03/050531号、Ward et al., Nature. 1989 Oct 12;341 (6242):544-6、Revets et al., Expert Opin Biol Ther. 5(1):111-24, 2005)。同じか又は異なる抗原についての結合特異性を有する1つ以上の単一ドメイン抗体同士を連結させることができる。ダイアボディは、2つの可変ドメインを含む2つのアミノ酸鎖からなる二価の抗体分子である(WO第94/13804号、Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8)。抗体様分子の他の例は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体である(IgSF、Srinivasan and Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96)。異なる概念から、一本鎖ヒンジに連結されたFvドメイン及び定常ドメインCH1を欠くエフェクタードメインを含む、いわゆる、小型モジュール免疫医薬品(SMIP)がもたらされる(WO第02/056910号)。
本発明に関して、本発明の第1の態様は、CD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位と、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位とを有する、免疫グロブリン様結合分子を提供する。
一態様では、本発明の免疫グロブリン様結合分子は、例えば、表面プラズモン共鳴分析(Malmqvist M., 「Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.」, Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.)により測定される親和性(1pM~100μM、好ましくは、1pM~1μMの範囲のKD値を有する)でCD137(4-1BB、TNFRSF9)又は線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)ターゲット抗原に結合する。抗体親和性を、動態排除アッセイ(KinExA)技術を使用して測定することもできる(Darling, R.J., and Brault P-A., 「Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions.」 ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657)。
本明細書で使用する場合、「結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、in vitroアッセイ、好ましくは、表面プラズモン共鳴アッセイ(SPR、BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)における、抗原のエピトープへの抗体及び/又は免疫グロブリン様分子の結合を指す。結合の親和性は、kon(抗体/抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数)、koff(解離定数)及びKD(koff/kon)という用語により定義される。特異的に結合するは、一般的には、レセプター分子とそのリガンドとの間の複合体の形成を指す。抗体-抗原結合の文脈において、高親和性抗体は、典型的には、10-9M以下の親和性でそれらのターゲット抗原に結合する。
「CD137に特異的に結合する抗体」もしくは「CD137に特異的に結合する免疫グロブリン様結合分子」又は「FAPに特異的に結合する抗体」もしくは「FAPに特異的に結合する免疫グロブリン様結合分子」は、抗体及び/又は免疫グロブリン様結合分子がそれぞれCD137又はFAPをターゲット化するのにおける診断剤及び/又は治療剤として有用であるように、十分な親和性で結合可能な分子を指す。一実施態様では、無関係の非CD137タンパク質への抗CD137結合分子の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)又はフローサイトメトリー(FAC)により測定された場合、抗体及び/又は免疫グロブリン様結合分子のCD137への結合の約10%未満である。特定の実施態様では、CD137に結合する抗体及び/又は免疫グロブリン様結合分子は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、≦0.001nMの解離定数(Kd)を有する。同様に、一実施態様では、無関係の非FAPタンパク質への抗FAP抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)又はフローサイトメトリー(FAC)により測定された場合、抗体及び/又は免疫グロブリン様結合分子のFAPへの結合の約10%未満である。特定の実施態様では、FAPに結合する抗体及び/又は免疫グロブリン様結合分子は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、≦0.001nM(例えば、10-6M以下、10-50M~10-13M、例えば、10-8M~10-10M)の解離定数(Kd)を有する。
抗体分子の結合親和性を親和性成熟として公知のプロセスにより向上させることができる(Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783、Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813、Shier et al., 1995, Gene 169:147-155)。したがって、親和性成熟抗体及び/又は免疫グロブリン様結合分子も、本発明に包含される。
さらに好ましい実施態様では、CD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的に結合する抗原結合部位は、免疫グロブリン(Ig)分子の一部であり、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位は、1つ以上のscFv、scFab、Fab又はFv結合エレメントを含む。好ましくは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位は、2つのscFvを含む。
「一本鎖Fvフラグメント」(scFv)は、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、リンカー及び抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含むポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、N末端からC末端方向に下記順序:a)VH-リンカー-VL、b)VL-リンカー-VHのうちの一方を有し、ここで、前記リンカーは、長さが15及び25個のアミノ酸、好ましくは、20個のアミノ酸のポリペプチドである。
加えて、これらの一本鎖Fab分子を、システイン残基の取り込みを介して、VHドメインとVLドメインとの間、VHドメイン内又はVLドメイン内にジスルフィド結合を取り込むことによりさらに安定化させることができる。N末端という用語は、ポリペプチド鎖の最初のアミノ酸を示し、一方、C末端という用語は、ポリペプチド鎖のC末端の最後のアミノ酸を示す。したがって、本発明の実施態様は、1つ以上のscFvがジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むものである。
添付の実施例において実証されているように、本発明者らは、N末端からC末端へのVL-VH配向を有するFAP scFvが本発明の結合分子において、ターゲット細胞においてCD137架橋を誘引するように機能することができることを示した。N末端からC末端へのVH-VL配向を有するFAP scFvも機能することができるが、その活性は、この配向において低下する場合がある。したがって、本発明の好ましい実施態様は、その順序がN末端からC末端にVL-VHである場合である。
本発明のさらに好ましい実施態様は、1つ以上のscFvがペプチドリンカー、好ましくは、約4~20個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、Ig分子に融合されているものである。好ましくは、scFvは、Ig分子の重鎖のC末端に融合される。好ましくは、Ig分子は、IgGである。
scFv分子をIgG分子の重鎖のC末端に連結させる方法は、当技術分野において周知である。典型的には、グリシン及びセリンアミノ酸の小さなリンカー配列(GSミニリンカーと呼ばれる)が使用される。リンカー中のアミノ酸の数を4(GGGS)(配列番号:279)、6(GGSGGS)(配列番号:280)、10(GGGGSGGGGS)(配列番号:281)、20(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号:282)又はそれ以上まで変化させることができる。実際には、通常、リンカーは、目的のIgGをコードする核酸分子(これは、本件では、CD137(4-1BB、TNFRSF9)結合部位のための重鎖の可変ドメインをコードする核酸を含むであろう)を、リンカー配列をコードする核酸分子により間隔を空けられた所望のscFvをコードする核酸(これは、本件では、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)結合部位のための重鎖の可変ドメインをコードする核酸を含むであろう)と組み合わせることにより形成される。ついで、以下でさらに説明されるように、この完全なHC-scFvコード核酸分子を発現ベクター内に配置し、完全なIgG重鎖-scFv単一ポリペプチドが形成されるように、適切なホスト細胞に導入する。
好ましくは、GSリンカーは、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号:282)である。
免疫グロブリン様結合分子は、抗体分子の特性に所望の影響を有する他の分子実体に(融合タンパク質として)融合しているか又は何らかの方法で(共有結合又は非共有結合により)連結していることができる。例えば、抗体分子の薬物動態特性、例えば、体液、例えば、血液における安定性、特に、一本鎖抗体又はドメイン抗体の場合における安定性を改善することが望ましい場合がある。この点に関して、特に、循環中のこのような抗体分子の半減期を延長するための多くの技術、例えば、ペグ化(WO第98/25971号、同第98/48837号、同第2004081026号)、血清タンパク質、例えば、アルブミンに対して親和性を有する別の抗体分子に抗体分子を融合させもしくは何らかの方法で共有的に付着させること(WO第2004041865号、同第2004003019号)又は血清タンパク質、例えば、アルブミンもしくはトランスフェリンの全部又は一部との融合タンパク質として抗体分子を発現させること(WO第2001079258号)が開発されている。
天然の抗体のFc領域は、多くのFcレセプターと相互作用するため、その結果、多くの重要な機能的能力(「エフェクター機能」と呼ばれる)が生じる。本発明の免疫グロブリン様結合分子は、可溶性Fcガンマレセプター又は補体C1qによる意図しない架橋を回避するように操作されたFc領域の一部を含有する。一実施態様では、このような抗体変異体は、親抗体よりFcガンマレセプター及び補体C1qに対する非常に低い親和性を有する。したがって、本発明の実施態様は、Ig分子が野生型Fc領域と比較して、Fcガンマレセプターもしくは補体レセプター又はその両方に対して低下した親和性を有するFc変異体を含むものである。
本発明の更なる実施態様は、本発明の結合分子が新生児Fcレセプター(FcRn)とのその相互作用を最適化することにより、血清レベル(半減期)を改変するように操作されたFc領域又はその関連部分を含む。
特異的ターゲット抗原に結合する結合部位を調製する方法は、当技術分野において周知である。当業者であれば、CD137(4-1BB、TNFRSF9)又は線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)ターゲット抗原に必要な特異性を有する結合部位を考案するために、これらの方法を容易に使用することができる。
抗体及び抗体フラグメントを生成する方法は、当技術分野において周知である。例えば、抗体は、抗体分子のin vivo産生の誘引、免疫グロブリンライブラリのスクリーニング(Orlandi et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837;Winter et al 1991, Nature 349:293-299)又は培養中の細胞系統によるモノクローナル抗体分子の生成を利用する幾つかの方法のいずれか1つにより生成することができる。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術及びエプスタイン-バーウイルス(EBV)-ハイブリドーマ技術(Kohler et al 1975. Nature 256:4950497;Kozbor et al 1985. J. Immunol. Methods 81 :31 -42;Cote et al 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030;Cole et al 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120)を含むが、これらに限定されない。
これらの方法を使用して、CD137(4-1BB、TNFRSF9)又は線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)ターゲット抗原に必要な特異性を有する結合部位を有する抗体を調製することは、当業者にとって日常的であろう。このような抗体からの結合ドメインの単離は、日常的な実務であり、実際に、使用することができる方法についての更なる情報は、添付の実施例において提供される。
本発明者らは、以下に列挙される本発明のCD137及びFAPについての例示的な抗原結合部位を利用して、特異的CD137(4-1BB、TNFRSF9)/線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)免疫グロブリン様結合分子を調製した。これらは、添付の実施例において検討されている。
非限定的な例として、二重特異性分子を、CD137(4-1BB、TNFRSF9)に特異的な例示的な抗原結合部位を使用して調製し、CD137 #1、CD137 #2、CD137 #3、CD137 #4、CD137 #5、CD137 #6、CD137 #7、CD137 #8、CD137 #9、CD137 #10である。
非限定的な例として、二重特異性分子を、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的な例示的な抗原結合部位を使用して調製し、これらをFAP #1、FAP #2、FAP #3、FAP #4及びFAP #5と呼ぶ。
特異的抗原結合部位のアミノ酸配列は、本説明及び配列表に提供される。
以下に、CD137(4-1BB、TNFRSF9)又は線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)についての特異的結合部位を含む本発明の好ましい実施態様の詳細を提供する。
疑義を回避するために、本発明の第1の態様について以下に列記された各特定の実施態様はそれぞれ、本発明の独立した態様であると考えることもできる。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:20のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:40のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:50のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:55のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:60のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:65のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:80のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:85のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9である。好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:90のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:95のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9である。本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:100のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:105のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
好ましくは、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
好ましくは、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:20のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:19(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:20のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:40のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:40のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:40のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:50のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:55のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:50のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:55のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:50のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:55のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:60のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:65のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:60のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:65のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:60のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:64のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:80のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:85のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:80のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:85のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:80のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:85のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:90のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:95のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:90のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:95のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:90のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:95のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:100のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:105のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:100のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:105のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の結合分子の好ましい実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、ここで、重鎖CDRは、配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDRは、配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
好ましくは、CD137に特異的な抗原結合部位は、配列番号:100のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:105のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含み、FAPに特異的な抗原結合部位は、配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。この実施態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。上記は、本発明の結合分子に使用することができるCD137及びFAPに特異的な抗原結合部位の具体的な組み合わせである。
これらの実施態様それぞれにおいて、抗原結合部位CD137を含有する可変重鎖は、ヒト重鎖定常領域に融合される。例えば、IgG、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE又はIgMである。好ましくは、ヒトIgG1の重鎖定常領域が使用される。
本発明の更なる実施態様は、抗原結合部位CD137を含有する可変軽鎖がヒト軽鎖定常領域カッパ又はラムダに融合される場合である。好ましくは、ヒトカッパの軽鎖定常領域が使用される。
野生型ヒトIgG1の重鎖定常領域についての例示的な配列は、配列番号:283に提供され、IgG1 KOは、配列番号:284に提供される。
ヒトカッパの軽鎖定常領域についての例示的な配列は、配列番号:285に提供される。
以下に、本発明の結合分子を提供する。本発明の特異的分子はそれぞれ、CD137に特異的に結合する可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含み、FAPに特異的に結合するscFvも含み、CD137に特異的に結合する可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、改変免疫グロブリン分子を含む。
本発明の更なる態様は、配列番号:151のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:152のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
本発明の更なる態様は、配列番号:153のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:154のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #1である。
本発明の更なる態様は、配列番号:155のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:156のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #1であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
本発明の更なる態様は、配列番号:157のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:158のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #7であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #4である。
