JP2024026356A - アペリンポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【課題】野生型アペリン-13ポリペプチドと比較して、安定性、循環半減期及び/または効力が向上した修飾アペリンポリペプチドを提供すること。【解決手段】修飾アペリンポリペプチドを含む組成物及び当該ポリペプチドを心不全などの心臓機能障害を治療するために使用する方法についても開示される。ある特定の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、安定性、半減期及び/または効力の向上などの有利な薬学的特徴を有する。いくつかの実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、少なくとも1つのD-アミノ酸、β-アミノ酸、N-メチルアミノ酸、α-メチルアミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型を含む。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2014年6月10日に出願された米国仮特許出願第62/010,322号の利益を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に援用する。
本出願は、2014年6月10日に出願された米国仮特許出願第62/010,322号の利益を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に援用する。
本出願は、野生型アペリンと比較して安定性、循環半減期及び/または効力が向上した、APJ受容体のアゴニストに関する。
アペリンは、APJ受容体(APLNR、アンギオテンシン受容体様-1)の内因性リガンドである。APJ受容体は、ロドプシン様Gタンパク質共役受容体(GPCR)ファミリーの一員である。アペリン/APJ系は、心臓、腎臓、膵臓、肺及び中枢神経系などの多くの組織中で観察されており、哺乳類の生理学及び病理学におけるこの系の多様な役割が示唆されている。
アペリンペプチドは、77残基のプレプロ形態から、より小さな生物活性断片である主に36残基の形態(アペリン42~77、アペリン-36ともいう)と、より小さい13残基ポリペプチド(アペリン65~77、アペリン-13ともいう)とに処理される(Hosoyaら、J.Biol.Chem.275:21061-21067,2000)。アペリンペプチドは、7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体スーパーファミリーの一員である、オーファンAPJ受容体の内因性リガンドであることがこれまでに特定されている(Tatemoto et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,251:471-476,1998)。より短い活性の強いアイソフォームの1つであることが特定されたピログルタミン酸化アペリン-13([PE65]アペリン-13(65~77))は、心臓組織において最も強力かつ豊富な形態のアペリンであることが報告されている(Maguire et al.,Hypertension,54:598-604,2009)。インビトロ及び前臨床モデルにより、アペリン/APJ系が心血管の恒常性及び代謝に関与することが示唆されている(Barnes et
al.,Heart,96:1011-1016,2010)。アペリン循環濃度は一過性のものであり、アペリン-13は5分未満という短い血漿半減期を有することから、心血管作用は短期的なものである。
al.,Heart,96:1011-1016,2010)。アペリン循環濃度は一過性のものであり、アペリン-13は5分未満という短い血漿半減期を有することから、心血管作用は短期的なものである。
インビトロにおいて、外因性アペリンは、心房細片及びラットの全心臓にてサブナノモル濃度で収縮性を増加させ、単離心筋細胞にて筋節の短縮を最大140%増加させる(Barnes et al.,Heart,96:1011-1016,2010)。アペリンはまた、エクスビボでの単離心臓アッセイにおいて、強力な変力作用を有する。インビボにおいて、急激なアペリン注入は、慢性心不全を持つラットにて、駆出率を回復させ、心拍出量を増加させ、左心室拡張終期圧を減少させる(Berry et al.,Circulation,110:187-193,2004)。外因性アペリンは、心室の前負荷及び後負荷の減少に付随する左心室肥大を誘発することなく、心筋収縮性を強力に増大する(Barnes et al.,Heart,96:1011-1016,2010)。
アペリンペプチドについて報告された構造活性相関(SAR)研究は、極めて限られている。この限られたSAR研究は、インビトロでの親和性及び/または効力増大に集中しており、APJアゴニストの効力を改善または維持した状態での、タンパク質分解に対する安定性の向上及び循環半減期の延長に焦点を当てたSARに関する報告はない。
したがって、野生型アペリンポリペプチドの効力を保持しつつ、安定性の向上した新しいアペリン類似体が当該技術分野において求められている。
したがって、野生型アペリンポリペプチドの効力を保持しつつ、安定性の向上した新しいアペリン類似体が当該技術分野において求められている。
Hosoyaら、J.Biol.Chem.275:21061-21067,2000
Tatemoto et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,251:471-476,1998
Maguire et al.,Hypertension,54:598-604,2009
Barnes et al.,Heart,96:1011-1016,2010
Berry et al.,Circulation,110:187-193,2004
本発明は、APJアゴニスト活性を有する新しい修飾アペリンポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、修飾ペプチドは、野生型アペリンと比較して安定性が向上している。本発明の修飾ペプチドは、心不全またはAPJ受容体の活性化に応答する他の疾患を治療するために使用することができる。
ある特定の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、安定性、半減期及び/または効力の向上などの有利な薬学的特徴を有する。いくつかの実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、少なくとも1つのD-アミノ酸、β-アミノ酸、N-メチルアミノ酸、α-メチルアミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型を含む。一実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上または8つ以上の非標準アミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態において、非標準アミノ酸残基は、アペリンポリペプチド配列内の天然アミノ酸残基と置き換わっている。修飾アペリンポリペプチドは、安定性を更に向上させるために、環化していてもよい。
一実施形態において、アペリンポリペプチドは、アミノ酸配列:X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10GX11X12X13X14(配列番号717)を含み、配列中、X1は、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、X2は、[r]、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、X3は、Q、[q]または[BLeu]であり、X4は、[hArg]、[NMeArg]、R、Eまたは[r]であり、X5は、Pまたは[aMePro]であり、X6は、R、E、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、X7は、L、[aMeLeu]、[BLeu]、[NMeLeu]または[Cha]であり、X8は、S、[BhSer]または[NhSerG]であり、X11は、P、[Oic]、[aMePro]または[Pip]であり、X13は、P、[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、X14は、F、[D-BhPhe]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]または[D-Bip]である。いくつかの実施形態において、X7は[NMeLeu]であり、X12は[pI-Phe]であり、X14は[D-Bip]である。ある特定の実施形態において、X1は[hArg]であり、X2は[hArg]であり、X3はQであり、X4は[hArg]であり、X5はPである。他の実施形態において、X13は[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、X14は[D-BhPhe]または[4-Cl-F]である。ある特定の実施形態において、X6は[NMeArg]または[hArg]であり、X7は[aMeLeu]または[BLeu]である。修飾アペリンポリペプチドは、そのアミノ末端がアセチル化されていてもよい。アペリンポリペプチドは、好ましくは、APJ受容体に対するアンタゴニスト活性をわずかしか有していないか、または全く有していない(すなわち、アペリンポリペプチドは、完全なAPJ受容体アゴニストである)。
いくつかの実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、所望によりリンカーを介して、半減期延長部分として機能する脂肪酸若しくは他の脂質、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコールポリマー)、タンパク質(例えば、抗体またはFcドメイン)または別のペプチド配列(例えば、標的ドメイン)などの別の部分に結合される。これらの半減期延長部分-アペリンペプチド複合体は、野生型アペリンペプチドと比較して、1つまたは複数の特性、例えば、安定性、インビボ半減期または効力などの改善を有し得る。この部分は、N末端若しくはC末端またはポリペプチドの任意の他の部位を介してアペリンポリペプチドに結合され得る。ある特定の実施形態において、半減期延長部分は、修飾アペリンポリペプチドのN末端に結合される。
いくつかの実施形態において、修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体は、野生型アペリン-13(配列番号4)またはpyr-アペリン-13(配列番号6)と比較して、インビトロまたはインビボでの安定性が向上している。種々の実施形態において、安定性の向上した修飾アペリンポリペプチドは、インビトロでの半減期が向上している。他の実施形態において、安定性の向上した修飾アペリンポリペプチドは、インビボ半減期が向上している。インビボ半減期の向上は、タンパク質分解の減少若しくは代謝安定性の向上及び/または半減期延長部分の組み込み若しくはアペリンポリペプチドの他の改変の結果であり得る。
本発明はまた、本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。医薬組成物は、心不全などの心血管障害のための治療を必要とする患者に投与することができる。
したがって、別の実施形態において、本発明は、必要とする対象において、心血管障害を治療し、心収縮性を改善し、または駆出率を増加させる方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体のいずれかを治療上有効な量で含む医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、心血管障害は、心不全である。心不全は、急性心不全であっても、慢性心不全(例えば、慢性収縮期または慢性拡張期)であってもよい。一実施形態において、心不全は、駆出率の低下した心不全である。別の実施形態において、心不全は、駆出率の保持された心不全である。他の実施形態において、心血管病態は、高血圧である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
アミノ酸配列:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10GX11X12X13X14(配列番号717)を含み、配列中、
X1は、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、[r]、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X3は、Q、[q]または[BLeu]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]、R、Eまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、R、E、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は、L、[aMeLeu]、[BLeu]、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、S、[BhSer]または[NhSerG]であり、X9は、HまたはYであり、
X10は、Kまたは[NLysG]であり、
X11は、P、[Oic]、[aMePro]または[Pip]であり、
X12は、[Nle]、[rNle]または[pI-Phe]であり、
X13は、P、[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、
X14は、F、[D-BhPhe]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]または[D-Bip]である、単離ポリペプチド。
(項目2)
前記ポリペプチドのアミノ末端がアセチル化されている、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目3)
所望により結合リンカーを介して、C1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基に結合した、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目4)
前記脂肪族アシル基が、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルである、項目3に記載の単離ポリペプチド。
(項目5)
前記脂肪族アシル基が、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイルまたはオクタデカンジオイルである、項目3に記載の単離ポリペプチド。
(項目6)
前記結合リンカーが、Aeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluを含む、項目3に記載の単離ポリペプチド。
(項目7)
所望により結合リンカーを介して、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーに結合した、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目8)
前記PEGポリマーが、5kDa、10kDaまたは20kDaのPEGポリマーである、項目7に記載の単離ポリペプチド。
(項目9)
前記結合リンカーが3-メルカプトプロパン酸を含む、項目7に記載の単離ポリペプチド。
(項目10)
所望により結合リンカーを介して、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFcドメインに結合した、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目11)
前記結合リンカーがペプチジルリンカーである、項目10に記載の単離ポリペプチド。(項目12)
前記結合リンカーが非ペプチジルリンカーである、項目10に記載の単離ポリペプチド。
(項目13)
前記非ペプチジルリンカーがPEGポリマーを含む、項目12に記載の単離ポリペプチド。
(項目14)
X7が[NMeLeu]であり、X12が[pI-Phe]であり、X14が[D-Bip]である、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目15)
X1が[hArg]であり、X2が[hArg]であり、X3がQであり、X4が[hArg]であり、X5がPである、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目16)
X6及びX7が[NMeArg]と[aMeLeu]、[hArg]と[BLeu]または[hArg]と[aMeLeu]である、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目17)
X13が[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、X14が[D-BhPhe]または[4-Cl-F]である、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目18)
配列番号8~11、16、17、31、32、45、53、60、68、69~71、92、112、114、119、120、221、228、237、263、286、287、362、373、376、379、382、388、412、416、460、468、482、483、485、491、498、499、500、502、505、514、519、526、531、534、544、552、554、560及び571から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目19)
次式:
X1X2X3X4
(式中、X1は、脂肪族アシル基であり、
X2は、γGluであるか、または不在であり、
X3は、スペーサー部分基であるか、または不在であり、
X4は、アペリンポリペプチドであり、前記アペリンポリペプチドは、少なくとも1つのD-アミノ酸、β-アミノ酸、N-メチルアミノ酸、α-メチルアミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型を含む。)
に従う構造を含む、単離ポリペプチド。
(項目20)
X2がγGluである、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目21)
前記脂肪族アシル基がC1~C25脂肪族アシル基である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目22)
前記脂肪族アシル基が、ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、オクタデカンジオイル、オクタンジオイル、デカンジオイル、ドデカンジオイル、ヘキサンジオイル、ブタンジオイル、テトラデカンジオイルまたはヘキサデカンジオイルである、項目21に記載の単離ポリペプチド。
(項目23)
X3が、Aeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluから選択されるスペーサー部分基である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目24)
X1がオクタデカンジオイル、ヘプタデカノイル、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルであり、X2がγ-Gluであるか、または不在であり、X3がAeea、Aeea-Aeeaであるか、または不在である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目25)
前記アペリンポリペプチドが少なくとも12アミノ酸長である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目26)
前記アペリンポリペプチドが少なくとも1つの非標準アミノ酸置換を有する、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目27)
前記アペリンポリペプチドが2、3、4、5、6、7、8または9個の非標準アミノ酸を有する、項目26に記載の単離ポリペプチド。
(項目28)
前記D-アミノ酸、前記β-アミノ酸、前記N-メチルアミノ酸、前記α-アミノ酸、前記非標準アミノ酸または前記非標準アミノ酸の前記D-若しくはβ-型が、完全長アペリン(配列番号2)、アペリン65~77(配列番号3)、アペリン65~77(アペリン-13)(配列番号4)、アペリン(配列番号5)または完全長アペリンの断片中の標準アミノ酸に代わって用いられる、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目29)
配列番号7~714の任意の配列群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
(項目30)
アミノ酸配列:
Z1Z2X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号769)を含み、
配列中、
Z1は、アシル基であり、
Z2は、結合リンカーを含むか、または不在であり、
X1は、O、K、[D-Orn]、[k]、[BLys]、[D-BLys]、[BhLys]若しくは[D-BhLys]であるか、または不在であり、
X2は、F、[BhPhe]、[BPhe]であるか、または不在であり、
X3は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X4は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X5は、Q、L、N、[q]、[l]、[PE]、[BhGln]、[BhAsn]、[aMeLeu]、[aMeGln]、[BLeu]または[BhLeu]であり、
X6は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X7は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[rPro]または[Pip]であり、
X8は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X9は、L、[Cha]、[NMeCha]、[rCha]、[rLeu]、[NMeLeu]、[aMeLeu]、[BLeu]または[BhLeu]であり、
X10は、S、[aMeSer]、[BhSer]、[rSer]、[Sar]または[bAla]であり、
X11は、H、A、V、L、Y、[Deg]、[Tle]、[NMeVal]または[bAla]であり、
X12は、K、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、
X13は、G、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、
X14は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、
X15は、M、L、V、I、[Met(O)]、[Nle]、[Nva]または[pI-Phe]であり、
X16は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、
X17は、F、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]若しくは[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
(項目31)
Z1が、C1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基である、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目32)
Z1が、アセチル、オクタノイル(Oct)、デカノイル(Dec)、ドデカノイル(DDA)、トリデカノイル(TDA)、テトラデカノイル(ミリストイル)、ペンタデカノイル(PDA)、ヘキサデカノイル(パルミトイル)、ヘプタデカノイル(HDA)、オクタデカノイル(ステアロイル)、オクタデカンジオイル(ODDA)または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の脂肪族アシル基若しくは親油基である、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目33)
Z1が、5kDa、10kDa、20kDaのPEGポリマー、または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の他のPEGポリマーである、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目34)
Z2がAeea、γ-グルタミン酸またはこれらの組み合わせを含む結合リンカーである、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目35)
前記Z2の結合リンカーが不在である、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目36)
野生型アペリン13(配列番号4)またはピログルタミン酸化野生型アペリン-13(配列番号6)と比較して安定性が向上した、項目1~35のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
(項目37)
項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
(項目38)
治療を必要とする対象の心血管病態を治療するための方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目39)
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善する方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記対象の心収縮性が投与後に改善する、前記方法。
(項目40)
dP/dtmax及び/または駆出率が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて増加する、項目38または39に記載の方法。
(項目41)
収縮期または拡張期機能が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて改善する、項目38または39に記載の方法。
(項目42)
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させる方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記駆出率が前記ポリペプチドの投与後に増加する、前記方法。
(項目43)
前記心血管病態が心不全である、項目38~42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、項目43に記載の方法。
(項目47)
前記心不全が急性心不全である、項目43に記載の方法。
(項目48)
前記心血管病態が高血圧である、項目38~42のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
治療を必要とする対象の心血管病態を治療する薬剤の調製のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドの使用。
(項目50)
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善する薬剤の調製のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドの使用であって、前記薬剤により前記対象の心収縮性が投与後に改善する、前記使用。
(項目51)
前記薬剤により前記対象のdP/dtmax及び/または駆出率が投与後に増加する、項目49または50に記載の使用。
(項目52)
前記薬剤により前記対象の収縮期または拡張期機能が投与後に改善する、項目49または50に記載の使用。
(項目53)
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させる薬剤の調製のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドの使用であって、前記薬剤により前記対象の駆出率が投与後に増加する、前記使用。
(項目54)
前記心血管病態が心不全である、項目49~53のいずれか一項に記載の使用。
(項目55)
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、項目54に記載の使用。
(項目56)
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、項目54に記載の使用。
(項目57)
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、項目54に記載の使用。
(項目58)
前記心不全が急性心不全である、項目54に記載の使用。
(項目59)
前記心血管病態が高血圧である、項目49~53のいずれか一項に記載の使用。
(項目60)
治療を必要とする対象の心血管病態を治療するための方法における使用のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
(項目61)
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善するための方法における使用のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドであって、前記対象の前記心収縮性が前記ポリペプチドの投与後に改善する、前記単離ポリペプチド。
(項目62)
dP/dtmax及び/または駆出率が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて増加する、項目60または61に記載の単離ポリペプチド。
(項目63)
収縮期または拡張期機能が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて改善する、項目60または61に記載の単離ポリペプチド。
(項目64)
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させるための方法における使用のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドであって、前記対象の前記駆出率が前記ポリペプチドの投与後に増加する、前記単離ポリペプチド。
(項目65)
前記心血管病態が心不全である、項目60~64のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
(項目66)
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。
(項目67)
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。(項目68)
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。
(項目69)
前記心不全が急性心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。
(項目70)
前記心血管病態が高血圧である、項目60~64のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
アミノ酸配列:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10GX11X12X13X14(配列番号717)を含み、配列中、
X1は、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、[r]、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X3は、Q、[q]または[BLeu]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]、R、Eまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、R、E、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は、L、[aMeLeu]、[BLeu]、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、S、[BhSer]または[NhSerG]であり、X9は、HまたはYであり、
X10は、Kまたは[NLysG]であり、
X11は、P、[Oic]、[aMePro]または[Pip]であり、
X12は、[Nle]、[rNle]または[pI-Phe]であり、
X13は、P、[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、
X14は、F、[D-BhPhe]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]または[D-Bip]である、単離ポリペプチド。
(項目2)
前記ポリペプチドのアミノ末端がアセチル化されている、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目3)
所望により結合リンカーを介して、C1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基に結合した、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目4)
前記脂肪族アシル基が、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルである、項目3に記載の単離ポリペプチド。
(項目5)
前記脂肪族アシル基が、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイルまたはオクタデカンジオイルである、項目3に記載の単離ポリペプチド。
(項目6)
前記結合リンカーが、Aeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluを含む、項目3に記載の単離ポリペプチド。
(項目7)
所望により結合リンカーを介して、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーに結合した、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目8)
前記PEGポリマーが、5kDa、10kDaまたは20kDaのPEGポリマーである、項目7に記載の単離ポリペプチド。
(項目9)
前記結合リンカーが3-メルカプトプロパン酸を含む、項目7に記載の単離ポリペプチド。
(項目10)
所望により結合リンカーを介して、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFcドメインに結合した、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目11)
前記結合リンカーがペプチジルリンカーである、項目10に記載の単離ポリペプチド。(項目12)
前記結合リンカーが非ペプチジルリンカーである、項目10に記載の単離ポリペプチド。
(項目13)
前記非ペプチジルリンカーがPEGポリマーを含む、項目12に記載の単離ポリペプチド。
(項目14)
X7が[NMeLeu]であり、X12が[pI-Phe]であり、X14が[D-Bip]である、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目15)
X1が[hArg]であり、X2が[hArg]であり、X3がQであり、X4が[hArg]であり、X5がPである、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目16)
X6及びX7が[NMeArg]と[aMeLeu]、[hArg]と[BLeu]または[hArg]と[aMeLeu]である、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目17)
X13が[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、X14が[D-BhPhe]または[4-Cl-F]である、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目18)
配列番号8~11、16、17、31、32、45、53、60、68、69~71、92、112、114、119、120、221、228、237、263、286、287、362、373、376、379、382、388、412、416、460、468、482、483、485、491、498、499、500、502、505、514、519、526、531、534、544、552、554、560及び571から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1に記載の単離ポリペプチド。
(項目19)
次式:
X1X2X3X4
(式中、X1は、脂肪族アシル基であり、
X2は、γGluであるか、または不在であり、
X3は、スペーサー部分基であるか、または不在であり、
X4は、アペリンポリペプチドであり、前記アペリンポリペプチドは、少なくとも1つのD-アミノ酸、β-アミノ酸、N-メチルアミノ酸、α-メチルアミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型を含む。)
に従う構造を含む、単離ポリペプチド。
(項目20)
X2がγGluである、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目21)
前記脂肪族アシル基がC1~C25脂肪族アシル基である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目22)
前記脂肪族アシル基が、ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、オクタデカンジオイル、オクタンジオイル、デカンジオイル、ドデカンジオイル、ヘキサンジオイル、ブタンジオイル、テトラデカンジオイルまたはヘキサデカンジオイルである、項目21に記載の単離ポリペプチド。
(項目23)
X3が、Aeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluから選択されるスペーサー部分基である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目24)
X1がオクタデカンジオイル、ヘプタデカノイル、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルであり、X2がγ-Gluであるか、または不在であり、X3がAeea、Aeea-Aeeaであるか、または不在である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目25)
前記アペリンポリペプチドが少なくとも12アミノ酸長である、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目26)
前記アペリンポリペプチドが少なくとも1つの非標準アミノ酸置換を有する、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目27)
前記アペリンポリペプチドが2、3、4、5、6、7、8または9個の非標準アミノ酸を有する、項目26に記載の単離ポリペプチド。
(項目28)
前記D-アミノ酸、前記β-アミノ酸、前記N-メチルアミノ酸、前記α-アミノ酸、前記非標準アミノ酸または前記非標準アミノ酸の前記D-若しくはβ-型が、完全長アペリン(配列番号2)、アペリン65~77(配列番号3)、アペリン65~77(アペリン-13)(配列番号4)、アペリン(配列番号5)または完全長アペリンの断片中の標準アミノ酸に代わって用いられる、項目19に記載の単離ポリペプチド。
(項目29)
配列番号7~714の任意の配列群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
(項目30)
アミノ酸配列:
Z1Z2X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号769)を含み、
配列中、
Z1は、アシル基であり、
Z2は、結合リンカーを含むか、または不在であり、
X1は、O、K、[D-Orn]、[k]、[BLys]、[D-BLys]、[BhLys]若しくは[D-BhLys]であるか、または不在であり、
X2は、F、[BhPhe]、[BPhe]であるか、または不在であり、
X3は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X4は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X5は、Q、L、N、[q]、[l]、[PE]、[BhGln]、[BhAsn]、[aMeLeu]、[aMeGln]、[BLeu]または[BhLeu]であり、
X6は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X7は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[rPro]または[Pip]であり、
X8は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X9は、L、[Cha]、[NMeCha]、[rCha]、[rLeu]、[NMeLeu]、[aMeLeu]、[BLeu]または[BhLeu]であり、
X10は、S、[aMeSer]、[BhSer]、[rSer]、[Sar]または[bAla]であり、
X11は、H、A、V、L、Y、[Deg]、[Tle]、[NMeVal]または[bAla]であり、
X12は、K、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、
X13は、G、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、
X14は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、
X15は、M、L、V、I、[Met(O)]、[Nle]、[Nva]または[pI-Phe]であり、
X16は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、
X17は、F、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]若しくは[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
(項目31)
Z1が、C1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基である、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目32)
Z1が、アセチル、オクタノイル(Oct)、デカノイル(Dec)、ドデカノイル(DDA)、トリデカノイル(TDA)、テトラデカノイル(ミリストイル)、ペンタデカノイル(PDA)、ヘキサデカノイル(パルミトイル)、ヘプタデカノイル(HDA)、オクタデカノイル(ステアロイル)、オクタデカンジオイル(ODDA)または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の脂肪族アシル基若しくは親油基である、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目33)
Z1が、5kDa、10kDa、20kDaのPEGポリマー、または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の他のPEGポリマーである、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目34)
Z2がAeea、γ-グルタミン酸またはこれらの組み合わせを含む結合リンカーである、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目35)
前記Z2の結合リンカーが不在である、項目30に記載の単離ポリペプチド。
(項目36)
野生型アペリン13(配列番号4)またはピログルタミン酸化野生型アペリン-13(配列番号6)と比較して安定性が向上した、項目1~35のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
(項目37)
項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
(項目38)
治療を必要とする対象の心血管病態を治療するための方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目39)
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善する方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記対象の心収縮性が投与後に改善する、前記方法。
(項目40)
dP/dtmax及び/または駆出率が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて増加する、項目38または39に記載の方法。
(項目41)
収縮期または拡張期機能が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて改善する、項目38または39に記載の方法。
(項目42)
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させる方法であって、項目1~36のいずれか一項に記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記駆出率が前記ポリペプチドの投与後に増加する、前記方法。
(項目43)
前記心血管病態が心不全である、項目38~42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、項目43に記載の方法。
(項目47)
前記心不全が急性心不全である、項目43に記載の方法。
(項目48)
前記心血管病態が高血圧である、項目38~42のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
治療を必要とする対象の心血管病態を治療する薬剤の調製のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドの使用。
(項目50)
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善する薬剤の調製のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドの使用であって、前記薬剤により前記対象の心収縮性が投与後に改善する、前記使用。
(項目51)
前記薬剤により前記対象のdP/dtmax及び/または駆出率が投与後に増加する、項目49または50に記載の使用。
(項目52)
前記薬剤により前記対象の収縮期または拡張期機能が投与後に改善する、項目49または50に記載の使用。
(項目53)
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させる薬剤の調製のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドの使用であって、前記薬剤により前記対象の駆出率が投与後に増加する、前記使用。
(項目54)
前記心血管病態が心不全である、項目49~53のいずれか一項に記載の使用。
(項目55)
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、項目54に記載の使用。
(項目56)
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、項目54に記載の使用。
(項目57)
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、項目54に記載の使用。
(項目58)
前記心不全が急性心不全である、項目54に記載の使用。
(項目59)
前記心血管病態が高血圧である、項目49~53のいずれか一項に記載の使用。
(項目60)
治療を必要とする対象の心血管病態を治療するための方法における使用のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
(項目61)
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善するための方法における使用のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドであって、前記対象の前記心収縮性が前記ポリペプチドの投与後に改善する、前記単離ポリペプチド。
(項目62)
dP/dtmax及び/または駆出率が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて増加する、項目60または61に記載の単離ポリペプチド。
(項目63)
収縮期または拡張期機能が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて改善する、項目60または61に記載の単離ポリペプチド。
(項目64)
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させるための方法における使用のための項目1~36のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドであって、前記対象の前記駆出率が前記ポリペプチドの投与後に増加する、前記単離ポリペプチド。
(項目65)
前記心血管病態が心不全である、項目60~64のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
(項目66)
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。
(項目67)
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。(項目68)
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。
(項目69)
前記心不全が急性心不全である、項目65に記載の単離ポリペプチド。
(項目70)
前記心血管病態が高血圧である、項目60~64のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
前述の概要は、本発明のあらゆる態様または実施形態を定義することを意図するものではなく、更なる態様が他の項にて記載され得る。本文書全体は、1つの開示として関連付けられることが意図され、特徴の組み合わせが本文書の同一の文または段落または項中に共に見出されない場合であっても、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせが企図され得ることを理解されたい。