本発明の更なる態様は、配列番号:159のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:160のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:164のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:165のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:169のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:170のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #2であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、配列番号:174のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:175のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:179のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:180のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:184のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:185のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #3であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、配列番号:189のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:190のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:194のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:195のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:199のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:200のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #4であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、配列番号:204のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:205のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:209のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:210のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:214のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:215のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #5であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、配列番号:219のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:220のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:224のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:225のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:229のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:230のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #6であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、配列番号:234のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:235のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:239のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:240のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:244のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:245のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #8であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、配列番号:249のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:250のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、#5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:254のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:255のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:259のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:260のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #9であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、配列番号:264のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:265のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #5である。
本発明の更なる態様は、配列番号:269のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:270のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #2である。
本発明の更なる態様は、配列番号:274のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖と、配列番号:275のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、免疫グロブリン様結合分子を提供する。この態様では、CD137に特異的な抗原結合部位は、CD137 #10であり、FAPに特異的な抗原結合部位は、FAP #3である。
本発明の更なる態様は、本発明の結合分子をコードする核酸分子又はこのような核酸分子を含有する発現ベクターを提供する。
一部の実施態様では、本発明の結合分子は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含む。当業者であれば理解することができるように、重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチド又は重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドをコードする核酸分子を容易に調製することができる。
軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を、標準的な方法を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、化学的にかつ酵素的に合成することができる。まず、適切なオリゴヌクレオチドを、合成遺伝子を産生するのに使用することができる当技術分野において公知の方法(例えば、Gait, 1984)により合成することができる。オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を生成する方法は、当技術分野において公知である(例えば、Stemmer et al., 1995;Ye et al., 1992;Hayden and Mandecki, 1988;Frank et al., 1987)。
本発明の核酸分子は、配列表に示されたポリペプチド配列をコードするDNA分子を含むが、これに限定されない。また、本発明は、WO第2007/042309号に定義されているように、高ストリンジェンシー結合及び洗浄条件下で、配列表に示されたポリペプチド配列をコードするDNA分子にハイブリダイゼーションする核酸分子に関する。好ましい分子(mRNAの観点から)は、本明細書に記載されたDNA分子のうちの1つと少なくとも75%又は80%(好ましくは、少なくとも85%、より好ましくは、少なくとも85%、最も好ましくは、少なくとも95%)の相同性又は配列同一性を有するものである。例として、真核細胞における抗体の発現を考慮して、配列表に示されたDNA配列は、真核細胞におけるコドン利用に一致するように設計されている。E. coliにおいて抗体を発現させることが所望される場合、これらの配列をE. coliのコドン利用に一致するように変更することができる。本発明のDNA分子の変異体を例えば、WO第2007/042309号に記載されているように、数種類の方法で構築することができる。
本明細書で使用する場合、「同一」又は「% 同一性」という用語は、2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、最大の対応のために比較され、アライメントされた場合、同じであるか又は特定の割合の同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、2つ以上の配列又はサブ配列を指す。% 同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的のためにアライメントされる(例えば、ギャップを第2のアミノ酸又は核酸配列との最適なアライメントのために、第1のアミノ酸又は核酸配列の配列に導入することができる)。ついで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められる場合には、分子は、その位置で同一である。2つの配列間の% 同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である(すなわち、% 同一性=同一位置の数/位置の合計数(例えば、重複位置)×100)。一部の実施態様では、比較される2つの配列は、ギャップが配列内に適切に導入された後、同じ長さである(例えば、比較される配列を超えて伸長する更なる配列を除外する)。例えば、可変領域配列が比較される場合、リーダー及び/又は定常ドメイン配列は考慮されない。2つの配列間の配列比較のために、「対応する」CDRは、両方の配列中の同じ位置にあるCDR(例えば、各配列のCDR-H1)を指す。
2つの配列間の% 同一性又は% 類似性の決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877におけるように改変されたKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索をNBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12により行い、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3により行い、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップアラインメントを得るために、Gapped BLASTをAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているように利用することができる。代替的には、PSI-Blastを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うことができる(同上)。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティー及び4のギャップペナルティーを使用することができる。配列分析のための更なるアルゴリズムは当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されているADVANCE及びADAM並びにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載されているFASTAを含む。FASTA内では、ktupは、検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ktup=2の場合、比較される2つの配列における類似領域は、アライメントされた残基ペアを見ることにより見出され、ktup=1の場合、単一のアライメントされたアミノ酸が検査される。ktupをタンパク質配列について2もしくは1又はDNA配列について1~6に設定することができる。ktupが指定されていない場合のデフォルトは、タンパク質について2であり、DNAについて6である。代替的には、タンパク質配列アラインメントをHiggins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402に記載されているCLUSTAL Wアルゴリズムを使用して行うことができる。
本発明の更なる態様は、先の特許請求の範囲のいずれか一項の結合分子の製造方法であり、
(a)本発明のホスト細胞を該分子の発現を可能にする条件下で培養することと、
(b)該分子を回収することとを含む、方法を提供する。
(a)本発明のホスト細胞を該分子の発現を可能にする条件下で培養することと、
(b)該分子を回収することとを含む、方法を提供する。
本発明のこの態様の実施態様は、(c)本発明の結合分子をさらに精製し/又は改変しかつ/又は製剤化する工程をさらに含む、該製造方法である。
本発明の結合分子を産生するために、全長の軽鎖及び/又は重鎖又はそのフラグメントをコードするDNA分子は、配列が転写及び翻訳制御配列に操作可能に連結されるように、発現ベクターに挿入される。
本発明の抗体を製造するために、当業者であれば、当技術分野において周知の非常に多様な発現系、例えば、Kipriyanov and Le Gall, 2004に概説されているものから選択することができる。
発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、EBV由来エピソーム等を含む。発現ベクター及び発現制御配列は、ホスト細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができる。特定の実施態様では、両DNA配列が、同じ発現ベクターに挿入される。都合の良いベクターは、任意のVH又はVL配列を上記されたように、容易に挿入し、発現させることができるように操作された適切な制限部位を有し、機能的に完全なヒトCH又はCL免疫グロブリン配列をコードするベクターである。定常鎖は、通常、抗体軽鎖についてカッパ又はラムダであり、抗体重鎖について、任意のIgGアイソタイプ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)又はアレル変異体を含む他の免疫グロブリンであることができるが、これらに限定されない。
また、リコンビナント発現ベクターにより、ホスト細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることもできる。シグナルペプチドが、成熟抗体鎖DNAのアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖をコードするDNAをベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は非免疫グロブリンタンパク質由来の異種ペプチドであることができる。代替的には、抗体鎖をコードするDNA配列は、シグナルペプチド配列を予め含有している場合がある。
リコンビナント発現ベクターは、抗体鎖をコードするDNA配列に加えて、プロモーター、エンハンサー、末端及びポリアデニル化シグナルを含むレギュラトリー配列並びにホスト細胞における抗体鎖の発現を制御する他の発現制御要素を有する。プロモーター配列(ほ乳類細胞における発現について例示される)の例は、(CMV)(例えば、CMV Simian Virus 40(SV40)(例えば、SV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマに由来するプロモーター及び/又はエンハンサー並びに強力なほ乳類プロモーター、例えば、ネイティブな免疫グロブリン及びアクチンプロモーターである。ポリアデニル化シグナルについての例は、BGHポリA、SV40後期又は初期ポリAである。代替的には、免疫グロブリン遺伝子の3’UTR等を使用することができる。
また、リコンビナント発現ベクターは、ホスト細胞におけるベクターの複製をレギュレーションする配列(例えば、複製起点)及び選択マーカー遺伝子を有することもできる。本発明の分子の重鎖もしくはその抗原結合部及び/又は軽鎖もしくはその抗原結合部をコードする核酸分子並びにこれらのDNA分子を含むベクターをリポソーム媒介性トランスフェクション、ポリカチオン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション又はウイルスベクターによる移入を含む当技術分野において周知のトランスフェクション法に従って、ホスト細胞、例えば、細菌細胞又は高等真核細胞、例えば、ほ乳類細胞に導入することができる。
好ましくは、重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子は、ホスト細胞、好ましくは、ほ乳類細胞に同時トランスフェクションされる2つのベクター上に存在する。
したがって、本発明の更なる態様は、重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター及び軽鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む、ホスト細胞を提供する。
発現のためのホストとして利用可能なほ乳類細胞系統は、当技術分野において周知であり、特に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO、CHO-DG44)細胞、NSO、SP2/0細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒトガン細胞(例えば、Hep G2)、A549細胞、3T3細胞又は任意のこのような細胞系統の派生体/子孫を含む。ヒト、マウス、ラット、サル及びげっ歯類細胞系統を含む(が、これらに限定されない)他のほ乳類細胞又は酵母、昆虫及び植物細胞含む(が、これらに限定されない)他の真核細胞又は原核細胞、例えば、細菌を使用することができる。本発明の結合分子は、ホスト細胞において結合分子の発現を可能にするのに十分な期間、ホスト細胞を培養することにより産生される。
抗体分子は、好ましくは、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるか又は例えば、分泌シグナルなしで発現される場合、ホスト細胞ライゼートから回収される場合がある。抗体の実質的に均質な調製物が得られるように、リコンビナントタンパク質及びホスト細胞タンパク質に使用される標準的なタンパク質精製方法を使用して、抗体分子を精製する必要である。例として、本発明の結合分子を得るのに有用な最先端の精製方法は、第1の工程として、培養培地又はライゼートからの細胞及び/又は粒子状細胞デブリの除去を含む。ついで、抗体は、例えば、免疫親和性カラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、Sephadexクロマトグラフィー、シリカ又はカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィーにより、交雑可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から精製される。CD137及びFAP結合分子を得るための方法における最終工程として、精製された抗体分子を治療用途について以下に記載されているように、乾燥させ、例えば、凍結乾燥させることができる。
本発明の更なる態様は、医薬において使用するための、本発明の結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、CD137/FAP結合分子に関し、ここで、結合分子は、下記特性:
(a)1×10-8M以下のKDでヒトCD137に結合する、
(b)ヒトCD137及びカニクイザルCD137に結合する、
(c)CRD3エピトープ又はCRD2/3エピトープでヒト及びカニクイザルCD137に結合する、
(d)本明細書に記載された抗原結合分子のいずれかとのCRD3エピトープ又はCRD2/3エピトープでのヒト及びカニクイザルCD137への結合を遮断しかつ/又はこの結合と競合する、
(d)FAP結合の不存在下では、CD137クラスター形成及びT細胞活性化を実質的に媒介しない、
(e)(混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける)T細胞増殖を増加させる、
(f)MLRアッセイにおけるインターフェロンガンマ産生を増加させる、
(g)MLRアッセイにおけるIL-2分泌を増加させる、
(h)CD137のCD137Lへの結合を阻害しない、
(i)抗原特異的記憶応答を刺激する、
(j)抗体応答を刺激する、
(k)in vivoでの腫瘍細胞成長を抑制する、及び
(l)in vivoでの肝毒性を示さない
のうちの少なくとも1つを示す。
(a)1×10-8M以下のKDでヒトCD137に結合する、
(b)ヒトCD137及びカニクイザルCD137に結合する、
(c)CRD3エピトープ又はCRD2/3エピトープでヒト及びカニクイザルCD137に結合する、
(d)本明細書に記載された抗原結合分子のいずれかとのCRD3エピトープ又はCRD2/3エピトープでのヒト及びカニクイザルCD137への結合を遮断しかつ/又はこの結合と競合する、
(d)FAP結合の不存在下では、CD137クラスター形成及びT細胞活性化を実質的に媒介しない、
(e)(混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける)T細胞増殖を増加させる、
(f)MLRアッセイにおけるインターフェロンガンマ産生を増加させる、
(g)MLRアッセイにおけるIL-2分泌を増加させる、
(h)CD137のCD137Lへの結合を阻害しない、
(i)抗原特異的記憶応答を刺激する、
(j)抗体応答を刺激する、
(k)in vivoでの腫瘍細胞成長を抑制する、及び
(l)in vivoでの肝毒性を示さない
のうちの少なくとも1つを示す。
好ましくは、結合分子は、1×10-8M~1×10-10MのKDでヒト及びカニクイザルCD137並びに1×10-8M及び1×10-10MのKDでヒト、カニクイザル及びマウスFAPタンパク質により弱く結合する。
さらに別の態様では、本発明は、CD137/FAP結合分子を提供し、ここで、CD137結合部は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、
(a)重鎖可変領域は、配列番号:10、20、30、40、50、60、70、80、90及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は、配列番号:15、25、35、45、55、65、75、85、95及び105からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(c)抗体は、1×10-8M以下のKDでヒトCD137に結合し、
(d)抗体は、FAPの不存在下で、CD137活性化を実質的に媒介しない。
(a)重鎖可変領域は、配列番号:10、20、30、40、50、60、70、80、90及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は、配列番号:15、25、35、45、55、65、75、85、95及び105からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(c)抗体は、1×10-8M以下のKDでヒトCD137に結合し、
(d)抗体は、FAPの不存在下で、CD137活性化を実質的に媒介しない。
本発明の好ましい実施態様は、10-10MのKDでヒトCD137に結合し、10-10MのKDでカニクイザルCD137に結合する。本発明の好ましい実施態様は、10-10MのKDでヒトFAP、10-10MのKDでカニクイザルFAP及び10-9MのKDでマウスFAPに結合する。
さらに別の態様では、本発明は、CD137結合分子を提供し、ここで、CD137重鎖可変領域は、ヒトIGHV3-7*01生殖細胞系統配列に由来するアミノ酸配列を含み、好ましくは、ここで、CD137結合分子は、配列番号:10、20、30、40、50及び60からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも78%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
さらに別の態様では、本発明は、CD137結合分子を提供し、ここで、CD137軽鎖可変領域は、ヒトIGKV1-NL1*01生殖細胞系統配列に由来するアミノ酸配列を含み、好ましくは、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号:15、25、35、45、55及び65からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一のアミノ酸配列を含む。
さらに別の態様では、本発明は、FAP結合分子を提供し、ここで、FAP重鎖可変領域は、ヒトIGHV3-23*04生殖細胞系統配列に由来するアミノ酸配列を含み、好ましくは、ここで、FAP結合分子は、配列番号:106、115、124、133又は142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも78%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
さらに別の態様では、本発明は、FAP結合分子を提供し、ここで、FAP軽鎖可変領域は、ヒトIGKV3-11*01生殖細胞系統配列に由来するアミノ酸配列を含み、好ましくは、ここで、FAP結合分子は、配列番号:110、119、128、137又は146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも78%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
さらに別の態様では、本発明は、CD137/FAP結合分子を提供し、ここで、FAP結合部は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、
(a)重鎖可変領域は、配列番号:106、115、124、133及び142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は、配列番号:110、119、128、137及び146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(c)(a)及び(b)の抗体は、1×10-7M以下のKDでヒトCD137に結合し、
(d)(a)~(c)の抗体は、FAP架橋の不存在下で、ヒトCD137L又はCD137に実質的に結合しない。
(a)重鎖可変領域は、配列番号:106、115、124、133及び142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は、配列番号:110、119、128、137及び146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(c)(a)及び(b)の抗体は、1×10-7M以下のKDでヒトCD137に結合し、
(d)(a)~(c)の抗体は、FAP架橋の不存在下で、ヒトCD137L又はCD137に実質的に結合しない。
さらに別の態様では、本発明は、CD137/FAP結合分子を提供し、ここで、FAP結合部は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、
(a)重鎖可変領域は、配列番号:106、115、124、133及び142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は、配列番号:110、119、128、137及び146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(c)(a)及び(b)の抗体は、アミノ酸87~118(配列番号:352)間の細胞外ドメインCRD3におけるヒトCD137上のエピトープに結合し又は
(d)(a)及び(b)の抗体は、アミノ酸46~117(配列番号:356)間の細胞外ドメインCRD2-3におけるヒトCD137上のエピトープに結合し、
(e)(a)~(c)の抗体は、FAP結合の不存在下で、CD137クラスター形成及びT細胞活性化を実質的に媒介しない。
(a)重鎖可変領域は、配列番号:106、115、124、133及び142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(b)軽鎖可変領域は、配列番号:110、119、128、137及び146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(c)(a)及び(b)の抗体は、アミノ酸87~118(配列番号:352)間の細胞外ドメインCRD3におけるヒトCD137上のエピトープに結合し又は
(d)(a)及び(b)の抗体は、アミノ酸46~117(配列番号:356)間の細胞外ドメインCRD2-3におけるヒトCD137上のエピトープに結合し、
(e)(a)~(c)の抗体は、FAP結合の不存在下で、CD137クラスター形成及びT細胞活性化を実質的に媒介しない。
好ましい実施態様では、上記されたCD137/FAP結合分子は、下記特性:
(a)抗体が(MLRアッセイにおける)T細胞増殖を増加させる、
(b)抗体が(MLRアッセイにおける)インターフェロンガンマ産生を増加させる、又は
(c)抗体が(MLRアッセイにおける)IL-2分泌を増加させる
のうちの少なくとも1つをさらに含む。
(a)抗体が(MLRアッセイにおける)T細胞増殖を増加させる、
(b)抗体が(MLRアッセイにおける)インターフェロンガンマ産生を増加させる、又は
(c)抗体が(MLRアッセイにおける)IL-2分泌を増加させる
のうちの少なくとも1つをさらに含む。
加えて又は代替的に、CD137/FAP結合分子は、上記列記された1つ以上の他の特徴を含むことができる。
本発明の更なる態様は、ガンの処置又は治療における使用のための、本発明の結合分子を提供する。本明細書で使用する場合、「処置」又は「治療」(並びにそのバリエーション、例えば、「処置する」又は「処置すること」、「治療的」)は、処置される個体の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、臨床病理学の経過の間に行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発の制限、症状の緩和及び疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の遅延、病状の改善又は緩和並びに寛解又は予後の改善を含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させ又は疾患の進行を遅らせるのに使用される。一態様では、本発明は、T細胞浸潤/FAP陽性腫瘍の処置に使用される。ガンは、結腸直腸ガン(CRC)(例えば、結腸直腸腺ガン)、胃ガン(GC)(例えば、胃腺ガン)、膵臓ガン(PAC)(例えば、膵臓腺ガン)、肺ガン(LC)(例えば、肺扁平上皮ガン、肺腺ガン、非小細胞肺ガン(NSCLC))、頭頸部ガン、尿路上皮ガン又はメラノーマであることが好ましいが、全てのガンの90%を構成する他の固形悪性腫瘍が企図される。これらの型の浸潤しにくい腫瘍に対する新規な処置のための満たされていない臨床的必要性のためである。
上記されたように、本発明者らは、本発明の結合分子がT細胞のFAP+組織制限CD137活性化及び腫瘍殺傷に非常に有用性を有し、したがって、CD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)の両方の共局在発現を有するガンの治療に使用することができることを特定した。特定の腫瘍がCD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)の共局在発現を有するかどうかを特定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、免疫組織化学を、腫瘍組織がCD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を発現するかどうかを決定するのに使用することができ、したがって、本発明の結合分子での処置に適切であろう。
CRCは、ICD-10に列記されている明確な悪性腫瘍疾患であり、世界的にガンの罹患率及び死亡率の主要原因の1つである。CRC患者の約25%は、明白な転移を呈し、転移疾患が、新たに診断された患者の40~50%に発生する。化学療法における近年の改善により、転移性CRCの生存期間は延長したが、ほとんどの患者は、その疾患により死亡するであろう。したがって、この疾患を処置するための更なる治療剤が大いに必要とされている。
更なる態様では、本発明は、ガンの治療又は予防のための方法であって、有効量の上記されたCD137/FAP結合分子のいずれかをヒトに投与することを含む、方法に関する。
好ましい適用様式は、注入又は注射(静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内)による非経口であるが、例えば、吸入、経皮、鼻腔内、頬側、経口による他の適用様式も適用可能である場合がある。
投与される分子の「治療上有効量」は、ガンの臨床症状を予防し、改善し又は治療するのに必要な最少量、特に、これらの障害に有効な最少量である。
1日当たりの適用可能な本発明の抗体の用量範囲は、通常、1μg/kg~100mg/kg、好ましくは、0.1mg/kg~20mg/kgである。
実際の薬学上有効量又は治療用量は、当然、当業者に公知の要因、例えば、患者の年齢及び体重、投与経路並びに疾患の重症度により決まるであろう。いずれの場合でも、組み合わせは、患者の固有の状態に基づいて薬学上有効量が送達されることを可能にする用量及び様式で投与されるであろう。
本発明の結合分子を単独で又は他の薬理学上有効成分、例えば、最先端又は標準治療の化合物、例えば、細胞増殖阻害物質又は細胞傷害性物質、細胞増殖阻害剤、血管新生物質、ステロイド、免疫モデュレーター/チェックポイント阻害剤等と併用で使用することできる。
したがって、本発明の更なる態様は、本発明の実施態様のいずれか1つの結合分子を薬学的に許容し得る担体及び場合により、1つ以上の更なる有効成分と共に含む、医薬組成物を提供する。
本発明の更なる態様は、ガンの治療に使用するための、本発明の結合分子を提供し、ここで、前記治療は、1つ以上の薬理学上活性物質を含む。
更なる実施態様では、本発明は、上記された抗CD137/FAPの実施態様のいずれか1つの抗体もしくは抗原結合フラグメント又は医薬組成物又は疾患の処置に使用するための、抗CD137/FAP抗体もしくは抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで、この使用は、ガン及び/又は腫瘍の治療のためのものである。
本発明の更なる態様は、ガン及び/又は腫瘍の治療のための医薬の製造における1つ以上の有効成分の使用を提供し、ここで、前記医薬は、本発明の実施態様のいずれか1つの結合分子を含む。
本発明の結合分子と併用して投与することができる細胞増殖阻害性及び/又は細胞傷害性活性物質は、ホルモン、ホルモン類似物及び抗ホルモン、アロマターゼ阻害剤、LHRHアゴニスト及びアンタゴニスト、成長因子(例えば、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF)、ヒト上皮成長因子(HER、例えば、HER2、HER3、HER4)が含まれるが、これらに限定されない。HER2、HER3、HER4)及び肝細胞成長因子等)の阻害剤(この阻害剤は、例えば、()成長因子抗体、()成長因子レセプター抗体及びチロシンキナーゼ阻害剤である)、例えば、セツキシマブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ニンテダニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ボスチニブ及びトラスツズマブ、代謝拮抗剤(例えば、葉酸拮抗剤、例えば、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ピリミジン類似物、例えば、5-フルオロウラシル(5-FU)、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、TAS-102、カペシタビン及びゲムシタビン、プリン及びアデノシン類似物、例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン及びペントスタチン、シタラビン(araC)、フルダラビン)、抗腫瘍抗生物質(例えば、アントラサイクリン)、プラチナ誘導体(例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン)、アルキル化剤(例えば、エストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド、ニトロソウレア、例えば、カルムスチン及びロムスチン、チオテパ等)、抗有糸分裂剤(例えば、ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン及びビンクリスチン等並びにタキサン、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル)、ベバシズマブ、ラムシルマブ及びアフリベルセプトを含む血管新生阻害剤、チューブリン阻害剤、DNA合成阻害剤、PARP阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド等及びエトポフォス、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロン)、セリン/トレオニンキナーゼ阻害剤(例えば、PDK1阻害剤、Raf阻害剤、A-Raf阻害剤、B-Raf阻害剤、C-Raf阻害剤、mTOR阻害剤、mTORC1/2阻害剤、PI3K阻害剤、PI3Kα阻害剤、二重mTOR/PI3K阻害剤、STKT33阻害剤、AKT阻害剤、PLK1阻害剤(例えば、ボラセルチブ)、CDK9阻害剤を含むCDK阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤)、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、PTK2/FAK阻害剤)、タンパク質タンパク質相互作用阻害剤、MEK阻害剤、ERK阻害剤、FLT3阻害剤、BRD4阻害剤、IGF-1R阻害剤、Bcl-xL阻害剤、Bcl-2阻害剤、Bcl-2/Bcl-xL阻害剤、ErbBレセプター阻害剤、BCR-ABL阻害剤、ABL阻害剤、Src阻害剤、ラパマイシン類似物(例えば、エベロリムス、テルシロシムス、リダロリムス、シロリムス)、アンドロゲン合成阻害剤、アンドロゲンレセプター阻害剤、DNMT阻害剤、HDAC阻害剤、ANG1/2阻害剤、CYP17阻害剤、放射性医薬品、免疫療法剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及びTIM3結合分子/免疫グロブリン、例えば、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ)並びに種々の化学療法剤、例えば、アミフォスチン、アナグレリッド、クロドロナット、フィルグラスチン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミゾール、メスナ、ミトタン、パミドロナート及びポルフィマー、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ)、Smac及びBH3模倣物、mdm2-p53アンタゴニストを含むp53機能を回復させる薬剤、Wnt/ベータ-カテニンシグナル伝達経路の阻害剤並びに/又はサイクリン依存性キナーゼ9阻害剤を含むが、これらに限定されない。
PD-1シグナル伝達が、抗腫瘍免疫応答を逃れるために腫瘍により利用される重要なメカニズムであることを示唆する証拠が増えている(Dong, et al, 2002、Iwai et al, 2002、Shin and Ribas, 2015)。抗PD-1及びPD-L1モノクローナル抗体による近年の臨床試験では、各種のガンを有する一部の患者において臨床的応答性が示されている。これらの免疫チェックポイント阻害剤により、PD-1とPD-L1との間の相互作用が遮断され、刺激シグナルを回復させ、T細胞の活性化を促進する。T細胞は、腫瘍浸潤T細胞(TIL)が多く、TILは、ガン細胞を排除する強力な免疫応答を引き起こす場合がある。このような状況において、本発明のCD137/FAP分子により、腫瘍微小環境において、TILを活性化しかつ/又はリクルートしかつ/又は維持することにより、ガン細胞の排除を増強することができる。残念なことに、現在の免疫療法処置に応答するのは、処置された患者全体の少数のみである。例えば、直腸結腸ガン(CRC)細胞は、PD-L1の発現が少なく、MSS CRC(マイクロサテライト安定性(MSS)腫瘍)におけるPD-L1の発現は、主に腫瘍浸潤免疫細胞に限定されることが、Valentini et al.により報告されている(Oncotarget, 2018)。これにより、MSS CRC患者が抗PD-1/PD-L1療法に応答しなかったかという理由を説明することができた。このように、患者の応答率を潜在的に上昇させることができる治療法を開発することが最優先事項となっている。
研究から、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の存在(すなわち、「炎症性腫瘍(hot tumor)」)又は腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の不存在(すなわち、「非炎症性腫瘍(cold tumor)」)は、PD-1療法に対する応答を予測するのに重要であり、TILの存在と種々の抗腫瘍療法中のより良好な患者アウトカムとを相関させることが示唆されている(Galon et al., 2006、Hwang et al., 2012、Mahmoud et al. 2011)。このため、本発明の一態様は、CD137/FAP二重特異性分子と「非炎症性」腫瘍を「炎症性」にする治療法との併用である。例えば、本発明の実施態様は、PDL-1阻害を弱める(かつ/又はチェックポイント遮断耐性を何らかの方法で克服する)ことができる免疫療法を、FAP+発現腫瘍を特異的にターゲットとするCD137/FAP二重特異性分子と併用する。これらの治療法の併用により、一方では、阻害が解除されるが、他方では、腫瘍部位への新たなT細胞浸潤が増加しかつ/又は腫瘍微小環境におけるT細胞の保持及び活性化が促進される(two-prongアプローチ)。治療法の併用により、いずれかの単独処置より良好な腫瘍制御がもたらされる。
上記を念頭に置いて、以下:
(i)例えば、CRC患者の処置のためのPD-1及びPD-L1剤を含む免疫療法剤、例えば、ペムブロリズマブ及びニボルマブ(以下で検討する)、
(ii)SIRPα抗体(例えば、任意のSIRPアンタゴニスト、特に、抗体、好ましくは、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO第2017/178653号に開示されているもの、同第20200068752号及び同第2019023347号に開示されている他の例)、
(iii)TcEngager(例えば、好ましくは、WO第2019234220号及びEP第19201200.3号に開示されているもの)、
(iv)KISIMAワクチン(例えば、好ましくは、参照により本明細書に組み入れられるWO第2016/146260号及び同第2018/055060号に開示されているもの);
(v)腫瘍溶解性ウイルス(例えば、好ましくは、特異的遺伝子カーゴを伴う又は伴わない水疱性口内炎ウイルス、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO第2010/040526号及びPCT/EP第2020/051701号それぞれに開示されていれるVSV-GP及びVSV-CCL21)、
(vi)STINGアゴニスト(例えば、好ましくは、参照により本明細書に組み入れられるWO第2018060323号及びUS第10,537,590号に開示されているもの)並びに
(vii)CRCの処置に使用される化学療法剤(5-フルオロウラシル、イリノテカン、ドキソルビシン及びTAS-102を含む)
から選択される薬剤との併用での本発明のCD137/FAP結合分子による処置が特に好ましい。
(i)例えば、CRC患者の処置のためのPD-1及びPD-L1剤を含む免疫療法剤、例えば、ペムブロリズマブ及びニボルマブ(以下で検討する)、
(ii)SIRPα抗体(例えば、任意のSIRPアンタゴニスト、特に、抗体、好ましくは、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO第2017/178653号に開示されているもの、同第20200068752号及び同第2019023347号に開示されている他の例)、
(iii)TcEngager(例えば、好ましくは、WO第2019234220号及びEP第19201200.3号に開示されているもの)、
(iv)KISIMAワクチン(例えば、好ましくは、参照により本明細書に組み入れられるWO第2016/146260号及び同第2018/055060号に開示されているもの);
(v)腫瘍溶解性ウイルス(例えば、好ましくは、特異的遺伝子カーゴを伴う又は伴わない水疱性口内炎ウイルス、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO第2010/040526号及びPCT/EP第2020/051701号それぞれに開示されていれるVSV-GP及びVSV-CCL21)、
(vi)STINGアゴニスト(例えば、好ましくは、参照により本明細書に組み入れられるWO第2018060323号及びUS第10,537,590号に開示されているもの)並びに
(vii)CRCの処置に使用される化学療法剤(5-フルオロウラシル、イリノテカン、ドキソルビシン及びTAS-102を含む)
から選択される薬剤との併用での本発明のCD137/FAP結合分子による処置が特に好ましい。
PD-1経路阻害剤は、本発明及びその実施態様の全ての意味において、PD-1とそのレセプターとの相互作用を阻害する化合物である。PD-1経路阻害剤は、好ましくは、PD-1レセプターにより媒介されるPD-1経路シグナル伝達を障害することができる。PD-1阻害剤は、PD-1経路シグナル伝達と拮抗可能なPD-1経路の任意のメンバーに対して向けられる任意の阻害剤であることができる。阻害剤は、好ましくは、PD-1レセプター、PD-L1又はPD-L2に対して向けられるPD-1経路の任意のメンバーをターゲットとするアンタゴニスト抗体であることができる。また、PD-1経路阻害剤は、PD1リガンドの活性を遮断するPD-1レセプターのフラグメント又はPD-1レセプターであることもできる。
PD-1アンタゴニストは、当技術分野において周知であり、例えば、(参照により本明細書に組み入れられる)Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151に概説されている。任意のPD-1アンタゴニスト、特に、抗体、例えば、Li et al.に開示されているもの及び本明細書において以下に開示される更なる抗体を本発明に従って使用することができる。好ましくは、本発明及びその全ての実施態様のPD-1アンタゴニストが、下記抗体:ペンブロリズマブ(抗PD-1抗体)、ニボルマブ(抗PD-1抗体)、ピジリズマブ(抗PD-1抗体)、PDR-001(抗PD-1抗体)、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及びPD1-5、好ましくは、本明細書において以下に開示されているBI-754019(抗PD-1抗体)、アテゾリズマブ(抗PD-L1抗体)、アベルマブ(抗PD-L1抗体)、デュルバルマブ(抗PD-L1抗体)からなる群より選択される。
例えば、Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369(2):134-44に開示されているペンブロリズマブ(以前はラムブロリズマブとしても公知、商品名Keytruda、MK-3475としても公知)は、PD-1に結合するヒト化IgG4モノクローナル抗体であり、Fc媒介性細胞殺傷を妨げるように設計されたC228Pに突然変異を含有する。ペンブロリズマブは、例えば、US第8,354,509号及びWO第2009/114335号に開示されている。切除不能又は転移性メラノーマを患っている患者及び転移性NSCLCを有する患者の処置について、FDAにより承認されている。
ニボルマブ(CAS登録番号:946414-94-4、BMS-936558又はMDX1106b)は、検出可能な抗体依存性細胞殺傷性(ADCC)を欠いており、PD-1を特異的に遮断する完全ヒトIgG4モノクローナル抗体である。ニボルマブは、例えば、US第8,008,449号及びWO第2006/121168号に開示されている。切除不能又は転移性メラノーマ、転移性NSCLC及び進行性腎細胞ガンを患っている患者の処置について、FDAにより承認されている。
ピジリズマブ(CT-011、Cure Tech)は、PD-1に結合するヒト化IgG1kモノクローナル抗体である。ピジリズマブは、例えば、WO第2009/101611号に開示されている。
PDR-001又はPDR001は、PD-L1及びPD-L2のPD-1への結合を遮断する高親和性リガンド遮断ヒト化抗PD-1 IgG4抗体である。PDR-001は、WO第2015/112900号及び同第2017/019896号に開示されている。
抗体PD1-1~PD1-5は、表4に示される配列により定義される抗体分子である。ここで、HCは、(全長)重鎖を示し、LCは、(全長)軽鎖を示す。