前述のものに加えて、追加の態様として、本明細書の特定の段落によって定義される変形形態よりも何らかの点で範囲の狭い全ての実施形態が本開示中に含まれ得る。例えば、特定の態様が1つの属として記載され、その属の全要素が個別に実施形態になり得ることを理解されたい。また、属として記載される態様または属の要素の選択は、属の2つ以上の要素の組み合わせを包含することも理解されたい。本明細書中の種々の実施形態は「含む(comprising)」という言葉を用いて提示されるが、種々の状況下において、関連実施形態が「からなる(consisting of)」または「から本質的になる(consisting essentially of)」という言葉を用いて記載され得ることも理解されたい。
本明細書の記載は、単に例示的かつ説明的なものであり、特許請求する本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。本出願において、単数形の使用は、別途の記載がない限り、複数を含む。本出願において、「or」は、別途の記載がない限り、「and/or」を意味する。更に、「including(含む)」という用語の使用は、「includes(含む)」及び「included(含んだ)」などの他の形も同様に、限定ではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、別途明記されない限り、1単位を含む要素及び成分と、1つを超える亜単位を含む要素及び成分との両方を包含する。また、「部分」という用語の使用は、部分の一部または部分全体を含み得る。
別途の記載がない限り、本出願に関して用いられる科学技術用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈により別途の定めがない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。したがって、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形の「a」、「an」及び「the」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「a protein」への言及は複数のタンパク質を含み、「a cell」への言及は複数の細胞の集団を含む。
値の範囲を記載する場合、記載される特性値は、その範囲内に存在する個別の値であり得ることも理解されたい。例えば、「約pH4~約pH6のpH」は、限定するものではないが、pH4、4.2、4.6、5.1、5.5などであり得、こうした値の間のあらゆる値であり得る。更に、「約pH4~約pH6のpH」は、当該pHがpH4~pH6の間で2pH単位異なるという意味ではなく、値が、その溶液のpHについて、2つのpH範囲内から選ばれ得ることを意味するように解釈されるべきである。
いくつかの実施形態において、「約」という用語が用いられる場合、示された数は、その示された数のプラスマイナス1%、5%、10%、15%またはそれ以上を意味する。意図される実際のばらつきは、文脈から決定される。
本明細書にて使用する段落見出しは、単に構成上の目的であり、記載される主題の限定を意図するものではない。限定するものではないが、特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含む、本出願に引用する全ての文献または文献の一部は、その全体が一切の目的のために参照により明示的に本明細書に援用される。
本発明は、APJ受容体のアゴニストとして作用する修飾アペリンポリペプチドを提供する。本明細書で使用するとき、「APJ受容体アゴニスト」とは、APJ受容体を活性化することができ、これにより生化学的、細胞若しくは生理学的プロセスに作用するか、またはこれらを刺激する分子を指す。APJ受容体アゴニストは、APJ受容体に結合することができる。この用語はまた、天然に生成するアペリンペプチドと少なくとも同等の生物活性を有するポリペプチドを指し得るが、天然アペリンペプチドよりも生物活性の低いポリペプチドも指し得る。この用語は、天然アペリンペプチドの作用を強化した分子を更に含む。APJ受容体アゴニストは、APJリガンドであってよく、APJリガンドとは、APJ受容体に結合するか、またはAPJ受容体と複合体を形成する分子を指す。リガンドは、シグナル伝達誘発分子であり得るが、必ずしもそうである必要はない。
いくつかの実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、野生型アペリンポリペプチドと比較して、より安定している。例えば、一実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、アペリン-13(配列番号4)またはピログルタミン酸化アペリン-13(配列番号6)と比較して、安定性(例えば、タンパク質分解に対する安定性)が向上している。これらの実施形態及び他の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、野生型アペリンポリペプチドと比較して、同等であるか、または向上したAPJ受容体アゴニスト活性を有する。ある特定の実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、dp/dt、駆出率または心拍数などの心収縮性の様々な特徴を増加させることによって、心臓におけるアゴニスト活性を有する。「野生型アペリンペプチド」または「内因性アペリンペプチド」という用語は、配列MNLRLCVQAL LLLWLSLTAV CGGSLMPLPD GNGLEDGNVR HLVQPRGSRN GPGPWQGGRR KFRRQRPRLS HKGPMPF(配列番号2)を有する完全長アペリンプレタンパク質;配列LVQPRGSRNG PGPWQGGRRK FRRQRPRLSH KGPMPF(配列番号3)を有するアペリン(42~77)(アペリン-36とも称される);配列QRPRLSHKGPMPF(配列番号4)を有するアペリン(65~77)(野生型アペリン-13とも称される);配列KFRRQRPRLS HKGPMPF(配列番号5)を有するアペリン(61~77)(アペリン-17としても知られる)及び完全長アペリンの他の断片を含む。アペリン断片は、多くの場合、完全長アペリンプレタンパク質(配列番号2)内の特定のアミノ酸配列範囲として定義される。例えば、アペリン-17の場合、N末端のKは、完全長アペリンタンパク質(配列番号2)を基準として、61番目であり、C末端のFは、77番目である。いくつかの実施形態において、本発明の修飾アペリンペプチドは、完全長アペリン配列(配列番号2)中のアミノ酸61~77に対応する位置に特定のアミノ酸置換を有するものとして定義され得る。例として、Oic74という表記法は、配列番号2中のアミノ酸74に対応する位置の修飾ポリペプチドのOic残基を指す。
本発明の一実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、次式:
Nx1x2x3x4x5x6x7x8x9x10x11x12x13x14x15x16x17(配列番号1)の配列を含み、配列中、
Nは、伸長部、結合リンカー、または野生型アペリン-13(配列番号4)と比較して安定性を改善することができる任意の部分(例えば、アセチル基、γ-gluまたは脂質)であり、
x1は、不在であるか、塩基性若しくは極性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x2は、不在であるか、非官能性若しくは疎水性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x3は、不在であるか、塩基性若しくは極性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x4は、不在であるか、塩基性若しくは極性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x5は、不在であるか、または非官能性、疎水性若しくは極性残基(例えば、pE、Q、Cit、L、V、G、HまたはP)であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x6は、不在であるか、または極性若しくは塩基性残基(例えば、KまたはCit、R、NMeArgまたはhArg)であり、
x7は、非官能性または疎水性残基(例えば、P、OicまたはG)であり、
x8は、塩基性または極性残基(例えば、Q、Cit、R、NMeArgまたはhArg)であり、
x9は、非官能性または疎水性残基(例えば、V、Iまたは好ましくはL、NMeLeuまたはCha)であり、
x10は、非官能性、極性若しくは疎水性残基であるか、または結合リンカーの一部を含み(例えば、S、F及び4F-Phe)、
x11は、非官能性、極性、塩基性若しくは疎水性残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x12は、非官能性、疎水性、極性または塩基性残基であり、
x13は、非官能性または芳香族残基(例えば、G)であり、
x14は、非官能性または親水性残基(例えば、P及びOic)であり、
x15は、非官能性、極性または疎水性残基(例えば、脂肪族、芳香族、疎水性残基)であり、
x16は、非官能性または疎水性残基(例えば、F、4I-Phe、4Cl-Phe、Bip、P、Oic)であり、
x17は、不在であるか、または疎水性残基(例えば、芳香族残基)である。
Nx1x2x3x4x5x6x7x8x9x10x11x12x13x14x15x16x17(配列番号1)の配列を含み、配列中、
Nは、伸長部、結合リンカー、または野生型アペリン-13(配列番号4)と比較して安定性を改善することができる任意の部分(例えば、アセチル基、γ-gluまたは脂質)であり、
x1は、不在であるか、塩基性若しくは極性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x2は、不在であるか、非官能性若しくは疎水性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x3は、不在であるか、塩基性若しくは極性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x4は、不在であるか、塩基性若しくは極性アミノ酸残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x5は、不在であるか、または非官能性、疎水性若しくは極性残基(例えば、pE、Q、Cit、L、V、G、HまたはP)であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x6は、不在であるか、または極性若しくは塩基性残基(例えば、KまたはCit、R、NMeArgまたはhArg)であり、
x7は、非官能性または疎水性残基(例えば、P、OicまたはG)であり、
x8は、塩基性または極性残基(例えば、Q、Cit、R、NMeArgまたはhArg)であり、
x9は、非官能性または疎水性残基(例えば、V、Iまたは好ましくはL、NMeLeuまたはCha)であり、
x10は、非官能性、極性若しくは疎水性残基であるか、または結合リンカーの一部を含み(例えば、S、F及び4F-Phe)、
x11は、非官能性、極性、塩基性若しくは疎水性残基であるか、または結合リンカーの一部を含み、
x12は、非官能性、疎水性、極性または塩基性残基であり、
x13は、非官能性または芳香族残基(例えば、G)であり、
x14は、非官能性または親水性残基(例えば、P及びOic)であり、
x15は、非官能性、極性または疎水性残基(例えば、脂肪族、芳香族、疎水性残基)であり、
x16は、非官能性または疎水性残基(例えば、F、4I-Phe、4Cl-Phe、Bip、P、Oic)であり、
x17は、不在であるか、または疎水性残基(例えば、芳香族残基)である。
上記式中のアミノ酸残基は、D-若しくはL-アミノ酸、α-若しくはβ-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD若しくはL-若しくはα-若しくはβ-型であってよい。
「アミノ酸」または「残基」という用語は、アミノ基(NH2)、カルボン酸基(COOH)及び種々の側基のいずれかを含有する化合物であって、基本式NH2CHRCOOHを有し、ペプチド結合によって一緒に連結してタンパク質を形成する化合物を意味するものと理解されたい。アミノ酸は、例えば、酸性、塩基性、芳香族、極性または誘導体であってよい。非標準(non-standard)アミノ酸は、「非標準(non-canonical)」アミノ酸と称されることもある。アミノ酸は、天然にはα-及びL-型で認められるが、β-及びD-型アミノ酸も調製することができる(Araghi,R.R.et al.,Amino Acids 41:733-742,2011)。α-アミノ酸では、カルボン酸基及びアミノ基は同じ炭素中心に結合している。β-アミノ酸では、アミノ基はβ炭素に結合しており、グリシンを除いて、ほとんどのアミノ酸に認められる。一般に、β-アミノ酸は、優勢であるα-型と比較して、天然にてあまり観察されない。
天然に生成するペプチド及びタンパク質に一般に組み込まれる20種の「天然」アミノ酸残基の識別を示すために、1文字の略号系がしばし適用される。(表1)。このような1文字略号は、意味の上で、3文字略号または略号化されていないアミノ酸の名称と完全に互換可能である。本明細書で使用する1文字略号系において、大文字はL-アミノ酸を示し、小文字はD-アミノ酸を示す。例えば、略号「R」はL-アルギニンを表し、略号「r」または「[r]」はD-アルギニンを表す。
アミノ酸配列中のアミノ酸置換については、本明細書にて、特定の位置のアミノ酸残基に関する1文字略号の後に、対象の天然配列を基準とした数値のアミノ酸位置と、次いで置換アミノ酸残基に関する1文字略号を続けることで示され得る。例えば、「T30D」は、対象の天然配列を基準として、アミノ酸位置30でトレオニン残基がアスパラギン酸残基により置換されていることを示す。
アミノ酸残基は、一般に、異なる化学的及び/または物理的特性に従って、分類される。「酸性アミノ酸残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有する、D-またはL-型のアミノ酸残基を指す。例示的な酸性残基には、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基が挙げられる。「アルキルアミノ酸残基」という用語は、プロリンの場合のようにアミノ酸アミンを含む、線状、分枝状または環化であってよいC1~6アルキル側鎖を有する、D-またはL-型のアミノ酸残基を指し、ここで、C1~6アルキルは、C1~4ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、-C(=O)Rb、-C(=O)ORa、-C(=O)NRaRa、-C(=NRa)NRaRa、-NRaC(=NRa)NRaRa、-ORa、-OC(=O)Rb、-OC(=O)NRaRa、-OC2~6アルキルNRaRa、-OC2~6アルキルORa、-SRa、-S(=O)Rb、-S(=O)2Rb、-S(=O)2NRaRa、-NRaRa、-N(Ra)C(=O)Rb、-N(Ra)C(=O)ORb、-N(Ra)C(=O)NRaRa、-N(Ra)C(=NRa)NRaRa、-N(Ra)S(=O)2Rb、-N(Ra)S(=O)2NRaRa、-NRaC2~6アルキルNRaRa及び-NRaC2~6アルキルORaから選択される0、1、2または3個の置換基によって置換され、式中、Raは、独立して、それぞれの場合において、HまたはRbであり、Rbは、独立して、それぞれの場合において、ハロ、C1~4アルキル、C1~3ハロアルキル、-OC1~4アルキル、-NH2、-NHC1~4アルキル及び-N(C1~4アルキル)C1~4アルキルから選択される0、1、2または3個の置換基によって置換されたC1~6アルキルであるか、あるいは、任意のそのプロトン化した形態(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、2-アミノ酪酸を含む)であるが、その残基にアリールまたは芳香族基を含有しないものである。
「芳香族アミノ酸残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有する、D-またはL-型のアミノ酸残基を指す。例示的な芳香族残基には、トリプトファン、チロシン、3-(1-ナフチル)アラニン、ヒスチジンまたはフェニルアラニン残基が挙げられる。「塩基性アミノ酸残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有する、D-またはL-型のアミノ酸残基を指す。例示的な塩基性アミノ酸残基には、ヒスチジン、リシン、ホモリシン、オルニチン、アルギニン、N-メチル-アルギニン、ω-アミノアルギニン、ω-メチル-アルギニン、1-メチル-ヒスチジン、3-メチル-ヒスチジン及びホモアルギニン(hR)残基が挙げられる。「親水性アミノ酸残基」または「極性アミノ酸残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有する、D-またはL-型のアミノ酸残基を指す。例示的な親水性または極性残基には、システイン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン及びシトルリン(Cit)残基が挙げられる。「疎水性アミノ酸残基」または「親油性アミノ酸残基」という用語は、無電荷の脂肪族基または芳香族基を含む側鎖を有する、D-またはL-型のアミノ酸残基を指す。例示的な親油性の側鎖には、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。アラニン(A)は、親水性または親油性(すなわち、疎水性)として作用できる、両親媒性残基である。したがって、アラニンは、「親油性」(すなわち、「疎水性」)残基と「親水性」残基の両方の定義に含まれる。「非官能性」または「中性」アミノ酸残基という用語は、側鎖に酸性、塩基性または芳香族基を持たない、D-またはL-型のアミノ酸残基を指す。例示的な中性アミノ酸残基には、メチオニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン及びノルロイシンが挙げられる。
「非標準」または「天然でない」アミノ酸という用語は、天然タンパク質に通常組み込まれる、20種の天然アミノ酸中にはない、D-またはL-型のアミノ酸残基を指す。非標準アミノ酸の例は、図1及び表2に見出すことができる。非標準アミノ酸残基は、組み換え発現細胞を用いる、タンパク質工学の既知の技術を用いることによって、ペプチド中に組み込むことができる。例えば、Link et al.,Non-canonical amino acids in protein engineering,Current Opinion in Biotechnology,14(6):603-609,2003を参照されたい。非標準アミノ酸の更なる例には、例えば、β-アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化された側鎖を持つアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。更なる例には、(L型またはD型の)β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリロン酸(aminocaprioic acid)、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Nα-エチルグリシン、Nα-エチルアスパラギン(Nα-ethylaspargine)、ヒドロキシリシン、アロ-ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、ω-メチルアルギニン、Nα-メチルグリシン、Nα-メチルイソロイシン、Nα-メチルバリン、γ-カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、Nα-アセチルセリン、Nα-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン及び他の類似のアミノ酸、ならびに以下の表2に列挙するもの、ならびに本明細書に記載のもののいずれかの誘導体形態が挙げられる。表2及び図1に、本発明の修飾アペリンポリペプチドに組み込むことができるいくつかの例示的な非標準アミノ酸残基と、本明細書にて概して用いる対応する略号とを記載する。しかしながら、当業者であれば、同じ物質に対して異なる略号及び命名法を適用することができ、本明細書にて区別なく記載されることを理解するであろう。本明細書に記載するいくつかのアミノ酸配列は、N末端に「{H}」、「{H2}」若しくは「{水素}」を含み得、これらの全てをN末端アミノ基と表し、かつ/またはC末端に「-{遊離酸}」若しくは{COOH}を含み得、この両方をC末端カルボキシ基と表す。いくつかの配列は、N末端に「Ac」、「アセチル」または「アセチル-NH」を含み、これはN末端のアセチル化を示す(例えば、アセテートまたはアセトアミド)。本明細書で使用するとき、「ブロモアセチル」という用語は、ブロモアセテートまたはブロモアセトアミドを指す。
本発明の修飾アペリンポリペプチドは、約10アミノ酸長~約80アミノ酸長、約13アミノ酸長~約40アミノ酸長、または約15アミノ酸~約25アミノ酸長であり得る。ある特定の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、約12アミノ酸長である。他の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、約13アミノ酸長である。特定の一実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、約15アミノ酸長である。別の特定の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、約17アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、約36アミノ酸長である。
ある特定の実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、少なくとも1つの非標準アミノ酸を有する。他の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、または少なくとも9つの非標準アミノ酸を有する。修飾アペリンポリペプチドは、ペプチド中の総アミノ酸の少なくとも25%を非標準アミノ酸として有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチド中の少なくとも30%のアミノ酸が非標準アミノ酸である。一実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、ポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも50%を非標準アミノ酸として有する。別の実施形態において、修飾アペリンポリペプチド中の少なくとも60%のアミノ酸が非標準アミノ酸である。更に別の実施形態において、修飾アペリンポリペプチド中の少なくとも70%のアミノ酸が非標準アミノ酸である。非標準アミノ酸は、本明細書にて開示するもののいずれかであり得、表2に挙げるものを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、アミノ酸配列:X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10GX11X12X13X14(配列番号717)を含み、配列中、
X1は、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、[r]、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X3は、Q、[q]または[BLeu]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]、R、Eまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、R、E、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は、L、[aMeLeu]、[BLeu]、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、S、[BhSer]または[NhSerG]であり、
X9は、HまたはYであり、
X10は、Kまたは[NLysG]であり、
X11は、P、[Oic]、[aMePro]または[Pip]であり、X12は、[Nle]、[rNle]または[pI-Phe]であり、
X13は、P、[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、
X14は、F、[D-BhPhe]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]または[D-Bip]である。
X1は、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、[r]、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X3は、Q、[q]または[BLeu]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]、R、Eまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、R、E、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は、L、[aMeLeu]、[BLeu]、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、S、[BhSer]または[NhSerG]であり、
X9は、HまたはYであり、
X10は、Kまたは[NLysG]であり、
X11は、P、[Oic]、[aMePro]または[Pip]であり、X12は、[Nle]、[rNle]または[pI-Phe]であり、
X13は、P、[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、
X14は、F、[D-BhPhe]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]または[D-Bip]である。
いくつかのこのような実施形態において、X7は[NMeLeu]であり、X12は[pI-Phe]であり、X14は[D-Bip]である。関連する実施形態において、X1は[hArg]であり、X2は[hArg]であり、X3はQであり、X4は[hArg]であり、X5はPである。ある特定の実施形態において、X6及びX7はそれぞれ、[NMeArg]と[aMeLeu]、[hArg]と[BLeu]または[hArg]と[aMeLeu]である。他の特定の実施形態において、X13は[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、X14は[D-BhPhe]または[4-Cl-F]である。本発明の修飾アペリンポリペプチドは、配列番号8~11、16、17、31、32、45、53、60、68、69~71、92、112、114、119、120、221、228、237、263、286、287、362、373、376、379、382、388、412、416、460、468、482、483、485、491、498、499、500、502、505、514、519、526、531、534、544、552、554、560及び571から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、配列番号19、20、22~24、29、30、33、34、37、46、47、50~52、55、56、97~105、107、109、111、115、117、118、127、150、154、156、157、176~181、183~185、211~232、236、241、242、261~267、270、274、275、278~281、284、349、540及び698から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の修飾アペリンポリペプチドは、N末端がアセチル化されていてもよい。例えば、一実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、アミノ酸配列:
Ac-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号718)を含み、配列中、X1はOまたは[BhLys]であり、X2はF、[BhPhe]または[Bphe]であり、X3は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X4は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X5はQ、[BhGln]、[BhAsn]または[BhLeu]であり、X6は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X7はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]または[Pip]であり、X8は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X9は[Cha]または[BhLeu]であり、X10はS、[BhSer]、[Sar]または[bAla]であり、X11はH、[NmeVal]または[bAla]であり、X12はK、[NmeLys]、[BhLys]、[Blys]または[bAla]であり、X13はG、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、X14は[Oic]、[Aib]、[Sar]、[bAla]、[BhPro]または[Pip]であり、X15は[Nle]または[bAla]であり、X16はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[bAla]、[Pip]、[D-1Nal]または[D-2Nal]であり、X17は[4-Cl-F]、[Bh-Phe]または[Bphe]である。このような実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、以下の表3に列挙するペプチドのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
Ac-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号718)を含み、配列中、X1はOまたは[BhLys]であり、X2はF、[BhPhe]または[Bphe]であり、X3は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X4は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X5はQ、[BhGln]、[BhAsn]または[BhLeu]であり、X6は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X7はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]または[Pip]であり、X8は[hArg]、[NmeArg]または[BhArg]であり、X9は[Cha]または[BhLeu]であり、X10はS、[BhSer]、[Sar]または[bAla]であり、X11はH、[NmeVal]または[bAla]であり、X12はK、[NmeLys]、[BhLys]、[Blys]または[bAla]であり、X13はG、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、X14は[Oic]、[Aib]、[Sar]、[bAla]、[BhPro]または[Pip]であり、X15は[Nle]または[bAla]であり、X16はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[bAla]、[Pip]、[D-1Nal]または[D-2Nal]であり、X17は[4-Cl-F]、[Bh-Phe]または[Bphe]である。このような実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、以下の表3に列挙するペプチドのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
他の実施形態において、本発明のアセチル化された修飾アペリンポリペプチドは、アミノ酸配列:[z]X1X2X3X4X5X6X7SHX8G[Oic]X9X10X11(配列番号719)を含み、配列中、zは、アセチルであるか、または不在であり、X1は、アセチル、[r]または[hArg]であり、X2は、[r]、Rまたは[hArg]であり、X3は、Qまたは[q]であり、X4は、[hArg]、Rまたは[r]であり、X5は、Pまたは[Oic]であり、X6は、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、X7は、[NMeLeu]または[Cha]であり、X8は、Kまたは[NLysG]であり、X9は、[pl-Phe]または[Nle]であり、X10は、Pまたは[D-1Nal]または[Pip]であり、X11は、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型である。このような実施形態において、X11は、[D-Bip]、[4-CL-F]、[D-4CLF]、[TIC]、[f]であるか、または不在である。例示的な修飾アペリンポリペプチドは、アセチル化修飾アペリンポリペプチドを含め、以下の表4に列挙する。ある特定の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、以下の表4に列挙するペプチドのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
本発明のいくつかの実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、アミノ酸配列:[z]X1X2[hArg][hArg]X3X4X5X6X7X8X9X10G[Oic][Nle]X11[4-Cl-F](配列番号720)を含み、配列中、zは、アセチルであり、X1は、oまたはOであり、X2は、fまたはFであり、X3は、Qまたは[BLeu]であり、X4は、[hArg]または[rhArg]であり、X5は、Pまたは[aMePro]であり、X6は、[hArg]または[rhArg]であり、X7は、[aMeLeu]、[rCha]、[BLeu]または[Cha]であり、X8は、[NhSerG]、[aMeS]、[rSer]、[DrSer]またはSであり、X9は、Hまたは[rHis]であり、X10は、K、[NLysG]、[rLys]または[aMeOrn]であり、X11は、Pまたは[aMePro]である。これら及び他の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、配列番号29~44から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドのバリアントを含む。本開示のアペリンポリペプチドのバリアントは、アペリンポリペプチド配列内のアミノ酸付加若しくは挿入、アミノ酸欠失、アミノ酸置換及び/またはアミノ酸残基の化学的誘導体化を行うことによって作製することができる。好ましいアミノ酸置換(保存的または非保存的であるかによらない)は、アペリンポリペプチドの効力を維持または増大させつつ、安定性を向上させるための本明細書に記載の指示に従って、当業者によって決定され得る。ある特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、生体系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。
保存的改変は、かかる改変が行われるペプチドと同様の機能的、物理的及び化学的特徴を有するペプチドをもたらすことができる。対照的に、ペプチドの機能的及び/または化学的特徴の大幅な改変は、(a)置換領域内の分子骨格の構造(例えば、α-ヘリックス構造)、(b)標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、または(c)分子の大きさを維持することに関する作用が顕著に異なるアミノ酸配列中での置換を選択することによって達成され得る。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどあるいは全く影響しないような非天然残基で天然アミノ酸残基を置換することを伴い得る。更に、ポリペプチド内の任意の天然残基をアラニンで置換することもでき、これは、「アラニンスキャニング変異導入法」として先に記載されている通りである(例えば、アラニンスキャニング変異導入法について論じている、MacLennan et al.,Acta Physiol.Scand.Suppl.,643:55-67,1998;Sasakiet al.,Adv.Biophys.35:1-24,1998を参照されたい)。
天然残基は、共通の側鎖特性に基づいて分類分けすることができる。
疎水性:ノルロイシン(NorまたはNle)、Met、Ala、Val、Leu、Ile
中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:His、Lys、Arg
鎖配向性に影響する残基:Gly、Pro、及び
芳香族:Trp、Tyr、Phe
疎水性:ノルロイシン(NorまたはNle)、Met、Ala、Val、Leu、Ile
中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:His、Lys、Arg
鎖配向性に影響する残基:Gly、Pro、及び
芳香族:Trp、Tyr、Phe
保存的アミノ酸置換は、これらの種類のうちの1つの種類の1つのメンバーを同じ種類の別のメンバーと交換することを伴い得る。非保存的置換は、これらの種類のうちの1つの種類の1つのメンバーを別の種類のメンバーと交換することを伴い得る。
このような変更を行う際、ある特定の実施形態によれば、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷の特徴に基づいて、疎水性親水性指標が割り当てられている。これらは、イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(-0.4)、トレオニン(-0.7)、セリン(-0.8)、トリプトファン(-0.9)、チロシン(-1.3)、プロリン(-1.6)、ヒスチジン(-3.2)、グルタミン酸(-3.5)、グルタミン(-3.5)、アスパラギン酸(-3.5)、アスパラギン(-3.5)、リシン(-3.9)、及びアルギニン(-4.5)である。
相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与することにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当該技術分野において認識されている(例えば、Kyteet al.,J.Mol.Biol.157:105-131、1982参照)。特定のアミノ酸を、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置き換えることができ、類似の生物活性が変わらず保持され得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更を行う際、ある特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある特定の実施形態では、±1以内である置換が含まれ、ある特定の実施形態では、±0.5以内である置換が含まれる。
類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができる。ある特定の実施形態において、隣接するアミノ酸の親水性によって決定される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性と相関している。
次の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン(+3.0)、リシン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、トレオニン(-0.4)、プロリン(-0.5±1)、アラニン(-0.5)、ヒスチジン(-0.5)、システイン(-1.0)、メチオニン(-1.3)、バリン(-1.5)、ロイシン(-1.8)、イソロイシン(-1.8)、チロシン(-2.3)、フェニルアラニン(-2.5)及びトリプトファン(-3.4)。類似の親水性値に基づいて変更を行う際、ある特定の実施形態では、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある特定の実施形態では、±1以内である置換が含まれ、ある特定の実施形態では、±0.5以内である置換が含まれる。
保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、ノルロイシン、アラニン若しくはメチオニンなどの1つの非極性(疎水性)アミノ酸残基の別の非極性残基への置換、アルギニン-リシン間、グルタミン-アスパラギン間、グリシン-セリン間などの1つの極性(親水性)アミノ酸残基の別の極性残基への置換、リシン、アルギニン若しくはヒスチジンなどの1つの塩基性アミノ酸残基の別の塩基性残基への置換、またはアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの1つの酸性残基の別の酸性残基への置換が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」という表現はまた、当該ポリペプチドが必須の生物活性を示すことを条件に、誘導体化されていない残基に代えて化学的に誘導体化された残基を使用することも含む。本明細書に開示する修飾アペリンポリペプチドのバリアントを作製するために用いることができる他の例示的なアミノ酸置換については、以下の表5に記載する。
本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドはまた、ポリペプチド配列内のアミノ酸を誘導体化することによって作製することもできる。「誘導体化」及び「誘導体」または「誘導体化された」という用語は、親分子の一部分が化学的に改変されるプロセス及び得られる化合物のそれぞれを意味するものと理解されたい。例には、(1)環状部分を有する化合物、例えば、化合物内での残基間の架橋、(2)架橋した化合物または架橋部位を有する化合物、例えば、化合物がシステイニル残基を有することにより架橋した二量体を形成すること、(3)1つまたは複数のペプチジル連結が非ペプチジル連結によって置き換えられること、(4)N末端が、アミノ基と反応することのできる試薬で修飾されること、(5)C末端がアミドまたはエステルによって置き換えられ得ること、(6)個別のアミノ酸部分が、選択した側鎖または末端残基と反応することのできる試薬を用いた処理により修飾されている化合物を挙げることができる。
種々の実施形態において、本明細書に記載する化合物のアペリンポリペプチド及び/またはビヒクル/担体部分は、誘導体化されてもよい。このような誘導体は、化合物の溶解度、吸収性、安定性、生物学的半減期などを改善し得る。誘導体部分は、あるいは、マスト細胞の脱顆粒の誘発などの化合物の任意の望ましくない作用を排除するか、または弱めることができる。本発明の修飾アペリンポリペプチドの作製に使用され、かつアペリンペプチドの安定性を向上させるために特に有用な種々の誘導体化手法について、図3に記載する。
「化学的誘導体」または「化学的に誘導体化された」はまた、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された1つまたは複数の残基を有する対象のペプチドを指す。このような誘導体化分子には、例えば、遊離アミノ基を誘導体化して、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチル及びエチルエステル若しくは他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成してもよい。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、O-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、N-im-ベンジルヒスチジンを形成してもよい。L-またはD-型にかかわらず、20種の標準アミノ酸の1つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも化学的誘導体に含まれる。例えば、プロリンの代わりに4-ヒドロキシプロリンを用いることができ、リシンの代わりに5-ヒドロキシリシンを用いることができ、ヒスチジンの代わりに3-メチルヒスチジンを用いることができ、セリンの代わりにホモセリンを用いることができ、リシンの代わりにオルニチンを用いることができる。
有用な誘導体化には、いくつかの実施形態において、ビヒクルまたは担体との結合がN末端の遊離アミノ基で起きることのないように、ペプチドのアミノ末端が化学的にブロックされたものが挙げられる。また、こうした改変には他の有益な効果、例えば、酵素的タンパク質分解に対するアペリンペプチド類似体の感受性の低減があり得る。N末端は、アシル化するか、置換アミンに改変するか、芳香族部分(例えば、インドール酸、ベンジル(BzlまたはBn)、ジベンジル(DiBzlまたはBn2)またはベンジルオキシカルボニル(CbzまたはZ))、N,N-ジメチルグリシンまたはクレアチンなどの別の官能基で誘導体化することができる。例えば、いくつかの実施形態において、限定するものではないが、ホルミル、アセチル(Ac)、プロパノイル、ブタニル、ヘプタニル、ヘキサノイル、オクタノイルまたはノナノイルなどのアシル部分をペプチドのN端末終端に共有結合させ、これにより、ビヒクルまたは担体のペプチドへの結合中の好ましくない副反応を防ぐことができる。他の例示的なN末端誘導体基には、-NRR1(-NH2以外)、-NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR1、スクシンイミドまたはベンジルオキシカルボニル-NH-(Cbz-NH-)が挙げられ、式中、R及びR1はそれぞれ独立して水素または低級アルキルであり、フェニル環は、C1~C4アルキル、C1~C4アルコキシ、クロロ及びブロモから選択される1~3個の置換基で置換されてもよい。
いくつかの実施形態において、アミノ酸残基間の1つまたは複数のペプチジル[-C(O)NR-]連結(結合)は、非ペプチジル連結で置き換え可能である。例示的な非ペプチジル連結は、-CH2-カルバメート[-CH2-OC(O)NR-]、ホスホネ-ト、-CH2-スルホンアミド[-CH2-S(O)2NR-]、尿素[-NHC(O)NH-]、-CH2-二級アミン及びアルキル化ペプチド[-C(O)NR6-(式中、R6は低級アルキルである)]である。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数の個別のアミノ酸残基が誘導体化され得る。選択した側鎖または末端残基を特異的に反応させる種々の誘導体化剤が知られており、以下に例として詳述する。
リシニル残基及びアミノ端末残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応し得、これにより、リシニル残基の電荷が逆転する。α-アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオン、及びグリオキシル酸とのアミノ基転移酵素触媒反応が挙げられる。
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンを含む、複数の従来の試薬のうちのいずれか1つまたは組み合わせとの反応により修飾することができる。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基のpKaが高いため、その反応をアルカリ条件で行う必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの各基及びアルギニンのε-アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特定の修飾については広範に研究されており、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基にスペクトル標識を導入することには特に関心が集まっている。最も一般的には、N-アセチルイミジゾール(acetylimidizole)及びテトラニトロメタンを用いて、O-アセチルチロシル種及び3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。
カルボキシル側鎖基(アスパルチルまたはグルタミル)は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R’-N=C=N-R’)との反応によって選択的に修飾することができる。更に、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換され得る。
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基に脱アミド化することができる。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内である。
システイニル残基は、アミノ酸残基または他の部分で置き換えて、ジスルフィド結合を除去するか、または反対に架橋を安定化することができる。例えば、Bhatnagar
et al.,J.Med.Chem.,39:3814-3819,1996を参照されたい。
et al.,J.Med.Chem.,39:3814-3819,1996を参照されたい。
二官能性物質による誘導体化は、ペプチドまたはその官能性誘導体を、非水溶性支持体マトリクスまたは所望により他の高分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般に使用される架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3’-ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性可能な中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性非水溶性マトリクスならびに反応性基質、例えば、米国特許第3,969,287号、同第3,691,016号、同第4,195,128号、同第4,247,642号、同第4,229,537号及び同第4,330,440号に記載されているものがタンパク質の固定化に用いられる。
他の可能な修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Cys中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化が挙げられる。Creighton,Proteins:Structure and Molecule Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,79-86,1983.