具体的には、本明細書において上記された抗PD-1抗体分子は、
(PD1-1)配列番号:652のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:653のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-2)配列番号:654のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:655のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-3)配列番号:656のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:657のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-4)配列番号:658のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:659のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-5)配列番号:660のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:661のアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する。
(PD1-1)配列番号:652のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:653のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-2)配列番号:654のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:655のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-3)配列番号:656のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:657のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-4)配列番号:658のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:659のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(PD1-5)配列番号:660のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号:661のアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する。
アテゾリズマブ(Tecentriq、MPDL3280Aとしても公知)は、PD-L1をターゲットとするファージ由来のヒトIgG1kモノクローナル抗体であり、例えば、Deng et al. mAbs 2016;8:593-603に記載されている。尿路上皮ガンを患っている患者の処置について、FDAにより承認されている。
アベルマブは、完全ヒト抗PD-L1 IgG1モノクローナル抗体であり、例えば、Boyerinas et al. Cancer Immunol. Res. 2015; 3:1148-1157に記載されている。
デュルバルマブ(MEDI4736)は、PD-L1に対して高い特異性を有するヒトIgG1kモノクローナル抗体であり、例えば、Stewart et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1052-1062又はIbrahim et al. Semin. Oncol. 2015; 42:474-483に記載されている。
Li et al.(上記)に開示さているか又は臨床試験中であることが公知の更なるPD-1アンタゴニスト、例えば、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、REGN2810、BMS-936559、JS001-PD-1、SHR-1210、BMS-936559、TSR-042、JNJ-63723283、MEDI4736、MPDL3280A及びMSB0010718Cを上記言及されたアンタゴニストの代わりに又はそれに加えて使用することができる。
本明細書で使用する場合、INNは、オリジネーター抗体(originator antibody)と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有する全てのバイオシミラー抗体も包含することを意味し、米国において42 USC §262サブセクション(k)及び他の管轄区域における同等の規則の下で認可されたバイオシミラーを含むが、これらに限定されない。
上記列記されたPD-1アンタゴニストは、それらの各製造、治療的使用及び特性と共に当技術分野において公知である。
一実施態様では、PD-1アンタゴニストは、ペンブロリズマブである。
別の実施態様では、PD-1アンタゴニストは、ニボルマブである。
別の実施態様では、PD-1アンタゴニストは、ピジリズマブである。
別の実施態様では、PD-1アンタゴニストは、アテゾリズマブである。
別の実施態様では、PD-1アンタゴニストは、アベルマブである。
別の実施態様では、PD-1アンタゴニストは、デュルバルマブである。
別の実施態様では、PD-1アンタゴニストは、PDR-001である。
好ましい実施態様では、本発明のタンパク質、例えば、CD137 #1/FAP #1、CD137 #7/FAP #1、CD137 #1/FAP #4、CD137 #7/FAP #4、CD137 #2/FAP #5、CD137 #2/FAP #2、CD137 #2/FAP #3、CD137 #3/FAP #5、CD137 #3/FAP #2、CD137 #3/FAP #3、CD137 #4/FAP #5、CD137 #4/FAP #2、CD137 #4/FAP #3、CD137 #5/FAP #5、CD137 #5/FAP #2、CD137 #5/FAP #3、CD137 #6/FAP #5、CD137 #6/FAP #2、CD137 #6/FAP #3、CD137 #8/FAP #5、CD137 #8/FAP #2、CD137 #8/FAP #3、CD137 #9/FAP #5、CD137 #9/FAP #2及びCD137 #9/FAP #3、CD137 #10/FAP #5、CD137 #10/FAP #2、CD137 #10/FAP #3は、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及びPD1-5からなる群より選択されるPD-1アンタゴニストと併用してガンの処置に使用される。
治療に使用されるために、本発明の結合分子は、動物又はヒトへの投与を容易にするのに適した医薬組成物に製剤化される。抗体分子の典型的な製剤を凍結乾燥もしくは何等かの方法で乾燥させた製剤又は水溶液又は水性もしくは非水性懸濁液の形態で、抗体分子を生理学的に許容し得る担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより調製することができる。担体、賦形剤、改質剤又は安定剤は、利用される用量及び濃度で無毒である。それらは、バッファー系、例えば、ホスファート、シトラート、アセタート及び他の無機もしくは有機酸及びそれらの塩;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤、例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール及びm-クレゾール;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンもしくはポリエチレングリコール(PEG);アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン;グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリンもしくはデキストランを含む単糖類、二糖類、オリゴ糖類もしくは多糖類及び他の淡水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール;塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)並びに/又はイオン性もしくは非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商標)(ポリソルベート)、PLURONICS(商標)もしくは脂肪酸エステル、脂肪酸エーテルもしくは糖エステルを含む。また、有機溶媒、例えば、エタノール又はイソプロパノールを抗体製剤に含有させることもできる。また、賦形剤は、放出改変又は吸収改変機能を有する場合がある。
ここから、本発明を下記非限定的な実施例により説明する。
実施例1:腫瘍微小環境との関連でのヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を認識する結合分子の設計
本発明者らは、CD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)と結合し、腫瘍間質におけるCD137 T細胞活性化及びFAP発現線維芽細胞へのリクルートをターゲットとする、結合分子を開発した。使用された分子設計は、1つのターゲット抗原についての特異性を有するIgG抗体(「マスター抗体」と呼ばれる)を有し、異なる特異性のscFvが重鎖のC末端に連結している。設計の概略を図1Aに示す。作用モードの概略を図1Bに示す。
本発明者らは、CD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)と結合し、腫瘍間質におけるCD137 T細胞活性化及びFAP発現線維芽細胞へのリクルートをターゲットとする、結合分子を開発した。使用された分子設計は、1つのターゲット抗原についての特異性を有するIgG抗体(「マスター抗体」と呼ばれる)を有し、異なる特異性のscFvが重鎖のC末端に連結している。設計の概略を図1Aに示す。作用モードの概略を図1Bに示す。
好ましくは、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
二重特異性分子は、scFvの可変重鎖(VH)ドメインと可変軽鎖(VL)ドメインとの間に柔軟なペプチド配列を含有し、scFvドメインは、更なる一連のリンカーを介して、マスターIgG抗体に連結している。1つの構成において、scFvは、VLドメインがscFvの「N末」端を形成し、このため、マスター抗体の重鎖のC末端に融合され、一方、VHがscFvのC末端、実際には、重鎖ポリペプチド全体を形成するように配向される。ただし、この「N-VL-VH-C」構造を逆にすることができる、すなわち、「N-VH-VL-C」とすることができると理解することができる。
下記実施例により、CD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する二重特異性分子を生成するのに使用される方法並びにこれらの分子のフォーマット及び生物学的活性におけるバリエーションを説明する。
実施例2:CD137(4-1BB、TNFRSF9)を認識する結合ドメインの調製
理解することができるように、ヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する二重特異性分子を調製するには、個々のターゲット抗原に結合する可変ドメインを得る必要がある。
理解することができるように、ヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に結合する二重特異性分子を調製するには、個々のターゲット抗原に結合する可変ドメインを得る必要がある。
a.CD137についての免疫化キャンペーン
ヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)に結合する二重特異性分子を調製するために、CD137(4-1BB、TNFRSF9)免疫マウスに由来するクローンハイブリドーマ又は単一B細胞をin vitroで培養した。上清をヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)に対する反応性についてスクリーニングした。ついで、免疫グロブリン(Ig)VH及びVL遺伝子を特定された陽性クローンから増幅した。
ヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)に結合する二重特異性分子を調製するために、CD137(4-1BB、TNFRSF9)免疫マウスに由来するクローンハイブリドーマ又は単一B細胞をin vitroで培養した。上清をヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)に対する反応性についてスクリーニングした。ついで、免疫グロブリン(Ig)VH及びVL遺伝子を特定された陽性クローンから増幅した。
簡潔に、野生型CD1マウスをヒト及びカニクイザルCD137-Fc_Hisタンパク質(それぞれ配列番号:349及び359)で免疫化し、完全フロイントアジュバントを、抗体応答を増強するために、種々の時点で使用した。血清学的検査を、抗原としてヒト及びカニクイザルCD137-Fc-Hisタンパク質を使用するELISAにより評価した。血清学的に陽性のマウスには、脾臓B細胞単離の1週間前に最終ブーストを与えた。マウスの脾臓を回収し、全脾細胞を回収するように処理した。全ての手順をIACUCにより承認されたプロトコールに従って行った。
CD137についてのバインダーを特定するために、6つの選別されたマウス脾臓を単離し、回収された脾細胞を標準的なSBC抗体生成手法に従って染色した。最初に、回収された脾細胞を製造業者の説明書に従って、マウスpan-T Dynabeads(Invitrogen 114.43D)を使用して、T細胞を枯渇させた。ついで、枯渇させた細胞調製物を、1nM ヒトCD137_huTNFRSF9_Hu-His 開裂性_タグ_ビオチン(配列番号:335)及び1nM MuGIPR-hu.FC-AF647と共に、CD3、CD19、IgD、IgM、B220及び生きたメモリーB細胞の特定を支援するために染色に含ませたSytox blueに対する蛍光色素コンジュゲート抗体と合わせてインキュベーションした。ストレプトアビジン-PEをビオチン化ヒトCD137に結合するB細胞の検出のために加えた。ついで、ヒトCD137抗原陽性メモリーB細胞を384ウェルプレートに単独で選別し、37℃、5% CO2で7日間培養した。B細胞上清を、製造業者の説明書に従って、AlphaLISAによりビオチン化ヒト及びカニクイザルCD137タンパク質への結合についてスクリーニングした。
CD137特異的バインダーを特定するために、ヒトFcにのみ反応した抗体を、カウンターFcベイトMuGIPR-hu.FC-AF647及びhuCD137ベイトhuTNFRSF9_His-ビオチンを使用して除去した。両方とも、CD1マウスB細胞脾細胞、FMO1及びFMO2それぞれとは独立して良好な結合を示す。二重陽性MuGIPR-hu.FC/huCD137 B細胞を完全に染色されたサンプル中のHu CD137陽性B細胞から完全に分離させ。CD137陽性マウスB細胞を含有する30の384ウェルプレート(10,560ウェル)を回収し、一次スクリーニングのために継代した。
一次スクリーニングにおいて、554のB細胞上清を、S/B>2のヒトCD137及びS/B>2のカニクイザルCD137の両方に対する特異的結合性について、IgG>10ng/mlで陽性とアッセイした(図1)。554個の陽性B細胞クローンを、DNAの回収並びにマウスVH及びVL遺伝子セグメントの単離及び増幅のために、6つの96ウェルプレートに分離した。554個のクローンのうち、0.6~75ug/mlの範囲の力価で抗CD137を発現する376個のB細胞クローンを、ヒトCD137を発現するリコンビナントCHO細胞(CHO-K1)への単一点結合についてアッセイした。376個のB細胞クローンのうち、168個のB細胞クローンが、2~57×S/Bの範囲で、バックグラウンドに対して>2×のレベルで抗CD137抗体を発現した(データを示さず)。
b.アゴニストCD137抗体の特定
アゴニストバインダーを特定するために、NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkatアッセイ系(Promega)を使用した。NFkB活性アッセイは、細胞表面上にヒトCD137を発現するJurkatレポーター細胞系統を使用する。
アゴニストバインダーを特定するために、NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkatアッセイ系(Promega)を使用した。NFkB活性アッセイは、細胞表面上にヒトCD137を発現するJurkatレポーター細胞系統を使用する。
簡潔に、リコンビナントIgG1(KO)抗体を含有するHTP上清をフローサイトメトリーにより、NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞系統への結合についてアッセイした。CD137抗体対照を、CD137陽性対照抗体であるウレルマブ(BMS)を含む染色バッファー中で希釈した。168個の抗CD137 B細胞クローンから採取した上清(50μl)(上記検討)をJurkat細胞と共に、96ウェルプレート中、4℃で30分間インキュベーションした。この細胞を染色バッファーで3回洗浄した。ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG-Fc PE二次抗体をこの細胞に加え、プレートを4℃で30分間インキュベーションした。この細胞を染色バッファーで3回洗浄した。細胞を冷染色バッファー 100μl中に懸濁させ、フローサイトメーターにより分析した。抗CD137抗体上清を細胞系統へのバックグラウンド結合に対して2倍超について分析した。168個のスクリーニングされた抗CD137抗体含有上清のうち、10個の抗CD137上清が、バックグラウンドに対して1.5倍(1.64~5.21倍)の抗CD137アゴニスト活性を示し、抗体力価は、0.76~31μg/mlの範囲であった。クローンCL-186330からのシグナルは、5.61S/Bであった(データを示さず)。
c.CD137結合分子についてのV遺伝子回収
10個のB細胞クローンは、更なる分析のために選択された特定の閾値を超えるアゴニスト活性を有すると特定された。まず、細胞ライゼートを収集し、96ウェルプレートに再配列し、-20℃で保存し、その後、V遺伝子を回収した。マウス重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする遺伝子をRT-PCR(表4のプライマーを参照のこと)により回収し、ついで、ヒトIgG1(KO)及びκ定常領域それぞれをコードするpTT5発現ベクターにインフレームでクローニングした。
10個のB細胞クローンは、更なる分析のために選択された特定の閾値を超えるアゴニスト活性を有すると特定された。まず、細胞ライゼートを収集し、96ウェルプレートに再配列し、-20℃で保存し、その後、V遺伝子を回収した。マウス重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする遺伝子をRT-PCR(表4のプライマーを参照のこと)により回収し、ついで、ヒトIgG1(KO)及びκ定常領域それぞれをコードするpTT5発現ベクターにインフレームでクローニングした。
B細胞ライゼートを、Smarter cDNA合成キット(Clontech, Mount View, CA)を使用してcDNA合成に供した。cDNA合成を容易にするために、オリゴ(dT)を使用して、全てのメッセンジャーRNAの逆転写を開始し、続けて、Smarter IIAオリゴヌクレオチドで「5’キャッピング」した。VH及びVLフラグメントのその後の増幅を、Smarter IIAキャップをターゲットとする5’プライマー及びCH1におけるコンセンサス領域をターゲットとする3’プライマーを使用する2ステップPCR増幅を使用して行った。簡潔に、各PCR反応 50μlは、20μM 各プライマー(フォワード及びリバース、最終濃度1μM) 1μl、PrimeStar(登録商標)Max DNAポリメラーゼプレミックス(Clontech) 25μl、未精製cDNA 2μl及び二重蒸留H2O 20μlからなる。サイクルプログラムが開始し、続けて、94℃で15秒間、50℃で30秒間、68℃で50秒間を35サイクル、68℃、7分間で終了する。第2ラウンドPCRを、各pTT5マザーベクター(VH及びVL)中の各領域に「重複する」15bp相補的延長部を含有するVL及びVH第2ラウンドプライマーを使用して行った。第2ラウンドPCRを下記プログラム:35サイクル(94℃で45秒間、50℃で30秒間、68℃で50秒間)を使用して行い、68℃、7分間で終了する。
キメラCD137を産生するために、マウスVH及びVL領域をヒトIgG1由来の重鎖及び軽鎖定常領域に融合させ、In-Fusion(登録商標)HDクローニングキット(Clontech, U.S.A.)をpT5 huIgKベクター(クローンID 401064)へのVL遺伝子及びpT5 huIgG1KOベクター(クローンID 403776)へのVH遺伝子の方向性クローニングに使用した。In-Fusion(登録商標)HDクローニングを容易にするために、PCR産物を精製し、In-Fusion(登録商標)HDクローニングの前に、クローニングエンハンサーで処理した。クローニング及びトランスフォーメーションを製造業者のプロトコール(Clontech, U.S.A.)に従って行った。サブクローニングされた遺伝子V-遺伝子フラグメントのDNA配列を、ミニプレップDNAを単離し、単離されたDNAをサンガー二本鎖配列決定に供することにより確認した。
d.CD137発現リコンビナントCHO細胞系統ツール
ヒト及びカニクイザルCD137の両方についての細胞外ドメイン(ECD)をpcDNA3.1ベクターにクローニングして、ほ乳類細胞系統、例えば、CHO-K1において高レベルで構成的な発現を促した。このベクターは、タンパク質の高効率発現のためのCMVプロモーター並びにmRNA安定性を向上させるためのウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列を含む。ヒト及びカニクイザルCD137のエクトドメインをコードするDNA配列は、配列番号:1及び2それぞれに対応する。
ヒト及びカニクイザルCD137の両方についての細胞外ドメイン(ECD)をpcDNA3.1ベクターにクローニングして、ほ乳類細胞系統、例えば、CHO-K1において高レベルで構成的な発現を促した。このベクターは、タンパク質の高効率発現のためのCMVプロモーター並びにmRNA安定性を向上させるためのウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列を含む。ヒト及びカニクイザルCD137のエクトドメインをコードするDNA配列は、配列番号:1及び2それぞれに対応する。
安定なクローン産生のために、CHO-K1細胞を6ウェルプレート中のウェル当たりに0.25×106個の細胞濃度で播種し、24時間後、完全培地中にトランスフェクションした。翌日、トランスフェクションの3時間前に、培地に完全培地 1mLを補充した。2.5μg DNAをDMEM培地中で総容量150μLに希釈し、Lipofectamine(登録商標)2000試薬(Life Technologies、カタログ番号11668-019) 7.5μLをDMEM培地 143μL中で希釈した。希釈されたDNAを希釈されたLipofectamine(登録商標)2000試薬に加え、15分間インキュベーションした。インキュベーション後、DNA-脂質複合体を細胞に加え、さらに48時間インキュベーションした。トランスフェクションの1時間後、細胞をトリプシン処理し、1000μg/mL G418含有培地(Life Technologies、カタログ番号10131-027)中で選択した。FACS分析をG418の存在下での選択の1週間後のプールについて行った。クローンをヒト及びカニクイザルタンパク質への結合に基づいて選択し、CD137抗体を発現するハイブリドーマをスクリーニングするのに使用した。
e.キメラCD137 IgGの単離及び特徴決定
本発明の目的で、抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基及びヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には、2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変領域(例えば、CDR)の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、FRの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が特にC1q結合及び/又はFcレセプター(FcR)結合に関して、本発明の特性を生成するために、元の抗体のものからさらに改変され又は変化させたものである。
本発明の目的で、抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基及びヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には、2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変領域(例えば、CDR)の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、FRの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が特にC1q結合及び/又はFcレセプター(FcR)結合に関して、本発明の特性を生成するために、元の抗体のものからさらに改変され又は変化させたものである。