誘導体化の上記例は、網羅的に論じるものではなく、単なる例示であることが意図される。
本明細書にて開示するアペリンポリペプチドの作製には、組み換えDNA及び/若しくはRNAを介したタンパク質発現ならびにタンパク質工学技術またはペプチド調製の任意の他の方法を適用することができる。「組み換え」という用語は、物質(例えば、核酸またはポリペプチド)が人間の介入により人工的または合成的に(すなわち、非自然的に)改変されていることを意味すると理解される。改変は、その自然環境内若しくは自然状態にある物質に対して、またはその自然環境若しくは自然状態から取り出した物質に対して行うことができる。例えば、「組み換え核酸」は、例えば、クローニング、DNAシャッフリングまたは他のよく知られた分子生物学的手順中に、核酸を組み換えることによって作製されるものである。このような分子生物学的手順の例は、Maniatis et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1982中に認められる。「組み換えDNA分子」は、このような分子生物学的技術を用いて連結させたDNAのセグメントからなる。本明細書で使用する「組み換えタンパク質」または「組み換えポリペプチド」という用語は、組み換えDNA分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。「組み換え宿主細胞」は、組み換え核酸を含有及び/または発現する細胞である。
本発明のペプチドは、当業者に知られた方法に従って、形質転換した宿主細胞中で作製してもよい。簡潔に述べれば、ペプチドをコードする組み換えDNA分子または構築物を作製する。このようなDNA分子の作製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、好適な制限酵素を用いて、ペプチドをコードする配列をDNAから切り出すことができる。種々の実施形態の実施において、多数の利用可能かつ周知の宿主細胞のいずれかを用いることができる。特定の宿主の選択は、当該技術にて認識されている多数の要因に左右される。これらには、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、DNA分子がコードするペプチドの毒性、形質転換の割合、ペプチドの回収容易性、発現特性、生物学的安全性及び費用が挙げられる。これらの要因のバランスは、全ての宿主が特定のDNA配列の発現に等しく有効であるわけではないという理解の下で達成されるべきである。これらの一般的な指針内で、培養での有用な微生物宿主細胞には、細菌(大腸菌属など)、酵母菌(サッカロミセス属など)ならびに他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞(ヒトを含む)、例えば、CHO細胞及びHEK293細胞が挙げられる。改変はDNAレベルでも行うことができる。ペプチドをコードするDNA配列を、選択した宿主細胞により適合するコドンに変更してもよい。大腸菌については、最適化コドンが当該技術分野において知られている。制限部位を除去するか、またはサイレント制限部位を含むようにコドンを置換することができ、これにより、選択した宿主細胞中でのDNAプロセシングが促進し得る。次に、形質転換した宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、従来の発酵条件下で培養することができ、これにより、所望の化合物が発現される。このような発酵条件は、当該技術分野において知られている。更に、DNAは、任意に、融合タンパク質をコードする領域の5’側に、発現されるペプチド類似体に機能的に連結したシグナルペプチド配列(例えば、分泌シグナルペプチド)を更にコードする。二量体Fc融合タンパク質(「ペプチボディ」)またはキメラ免疫グロブリン(軽鎖+重鎖)-Fcヘテロ三量体(「ヘミボディ」)を含む、哺乳動物細胞による組成物の組み換え発現に有用な適切な組み換え法及び例示的なDNA構築物の更なる例については、例えば、Sullivan et al.,Toxin Peptide Therapeutic Agents(米国特許出願公開第2007/0071764号)及びSullivan et al.,Toxin Peptide Therapeutic Agents(WO2008/088422)を参照されたい(両出願は、その全体を参照により本明細書に援用する)。
本発明の修飾アペリンポリペプチドはまた、合成的方法によっても作製することができる。固相合成は、最も費用対効果の高い小ペプチド作製方法であることから、個々のペプチドを作製する技術として用いることができる。例えば、よく知られている固相合成法は、保護基、リンカー及び固相支持体の使用はもとより、特定の保護脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用及び固相ペプチド合成の他の側面を伴う。好適な技術は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Merrifield,Chem.Polypeptides,Katsoyannis and Panayotis
ed.,pp.335-361,1973;Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149,1963;Davis et al.,Biochem.Intl.10:394-414,1985;Stewart and Young、Solid Phase Peptide Synthesis,1969;米国特許第3,941,763号;Finn et al.,The Proteins,3rd ed.,2:105-253,1976;ならびにErickson et al.,The Proteins,3rd ed.,2:257-527,1976;“Protecting Groups in Organic Synthesis”,3rd ed.,T.W.Greene and P.G.M.Wuts Ed.,John Wiley&Sons,Inc.,1999;NovaBiochem Catalog,2000;“Synthetic Peptides,A User’s Guide”、G.A.Grant Ed.,W.H.Freeman&Company,New York,N.Y.,1992;“Advanced Chemtech Handbook
of Combinatorial&Solid Phase Organic Chemistry”、W.D.Bennet、J.W.Christensen、L.K.Hamaker、M.L.Peterson、M.R.Rhodes and H.H.Saneii Ed.,Advanced Chemtech,1998;“Principles of Peptide Synthesis”,2nd ed.,M.Bodanszky Ed.,Springer-Verlag,1993;“The Practice of Peptide Synthesis”,2nd ed.,M.Bodanszky and A.Bodanszky Ed.,Springer-Verlag,1994;“Protecting Groups”、P.J.Kocienski Ed.,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,Germany,1994;“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,A Practical Approach”、W.C.Chan and P.D.White Ed.,Oxford Press,2000;G.B.Fields et al.,Synthetic Peptides:A User’s Guide,77-183,1990を参照されたい。本発明のポリペプチド及び複合体の作製に適用できる、当該技術分野において知られている合成法及び精製法の更なる例については、例えば、Sullivanらの米国特許出願公開第2007/0071764号及びSullivan et al.,のWO2008/088422A2を参照されたい(両出願は、その全体を参照により本明細書に援用する)。
ed.,pp.335-361,1973;Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149,1963;Davis et al.,Biochem.Intl.10:394-414,1985;Stewart and Young、Solid Phase Peptide Synthesis,1969;米国特許第3,941,763号;Finn et al.,The Proteins,3rd ed.,2:105-253,1976;ならびにErickson et al.,The Proteins,3rd ed.,2:257-527,1976;“Protecting Groups in Organic Synthesis”,3rd ed.,T.W.Greene and P.G.M.Wuts Ed.,John Wiley&Sons,Inc.,1999;NovaBiochem Catalog,2000;“Synthetic Peptides,A User’s Guide”、G.A.Grant Ed.,W.H.Freeman&Company,New York,N.Y.,1992;“Advanced Chemtech Handbook
of Combinatorial&Solid Phase Organic Chemistry”、W.D.Bennet、J.W.Christensen、L.K.Hamaker、M.L.Peterson、M.R.Rhodes and H.H.Saneii Ed.,Advanced Chemtech,1998;“Principles of Peptide Synthesis”,2nd ed.,M.Bodanszky Ed.,Springer-Verlag,1993;“The Practice of Peptide Synthesis”,2nd ed.,M.Bodanszky and A.Bodanszky Ed.,Springer-Verlag,1994;“Protecting Groups”、P.J.Kocienski Ed.,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,Germany,1994;“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,A Practical Approach”、W.C.Chan and P.D.White Ed.,Oxford Press,2000;G.B.Fields et al.,Synthetic Peptides:A User’s Guide,77-183,1990を参照されたい。本発明のポリペプチド及び複合体の作製に適用できる、当該技術分野において知られている合成法及び精製法の更なる例については、例えば、Sullivanらの米国特許出願公開第2007/0071764号及びSullivan et al.,のWO2008/088422A2を参照されたい(両出願は、その全体を参照により本明細書に援用する)。
本発明の修飾アペリンポリペプチドは、1つまたは複数の半減期を延長する部分またはビヒクルに共有結合的に融合、接続、連結または複合体化され得る。「半減期を延長する部分」は、本明細書にて「ビヒクル」と区別なく使用され、非複合体形態のアペリンペプチドと比較して、タンパク質分解若しくは他の活性を低減させる化学修飾によるインビボ分解の阻止若しくは軽減、限定するものではないが腎クリアランス率若しくは肝クリアランス率の減少、吸収率の増加などのインビトロ半減期若しくはインビボ半減期若しくは他の薬物動態特性の向上、毒性の低減、免疫原性の低減、溶解度の改善、目的とする標的に対するアペリンペプチドの生物活性及び/若しくは標的選択性の向上、ならびに/または製造性の向上をもたらす分子を指す。半減期を延長する部分は、薬学的に許容されるものであり得る。
別のペプチド、ビヒクルまたは半減期を延長する部分に直接的にまたはリンカー部分を介して間接的に共有結合的に連結、接続または結合されたアペリンペプチドまたはポリペプチドを含む組成物は、化学的手段(例えば、翻訳後または合成後)または組み換え融合によって複合体化されるかに関わらず、「複合体」または「複合体化された」分子である。半減期を延長する部分またはその複数の部分へのアペリンポリペプチドの結合は、アペリンペプチドのN末端及び/またはC末端を介してもよいし、ペプチドの一次アミノ酸配列に対して挿入されたものであってもよい。ある特定の実施形態において、半減期を延長する部分は、修飾アペリンポリペプチドのN末端に結合される。
半減期を延長する部分またはビヒクルは、得られるペプチド複合体が、インビボでの腎臓濾過によるクリアランスを妨げるのに十分な流体力学的大きさを得るように選択され得る。例えば、半減期を延長する部分には、実質的に直鎖状、分岐鎖状(br)、または樹枝状の形態である高分子が選択され得る。あるいは、半減期を延長する部分は、得られるペプチド複合体がインビボで血清タンパク質に結合して複合体を形成し、このようして形成された複合体が実質的な腎クリアランスを回避するように選択され得る。半減期を延長する部分またはビヒクルは、例えば、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG))、脂質、コレステロール基(ステロイドなど)、炭水化物若しくはオリゴ糖(例えば、デキストラン)、任意の天然若しくは合成タンパク質(例えば、抗体またはFcドメイン)またはサルベージ受容体に結合する任意のポリペプチド若しくはペプチドであってよい。
使用することができる本発明による例示的な半減期を延長する部分には、免疫グロブリン、免疫グロブリンFcドメイン若しくはその一部分または生物学的に適したポリマー若しくはコポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)若しくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール化合物が挙げられる。他の適切なポリアルキレングリコール化合物には、次の種類の荷電性または中性ポリマー:デキストラン、ポリリシン、コロミン酸または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー及びビオチン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン(軽鎖及び重鎖を含む)またはその一部分を、半減期を延長する部分として使用することができ、好ましくは、ヒト由来の免疫グロブリンであり、限定するものではないが、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4などの免疫グロブリンのうちのいずれかが挙げられる。
本発明による半減期を延長する部分またはビヒクルの他の例には、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(例えば、ポリリシンまたはポリオルニチン)、デキストランn-ビニルピロリドン、ポリn-ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、線状若しくは分枝状のグリコシル化鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基またはポリシアル酸(例えば、PolyXen(商標)技術;Gregoriadis et al.,Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins:a role for polysialic acids,Intl.J.Pharmaceutics,300:125-130,2005(その全体を参照により本明細書に援用する))が挙げられる。
他の実施形態において、半減期を延長する部分は、アペリンペプチドのN末端に共有結合的に連結されたアニオン荷電性化学的実体である。アニオン荷電性化学的実体には、限定するものではないが、ホスホチロシン、ホスホセリン、p-ホスホノ(ジフルオロ-メチル)-フェニルアラニン(Pfp)、p-ホスホノ-メチル-フェニルアラニン(Pmp)、p-ホスファチジル-フェニルアラニン(Ppa)またはp-ホスホノ-メチルケト-フェニルアラニン(Pkp)が挙げられ、所望によりAEEAリンカーまたは本明細書に記載の他のリンカーを介して間接的に、アペリンペプチドのN末端に共有結合的に連結され得る。WO2006/042151A2;Beeton et al.,"Tar
geting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases”,Molec.Pharmacol.67(4):1369-1381,2005;Pennington et al.,“Engineering a stable and
selective peptide blocker of the Kv1.3 channel in T lymphocytes”,Molecular Pharmacology Fast Forward、2009年1月2日公開、doi:10.1124/mol.108.052704を参照されたい(これらの全体を参照により本明細書に援用する)。
geting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases”,Molec.Pharmacol.67(4):1369-1381,2005;Pennington et al.,“Engineering a stable and
selective peptide blocker of the Kv1.3 channel in T lymphocytes”,Molecular Pharmacology Fast Forward、2009年1月2日公開、doi:10.1124/mol.108.052704を参照されたい(これらの全体を参照により本明細書に援用する)。
本発明による半減期を延長する部分の他の実施形態には、生理学的条件の温度、pH及びイオン強度下で、半減期の長い血清タンパク質に対する結合親和性を有する、ペプチドリガンドまたは小(有機)分子リガンドが挙げられる。例には、アルブミン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、チロキシン結合グロブリン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、抗体結合ペプチド若しくは小分子リガンド、または血清アルブミンなどの半減期の長い血清タンパク質に対する親和性を有する別のペプチド若しくは小分子が挙げられる。例えば、Kratz,“Albumin as a drug carrier:Design of prodrugs,drug conjugates and nanoparticles”,J.Controlled Release,132:171-183,2008;Dennis et al.,“Albumin binding as a general strategy fopr improving the pharmacokinetics of proteins”,J.Biol.Chem.277(38):35035-35043,2002;Knudsen et al.,“Potent derivative of glucagon-like Peptide-1 with pharmacokinetic properties suitable for once daily administration”,J.Med.Chem.43:1664-1669,2000;Kurtzhalsら、“Albumin binding of insulins acylated with fatty acids:characterization of the ligand-protein
interaction and correlation between binding affinity and timing of the insulin effect in vivo”,Biochem.J.312:725-731,1995;Kenyon et al.,“13C NMR Studies of the binding of medium-chain fatty acids to human serum albumin”,J.Lipid Res.35:458-467,1994;Blaneyら、“Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands”(米国特許第5,714,142号);Sato et al.,“Serum albumin binding moieties”(米国特許出願公開第2003/0069395A1号)及び米国特許第6,342,225号を参照されたい。ヒト血清アルブミンに結合することができる例示的な小分子リガンドには、pIFBu((S)-2-(4-(4-ヨードフェニル)ブタンアミド)ペンタン二酸)及びDOTA(2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトライル)四酢酸)が挙げられるが、これらに限定されない。配列番号118({pIFBu}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QRP[NMeArg]LSHKGP[Nle]P[4-Cl-F]{COOH})のポリペプチドの場合のように、このようなリガンドを本発明の修飾アペリンポリペプチドに接続して、血清半減期を向上させることができる。
interaction and correlation between binding affinity and timing of the insulin effect in vivo”,Biochem.J.312:725-731,1995;Kenyon et al.,“13C NMR Studies of the binding of medium-chain fatty acids to human serum albumin”,J.Lipid Res.35:458-467,1994;Blaneyら、“Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands”(米国特許第5,714,142号);Sato et al.,“Serum albumin binding moieties”(米国特許出願公開第2003/0069395A1号)及び米国特許第6,342,225号を参照されたい。ヒト血清アルブミンに結合することができる例示的な小分子リガンドには、pIFBu((S)-2-(4-(4-ヨードフェニル)ブタンアミド)ペンタン二酸)及びDOTA(2,2’,2’’,2’’’-(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトライル)四酢酸)が挙げられるが、これらに限定されない。配列番号118({pIFBu}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QRP[NMeArg]LSHKGP[Nle]P[4-Cl-F]{COOH})のポリペプチドの場合のように、このようなリガンドを本発明の修飾アペリンポリペプチドに接続して、血清半減期を向上させることができる。
「半減期の長い血清タンパク質」は、哺乳動物の血漿中に溶解している何百もの異なるタンパク質の1つであり、いわゆる「担体タンパク質」(アルブミン、トランスフェリン及びハプトグロビンなど)、フィブリノゲン及び他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンギオテンシン及びブラジキニンなどの物質の前駆体ならびに多くの他の種類のタンパク質が挙げられる。本発明は、限定するものではないが本明細書に記載するものなどの薬学的に許容される半減期延長部分のいずれかの単一種の使用、またはPEG及び免疫グロブリンFcドメイン若しくはFcのCH2ドメインなどのその一部分(例えば、Feige et al.,“Modified peptidess as therapeutic agents”(米国特許第6,660,843号)参照)、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA);例えば、Ehrlich et al.,“Preparation and characterization of albumin conjugates of a truncated Peptide YYY analogue for half-life extension”,Bioconjugate Chem.,24(12):2015-2024,2013、米国特許第6,926,898号、米国特許出願公開第2005/0054051号、米国特許第6,887,470号参照)、トランスサイレチン(TTR;例えば、米国特許出願公開第2003/0195154A1号及び第2003/0191056A1号参照)若しくはチロキシン結合グロブリン(TBG)若しくは例えば、WO2008/088422(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている、免疫グロブリン(軽鎖+重鎖)とFcドメインの組み合わせ(ヘテロ三量体、いわゆる「ヘミボディ」)などの2つ以上の異なる半減期延長部分の組み合わせの使用を包含する。
修飾アペリンポリペプチドの半減期を延長することは、「安定性」の向上でもあり得る。安定性の向上はまた、アペリンポリペプチドのクリアランスの低減、またはアペリンポリペプチド若しくは非修飾アペリンポリペプチドと比較して代謝分解速度を低減させる修飾若しくは修飾の組み合わせを有するアペリンポリペプチドの全体的な曝露の増加を意味するものと理解され得る。安定性が向上すると、血漿及び組織ホモジネートなどのインビトロの生物学的マトリクス中におけるアペリンポリペプチドの半減期が延長し得、インビボでの血漿滞留時間が延長し得る。インビボ血漿滞留時間は、動物に投与されるインタクトなペプチド薬物実体の循環半減期を意味するものと理解されたい。インビトロ血漿滞留時間は、生物学的媒体中に添加された後のインタクトなペプチド薬物実体の半減期を意味するものと理解されたい。
アペリンポリペプチドの修飾はまた、当該分子の「効力」の増大、例えば、分子の薬物動態的または薬力学的特性の改善につながり得る。効力の増大はまた、非修飾アペリンポリペプチドと比較して代謝分解速度を低減させる修飾または修飾の組み合わせを有するアペリンポリペプチドを意味するものと理解され得る。安定性が向上すると、血漿及び組織ホモジネートなどのインビトロの生物学的マトリクス中におけるアペリンポリペプチドの半減期が延長し得、インビボでの血漿滞留時間が延長し得る。効力の増大は、更に、APJ受容体に対する修飾アペリンポリペプチドの親和性及び/または有効性の向上を意味するものと理解され得る。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の1つまたは複数の修飾アペリンポリペプチドは、ポリペプチドのN末端、C末端、主鎖または側鎖を介し、種々の構造の化学修飾によって、半減期延長部分またはビヒクルに結合または接続される。したがって、一実施形態において、ビヒクル-ペプチド複合体は、次式Iによって記載することができ、
式中、
V1は、ビヒクル(例えば、PEG、脂質または他の半減期延長部分)であり、
A1、A2、A3及びA4は、-(L1)e-P1、-(L1)e-P1-(L2)f-P2、-(L1)e-P1-(L2)f-P2-(L3)g-P3、-(L1)e-P1-(L2)f-P2-(L3)g-P3-(L4)h-P4及びこれらの高次多量体からそれぞれ独立して選択され、
P1、P2、P3及びP4は、それぞれ独立してアペリンポリペプチドの配列であり、脂質及び/若しくはAeea及び/若しくはγ-グルタミン酸ならびに/または結合リンカーの一部を含む別の部分を伴わない本出願に記載のアペリンペプチドのいずれかであってよく、例えば、配列番号121~647のアミノ酸配列を有するアペリンペプチドであり、
L1、L2、L3及びL4は、それぞれ独立してリンカーであり、
a、b、c、d、e、f、g及びhは、それぞれ独立して0または1であり、但し、a、b及びcのうちの少なくとも1つは1である。
V1は、ビヒクル(例えば、PEG、脂質または他の半減期延長部分)であり、
A1、A2、A3及びA4は、-(L1)e-P1、-(L1)e-P1-(L2)f-P2、-(L1)e-P1-(L2)f-P2-(L3)g-P3、-(L1)e-P1-(L2)f-P2-(L3)g-P3-(L4)h-P4及びこれらの高次多量体からそれぞれ独立して選択され、
P1、P2、P3及びP4は、それぞれ独立してアペリンポリペプチドの配列であり、脂質及び/若しくはAeea及び/若しくはγ-グルタミン酸ならびに/または結合リンカーの一部を含む別の部分を伴わない本出願に記載のアペリンペプチドのいずれかであってよく、例えば、配列番号121~647のアミノ酸配列を有するアペリンペプチドであり、
L1、L2、L3及びL4は、それぞれ独立してリンカーであり、
a、b、c、d、e、f、g及びhは、それぞれ独立して0または1であり、但し、a、b及びcのうちの少なくとも1つは1である。
別の実施形態において、ビヒクル-ペプチド複合体は、次式II:
V1-A1
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA1のN末端で接続されている。
V1-A1
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA1のN末端で接続されている。
別の実施形態において、ビヒクル-ペプチド複合体は、次式III:
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA2の主鎖または側鎖で接続されている。
別の実施形態において、ビヒクル-ペプチド複合体は、次式IV:
A3-V1
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA3のC末端で接続されている。
A3-V1
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA3のC末端で接続されている。
別の実施形態において、ビヒクル-ペプチド複合体は、次式V:
A2-V1-A1
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA1及びA2の任意の位置で接続されている。
A2-V1-A1
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA1及びA2の任意の位置で接続されている。
別の実施形態において、ビヒクル-ペプチド複合体は、次式VI:
及びその多量体によって記載され、式中、V1はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA1、A2、A3またはA4の任意の位置で接続されている。
別の実施形態において、ビヒクル-ペプチド複合体は、次式VII:
及びその多量体によって記載され、式中、V1及びV2はPEG、脂質または他の半減期延長部分であり、かつリンカーによりまたはリンカーなしでA1の任意の位置で接続されている。
ある特定の実施形態において、γ-グルタミン酸を本発明の修飾アペリンポリペプチドに挿入することができる。γ-グルタミン酸は、脂質部分(例えば、脂肪酸)と修飾アペリンポリペプチドの間に挿入され得る。γ-グルタミン酸に加えて、本明細書にて更に詳述する結合リンカーの構成要素として、任意の他の部分が存在してもよい。結合リンカーの構成要素は、特定的、機能的及び/または構造的役割を果たす、極性、非極性、疎水性、脂肪族または芳香族部分であってよい。
ある特定の実施形態において、半減期延長部分またはビヒクルは、脂質である。したがって、本明細書にて開示する修飾アペリンポリペプチドのいずれかは、所望により結合リンカーを介して、脂肪酸などの脂質部分に結合することができる。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、C1~C25飽和または不飽和脂肪酸である。半減期延長部分として使用でき、所望により結合リンカーを介して本発明の修飾アペリンポリペプチドに接続することができる例示的な脂肪酸については、以下の表6に列挙する。
いくつかの実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドに結合される脂肪酸または脂肪族アシル基は、ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、オクタデカンジオイル、オクタンジオイル、デカンジオイル、ドデカンジオイル、ヘキサンジオイル、ブタンジオイル、テトラデカンジオイルまたはヘキサデカンジオイルから選択される。他の実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドに結合される脂肪酸または脂肪族アシル基は、オクタデカンジオイル、ヘプタデカノイル、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルから選択される。ある特定の実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドに結合される脂肪酸または脂肪族アシル基は、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルから選択される。ある特定の他の実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドに結合される脂肪酸または脂肪族アシル基は、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイルまたはオクタデカンジオイルから選択される。
本発明の一実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は、次式:
X1X2X3X4(配列番号721)によって記載することができ、
式中、
X1は、脂肪族アシル基であり、
X2は、γGluであるか、または不在であり、
X3は、PEG基であるか、または不在であり、
X4は、アペリンポリペプチドである。
X1X2X3X4(配列番号721)によって記載することができ、
式中、
X1は、脂肪族アシル基であり、
X2は、γGluであるか、または不在であり、
X3は、PEG基であるか、または不在であり、
X4は、アペリンポリペプチドである。
上記式のアペリンペプチド中のアミノ酸残基は、L-若しくはD-アミノ酸、α-若しくはβ-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のL-若しくはD-若しくはα-若しくはβ-型であってよい。上記式中のアペリンポリペプチドは、本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドのいずれであってもよい。一実施形態において、PEG基は、1つまたは複数のAEEA([2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-酢酸)基である。関連する実施形態において、X2はγGlu(本明細書中、AC4Abuともいう)であり、X3はAEEAまたはAEEA-AEEAである。
本発明の別の実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は、次式:{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3P[Cha]SHKG[Oic][Nle]X4X5(配列番号722)によって記載することができ、式中、X1は[hArg]であるか、または不在であり、X2はQまたは[q]であり、X3は[hArg]または[r]であり、X4はPまたは[Pip]であり、X5は[4-Cl-F]または[D-4ClF]である。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号237、239または242の配列を含み得る。
本発明の更に別の実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は、次式:
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5SHKG[Oic][Nle]X6X7(配列番号723)によって記載することができ、式中、X1は[hArg]であるか、または不在であり、X2はQまたは[q]であり、X3はrまたは[hArg]であり、X4はrまたは[NMeArg]であり、X5は[NMeLeu]または[Cha]であり、X6は[Pip]またはPであり、X7は[4-CL-F]、[f]、[D-4ClF]または[Tic]である。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号234~243のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5SHKG[Oic][Nle]X6X7(配列番号723)によって記載することができ、式中、X1は[hArg]であるか、または不在であり、X2はQまたは[q]であり、X3はrまたは[hArg]であり、X4はrまたは[NMeArg]であり、X5は[NMeLeu]または[Cha]であり、X6は[Pip]またはPであり、X7は[4-CL-F]、[f]、[D-4ClF]または[Tic]である。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号234~243のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
本発明のいくつかの実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は次式:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3X4X5X6X7X8KG[Oic]X9X10X11(配列番号724)によって記載することができ、
式中、X1は[hArg]、[r]であるか、または不在であり、X2はQ、[q]、[BLeu]または[NMeGln]であり、X3は[hArg]または[r]であり、X4はP、[Pip]、[Oic]または[Sar]であり、X5は[NMeArg]、[r]または[hArg]であり、X6は[Cha]、[NMeLeu]、[BLeu]または[NMeCha]であり、X7はS、[BhSer]、[bAla]、[NhSerG]または[aMeS]であり、X8はH、A、Y、[Tle]、[Deg]、LまたはVであり、X9は[Nle]または[pl-Phe]であり、X10はP、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、X11は[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[D-Bip]であるか、または不在である。ある特定の実施形態において、X10は、[D-Tic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4F]、[D-Ogl]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]、[Tic]、[Aib]または[Deg]である。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号121~210及び245~256のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3X4X5X6X7X8KG[Oic]X9X10X11(配列番号724)によって記載することができ、
式中、X1は[hArg]、[r]であるか、または不在であり、X2はQ、[q]、[BLeu]または[NMeGln]であり、X3は[hArg]または[r]であり、X4はP、[Pip]、[Oic]または[Sar]であり、X5は[NMeArg]、[r]または[hArg]であり、X6は[Cha]、[NMeLeu]、[BLeu]または[NMeCha]であり、X7はS、[BhSer]、[bAla]、[NhSerG]または[aMeS]であり、X8はH、A、Y、[Tle]、[Deg]、LまたはVであり、X9は[Nle]または[pl-Phe]であり、X10はP、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、X11は[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[D-Bip]であるか、または不在である。ある特定の実施形態において、X10は、[D-Tic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4F]、[D-Ogl]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]、[Tic]、[Aib]または[Deg]である。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号121~210及び245~256のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
本発明の別の実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は、次式:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X2X3(配列番号725)によって記載することができ、式中、X1は[hArg]であるか、または不在であり、X2はP、D-アミノ酸または非標準アミノ酸であり、X3はD-アミノ酸、非標準アミノ酸または-COOHである。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号121~152のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X2X3(配列番号725)によって記載することができ、式中、X1は[hArg]であるか、または不在であり、X2はP、D-アミノ酸または非標準アミノ酸であり、X3はD-アミノ酸、非標準アミノ酸または-COOHである。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号121~152のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
本発明の更に別の実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は、次式:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X1COOH(配列番号726)によって記載することができ、式中、X1はD-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型である。いくつかの実施形態において、X1は、[D-Tic]、[4-CL-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4lF]、[D-IgL]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]または[Tic]である。ある特定の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号166、171及び245~256のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X1COOH(配列番号726)によって記載することができ、式中、X1はD-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型である。いくつかの実施形態において、X1は、[D-Tic]、[4-CL-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4lF]、[D-IgL]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]または[Tic]である。ある特定の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号166、171及び245~256のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
本発明の一実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は、次式:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QX1PX2X3SHKG[Oic]X4X5X6(配列番号727)によって記載することができ、式中、
X1はR、rまたは[hArg]であり、X2はr、[hArg]または[NMeArg]であり、X3は[NMeLeu]または[Cha]であり、X4は[pl-Phe]または[Nle]であり、X5はPまたは[D-1Nal]であり、X6は[D-Bip]、[4-CL-F]、[D-4ClF]であるか、または不在である。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号165及び211~233のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QX1PX2X3SHKG[Oic]X4X5X6(配列番号727)によって記載することができ、式中、
X1はR、rまたは[hArg]であり、X2はr、[hArg]または[NMeArg]であり、X3は[NMeLeu]または[Cha]であり、X4は[pl-Phe]または[Nle]であり、X5はPまたは[D-1Nal]であり、X6は[D-Bip]、[4-CL-F]、[D-4ClF]であるか、または不在である。これら及び他の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号165及び211~233のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
本発明の更に別の実施形態において、脂質-アペリンペプチド複合体は、次式:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5X6X7KG[Oic]X8X9X10(配列番号728)によって記載することができ、
式中、X1は[hArg]または[r]であり、X2はQまたは[q]であり、X3はrまたは[hArg]であり、X4はrまたは[NMeArg]であり、X5は[NMeLeu]、[BLeu]または[Cha]であり、X6はSまたは[bAla]であり、X7はH、Aまたは[Tle]であり、X8は[Nle]または[pl-Phe]であり、X9はP、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、X10は[Oic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[D-1Nal]、[D-Bip]であるか、または不在である。いくつかの実施形態において、X9は[D-Tic]、[4-Cl-F] [D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X10は不在である。ある特定の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号153~155、166、171、173~175、180、199、201、208及び245~256のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5X6X7KG[Oic]X8X9X10(配列番号728)によって記載することができ、
式中、X1は[hArg]または[r]であり、X2はQまたは[q]であり、X3はrまたは[hArg]であり、X4はrまたは[NMeArg]であり、X5は[NMeLeu]、[BLeu]または[Cha]であり、X6はSまたは[bAla]であり、X7はH、Aまたは[Tle]であり、X8は[Nle]または[pl-Phe]であり、X9はP、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、X10は[Oic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[D-1Nal]、[D-Bip]であるか、または不在である。いくつかの実施形態において、X9は[D-Tic]、[4-Cl-F] [D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X10は不在である。ある特定の実施形態において、脂質-ペプチド複合体は、配列番号153~155、166、171、173~175、180、199、201、208及び245~256のうちのいずれか1つの配列を含み得る。
表7に列挙する特定のペプチド複合体中の脂肪族アシル基うちのいずれかは、表6に列挙したものなどの別の脂肪族アシル基で置換され得る。例として、上で列挙した特定のペプチドのいずれか中のTDA脂肪族アシル基をHDA、ODDAまたは別の脂肪族アシル基で置き換えることができる。いくつかの実施形態において、上で列挙したペプチド-複合体中の長い炭素鎖を有する脂肪族アシル基の代わりに、より短い炭素鎖を有する脂肪族アシル基を用いることができる。例えば、パルミトイル、TDA、HDAまたはODDA脂肪族アシル基の代わりにブタノイル基またはヘキサノイル基を用いてもよい。他の実施形態において、表7に列挙する特定のペプチド複合体中の脂肪族アシル基を、本明細書に記載する別の半減期を延長する部分(例えば、PEGまたは免疫グロブリンFc)に置き換えてもよい。代替的な実施形態において、複合体のアペリンペプチド部分のうちのいずれかは、非複合体化形態のAPJアゴニストとして使用してもよい。
ある特定の実施形態において、半減期延長部分またはビヒクルはポリマーである。したがって、本明細書にて開示する修飾アペリンポリペプチドのいずれかは、所望により結合リンカーを介して、ポリマー、特に水溶性ポリマーに接続することができる。いくつかの実施形態において、ポリマー半減期を延長する部分は、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーであり、所望により結合リンカーを介して、アペリンポリペプチドのN末端、C末端または1つ以上の介在する側鎖で共有結合的に連結されている。いくつかの実施形態において、ペプチド複合体は、PEGではない半減期を延長する部分若しくはアペリンポリペプチドまたはこれらのいずれかの任意の組み合わせに結合された、1つまたは複数のPEG部分を含み得る。例えば、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンFcドメインまたはこれらの一部分は、共有結合的複合体化のプロセスによって、モノPEG化、ジPEG化またはあるいはマルチPEG化することができ、アペリンポリペプチドは、1つまたは複数のPEG部分によって免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFcドメインに結合され得る。
タンパク質及びペプチドのPEGとの共有結合的複合体化は、インビボ循環半減期を著しく延ばすことができる。PEG化は、そのPEG部分が分子に大幅な流体力学半径を付与することから、主に腎クリアランスを遅らせることによって、この効果を達成すると考えられている(Zalipsky et al.,“Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides,in poly(ethylene glycol)chemistry:Biotechnical and biomedical applications”、J.M.Harris Ed.,Plenum Press:New York,347-370,1992参照)。タンパク質及びペプチドのPEG化によって多くの場合に付与される更なる利点には、溶解度の増加、タンパク質分解への耐性及び治療用ポリペプチドの免疫原性の低減が挙げられる。タンパク質PEG化の利点は、PEG-アデノシンデアミナーゼ(Adagen(商標)/Enzon
Corp.)、PEG-L-アスパラギナーゼ(Oncaspar(商標)/Enzon Corp.)、PEG-インターフェロンα-2b(PEG-Intron(商標)/Schering/Enzon)、PEG-インターフェロンα-2a(PEGASYS(商標)/Roche)及びPEG-G-CSF(Neulasta(商標)/Amgen)ならびに臨床試験中の多くの他のものを含む、いくつかのPEG化タンパク質の商品化から明らかである。
Corp.)、PEG-L-アスパラギナーゼ(Oncaspar(商標)/Enzon Corp.)、PEG-インターフェロンα-2b(PEG-Intron(商標)/Schering/Enzon)、PEG-インターフェロンα-2a(PEGASYS(商標)/Roche)及びPEG-G-CSF(Neulasta(商標)/Amgen)ならびに臨床試験中の多くの他のものを含む、いくつかのPEG化タンパク質の商品化から明らかである。
「PEG化ペプチド」、「PEG化ポリペプチド」または「PEG化タンパク質」とは、ペプチド自体のアミノ酸残基に共有結合したポリエチレングリコール(PEG)部分、または直接的若しくは別のリンカー部分を介して間接的にペプチドの残基に共有結合したペプチジル若しくは非ペプチジルリンカーに共有結合したポリエチレングリコール(PEG)部分を有するペプチドを意味する。非限定的な例は、3-(1-(1-ブロモ-2-オキソ-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-ウンデカオキサ-3-アザオクタトリアコンタン-38-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)プロパノイル(本明細書では「{ブロモアセトアミド-PEG11-トリアゾール}-」の略記で表す)とペプチドのN末端結合である。
「ポリエチレングリコール」または「PEG」とは、カップリング部分または活性化部分(例えば、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジド、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン(azirdine)、オキシラン、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドまたはマレイミド部分)とのカップリング剤若しくは誘導体化を用いた、または用いないポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。種々の実施形態によれば、有用なPEGには、実質的に線状の直鎖PEG、分枝鎖PEG(brPEG)または樹枝状のPEGが挙げられる。例えば、米国特許第5,171,264号、同第5,932,462号、同第6,602,498号を参照されたい。
簡潔に述べれば、PEG基は、一般に、PEG部分上の反応性基(例えば、アルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基)を介した化合物上の反応性基(例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基)へのアシル化またはアルキル化(または還元的アミノ化)により組成物のペプチド部分に接続することができる。合成ペプチドをPEG化するのに有用な手法は、各々が他方に対して相互に反応性である特定の官能性を持つペプチドとPEG部分とを、溶液中で複合体連結を形成することによって合わせることからなる。ペプチドは、従来の固相合成により容易に作製することができる。ペプチドは、特定の部位で、適切な官能基で「予め活性化」され得る。この前駆体は、PEG部分と反応させる前に、精製し、十分に特性評価を行う。ペプチドとPEGとの連結は、通常、水相中で生じ、逆相HPLC分析によって容易に観察することができる。PEG化ペプチドは、容易に、分取HPLCによって精製し、HPLC分析、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析によって特性評価を行うことができる。
PEGは、市販されているか、または当該技術分野においてよく知られた方法に従ったエチレングリコールの開環重合(Sandler and Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,3:138-161)によって調製することができる、周知の水溶性ポリマーである。本出願において、「PEG」という用語は、大きさまたはPEGの終端における修飾に関係なく、単官能、二官能または多官能性の形態である、あらゆるポリエチレングリコール分子を包含するように広範に使用され、次式で表すことができる。
X-O(CH2CH2O)n-R