キメラヒト化抗体をCHO-E37細胞を対応するキメラ重鎖及び軽鎖をコードするpTT5プラスミドで一過性トランスフェクションすることにより産生した。ここで、親抗CD137抗体由来のマウス可変領域を、FcレセプターがFc部分においてノックアウト突然変異L234A/L235Aをさらに発現して、Fc R結合を遮断するように改変されたヒト定常領域とインフレームでクローニングした。陽性CD137結合対照を同様にヒトIgG定常領域とインフレームでクローニングし、ここで、ウレルマブ(VH、配列番号:371及びVL、配列番号:372)及びウツリロマブ(VH、配列番号:373及びVL、配列番号:374)由来のVH及びVL領域をクローニングした。
CHO-E細胞を50mLのBioreactorチューブ(Sigma)中の4mM グルタミンが補充されたIrvine培地中において、4×106個/mLでトランスフェクションする。典型的なトランスフェクション体積 35mLについて、予め滅菌された軽鎖(LC)プラスミドDNA及び重鎖(HC)プラスミドDNA(2:1の比率)を、フィラーDNAを含有するOptiPRO(商標)SFM(Gibco)の予め滅菌された1mL中に希釈する。TransIT-PRO(登録商標)(Mirus Bio LLC)トランスフェクション試薬をDNA+Opti-PRO(商標)ミックスに加え、調製されたCHO-E細胞に直ちに移し、bioreactorチューブを37℃、5% CO2、300rpmで振とう機に戻す。トランスフェクションの24時間後、温度を30℃に変化させる。トランスフェクションされた培養物を7日間維持する。培養物の収集を4700rpmで25分間遠心分離することにより完了させる。
培養上清からのキメラCD137 IgG抗体分子の精製を、ForteBioのOctet(登録商標)RED96機器(ForteBio)においてプロテインAセンサーチップを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより行った。単離されたCD137抗体が、ヒト及びカニクイザル細胞と交差反応可能であったかどうかを試験するために、キメラ抗ヒトCD137 IgG1(KO)抗体をアッセイして、フローサイトメトリー結合曲線及びCHO-ヒトCD137及びCHO-カニクイザルCD137過剰発現細胞系統に対するEC50値を生成した。簡潔に、キメラCD137 IgG抗体及び陽性IgG対照を染色バッファーで希釈して、12点希釈曲線を生成した。細胞及び抗体を96ウェルプレート中において、4℃で30分間インキュベーションした。細胞を染色バッファーで3回洗浄した。ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG-Fc PE二次抗体を細胞に加え、プレートを4℃で30分間インキュベーションした。細胞を染色バッファーで3回洗浄した。細胞を冷染色バッファー 100μl中で懸濁させ、フローサイトメーターで分析した。結合曲線を分析し、抗ヒトCD137抗体についてのEC50を計算した。
27個のヒットを第1ラウンドの選択から特定し、追加のスクリーニングにより、異なる選択プールを示す「B」とラベルされた18個の更なるヒットが提供された。表7を参照のこと。
表7(上記)に示されたように、ほぼ全ての抗ヒトCD137結合クローンは、同等のEC50値により実証されたように、リコンビナントCHO細胞上に発現されたカニクイザルCD137と交差反応性であり、ヒトCD137を発現するCHO細胞系統と結合した。
f.キメラ抗CD137 IgG1結合クローンの機能特性
CD137は、公知の共刺激レセプターであり、活性化T細胞上に発現された場合、T細胞の増殖、サイトカイン産生及び機能特性を改善する。本来、T細胞の活性化により、T細胞上のCD137のアップレギュレーションが誘引され(Pollok et al.(1993)J. Immunol. 150(3):771-781)、係合後、増殖及びサイトカイン放出をブーストすることにより免疫応答が支持される(Hurtado et al.(1995)J Immunology 155(7), 3360-3367)。活性化T細胞の文脈における架橋CD137は、T細胞活性化を増強し、T細胞の増殖及びリクルートをもたらすことが期待される。
CD137は、公知の共刺激レセプターであり、活性化T細胞上に発現された場合、T細胞の増殖、サイトカイン産生及び機能特性を改善する。本来、T細胞の活性化により、T細胞上のCD137のアップレギュレーションが誘引され(Pollok et al.(1993)J. Immunol. 150(3):771-781)、係合後、増殖及びサイトカイン放出をブーストすることにより免疫応答が支持される(Hurtado et al.(1995)J Immunology 155(7), 3360-3367)。活性化T細胞の文脈における架橋CD137は、T細胞活性化を増強し、T細胞の増殖及びリクルートをもたらすことが期待される。
CD137抗体アゴニスト挙動を評価するために、二次抗体を使用して、細胞表面上のCD137を架橋させた。理論的根拠は、抗CD137抗体を特定することであった。この抗体は、FAPについての二重特異性分子として組み合わせた場合にのみアゴニストとなる分子を特定する目的で架橋させた場合にのみアゴニストであった。
これを達成するために、72nM 抗CD137抗体それぞれを、2.5倍モル過剰の架橋抗体と共に(+CL)、架橋抗体無しで(-CL)、37℃で30分間インキュベーションした。抗CD137抗体上清又は実際の抗体を、培地 220.5μlを各チューブに加えることにより、約48nMに希釈した。この抗体混合物を培地(RPMI培地/1% FBS) 160μlのうちの80μl中で連続希釈した。細胞 50μL(0.8×105個)を平底96ウェルプレートにおいて、希釈抗体 25μLと共に混合した(3×抗体希釈をそれぞれ全部で9つのデータ点について行った)。細胞を抗CD137抗体と共に、37℃及び5% CO2で5時間インキュベーションした。活性の検出をBio-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ試薬(G7940 Promega) 75μlの添加により達成し、得られた発光をEnVision(登録商標)プレートリーダー(Perkin-Elmer)により測定した。
CD137依存性係合及び架橋により、Jurkatレポーター細胞系統においてNFκB媒介性ルシフェラーゼ活性化を誘引することができる。抗CD137アゴニスト結合曲線及びEC50値を生成した。結合活性データを曲線としてプロットし(図3A及び図3B)、ルシフェラーゼ活性データ(RLU)(図3C及び図3D)を棒グラフとしてプロットした。公知のCD137バインダー(ウレルマブ(BMS抗CD137 Ab)及びウトミルマブ(Pfizerの抗CD137 Ab))に基づく2つの陽性対照を本発明の新規なCD137バインダーと比較した。NFkB-Jurkatアッセイにおけるアゴニスト活性に基づいて、候補CD137 #B21(親を指す「CD137 #1」とも呼ばれる)及びCD137 #A49(親を指す「CD137 #7」とも呼ばれる)を更なる最適化に選択した。
8.リード候補CD137抗体(CD137 #1)についてのキメラFabの生成
抗原についての抗体の親和性を改善するために、公知の技術を使用して、in vivoで天然にランダムに起こる親和性成熟及び過突然変異イベントをミラーリングする。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は同配列への挿入及び/又は同残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達するように行うことができる。ただし、最終構築物が、所望の特徴、例えば、抗原結合を有するという条件である。置換的突然変異誘発に関心のある部位は、超可変領域(CDR)及びフレームワーク領域(FW)を含む。親和性、結合力、安定性、溶解性、グリコシル化は、候補CD137バインダーを最適化すると考えられる幾つかの特徴である。
抗原についての抗体の親和性を改善するために、公知の技術を使用して、in vivoで天然にランダムに起こる親和性成熟及び過突然変異イベントをミラーリングする。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は同配列への挿入及び/又は同残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達するように行うことができる。ただし、最終構築物が、所望の特徴、例えば、抗原結合を有するという条件である。置換的突然変異誘発に関心のある部位は、超可変領域(CDR)及びフレームワーク領域(FW)を含む。親和性、結合力、安定性、溶解性、グリコシル化は、候補CD137バインダーを最適化すると考えられる幾つかの特徴である。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、親抗原結合分子(例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的には、更なる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性(例えば、親和性の向上、免疫原性の低下)における改変(例えば、改善)を有しかつ/又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換的変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、ファージディスプレイ系親和性成熟技術、例えば、本明細書に記載されたものを使用して、都合良く生成することができる。簡潔に、1つ以上の可変領域残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失を、このような改変が抗原結合分子の抗原結合能を実質的に低下させない限り、1つ以上の超可変領域内で生じさせることができる。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変(例えば、本明細書で提供された保存的置換)を超可変領域に行うことができる。最初の置換に対する機能的感受性を実証する更なる置換をアミノ酸位置に導入することができる。代替的には又は加えて、抗体と抗原との間の接触点を特定するための抗原-抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基を置換の候補としてのターゲットとし又は排除することができる。変異体をそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングすることができる。
「親和性成熟」抗体は、このような改変を有さない親抗体と比較して、1つ以上の超可変領域において1つ以上の改変を有する抗体を指し、このような改変により、抗原についての抗体の親和性の改善がもたらされる。
アミノ酸置換を、目的の分子に導入することができ、この産物を所望の活性、例えば、親マウス分子と比較して、保持された/改善された抗原結合についてスクリーニングすることができる。保存的置換及び非保存的置換の両方が企図される。
本発明の実施態様は、CD137抗原結合分子のアミノ酸配列変異体を含む。CD137結合分子のアミノ酸配列変異体を、この分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより又はペプチド合成により調製する。
選択された抗体候補のマウス配列を使用して、遺伝子フラグメントをマウスVK及びVHについて設計し、合成した。マウスフレームワーク1領域に特異的な配列及び遺伝子III配列の末端にアニーリングされたオーバーハング配列を含有するビオチン化フォワードプライマー並びにヒト定常領域(Cκ又はCH1)と共に保存されたマウスフレームワーク4領域からのリバースプライマーを使用して、V領域を増幅する(表8を参照のこと)。
PCRを、テンプレートとして遺伝子フラグメントを使用して行い、DNA産物を、標準的な社内プロトコールを使用して、M13LE01ベクター(New England Biolabs製のM13 mp18の改変バージョン)にクローニングし、E. coli細胞にトランスフェクションした(図5)。M13は、DNAをファージ粒子にパッケージングするのに必要なコンポーネントを供給する。ファージ粒子は、細胞壁を通して分泌され、培地中に放出され、ファージによる広範な感染により、E. coli細胞で溶解を生じさせることができる。このように、リコンビナントM13ファージによる感染により、Lアガープレート上で増殖させると、E. coli細胞にプラークを形成することができる。目的のDNAの特定の変化を表わす個々のプラークを取り上げ、E. coliで一晩増殖させ、対応する培養物をミニプレップして、配列決定分析によりDNA配列を得た。キメラFabの正しいDNA配列を有するプラークを使用して、E. coli細胞を感染させた。培養物の適切な増殖後、E. coli細胞を0.5mM IPTGで誘引して、培養培地中に分泌されるキメラFabを発現させた。発現されたキメラFabを培養上清及び/又は感染されたE.coli細胞のペリプラズム抽出物から得た。このキメラFabをさらに使用して、ELISA結合アッセイを開発し、後述するヒト化変異体を特定するために、陽性対照として保持した。キメラFabの配列を以下に記載する。
配列最適化Fabを、以下に記載されるように、ELISA結合アッセイにおいて評価した。
h.CD137 #1最適化バインダーの特定
ヒト化/最適化抗CD137バインダーを特定するために、2DサンドイッチELISAアッセイを、キメラ抗CD137 Fabを使用して開発し、実験プロセス全体を通して、キメラ抗CD137 Fabを、キメラFabに存在するマウス可変領域と同様の結合を有するヒト化変異体を特定する陽性対照として維持した。アッセイを開発するために、プレートを培養上清及び/又はペリプラズム調製物(E. coli細胞を、キメラCD137 Fabを含有するファージに感染させ、0.5mM IPTGで誘引し、4時間のインキュベーション後、上清を使用するか又は細胞を溶解して、ペリプラズム抽出物を得る)中に存在するキメラCD137 FabフラグメントにおけるCH1領域に結合する抗Fd抗体で被覆した。
ヒト化/最適化抗CD137バインダーを特定するために、2DサンドイッチELISAアッセイを、キメラ抗CD137 Fabを使用して開発し、実験プロセス全体を通して、キメラ抗CD137 Fabを、キメラFabに存在するマウス可変領域と同様の結合を有するヒト化変異体を特定する陽性対照として維持した。アッセイを開発するために、プレートを培養上清及び/又はペリプラズム調製物(E. coli細胞を、キメラCD137 Fabを含有するファージに感染させ、0.5mM IPTGで誘引し、4時間のインキュベーション後、上清を使用するか又は細胞を溶解して、ペリプラズム抽出物を得る)中に存在するキメラCD137 FabフラグメントにおけるCH1領域に結合する抗Fd抗体で被覆した。
結合したCD137 Fabフラグメントをビオチン化huCD137抗原の存在下でインキュベーションし、結合したビオチン化抗原をストレプトアビジンラベルフルロクロムで検出する。種々の量の抗原(ビオチン化huCD137-6×Hisを、Sulfo ChromaLink(商標)ビオチンキット(SoluLink、カタログ番号B-1007、PPB-16748)(50ng/mL及び80ng/mL)を使用して生成し、キメラFab(Chi Fab)の種々の希釈物(0.4μg/ml、0.2μg/ml及び0.1μg/ml)を2Dアッセイで評価した。プレートを種々の量の抗Fd(Meridian Life Sciences Inc., ヒツジ抗ヒト抗Fd #W90075C)で被覆した;一次スクリーニング(分泌Fab)のための1700ng/mL 抗Fd抗体及び確認スクリーニング(ペリプラズムFab)のための900ng/mL 抗Fd抗体(図4Aを参照のこと)。
i.CD137 #1由来のCDRを使用した移植Fabの生成
リード最適化/ヒト化の目的は、ADAの可能性を低下させるために、多くの非ヒト残基をヒト生殖細胞系統配列に変換することにより、CDR及びフレームワークの両方である可変ドメインにおいて最適なアミノ酸配列を有する分子を得ることであり、ADAは、薬剤の有効性及び安全性に影響を及ぼす場合があり、生成物の一貫性及び貯蔵寿命を改善するために可能性のあるPTMの傾向を除去し、他のCMC特性を増強する。このため、「ヒト化」抗体は、非ヒト超可変領域由来のアミノ酸残基及びヒトFR由来のアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には、2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ドメイン(例えば、CDR)の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、FRの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。
リード最適化/ヒト化の目的は、ADAの可能性を低下させるために、多くの非ヒト残基をヒト生殖細胞系統配列に変換することにより、CDR及びフレームワークの両方である可変ドメインにおいて最適なアミノ酸配列を有する分子を得ることであり、ADAは、薬剤の有効性及び安全性に影響を及ぼす場合があり、生成物の一貫性及び貯蔵寿命を改善するために可能性のあるPTMの傾向を除去し、他のCMC特性を増強する。このため、「ヒト化」抗体は、非ヒト超可変領域由来のアミノ酸残基及びヒトFR由来のアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には、2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ドメイン(例えば、CDR)の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、FRの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。
親マウス分子の結合及び他の所望の特性を保持するだけでなく、潜在的な薬剤の特徴も有するヒト化抗体を生成するために、本発明者らは、in silico分析により軽鎖及び重鎖の両方について密接に一致する生殖細胞系統を評価し、軽鎖及び重鎖それぞれについてIGKV1-39*01及びIGHV3-7*01を特定した。マウスCD137 #B21のCDRをヒト生殖細胞系統のフレームワークと組み合わせた:VKについてIGKV1-39*01及びVHについてIGHV3-7*01。KJ2をVKにおけるJ領域として使用し、HJ6をVHにおけるJ領域として使用した。
CD137特異的クローン由来のCDRをVK生殖細胞系統上に移植し、VH生殖細胞系統DNAフラグメントを、公知の技術を使用するPCRにより増幅する。以下の実施例では、表9の下記プライマーを使用した。
CD137 VH又はVL遺伝子セグメントに特異的な配列を含有するビオチン化フォワードプライマー及び遺伝子III配列の末端にアニーリングされたオーバーハング配列及び保存された定常領域(Cκ又はCH1)からのリバースプライマー。PCR産物をM13LE01ベクターにクローニングして、マウスFabと同じCDRを含有するが、ヒトフレームワークにある移植Fabを生成する。移植Fabを結合滴定において親キメラFabと比較して、huCD137抗原への結合を決定した(図4B)。各候補について、huCD137への特異的結合は、キメラ及び移植Fab分子の両方についてアッセイされた抗原濃度範囲にわたって一致した。移植Fab分子は、図4Bにおいて観察されたように、それらの結合においてわずかに低かったが、それらがヒトフレームワーク上でマウスCDRを表わしたため、それらを更なる最適化のための基礎として使用した。CDRに加えて、特定のマウスフレームワーク残基、例えば、カノニカル及びバーニエゾーン残基は、CDRループの位置決めにおいて重要な役割を果たすことが公知である。
j.ヒトVK及びVHにおけるフレームワーク領域の最適化
抗原への結合において重要な役割を果たすことが公知の重要なマウス残基、例えば、カノニカル、界面及びバーニエゾーン残基を特定するために、本発明者らは、軽鎖可変領域における3つのフレームワーク位置及び重鎖可変領域における5つのフレームワーク位置を特定した。これらの位置は、軽鎖におけるT20S、S60D及びT85V並びにアミノ酸A23T、T69I、N77Q、S78I、N84S又はQに対応する重鎖における5つの位置であった。マウスリード候補(CD137 #B21)の同様の結合を保持したヒトフレームワークを特定するために、本発明者らは、M13LE01ベクターにファージライブラリーを作製した。突然変異/変化をオリゴヌクレオチド配列に行い、それらを、標準的な分子生物学技術を使用して組み立てた。
抗原への結合において重要な役割を果たすことが公知の重要なマウス残基、例えば、カノニカル、界面及びバーニエゾーン残基を特定するために、本発明者らは、軽鎖可変領域における3つのフレームワーク位置及び重鎖可変領域における5つのフレームワーク位置を特定した。これらの位置は、軽鎖におけるT20S、S60D及びT85V並びにアミノ酸A23T、T69I、N77Q、S78I、N84S又はQに対応する重鎖における5つの位置であった。マウスリード候補(CD137 #B21)の同様の結合を保持したヒトフレームワークを特定するために、本発明者らは、M13LE01ベクターにファージライブラリーを作製した。突然変異/変化をオリゴヌクレオチド配列に行い、それらを、標準的な分子生物学技術を使用して組み立てた。
第1のファージライブラリーを、VK及びVHフレームワーク突然変異を組み合わせて構築した。ここで、VK変異体ライブラリーは、8つの可能性のあるバリエーションを表わし、VH変異体ライブラリーは、128の可能性のあるバリエーションを表わす。VK及びVH変異体ライブラリーを併せて、第1の組み合わせたライブラリーについて、合計約1024の変異体を表わした。
E. coli細胞を、種々の組み合わせを含有するDNAでトランスフォーメーションし、翌日、単一の変異体を表わす個々のプラークを採取した。先に記載されたように、約2700個のクローン変異体を選択し、ELISAによりhuCD137への結合についてスクリーニングした。最初に、E. coli細胞に、各変異体を感染させ、続けて、0.5mM IPTGで誘引し、培地上清を結合について評価した。これらの実験では、キメラ抗CD137 Fabを、ELISA実験における陽性対照として保持した。陽性対照と同様の結合を示した分子を選択し、それらの結合活性について再度チェックした。第2の工程では、選択されたバインダーを表わすプラークを使用して、E. coli細胞に再度感染させ、培養物を0.5mM IPTGで誘引した。必要なインキュベーション後、細胞を溶解させ、ペリプラズム抽出物を得た。これらのペリプラズム抽出物を使用して、CD137抗原への結合を確認した。以前のように、本発明者らは、本発明者らの実験において、キメラFabを陽性対照として保持した。
ELISAにより検出された結合結果に基づいて、最良のVK及びVHフレームワーク配列の組み合わせを決定した。
図5から分かるように、クローンB21~55及びB21~49は、キメラ親Fabと同程度に良好な又はわずかに改善された結合特性を有した。これらの軽鎖フレームワークの配列分析から、FW3におけるアミノ酸突然変異T85Vが両方のクローンに存在し、このため、結合に対する重要な改善と考えられ、このため、最適化分子に含まれるべきであることが明らかとなった。VHについて、FW3におけるアミノ酸突然変異S78Iも、両クローンに存在し、このため、最適化分子に重要であると考えられた。
第1のライブラリーからのトップバインダーの幾つかについての配列が提供される。
k.キメラVK及びキメラVHにおけるCDR L-CDR1、L-CDR2、H-CDR1及びH-CDR2の突然変異分析
CDR中の特定のアミノ酸残基、例えば、アスパラギン及びアスパラギン酸により、薬剤候補の貯蔵寿命を短縮させてしまう場合がある翻訳後修飾、例えば、脱アミド化、グリコシル化及びイソアスパラギン酸異性化を受けることによって、薬剤候補における不均一性がもたらされる場合がある。加えて、抗薬剤抗体の生成を減少させるために、生殖細胞系統は、重要でないマウス残基をヒト生殖細胞系統残基で変化させるための新規なストラテジーとして進化してきた。本発明者らは、潜在的な傾向についてCDR残基を評価し、必要な結合/機能に影響を及ぼすことなく、それらの残基の変化を評価した。
CDR中の特定のアミノ酸残基、例えば、アスパラギン及びアスパラギン酸により、薬剤候補の貯蔵寿命を短縮させてしまう場合がある翻訳後修飾、例えば、脱アミド化、グリコシル化及びイソアスパラギン酸異性化を受けることによって、薬剤候補における不均一性がもたらされる場合がある。加えて、抗薬剤抗体の生成を減少させるために、生殖細胞系統は、重要でないマウス残基をヒト生殖細胞系統残基で変化させるための新規なストラテジーとして進化してきた。本発明者らは、潜在的な傾向についてCDR残基を評価し、必要な結合/機能に影響を及ぼすことなく、それらの残基の変化を評価した。
突然変異分析を、軽鎖におけるCDR、L-CDR1、L-CDR2並びに重鎖におけるCDR、H-CDR1及びH-CDR2における点突然変異の影響を評価するために行い、得られた変異体を、マウス可変領域を有するが、ヒト定常領域を有する親キメラIgGと比較して評価した。標準的な分子生物学技術を利用して、1つずつ別個に、10個の点突然変異を軽鎖(VL)CDR1及びCDR2に導入し、19個の点突然変異体を、重鎖(VH)CDR1及びCDR2(図6A及び図6B)に導入した。
VL及びVH遺伝子を、上記検討された方法を使用して生成し、pTT5ベクターにクローニングした。各VL及びVH配列を標準的な方法により確認した。