式中、nは3~2300であり、XはHまたは端末修飾、例えば、メチルまたはC1~4アルキルであり、Rは共有結合に使用される反応性部分である。
X-O(CH2CH2O)n-R
式中、nは3~2300であり、XはHまたは端末修飾、例えば、メチルまたはC1~4アルキルであり、Rは共有結合に使用される反応性部分である。
いくつかの実施形態において、1つの終端がヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、XがHまたはCH3(「メトキシPEG」)である、PEGを使用することができる。上記式に示すPEGのRで終結するもう一方の終端は、エーテル酸素結合、アミン連結またはアミド連結により、活性化部分に共有結合されることに注意されたい。化学構造中で使用される場合、「PEG」という用語は、示されたヒドロキシル基の水素を有さず、リンカーの遊離炭素原子と反応してエーテル結合を形成できる酸素を残した上記式を含む。より具体的には、PEGをペプチドに結合させるためには、ペプチドを「活性化した」形態のPEGと反応させる必要がある。活性化PEGは、次式によって表すことができ、
(PEG)-(A)
式中、PEG(上で定義したもの)は、活性化部分(A)の炭素原子に共有結合的に接続してエーテル結合、アミン連結またはアミド連結を形成し、(A)は、ペプチドのアミノ酸残基上またはアペリンペプチドに共有結合したリンカー部分上のアミノ、アジド、アルキン、イミノ、マレイミド、N-スクシンイミジル、カルボキシル、アミノオキシ、セレノまたはチオール基と反応することができる反応性基を含む。
(PEG)-(A)
式中、PEG(上で定義したもの)は、活性化部分(A)の炭素原子に共有結合的に接続してエーテル結合、アミン連結またはアミド連結を形成し、(A)は、ペプチドのアミノ酸残基上またはアペリンペプチドに共有結合したリンカー部分上のアミノ、アジド、アルキン、イミノ、マレイミド、N-スクシンイミジル、カルボキシル、アミノオキシ、セレノまたはチオール基と反応することができる反応性基を含む。
Aeaa([2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-酢酸)は、アペリンペプチドの安定性を向上させるために使用することができ、またはアペリンポリペプチドの結合リンカーの空間的、機能的及び/または構造的役割を果たし得る、別のPEGである。Aeeaの構造を以下に示す。
活性化PEGの調製技術及び生物学的に活性なペプチドとの複合体化技術は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第5,643,575号、同第5,919,455号、同第5,932,462号及び同第5,990,237号、同第5,985,265号及び同第5,824,784号;Thompson et al.,“PEGylation of polypeptides”(EP 0575545B1);Petit,“Site specific protein modification”(米国特許第6,451,986号及び同第6,548,644号);S.Herman et al.,“Poly(ethylene glycol)with reactive endgroups:I.Modification of proteins”,J.Bioactive Compatible Polymers,10:145-187,1995;Y.Lu et al.,“PEGylated peptides III:Solid-phase synthesis with PEGylating reagents of varying molecular weight:synthesis of multiply PEGylated peptides”,Reactive Polymers,22:221-229,1994;A.M.Felix et al.,“PEGylated Peptides IV:Enhanced biological activity of site-directed PEGylated GRF analogs”,Int.J.Peptide Protein Res.,46:253-264,1995;A.M.Felix,“Site-specific poly(ethylene glycol)ylation of peptides”,ACS Symposium Series 680(poly(ethylene glycol)),218-238,1997;Y.Ikeda et al.,“Polyethylene glycol derivatives,their modified peptides,methods for producing them and use of the modified peptides”(EP0473084B1);G.E.Means et
al.,“Selected techniques for the modification of protein side chains,in:Chemical modification of proteins”,Holden Day,Inc.,pp.219,1971)を参照されたい。
al.,“Selected techniques for the modification of protein side chains,in:Chemical modification of proteins”,Holden Day,Inc.,pp.219,1971)を参照されたい。
PEG-アルデヒドまたはPEG-アルデヒド水和物などの活性化PEGは、既知の手段によって化学的に合成することができ、または民間供給元、例えば、Shearwater Polymers(Huntsville,Al)若しくはEnzon,Inc.(Piscataway,N.J.)から入手できる。
有用な活性化PEGの一例は、Shearwater Polymers(Huntsville,Al)から市販されているPEG-プロピオンアルデヒドなどのPEG-アルデヒド化合物(例えば、メトキシPEG-アルデヒド)であり得る。PEG-プロピオンアルデヒドは、式PEG-CH2CH2CHOによって表される。例えば、米国特許第5,252,714号を参照されたい。また、PEGアルデヒド水和物、例えば、PEGアセトアルデヒド水和物及びPEGビスアルデヒド水和物も「PEGアルデヒド化合物」の意味に含まれ、後者は、二官能性活性化構造を生じる。例えば、Bentley et
al.,“Poly(ethylene glycol)aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines”(米国特許第5,990,237号)を参照されたい。活性化多分岐PEGアルデヒド化合物、例えば、二価、三価、四価、八価の構造体を与える複数の腕を含むPEG誘導体を使用することができる。4腕のPEG誘導体を用いて、4つのアペリンポリペプチドを各PEG分子に接続することができる。例えば、PEGの1、2、3または4つのアミノ官能化部位で、アペリンポリペプチドをポリエチレングリコール(PEG)に結合することができる。
al.,“Poly(ethylene glycol)aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines”(米国特許第5,990,237号)を参照されたい。活性化多分岐PEGアルデヒド化合物、例えば、二価、三価、四価、八価の構造体を与える複数の腕を含むPEG誘導体を使用することができる。4腕のPEG誘導体を用いて、4つのアペリンポリペプチドを各PEG分子に接続することができる。例えば、PEGの1、2、3または4つのアミノ官能化部位で、アペリンポリペプチドをポリエチレングリコール(PEG)に結合することができる。
本明細書に記載するポリエチレングリコール(PEG)は、複合体化される際、ペプチド中に存在するチオールのアルキル化によって共有結合されるか、またはPEG及びペプチド中に存在するアジド部分とアルキン部分との間の環化付加反応によって共有結合される。あるいは、PEGは、還元的アミノ化によって、直接、アペリンポリペプチド自体のアミノ酸残基の少なくとも1つの溶媒露出遊離アミン部分に共有結合され得る。いくつかの実施形態において、アペリンポリペプチドは、ペプチド上の1つまたは複数の第一級または第二級アミンでPEGに結合してもよいし、ペプチド上の1つの第一級アミン部位で2つのPEG基に結合してもよい(例えば、これは、還元型アミノ化反応が過剰なPEG-アルデヒド化合物の存在を伴うときに生じ得る)。還元的アミノ化によるPEG化がペプチド上の第一級アミンにおける場合、1分子ごとにPEGが2つ以上存在する反応生成物が多数(1~100%の範囲)得られることが珍しくないことが観察されており、所望のPEG化生成物が1分子ごとにPEGを1つのみ有するものであれば、この「過剰PEG化」は望ましくないだろう。PEG化生成物分子1つにつき1つのPEGを有するPEG化生成物が所望される場合、薬学的活性ペプチドの第二級アミンを用いたPEG化を伴う実施形態を、この還元的アミノ化反応では1分子につきPEG基が1つのみ移されることから、採用することができる。
第一級アミン部分を提供することができるアミノ酸残基には、リシン、ホモリシン、オルニチン、α,β-ジアミノプロピオン酸(Dap)、α,β-ジアミノプロピオン酸(Dpr)ならびに及びα,γ-ジアミノ酪酸(Dab)、アミノ酪酸(Abu)、及びα-アミノ-イソ酪酸(Aib)の残基が挙げられる。ポリペプチドN末端もまた、PEG化に有用なα-アミノ基を提供する。第二級アミン部分を提供することができるアミノ酸残基には、ε-N-アルキルリシン、α-N-アルキルリシン、δ-N-アルキルオルニチン、α-N-アルキルオルニチンまたはN-末端プロリンが挙げられ、ここでアルキルはC1~C6である。
PEG化類似体を生成するのに有用な別の活性化PEGは、限定するものではないが、PEG-マレイミド化合物であり、例えば、マレイミドモノメトキシPEGなどのメトキシPEG-マレイミドであり、これらは、PEG結合ペプチドを生成するのに特に有用である(例えば、Shen,“N-maleimidyl polymer derivatives”(米国特許第6,602,498号);C.Delgado et al.,“The uses and properties of PEG-linked proteins”,Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems,9:249-304,1992;S.Zalipsky et al.,“Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides,in:Poly(ethylene glycol)chemistry”,Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,Ed.,Plenum Press:New York,347-370,1992;S.Herman et al.,“Poly(ethylene glycol)with reactive endgroups:I.Modification of proteins”,J.Bioactive Compatible Polymers,10:145-187,1995;P.J.Shadleら、“Conjugation of polymer to colony stimulating
factor-1”(米国特許第4,847,325号);G.Shaw et al.,“Cysteine added variants IL-3 and chemical modifications thereof”(米国特許第5,166,322号及びEP0469074B1);G.Shawら、“Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof”(EP0668353A1);G.Shaw et al.,“Cysteine added variants G-CSF and chemical modifications thereof”(EP0668354A1);N.V.Katre et al.,“Interleukin-2 muteins
and polymer conjugation thereof”(米国特許第5,206,344号);R.J.Goodson and N.V.Katre、“Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site”,Biotechnol.,8:343-346,1990)。
factor-1”(米国特許第4,847,325号);G.Shaw et al.,“Cysteine added variants IL-3 and chemical modifications thereof”(米国特許第5,166,322号及びEP0469074B1);G.Shawら、“Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof”(EP0668353A1);G.Shaw et al.,“Cysteine added variants G-CSF and chemical modifications thereof”(EP0668354A1);N.V.Katre et al.,“Interleukin-2 muteins
and polymer conjugation thereof”(米国特許第5,206,344号);R.J.Goodson and N.V.Katre、“Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site”,Biotechnol.,8:343-346,1990)。
ポリ(エチレン)グリコールビニルスルホンは、チオール化アミノ酸残基、例えば、C残基での結合によるPEG複合体化アペリンポリペプチドを生成するのに有用な別の活性化PEGである。例えば、M.Morpurgo et al.,“Preparation and characterization of poly(ethylene
glycol)vinyl sulfone”,Bioconj.Chem.,7:363-368,1996を参照されたい。また、Harris,“Functionalization of polyethylene glycol for formation of active sulfone-terminated PEG derivatives for binding to proteins and biologically compatible materials”、米国特許第5,446,090号、同第5,739,208号、同第5,900,461号、同第6,610,281号及び同第6,894,025号、ならびにHarris,“Water soluble active sulfones of poly(ethylene
glycol)”(WO95/13312A1)も参照されたい。種々の実施形態に従って有用である別の活性化形態のPEGは、PEG-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステルである。ヘテロ二官能性活性化形態のPEGもまた有用である。例えば、Thompson et al.,PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith”(米国特許第6,552,170号)を参照されたい。
glycol)vinyl sulfone”,Bioconj.Chem.,7:363-368,1996を参照されたい。また、Harris,“Functionalization of polyethylene glycol for formation of active sulfone-terminated PEG derivatives for binding to proteins and biologically compatible materials”、米国特許第5,446,090号、同第5,739,208号、同第5,900,461号、同第6,610,281号及び同第6,894,025号、ならびにHarris,“Water soluble active sulfones of poly(ethylene
glycol)”(WO95/13312A1)も参照されたい。種々の実施形態に従って有用である別の活性化形態のPEGは、PEG-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステルである。ヘテロ二官能性活性化形態のPEGもまた有用である。例えば、Thompson et al.,PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith”(米国特許第6,552,170号)を参照されたい。
PEG-アペリンペプチド複合体を生成するいくつかの実施形態において、アペリンポリペプチドを、既知の化学的技法によって、限定するものではないが、チオール活性化PEG化合物、ジオール活性化PEG化合物、PEGヒドラジド化合物、PEGオキシアミン化合物またはPEGブロモアセチル化合物などの活性化PEG化合物と反応させる(例えば、S.Herman,“Poly(ethylene glycol)with Reactive Endgroups:I.Modification of Proteins”,J.Bioactive and Compatible Polymers,10:145-187,1995;S.Zalipsky,“Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules”,Advanced Drug Delivery Reviews,16:157-182,1995;R.Greenwald et al.,“Poly(ethylene glycol)conjugated drugs and prodrugs:a comprehensive review”,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,17:101-161,2000参照)。
別の実施形態において、PEG結合アペリンポリペプチドを生成するための活性化PEGは、2つ以上の活性化残基を有する多価PEGであり得る。多価PEG部分には、以下の表8に示すものなどが挙げられるが、これらに限定されない。
更に他の実施形態において、アペリンポリペプチドは、既知の化学的技法によって、限定するものではないが、ペンタエリスリトールテトラポリエチレングリコールエーテルなどの活性化多分岐PEG化合物(二価、三価、四価、八価の構造体を与える複数の腕を有するPEG誘導体)と反応させられる。N-スクシンイミジルオキシカルボニル)プロピル、p-ニトロフェニルオキシカルボニル、(-CO2-p-C6H4NO2)、3-(N-マレイミド)プロパンアミド、2-スルファニルエチル、及び3-アミノプロピルなどの官能化及び活性化誘導体などであるが、これらに限定されない。4腕のPEG誘導体を用いて、4つのアペリンポリペプチドを各PEG分子に接続することができる。例えば、アペリンポリペプチドは、PEGの1、2、3または4つのアミノ官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのチオール官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのマレイミド官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのN-スクシンイミジル官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのカルボキシル官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのp-ニトロフェニルオキシカルボニル官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのアジド官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのアルケンまたはアルキン官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのハライドまたはハロゲン化アセチルアミド官能化部位
でポリエチレングリコール(PEG)に結合することができる。
PEGの1、2、3または4つのチオール官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのマレイミド官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのN-スクシンイミジル官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのカルボキシル官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのp-ニトロフェニルオキシカルボニル官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのアジド官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのアルケンまたはアルキン官能化部位、
PEGの1、2、3または4つのハライドまたはハロゲン化アセチルアミド官能化部位
でポリエチレングリコール(PEG)に結合することができる。
実用的なPEGの最小サイズは、約500Da(ダルトン)であり、これを下回るとPEGは毒性になる。約500Daを上回るのであれば、PEGは、いかなる分子量も実用的に望まれるように使用することができる(例えば、約500Da(ダルトン)~100,000Da(nは10~2300))。PEGモノマーの数(n)は、各モノマーに関してMW=44Daを用いて、平均分子量から概算される。いくつかの実施形態において、PEG結合アペリンポリペプチドに使用されるPEGの合計または総平均分子量は、約500Da~10,000Da(nの合計は10~230)、または約10,000~40,000Da(nの合計は230~910)、または約40,000~100,000Da(nの合計は910~2300)であり得る。
種々の他の実施形態において、PEG分子の合計分子量は、約100,000Daを超えるべきではない。いくつかの実施形態において、PEG結合アペリンポリペプチドに使用されるPEGの合計または総平均分子量は、約3,000Da~60,000Da(nの合計は70~1,400)、約10,000Da~40,000Da(nの合計は約230~約910)であり得る。他の実施形態において、PEGの合計質量は、約20,000Da~30,000Da(nの合計は約450~約680)である。一実施形態において、PEG結合アペリンポリペプチドに使用されるPEGの平均分子量は、約5,000Da(5kDa)である。別の実施形態において、PEG結合アペリンポリペプチドに使用されるPEGの平均分子量は、約10,000Da(10kDa)である。更に別の実施形態において、PEG結合アペリンポリペプチドに使用されるPEGの平均分子量は、約20,000Da(20kDa)である。
いくつかの実施形態において、PEGポリマーは、以下に詳述する結合リンカーを介してアペリンポリペプチドに結合される。一実施形態において、結合リンカーは、3-メルカプトプロパン酸(本明細書中MerPrと略記する)を含む。別の実施形態において、結合リンカーは、3-(1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)プロパン酸(本明細書中3TPと略記する)を含む。3TPは、複合体化にPEGアジドクリック反応を用いる場合、ペンタ-4-イン酸からもたらされる。本発明の例示的なPEG-アペリンペプチド複合体を以下の表9に示す。表9及び本明細書の他の箇所で使用するPEGの略称は、次の通りに定義する。NPeg11=1-アミノ-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-ドデカオキサノナトリアコンタン-39-酸;[Pra](NPeg9)=(S)-2-アミノ-3-(1-(32-アミノ-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-デカオキサドトリアコンチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)プロパン酸;10K-mPEGアセトアミドReg、10K-mPEGReg、または10K-mPEGアセトアミド=メトキシポリエチレングリコールアミン-N-アセトアミド(10kDa);及び20K-mPEGアセトアミドReg、20K-mPEGReg、20K-mPEGアセトアミド=メトキシポリエチレングリコールアミン-N-アセトアミド(20kDa)。MerPr及び3TPは、双方とも上記したリンカーであるが、そのリンカーの略称が以下の配列の最初に示されている場合であっても、これらは、PEGポリマーとアペリンポリペプチドのアミノ末端の間に位置することに注意されたい。ある特定の実施形態において、修飾アペリンポリペプチドは、以下の表9に列挙するペプチドのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
本発明のある特定の実施形態において、半減期延長部分またはビヒクルは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFcドメイン、特にヒト免疫グロブリンまたはヒト免疫グロブリンFcドメイン(例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4)である。したがって、本明細書にて開示する修飾アペリンポリペプチドのいずれかは、所望により結合リンカーを介して、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFcドメインに結合することができる。結合リンカーが存在する実施形態において、結合リンカーは、ペプチジルまたは非ペプチジルリンカーであってよい。ある特定の実施形態において、非ペプチジルリンカーは、PEGポリマーを含む。「免疫グロブリン」という用語は、それぞれが軽鎖(LC)に共有結合した2つの二量体化した重鎖(HC)を含む完全抗体、1つの二量体化していない免疫グロブリン重鎖と共有結合した軽鎖(HC+LC)、またはキメラ免疫グロブリン(軽鎖+重鎖)-Fcヘテロ三量体(いわゆる「ヘミボディ」)を包含する。「Fc領域」または本明細書において区別なく用いられる「Fcドメイン」若しくは「免疫グロブリンFcドメイン」は、抗体のHCのCH1、CH2及びCH3ドメインを含み得る2つの重鎖断片を含む。いくつかの実施形態において、Fcドメインは、免疫グロブリンのCH2及びCH3ドメインを含むが、CH1ドメインは含まない。Fcドメインの2つの重鎖断片は、2つ以上のジスルフィド結合及びCH3ドメインの疎水性相互作用によって互いに保持されている。
組み換え免疫グロブリンまたはIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4アイソタイプのいずれかの免疫グロブリンFcドメインへの本発明のアペリンポリペプチドの組み換え融合または化学的結合は、薬物動態学的半減期を延ばすのに有用であり得る。例えば、WO2010/108153A2を参照されたい。WO2010/108153A2若しくはWO/2012/040518に記載されている担体免疫グロブリン若しくはそのFcドメイン、または異なるアイソタイプの定常ドメインを含む、これらのいずれかのアイソタイプ変換、または当該技術分野にて知られている他の担体免疫グロブリンのいずれかを本発明の範囲内の半減期を延長する部分として使用することができる。例えば、脱グリコシル化(例えば、N297GバリアントIgG1;WO2012/075037A1)及び/またはシステイン置換(「CysMab」)バリアント免疫グロブリンFcモノマーを安定性の向上またはエフェクター機能の変更に用いることもできる。例えば、WO2007/022070A2(全体を参照により本明細書に援用する)を参照されたい。
免疫グロブリンまたはFcドメイン半減期延長部分をもたらすために用いることができるヒトIgG2重鎖(HC)定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号729)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号729)
他のIgGアイソタイプ、所望であれば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4免疫グロブリンアイソタイプに関する定常領域配列は、当該技術分野において知られている。一般に、ヒトIgG2はエフェクター機能が望ましくない標的に用いることができ、ヒトIgG1はこのようなエフェクター機能(例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC))が望ましい場合に用いることができる。ヒトIgG3は半減期が比較的短く、ヒトIgG4は抗体「半分子」を形成する。ヒトIgG1には、4つのアロタイプが知られている。好ましいアロタイプは、「hIgG1z」と呼ばれ、「KEEM」アロタイプとしても知られている。ヒトIgG1アロタイプ「hIgG1za」(KDEL)、「hIgG1f」(REEM)及び「hIgG1fa」もまた有用であり、これら全てがADCCエフェクター機能を有すると思われる。
ヒトhIgG1z重鎖(HC)定常ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号730)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号730)
ヒトhIgG1za重鎖(HC)定常ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号731)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号731)
ヒトhIgG1f重鎖(HC)定常ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号732)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号732)
ヒトhIgG1fa重鎖(HC)定常ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号733)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号733)
本発明のいくつかの実施形態において、半減期を延長する部分は、免疫グロブリンFcドメイン(例えば、ヒト免疫グロブリンFcドメインであり、アロタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のFcを含む)またはその一部分(例えば、FcドメインのCH2ドメイン)である。Fcドメインは、配列番号716及び729~733のうちのいずれか1つの配列を含み得る。一実施形態において、本発明のアペリンポリペプチドに結合されるFcドメインは、配列番号716のアミノ酸配列を含む。
一価の二量体または二価の二量体のFc-アペリンペプチド融合体または複合体は、本発明のペプチド複合体の有用な実施形態である。「一価二量体」Fc-アペリンペプチド融合体若しくは複合体または区別なく使用される「一価二量体」または区別なく使用される「一価ヘテロ二量体」は、二量体化Fcドメインの1つのみと複合体化したアペリンペプチドを含む、Fc-アペリンペプチド類似融合体または複合体である。「二価二量体」Fc-アペリンペプチド類似体融合体、または区別なく使用される「二価二量体」若しくは「二価ホモ二量体」は、2つの二量体化Fcドメインを有し、そのそれぞれがアペリンペプチド類似体と個別に複合化している、Fc-アペリンペプチド融合体または複合体である。
免疫グロブリンFcドメインは、Fcバリアントを含み、これは、本発明の範囲内の好適な半減期延長部分である。サルベージ受容体への結合が維持される限り、本発明に従って、野生型Fcを大幅に改変してFcバリアントを形成することができる。例えば、WO97/34631、WO96/32478及びWO04/110472を参照されたい。このようなFcバリアントにおいて、本発明の融合体または複合体分子に必要とされない構造的特徴または機能活性を与える、野生型Fcの1つまたは複数の部位を取り除くことができる。例えば、残基の置換若しくは欠失、その部位中への残基の挿入、またはその部位に含まれる部分の末端切断によって、これらの部位を取り除くことができる。挿入または置換された残基はまた、ペプチド模倣物またはD-アミノ酸などの改変アミノ酸であってよい。Fcバリアントは、多数の理由から望ましい場合があり、これらの一部について以下に記載する。例示的なFcバリアントは、以下の分子及び配列を含む。
1.ジスルフィド結合形成に関与する部位を除去する。かかる除去により、本発明の分子を産生するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。この目的のために、N末端のシステイン含有セグメントを末端切除してもよいし、システイン残基を欠失させるか、他のアミノ酸(例えば、アラニル、セリル)で置換してもよい。システイン残基が除去される場合であっても、単鎖Fcドメインは非共有結合的に互いに保持された二量体Fcドメインをなお形成することができる。
2.選択された宿主細胞との適合性がより大きくなるように、野生型Fcを改変する。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの大腸菌中の消化酵素によって認識され得る、典型的な野生型FcのN末端に近いPAジペプチド配列を除去することができる。また、特に分子が大腸菌などの細菌細胞において組み換え的に発現される場合は、N末端メチオニン残基を付加することもできる。
3.選択された宿主細胞中で発現されるときのN末端不均一性を防ぐために、野生型FcのN末端の一部を除去する。この目的のために、N末端の最初の20個のアミノ酸残基のいずれか、特に1、2、3、4及び5番目の位置にあるものを欠失させることができる。
4.1つまたは複数のグリコシル化部位を除去する。典型的にグリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は、細胞溶解性応答を付与することができる。かかる残基は、欠失させるか、グリコシル化されない残基(例えば、アラニン)で置換することができる。
5.C1q結合部位などの補体との相互作用に関連する部位を除去する。例えば、ヒトIgG1のEKKトリペプチド配列を欠失または置換することができる。補体の動員は、本発明の分子にとって有利でない場合があり、このようなバリアントを用いることで回避することができる。
6.サルベージ受容体以外のFc受容体への結合に影響する部位を除去する。野生型Fcは、本発明の融合体または複合体分子に必要ではない一部の白血球と相互作用する部位を有し得るので、これを除去することができる。
7.ADCCエフェクター機能を低減または排除するためにADCC部位を除去するか、あるいは、非フコシル化または脱フコシル化によってADCCエフェクター機能を高めるように改変する。ADCC部位は、当該技術分野において知られており、例えば、IgG1中のADCC部位に関する、Molec.Immunol.29(5):633-9,1992を参照されたい。これらの部位も同様に、本発明の融合体または複合体分子には不要であるので、これを除去してもよいし、所望であればADCCエフェクター機能を高めてもよい。Iida et al.,Two mechanisms of the
enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity(ADCC)efficacy of non-fucosylated therapeutic antibodies in human blood,BMC Cancer 9:58,2009,doi:10.1186/1471-2407-9-58を参照されたい。
enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity(ADCC)efficacy of non-fucosylated therapeutic antibodies in human blood,BMC Cancer 9:58,2009,doi:10.1186/1471-2407-9-58を参照されたい。
8.野生型Fcが非ヒト抗体に由来する場合、野生型Fcをヒト化することができる。典型的には、野生型Fcをヒト化するために、非ヒト野生型Fc中の選択した残基をヒト野生型Fc中に通常みられる残基で置換する。抗体ヒト化に関する技術は、当該技術分野においてよく知られている。
9.以下に詳述するものなどの好適な長さ及び中性電荷のペプチジルまたは非ペプチジルリンカーを、本発明のアペリンポリペプチドのN末端とFcドメインのC末端、N末端または内部残基との間に共有結合的に融合することができる。いくつかの実施形態において、アペリンポリペプチドを結合することができる内部残基(システイン残基など)を含むようにFcドメインを操作することができる(実施例11参照)。Fc-アペリンペプチド複合体に使用することができる他の操作されたFcドメインは、WO2007/022070A2に記載されており、その全体を参照により本明細書に援用する。本発明の目的のために、バリアントFcドメインは、単量体の免疫グロブリン重鎖、抗体またはヘテロ三量体ヘミボディ(LC+HC+Fc)の一部であってもよい。
アペリンポリペプチドの複合体化に用いられる半減期を延長する部分(介在するリンカー部分を含有または非含有)が、半減期を延長する部分を結合することができるアミノ酸残基の数に応じて、多価(例えば、二価、三価、四価または更に高次の価数)であり得ることから、ペプチド複合体の「多量体」を作製することができることは理解されよう。いくつかの実施形態において、ペプチドは、多価(例えば、二価、三価、四価または更に高次の価数)であり得、したがって、いくつかの「多量体」は、2つ以上の半減期を延長する部分を有し得る。したがって、種々の複合体化した半減期延長部分ペプチド構造体を作製することが可能である。例として、一価の半減期延長部分と一価のペプチドは、1:1の複合体を生成することができ、二価のペプチドと一価の半減期延長部分は、ペプチド複合体が2つの半減期延長部分の部分を有する複合体を形成し得るのに対し、二価の半減期延長部分と一価のペプチドは、2つのペプチド実体が1つの半減期延長部分に連結した種を生成し得、価数のより大きい半減期延長部分を使用すると、ペプチド実体のクラスターが1つの半減期延長部分に結合したものが形成され得るのに対し、価数のより大きいペプチドは、複数の半減期延長部分の部分で覆われ得る。更なる例として、多価の半減期延長部分のアペリンポリペプチドへの結合部位がシステインまたは他のアミノチオールである場合、D’Amicoらによって記載された方法を用いることができる(米国特許出願公開第2006/0199812号として公開されたD’Amico et al.,“Method of conjugating aminothiol containing molecules to vehicles”(その全体を参照により本明細書に援用する))。
ペプチド部分は、活性化した半減期延長部分と反応する2つ以上の反応性基を有し得るため、複合体構造が形成される可能性を常に考慮する必要があり、半減期を延長する部分とペプチドとの1:1の付加物などの単一構造の形成、または二価の半減期延長部分を使用してペプチド:半減期を延長する部分:ペプチドの付加物の形成が望まれる場合、所定の比率の活性化した半減期延長部分とペプチド材料、それらの所定の濃度を使用し、ある比率の記載の生成物が形成されるように所定の条件(例えば時間、温度、pHなど)下で反応を実施し、次いで、記載の生成物を他の反応生成物から分離することが有益であろう。試薬の反応条件、比率及び濃度は、当業者の技量の範囲内である比較的簡単な試行錯誤による実験によって得ることができ、必要に応じて適切なスケールアップを伴う。生成物の精製及び分離は、当業者によく知られた従来の技術によって、同様に達成される。
更に、半減期を延長する部分に融合化または複合体化したアペリンポリペプチドの生理学的に許容される塩もまた、記載する種々の実施形態に包含される。
上述した半減期を延長する部分及び本明細書に記載の他の半減期を延長する部分は、単独または組み合わせのいずれでも有用であり、当該技術分野において、例えば、米国特許出願公開第2007/0071764号及びWO2008/088422(両出願の全体を参照により本明細書に援用する)に詳述されている通りである。種々の実施形態は、本明細書に記載のものなどであるがこれらに限定されない、薬学的に許容される半減期延長部分の任意の1種とアペリンポリペプチドとの併用または2つ以上の類似する若しくは異なる半減期延長部分の組み合わせの使用を包含する。
本発明の修飾アペリンポリペプチドは、いくつかの実施形態において、結合リンカーを介して、半減期延長部分に結合または接続され得る。リンカーは、例えば、チオエーテル、アミン、イミン、アミド、トリアゾール、ジスルフィドまたは炭素-炭素結合から構成され得る。したがって、種々の実施形態において、例えば、チオエーテルは、ビヒクルまたは半減期延長部分をアペリンポリペプチドにつなぐことができる。ある特定の実施形態において、結合リンカーは、存在する場合、Aeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluを含む。例えば、本明細書の実施例2を参照されたい。
結合リンカーまたはリンカー部分は、生物学的に許容されるペプチジルまたは非ペプチジル有機基であり得、これは、組成物中に含まれるアペリンポリペプチドまたは他のポリペプチド鎖(例えば、免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖または免疫グロブリンFcドメイン)のアミノ酸残基に共有結合され、リンカー部分がアペリンポリペプチドまたは他のポリペプチド鎖と、組成物中の別のペプチド若しくはポリペプチド鎖または半減期を延長する部分とを共有結合的に連結または結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の半減期を延長する部分は、アペリンポリペプチド自体のアミノ酸残基に結合、すなわち直接的に共有結合されるか、または所望によりアペリンポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合されるペプチジル若しくは非ペプチジルリンカー部分(限定するものではないが、芳香族またはアリールリンカー)に結合される。
いくつかの実施形態において、リンカー部分の存在は、ペプチド複合体の薬理活性を最適化するのに有用であり得る。リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結したアミノ酸で構成され得る。リンカー部分は、存在する場合、独立して、組成物中に存在し得る任意の他のリンカーまたは複数のリンカーと同じであっても、異なってもよい。上述した通り、リンカー部分は、存在する場合(アペリンペプチドの一次アミノ酸配列内に存在する場合または半減期を延長する部分をアペリンペプチドに接続するためのリンカーとして存在する場合のいずれであれ)、本質的に「ペプチジル」であってよく(すなわち、ペプチド結合によって互いに連結したアミノ酸を構成する)、好ましくは、1~約40個のアミノ酸残基、1~約20個のアミノ酸残基または1~約10個のアミノ酸残基の長さからなり得る。リンカー中のアミノ酸残基は、20種の天然アミノ酸からのものであり、例えば、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及び/またはセリンである。種々の実施形態において、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合によって連結された、グリシン、セリン及びアラニンなどの立体阻害のないアミノ酸で大部分が構成され得る。また、ペプチジルリンカーは、存在する場合、インビボ循環中のタンパク質分解による急速な代謝回転を回避するものを選択するのが望ましい場合がある。当業者によく理解されているように、これらのアミノ酸のうちのいくつかは、グリコシル化され得る。例えば、シアル化部位を構成する有用なリンカー配列は、X1X2NX4X5G(配列番号734)であり、配列中、X1、X2、X4及びX5は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基である。また、ペプチジルリンカーは、存在する場合、インビトロ及び/またはインビボにおけるタンパク質分解による急速な代謝回転を回避または低減するように選択される任意の非標準アミノ酸または非標準及び標準アミノ酸の組み合わせからなり得るのが望ましい場合がある。
他の実施形態において、ペプチジルリンカー部分の1~40個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択することができる。リンカーは、グリシン及びアラニンなどの立体阻害のないアミノ酸で大部分が構成され得る。したがって、リンカーには、ポリグリシン、ポリセリン及びポリアラニンまたはこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。いくつかの例示的なペプチジルリンカーは、ポリ(Gly)1~8、特に(Gly)3(配列番号735)、(Gly)4(配列番号736)、(Gly)5(配列番号737)及び(Gly)7(配列番号738)ならびに「L15」(GGGGSGGGGSGGGGS;配列番号739)などのポリグリシン-セリンリンカー、ポリグリシン-アラニン及びポリアラニンリンカーである。ペプチジルリンカーの他の具体的な例には、(Gly)5Lys(配列番号740)及び(Gly)5LysArg(配列番号741)が挙げられる。有用なペプチジルの他の例は、(Gly)3Lys(Gly)4(配列番号742)、
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(配列番号743)、
(Gly)3Cys(Gly)4(配列番号744)及び
GlyProAsnGlyGly(配列番号745)である。
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(配列番号743)、
(Gly)3Cys(Gly)4(配列番号744)及び
GlyProAsnGlyGly(配列番号745)である。
上記の命名法を説明すると、例えば、(Gly)3Lys(Gly)4(配列番号742)は、Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly(配列番号742)を意味する。GlyとLysまたはGlyとAlaの他の組み合わせもまた有用である。
他のリンカーは、「L5」(GGGGSまたは「G4S」;配列番号746)、「L10」(GGGGSGGGGS;配列番号747);「L20」(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;配列番号748);「L25」(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;配列番号749)として本明細書中に特定されるもの及び以下の実施例にて使用される任意のリンカーである。
ペプチドリンカー部分を含むいくつかの実施形態において、酸性残基、例えば、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基は、リンカー部分のアミノ酸配列中に置かれる。例としては、次のペプチドリンカー配列が挙げられる。
GGEGGG(配列番号750)、
GGEEEGGG(配列番号751)、
GEEEG(配列番号752)、
GEEE(配列番号753)、
GGDGGG(配列番号754)、
GGDDDGG(配列番号755)、
GDDDG(配列番号756)、
GDDD(配列番号757)、
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(配列番号758)、
WEWEW(配列番号759)、
FEFEF(配列番号760)、EEEWWW(配列番号761)、
EEEFFF(配列番号762)、
WWEEEWW(配列番号763)または
FFEEEFF(配列番号764)。
GGEGGG(配列番号750)、
GGEEEGGG(配列番号751)、
GEEEG(配列番号752)、
GEEE(配列番号753)、
GGDGGG(配列番号754)、
GGDDDGG(配列番号755)、
GDDDG(配列番号756)、
GDDD(配列番号757)、
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(配列番号758)、
WEWEW(配列番号759)、
FEFEF(配列番号760)、EEEWWW(配列番号761)、
EEEFFF(配列番号762)、
WWEEEWW(配列番号763)または
FFEEEFF(配列番号764)。
ここに示すリンカーは例示的なものであり、ペプチジルリンカーは、更により長いものであってもよいし、他の残基を含んでもよい。ペプチジルリンカーは、例えば、システイン、別のチオールまたは半減期を延長する部分と結合するための求核基を含み得る。別の実施形態において、リンカーは、マレイミド、ヨードアセトアミドまたはチオエステルの官能化された半減期を延長する部分への結合のためのシステイン若しくはホモシステイン残基または他の2-アミノ-エタンチオール若しくは3-アミノ-プロパンチオール部分を含み得る。
別の有用なペプチジルリンカーは、例えば、GSGSATGGSGSTASSGSGSATH(配列番号765)またはHGSGSATGGSGSTASSGSGSAT(配列番号766)のGly/Ser/Thrランダム配列を含む柔軟で大きいリンカーであり、おおよそ1kDaのサイズのPEG分子であると推定される。あるいは、有用なペプチジルリンカーは、剛直なヘリックス構造を形成する、当該技術分野において既知のアミノ酸配列(例えば、剛直リンカー:-AEAAAKEAAAKEAAAKAGG(配列番号767)からなってもよい。更に、ペプチジルリンカーはまた、非ペプチジルセグメント、例えば、炭素数6の式-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-の脂肪族分子を含み得る。ペプチジルリンカーは、本明細書に記載の誘導体を形成するように改変してもよい。
非ペプチジルリンカー部分もまた、半減期を延長する部分をアペリンペプチドに結合するのに有用である。例えば、-NH-(CH2)s-C(O)-(式中、s=2~20)などのアルキルリンカーも用いることができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル(例えば、C1~C6)低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニルなどの任意の非立体障害性基によって更に置換されてもよい。例示的な非ペプチジルリンカーは、PEGリンカー(例えば、以下に示すもの)である。
式中、nは、リンカーが約100~約5000Da(ダルトン)の分子量を有するものである。ある特定の実施形態において、非ペプチジルリンカーは、Fc-アペリンペプチド複合体について実施例11に例示するブロモアセチル-NPeg11である。
一実施形態において、非ペプチジルリンカーは、アリールである。リンカーは、本明細書に記載する方法と同じ方法で誘導体を形成するように改変してもよい。加えて、PEG部分は、PEGのアルデヒドを用いる還元的アルキル化またはPEGのヒドロキシスクシンイミド若しくは炭酸エステルを用いるアシル化のいずれか、またはチオール結合によって、N端末アミンまたは選択した側鎖アミンに接続することができる。
「アリール」は、フェニルまたは飽和、部分飽和若しくは不飽和の3、4若しくは5員炭素架橋と近接融合したフェニルであり、フェニルまたは架橋は、C1~8アルキル、C1~4ハロアルキルまたはハロから選択される0、1、2または3つの置換基によって置換される。「ヘテロアリール」は、不飽和の5、6若しくは7員単環式環または部分飽和若しくは不飽和の6、7、8、9、10若しくは11員二環式環であり、少なくとも1つの環は不飽和であり、単環式環及び二環式環はN、O及びSから選択される1、2、3または4つの原子を含有し、環はC1~8アルキル、C1~4ハロアルキル及びハロから選択される0、1、2または3つの置換基によって置換される。非ペプチジルリンカーまたは非ペプチド半減期延長部分などの非ペプチド部分は、従来の有機化学反応によって合成することができる。
上記は、本発明の半減期延長-アペリンペプチド複合体の種々の実施形態に従って任意に使用され得る種々のリンカーの単なる例示であり、網羅的に論じるものではない。
アペリンポリペプチドの安定性を向上させる更なる手法として、ポリペプチド中に存在する任意の2つの原子を共有結合で連結して環式構造を形成するようにポリペプチドを調製することができる。Xn及びXn+3またはXn及びXn+4は、独立して、DまたはLの立体配置のいずれでもよい、K、D、Orn、DabまたはEから選択される天然または非天然アミノ酸であり、これらの位置のアミノ酸の側鎖は互いに共有結合してアミド結合(-NHC(O)-または-C(O)-NH-)を形成する。アミド結合は、側鎖のアミノ官能基及びカルボキシル官能基を介して直接形成してもよいし、ジアミノ、ビス-カルボキシルまたはアミノ-カルボキシルリンカーを用いてアミド結合を形成してもよい。あるいは、モノスルフィド(-S-)、ジスルフィド(-S-S-)または式-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-(式中、ZはO、N-O-CH2C(O)-であり、環化を達成する)の連結でアミド結合を置き換えてもよい。いくつかの実施形態において、環式アペリンポリペプチドを半減期延長部分に結合させると、更にペプチドの安定性が向上し、及び/またはペプチドの薬物動態プロファイルが調整される。
一実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、次式:
N1[AC4Abu]N2Xによって記載することができ、式中、N1は脂肪族アシル基またはアセチル-NHであり、N2は[Aeea][Aeea]または[Aeea]であり、Xは11、12、13、14、15、16または17アミノ酸長のアペリンポリペプチドであり、E1xxK1(EとKの間のアミド結合により環化)を含み、式中、xxはD-若しくはL-アミノ酸、α-若しくはβ-アミノ酸、ホモログ化アミノ酸、N-メチル化アミノ酸、α-メチルアミノ酸、α-炭素ではなくN上に側鎖を有するアミノ酸または別の天然若しくは非標準アミノ酸から選択される2~3個のアミノ酸である。
N1[AC4Abu]N2Xによって記載することができ、式中、N1は脂肪族アシル基またはアセチル-NHであり、N2は[Aeea][Aeea]または[Aeea]であり、Xは11、12、13、14、15、16または17アミノ酸長のアペリンポリペプチドであり、E1xxK1(EとKの間のアミド結合により環化)を含み、式中、xxはD-若しくはL-アミノ酸、α-若しくはβ-アミノ酸、ホモログ化アミノ酸、N-メチル化アミノ酸、α-メチルアミノ酸、α-炭素ではなくN上に側鎖を有するアミノ酸または別の天然若しくは非標準アミノ酸から選択される2~3個のアミノ酸である。
別の実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、次式:
[Z]X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13PX14(配列番号768)によって記載することができ、Eのカルボン酸側鎖とKのアミノ側鎖との間のアミド結合を1つだけ有し、
Zは、アセチル、アシル、[Atz(PEG10)]、PEG誘導体{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]若しくは他の半減期延長部分であるか、または不在であり、X1は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、不在またはEであり、X1がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX4またはX5の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、X2は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、不在またはEであり、X2がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX5またはX6の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、X3は、Q、qまたはEであり、X3がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX6またはX7の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、X4は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、KまたはEであり、X4がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX7またはX8の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX4がKである場合は、そのアミン側鎖がX1の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X5は、P、KまたはEであり、X5がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX8またはX9の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX5がKである場合は、そのアミン側鎖がX1またはX2の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X6は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、KまたはEであり、X6がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX9またはX10の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX6がKである場合は、そのアミン側鎖がX2またはX3の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X7は、[Cha]、[NmeLeu]、KまたはEであり、X7がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはKがX7である場合は、そのアミン側鎖がX3またはX4の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X8は、S、KまたはEであり、X8がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX8がKである場合は、そのアミン側鎖がX4またはX5の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X9は、HまたはKであり、X9がEである場合は、そのアミン側鎖がX5またはX6の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X10は、Kであり、そのアミン側鎖は、X6またはX7の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し得るが、必ずしもそうである必要はなく、X11は、GまたはKであり、X11がKである場合は、そのアミン側鎖がX7またはX8の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X12は、[Oic]またはKであり、X12がKである場合は、そのアミン側鎖がX8またはX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X13は、[p-I-Phe]、[Nle]またはKであり、X13がEである場合は、そのアミン側鎖がX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X14は、[D-Bip]、[D-4ClF]または[4-Cl-F]である。
[Z]X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13PX14(配列番号768)によって記載することができ、Eのカルボン酸側鎖とKのアミノ側鎖との間のアミド結合を1つだけ有し、
Zは、アセチル、アシル、[Atz(PEG10)]、PEG誘導体{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]若しくは他の半減期延長部分であるか、または不在であり、X1は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、不在またはEであり、X1がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX4またはX5の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、X2は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、不在またはEであり、X2がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX5またはX6の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、X3は、Q、qまたはEであり、X3がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX6またはX7の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、X4は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、KまたはEであり、X4がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX7またはX8の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX4がKである場合は、そのアミン側鎖がX1の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X5は、P、KまたはEであり、X5がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX8またはX9の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX5がKである場合は、そのアミン側鎖がX1またはX2の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X6は、r、[hArg]、[NmeArg]、R、KまたはEであり、X6がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX9またはX10の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX6がKである場合は、そのアミン側鎖がX2またはX3の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X7は、[Cha]、[NmeLeu]、KまたはEであり、X7がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはKがX7である場合は、そのアミン側鎖がX3またはX4の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X8は、S、KまたはEであり、X8がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX8がKである場合は、そのアミン側鎖がX4またはX5の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X9は、HまたはKであり、X9がEである場合は、そのアミン側鎖がX5またはX6の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X10は、Kであり、そのアミン側鎖は、X6またはX7の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し得るが、必ずしもそうである必要はなく、X11は、GまたはKであり、X11がKである場合は、そのアミン側鎖がX7またはX8の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X12は、[Oic]またはKであり、X12がKである場合は、そのアミン側鎖がX8またはX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X13は、[p-I-Phe]、[Nle]またはKであり、X13がEである場合は、そのアミン側鎖がX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、X14は、[D-Bip]、[D-4ClF]または[4-Cl-F]である。
いくつかの実施形態において、本発明の修飾アペリンポリペプチドは、次式:
Z1Z2X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号769)によって記載することができ、
式中、Z1はアシル基であり、Z2は結合リンカーを含むか、または不在であり、X1はO、K、[D-Orn]、[k]、[BLys]、[D-BLys]、[BhLys]若しくは[D-BhLys]であるか、または不在であり、X2はF、[BhPhe]、[BPhe]であるか、または不在であり、X3はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、X4はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、X5はQ、L、N、[q]、[l]、[PE]、[BhGln]、[BhAsn]、[aMeLeu]、[aMeGln]、[Bleu]または[BhLeu]であり、X6はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、X7はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[rPro]または[Pip]であり、X8はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、X9はL、[Cha]、[NMeCha]、[rCha]、[rLeu]、[NMeLeu]、[aMeLeu]、[BLeu]または[BhLeu]であり、X10はS、[aMeSer]、[BhSer]、[rSer]、[Sar]または[bAla]であり、X11はH、A、V、L、Y、[Deg]、[Tle]、[NMeVal]または[bAla]であり、X12はK、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、X13はG、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、X14はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、X15はM、L、V、I、[Met(O)]、[Nle]、[Nva]または[pI-Phe]であり、X16はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、X17はF、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]若しくは[D-Bip]であるか、または不在である。特定の一実施形態において、X16はF、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X17は不在である。
Z1Z2X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号769)によって記載することができ、
式中、Z1はアシル基であり、Z2は結合リンカーを含むか、または不在であり、X1はO、K、[D-Orn]、[k]、[BLys]、[D-BLys]、[BhLys]若しくは[D-BhLys]であるか、または不在であり、X2はF、[BhPhe]、[BPhe]であるか、または不在であり、X3はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、X4はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、X5はQ、L、N、[q]、[l]、[PE]、[BhGln]、[BhAsn]、[aMeLeu]、[aMeGln]、[Bleu]または[BhLeu]であり、X6はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、X7はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[rPro]または[Pip]であり、X8はR、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、X9はL、[Cha]、[NMeCha]、[rCha]、[rLeu]、[NMeLeu]、[aMeLeu]、[BLeu]または[BhLeu]であり、X10はS、[aMeSer]、[BhSer]、[rSer]、[Sar]または[bAla]であり、X11はH、A、V、L、Y、[Deg]、[Tle]、[NMeVal]または[bAla]であり、X12はK、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、X13はG、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、X14はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、X15はM、L、V、I、[Met(O)]、[Nle]、[Nva]または[pI-Phe]であり、X16はP、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、X17はF、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]若しくは[D-Bip]であるか、または不在である。特定の一実施形態において、X16はF、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X17は不在である。
ある特定の実施形態において、Z1は、C1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基である。例えば、Z1は、表6に由来する任意の脂肪族アシル基、例えば、オクタノイル(Oct)またはデカノイル(Dec)またはドデカノイル(DDA)、トリデカノイル(TDA)、テトラデカノイル(ミリストイル)、ペンタデカノイル(PDA)、ヘキサデカノイル(パルミトイル)、ヘプタデカノイル(HDA)、オクタデカノイル(ステアロイル)、オクタデカンジオイル(ODDA)から選択される脂肪族アシル基であってよい。いくつかの実施形態において、Z1は、アセチルである。他の実施形態において、Z1は、5kDa、10kDa若しくは20kDaのPEGポリマーまたは本明細書に開示する他のPEGポリマーである。いくつかの実施形態において、Z2は、Aeea、γ-グルタミン酸またはこれらの組み合わせを含む結合リンカーである。他の実施形態において、Z2の結合リンカーは、不在である。
本発明はまた、疾患、障害または他の医学的状態、特に心臓機能障害の治療または予防のための、本明細書に開示の修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体のうちの1つまたは複数の使用を提供する。一実施形態において、本発明は、必要とする対象において、心血管病態を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のいずれかの修飾アペリンポリペプチドまたはその半減期延長複合体を治療上有効な量で含む医薬組成物を対象に投与することを含む。「治療上有効な量」は、疾患または疾患若しくは障害の臨床症状のうちの少なくとも1つを治療するために対象に投与されたとき、当該疾患、障害または症状に対する当該治療をもたらすのに十分な化合物の量を指す。「治療上有効な量」は、使用される特定のポリペプチド若しくはペプチド複合体、疾患、障害ならびに/または疾患若しくは障害の症状、疾患、疾病及び/若しくは疾患若しくは疾病の症状の重症度、治療がなされる対象の年齢ならびに/または治療がなされる対象の体重に応じて変化し得る。任意の所与の場合における適切な量は、当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で使用するとき、任意の疾患若しくは障害を「治療すること」またはそれらの「治療」とは、疾患、障害または疾患若しくは障害の臨床症状の少なくとも1つを抑止または改善すること、疾患、障害または疾患若しくは障害の臨床症状の少なくとも1つに罹るリスクを低減すること、疾患、障害または疾患若しくは障害の臨床症状の少なくとも1つの発現を減じること、あるいは疾患または障害または疾患若しくは障害の臨床症状の少なくとも1つの進行リスクを低減することを指す。「治療すること」または「治療」はまた、身体的(例えば、識別し得る症状の安定化)、生理学的(例えば、身体的パラメータの安定化)のいずれかまたは両方の点で疾患または障害を阻害すること、あるいは対象には識別することができない場合もある、少なくとも1つの身体的パラメータを阻害することも指す。更に、「治療すること」または「治療」は、ある疾患または障害に罹患しているおそれがあり得るか、または罹患しやすい対象において、当該対象がその疾患または障害の症状をまだ経験していないか、または呈していない場合であっても、その疾患または障害または少なくともその症状の発症を遅延することを指す。
本発明の修飾アペリンポリペプチドまたはペプチド複合体を用いて治療または改善され得る心血管病態には、心臓の収縮性に影響する障害または心機能障害に伴う任意の形態の心疾患若しくは心障害、例えば、心臓肥大症、高血圧、心不全、鬱血性心不全、心臓性ショック、敗血性ショック、急性非代償性不全、肺高血圧症、心筋梗塞、虚血、虚血再灌流傷害または心筋症などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、心血管病態は、心不全である。全ての形態の心不全、限定するものではないが、収縮不全、拡張不全、右心不全、慢性心不全、急性心不全及び非代償性鬱血性心不全が本発明の方法に従って治療または改善され得る。本発明の修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体は、駆出率が低下したまたは駆出率が保持された患者を治療するために使用することができる。一実施形態において、本発明の方法に従って治療される心不全は、慢性収縮期心不全である。別の実施形態において、本発明の方法に従って治療される心不全は、慢性拡張期心不全である。更に別の実施形態において、本発明の方法に従って治療される心不全は、急性心不全である。いくつかの実施形態において、本発明の方法に従って治療される心血管病態は、高血圧である。
他の実施形態において、本発明は、心血管病態を有する対象において、心収縮性を改善する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のいずれかの修飾アペリンポリペプチドまたはその半減期延長複合体を治療上有効な量で含む医薬組成物を対象に投与することを含み、心収縮性が投与後に改善する。ある特定の実施形態において、対象は、慢性または急性心不全を患っている。いくつかの実施形態において、医薬組成物の投与により、dP/dt maxまたは駆出率が、当該組成物の投与前のこれらのパラメータまたは医薬組成物の投与を受けていない対象のこれらのパラメータと比較して増加する。医薬組成物の投与はまた、医薬組成物の投与前のパラメータまたは医薬組成物の投与を受けていない対象のパラメータと比較して、運動能力の向上、心臓駆出率の増加、左心室拡張終期圧の減少、肺毛細血管楔入圧の減少、心拍出量の増加、心係数の増加、肺動脈圧の低下、左心室の収縮末期径及び拡張末期径の減少、左心室及び右心室の壁応力(wail stress)の減少、ならびに壁張力の減少をもたらし得る。
一実施形態において、本発明はまた、心血管病態を有する対象において、駆出率を増加させる方法を提供し、本明細書に記載のいずれかの修飾アペリンポリペプチドまたはその半減期延長複合体を治療上有効な量で含む医薬組成物を対象に投与することを含み、駆出率が投与後に増加する。ある特定の実施形態において、対象は急性または慢性心不全を患っている。
いくつかの実施形態において、本発明の方法に従って治療が施される対象は、例えば、長年放置された高血圧、未矯正の弁膜症、慢性狭心症、近時の心筋梗塞、鬱血性心不全、心疾患に対する先天性素因または病理学的肥大を含む、心疾患に関する1つまたは複数の危険因子を有する。代替的または付加的に、対象は、例えば、心臓肥大症、高血圧または他の心臓機能障害に対する遺伝的素因があると診断されていてもよいし、例えば、心臓肥大症、高血圧または他の心臓機能障害の家族歴を有し得る。
本発明の他の実施形態は、肺高血圧症、癌、糖尿病、肥満症、転移性疾患及びHIVに起因する心臓症状を治療するための、本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体の使用に関する。他の実施形態は、限定するものではないが、脂質及びグルコース代謝に関係する障害の治療、消化管の調節及び機能に関係する障害の治療、HIV細胞侵入に対する防御、ならびに細胞アポトーシスからの保護などの種々の他の障害または疾患の治療または予防のための、本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体の使用に関する。
修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体を含む医薬組成物は、多種多様な送達経路、例えば、注射若しくは注入などによる血管内送達経路、皮下(「s.c.」)、静脈内(「i.v.」)、筋肉内、腹腔内(「i.p.」)、硬膜外若しくは髄腔内送達経路による患者への投与用、または経口、経腸、経肺(例えば、吸入)、経鼻、経粘膜(例えば、舌下投与)、経皮若しくは他の送達経路及び/または当該技術分野において知られている投与形態用に構成することができる。修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体を含む薬物または医薬組成物の送達は、最も正確な用量及び最も安定した血漿中曝露量を達成するために、標準的な注入様式(プレフィルドシリンジを用いる自己投与または病院の場であるかに関わらない)によって、あるいはオートインジェクター、パッチポンプまたは大容量注射器などの送達ポンプによっても行われ得る。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載の修飾アペリンポリペプチドまたはその複合体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。医薬組成物は、液状に調製されてもよいし、凍結乾燥形態などの乾燥粉末形態であってもよい。経口または経腸での使用には、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬質若しくは軟質カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤または経腸製剤として医薬組成物を構成することができる。
実施において、「薬学的に許容される担体」は、医薬組成物の処方に有用な当業者に知られた生理学的に耐容性のある任意の物質であり得、単独または組み合わせで、任意の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、分散剤、結合剤、充填剤、流動促進剤、減摩剤、圧縮助剤、錠剤崩壊剤(崩壊剤)、懸濁化剤、潤滑剤、風味剤、着香剤、甘味料、浸透または透過促進剤、保存剤、界面活性剤、溶解剤、乳化剤、粘稠剤、補助剤、色素、コーティング剤、カプセル化材料及び/または他の添加剤が挙げられる。かかる医薬組成物は、種々の緩衝液成分(例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pH及びイオン強度の希釈剤;界面活性剤及び可溶化剤(例えば、Tween(登録商標)80、ポリソルベート80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、Thimersol(登録商標)、ベンジルアルコール)ならびに増量材(例えば、ラクトース、マンニトール)などの添加剤;ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物またはリポソームへの材料の組み込みを含み得る。ヒアルロン酸もまた用いることができ、循環継続期間を助長する効果を有し得る。このような組成物は、本タンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響し得る。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing
Co.,Easton,PA18042,pp.1435-1712,1990を参照されたい(その全体を参照により本明細書に援用する)。組成物は、液状に調製されてもよいし、凍結乾燥形態などの乾燥粉末であってもよい。埋め込み式持続放出性製剤もまた有用であり、経皮または経粘膜製剤も同様である。付加的に(または代替的に)、種々の実施形態は、当事者に知られた種々の遅延または持続放出性の製剤または微小粒子製剤のうちのいずれか、例えば、経肺、経鼻または皮下送達経路を介して投与することができる持続放出性微小粒子製剤で使用するための組成物を提供する(例えば、Murthy et al.,“Injectable compositions for the controlled delivery of pharmacologically active compound”(米国特許第6,887,487号);Manning et al.,“Solubilization of pharmaceutical substances in an organic solvent and preparation of pharmaceutical powders using the same”(米国特許第5,770,559号及び同第5,981,474号);Lieberman et al.,“Lipophilic complexes of pharmacologically active inorganic mineral acid esters of organic compounds”(米国特許第5,002,936号);Gen,“Formative agent of protein complex”(US2002/0119946A1);Goldenberg et al.,“Sustained release formulations”(WO2005/105057A1)参照)。
Co.,Easton,PA18042,pp.1435-1712,1990を参照されたい(その全体を参照により本明細書に援用する)。組成物は、液状に調製されてもよいし、凍結乾燥形態などの乾燥粉末であってもよい。埋め込み式持続放出性製剤もまた有用であり、経皮または経粘膜製剤も同様である。付加的に(または代替的に)、種々の実施形態は、当事者に知られた種々の遅延または持続放出性の製剤または微小粒子製剤のうちのいずれか、例えば、経肺、経鼻または皮下送達経路を介して投与することができる持続放出性微小粒子製剤で使用するための組成物を提供する(例えば、Murthy et al.,“Injectable compositions for the controlled delivery of pharmacologically active compound”(米国特許第6,887,487号);Manning et al.,“Solubilization of pharmaceutical substances in an organic solvent and preparation of pharmaceutical powders using the same”(米国特許第5,770,559号及び同第5,981,474号);Lieberman et al.,“Lipophilic complexes of pharmacologically active inorganic mineral acid esters of organic compounds”(米国特許第5,002,936号);Gen,“Formative agent of protein complex”(US2002/0119946A1);Goldenberg et al.,“Sustained release formulations”(WO2005/105057A1)参照)。
不活性物質を用いて、組成物を希釈してもよいし、医薬組成物の体積を増やしてもよい。このような希釈剤には、炭水化物、特に、マンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン及びデンプンを挙げることができる。ある種の無機塩も充填剤として使用してよく、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムが挙げられる。
限定されないが、アルギネート、キサンタンガムまたはペテロレータムなどの従来の種々の粘稠剤は、クリーム剤、軟膏剤、座薬及びゲル剤構成の医薬組成物に有用であり、医薬組成物の各種構成にも用いることができる。
種々の実施形態において、滅菌した溶液または懸濁液である液体の医薬組成物は、注入、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、血管内(例えば、静脈内または動脈内)、腹腔内または皮下注入によって患者に投与することができる。例えば、Goldenberg et al.,“Suspensions for the sustained release of proteins”、米国特許第6,245,740号及びWO00/38652A1を参照されたい。滅菌溶液は、静脈内注入によって投与することもできる。組成物は、凍結乾燥粉末などの滅菌した固体の医薬組成物中に含まれてもよく、これは、患者への投与前の都合の良い時間に、滅菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水または他の適切な滅菌注入用媒体を使用して溶解または懸濁することができる。
埋め込み式持続放出性製剤もまた医薬組成物の有用な実施形態である。例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物の体内または皮下に埋め込まれる生分解性マトリクスである、薬学的に許容される担体は、上記のものに類似したヒドロゲルであってよい。あるいは、ポリ-α-アミノ酸成分から形成されてもよい(Sidman,“Biodegradable,implantable drug delivery device,and process for preparing and using same”(米国特許第4,351,337号))。薬物送達のためのインプラントを作製するための他の技術もまた知られており、有用である。
粉末形態の場合、薬学的に許容される担体は、微粉化された固体であり、本組成物を含む微粉化された活性成分と混合される。例えば、いくつかの実施形態において、医薬組成物を吸入剤として構成する場合、粉末形態が有用である。例えば、WO2004/017918号、米国特許第6,900,317号)を参照されたい。
不活性物質を用いて、化合物を希釈してもよいし、化合物の体積を増やしてもよい。これらの希釈剤には、炭水化物、特に、マンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン及びデンプンを挙げることができる。ある種の無機塩も充填剤として使用することができ、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムが挙げられる。一部の市販の希釈剤には、Fast-Flo(商標)、Emdex(商標)、STA-Rx(商標)1500、Emcompress(商標)及びAvicell(商標)がある。
治療薬をまとめて硬質錠剤を形成するために結合剤を用いることができ、これらには、アカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンなどの天然物に由来する材料が挙げられる。他には、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)及びカルボキシメチルセルロース(CMC)が挙げられる。ポリビニルピロリドン(PVP)及びヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は両方とも、治療薬を粒状にするために、アルコール性溶液中で使用され得る。製剤プロセス中の固着を防ぐために、減摩剤を治療製剤中に含めてもよい。潤滑剤は、治療薬とダイ壁との間の層として使用することができ、これらには、ステアリン酸(そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含む)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、流動パラフィン、植物油及びワックスを挙げることができるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax4000及び6000などの可溶性潤滑剤も使用することができる。
経口剤形も種々の実施形態にて有用である。必要であれば、経口送達が有効となるように、組成物を化学修飾してもよい。一般に、企図される化学修飾は、その分子自体への少なくとも1つの部分の結合であり、当該部分は、(a)タンパク質分解の阻害及び(b)胃または腸から血流への取り込みを可能にするものである。また、化合物の全体的な安定性の増加及び体内循環時間の増加も所望される。共有結合した半減期を延長する部分として有用な部分は、この目的のために用いることもできる。このような部分の例には、PEG、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが挙げられる。例えば、Abuchowski and Davis,“Soluble Polymer-Enzyme Adducts,Enzymes as Drugs”、Hocenberg and Robertseds.,Wiley-Interscience,New York,New York,pp.367-383,1981;Newmark et al.,J.Appl.Biochem.,4:185-189,1982を参照されたい。使用され得る他のポリマーは、ポリ-1,3-ジオキソラン及びポリ-1,3,6-チオキソカン(tioxocane)である。薬学的用途に好ましいのは、上記の通り、PEG部分である。
経口送達剤形の場合、治療用化合物の吸収を高める担体として、N-(8-[2-ヒドロキシベンゾイル]アミノ)カプリル酸ナトリウム(SNAC)、などの修飾脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。SNACを用いたヘパリン製剤の臨床有効性は、Emisphere Technologiesが実施した第II相試験にて実証されている。米国特許第5,792,451号、“Oral drug delivery composition and methods”を参照されたい。
一実施形態において、薬学的に許容される担体は液体であり得、医薬組成物は液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤または加圧組成物の形態に調製される。本活性成分(例えば、本組成物)は、水、有機溶媒、その混合物または薬学的に許容される油若しくは脂肪油などの薬学的に許容される液体担体中に溶解、希釈または懸濁することができる。液体担体は、界面活性剤及び/若しくは溶解剤(例えば、Tween80、ポリソルベート80)、乳化剤、適切なpHの緩衝剤(例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、補助剤、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、Thimersol、ベンジルアルコール)、甘味料、風味剤、懸濁化剤、粘稠化剤、増量材(例えば、ラクトース、マンニトール)、着色料、粘性調整剤、安定剤、電解質、オスモライト(osmolutes)または浸透圧調節剤などの他の好適な医薬品添加物を含有し得る。添加剤はまた、組成物の取り込みを高めるために製剤中に含めてよい。この性質を潜在的に有する添加剤は、例えば、脂肪酸のオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
上掲のRemington’s Pharmaceutical Sciences(1990)第89章(その全体を参照により本明細書に援用する)に概略されている経口用固体剤形もまた有用である。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、カシェ剤またはペレット剤が挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイドカプセル化を用いて、本組成物を製剤化することもできる(例えば、米国特許第4,925,673号に報告されているプロテイノイド微粒子として)。リポソームカプセル化を使用することができ、リポソームは種々のポリマーを用いて誘導化することができる(例えば、米国特許第5,013,556号)。治療薬として可能な固体剤形に関する説明は、G.S.Banker及びC.T.Rhodesが編集したMarshall,K.,Modern Pharmaceutics(1979)第10章に記載されている(その全体を参照により本明細書に援用する)。一般に、製剤は、化合物と、胃環境に対する保護及び生物学的活性物質の腸内における放出を可能にする不活性成分とを含む。
錠剤の場合、活性成分は、必要な圧縮特性を有する薬学的に許容される担体と好適な比率で混合され、所望の形状及び大きさに圧縮成形される。
散剤及び錠剤は、活性成分を最大99%まで含有することができる。好適な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン(polyvinylpyrrolidine)、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。
制御放出製剤が望ましい場合がある。種々の実施形態において、拡散または滲出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリクス(例えば、ゴム)中に組成物を組み込むことができる。ゆっくりと変性するマトリクス、例えば、アルギネート、多糖も製剤中に組み込むことができる。組成物の制御放出の別の形態は、Oros(商標)治療システム(Alza Corp.)に基づく方法、すなわち、水の入ることができる半透膜で薬物を覆い、1つの小さな穴から浸透圧作用によって薬物を押し出すものである。一部の腸溶性コーティングも遅延放出作用を有する。
組成物の肺送達も有用であり得る。タンパク質(または誘導体)は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を通過して血流に移動する(これに関する他の報告には、Adjei et al.,Pharma.Res.(1990)7:565-9;Adjei et al.,(1990),Internatl.J.Pharmaceutics 63:135-44(酢酸ロイプロリド);Braquet et al.,(1989)、J.Cardiovasc.Pharmacol.13(suppl.5):s.143-146(エンドセリン-1);Hubbard et al.,(1989)、Annals Int.Med.3:206-12(α1-抗トリプシン);Smith et al.,(1989)、J.Clin.Invest.84:1145-6(α1-プロテイナーゼ);Oswein et al.,(March 1990)、“Aerosolization of Proteins”Proc.Symp.Resp.Drug Delivery II,Keystone,Colorado(組み換えヒト成長ホルモン);Debs et al.,(1988),J.Immunol.140:3482-8(インターフェロン-γ及び腫瘍壊死因子α)及びPlatz et al.,米国特許第5,284,656号(顆粒球コロニー刺激因子)が挙げられる)。
病態を治療するための方法に伴う投与計画は、薬物の作用を変える種々の因子、例えば、患者の年齢、状態、体重、性別及び食生活、あらゆる感染の重症度、投与の時間ならびに他の臨床学的因子を鑑みて、主治医によって決定される。一般に、毎日のレジメンは、化合物0.1~1000マイクログラム/キログラム体重、好ましくは、0.1~150マイクログラム/キログラムの範囲内である必要がある。
更なる例示として、次の付番した実施形態を示す。
実施形態1
次式:
X1X2X3X4(配列番号721)を含み、
式中、
X1は、脂肪族アシル基であり、
X2は、γGlu若しくは別の好適なスペーサー部分であるか、または不在であり、
X3は、PEG基若しくは別の好適なスペーサー部分であるか、または不在であり、
X4は、アペリンポリペプチドである、単離ポリペプチド。
次式:
X1X2X3X4(配列番号721)を含み、
式中、
X1は、脂肪族アシル基であり、
X2は、γGlu若しくは別の好適なスペーサー部分であるか、または不在であり、
X3は、PEG基若しくは別の好適なスペーサー部分であるか、または不在であり、
X4は、アペリンポリペプチドである、単離ポリペプチド。
種々の実施形態において、実施形態1の修飾アペリンポリペプチドは、半減期延長部分(例えば、PEG、脂質、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFc)を有さないが、それでもなお野生型アペリンポリペプチドと比較して安定性が向上しており、かつ少なくとも3、4、5、6、7または8個の非標準アミノ酸置換を有し得る。
実施形態2
X2がγGluである、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
X2がγGluである、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
実施形態3
前記脂肪族アシル基がC1~C25脂肪族アシル基である、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
前記脂肪族アシル基がC1~C25脂肪族アシル基である、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
実施形態4
前記脂肪族アシル基が、ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、オクタデカンジオイル、オクタンジオイル、デカンジオイル、ドデカンジオイル、ヘキサンジオイル、ブタンジオイル、テトラデカンジオイルまたはヘキサデカンジオイルである、実施形態3に記載の単離ポリペプチド。
前記脂肪族アシル基が、ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、オクタデカンジオイル、オクタンジオイル、デカンジオイル、ドデカンジオイル、ヘキサンジオイル、ブタンジオイル、テトラデカンジオイルまたはヘキサデカンジオイルである、実施形態3に記載の単離ポリペプチド。
実施形態5
X3がAeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluである、実施形態1~4のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
X3がAeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluである、実施形態1~4のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
実施形態6
X1がオクタデカンジオイル、ヘプタデカノイル、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルであり、X2がγ-Gluであるか、または不在であり、X3がAeea、Aeea-Aeeaであるか、または不在である、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
X1がオクタデカンジオイル、ヘプタデカノイル、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルであり、X2がγ-Gluであるか、または不在であり、X3がAeea、Aeea-Aeeaであるか、または不在である、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
実施形態7
前記アペリンポリペプチドが少なくとも12アミノ酸長である、実施形態1~6のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
前記アペリンポリペプチドが少なくとも12アミノ酸長である、実施形態1~6のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
実施形態8
前記アペリンポリペプチドが少なくとも1つの非標準アミノ酸置換を有する、実施形態1~7のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
前記アペリンポリペプチドが少なくとも1つの非標準アミノ酸置換を有する、実施形態1~7のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
実施形態9
前記アペリンポリペプチドが2、3、4、5、6、7、8または9個の非標準アミノ酸を有する、実施形態8に記載の単離ポリペプチド。
前記アペリンポリペプチドが2、3、4、5、6、7、8または9個の非標準アミノ酸を有する、実施形態8に記載の単離ポリペプチド。
実施形態10
前記アペリンポリペプチドが少なくとも1つのD-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸、N-メチルアミノ酸若しくはα-メチルアミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型を含む、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
前記アペリンポリペプチドが少なくとも1つのD-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸、N-メチルアミノ酸若しくはα-メチルアミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型を含む、実施形態1に記載の単離ポリペプチド。
実施形態11
前記D-アミノ酸、前記β-アミノ酸、前記N-メチルアミノ酸、前記α-メチルアミノ酸、前記非標準アミノ酸または前記非標準アミノ酸の前記D-若しくはβ-型が、完全長アペリン(配列番号2)、アペリン42~77(配列番号3)、アペリン65~77(アペリン-13)(配列番号4)、アペリン61~77(配列番号5)または完全長アペリンの断片中の標準アミノ酸に代わって用いられる、実施形態10に記載の単離ポリペプチド。
前記D-アミノ酸、前記β-アミノ酸、前記N-メチルアミノ酸、前記α-メチルアミノ酸、前記非標準アミノ酸または前記非標準アミノ酸の前記D-若しくはβ-型が、完全長アペリン(配列番号2)、アペリン42~77(配列番号3)、アペリン65~77(アペリン-13)(配列番号4)、アペリン61~77(配列番号5)または完全長アペリンの断片中の標準アミノ酸に代わって用いられる、実施形態10に記載の単離ポリペプチド。
実施形態12
アミノ酸配列:
[z]X1X2X3X4X5X6X7SHX8G[Oic]X9X10X11(配列番号719)を含み、
zは、アセチルであるか、または不在であり、
X1は、アセチル、[r]または[hArg]であり、
X2は、[r]、Rまたは[hArg]であり、
X3は、Qまたは[q]であり、
X4は、[hArg]、Rまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[Oic]であり、
X6は、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、Kまたは[NLysG]であり、
X9は、[pl-Phe]または[Nle]であり、
X10は、Pまたは[D-1Nal]または[Pip]であり、
X11は、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
[z]X1X2X3X4X5X6X7SHX8G[Oic]X9X10X11(配列番号719)を含み、
zは、アセチルであるか、または不在であり、
X1は、アセチル、[r]または[hArg]であり、
X2は、[r]、Rまたは[hArg]であり、
X3は、Qまたは[q]であり、
X4は、[hArg]、Rまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[Oic]であり、
X6は、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、Kまたは[NLysG]であり、
X9は、[pl-Phe]または[Nle]であり、
X10は、Pまたは[D-1Nal]または[Pip]であり、
X11は、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型である、単離ポリペプチド。
実施形態13
X11が[D-Bip]、[4-CL-F]、[D-4CLF]、[TIC]、[f]であるか、または不在である、実施形態12に記載の単離ポリペプチド。
X11が[D-Bip]、[4-CL-F]、[D-4CLF]、[TIC]、[f]であるか、または不在である、実施形態12に記載の単離ポリペプチド。
実施形態14
配列番号16~44からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態12に記載の単離ポリペプチド。
配列番号16~44からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態12に記載の単離ポリペプチド。
実施形態15
アミノ酸配列:
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3P[Cha]SHKG[Oic][Nle]X4X5(配列番号722)を含み、配列中、
X1は、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、Qまたは[q]であり、
X3は、[hArg]または[r]であり、
X4は、Pまたは[Pip]であり、
X5は、[4-Cl-F]または[D-4ClF]である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3P[Cha]SHKG[Oic][Nle]X4X5(配列番号722)を含み、配列中、
X1は、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、Qまたは[q]であり、
X3は、[hArg]または[r]であり、
X4は、Pまたは[Pip]であり、
X5は、[4-Cl-F]または[D-4ClF]である、単離ポリペプチド。
実施形態16
配列番号237、239または242からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態15に記載の単離ポリペプチド。
配列番号237、239または242からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態15に記載の単離ポリペプチド。
実施形態17
アミノ酸配列:
[z]X1X2[hArg][hArg]X3X4X5X6X7X8X9X10G[Oic][Nle]X11[4-Cl-F](配列番号720)を含み、
配列中、
zは、アセチルであり、
X1は、oまたはOであり、
X2は、fまたはFであり、
X3は、Qまたは[BLeu]であり、
X4は、[hArg]または[rhArg]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、[hArg]または[rhArg]であり、
X7は、[aMeLeu]、[rCha]、[BLeu]または[Cha]であり、
X8は、[NhSerG]、[aMeS]、[rSer]、[DrSer]またはSであり、
X9は、Hまたは[rHis]であり、
X10は、K、[NLysG]、[rLys]または[aMeOrn]であり、
X11は、Pまたは[aMePro]である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
[z]X1X2[hArg][hArg]X3X4X5X6X7X8X9X10G[Oic][Nle]X11[4-Cl-F](配列番号720)を含み、
配列中、
zは、アセチルであり、
X1は、oまたはOであり、
X2は、fまたはFであり、
X3は、Qまたは[BLeu]であり、
X4は、[hArg]または[rhArg]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、[hArg]または[rhArg]であり、
X7は、[aMeLeu]、[rCha]、[BLeu]または[Cha]であり、
X8は、[NhSerG]、[aMeS]、[rSer]、[DrSer]またはSであり、
X9は、Hまたは[rHis]であり、
X10は、K、[NLysG]、[rLys]または[aMeOrn]であり、
X11は、Pまたは[aMePro]である、単離ポリペプチド。
実施形態18
配列番号29~44からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態17に記載の単離ポリペプチド。
配列番号29~44からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態17に記載の単離ポリペプチド。
実施形態19
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3X4X5X6X7X8KG[Oic]X9X10X11(配列番号724)を含み、配列中、
X1は、[hArg]、[r]であるか、または不在であり、
X2は、Q、[q]、[BLeu]または[NMeGln]であり、
X3は、[hArg]または[r]であり、
X4は、P、[Pip]、[Oic]または[Sar]であり、
X5は、[NMeArg]、[r]または[hArg]であり、
X6は、[Cha]、[NMeLeu]、[BLeu]または[NMeCha]であり、X7は、S、[BhSer]、[bAla]、[NhSerG]または[aMeS]であり、
X8は、H、A、Y、[Tle]、[Deg]、LまたはVであり、
X9は、[Nle]または[pl-Phe]であり、
X10は、P、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、X11は、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3X4X5X6X7X8KG[Oic]X9X10X11(配列番号724)を含み、配列中、
X1は、[hArg]、[r]であるか、または不在であり、
X2は、Q、[q]、[BLeu]または[NMeGln]であり、
X3は、[hArg]または[r]であり、
X4は、P、[Pip]、[Oic]または[Sar]であり、
X5は、[NMeArg]、[r]または[hArg]であり、
X6は、[Cha]、[NMeLeu]、[BLeu]または[NMeCha]であり、X7は、S、[BhSer]、[bAla]、[NhSerG]または[aMeS]であり、
X8は、H、A、Y、[Tle]、[Deg]、LまたはVであり、
X9は、[Nle]または[pl-Phe]であり、
X10は、P、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、X11は、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
実施形態20
X10が[D-Tic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4F]、[D-Ogl]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]、[Tic]、[Aib]または[Deg]である、実施形態19に記載の単離ポリペプチド。
X10が[D-Tic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4F]、[D-Ogl]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]、[Tic]、[Aib]または[Deg]である、実施形態19に記載の単離ポリペプチド。