単点突然変異体をキメラ「親」残基(lChi Ig VK)を「変異体」残基(「太字」のボックス)で置き換えて調製した。表11及び表12に、CDR1におけるアミノ酸位置24、23、29、31及び33並びにCDR2におけるアミノ酸位置50、53、54、55及び56でのVK CDRについての単点突然変異体を表わし、10個の変異体構築物を生成する。表13及び表14に、CDR1におけるアミノ酸位置31、32、33及び35並びにCDR2におけるアミノ酸位置52、53、54、55、57、58、61、62、63、64及び66でのVH CDRについての単点突然変異体を表わし、19個の変異体構築物を生成する。
7日間のCHO-E細胞における発現分析のために、得られた軽鎖突然変異体を親キメラ重鎖と対合させ、重鎖突然変異体を親キメラ軽鎖と対合させた。親キメラIgGを陽性対照として使用した。
7日後、抗体含有上清を回収し、ELISAにおいてビオチン化huCD137への結合について評価した。CD137特異的結合についての効果を変異体それぞれについてVH及びVL領域に導入された突然変異に基づいて評価した。CD137結合を測定し、OD単位として表わし、親キメラIgGと比較して、CD137抗体結合における個々の残基の寄与を特定した(図6A及び図6B)。
軽鎖変異体について、示された全ての位置における点突然変異体により、親キメラIgGと同様の結合が実証された(図6A)。重鎖について、位置A35S、T58K、L61V、L64V及びS66Gの点突然変異体により、親キメラIgGと同様の結合が示された(図6B)。
l.B21~55におけるヒトCD137 VK及びVHについての突然変異ライブラリー
表10及び図5から、B21~55を、B21親キメラFabと同じ結合を保持する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方について最良のヒト化フレームワーク配列として特定し、更なるCDR変化をこのフレームワークに組み込ませた。3つのファージFabライブラリーをベクターLE01中に調製した。第1の(ファージFab)ライブラリーであるL458VKは、複数のFW及びCDR点突然変異を有する変異体を含むキメラヒト/マウスVK軽鎖と複数のFW及びCDR点突然変異を有する変異体との組み合わせであり、約1024個の変異体を表わす。第2のファージFabライブラリーであるL459VHは、CDR点突然変異を含む移植ヒトVHと移植ヒトVKとの組み合わせであり、約512個のVH変異体を表わす。第3のファージFabライブラリーであるL460Cは、ヒトVKとヒトVH FW突然変異との組み合わせであった。これらのライブラリーについて、VKは、約1024個の可能性のあるバリエーションを有し、VHは、約512個の可能性のあるバリエーションを有し、組み合わせたライブラリーであるL460Cについて、合計で約524,288個の変異体調製した。本発明者らは、約1980個の変異体を評価した。
表10及び図5から、B21~55を、B21親キメラFabと同じ結合を保持する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方について最良のヒト化フレームワーク配列として特定し、更なるCDR変化をこのフレームワークに組み込ませた。3つのファージFabライブラリーをベクターLE01中に調製した。第1の(ファージFab)ライブラリーであるL458VKは、複数のFW及びCDR点突然変異を有する変異体を含むキメラヒト/マウスVK軽鎖と複数のFW及びCDR点突然変異を有する変異体との組み合わせであり、約1024個の変異体を表わす。第2のファージFabライブラリーであるL459VHは、CDR点突然変異を含む移植ヒトVHと移植ヒトVKとの組み合わせであり、約512個のVH変異体を表わす。第3のファージFabライブラリーであるL460Cは、ヒトVKとヒトVH FW突然変異との組み合わせであった。これらのライブラリーについて、VKは、約1024個の可能性のあるバリエーションを有し、VHは、約512個の可能性のあるバリエーションを有し、組み合わせたライブラリーであるL460Cについて、合計で約524,288個の変異体調製した。本発明者らは、約1980個の変異体を評価した。
位置K24R、D28S、V29I、T31S、V33L、S50A、Y53S、R54L、Y55Q及びT56Sに突然変異を有する、単離されたVκ変異体クローンCD137 #1.V55A-Jを、ベクターLE01でファージFabを評価するために選択した。
位置A35S、N52Q、D54E、G55A、T58K、L61V、D62E、L64V及びS66Gに突然変異を有する、単離されたVH変異体クローンCD137 #1 V.55.N、V55.T、V55.V、V55.W、V55.AA、V55.BBをベクターLE01において評価するために選択した。H-CDR2における変化N52Qを、潜在的な脱アミド化部位の除去を評価するために選択した。H-CDR2における変化D54E及びD62Eを、潜在的な異性化部位の除去を評価するために選択した。
変異体をキメラCD137親と比較し、75個の変異体の分析を行った。75個の変異体のうち、55個の変異体クローンは、キメラ分子への同様又はより良好な結合を有した(図7)。
m.選択されたCD137配列最適化候補をIgG1-KOとしてフォーマットし、機能活性について評価した
ヒットのうちの39個をCD137 #B21配列最適化キャンペーンから選択し、IgG1-KOとしてフォーマットし、図8A及び図8Bに示されたように、NFkB-Jurakat細胞アッセイシステム(Promega)において、上記された二次抗体による架橋を伴わない及び同架橋を伴うアゴニスト挙動について評価した。
ヒットのうちの39個をCD137 #B21配列最適化キャンペーンから選択し、IgG1-KOとしてフォーマットし、図8A及び図8Bに示されたように、NFkB-Jurakat細胞アッセイシステム(Promega)において、上記された二次抗体による架橋を伴わない及び同架橋を伴うアゴニスト挙動について評価した。
これら39個のIgGから、5つの例示的な候補を選択し、配列最適化FAP分子と組み合わせた二重特異性「Doppelmab」としてフォーマットした。
n.CD137候補クローンCD137 #7(A49)の配列最適化
ヒト化マウスAlivamab由来の更なる候補分子を評価した。候補を配列最適化するために、軽鎖可変領域における潜在的な脱アミド化傾向NG~QG及び重鎖可変領域におけるNY~QYを突然変異させた。また、両鎖における凝集傾向領域を、LからG/A又はIからMのいずれかに突然変異させた。
ヒト化マウスAlivamab由来の更なる候補分子を評価した。候補を配列最適化するために、軽鎖可変領域における潜在的な脱アミド化傾向NG~QG及び重鎖可変領域におけるNY~QYを突然変異させた。また、両鎖における凝集傾向領域を、LからG/A又はIからMのいずれかに突然変異させた。
先に記載されたように(上記を参照のこと)、8つの最適化された突然変異体構築物を生成し、NFkB-Jurakat細胞アッセイ系(Promega)においてCD137への結合について評価した。
結合活性をルシフェラーゼ活性(RLU)として表わし、棒グラフとしてプロットした。公知のCD137バインダー(ウレルマブ(BMS抗CD137 Ab)及びウトミルマブ(Pfizerの抗CD137 Ab))に基づく2つの陽性対照を上記単離された8つのCD137バインダーと比較し、他の最適化候補とも比較した。
実施例3:抗CD137結合候補のエピトープマッピングデータ
CD137は、CRD1、CRD2、CRD3及びCRD4と呼ばれる4つのシステイン-リッチドメイン(CRD)からなり、これらはそれぞれ、細胞膜に対して遠位~近位に位置する。CRD1は、Uniprotの配列Q07011のアミノ酸24~45を指す。CRD2は、アミノ酸47~86により形成され、CRD3は、アミノ酸87~118により形成され、CRD4は、アミノ酸119~159により形成される。マウス及びヒトCD137キメラタンパク質を発現するJurkat細胞を、ヒトCRDを対応するマウス対応物で置き換えることにより生成した。CD137抗体をこれらのリコンビナント細胞系統とインキュベーションし、蛍光ラベル二次抗体を加えて、結合をフローサイトメトリーにより決定した。全ての抗体は、全長ヒトCD137発現Jurkat細胞系統に結合可能であったが、多様なヒトCRDをマウスCRDにより置き換えた場合、結合は失われた。このアプローチにより、本発明者らは、異なるCD137抗体がヒトCD137タンパク質内で結合するCRDを解明することが可能となった(図9を参照のこと)。
CD137は、CRD1、CRD2、CRD3及びCRD4と呼ばれる4つのシステイン-リッチドメイン(CRD)からなり、これらはそれぞれ、細胞膜に対して遠位~近位に位置する。CRD1は、Uniprotの配列Q07011のアミノ酸24~45を指す。CRD2は、アミノ酸47~86により形成され、CRD3は、アミノ酸87~118により形成され、CRD4は、アミノ酸119~159により形成される。マウス及びヒトCD137キメラタンパク質を発現するJurkat細胞を、ヒトCRDを対応するマウス対応物で置き換えることにより生成した。CD137抗体をこれらのリコンビナント細胞系統とインキュベーションし、蛍光ラベル二次抗体を加えて、結合をフローサイトメトリーにより決定した。全ての抗体は、全長ヒトCD137発現Jurkat細胞系統に結合可能であったが、多様なヒトCRDをマウスCRDにより置き換えた場合、結合は失われた。このアプローチにより、本発明者らは、異なるCD137抗体がヒトCD137タンパク質内で結合するCRDを解明することが可能となった(図9を参照のこと)。
ドメインマッピングにより、本発明者らは、本発明のCD137バインダーがCRD3又はCRD2/3のジャンクションに結合することを決定した。CD137 #1及びその変異体は、CRD3に結合する。CD137 #7及びその変異体は、CRD2/3のジャンクションに結合する。対照的に、CD137についての天然リガンドであるCD137Lは、CRD2に結合する。
天然CD137リガンドの結合が本発明により改変されるかどうかに対処するために、本発明者らは、ヒトCD137リガンド(CD137-L)を発現するHEK293細胞を生成した。この細胞を、ヒトCD137を発現するJurkat細胞と共に培養した。これらのJurkat細胞におけるNFkB経路の活性化を、ルシフェラーゼ活性を介して測定した。本発明は、CD137Lにより誘引される機能的活性化と競合しないが、他の既存の分子ウレルマブ(BMS)及びウトミルマブ(Pfizer)並びにFAPターゲット化分割三量体4-1BBリガンドFc融合抗原結合分子クローン2.11(本明細書に含まれる配列番号:113、114及び116としてWO第2017194438号に記載され、配列番号:663、664、665及び666に対応する、Roche分割三量体4-1BBL(71-248)/FAP(28H1)分子構築物2.11を指す)は、CD137-Lにより誘引される活性化を遮断する(図10A及び図10B)。
a.ヒトマウスキメラの構築
CD137のキメラバージョンを発現するJurkat細胞を、各ヒトCRD領域が続けて同等のマウスCRD領域により置き換えられるように生成した。簡潔に、CD137のキメラバージョンを発現するJurkat細胞を、各ヒトCRD領域が続けて同等のマウスCRD領域により置き換えられるように生成した。
CD137のキメラバージョンを発現するJurkat細胞を、各ヒトCRD領域が続けて同等のマウスCRD領域により置き換えられるように生成した。簡潔に、CD137のキメラバージョンを発現するJurkat細胞を、各ヒトCRD領域が続けて同等のマウスCRD領域により置き換えられるように生成した。
その目的で、レンチウイルス上清を、ヒトCD137 cDNAの異なる改変を含有するプラスミドで293FT細胞をトランスフェクションして産生した。これらの改変されたヒトCD137配列において、ヒトCRD1又はCRD2又はCRD3又はCRD4におけるシステイン間のアミノ酸が、マウス対応物により置き換えられていた。特に、1つの構築物において、ヒトCRD1のアミノ酸23~45に対応する配列番号:350を配列番号:360に対応するマウスCRD1により置き換えた。別の構築物において、ヒトCRD2のアミノ酸46~86に対応する配列番号:351を配列番号:361に対応するマウスCRD2により置き換えた。第3の構築物において、ヒトCRD3のアミノ酸87~118に対応する配列番号:352を配列番号:362に対応するマウスCRD3により置き換えた。第4の構築物において、ヒトCRD4のアミノ酸119~159に対応する配列番号:353を配列番号:363に対応するマウスCRD4により置き換えた。
また、プラスミドに、構築物が発現されている細胞の選択を可能にするピューロマイシン耐性遺伝子を含ませた。12ウェルプレートにおいて、1ウェル当たりに2.5×105個の293FT細胞を完全DMEM 1.5mLに播種した。翌日、トランスフェクション混合物を、JetPRIME(登録商標)トランスフェクションバッファー(Polyplus Transfection) 75マイクロリットル、0.5μg DNA(CD137プラスミド)及びパッケージング混合物(psPAX2、pMD2.G) 1マイクロリットルを混合することにより調製した。ボルテックス後、JetPRIME(登録商標)試薬 2μlを加え、この混合物を再度ボルテックスした。室温で15分後、トランスフェクション混合物を細胞(70~80%コンフルエント)上に注いだ。37℃で4時間後、培養培地を新鮮な培地により置き換えた。翌日、ウイルス上清を収集し、硫酸プロタミンの添加後、続けて、Jurkat細胞をトランスダクションするのに使用した。正に荷電したポリカチオン硫酸プロタミンにより、細胞とウイルスとの間の反発力が低下し、より高いトランスダクション効率がもたらされる。Jurkat細胞をレンチウイルス含有上清と共にインキュベーションし、CO2インキュベーター中において、37℃で48時間培養した。その後、ピューロマイシン(最終濃度1μg/ml)を加えて、トランスダクションされた細胞を選択した。2回の後続ラウンドのウイルス除去細胞を使用して、種々のCD137ターゲット抗体がヒトCD137タンパク質に結合するドメインを決定した。
b.CD137候補の種々のエピトープへの結合
バッファー 50μl中の2×105個のCD137のこれらの変異体を発現するJurkat細胞を、CD137抗体バインダー 50μlと共に4℃で20分間インキュベーションした。その後、細胞を2回洗浄して、未結合抗体を除去し、サンプルをR-Phycoerythrin AffiniPure F(ab’)2フラグメント ロバ抗ヒトIgG(H+L)と共にさらにインキュベーションした。暗所において4℃でさらに20分間インキュベーションした後、サンプルを2回洗浄し、蛍光をフローサイトメーター(FACSCanto(商標)II分析器、BD Biosciences)で測定した。CD137の特定の改変に対する結合の減少又は不存在は、ヒトCRDがマウス対応物により置き換えられた場合、CD137抗体の結合の欠如を反映する。
バッファー 50μl中の2×105個のCD137のこれらの変異体を発現するJurkat細胞を、CD137抗体バインダー 50μlと共に4℃で20分間インキュベーションした。その後、細胞を2回洗浄して、未結合抗体を除去し、サンプルをR-Phycoerythrin AffiniPure F(ab’)2フラグメント ロバ抗ヒトIgG(H+L)と共にさらにインキュベーションした。暗所において4℃でさらに20分間インキュベーションした後、サンプルを2回洗浄し、蛍光をフローサイトメーター(FACSCanto(商標)II分析器、BD Biosciences)で測定した。CD137の特定の改変に対する結合の減少又は不存在は、ヒトCRDがマウス対応物により置き換えられた場合、CD137抗体の結合の欠如を反映する。
c.CD137リガンドを発現する細胞の生成
12ウェルプレートにおいて、1ウェル当たりに2.5×105個の293FT細胞を完全DMEM 1.5mLに播種した。翌日、トランスフェクション混合物を、JetPRIME(登録商標)トランスフェクションバッファー 75μl、0.5μg DNA(CD137プラスミド)及びパッケージング混合物(psPAX2、pMD2.G) 1μlを混合することにより調製した。ボルテックス後、JetPRIME(登録商標)試薬 2μlを加え、この混合物を再度ボルテックスした。室温で15分後、トランスフェクション混合物を細胞(70~80%コンフルエント)上に注いだ。37℃で4時間後、培養培地を新鮮な培地により置き換えた。翌日、ウイルス上清を収集し、硫酸プロタミンの添加(最終濃度4μg/ml)後、続けて、293FT細胞をトランスダクションするのに使用した。正に荷電したポリカチオン硫酸プロタミンにより、細胞とウイルスとの間の反発力が低下し、より高いトランスダクション効率がもたらされる。293FT細胞(培地 1.5ml中の0.5×105個)をレンチウイルス含有上清と共にインキュベーションし、CO2インキュベーター中において、37℃で48時間培養した。その後、ピューロマイシン(最終濃度1μg/ml)を加えて、トランスダクションされた細胞を選択した。2回の後続ラウンドのウイルス除去後、CD137-Lの発現をFACSCanto(登録商標)II分析器(BD Biosciences)でのフローサイトメトリーにより確認した。
12ウェルプレートにおいて、1ウェル当たりに2.5×105個の293FT細胞を完全DMEM 1.5mLに播種した。翌日、トランスフェクション混合物を、JetPRIME(登録商標)トランスフェクションバッファー 75μl、0.5μg DNA(CD137プラスミド)及びパッケージング混合物(psPAX2、pMD2.G) 1μlを混合することにより調製した。ボルテックス後、JetPRIME(登録商標)試薬 2μlを加え、この混合物を再度ボルテックスした。室温で15分後、トランスフェクション混合物を細胞(70~80%コンフルエント)上に注いだ。37℃で4時間後、培養培地を新鮮な培地により置き換えた。翌日、ウイルス上清を収集し、硫酸プロタミンの添加(最終濃度4μg/ml)後、続けて、293FT細胞をトランスダクションするのに使用した。正に荷電したポリカチオン硫酸プロタミンにより、細胞とウイルスとの間の反発力が低下し、より高いトランスダクション効率がもたらされる。293FT細胞(培地 1.5ml中の0.5×105個)をレンチウイルス含有上清と共にインキュベーションし、CO2インキュベーター中において、37℃で48時間培養した。その後、ピューロマイシン(最終濃度1μg/ml)を加えて、トランスダクションされた細胞を選択した。2回の後続ラウンドのウイルス除去後、CD137-Lの発現をFACSCanto(登録商標)II分析器(BD Biosciences)でのフローサイトメトリーにより確認した。
d.CD137リガンド結合遮断の測定
0.2×105個のヒトCD137-Lを発現するHEK293細胞を96ウェルプレートに播種した。5% CO2インキュベーター中において、37℃で30分間インキュベーションした後、種々のCD137バインダーの連続希釈物 12.5μlをCD137-L発現細胞に加えた。5% CO2インキュベーター中において、37℃で30分間インキュベーションした後、NFkBプロモーター(Promega)下でヒトCD137及びルシフェラーゼcDNAを発現するJurkat細胞を加えた(1ウェル当たりに0.2×105個)。5時間のインキュベーション後、プレートを室温に10分間置き、Bio-Glo(商標)試薬(Promega) 75μlを各ウェルに加えた。CD137L-CD137相互作用により媒介されるJurkat細胞活性化の測定としての発光を、EnVision(登録商標)プレートリーダー(Perkin-Elmer)により検出した。
0.2×105個のヒトCD137-Lを発現するHEK293細胞を96ウェルプレートに播種した。5% CO2インキュベーター中において、37℃で30分間インキュベーションした後、種々のCD137バインダーの連続希釈物 12.5μlをCD137-L発現細胞に加えた。5% CO2インキュベーター中において、37℃で30分間インキュベーションした後、NFkBプロモーター(Promega)下でヒトCD137及びルシフェラーゼcDNAを発現するJurkat細胞を加えた(1ウェル当たりに0.2×105個)。5時間のインキュベーション後、プレートを室温に10分間置き、Bio-Glo(商標)試薬(Promega) 75μlを各ウェルに加えた。CD137L-CD137相互作用により媒介されるJurkat細胞活性化の測定としての発光を、EnVision(登録商標)プレートリーダー(Perkin-Elmer)により検出した。
実施例4:線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を認識する結合ドメインの作製
抗FAP抗体を、OmniAb(登録商標)プラットフォーム(Crystal Biosciences)を使用して生成した。ここで、トランスジェニックニワトリ又はOminChicken(登録商標)は、本質的にUS第9,404,125号に記載されるように、ヒト生殖細胞系統可変領域、VH及びVL遺伝子IgHV3-23*04/IgKV3-11*01それぞれを含有するそのゲノム免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺ローカスを発現するように遺伝子操作されている。10羽のOmnichicken(登録商標)を、100μg ヒトFAP(フロイント完全アジュバントを含む)で筋肉内免疫化した。2週間後、10羽のうちの5羽に、100μg ヒトFAP(不完全アジュバントを含む)を受けさせ、10羽のうちの5羽に、100μg マウスFAP(不完全アジュバントを含む)を受けさせた。後続の追加免疫を2週間ごとに行い、10羽のうちの5羽に、ヒトFAPのみを受けさせ、10羽のうちの5羽に、ヒト及びマウスFAPを交互に受けさせた。カニクイザルFAPは、免疫化スケジュールには含ませなかった。ヒトFAPとカニクイザルFAPとの間で、ほぼ100%の相同性が認められたためである。
抗FAP抗体を、OmniAb(登録商標)プラットフォーム(Crystal Biosciences)を使用して生成した。ここで、トランスジェニックニワトリ又はOminChicken(登録商標)は、本質的にUS第9,404,125号に記載されるように、ヒト生殖細胞系統可変領域、VH及びVL遺伝子IgHV3-23*04/IgKV3-11*01それぞれを含有するそのゲノム免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺ローカスを発現するように遺伝子操作されている。10羽のOmnichicken(登録商標)を、100μg ヒトFAP(フロイント完全アジュバントを含む)で筋肉内免疫化した。2週間後、10羽のうちの5羽に、100μg ヒトFAP(不完全アジュバントを含む)を受けさせ、10羽のうちの5羽に、100μg マウスFAP(不完全アジュバントを含む)を受けさせた。後続の追加免疫を2週間ごとに行い、10羽のうちの5羽に、ヒトFAPのみを受けさせ、10羽のうちの5羽に、ヒト及びマウスFAPを交互に受けさせた。カニクイザルFAPは、免疫化スケジュールには含ませなかった。ヒトFAPとカニクイザルFAPとの間で、ほぼ100%の相同性が認められたためである。
ほ乳類の種に代わるものとして、鳥類(特に、ニワトリ)は、魅力的な選択肢を提示している。鳥類は、系統発生的にヒトから離れており、高い親和性及び特異性の抗体を産生し、マウスではアクセスし得ない固有のエピトープを認識することができるためである。拡張されたエピトープ範囲は、この事例の利点である。ターゲットの機能的に異なる領域にアクセスする機会が増えるためである。
免疫化後、免疫化されたトランスジェニック動物由来の血清を単離した。FAPに特異的な抗体の血清力価をELISAにより隔週で測定した。十分な力価に達した時、100μg ヒトFAP又は50μg ヒトFAP及びマウスFAPのいずれかの最終追加免疫をアジュバントなしで静脈内投与した。
FAPに特異的なモノクローナル抗体を調製するために、抗体産生脾細胞を、7羽の免疫化トランスジェニック鳥から、最終追加免疫の4日後に単離した。FAP特異的抗体をコードするcDNAを標準的な分子生物学技術によりクローニングし、トランスフェクトされた細胞中で発現させる。クローニングされたcDNA分子からのモノクローナル抗体のin vitro産生は、Andris-Widhopf et al., J. Immunol Methods 242:159(2000)及びBurton, Immunotechnology 1:87(1995)に記載されている。これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
a.免疫化及びスクリーニング戦略による種交差反応性クローンについての濃縮
最初に、ゲルカプセル化微小環境(GEM)スクリーニング(Crystal Biosciences)を、レポータービーズにより6羽の鳥から単離された脾細胞を使用して行った。一方のレポータービーズは、ヒトFAPで被覆されており、他方のレポータービーズは、マウスFAPで被覆されており、交差反応性について選択した。ヒトタンパク質とカニクイザルタンパク質は、99%相同であるため、カニクイザルスクリーニングは行わなかった。
最初に、ゲルカプセル化微小環境(GEM)スクリーニング(Crystal Biosciences)を、レポータービーズにより6羽の鳥から単離された脾細胞を使用して行った。一方のレポータービーズは、ヒトFAPで被覆されており、他方のレポータービーズは、マウスFAPで被覆されており、交差反応性について選択した。ヒトタンパク質とカニクイザルタンパク質は、99%相同であるため、カニクイザルスクリーニングは行わなかった。
b.ヒトFAP及びマウスFAPを安定して発現する細胞系統の生成
FAPは、ガン関連線維芽細胞(CAF)の細胞表面に高度に発現され、これは、多くのガンの腫瘍微小環境における重要なコンポーネントを表わす。HT1080は、線維肉腫細胞系統であり、腫瘍微小環境におけるFAPの潜在的役割についてのモデルとして広く使用されている。HT1080細胞を、高レベルのヒトFAPを発現するようにトランスフェクションした。B16メラノーマは、転移及び固形腫瘍形成の研究に有用なマウス腫瘍細胞系統である。B16細胞を、高レベルのマウスFAPを発現するようにトランスフェクションした。