実施形態21
配列番号121~210及び245~256からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態19に記載の単離ポリペプチド。
配列番号121~210及び245~256からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態19に記載の単離ポリペプチド。
実施形態22
TDAがHDAで置き換えられた、実施形態19に記載の単離ポリペプチド。
TDAがHDAで置き換えられた、実施形態19に記載の単離ポリペプチド。
実施形態23
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X2X3(配列番号725)を含み、配列中、
X1は、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、P、D-アミノ酸または非標準アミノ酸であり、
X3は、D-アミノ酸、非標準アミノ酸または-COOHである、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X2X3(配列番号725)を含み、配列中、
X1は、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、P、D-アミノ酸または非標準アミノ酸であり、
X3は、D-アミノ酸、非標準アミノ酸または-COOHである、単離ポリペプチド。
実施形態24
配列番号121~152からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態23に記載の単離ポリペプチド。
配列番号121~152からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態23に記載の単離ポリペプチド。
実施形態25
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X1COOH(配列番号726)を含み、配列中、X1はD-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X1COOH(配列番号726)を含み、配列中、X1はD-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型である、単離ポリペプチド。
実施形態26
X1が[D-Tic]、[4-CL-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4lF]、[D-IgL]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]または[Tic]である、実施形態25に記載の単離ポリペプチド。
X1が[D-Tic]、[4-CL-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-4lF]、[D-IgL]、[f]、[1-Nal]、[2-Nal]、[D-Bip]または[Tic]である、実施形態25に記載の単離ポリペプチド。
実施形態27
配列番号166、171及び245~256からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態25に記載の単離ポリペプチド。
配列番号166、171及び245~256からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態25に記載の単離ポリペプチド。
実施形態28
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QX1PX2X3SHKG[Oic]X4X5X6(配列番号727)を含み、配列中、
X1は、R、rまたは[hArg]であり、
X2は、r、[hArg]または[NMeArg]であり、
X3は、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X4は、[pl-Phe]または[Nle]であり、
X5は、Pまたは[D-1Nal]であり、
X6は、[D-Bip]、[4-CL-F]、[D-4ClF]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QX1PX2X3SHKG[Oic]X4X5X6(配列番号727)を含み、配列中、
X1は、R、rまたは[hArg]であり、
X2は、r、[hArg]または[NMeArg]であり、
X3は、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X4は、[pl-Phe]または[Nle]であり、
X5は、Pまたは[D-1Nal]であり、
X6は、[D-Bip]、[4-CL-F]、[D-4ClF]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
実施形態29
配列番号165及び211~233からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態28に記載の単離ポリペプチド。
配列番号165及び211~233からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態28に記載の単離ポリペプチド。
実施形態30
アミノ酸配列:
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5SHKG[Oic][Nle]X6X7(配列番号723)を含み、配列中、
X1は、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、Qまたは[q]であり、
X3は、rまたは[hArg]であり、
X4は、rまたは[NMeArg]であり、
X5は、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X6は、[Pip]またはPであり、
X7は、[4-CL-F]、[f]、[D-4ClF]または[Tic]である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5SHKG[Oic][Nle]X6X7(配列番号723)を含み、配列中、
X1は、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、Qまたは[q]であり、
X3は、rまたは[hArg]であり、
X4は、rまたは[NMeArg]であり、
X5は、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X6は、[Pip]またはPであり、
X7は、[4-CL-F]、[f]、[D-4ClF]または[Tic]である、単離ポリペプチド。
実施形態31
HDAがTDAまたは他の脂肪族アシル基で置き換えられた、実施形態30に記載の単離ポリペプチド。
HDAがTDAまたは他の脂肪族アシル基で置き換えられた、実施形態30に記載の単離ポリペプチド。
実施形態32
配列番号234~243からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態30に記載の単離ポリペプチド。
配列番号234~243からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態30に記載の単離ポリペプチド。
実施形態33
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5X6X7KG[Oic]X8X9X10(配列番号728)を含み、配列中、
X1は、[hArg]または[r]であり、
X2は、Qまたは[q]であり、
X3は、rまたは[hArg]であり、
X4は、rまたは[NMeArg]であり、
X5は、[NMeLeu][BLeu]または[Cha]であり、
X6は、Sまたは[bAla]であり、
X7は、H、Aまたは[Tle]であり、
X8は、[Nle]または[pl-Phe]であり、
X9は、P、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、
X10は、[Oic]、[D-4ClF]、[D-1Nal]、[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5X6X7KG[Oic]X8X9X10(配列番号728)を含み、配列中、
X1は、[hArg]または[r]であり、
X2は、Qまたは[q]であり、
X3は、rまたは[hArg]であり、
X4は、rまたは[NMeArg]であり、
X5は、[NMeLeu][BLeu]または[Cha]であり、
X6は、Sまたは[bAla]であり、
X7は、H、Aまたは[Tle]であり、
X8は、[Nle]または[pl-Phe]であり、
X9は、P、D-アミノ酸、β-アミノ酸、非標準アミノ酸または非標準アミノ酸のD-若しくはβ-型であり、
X10は、[Oic]、[D-4ClF]、[D-1Nal]、[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
実施形態34
X9が[D-Tic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X10が不在である、実施形態33に記載の単離ポリペプチド。
X9が[D-Tic]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]、[Aic]、[Oic]、[D-igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X10が不在である、実施形態33に記載の単離ポリペプチド。
実施形態35
TDAがHDAで置き換えられた、実施形態33に記載の単離ポリペプチド。
TDAがHDAで置き換えられた、実施形態33に記載の単離ポリペプチド。
実施形態36
配列番号153~155、166、171、173~175、180、199、201、208及び245~256からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態33に記載の単離ポリペプチド。
配列番号153~155、166、171、173~175、180、199、201、208及び245~256からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態33に記載の単離ポリペプチド。
実施形態37
アミノ酸配列:
AcOF[hArg][hArg]Q[hArg]P[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F](配列番号45)を含む、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
AcOF[hArg][hArg]Q[hArg]P[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F](配列番号45)を含む、単離ポリペプチド。
実施形態38
配列番号7~714の任意の配列群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
配列番号7~714の任意の配列群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
実施形態39
野生型アペリン13(配列番号4)と比較して安定性が向上した、実施形態1~38のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
野生型アペリン13(配列番号4)と比較して安定性が向上した、実施形態1~38のいずれか1つに記載の単離ポリペプチド。
実施形態40
式:
N1[AC4Abu]N2Xを含み、
式中、
N1は、脂肪族アシル基またはアセチル-NHであり、
N2は、[Aeea][Aeea]または[Aeea]であり、及び
Xは、11、12、13、14、15、16または17アミノ酸長のアペリンポリペプチドであり、
E1xxK1(EとKの間のアミド結合により環化)を含み、式中、xxはD-若しくはL-アミノ酸、α-若しくはβ-アミノ酸、ホモログ化アミノ酸、N-メチル化アミノ酸、α-メチルアミノ酸、α-炭素ではなくN上に側鎖を有するアミノ酸または別の天然若しくは非標準アミノ酸から選択される2~3個のアミノ酸であり得る、単離ポリペプチド。
式:
N1[AC4Abu]N2Xを含み、
式中、
N1は、脂肪族アシル基またはアセチル-NHであり、
N2は、[Aeea][Aeea]または[Aeea]であり、及び
Xは、11、12、13、14、15、16または17アミノ酸長のアペリンポリペプチドであり、
E1xxK1(EとKの間のアミド結合により環化)を含み、式中、xxはD-若しくはL-アミノ酸、α-若しくはβ-アミノ酸、ホモログ化アミノ酸、N-メチル化アミノ酸、α-メチルアミノ酸、α-炭素ではなくN上に側鎖を有するアミノ酸または別の天然若しくは非標準アミノ酸から選択される2~3個のアミノ酸であり得る、単離ポリペプチド。
実施形態41
アミノ酸配列:
AcX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号718)を含み、配列中、
X1は、Oまたは[BhLys]であり、
X2は、F、[BhPhe]または[Bphe]であり、
X3は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X5は、Q、[BhGln]、[BhAsn]または[BhLeu]であり、
X6は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X7は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]または[Pip]であり、
X8は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X9は、[Cha]または[BhLeu]であり、
X10は、S、[BhSer]、[Sar]または[bAla]であり、
X11はH、[NMeVal]または[bAla]であり、
X12は、K、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、
X13は、G、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、
X14は、[Oic]、[Aib]、[Sar]、[bAla]、[BhPro]または[Pip]であり、
X15は、[Nle]または[bAla]であり、
X16は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[bAla]、[Pip]、[D-1Nal]または[D-2Nal]であり、及び
X17は、[4-Cl-F]、[Bh-Phe]または[BPhe]である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
AcX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号718)を含み、配列中、
X1は、Oまたは[BhLys]であり、
X2は、F、[BhPhe]または[Bphe]であり、
X3は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X5は、Q、[BhGln]、[BhAsn]または[BhLeu]であり、
X6は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X7は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]または[Pip]であり、
X8は、[hArg]、[NMeArg]または[BhArg]であり、
X9は、[Cha]または[BhLeu]であり、
X10は、S、[BhSer]、[Sar]または[bAla]であり、
X11はH、[NMeVal]または[bAla]であり、
X12は、K、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、
X13は、G、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、
X14は、[Oic]、[Aib]、[Sar]、[bAla]、[BhPro]または[Pip]であり、
X15は、[Nle]または[bAla]であり、
X16は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[bAla]、[Pip]、[D-1Nal]または[D-2Nal]であり、及び
X17は、[4-Cl-F]、[Bh-Phe]または[BPhe]である、単離ポリペプチド。
実施形態42
配列番号668~714からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態41に記載の単離ポリペプチド。
配列番号668~714からなる配列群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態41に記載の単離ポリペプチド。
実施形態43
アミノ酸配列:
[Z]X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13PX14(配列番号768)を含み、
Eのカルボン酸側鎖とKのアミノ側鎖との間のアミド結合を1つだけ有し、
Zは、アセチル、アシル、[Atz(PEG10)]、PEG誘導体{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]若しくは他の半減期延長部分であるか、または不在であり、
X1は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、不在またはEであり、X1がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX4またはX5の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、
X2は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、不在またはEであり、X2がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX5またはX6の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、
X3は、Q、qまたはEであり、X3がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX6またはX7の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、
X4は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、KまたはEであり、X4がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX7またはX8の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX4がKである場合は、そのアミン側鎖がX1の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X5は、P、KまたはEであり、X5がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX8またはX9の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX5がKである場合は、そのアミン側鎖がX1またはX2の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X6は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、KまたはEであり、X6がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX9またはX10の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX6がKである場合は、そのアミン側鎖がX2またはX3の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X7は、[Cha]、[NMeLeu]、KまたはEであり、X7がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはKがX7である場合は、そのアミン側鎖がX3またはX4の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X8は、S、KまたはEであり、X8がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX8がKである場合は、そのアミン側鎖がX4またはX5の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X9は、HまたはKであり、X9がEである場合は、そのアミン側鎖がX5またはX6の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X10は、Kであり、そのアミン側鎖は、X6またはX7の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し得るが、必ずしもそうである必要はなく、
X11は、GまたはKであり、X11がKである場合は、そのアミン側鎖がX7またはX8の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X12は、[Oic]またはKであり、X12がKである場合は、そのアミン側鎖がX8またはX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X13は、[p-I-Phe]、[Nle]またはKであり、X13がEである場合は、そのアミン側鎖がX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、及び
X15は、[D-Bip]、[D-4ClF]または[4-Cl-F]である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
[Z]X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13PX14(配列番号768)を含み、
Eのカルボン酸側鎖とKのアミノ側鎖との間のアミド結合を1つだけ有し、
Zは、アセチル、アシル、[Atz(PEG10)]、PEG誘導体{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]若しくは他の半減期延長部分であるか、または不在であり、
X1は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、不在またはEであり、X1がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX4またはX5の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、
X2は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、不在またはEであり、X2がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX5またはX6の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、
X3は、Q、qまたはEであり、X3がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX6またはX7の位置のKの側鎖とアミド結合を形成し、
X4は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、KまたはEであり、X4がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX7またはX8の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX4がKである場合は、そのアミン側鎖がX1の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X5は、P、KまたはEであり、X5がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX8またはX9の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX5がKである場合は、そのアミン側鎖がX1またはX2の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X6は、r、[hArg]、[NMeArg]、R、KまたはEであり、X6がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX9またはX10の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX6がKである場合は、そのアミン側鎖がX2またはX3の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X7は、[Cha]、[NMeLeu]、KまたはEであり、X7がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはKがX7である場合は、そのアミン側鎖がX3またはX4の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X8は、S、KまたはEであり、X8がEである場合は、そのカルボン酸側鎖がX10またはX11の位置のKの側鎖とアミド結合を形成するか、あるいはX8がKである場合は、そのアミン側鎖がX4またはX5の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X9は、HまたはKであり、X9がEである場合は、そのアミン側鎖がX5またはX6の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X10は、Kであり、そのアミン側鎖は、X6またはX7の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し得るが、必ずしもそうである必要はなく、
X11は、GまたはKであり、X11がKである場合は、そのアミン側鎖がX7またはX8の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X12は、[Oic]またはKであり、X12がKである場合は、そのアミン側鎖がX8またはX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、
X13は、[p-I-Phe]、[Nle]またはKであり、X13がEである場合は、そのアミン側鎖がX9の位置のEの側鎖とアミド結合を形成し、及び
X15は、[D-Bip]、[D-4ClF]または[4-Cl-F]である、単離ポリペプチド。
実施形態44
アミノ酸配列:
Z1Z2X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号769)を含み、配列中、
Z1は、アシル基であり、
Z2は、結合リンカーを含むか、または不在であり、
X1は、O、K、[D-Orn]、[k]、[BLys]、[D-BLys]、[BhLys]若しくは[D-BhLys]であるか、または不在であり、
X2は、F、[BhPhe]、[BPhe]であるか、または不在であり、
X3は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X4は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X5は、Q、L、N、[q]、[l]、[PE]、[BhGln]、[BhAsn]、[aMeLeu]、[aMeGln]、[Bleu]または[BhLeu]であり、
X6は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X7は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[rPro]または[Pip]であり、
X8は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X9は、L、[Cha]、[NMeCha]、[rCha]、[rLeu]、[NMeLeu]、[aMeLeu]、[BLeu]または[BhLeu]であり、
X10は、S、[aMeSer]、[BhSer]、[rSer]、[Sar]または[bAla]であり、
X11は、H、A、V、L、Y、[Deg]、[Tle]、[NMeVal]または[bAla]であり、
X12は、K、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、
X13は、G、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、
X14は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、
X15は、M、L、V、I、[Met(O)]、[Nle]、[Nva]または[pI-Phe]であり、
X16は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、及び
X17は、F、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]若しくは[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
Z1Z2X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号769)を含み、配列中、
Z1は、アシル基であり、
Z2は、結合リンカーを含むか、または不在であり、
X1は、O、K、[D-Orn]、[k]、[BLys]、[D-BLys]、[BhLys]若しくは[D-BhLys]であるか、または不在であり、
X2は、F、[BhPhe]、[BPhe]であるか、または不在であり、
X3は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X4は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]、[BhArg]であるか、または不在であり、
X5は、Q、L、N、[q]、[l]、[PE]、[BhGln]、[BhAsn]、[aMeLeu]、[aMeGln]、[Bleu]または[BhLeu]であり、
X6は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X7は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[rPro]または[Pip]であり、
X8は、R、[hArg]、[r]、[NMeArg]、[NMehArg]、[rhArg]、[rArg]または[BhArg]であり、
X9は、L、[Cha]、[NMeCha]、[rCha]、[rLeu]、[NMeLeu]、[aMeLeu]、[BLeu]または[BhLeu]であり、
X10は、S、[aMeSer]、[BhSer]、[rSer]、[Sar]または[bAla]であり、
X11は、H、A、V、L、Y、[Deg]、[Tle]、[NMeVal]または[bAla]であり、
X12は、K、[NMeLys]、[BhLys]、[BLys]または[bAla]であり、
X13は、G、[Sar]、[Aib]または[bAla]であり、
X14は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、
X15は、M、L、V、I、[Met(O)]、[Nle]、[Nva]または[pI-Phe]であり、
X16は、P、[Sar]、[Aib]、[BhPro]、[aMePro]、[Oic]、[Idc]、[rPro]または[Pip]であり、及び
X17は、F、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]若しくは[D-Bip]であるか、または不在である、単離ポリペプチド。
実施形態45
Z1がC1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
Z1がC1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
実施形態46
Z1が、アセチル、オクタノイル(Oct)、デカノイル(Dec)、ドデカノイル(DDA)、トリデカノイル(TDA)、テトラデカノイル(ミリストイル)、ペンタデカノイル(PDA)、ヘキサデカノイル(パルミトイル)、ヘプタデカノイル(HDA)、オクタデカノイル(ステアロイル)、オクタデカンジオイル(ODDA)または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の脂肪族アシル基若しくは親油基である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
Z1が、アセチル、オクタノイル(Oct)、デカノイル(Dec)、ドデカノイル(DDA)、トリデカノイル(TDA)、テトラデカノイル(ミリストイル)、ペンタデカノイル(PDA)、ヘキサデカノイル(パルミトイル)、ヘプタデカノイル(HDA)、オクタデカノイル(ステアロイル)、オクタデカンジオイル(ODDA)または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の脂肪族アシル基若しくは親油基である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
実施形態47
Z1が、{5kDa}、{10kDa}、{20kDa}または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の他のポリエチレングリコール(PEG)ポリマーである、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
Z1が、{5kDa}、{10kDa}、{20kDa}または前記ポリペプチドの半減期を延長するために組み込まれる任意の他のポリエチレングリコール(PEG)ポリマーである、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
実施形態48
Aeea、γ-グルタミン酸または任意の他の部分が、前記Z2の結合リンカーの構成成分として存在する、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
Aeea、γ-グルタミン酸または任意の他の部分が、前記Z2の結合リンカーの構成成分として存在する、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
実施形態49
前記結合リンカーが、特定的、機能的または構造的役割を果たす、極性、非極性、疎水性、脂肪族または芳香族部分であってよい、実施形態48に記載の単離ポリペプチド。
前記結合リンカーが、特定的、機能的または構造的役割を果たす、極性、非極性、疎水性、脂肪族または芳香族部分であってよい、実施形態48に記載の単離ポリペプチド。
実施形態50
前記Z2の結合リンカーが不在である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
前記Z2の結合リンカーが不在である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
実施形態51
X16がF、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X17が不在である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
X16がF、[Tic]、[D-Tic]、[Tiq]、[D-Tiq]、[4-Cl-F]、[pI-Phe]、[D-4FF]、[D-4ClF]、[D-4IF]、[Idc]、[Aic]、[Oic]、[D-Igl]、[f]、[D-1Nal]、[D-2Nal]、[1-Nal]、[2-Nal]または[D-Bip]であり、X17が不在である、実施形態44に記載の単離ポリペプチド。
実施形態52
アミノ酸配列:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10GX11X12X13X14(配列番号717)を含み、配列中、
X1は、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、[r]、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X3は、Q、[q]または[BLeu]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]、R、Eまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、R、E、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は、L、[aMeLeu]、[BLeu]、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、S、[BhSer]または[NhSerG]であり、
X9は、HまたはYであり、
X10は、Kまたは[NLysG]であり、
X11は、P、[Oic]、[aMePro]または[Pip]であり、
X12は、[Nle]、[rNle]または[pI-Phe]であり、
X13は、P、[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、及び
X14は、F、[D-BhPhe]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]または[D-Bip]である、単離ポリペプチド。
アミノ酸配列:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10GX11X12X13X14(配列番号717)を含み、配列中、
X1は、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X2は、[r]、R、E、[hArg]であるか、または不在であり、
X3は、Q、[q]または[BLeu]であり、
X4は、[hArg]、[NMeArg]、R、Eまたは[r]であり、
X5は、Pまたは[aMePro]であり、
X6は、R、E、[r]、[hArg]または[NMeArg]であり、
X7は、L、[aMeLeu]、[BLeu]、[NMeLeu]または[Cha]であり、
X8は、S、[BhSer]または[NhSerG]であり、
X9は、HまたはYであり、
X10は、Kまたは[NLysG]であり、
X11は、P、[Oic]、[aMePro]または[Pip]であり、
X12は、[Nle]、[rNle]または[pI-Phe]であり、
X13は、P、[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、及び
X14は、F、[D-BhPhe]、[4-Cl-F]、[D-4ClF]または[D-Bip]である、単離ポリペプチド。
実施形態53
前記ポリペプチドのアミノ末端がアセチル化されている、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
前記ポリペプチドのアミノ末端がアセチル化されている、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態54
所望により結合リンカーを介して、C1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基に結合した、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
所望により結合リンカーを介して、C1~C25飽和または不飽和脂肪族アシル基に結合した、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態55
前記脂肪族アシル基が、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルである、実施形態54に記載の単離ポリペプチド。
前記脂肪族アシル基が、トリデカノイル、ブタノイル、ヘキサノイル、ヘキサデカノイル、ブタンジオイル、オクタンジオイルまたはデカンジオイルである、実施形態54に記載の単離ポリペプチド。
実施形態56
前記脂肪族アシル基が、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイルまたはオクタデカンジオイルである、実施形態54に記載の単離ポリペプチド。
前記脂肪族アシル基が、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイルまたはオクタデカンジオイルである、実施形態54に記載の単離ポリペプチド。
実施形態57
前記結合リンカーが、Aeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluを含む、実施形態54に記載の単離ポリペプチド。
前記結合リンカーが、Aeea、Aeea-Aeea、γGlu-Aeea、γGlu-Aeea-AeeaまたはγGluを含む、実施形態54に記載の単離ポリペプチド。
実施形態58
所望により結合リンカーを介して、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーに結合した、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
所望により結合リンカーを介して、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーに結合した、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態59
前記PEGポリマーが、5kDa、10kDaまたは20kDaのPEGポリマーである、実施形態58に記載の単離ポリペプチド。
前記PEGポリマーが、5kDa、10kDaまたは20kDaのPEGポリマーである、実施形態58に記載の単離ポリペプチド。
実施形態60
前記結合リンカーが3-メルカプトプロパン酸を含む、実施形態58に記載の単離ポリペプチド。
前記結合リンカーが3-メルカプトプロパン酸を含む、実施形態58に記載の単離ポリペプチド。
実施形態61
所望により結合リンカーを介して、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFcドメインに結合した、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
所望により結合リンカーを介して、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンFcドメインに結合した、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態62
前記結合リンカーがペプチジルリンカーである、実施形態61に記載の単離ポリペプチド。
前記結合リンカーがペプチジルリンカーである、実施形態61に記載の単離ポリペプチド。
実施形態63
前記結合リンカーが非ペプチジルリンカーである、実施形態61に記載の単離ポリペプチド。
前記結合リンカーが非ペプチジルリンカーである、実施形態61に記載の単離ポリペプチド。
実施形態64
前記非ペプチジルリンカーがPEGポリマーを含む、実施形態63に記載の単離ポリペプチド。
前記非ペプチジルリンカーがPEGポリマーを含む、実施形態63に記載の単離ポリペプチド。
実施形態65
X7が[NMeLeu]であり、X12が[pI-Phe]であり、X14が[D-Bip]である、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
X7が[NMeLeu]であり、X12が[pI-Phe]であり、X14が[D-Bip]である、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態66
X1が[hArg]であり、X2が[hArg]であり、X3がQであり、X4が[hArg]であり、X5がPである、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
X1が[hArg]であり、X2が[hArg]であり、X3がQであり、X4が[hArg]であり、X5がPである、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態67
X6及びX7が[NMeArg]と[aMeLeu]、[hArg]と[BLeu]または[hArg]と[aMeLeu]である、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
X6及びX7が[NMeArg]と[aMeLeu]、[hArg]と[BLeu]または[hArg]と[aMeLeu]である、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態68
X13が[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、X14が[D-BhPhe]または[4-Cl-F]である、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
X13が[BhPro]、[aMePro]または[Aib]であり、X14が[D-BhPhe]または[4-Cl-F]である、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態69
配列番号8~11、16、17、31、32、45、53、60、68、69~71、92、112、114、119、120、221、228、237、263、286、287、362、373、376、379、382、388、412、416、460、468、482、483、485、491、498、499、500、502、505、514、519、526、531、534、544、552、554、560及び571から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
配列番号8~11、16、17、31、32、45、53、60、68、69~71、92、112、114、119、120、221、228、237、263、286、287、362、373、376、379、382、388、412、416、460、468、482、483、485、491、498、499、500、502、505、514、519、526、531、534、544、552、554、560及び571から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態52に記載の単離ポリペプチド。
実施形態70
実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
実施形態71
治療を必要とする対象の心血管病態を治療するための方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載の単離ポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
治療を必要とする対象の心血管病態を治療するための方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載の単離ポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態72
前記心血管病態が心不全である、実施形態71に記載の方法。
前記心血管病態が心不全である、実施形態71に記載の方法。
実施形態73
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、実施形態72に記載の方法。
前記心不全が駆出率の低下した心不全である、実施形態72に記載の方法。
実施形態74
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、実施形態72に記載の方法。
前記心不全が駆出率の保持された心不全である、実施形態72に記載の方法。
実施形態75
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態72に記載の方法。
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態72に記載の方法。
実施形態76
前記心不全が急性心不全である、実施形態72に記載の方法。
前記心不全が急性心不全である、実施形態72に記載の方法。
実施形態77
前記心血管病態が高血圧である、実施形態71に記載の方法。
前記心血管病態が高血圧である、実施形態71に記載の方法。
実施形態78
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善する方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記対象の心収縮性が投与後に改善する、前記方法。
心血管病態を有する対象の心収縮性を改善する方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記対象の心収縮性が投与後に改善する、前記方法。
実施形態79
前記心血管病態が心不全である、実施形態78に記載の方法。
前記心血管病態が心不全である、実施形態78に記載の方法。
実施形態80
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態79に記載の方法。
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態79に記載の方法。
実施形態81
dP/dtmax及び/または駆出率が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて増加する、実施形態71~80のいずれか1つに記載の方法。
dP/dtmax及び/または駆出率が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて増加する、実施形態71~80のいずれか1つに記載の方法。
実施形態82
収縮期または拡張期機能が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて改善する、実施形態71~80のいずれか1つに記載の方法。
収縮期または拡張期機能が前記ポリペプチドの投与後に前記対象にて改善する、実施形態71~80のいずれか1つに記載の方法。
実施形態83
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させる方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記駆出率が前記ポリペプチドの投与後に増加する、前記方法。
心血管病態を有する対象の駆出率を増加させる方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記駆出率が前記ポリペプチドの投与後に増加する、前記方法。
実施形態84
前記心血管病態が心不全である、実施形態83に記載の方法。
前記心血管病態が心不全である、実施形態83に記載の方法。
実施形態85
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態84に記載の方法。
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態84に記載の方法。
実施形態86
心血管病態を有する対象の収縮期または拡張期機能を改善する方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
心血管病態を有する対象の収縮期または拡張期機能を改善する方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態87
前記心血管病態が心不全である、実施形態86に記載の方法。
前記心血管病態が心不全である、実施形態86に記載の方法。
実施形態88
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態87に記載の方法。
前記心不全が慢性収縮期心不全または慢性拡張期心不全である、実施形態87に記載の方法。
実施形態89
治療を必要とする患者の心機能不全を治療する方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記患者に投与することを含む、前記方法。
治療を必要とする患者の心機能不全を治療する方法であって、実施形態1~69のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記患者に投与することを含む、前記方法。
実施形態90
前記心機能不全が駆出率の低下した心機能不全である、実施形態89に記載の方法。
前記心機能不全が駆出率の低下した心機能不全である、実施形態89に記載の方法。
実施形態91
前記心機能不全が駆出率の保持された心機能不全である、実施形態89に記載の方法。
前記心機能不全が駆出率の保持された心機能不全である、実施形態89に記載の方法。
実施形態92
前記心機能不全が慢性収縮期心機能不全または慢性拡張期心機能不全である、実施形態89に記載の方法。
前記心機能不全が慢性収縮期心機能不全または慢性拡張期心機能不全である、実施形態89に記載の方法。
前述の説明及び以下の実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するようにみなされるべきではない。
実施例1.修飾アペリンポリペプチドの調製
APJアゴニストとして作用し得るポリペプチドを調製した。これらのポリペプチドを、以下の実施例に詳述するように、効力及び代謝安定性に関してスクリーニングした。配列は、ペプチドの親和性、機能活性または安定性を維持または改善しつつ、1つまたは複数のアミノ酸を変更し得る当該技術分野にて知られている技術により最適化した。Nishizawa et al.,Peptide Science 37:151-157,2001;Murza et al.,Chem MeD Chem.,7:318-325,2012。
APJアゴニストとして作用し得るポリペプチドを調製した。これらのポリペプチドを、以下の実施例に詳述するように、効力及び代謝安定性に関してスクリーニングした。配列は、ペプチドの親和性、機能活性または安定性を維持または改善しつつ、1つまたは複数のアミノ酸を変更し得る当該技術分野にて知られている技術により最適化した。Nishizawa et al.,Peptide Science 37:151-157,2001;Murza et al.,Chem MeD Chem.,7:318-325,2012。
種々の非標準アミノ酸を修飾アペリンポリペプチドの調製に使用した。これらのアミノ酸のいくつかは、商業的に入手可能である。修飾アペリンポリペプチドの合成に使用することができる、ある特定の非標準アミノ酸を作製する方法について、以下に記載する。
化合物1の調製
温度計を取り付けた三口フラスコ中の-10℃のTHF(50mL)中の(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-(1,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)グアニジノ)ヘキサン酸(6.95g、11.4mmol)の攪拌溶液に4-メチルモルホリン(1.25mL、11.4mmol)及びクロロギ酸エチル(1.09mL、11.4mmol)を加えた。混合物を-10℃で10分間攪拌した。水素化ホウ素ナトリウム(1.29g、34.1mmol)を加え、反応混合物を0℃まで加温した。次いで、メタノール(50mL)を0℃にて滴下漏斗を通してゆっくりと30分かけて添加した。次いで、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチルでもう一回抽出した。合わせた有機層を5%クエン酸水溶液、重炭酸ナトリウム飽和水溶液、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(50~100%EtOAc/ヘプタンのグラジエント)によって精製して1(4.68g、収率69%)を白色固体として得た。LC/MS(ESI-)m/z=597.3(M+H)+.