FAPは、ガン関連線維芽細胞(CAF)の細胞表面に高度に発現され、これは、多くのガンの腫瘍微小環境における重要なコンポーネントを表わす。HT1080は、線維肉腫細胞系統であり、腫瘍微小環境におけるFAPの潜在的役割についてのモデルとして広く使用されている。HT1080細胞を、高レベルのヒトFAPを発現するようにトランスフェクションした。B16メラノーマは、転移及び固形腫瘍形成の研究に有用なマウス腫瘍細胞系統である。B16細胞を、高レベルのマウスFAPを発現するようにトランスフェクションした。
その目的で、レンチウイルス上清を種々の種のFAP cDNAを含有するプラスミドにより293FT細胞をトランスフェクションすることにより産生した。また、プラスミドに、構築物が発現されている細胞の選択を可能にするために、ピューロマイシン耐性遺伝子を含ませた。10cm培養プレート当たりに5×106個の293FT細胞を完全DMEM 10mLに播種した。翌日、トランスフェクション混合物を、JetPRIME(登録商標)バッファー 500μl、8μg DNA(FAPプラスミド)及びパッケージング混合物(psPAX2、pMD2.G) 20μlを混合することにより調製した。ボルテックス後、JetPRIME(登録商標)試薬 36μlを加え、この混合物を再度ボルテックスした。室温で15分後、トランスフェクション混合物を細胞(70~80%コンフルエント)上に注いだ。37℃で4時間後、培養培地を新鮮な培地により置き換えた。翌日、ウイルス上清を収集し、硫酸プロタミンの添加後、続けて、HT-1080又はB16細胞をトランスダクションするのに使用した。正に荷電したポリカチオン硫酸プロタミンにより、細胞とウイルスとの間の反発力が低下し、より高いトランスダクション効率がもたらされる。T25フラスコ(完全培地 4ml)中における30%コンフルエントでのHT-1080又はB16細胞をレンチウイルス含有上清と共にインキュベーションし、CO2インキュベーター中において、37℃で一晩培養した。翌日、細胞をPBSですすぎ、トランスダクションされた細胞の選択を可能にするために、ピューロマイシン(最終濃度1μg/ml)を含有する完全培地中で再懸濁させた。2回の後続ラウンドのウイルス除去後、FAPの発現を、FACSCanto(登録商標)II分析器(BD Biosciences)を使用することにより、フローサイトメトリーによって確認した。
c.FAP抗体のScFv-Fcへの再フォーマット
本明細書で使用する場合、「一本鎖Fv」、「一本鎖抗体」及び「scFv」という用語は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く単一ポリペプチド鎖抗体フラグメントを指す。一般的には、一本鎖抗体は、VH及びVLドメインを連結するペプチドリンカーをさらに含む。同リンカーにより、抗原に結合するための所望の構造を形成することが可能となる。
本明細書で使用する場合、「一本鎖Fv」、「一本鎖抗体」及び「scFv」という用語は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く単一ポリペプチド鎖抗体フラグメントを指す。一般的には、一本鎖抗体は、VH及びVLドメインを連結するペプチドリンカーをさらに含む。同リンカーにより、抗原に結合するための所望の構造を形成することが可能となる。
一本鎖抗体は、PluckthunによりThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113. Rosenburg and Moore edsにおいて詳細に検討されている。一本鎖抗体を生成する種々の方法は公知であり、例えば、US第4,946,778号及び同第5,260,203号、WO第88/01649号、Bird(1988) Science 242:423-442、Huston et al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、Ward et al.(1989) Nature 5 334:54454、Skerra et al.(1988) Science 242:1038-1041に記載されている。特定の実施態様では、少なくとも1つ、ただし好ましくは、2つのscFv抗体フラグメントが、抗体Fc領域と会合している。
FAP結合クローンのパネルを特定し、ScFv-Fcとしてフォーマットし、この分子を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、ヒトFAP及びマウスFAP発現安定細胞系統への結合についてチェックした(図9A、図9B及び図9C)。
線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)scFvをコードする遺伝子セグメントを構築するために、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)結合可変ドメインをコードするVL及びVH遺伝子ペアを、ペプチド配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号:282)の柔軟なリンカーをコードする遺伝子セグメントにより連結させた。次に、得られたscFvをコードする遺伝子セグメントを、ヒトIgG抗体の重鎖をコードする遺伝子の3’末端にインフレームでクローニングした。これらのコードセグメントをオーバーラップPCR法により合成し、発現ベクターpTT5にクローニングした。
d.ヒトFAP及びマウスFAP発現細胞に結合するリコンビナントFAPタンパク質
非FAP発現細胞HT-1080及びB16を対照として保持した。149個のFAP抗体を特定し、ついで、最初の工程の精製、Tm測定(>60℃)及び分析用HICカラムからの溶出、種々のタンパク質の疎水性の測定(9分未満)後に、% 単量体(>85%)含量に基づいてトリアージした。149個の候補のうち、下記11個の抗体を、選択された抗CD137バインダーと組み合わせた二重特異性抗体の生成のために選択した。
非FAP発現細胞HT-1080及びB16を対照として保持した。149個のFAP抗体を特定し、ついで、最初の工程の精製、Tm測定(>60℃)及び分析用HICカラムからの溶出、種々のタンパク質の疎水性の測定(9分未満)後に、% 単量体(>85%)含量に基づいてトリアージした。149個の候補のうち、下記11個の抗体を、選択された抗CD137バインダーと組み合わせた二重特異性抗体の生成のために選択した。
実施例5:CD137及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)をターゲットとする二重特異性構築物の生成
ついで、抗CD137(4-1BB、TNFRSF9)-抗体であるウレルマブをコードするVL及びVH遺伝子のペアを、先に上記検討されたように、実施例1に概説された二重特異性フォーマットにフォーマットした。VH遺伝子を、ヒトIgγをコードする遺伝子の5’末端でのフレーム融合としてpTT5発現ベクターにクローニングした。11個のFAP候補(表20)を選択し、二重特異性分子としてフォーマットした。ここで、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)結合scFvをコードする遺伝子を同じIgγコードセグメントの3’末端でのインフレームでクローニングした。同様に、VL遺伝子を、ヒトIgGカッパ軽鎖をコードする遺伝子とのインフレーム融合としてpTT5発現ベクターにクローニングした。Leu234Ala及びLeu235Alaの突然変異を重鎖の定常領域に導入して、Fc-ガンマレセプターへの結合を妨げた(WO第2012/130831号を参照のこと)。得られた二重特異性二価構築物の模式図を図1Aに示す。
ついで、抗CD137(4-1BB、TNFRSF9)-抗体であるウレルマブをコードするVL及びVH遺伝子のペアを、先に上記検討されたように、実施例1に概説された二重特異性フォーマットにフォーマットした。VH遺伝子を、ヒトIgγをコードする遺伝子の5’末端でのフレーム融合としてpTT5発現ベクターにクローニングした。11個のFAP候補(表20)を選択し、二重特異性分子としてフォーマットした。ここで、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)結合scFvをコードする遺伝子を同じIgγコードセグメントの3’末端でのインフレームでクローニングした。同様に、VL遺伝子を、ヒトIgGカッパ軽鎖をコードする遺伝子とのインフレーム融合としてpTT5発現ベクターにクローニングした。Leu234Ala及びLeu235Alaの突然変異を重鎖の定常領域に導入して、Fc-ガンマレセプターへの結合を妨げた(WO第2012/130831号を参照のこと)。得られた二重特異性二価構築物の模式図を図1Aに示す。
a.FAPクローンの選択
以下の表に、FAP活性をスクリーニングするのに使用された成熟二重特異性二価抗CD137(ウレルマブ)/FAP抗体のアミノ酸配列を示す。
以下の表に、FAP活性をスクリーニングするのに使用された成熟二重特異性二価抗CD137(ウレルマブ)/FAP抗体のアミノ酸配列を示す。
In-Fusion(登録商標)HDクローニングキット(Clonetech, U.S.A.)を、VH及びVL遺伝子の方向性クローニングのための上記手法に使用した。線状化ベクターの末端に相補的な15bp伸長を有するVL/VHのためのPCRプライマーを合成した。PCRを、製造業者の標準的なプロトコールを使用して行い、アンプリコンを精製するか又はクローニングエンハンサーで処理し、ついで、適切なベクターにクローニングした。ついで、E.coliを、製造業者の説明書(Clonetech, U.S.A.)に従ってトランスフォーメーションした。DNAプレップを配列決定した。
各発現ベクターは、鎖をコードする遺伝子のための真核生物プロモーターエレメント、シグナル配列及び重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子、原核生物選択マーカー遺伝子、例えば、アンピシリンのための発現カセット並びに複製起点を含有する。これらのDNAプラスミドをアンピシリン耐性E. coliコロニー中で増幅させ、精製した。
b.ヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)及びヒト線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を認識する二重特異性で四価の分子の発現及び精製
上記実施例のように調製された発現ベクターをCHO-E細胞にトランスフェクションした。無血清培地中の懸濁液中で増殖するトランスフェクションされたCHO-E細胞を振とうフラスコ中において、140rpm、37℃及び5% CO2で撹拌しながら培養し、指数増殖の条件下で維持した。トランスフェクションの日に、細胞を1mg 軽鎖プラスミド及び0.5mg 重鎖プラスミドで化学的にトランスフェクションした。ついで、それらを、Gibco(登録商標)FreeStyle(商標)CHO発現培地(LifeTechnologies, NY, US) 1L中に、1~2×106個/mlで播種した。ついで、細胞を、タンパク質の発現を可能にするために、市販の供給溶液 150mlを1回供給しながら、軌道振とう下で10~12日間インキュベーションした。細胞培養上清中の抗体力価を、Octet(登録商標)機器(Pall ForteBio, CA, US)及びprotAバイオセンサーチップを使用して、製造業者の説明書に従って測定した。
上記実施例のように調製された発現ベクターをCHO-E細胞にトランスフェクションした。無血清培地中の懸濁液中で増殖するトランスフェクションされたCHO-E細胞を振とうフラスコ中において、140rpm、37℃及び5% CO2で撹拌しながら培養し、指数増殖の条件下で維持した。トランスフェクションの日に、細胞を1mg 軽鎖プラスミド及び0.5mg 重鎖プラスミドで化学的にトランスフェクションした。ついで、それらを、Gibco(登録商標)FreeStyle(商標)CHO発現培地(LifeTechnologies, NY, US) 1L中に、1~2×106個/mlで播種した。ついで、細胞を、タンパク質の発現を可能にするために、市販の供給溶液 150mlを1回供給しながら、軌道振とう下で10~12日間インキュベーションした。細胞培養上清中の抗体力価を、Octet(登録商標)機器(Pall ForteBio, CA, US)及びprotAバイオセンサーチップを使用して、製造業者の説明書に従って測定した。
リコンビナント抗体を培養上清から、MabSelect(商標)(Amersham Biosciences)を使用するプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、60mM NaOAcバッファー(pH5.0)中に保存した。サンプルの純度及び不均一性の程度を質量分光法及び分析用超遠心分離により評価した。全てのサンプルを機能試験の前に、≧90%のモノマー含量を有し、<10%の不純物を含有することを確認した。
c.CD137/FAP二重特異性Abの機能活性
T細胞線維芽細胞共培養アッセイを使用して、FAP媒介性CD137架橋に特異的なT細胞活性化を実証した。
T細胞線維芽細胞共培養アッセイを使用して、FAP媒介性CD137架橋に特異的なT細胞活性化を実証した。
簡潔に、FAP+HT1080及びHT1080親細胞を培養培地(RPMI1640/Glutamax, Gibco 61870-010、プラス10% FCS、Gibco 26140)中に播種した。37℃及び5% CO2で一晩静置した後、細胞をCD137+Jurkat細胞と共に、所望の濃度での種々の抗体希釈液 50μLと24時間インキュベーションした。NFKBレポーター遺伝子活性を、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega G7571)を使用することにより、製造業者により提供される説明書に従って評価した。最後に、発光を、Perkin Elmer製のVICTOR(商標)X4 2030マルチラベルプレートリーダーを使用して記録した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、本発明者らは、本発明のCD137/FAP二重特異性分子がFAP陽性細胞の存在下でのみJurkat細胞を活性化するが、FAP陰性細胞の存在下では活性化しないことを確認した(図12A~図12C)。これは、FAP陽性及びFAP陰性細胞の存在下において、同程度でJurkat細胞を活性化するウレルマブとは対照的であった(図12B)。このアッセイ系では、ウトミルマブは何ら活性を示さなかった(図12C)。
NFkB-Jurkatアッセイにおける活性に基づいて、3つのクローンFAP84.A11(それぞれVH、VL配列番号:629、630)、FAP84.B8(それぞれVH、VL配列番号:635、636)及びFAP63.C3(それぞれVH、VL配列番号:623、624)を最適化FAP候補として特定した。これらのうち、2つのFAP分子を、候補クローンCD137 #B21及びCD137 #A49を有するdoppelmabとして調製し、4種類の親二重特異性構築物を得た。4つの親二重特異性に対応する配列を表24、行1~4に提供する。発展性についての予備製剤化評価を、4つの最初のタンパク質について行った(表22を参照のこと)。
実施例6:調製されたヒトCD137(4-1BB、TNFRSF9)及びヒト線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)分子を認識する二重特異性分子の詳細
下記実施例では、本発明の多数の異なる二重特異性CD137(4-1BB、TNFRSF9)/線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)抗体分子を調製した。混乱を避けるために、これらの分子の特徴及び配列を以下に提供する。
下記実施例では、本発明の多数の異なる二重特異性CD137(4-1BB、TNFRSF9)/線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)抗体分子を調製した。混乱を避けるために、これらの分子の特徴及び配列を以下に提供する。
a.FAPの配列最適化
FAP84.A11(「FAP #1」)及びFAP63.C3(「FAP #4」)親変異体の配列最適化のために、潜在的傾向部位における点突然変異をヒトフレームワークにおいて形成した。以下に、FAP候補についての配列を記載する。
FAP84.A11(「FAP #1」)及びFAP63.C3(「FAP #4」)親変異体の配列最適化のために、潜在的傾向部位における点突然変異をヒトフレームワークにおいて形成した。以下に、FAP候補についての配列を記載する。
機能アッセイにおける活性に基づいて、3つの抗FAP候補であるFAP-A11-VK3-VH13又は「FAP #2」、FAP-A11-VK7-VH1又は「FAP #3」及びFAP-C3-VK1-VH4又は「FAP #5」を特定し、8つの配列最適化された抗CD137結合分子(以下の表24に記載されているように、B21変異体V.16(「CD137 #2」)、V.22(「CD137 #3」)、V.25(「CD137 #4」)、V.29(「CD137 #5」)、V.37(「CD137 #6」)並びにA49変異体V.43(「CD137 #8」)、V.47(「CD137 #9」)及びV.48(「CD137 #10」))でフォーマットし、24個のCD137-FAP二重特異的分子を生じさせた。
実施例7:in vitroアッセイ-ターゲットされたCD137-FAP結合分子の生物学的活性;Jurkat CellsにおけるCD137のFAP依存性架橋
T細胞線維芽細胞共培養アッセイを使用して、FAP媒介性CD137架橋に特異的なT細胞活性化を実証した。このために、内部で生成されたFAP+HT1080又はFAP-HT1080親細胞をJurkat-CD137 NFκBルシフェラーゼ細胞(Promega #CS196004)の培養物に加えた。Jurkat-CD137の活性化は、NFκB駆動ルシフェラーゼレポーターを介して測定される。細胞をCD137/FAP分子の存在下で培養して、FAP選択的CD137アゴニストを特定した。EC90/IC90値を表25及び表26に示す。
T細胞線維芽細胞共培養アッセイを使用して、FAP媒介性CD137架橋に特異的なT細胞活性化を実証した。このために、内部で生成されたFAP+HT1080又はFAP-HT1080親細胞をJurkat-CD137 NFκBルシフェラーゼ細胞(Promega #CS196004)の培養物に加えた。Jurkat-CD137の活性化は、NFκB駆動ルシフェラーゼレポーターを介して測定される。細胞をCD137/FAP分子の存在下で培養して、FAP選択的CD137アゴニストを特定した。EC90/IC90値を表25及び表26に示す。
EC50、IC50、EC90及びIC90並びにその比率IC50/EC50及びIC90/EC90を代表的なクローンについて計算し、表26で比較した。全てのクローンは、比較的同等の挙動を示した。具体的には、これらの分子は、ベル型応答を示し、これは、このアッセイに固有であった。この応答は、統計的に類似したIC50/EC50及びIC90/EC90比を生じる分子間で一致した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、本発明者らは、本発明のCD137/FAP二重特異性分子がFAP陽性細胞の存在下でのみJurkat-CD137細胞を活性化するが、FAP陰性細胞の存在下では活性化しないことを確認した。データから、CD137変異体分子のセットが多様なレベルの活性を示すことが示され、全てのCD137係合、したがって、活性がFAP発現細胞の存在下でのみ生じるように限定されたことも示される(図13A~図13D)。
実施例8:T細胞活性化に対する二重特異性CD137(4-1BB、TNFRSF9)/線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)分子の影響
本発明のCD137/FAP分子は、FAP依存的にCD137レセプターを介してT細胞を活性化する非常に特異的かつ強力な分子である。本発明のCD137/FAP分子が初代ヒトT細胞に係合し、活性化する能力を評価するために、IFN-γ分泌を測定するヒトPBMC活性化アッセイを使用した。このアッセイを、上記実施例7に記載されたJurkat NFκBスクリーニングアッセイから選択されたCD137/FAP分子を使用して行った。
本発明のCD137/FAP分子は、FAP依存的にCD137レセプターを介してT細胞を活性化する非常に特異的かつ強力な分子である。本発明のCD137/FAP分子が初代ヒトT細胞に係合し、活性化する能力を評価するために、IFN-γ分泌を測定するヒトPBMC活性化アッセイを使用した。このアッセイを、上記実施例7に記載されたJurkat NFκBスクリーニングアッセイから選択されたCD137/FAP分子を使用して行った。
活性化を実証し、腫瘍微小環境をシミュレーションするために、抗CD3(クローンOKT3)を0.5μg/mlの濃度でプレート上に被覆した。次に、マイトマイシンC処理HT1080-FAP陽性細胞に、ヒトPBMCを加えた。T細胞活性化をMSD分析(Meso Scale Discovery)によるhIFN-γレベルを定量することにより、24時間後に測定した。各クローンについてのEC50値を図14A~図14Hに示す。CD3単独での刺激により、IFN-γ分泌がもたらされるが、CD137/FAP分子の存在下でFAP陽性HT1080細胞と共培養されたPBMCにより、CD3単独のレベルより50%多いIFN-γが分泌された。このIFN-γの増加は、CD137FAP分子により提供される共刺激活性によるものである場合がある。
さらに、8名の健康なドナー由来の初代ヒトPBMCも、HT1080-FAP+ve線維肉腫細胞の存在下で、本発明のCD137/FAP二重特異性分子のレベルを増加させて培養した場合、FAP依存性IFN-γ産生を示した。
図15A及び図15Bに、例示的なCD137 B21/FAP分子の濃度を増加させた個々のドナーのPBMCのhIFN-γ分泌を示す(図15B)。この例示は、FAP発現細胞の存在下で、複数のドナーPBMCにわたって一貫した強力なIFN-γ応答であったこの一連の分子に理想的な特性を示した。さらに、この応答は、FAP発現細胞の不存在下で失われた。
実施例9:in vitro FAP酵素活性はCD137/FAP結合により阻害されない
FAPはエンドペプチダーゼ活性を有する表面局在糖タンパク質である。FAPの発現は、ほとんどの組織で低いが、活性化された線維芽細胞では活発な組織リモデリング部位及びガンでアップレギュレーションされている。幾つかの基質が、FAPにより開裂されることが報告されているが、この活性の生理学的重要性は十分に理解されていない。この目的で、FAP酵素アッセイを使用して、本発明のFAPターゲット抗体がFAP酵素活性を妨害するかどうかを決定した。
FAPはエンドペプチダーゼ活性を有する表面局在糖タンパク質である。FAPの発現は、ほとんどの組織で低いが、活性化された線維芽細胞では活発な組織リモデリング部位及びガンでアップレギュレーションされている。幾つかの基質が、FAPにより開裂されることが報告されているが、この活性の生理学的重要性は十分に理解されていない。この目的で、FAP酵素アッセイを使用して、本発明のFAPターゲット抗体がFAP酵素活性を妨害するかどうかを決定した。
これを実証するために、蛍光FAP活性アッセイ(BPS Bioscience #80210)を使用した。このアッセイを、阻害が濃度依存性であるFAP阻害についての陽性対照としてタラボスタットメシラートを使用して行った(図16B)。図16Aでは、本発明の例示的な分子であるCD137-B21/FAP-C3及びマウスCD137 B21/FAP-A11がFAPタンパク質の酵素活性を妨害せず、このため、FAPの生理学的活性を妨害しないようであることを実証されている。
実施例10:CRC異種移植モデルにおける二重特異性分子のin vivo有効性
また、本発明者らは、CD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を認識する結合分子のin vivo有効性を調査した。この目的で、ヒト腫瘍モデルを開発した。
また、本発明者らは、CD137(4-1BB、TNFRSF9)及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を認識する結合分子のin vivo有効性を調査した。この目的で、ヒト腫瘍モデルを開発した。
有効性試験をCD137 KI HuGEMM(商標)マウスの皮下同系MC38結腸直腸ガンモデルで行った。このモデルでは、腫瘍細胞及び腫瘍間質細胞は、マウス由来のものであり、T細胞も、マウス由来であるが、細胞表面上にヒトCD137抗原を発現する。簡潔に、MC38マウス腫瘍細胞を腫瘍発生のために、約1×106個の腫瘍細胞/マウスで右後側腹部に皮下接種した。処置を腫瘍が63.6mm3の体積中央値であった7日目に開始し、マウス交差反応性CD137/FAP、マウス最適化代替分子(VH及びVLそれぞれ、配列番号:169、170)又は媒体バッファー(50mM NaOAc、100mM NaCl、pH5.0)を腹腔内注射(i.p.)により、q7d投与計画で投与し、マウスPD-1抗体(マウスPD-1抗体は、Chen, S., Lee, L-F., Fisher, T.S, et al., Feb 2015, DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0118(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているクローンRMP1-14に由来する)を週2回i.p.投与した。