温度計を取り付けた三口フラスコ中の-10℃のTHF(50mL)中の(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-(1,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)グアニジノ)ヘキサン酸(6.95g、11.4mmol)の攪拌溶液に4-メチルモルホリン(1.25mL、11.4mmol)及びクロロギ酸エチル(1.09mL、11.4mmol)を加えた。混合物を-10℃で10分間攪拌した。水素化ホウ素ナトリウム(1.29g、34.1mmol)を加え、反応混合物を0℃まで加温した。次いで、メタノール(50mL)を0℃にて滴下漏斗を通してゆっくりと30分かけて添加した。次いで、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、5%クエン酸水溶液で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチルでもう一回抽出した。合わせた有機層を5%クエン酸水溶液、重炭酸ナトリウム飽和水溶液、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(50~100%EtOAc/ヘプタンのグラジエント)によって精製して1(4.68g、収率69%)を白色固体として得た。LC/MS(ESI-)m/z=597.3(M+H)+.
化合物2の調製
アルゴン下のDCM(50mL)中1(5.62g、9.42mmol)の氷冷溶液にデス-マーチンペルヨージナン(5.19g、12.2mmol)を加えた。氷浴を取り外し、混合物を3時間攪拌した。この混合物をジエチルエーテル(100mL)と重炭酸ナトリウム飽和水溶液(100mL)の混合物中に注ぎ、次いで、30分間激しく攪拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾過ケーキをジエチルエーテルで洗浄した。二相濾液を分離し、水層をジエチルエーテル(2×)で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して2を得た。これを更に精製することなく使用した。
アルゴン下のDCM(50mL)中1(5.62g、9.42mmol)の氷冷溶液にデス-マーチンペルヨージナン(5.19g、12.2mmol)を加えた。氷浴を取り外し、混合物を3時間攪拌した。この混合物をジエチルエーテル(100mL)と重炭酸ナトリウム飽和水溶液(100mL)の混合物中に注ぎ、次いで、30分間激しく攪拌した。得られた懸濁液を濾過し、濾過ケーキをジエチルエーテルで洗浄した。二相濾液を分離し、水層をジエチルエーテル(2×)で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して2を得た。これを更に精製することなく使用した。
化合物3の調製
DCM(50mL)中の2の0℃溶液にl-(-)-プロリン(2.71g、23.6mmol)及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(2.99g、14.1mmol)を加え、この混合物を室温に加温しながら一晩攪拌した。重炭酸ナトリウム飽和水溶液を加え、二相混合物が透明になるまで混合物を攪拌した。層を分離し、水層を9:1のDCM/MeOH(2×)で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(DCMからDCM中9%MeOH/1%AcOHのグラジエント)によって精製して(S)-1-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-(1,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)グアニジノ)ヘキシル)ピロリジン-2-カルボン酸(3、2.14g、1からの収率33%)を白色固体として得た。LC/MS(ESI-)m/z=694.4(M+H)+.
DCM(50mL)中の2の0℃溶液にl-(-)-プロリン(2.71g、23.6mmol)及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(2.99g、14.1mmol)を加え、この混合物を室温に加温しながら一晩攪拌した。重炭酸ナトリウム飽和水溶液を加え、二相混合物が透明になるまで混合物を攪拌した。層を分離し、水層を9:1のDCM/MeOH(2×)で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(DCMからDCM中9%MeOH/1%AcOHのグラジエント)によって精製して(S)-1-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-(1,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)グアニジノ)ヘキシル)ピロリジン-2-カルボン酸(3、2.14g、1からの収率33%)を白色固体として得た。LC/MS(ESI-)m/z=694.4(M+H)+.
化合物5の調製
DCM(40mL)中のN,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩(0.97g、9.90mmol)とトリエチルアミン(1.38mL、9.90mmol)の攪拌混合物にN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.04g、9.90mmol)及びfmoc-lys(boc)-OH(4.22g、9.00mmol)加えた。反応混合物を室温で2.5時間攪拌した。反応混合物を-20℃に冷却し、濾過した。回収した固体を冷DCMで洗浄し、これを捨てた。濾液を重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をヘプタン中10%~75%EtOAcで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチルtert-ブチル(6-(メトキシ(メチル)アミノ)-6-オキソヘキサン-1,5-ジイル)ジカルバメート(5、4.31g、収率91%)を油状物として得た。LC/MS(ESI-)m/z=534.2(M+Na)+.
DCM(40mL)中のN,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩(0.97g、9.90mmol)とトリエチルアミン(1.38mL、9.90mmol)の攪拌混合物にN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.04g、9.90mmol)及びfmoc-lys(boc)-OH(4.22g、9.00mmol)加えた。反応混合物を室温で2.5時間攪拌した。反応混合物を-20℃に冷却し、濾過した。回収した固体を冷DCMで洗浄し、これを捨てた。濾液を重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をヘプタン中10%~75%EtOAcで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチルtert-ブチル(6-(メトキシ(メチル)アミノ)-6-オキソヘキサン-1,5-ジイル)ジカルバメート(5、4.31g、収率91%)を油状物として得た。LC/MS(ESI-)m/z=534.2(M+Na)+.
化合物6の調製
0℃のTHF(9mL)中の(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチルtert-ブチル(6-(メトキシ(メチル)アミノ)-6-オキソヘキサン-1,5-ジイル)ジカルバメート(5、886mg、1.73mmol)の溶液に水素化リチウムアルミニウム(THF中1.0M溶液、3.29mL、3.29mmol)を滴加した。この混合物を45分間攪拌した後、1M硫酸水素カリウム水溶液を慎重に添加することによって0℃にてクエンチした。得られた二相混合物を分離し、水層を酢酸エチル(1×)で抽出した。合わせた抽出物を水(1x)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(6)を油状物として得た。この物質を更に精製することなく次の工程に用いた。
0℃のTHF(9mL)中の(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチルtert-ブチル(6-(メトキシ(メチル)アミノ)-6-オキソヘキサン-1,5-ジイル)ジカルバメート(5、886mg、1.73mmol)の溶液に水素化リチウムアルミニウム(THF中1.0M溶液、3.29mL、3.29mmol)を滴加した。この混合物を45分間攪拌した後、1M硫酸水素カリウム水溶液を慎重に添加することによって0℃にてクエンチした。得られた二相混合物を分離し、水層を酢酸エチル(1×)で抽出した。合わせた抽出物を水(1x)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(6)を油状物として得た。この物質を更に精製することなく次の工程に用いた。
化合物7の調製
(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(化合物6)をDCM(4mL)中に溶解し、0℃に冷却した。DCM(1mL)中の2-アミノ酢酸アリル(0.20g、1.73mmol)の溶液を滴加し、続いてトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(0.44g、2.08mmol)を滴加した。この混合物を0℃にて1時間攪拌した後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチした。得られた二相混合物を分離し、水層をDCM(1×)で抽出した。合わせた有機抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー(50~100%EtOAc/ヘプタンのグラジエント)によって精製して(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(7、0.51g、2つの工程の収率54%)を油状物として得た。LC/MS(ESI-)m/z=552.2(M+H)+.
(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(化合物6)をDCM(4mL)中に溶解し、0℃に冷却した。DCM(1mL)中の2-アミノ酢酸アリル(0.20g、1.73mmol)の溶液を滴加し、続いてトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(0.44g、2.08mmol)を滴加した。この混合物を0℃にて1時間攪拌した後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチした。得られた二相混合物を分離し、水層をDCM(1×)で抽出した。合わせた有機抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー(50~100%EtOAc/ヘプタンのグラジエント)によって精製して(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(7、0.51g、2つの工程の収率54%)を油状物として得た。LC/MS(ESI-)m/z=552.2(M+H)+.
化合物8の調製
アルゴン下のDCM(4mL)中の(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(7、0.51g、0.92mmol)の溶液にヒューニッヒ塩基(0.19mL、1.11mmol)及び二炭酸ジ-tert-ブチル(0.22g、1.02mmol)を加えた。この混合物を4時間攪拌し、水を加え、生成物をDCM(3×)中に抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(0~100%EtOAc/ヘプタンのグラジエント)によって精製して(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)アセテート(7、0.52g、収率86%)を油状物として得た。LC/MS(ESI-)m/z=674.2(M+Na)+.
アルゴン下のDCM(4mL)中の(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)アミノ)アセテート(7、0.51g、0.92mmol)の溶液にヒューニッヒ塩基(0.19mL、1.11mmol)及び二炭酸ジ-tert-ブチル(0.22g、1.02mmol)を加えた。この混合物を4時間攪拌し、水を加え、生成物をDCM(3×)中に抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(0~100%EtOAc/ヘプタンのグラジエント)によって精製して(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)アセテート(7、0.52g、収率86%)を油状物として得た。LC/MS(ESI-)m/z=674.2(M+Na)+.
化合物9の調製
DCM(5mL)中の(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)アセテート(8、0.52g、0.78mmol)の脱気溶液にテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(91mg、0.078mmol)及びフェニルシラン(0.19mL、1.57mmol)を加えた。この混合物にアルゴンを3分間スパージし、次いで、室温で2時間攪拌し、水を加え、生成物をDCM(2×)で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(0~10%MeOH/DCMグラジエント)によって精製して生成物を茶色固体として得た。次いで、この固体をDCM(10mL)中に溶解し、シリカボンドDMTシリカゲル(300重量%)とともに30℃で1時間攪拌することによって、有色の不純物を除去した。セライトを用いてシリカゲルを濾去し、濾液を減圧下で濃縮して(S)-2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)酢酸(9、0.36g、収率76%)を白色固体として得た。LC/MS(ESI-)m/z=634.2(M+Na)+.
DCM(5mL)中の(S)-アリル2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)アセテート(8、0.52g、0.78mmol)の脱気溶液にテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(91mg、0.078mmol)及びフェニルシラン(0.19mL、1.57mmol)を加えた。この混合物にアルゴンを3分間スパージし、次いで、室温で2時間攪拌し、水を加え、生成物をDCM(2×)で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(0~10%MeOH/DCMグラジエント)によって精製して生成物を茶色固体として得た。次いで、この固体をDCM(10mL)中に溶解し、シリカボンドDMTシリカゲル(300重量%)とともに30℃で1時間攪拌することによって、有色の不純物を除去した。セライトを用いてシリカゲルを濾去し、濾液を減圧下で濃縮して(S)-2-((2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-6-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキシル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)酢酸(9、0.36g、収率76%)を白色固体として得た。LC/MS(ESI-)m/z=634.2(M+Na)+.
化合物1bの調製
トルエン(150mL)中の市販の(1a)(6.0g、9.82mmol)、パラホルムアルデヒド(2.95g、29.5mmol)、4-メチルベンゼンスルホン酸一水和物(0.093g、0.491mmol)の懸濁液を75℃まで30分間加熱した。溶液を20℃まで冷却した後、5%NaHCO3(2×25mL)で抽出した。この有機物をMgSO4で乾燥させ、濾過した後、乾燥シリカ(10g)で減圧下にて濃縮した。次いで、この生成物を0~40%酢酸エチル/ヘプタンのグラジエントで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー(220g)によって精製して(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチル5-オキソ-4-(3-オキソ-3-(トリチルアミノ)プロピル)オキサゾリジン-3-カルボキシレート(1b、5.95g、収率97%)を白色固体として得た。m/z(APCI,pos.ion)645.2(M+Na).
トルエン(150mL)中の市販の(1a)(6.0g、9.82mmol)、パラホルムアルデヒド(2.95g、29.5mmol)、4-メチルベンゼンスルホン酸一水和物(0.093g、0.491mmol)の懸濁液を75℃まで30分間加熱した。溶液を20℃まで冷却した後、5%NaHCO3(2×25mL)で抽出した。この有機物をMgSO4で乾燥させ、濾過した後、乾燥シリカ(10g)で減圧下にて濃縮した。次いで、この生成物を0~40%酢酸エチル/ヘプタンのグラジエントで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー(220g)によって精製して(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチル5-オキソ-4-(3-オキソ-3-(トリチルアミノ)プロピル)オキサゾリジン-3-カルボキシレート(1b、5.95g、収率97%)を白色固体として得た。m/z(APCI,pos.ion)645.2(M+Na).
化合物1cの調製
20℃のCHCl3(30mL)中の(1b)(5.95g、9.56mmol)及びトリエチルシラン(5.56g、47.8mmol)の攪拌用液にトリフルオロ酢酸(30mL)を加えた。この溶液を40℃で18時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣を氷状AcOH(3×100mL)と共沸して(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチル5-オキソ-4-(3-オキソ-3-(トリチルアミノ)プロピル)オキサゾリジン-3-カルボキシレート(1c)を白色固体として得た。これを更に精製することなく次の工程に用いた。m/z(APCI,pos.ion)383.1(M+1).
20℃のCHCl3(30mL)中の(1b)(5.95g、9.56mmol)及びトリエチルシラン(5.56g、47.8mmol)の攪拌用液にトリフルオロ酢酸(30mL)を加えた。この溶液を40℃で18時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残渣を氷状AcOH(3×100mL)と共沸して(S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチル5-オキソ-4-(3-オキソ-3-(トリチルアミノ)プロピル)オキサゾリジン-3-カルボキシレート(1c)を白色固体として得た。これを更に精製することなく次の工程に用いた。m/z(APCI,pos.ion)383.1(M+1).
化合物1dの調製
氷状AcOH(40mL)中の(1c)(3.6g、9.41mmol)、トリフェニルメタノール(4.90g、18.83mmol)、無水酢酸(1.922g、18.83mmol)の攪拌懸濁液中に純硫酸(0.025ml、0.471mmol)を20℃で加えた。次いで、黄色がかった混合物を45℃まで加熱して溶液にし、18時間攪拌した。その後、反応物を冷水(200mL)とEtOAc(200mL)の間に分配した。有機物をMgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した後、生成物を10~30%の3:1酢酸エチル/エタノール(溶媒B)及びヘプタン(溶媒A)のグラジエントで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー(220g)によって精製して(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-5-オキソ-5-(トリチルアミノ)ペンタン酸(1d、3.85g、6.16mmol、収率65.5%)を白色発泡体として得た。m/z(APCI,pos.ion)647.2(M+Na).
氷状AcOH(40mL)中の(1c)(3.6g、9.41mmol)、トリフェニルメタノール(4.90g、18.83mmol)、無水酢酸(1.922g、18.83mmol)の攪拌懸濁液中に純硫酸(0.025ml、0.471mmol)を20℃で加えた。次いで、黄色がかった混合物を45℃まで加熱して溶液にし、18時間攪拌した。その後、反応物を冷水(200mL)とEtOAc(200mL)の間に分配した。有機物をMgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した後、生成物を10~30%の3:1酢酸エチル/エタノール(溶媒B)及びヘプタン(溶媒A)のグラジエントで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー(220g)によって精製して(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-5-オキソ-5-(トリチルアミノ)ペンタン酸(1d、3.85g、6.16mmol、収率65.5%)を白色発泡体として得た。m/z(APCI,pos.ion)647.2(M+Na).
また、ペプチド主鎖のN-メチル化についても、Scanlon et al.,Int.J.Pept.Res.Ther.2008,14,381-386またはBiron et al.,J.Peptide Sci.2006,12,213-219に従って直接実施した。簡潔に述べれば、樹脂に固定したペプチドをo-ニトロベンゼンスルホニルクロリド及び2,4,6-コリジンで処理し、続いて、メチルp-ニトロトリフレート及びMTBDで処理するか、またはトリフェニルホスフィン、DIAD及びメタノールで処理した。中間体o-ニトロベンゼンスルホンアミドをメルカプトエタノール及びDBUで処理することにより切断した。
固相ペプチド合成を用いた修飾アペリンポリペプチドの作製に関する更に詳細な説明を以下に示す。
ペプチド合成の実験方法
適切なオルソゴナル保護及び樹脂リンカー手順によるNα-Fmoc固相ペプチド合成(SPPS)法を用いて、Intavis MultiPep RSi自動ハイスループットペプチド合成装置によりペプチドを調製した。予め充填したFmoc-アミノ酸樹脂を用いて、ペプチドを0.1mmolスケールで合成した。10mLのフリット反応容器中にて、標準的な固相法を用いる段階的な添加によって、残りのアミノ酸を伸長中のペプチド鎖に加えた。ジメチルホルムアミド(DMF)中20%ピペリジン溶液の添加によって(1×5分、1×15分)、樹脂結合アミノ酸からNα-Fmoc基を除去した。カップリング反応は、ペプチド合成等級DMF中で5倍過剰のNα-Fmoc-アミノ酸、5倍過剰のジイスプロピルカルボジイミド(diisppropylcarbodiimide)(DIC)及び5倍過剰の1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)のプレ活性化(5分)により進行し、続いてペプチド-樹脂を加えた。ストック濃度は0.5Mアミノ酸、1M DIC、及び0.4M HOAtであった。樹脂混合物を1サイクル当たり60分間混合し、排出した。2カップリングサイクルを使用した場合は、Fmoc除去の前にカップリングサイクルを繰り返した。保護ペプチドの形成が完了したら、最後のNα-Fmoc保護基を上述の通りに除去した。アミノ酸カップリングのために、記載の通りにN末端アシル化を行った。3mLの10%無水酢酸及び0.5mLのDMF中1.25M DIEAを用いて、N末端アセチル化を1時間実施した。ペプチド主鎖残基を脂質化したペプチドは、まず2%TFA/5%TisのDCM溶液(5×10分)を用いてMttをLys(Mtt)残基からまず除去し、DCM中10%DIEAによるεアミンの中和(2×5分)、続いて、アミノ酸カップリングサイクルに関して上記したアシル化を行うことによって調製した。ペプチド-樹脂をDMF(4×)、DCM(6×)で洗浄し、切断の前に減圧下で完全に乾燥させた。
適切なオルソゴナル保護及び樹脂リンカー手順によるNα-Fmoc固相ペプチド合成(SPPS)法を用いて、Intavis MultiPep RSi自動ハイスループットペプチド合成装置によりペプチドを調製した。予め充填したFmoc-アミノ酸樹脂を用いて、ペプチドを0.1mmolスケールで合成した。10mLのフリット反応容器中にて、標準的な固相法を用いる段階的な添加によって、残りのアミノ酸を伸長中のペプチド鎖に加えた。ジメチルホルムアミド(DMF)中20%ピペリジン溶液の添加によって(1×5分、1×15分)、樹脂結合アミノ酸からNα-Fmoc基を除去した。カップリング反応は、ペプチド合成等級DMF中で5倍過剰のNα-Fmoc-アミノ酸、5倍過剰のジイスプロピルカルボジイミド(diisppropylcarbodiimide)(DIC)及び5倍過剰の1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)のプレ活性化(5分)により進行し、続いてペプチド-樹脂を加えた。ストック濃度は0.5Mアミノ酸、1M DIC、及び0.4M HOAtであった。樹脂混合物を1サイクル当たり60分間混合し、排出した。2カップリングサイクルを使用した場合は、Fmoc除去の前にカップリングサイクルを繰り返した。保護ペプチドの形成が完了したら、最後のNα-Fmoc保護基を上述の通りに除去した。アミノ酸カップリングのために、記載の通りにN末端アシル化を行った。3mLの10%無水酢酸及び0.5mLのDMF中1.25M DIEAを用いて、N末端アセチル化を1時間実施した。ペプチド主鎖残基を脂質化したペプチドは、まず2%TFA/5%TisのDCM溶液(5×10分)を用いてMttをLys(Mtt)残基からまず除去し、DCM中10%DIEAによるεアミンの中和(2×5分)、続いて、アミノ酸カップリングサイクルに関して上記したアシル化を行うことによって調製した。ペプチド-樹脂をDMF(4×)、DCM(6×)で洗浄し、切断の前に減圧下で完全に乾燥させた。
脱保護及び固体支持体からの切断の実験方法
各ペプチド-樹脂の5mLのトリフルオロ酢酸(TFA、87.5%)、トリイソプロピルシラン(Tis、5%)、水(2.5%)、アニソール(1%)及びチオアニソール(1%)の溶液を室温で2時間攪拌することによって、ペプチドを樹脂から切断した。粗製ペプチドTFA溶液を、Biotage Syro切断装置を用いる濾過によって、風袋を量った(tarred)50mLのコニカルチューブに移し、樹脂を5mLのTFA溶液で洗浄し、濾液を合わせた。合わせた濾液を50mLのポリプロピレン製コニカルチューブ中で2時間の真空遠心分離により濃縮し(Genevac HT-12)、粗製ペプチドを冷無水エチルエーテルによる沈殿によって回収し、白色~琥珀色の沈殿物を得た。50mLのコニカルチューブを3000RPMで4分間遠心分離し、エーテルをデカントし、沈殿物を別の冷エーテル50mLで洗浄し、遠心分離し、デカントし、次いで、減圧下で乾燥させ、分析的LCMS分析を行った。
各ペプチド-樹脂の5mLのトリフルオロ酢酸(TFA、87.5%)、トリイソプロピルシラン(Tis、5%)、水(2.5%)、アニソール(1%)及びチオアニソール(1%)の溶液を室温で2時間攪拌することによって、ペプチドを樹脂から切断した。粗製ペプチドTFA溶液を、Biotage Syro切断装置を用いる濾過によって、風袋を量った(tarred)50mLのコニカルチューブに移し、樹脂を5mLのTFA溶液で洗浄し、濾液を合わせた。合わせた濾液を50mLのポリプロピレン製コニカルチューブ中で2時間の真空遠心分離により濃縮し(Genevac HT-12)、粗製ペプチドを冷無水エチルエーテルによる沈殿によって回収し、白色~琥珀色の沈殿物を得た。50mLのコニカルチューブを3000RPMで4分間遠心分離し、エーテルをデカントし、沈殿物を別の冷エーテル50mLで洗浄し、遠心分離し、デカントし、次いで、減圧下で乾燥させ、分析的LCMS分析を行った。
粗製ペプチドの分析的分析法
粗製ペプチドをH2O中50%ACN(0.1%TFA)中に溶解し、0.45umのシリンジフィルターを用いて溶液を濾過した。H2O中50%ACN(0.1%TFA)にて10倍希釈物を作製することによって、LCMS分析用の粗製分析サンプルを調製した。Phenomenex Kinetex C18カラム(1.7μm、2.1×50mm)からの溶出による分析的LCMSによって、ペプチドを分析した。アセチル化ペプチドは、1000μL/分の流速で3分にわたる5~50%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。PEG化及び脂質化ペプチドは、1000μL/分の流速で3分にわたる20~65%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。
粗製ペプチドをH2O中50%ACN(0.1%TFA)中に溶解し、0.45umのシリンジフィルターを用いて溶液を濾過した。H2O中50%ACN(0.1%TFA)にて10倍希釈物を作製することによって、LCMS分析用の粗製分析サンプルを調製した。Phenomenex Kinetex C18カラム(1.7μm、2.1×50mm)からの溶出による分析的LCMSによって、ペプチドを分析した。アセチル化ペプチドは、1000μL/分の流速で3分にわたる5~50%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。PEG化及び脂質化ペプチドは、1000μL/分の流速で3分にわたる20~65%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。
精製の概括的方法
YMC Triart C18カラム(5um、30×250mm)からの溶出による分取逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって、ペプチドを精製した。典型的な方法は、平衡条件での4分間の保持、続いて、40mL/分で56分にわたるアセトニトリル/H2O(0.1%TFA)の0.333%増加の直線勾配から構成された。適切な生成物に相当する高純度のフラクションを回収し、合わせ、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して非晶質固体を得た。
YMC Triart C18カラム(5um、30×250mm)からの溶出による分取逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって、ペプチドを精製した。典型的な方法は、平衡条件での4分間の保持、続いて、40mL/分で56分にわたるアセトニトリル/H2O(0.1%TFA)の0.333%増加の直線勾配から構成された。適切な生成物に相当する高純度のフラクションを回収し、合わせ、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して非晶質固体を得た。
特性評価の概括的方法
Agilent1290 LC-MSシステムでのPhenomenex Max-RPカラム(2.5μm、2.0×50mm)からの溶出によって、精製した生成物の純度及びMW検証について分析した。アセチル化ペプチドは、700μL/分の流速で10分にわたる5~50%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。PEG化及び脂質化ペプチドは、700μL/分の流速で10分にわたる20~65%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。化学発光窒素検出器(CLND)によりペプチドを定量化した。214nMでの純度が95%以上であり、理論的質量が観察されたペプチドをデータベースに登録し、以下の実施例に記載する更なるインビトロ及びインビボ特性評価にまわした。
Agilent1290 LC-MSシステムでのPhenomenex Max-RPカラム(2.5μm、2.0×50mm)からの溶出によって、精製した生成物の純度及びMW検証について分析した。アセチル化ペプチドは、700μL/分の流速で10分にわたる5~50%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。PEG化及び脂質化ペプチドは、700μL/分の流速で10分にわたる20~65%ACN/H2O(0.1%TFA)の直線勾配を用いて、特性評価した。化学発光窒素検出器(CLND)によりペプチドを定量化した。214nMでの純度が95%以上であり、理論的質量が観察されたペプチドをデータベースに登録し、以下の実施例に記載する更なるインビトロ及びインビボ特性評価にまわした。
Aは、脂肪族アシル基を表し、Rは、カルボン酸、アミン、ヒドロキシル、エステル、アルケン、アルキンまたはメチルである。Bは、酸性度及び溶解度のためのγGlu(α-カルボキシ-4-アミノ酪酸;AC4Abu)を表す。Cは、柔軟性及び溶解度のための[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-酢酸(Aeea)などの短いPEG基である。Xは、アペリンポリペプチドへの共有結合点である。独立してまたは共に、構成要素B及びCは、結合リンカーを含む。結合リンカーは、半減期延長を達成するのに重要ではなく、アペリンポリペプチドの固有のAPJアゴニスト活性に寄与しないが、脂肪族アシル半減期延長部分とアペリンポリペプチドとの間で空間的、機能的及び/または構造的役割を果たす。この点において、結合リンカーは、不在であってもよいし、脂肪族アシル半減期延長基の共有結合を達成する任意の他の部分と置き換えてもよい。
脂肪酸は、N末端またはアペリンプレタンパク質(配列番号2)中の70若しくは71番目の位置に該当するアミノ酸またはペプチド中の他の部位に共有結合される。脂肪族アシル基は、ポリペプチドに直接結合されてもよいし、AEEA(小さなPEG基)、AEEA-AEEA、γGlu-AEEA、γGlu-AEEA-AEEA、γGluまたは他のアミノ酸などのスペーサーによって結合されてもよい。脂肪酸のアルキル鎖は、典型的に、2~24個のメチレン単位から構成される。
この手法に従って、種々の修飾アペリンポリペプチドを複数の異なる脂肪族アシル基に結合させ、得られた脂質化ポリペプチドのAPJ受容体アゴニスト活性を実施例3及び10に記載するように試験した。以下に記載する及び本明細書に記載する配列のアペリンポリペプチドは、結合を含まない(例えば、脂肪族アシル基への結合を含まない)ものでもAPJアゴニストとして機能し得ることに留意されたい。
実施例3.修飾アペリンポリペプチドのAPJアゴニスト活性APJ受容体の内因性リガンドであるpyrアペリン-13(配列番号6)と比較して、効力及び代謝安定性を最適化するために、800を超える修飾ペプチドを構造活性相関アッセイに使用した。陽性対照として使用するpyrアペリン-13とともに、化合物を10μMまでスクリーニングした。全てのSARアッセイにおいて機能活性を示した化合物を陽性とみなし、再度スクリーニングした。反復プロセスを継続し、最適化のためにペプチドを更に変更した。
以下に記載する異なる2つのアッセイを使用して、修飾アペリンポリペプチドのAPJアゴニスト活性を評価した。cAMPアッセイは、APJ受容体の活性化によってもたらされる細胞内のcAMP変化を測定することを伴う。内因性リガンドpyr-アペリンによるAPJ受容体の活性化は、細胞内cAMPの減少をもたらす。2つ目のアッセイは、GTPγSアッセイであり、アゴニストに結合したときのAPJ受容体とGタンパク質との結合を測定する。したがって、cAMP濃度の減少量及びアゴニスト受容体複合体に結合したGタンパク質の有効性を用いて、修飾アペリンポリペプチドのアゴニスト活性の程度を評価する。
cAMPアッセイ
ヒトまたはラットAPJ受容体を発現する安定したCHO細胞株を、種々の濃度のペプチドの不存在下または存在下で、HANK緩衝液、フォルスコリン及び0.5mM IBMXを含有する刺激用緩衝液とともに37℃で45分間インキュベートした。環状AMPキット(Cisbio cAMPキット)を製造者の説明書に従って用いて、cAMP濃度を決定した。