腫瘍成長を外部キャリパー測定によりモニターし、腫瘍体積を、標準的な半楕円体式を使用して計算した。人道的エンドポイントに達した動物を倫理的理由から研究の初期に安楽死させた。エンドポイント腫瘍をIHC分析のために収集した。本発明者らは、媒体単独と比較して、腫瘍へのCD8+T細胞の浸潤の増加を見出した。
図17に示された模式図に、CD137 KI HuGEMM(商標)マウスでの皮下同系MC38結腸直腸ガンモデルにおける分子の投与スケジュールを表わす。
最初のin vivo研究では、マウスをq7d計画において10mg/kgの用量でi.p.投与された最適化されたヒトCD137-B21/FAP-C3又はマウスCD137 B21/FAP-A11分子のいずれかで処置した。両分子ともに、弱い腫瘍活性を示し、TGIは、22日目にそれぞれ43%及び46%であった(図18B)。
図18A~図18Dに、CD137 KI HuGEMMマウスでの皮下同系MC38結腸直腸ガンモデルにおけるヒトCD137 B21/FAP C3及びマウスCD137 B21/FAPA11単剤療法のインビボ有効性を示す。図18Aに、ヒトCD137 B21/FAP C3での処置後の平均腫瘍成長曲線を示し、図18Bに、ヒトCD137 B21/FAP C3での処置後の個々の腫瘍成長曲線を示す。同様に、図18Cに、マウスCD137 B21/FAP A11での処置後の平均腫瘍成長曲線を示し、図18Dに、マウスCD137 B21/FAP A11での処置後の個々の腫瘍成長曲線を示す。
図18A~図18Dに提示されたデータから、本発明の結合分子が対照群と比較した場合、腫瘍体積の減少を誘引可能であり、その効果が用量依存性であることが実証される。
図19A及び図19Bに提示されたデータから、本発明のヒトCD137 B21/FAP C3及びマウスCD137 B21/FAP-A11結合分子が対照群と比較した場合、腫瘍微小環境へのCD3+又はCD8+T細胞浸潤の増加を誘引可能であることが実証される。
実施例11:PD-1 Ab及びCD137/FAPによる相乗効果
本発明者らは、q7d計画において10mg/kgで投与されるCD137/FAPと、q3d/q4d計画において10mg/kgでのマウスPD-1抗体(マウスPD-1抗体は、Chen, S., Lee, L-F., Fisher, T.S, et al., Feb 2015, DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0118(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているクローンRMP1-14に由来する)との併用の可能性を調査した。
本発明者らは、q7d計画において10mg/kgで投与されるCD137/FAPと、q3d/q4d計画において10mg/kgでのマウスPD-1抗体(マウスPD-1抗体は、Chen, S., Lee, L-F., Fisher, T.S, et al., Feb 2015, DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0118(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているクローンRMP1-14に由来する)との併用の可能性を調査した。
この研究では、単剤療法としてマウスCD137 B21/FAP A11での処置により、44%のTGIで同様の腫瘍活性がもたらされた。ただし、この実施例では、ヒトCD137 B21/FAP A11は、単独療法として腫瘍活性を示さなかった。これは、マウスCD137 B21/FAP A11と比較して、ヒトFAPに対する約130倍弱い親和性と組み合わせた典型的なバリエーションの生物学的モデルにより説明することができた。
図20B~図20Eに提示されたデータから、本発明の結合分子が対照群と比較した場合、PD-1アンタゴニストmAbと併用して腫瘍体積の減少を誘引可能であり、その効果が用量依存性であることが実証される。
マウスPD-1抗体とヒトCD137 B21/FAP A11(図20B及び図20D)又はマウスCD137 B21/FAP A11(図20C及び図20E)との併用療法により、腫瘍活性の強力かつ統計的に有意な(p<0.0001)向上がもたらされ、24日目のTGIはそれぞれ、92%及び94%であった。このことから、ヒトCD137 B21/FAP A11と抗PD-1との併用の相乗効果が示唆される。
また、マウスPD-1抗体とヒトCD137 B21/FAP A11又はマウスCD137 B21/FAP A11との併用療法によりそれぞれ、50%及び37.5%の顕著な数値の腫瘍の退縮(100mm3未満の腫瘍体積と定義)ももたらされた。このことから、CD137/FAP分子と抗PD-1との併用の相乗効果が示唆される(表27)。この効果は、用量依存性であり、1mpk マウスCD137 B21/FAP A11で腫瘍退縮の消失を伴う(表27)。
表27に提示されたデータから、本発明の結合分子が対照群と比較して、PD-1アゴニストと併用した場合、腫瘍退縮を誘引可能であり、その効果が用量依存性であることが実証される。
マウスPD-1抗体とヒトCD137 B21/FAP A11との併用療法により、腫瘍生存面積の強力かつ統計的に有意な減少並びにCD4+及びCD8+T細胞腫瘍浸潤の両方の増加がもたらされた。このことから、ヒトCD137 B21/FAP A11と抗PD-1との併用の相乗効果が示唆された(図21A~図21G)。CD8+浸潤のこの増加(図21C)は、腫瘍生存面積の減少(図21G)と正に相関した。
図21A~図21Gに提示されたデータから、本発明の結合分子が対照群と比較して、PD-1アゴニストと併用された場合、CD4及びCD8 T細胞浸潤の両方を誘引可能であることが実証される。また、データから、CD8+T細胞浸潤の増加が腫瘍生存領域の消失と正に相関することも実証される。
Claims (20)
- CD137(4-1BBリガンドレセプター、4-1BB)に特異的に結合する2つの抗原結合部位と、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する2つの抗原結合部位とを有し、
ここで、CD137(4-1BBリガンドレセプター)に特異的に結合する抗原結合部位は、免疫グロブリン分子の一部であり、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位は、2つのscFvを含む、
二重特異性かつ四価の結合分子。 - 2つ以上のscFvが、N末端からC末端へのVL-VH配向を有する、請求項1記載の結合分子。
- 2つのscFvがそれぞれ、Ig分子の重鎖のC末端に融合される、請求項1記載の結合分子。
- Ig分子が、IgGである、請求項1記載の結合分子。
- 2つのscFvが、4~20個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、Ig分子に融合される、請求項1記載の結合分子。
- CD137(4-1BB)に特異的に結合する抗原結合部位が、下記:
i)配列番号:290(CDR1)、配列番号:8(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:12(CDR1)、配列番号:13(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ii)配列番号:295(CDR1)、配列番号:18(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:22(CDR1)、配列番号:23(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iii)配列番号:295(CDR1)、配列番号:28(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:32(CDR1)、配列番号:33(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iv)配列番号:295(CDR1)、配列番号:38(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:42(CDR1)、配列番号:43(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
v)配列番号:295(CDR1)、配列番号:48(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:52(CDR1)、配列番号:53(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vi)配列番号:295(CDR1)、配列番号:58(CDR2)及び配列番号:9(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:62(CDR1)、配列番号:63(CDR2)及び配列番号:14(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
vii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:68(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
viii)配列番号:308(CDR1)、配列番号:78(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:72(CDR1)、配列番号:73(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ix)配列番号:308(CDR1)、配列番号:88(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
x)配列番号:308(CDR1)、配列番号:98(CDR2)及び配列番号:69(CDR3)を含む重鎖CDR並びに配列番号:92(CDR1)、配列番号:93(CDR2)及び配列番号:74(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR
を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む群より選択される免疫グロブリン分子の一部である、請求項1~5のいずれか一項記載の結合分子。 - CD137(4-1BB)に特異的に結合する抗原結合部位が、下記:
i)配列番号:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:15のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ii)配列番号:20のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:25のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iii)配列番号:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:35のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iv)配列番号:40のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
v)配列番号:50のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:55のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vi)配列番号:60のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:65のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
vii)配列番号:70のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:75のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
viii)配列番号:80のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:85のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ix)配列番号:90のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:95のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
x)配列番号:100のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:105のアミノ酸配列を含む可変軽鎖
を含む群より選択される免疫グロブリン(Ig)分子の一部である、請求項1~6のいずれか一項記載の結合分子。 - 線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位が、下記:
i)配列番号:319(CDR1)、配列番号:108(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:111(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
ii)配列番号:319(CDR1)、配列番号:117(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:120(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iii)配列番号:319(CDR1)、配列番号:126(CDR2)及び配列番号:109(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:129(CDR1)、配列番号:112(CDR2)及び配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
iv)配列番号:328(CDR1)、配列番号:135(CDR2)及び配列番号:136(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR又は
v)配列番号:333(CDR1)、配列番号:144(CDR2)及び配列番号:145(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDR並びに配列番号:138(CDR1)、配列番号:139(CDR2)及び配列番号:140(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR
を含むscFvの群より選択される、請求項1~7のいずれか一項記載の結合分子。 - 線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合する抗原結合部位が、下記:
i)配列番号:106のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
ii)配列番号:115のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:119のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iii)配列番号:124のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:128のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
iv)配列番号:133のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:137のアミノ酸配列を含む可変軽鎖又は
v)配列番号:142のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号:146のアミノ酸配列を含む可変軽鎖
を含む群より選択される、請求項1~8のいずれか一項記載の結合分子。 - (i)配列番号:159のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:160のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(ii)配列番号:164のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:165のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(iii)配列番号:169のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:170のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(iv)配列番号:174のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:175のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(v)配列番号:179のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:180のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(vi)配列番号:184のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:185のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(vii)配列番号:189のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:190のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(viii)配列番号:194のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:195のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(ix)配列番号:199のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:200のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(x)配列番号:204のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:205のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xi)配列番号:209のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:210のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xii)配列番号:214のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:215のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xiii)配列番号:219のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:220のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xiv)配列番号:224のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:225のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xv)配列番号:229のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:230のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvi)配列番号:234のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:235のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xvii)配列番号:239のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:240のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xviii)配列番号:244のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:245のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xix)配列番号:249のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:250のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xx)配列番号:254のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:255のアミノ酸配列を含む軽鎖又は
(xxi)配列番号:259のアミノ酸配列を含み、そのC末端でscFvに融合された免疫グロブリン重鎖及び配列番号:260のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、
免疫グロブリン様結合分子。 - CD137結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ここで、
(i)重鎖可変領域は、配列番号:10、20、30、40、50、60、70、80、90及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み又は
(ii)軽鎖可変領域は、配列番号:15、25、35、45、55、65、75、85、95及び105からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み又は
(iii)得られた分子は、1×10-7M以下のKDでヒトCD137に結合し、
(iv)得られた分子は、FAP結合の不存在下で、CD137クラスター化及びT細胞活性化を実質的に媒介せず又は
(v)得られた分子は、アミノ酸87~118(配列番号:352)の細胞外ドメインCRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(iv)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこれらと結合について競合し又は
(vi)得られた分子は、アミノ酸46~117(配列番号:356)の細胞外ドメインCRD2/CRD3でCD137上のエピトープに結合し、上記抗原結合分子(i)~(iv)のいずれかの結合を遮断しかつ/もしくはこららと結合について競合する、
CD137/FAP結合分子。 - FAP結合部分が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ここで、
(i)重鎖可変領域が、配列番号:106、115、124、133及び142からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含み、
(ii)軽鎖可変領域が、配列番号:110、119、128、137及び146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%相同なアミノ酸配列を含む、請求項11記載のCD137/FAP結合分子。 - 請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子をコードする、核酸分子もしくは複数の核酸分子又はこのような1つ以上の核酸分子を含有する1つ以上の発現ベクター。
- 請求項13記載の核酸分子を含有する、
ホスト細胞。 - 請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子の製造方法であり、
(i)請求項14記載のホスト細胞を該分子の発現を可能にする条件下で培養することと、
(ii)該分子を回収することとを含む、
方法。 - 医薬において使用するための、請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子。
- ガン、好ましくは、結腸直腸ガン(CRC)(例えば、結腸直腸腺ガン)、胃ガン(GC)(例えば、胃腺ガン)、膵臓ガン(PAC)(例えば、膵臓腺ガン)及び肺ガン(LC)(例えば、肺扁平上皮ガン、肺腺ガン)の治療に使用するための、請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子。
- 請求項1~12、16又は17のいずれか一項記載の結合分子を薬学的に許容し得る担体及び場合により、1種以上の更なる有効成分と共に含む、
医薬組成物。 - 有効量の請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、
ガンの処置方法。 - 前記方法が、CD137及びFAPに特異的に結合可能なポリペプチドをPD-1抗体と組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む、請求項19記載の方法。
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