ヒトまたはラットAPJ受容体を発現する安定したCHO細胞株を、種々の濃度のペプチドの不存在下または存在下で、HANK緩衝液、フォルスコリン及び0.5mM IBMXを含有する刺激用緩衝液とともに37℃で45分間インキュベートした。環状AMPキット(Cisbio cAMPキット)を製造者の説明書に従って用いて、cAMP濃度を決定した。
[35S]GTPγSアッセイ
受容体に結合したGTPγSについて評価するために、ヒトまたはラットAPJ受容体を発現する安定した細胞株から膜を調製し、非加水分解性GTP(GTPγS)に結合した受容体を用いて修飾ペプチドの有効性/効力を決定した。アッセイ緩衝液中のGDP、MgCl2及びNaClの濃度の最適実験条件を最初に決定した。アッセイ緩衝液中で、膜と修飾ペプチドをともにインキュベートした。ペプチドの不存在下または存在下で、[35S]GTPγSを添加することによって反応を開始し、室温で90分間インキュベートした。過剰な冷GTPγSの存在下で、非特異的結合を特定すると、常に結合全体の0.2%未満であった。結合した[35S]GTPγSを濾過によって遊離放射標識から分離した。フィルターに結合した放射能を液体シンチレーション計測によって決定した。種々の修飾アペリンポリペプチドに関するGTPγSアッセイの結果を以下の表11に示す。EC50値は、ヒト及びラットAPJ受容体の活性化に関して、それぞれの修飾ポリペプチドについて記載する。
受容体に結合したGTPγSについて評価するために、ヒトまたはラットAPJ受容体を発現する安定した細胞株から膜を調製し、非加水分解性GTP(GTPγS)に結合した受容体を用いて修飾ペプチドの有効性/効力を決定した。アッセイ緩衝液中のGDP、MgCl2及びNaClの濃度の最適実験条件を最初に決定した。アッセイ緩衝液中で、膜と修飾ペプチドをともにインキュベートした。ペプチドの不存在下または存在下で、[35S]GTPγSを添加することによって反応を開始し、室温で90分間インキュベートした。過剰な冷GTPγSの存在下で、非特異的結合を特定すると、常に結合全体の0.2%未満であった。結合した[35S]GTPγSを濾過によって遊離放射標識から分離した。フィルターに結合した放射能を液体シンチレーション計測によって決定した。種々の修飾アペリンポリペプチドに関するGTPγSアッセイの結果を以下の表11に示す。EC50値は、ヒト及びラットAPJ受容体の活性化に関して、それぞれの修飾ポリペプチドについて記載する。
実施例4.アペリンポリペプチドによる心機能の改善
ペプチドの血行動態学的心機能を評価するために、ランゲンドルフ単離心臓法を使用した。ラットから単離した心臓は、生化学的、代謝的、形態学的及び生理学的指標を含み得る、広範な測定値を提供する。この方法は神経ホルモンの影響、神経調節及び高い冠状血流量を欠くが、この方法の利点は、体循環及び多数の末梢相互作用を伴わずに直接的な心作用を研究できることである。この方法は、優れた用量反応関係を提供し得、目的分子の薬理学的及び生理学的特性に重要な洞察を与える。
ペプチドの血行動態学的心機能を評価するために、ランゲンドルフ単離心臓法を使用した。ラットから単離した心臓は、生化学的、代謝的、形態学的及び生理学的指標を含み得る、広範な測定値を提供する。この方法は神経ホルモンの影響、神経調節及び高い冠状血流量を欠くが、この方法の利点は、体循環及び多数の末梢相互作用を伴わずに直接的な心作用を研究できることである。この方法は、優れた用量反応関係を提供し得、目的分子の薬理学的及び生理学的特性に重要な洞察を与える。
動物に用量50~100mg/kgのペントバルビタールナトリウムを腹腔内経路にて投与して麻酔をかけた。心臓を取り出し、傷をつけないように指の間にそっと持ち、次にわずかに持ち上げた後、大動脈、大静脈及び肺血管を切開した。大動脈を残した心臓を切り出した後すぐに、心臓をランゲンドルフ装置のカニューレに大動脈を介して取り付けた。37℃にて95%O2/5%CO2で平衡させたpH7.5の改変酸素化Krebs-Henseleit緩衝液を用いて心臓を灌流した。灌流を10ml/分の一定流量で実施し、300bpmで拍動させた。左心室腔内に挿入した圧力検出バルーンカテーテルにより圧力を測定した。心臓の内在収縮性(筋収縮力)及び拡張性(心臓弛緩)作用をdp/dtmax及びdp/dtminにより評価した。
ランゲンドルフ単離心臓法にて、以下のポリペプチドの心機能に対する作用を試験した。
アセチル-[hArg][r]Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号16)
アセチル-Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号53)
図4A~D及び5A~Dは、単離したラット灌流心臓にて、それぞれ配列番号16及び配列番号53のペプチドによる収縮及び拡張の両機能の用量依存的改善を示している。
アセチル-[hArg][r]Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号16)
アセチル-Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号53)
図4A~D及び5A~Dは、単離したラット灌流心臓にて、それぞれ配列番号16及び配列番号53のペプチドによる収縮及び拡張の両機能の用量依存的改善を示している。
実施例5.アペリンポリペプチドによる、心不全を有するラットの心機能の改善
修飾アペリンポリペプチドの心臓血管作用を評価するために、MI(心筋梗塞)誘発性心不全を有するラットにポリペプチドを投与した。Millar PVループシステムにより心機能を評価した。
修飾アペリンポリペプチドの心臓血管作用を評価するために、MI(心筋梗塞)誘発性心不全を有するラットにポリペプチドを投与した。Millar PVループシステムにより心機能を評価した。
2~3月齢の雄のLewisラットを実験に用いた。左前下行枝冠動脈(LAD)の結紮によってMIを誘発した。動物の採用ためにMI後1週間で心エコー検査を行った。駆出率(EF)が40%を超え、かつ心エコー検査画像から梗塞が特定されない場合は、当該動物を実験から除外した。心血管血行動態学的評価のために、Millar PVループカテーテルを右総頸動脈に挿入し、次いで左心室(LV)に進めた。末梢血圧をモニタリングするために、動脈圧カテーテルを大腿動脈に挿入した。MIの誘発から6~7週後に実験を実施した。次のアペリンポリペプチドを種々の用量で頸静脈を介して静脈内投与した。
Pyr-アペリン:{水素}[PE]RPRLSHKGPMPF{COOH}(配列番号6)
{アセチル-NH}[NPeg11]QRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{COOH}(配列番号109)
アセチル-[hArg][r]Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号16)
Pyr-アペリン:{水素}[PE]RPRLSHKGPMPF{COOH}(配列番号6)
{アセチル-NH}[NPeg11]QRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{COOH}(配列番号109)
アセチル-[hArg][r]Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号16)
ペプチドを30分間、各用量で連続注入した。実験終了後、梗塞の大きさを肉眼形態で検証した。図6~8は、これらの実験の結果を示す。梗塞の大きさ(LVの38~39%)は、群間で極めて類似した。結果は、MIラットにおける連続注入後のpyr-アペリン-13(配列番号6;図6A~D)及び修飾類似体(配列番号109及び16;それぞれ図7A~D及び8A~D)の血行動態学的機能に対する用量依存的作用を示している。ベースラインを上回る収縮性(dp/dt max)、駆出率(EF)、平均動脈圧(MAP)及び心拍数(HR)の変化が各ポリペプチドの注入期間30分の終了時に報告されている。
実施例6.修飾アペリンポリペプチドの薬物動態プロファイル
いくつかのPEG化及び脂質化アペリンポリペプチドについて、ラットにおけるインビボ薬物動態学プロファイルの評価を行った(図9及び10A~B)。アペリンポリペプチドをSprague-Dawleyラットに皮下(SC)投与により投与し、その後、各ポリペプチドの薬物動態学プロファイルを評価した。最終用量が0.5mg/kgまたは5mg/kgになるように、アペリンペプチドを含有するPBS緩衝溶液を頸静脈を介してラットに投与した。24時間かけて採取した血液サンプルを、EDTAカリウムを入れた採血管に移し、処理まで氷上保管した。遠心分離により血液から血漿を得た。96ウェル容器に移した後、血漿サンプルを約-80℃に維持した凍結機内に保管した。ラット血漿サンプル中のアペリンポリペプチドの定量分析を、LC-MS/MSシステムを多重反応モニタリング(MRM)モードで用いて行った。
いくつかのPEG化及び脂質化アペリンポリペプチドについて、ラットにおけるインビボ薬物動態学プロファイルの評価を行った(図9及び10A~B)。アペリンポリペプチドをSprague-Dawleyラットに皮下(SC)投与により投与し、その後、各ポリペプチドの薬物動態学プロファイルを評価した。最終用量が0.5mg/kgまたは5mg/kgになるように、アペリンペプチドを含有するPBS緩衝溶液を頸静脈を介してラットに投与した。24時間かけて採取した血液サンプルを、EDTAカリウムを入れた採血管に移し、処理まで氷上保管した。遠心分離により血液から血漿を得た。96ウェル容器に移した後、血漿サンプルを約-80℃に維持した凍結機内に保管した。ラット血漿サンプル中のアペリンポリペプチドの定量分析を、LC-MS/MSシステムを多重反応モニタリング(MRM)モードで用いて行った。
一連の20kDaのPEG化ペプチドに関するインビボ薬物動態をSprague-Dawleyラットで調査した。アペリンポリペプチドの配列は試験したペプチド間で異なったが、PEGポリマー(20kDa PEG)は一定であった。血漿中濃度/曝露量は、ペプチドの固有の代謝安定性によって調節することができる。図9に示すように、ペプチド配列番号103を用いると、他の20kDa PEG化アペリンペプチドの10分の1の用量で、高血漿中濃度が達成された。
薬物動態学実験に用いたPEG化アペリンポリペプチドの配列を以下に示す。
{アセチル}[Atz(20-mPEG)]KFRRQRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{COOH}(配列番号105)
{アセチル-NH}[Pra](20K-mPEGReg)OF[hArg][hArg]QRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号107)
{アセチル-NH}[Pra](20K-mPEGReg)OF[hArg][hArg]QRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[pI-Phe]{COOH}(配列番号108)
{H2}[3TP](20K-mPEGReg)[hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号103)
{アセチル}[Atz(20-mPEG)]KFRRQRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{COOH}(配列番号105)
{アセチル-NH}[Pra](20K-mPEGReg)OF[hArg][hArg]QRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号107)
{アセチル-NH}[Pra](20K-mPEGReg)OF[hArg][hArg]QRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[pI-Phe]{COOH}(配列番号108)
{H2}[3TP](20K-mPEGReg)[hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号103)
一連の脂質化ペプチドに関するインビボ薬物動態をSprague-Dawleyラットで調査した。実験の第1セットにおいて、脂肪族アシル基(トリデカノイル、ペンタデコニル(Pentadeconyl)、ヘプタデコニル(Heptadeconyl)及びオクタデカンジオイル)は試験したペプチド間で異なったが、ペプチド配列は同じとした。図10Aに示すように、血漿中濃度/曝露量は、脂肪族アシル基の長さ及び組成により調節することができる。実験の第1セットにて使用したペプチドのそれぞれの構造を以下に示す。
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号261)
{PDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号262)
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号263)
{ODDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号264)
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号261)
{PDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号262)
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号263)
{ODDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号264)
実験の第2セットでは、アペリンペプチドの配列はポリペプチド配列番号237、213、212及び261で異なる一方、脂肪族アシル基は、ポリペプチド配列番号237及び263とポリペプチド配列番号212、213及び261の間で異なっている。図10Bに示すように、血漿中濃度/曝露量は、ペプチドの固有の代謝安定性及び脂肪族アシル基によって調節することができる。
実験の第2セットにて使用したペプチドのそれぞれの構造を以下に示す。
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][q][hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[D-4ClF]{COOH}(配列番号237)
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号263)
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]RQRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号212)
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号261)
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][r]QRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号213)
実験の第2セットにて使用したペプチドのそれぞれの構造を以下に示す。
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][q][hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[D-4ClF]{COOH}(配列番号237)
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号263)
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]RQRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号212)
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号261)
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][r]QRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH}(配列番号213)
実施例7.マスト細胞脱顆粒に対する修飾アペリンポリペプチドの作用
ペプチドの潜在的免疫原性作用を特定するために、多数の修飾アペリンポリペプチドについて、マスト細胞脱顆粒を以下の通り測定した。マスト細胞脱顆粒ペプチド(MCDP)及び化合物48/80を陽性対照として使用した。MCDPは、Alomone Labs(Israel)から入手した。化合物48/80は、Sigma(Saint Louis,MI)から入手した。ヒスタミンElisaキットをNEOGEN(Lexington,KY)から入手した。Tyrode緩衝液をSigma(#T2397)から入手した。
ペプチドの潜在的免疫原性作用を特定するために、多数の修飾アペリンポリペプチドについて、マスト細胞脱顆粒を以下の通り測定した。マスト細胞脱顆粒ペプチド(MCDP)及び化合物48/80を陽性対照として使用した。MCDPは、Alomone Labs(Israel)から入手した。化合物48/80は、Sigma(Saint Louis,MI)から入手した。ヒスタミンElisaキットをNEOGEN(Lexington,KY)から入手した。Tyrode緩衝液をSigma(#T2397)から入手した。
ラット腹腔マスト細胞
8週齢の雌のSprague DawleyまたはLewisラットからラット腹腔液をTyrode緩衝液中に採取した(Gillespieら、Histamine release from rat peritoneal mast cells:inhibition by colchicine and potentiation,1968;154-1)。腹腔マスト細胞のパーセンテージ(5~8%)をフローサイトメトリー及び免疫組織化学法(IHC)によって決定した。
8週齢の雌のSprague DawleyまたはLewisラットからラット腹腔液をTyrode緩衝液中に採取した(Gillespieら、Histamine release from rat peritoneal mast cells:inhibition by colchicine and potentiation,1968;154-1)。腹腔マスト細胞のパーセンテージ(5~8%)をフローサイトメトリー及び免疫組織化学法(IHC)によって決定した。
ヒトマスト細胞
ヒト成熟マスト細胞は、インビトロでの8~12週の分化/成熟プロセス後のCD34+末梢血前駆細胞から誘導した。CD34+末梢血細胞をAllCells(#MPB016F、ドナーID#:PCA1452A)から入手し、以下の培地中で8~12週間培養した。SFEM11 Stem Span無血清培地(#09655 StemCell
Technologies)、1×ペニシリン(100U/ml)及びストレプトマイシン(100ug/ml)(#15140-122、Life Technologies)、1×ゲンタマイシン/アンホテリシンB(Gibco#50-0640)、100ng/ml SCF(#300-07、PeproTech)、IL-3(最初の週のみ)(5ng/ml、#203-IL-050、R&D Systems)、IL-9(1~3週中)(15ng/ml、#209-IL-050、R&D Systems)、IL-6(5週以降)(50ng/ml、#206-IL-050、R&D Systems)及びIL-4(8週以降)(10ng/ml、#204-IL-050、R&D Systems)。マスト細胞の成熟は、フローサイトメトリー(>75%陽性)によるマスト細胞マーカーc-kit及びFcεRIの発現ならびにヒスタミン放出により確認した。
ヒト成熟マスト細胞は、インビトロでの8~12週の分化/成熟プロセス後のCD34+末梢血前駆細胞から誘導した。CD34+末梢血細胞をAllCells(#MPB016F、ドナーID#:PCA1452A)から入手し、以下の培地中で8~12週間培養した。SFEM11 Stem Span無血清培地(#09655 StemCell
Technologies)、1×ペニシリン(100U/ml)及びストレプトマイシン(100ug/ml)(#15140-122、Life Technologies)、1×ゲンタマイシン/アンホテリシンB(Gibco#50-0640)、100ng/ml SCF(#300-07、PeproTech)、IL-3(最初の週のみ)(5ng/ml、#203-IL-050、R&D Systems)、IL-9(1~3週中)(15ng/ml、#209-IL-050、R&D Systems)、IL-6(5週以降)(50ng/ml、#206-IL-050、R&D Systems)及びIL-4(8週以降)(10ng/ml、#204-IL-050、R&D Systems)。マスト細胞の成熟は、フローサイトメトリー(>75%陽性)によるマスト細胞マーカーc-kit及びFcεRIの発現ならびにヒスタミン放出により確認した。
マスト細胞脱顆粒の測定
マスト細胞(ヒトまたはラット)をTyrode緩衝液で洗浄し、96ウェルプレート(約2000マスト細胞/ウェル)に播種した。試験化合物の10段階希釈物をTyrode緩衝液で調製し、マスト細胞とともに37℃で30分間インキュベートした(0.005~30μM)。脂質化分子を試験する際には、アッセイ中の脂質化分子の可溶性を維持するために、Tyrode緩衝液中に、Croda社(Edison,NJ)の0.1%Tween80などの界面活性剤を含めてもよい。マスト細胞界面活性剤対照をマスト細胞Tyrode緩衝液対照と比較して、界面活性剤が脂質化分子の不在下でヒスタミン放出を誘発しないことを確かめる。ヒスタミン放出をプレートを氷上に5分間置くことによってクエンチした。細胞を350×g、4℃で5分間遠心分離にかけ、上清を回収した。キットの説明書に従って、ELISA(Neogen Corporation)により放出されたヒスタミンを定量した。簡潔に述べれば、直接競合ELISA反応を行った後、マイクロプレートリーダーで650nmの吸光度を測定し、試験サンプルを標準曲線と比較した。ヒスタミン放出パーセントを特定するために、細胞の総ヒスタミン含有量(0.1%Triton X-100)及び自然放出についても測定した。ヒスタミン放出パーセントを次式により算出した。
ヒスタミン放出%=(試験物によるヒスタミン放出ng/ml-Tyrode緩衝液中のヒスタミン自然放出ng/ml)/(0.1%TritonX-100中に溶解した細胞の総ヒスタミン含有量ng/ml-Tyrode緩衝液中のヒスタミン自然放出ng/ml)×100
マスト細胞(ヒトまたはラット)をTyrode緩衝液で洗浄し、96ウェルプレート(約2000マスト細胞/ウェル)に播種した。試験化合物の10段階希釈物をTyrode緩衝液で調製し、マスト細胞とともに37℃で30分間インキュベートした(0.005~30μM)。脂質化分子を試験する際には、アッセイ中の脂質化分子の可溶性を維持するために、Tyrode緩衝液中に、Croda社(Edison,NJ)の0.1%Tween80などの界面活性剤を含めてもよい。マスト細胞界面活性剤対照をマスト細胞Tyrode緩衝液対照と比較して、界面活性剤が脂質化分子の不在下でヒスタミン放出を誘発しないことを確かめる。ヒスタミン放出をプレートを氷上に5分間置くことによってクエンチした。細胞を350×g、4℃で5分間遠心分離にかけ、上清を回収した。キットの説明書に従って、ELISA(Neogen Corporation)により放出されたヒスタミンを定量した。簡潔に述べれば、直接競合ELISA反応を行った後、マイクロプレートリーダーで650nmの吸光度を測定し、試験サンプルを標準曲線と比較した。ヒスタミン放出パーセントを特定するために、細胞の総ヒスタミン含有量(0.1%Triton X-100)及び自然放出についても測定した。ヒスタミン放出パーセントを次式により算出した。
ヒスタミン放出%=(試験物によるヒスタミン放出ng/ml-Tyrode緩衝液中のヒスタミン自然放出ng/ml)/(0.1%TritonX-100中に溶解した細胞の総ヒスタミン含有量ng/ml-Tyrode緩衝液中のヒスタミン自然放出ng/ml)×100
合成的に修飾したアペリンポリペプチドは、インビトロでのヒスタミン放出の誘発において、広範な強さを示す。配列番号50~52は、陽性対照のMCDPと同程度の強さであるが、配列番号237及び6(pyr-アペリン-13)は、試験した最大濃度で不活性である。この表から配列番号237のポリペプチドがアッセイにてヒスタミン放出を誘発しないことが認められる。
実施例8.マスト細胞脱顆粒能を低減した修飾アペリンポリペプチド
実施例7に示したように、いくつかの修飾アペリンポリペプチドは、ラットマスト細胞からのヒスタミン放出を誘発する。これは、これらのポリペプチドが潜在的な免疫原性作用を有し得ることを示唆するものである。修飾ポリペプチドの構造と脱顆粒の誘発との間の関係をより完全に理解するために、また脱顆粒能を低減した更なるポリペプチドを創出するために、更なる構造活性相関(SAR)研究を実施した。実施例7に記載の方法を使用して、ラット及びヒトのマスト細胞からのヒスタミン放出誘発について、以下の表13の修飾アペリンポリペプチドを試験した。検出された細胞の総ヒスタミン含有量のうち誘発されたものが30%未満である化合物を本アッセイで陰性とした。
実施例7に示したように、いくつかの修飾アペリンポリペプチドは、ラットマスト細胞からのヒスタミン放出を誘発する。これは、これらのポリペプチドが潜在的な免疫原性作用を有し得ることを示唆するものである。修飾ポリペプチドの構造と脱顆粒の誘発との間の関係をより完全に理解するために、また脱顆粒能を低減した更なるポリペプチドを創出するために、更なる構造活性相関(SAR)研究を実施した。実施例7に記載の方法を使用して、ラット及びヒトのマスト細胞からのヒスタミン放出誘発について、以下の表13の修飾アペリンポリペプチドを試験した。検出された細胞の総ヒスタミン含有量のうち誘発されたものが30%未満である化合物を本アッセイで陰性とした。
マスト細胞の脱顆粒は、部分的には、ペプチド脱顆粒因子の物理的性質に関連した非免疫学的機構により生じることが提唱されている(Watt,A.P.Immunopharmacology,2002,9,421-434)。本修飾アペリンポリペプチドの場合、マスト細胞脱顆粒は、化合物の親油性及び形式電荷を小さくすることによって低減することができた。例えば、配列番号75~77、477及び526に記載する修飾ポリペプチドのように、アペリンプレタンパク質(配列番号2)中の63、64、66及び68番目の位置に該当するアミノ酸位置を酸性残基で置換することが可能であった。配列番号2の75番目の位置に該当するアミノ酸における脂肪族残基(例えば、Nle)及び配列番号2の77番目の位置に該当するアミノ酸における小さな芳香族残基(例えば、4-Cl-F)が好ましかった。アペリンポリペプチドのN末端におけるPEG化またはFcタンパク質複合体化(実施例11参照)により、アペリンポリペプチド自体と比較して、マスト細胞脱顆粒が低減した。例えば、配列番号92のアペリンポリペプチドは、ラットマスト細胞からのヒスタミン放出誘発に関して陽性であった。表13を参照されたい。しかしながら、この同じペプチドをPEG化するか(配列番号120のポリペプチド)、または免疫グロブリンFcドメインに結合する(実施例11の免疫グロブリン4)と、当該ペプチドは、ラットマスト細胞からのヒスタミン放出を誘発しなくなった。N末端アセチル化は、かなり良好な忍容性を示した。一般的に、脂質化ペプチドは、親油性が増加することから、より強力なマスト細胞脱顆粒因子となる傾向があった。形式電荷を更に小さくすることにより(約<1)、脂質化ペプチドについても同じく、脱顆粒を回避することができた。配列番号491のアペリンポリペプチドに関して示すように、より短い親油性の低い脂質ではマスト細胞脱顆粒活性がより小さくなった。
実施例9.安定性の向上した修飾アペリンポリペプチド
いくつかの修飾アペリンペプチドのインビトロにおける血漿、肝臓及び腎臓安定性の評価を行った。
いくつかの修飾アペリンペプチドのインビトロにおける血漿、肝臓及び腎臓安定性の評価を行った。
民間供給元から入手したラット血漿、肝臓ホモジネート及び腎臓ホモジネート中にアペリンペプチドを最終濃縮5μMとなるようにスパイクした。次いで、これらのサンプルを37℃で4時間にわたってインキュベートした。3つの異なるマトリクス中におけるインビトロ半減期の推定を容易にするために、最大8つの時点でサンプルを採取した。典型的な実験では、インキュベーションバイアルから100μLのサンプルのアリコートを採取し、続いて、内部標準を含有する300μLのMeOHを添加した。クエンチしたサンプルを室温で15分間ボルテックスにかけた後、5500gで15分間遠心分離した。次いで、上清を高分解能LC-MSにより分析した。4時間にわたる測定精密質量のフルスキャン質量データを親ペプチド濃度の推定に使用し、その後、そのデータを、血漿、肝臓及び腎臓中のインビトロ半減期の推定に使用した。インビトロにおける血漿、ラット及び腎臓安定性に関する結果を以下の表14に示す。
これらの安定性試験の結果に基づき、修飾アペリンポリペプチド内の代謝作用部位を特定し、これらの部位を代謝的により安定なアミノ酸で置換した。代謝を阻止するか、またはペプチダーゼによる認識を低減するために、非天然アミノ酸を化学合成により導入した。配列番号2中のアミノ酸66(NMeArg66)、68(NMeArg68)及び69(NMeLeu69)に該当する位置におけるN-メチルアミノ酸、配列番号2中のアミノ酸70(NhSerG70)に該当する位置におけるN-アルキルアミノ酸、ならびに配列番号2中のアミノ酸67(aMePro67)、69(aMeLeu69)、74(aMePro74)及び76(aMePro76)に該当する位置のα-メチルアミノ酸は、アペリンペプチド中のペプチダーゼの結合アクセスを立体阻害することができる。配列番号2中のアミノ酸64、65、66及び68に該当する位置におけるD-アミノ酸(r64、q65、r66、r68)ならびに配列番号2中のアミノ酸65、69、70、76及び77に該当する位置におけるβ-アミノ酸(BLeu65、BLeu69、BhSer70、BhPro76、D-BhPhe77)は、L-アミノ酸を含有する内因性ペプチドを切断するペプチダーゼの認識を回避することができる。例えば、配列番号2中のアミノ酸75に該当する位置におけるψ(CH2NH)-還元アミド結合アミノ酸(rNle75)は、アミド結合をより安定なアミン結合に置き換える。環状ペプチドは、エキソペプチダーゼによって認識されず、他のペプチダーゼによるアクセスを立体阻害する。天然配列中のメチオニン75(配列番号2に対するアミノ酸位置)における酸化代謝は、ノルロイシン75での置換によって回避された。配列番号2中のアミノ酸69、75及び77にそれぞれ該当する位置におけるNMeLeu、pI-Phe及びD-Bipの組み合わせは、特に安定なペプチドを提供した。脂質またはPEGとの複合体化は、ペプチドのインビトロ安定性を改善し、インビボクリアランスを減少させた。
ラットにおけるインビボ薬物動態学分析は、実施例6に記載する方法に従って、4つの脂質化アペリンペプチド(配列番号286、376、379及び382)に関して実施した。薬物動態学実験の結果を以下の表15にまとめる。
実施例10.効力が改善した修飾アペリンポリペプチド
いくつかの場合、安定性を向上させるためのアペリンポリペプチドの修飾は、APJ受容体を活性化するペプチドの効力を下げることになった。安定化したペプチドのAPJアゴニストの効力を改善するために、更なるSAR研究を実施した。実施例3に記載のGTPγSアッセイを使用して、APJアゴニスト活性について、以下の表16の修飾アペリンポリペプチドを試験した。EC50値は、ヒト及びラットAPJ受容体の活性化に関して、それぞれの修飾ポリペプチドについて記載する。
いくつかの場合、安定性を向上させるためのアペリンポリペプチドの修飾は、APJ受容体を活性化するペプチドの効力を下げることになった。安定化したペプチドのAPJアゴニストの効力を改善するために、更なるSAR研究を実施した。実施例3に記載のGTPγSアッセイを使用して、APJアゴニスト活性について、以下の表16の修飾アペリンポリペプチドを試験した。EC50値は、ヒト及びラットAPJ受容体の活性化に関して、それぞれの修飾ポリペプチドについて記載する。
ペプチドの効力及び有効性は、安定性のためにペプチド主鎖を改変しても、野生型アペリン-13配列(配列番号4)の側鎖の特徴を保持することによって得ることができることが結果により示されている。修飾ポリペプチドのN末端では、配列番号2のアミノ酸63~67に該当する位置における配列:hArg hArg Q hArg P(配列番号715)が良好な効力をもたらした。配列番号2のアミノ酸68及び69に該当する位置では、次の置換ペア:(i)NMeArgとaMeLeu、(ii)hArgとBLeu、(iii)hArgとaMeLeu、及び(iv)NMehArgとLが強力なアゴニストを提供した。配列番号2のアミノ酸70~73に該当する修飾ポリペプチド内の位置は置換の影響をあまり受けなかったが、BhSer70、NhSerG70、Y71及びNLysG72が忍容性を示した。配列番号2のアミノ酸74に該当する修飾ポリペプチド中のアミノ酸位置では、Oic及びaMeProが強力なペプチドを達成するのに好ましく、この位置のPipも同様に効力を改善する傾向があった。配列番号2のアミノ酸75に該当する修飾ポリペプチド中のアミノ酸位置では、NleまたはrNleが強力な化合物を与えた。C末端残基(配列番号2のアミノ酸76及び77に該当する位置)は、活性と安定性の両方に重要であった。アミノ酸76に該当する位置のBhPro、aMeProまたはAib及びアミノ酸77に該当する位置のD-BhPheまたは4-Cl-Fは、効力と安定性の良好なバランスをもたらした。N末端の脂質結合は、効力または有効性にあまり影響しなかった。PEG及びFc複合体(実施例11参照)は、DMSOに不溶であったため、インビトロアッセイは水性ストック溶液から実施した。DMSOの不在下において、GTPγSアッセイにおける効力及び有効性の測定値は、概して減少した。一方、同じ条件で行った[MerPr](10K-mPEGアセトアミドReg)-アペリン13(hAPJ EC50 0.21μM;rAPJ EC50 0.39μM)と比較して、修飾ポリペプチドのPEG及びFc複合体は、強力な完全APJアゴニストであった。
実施例11.免疫グロブリンFc-アペリンペプチド複合体
ヒトIgGの操作Fc領域への位置選択的結合に、本発明の4つの修飾アペリンポリペプチド(配列番号8~11)を用いた。ペプチドは、ペプチドのアミノ末端に結合されたブロモアセチル-NPeg11リンカーを介してFc領域に結合させた。リンカーのブロモアセトアミド部分をFcタンパク質中の遊離システイン残基と反応させることにより、チオエーテル共有結合を以下に示すように形成した。
ヒトIgGの操作Fc領域への位置選択的結合に、本発明の4つの修飾アペリンポリペプチド(配列番号8~11)を用いた。ペプチドは、ペプチドのアミノ末端に結合されたブロモアセチル-NPeg11リンカーを介してFc領域に結合させた。リンカーのブロモアセトアミド部分をFcタンパク質中の遊離システイン残基と反応させることにより、チオエーテル共有結合を以下に示すように形成した。
4つのペプチドの配列を表17に示す。ヒトIgG Fcタンパク質配列を以下に示す。
ヒトIgG Fc配列(配列番号716)
下線を付したCは、操作したシステインの位置及び修飾アペリンポリペプチドの共有結合点を示す。ホモ二量体において、C7-C7及びC10-C10は分子間ジスルフィドであるが、C42-C102及びC148-C206は分子内ジスルフィドである。
ヒトIgG Fc配列(配列番号716)
Fcタンパク質は、折り畳みされるとホモ二量体を形成することから、折り畳まれたタンパク質1つにつき操作システイン反応部位を2つ有する。各Fc-ホモ二量体複合体は、修飾アペリンポリペプチドの2つのコピーを含有するのが理想である。ラット及びヒトAPJ受容体の活性化における有効性について、GTPγSアッセイ(方法に関しては実施例3参照)により測定して複合体のそれぞれを評価した。複合体は、ラットマスト細胞からのヒスタミン放出誘発についても試験した(方法に関しては実施例7参照)。これらの実験の結果を以下の表18にまとめる。非複合体化ペプチドのデータについても比較のために示す。表の結果からみてわかるように、アペリンペプチドの複合体化は、APJ受容体を活性化するペプチドの抗力に有意に影響しなかった。加えて、いずれのFc-ペプチド複合体もラットマスト細胞からのヒスタミン放出を誘発しなかった。1つの場合において、Fc-複合体が非複合体化ペプチドのヒスタミン放出活性を排除した(Fc-ペプチド複合体#4参照)。
本明細書全体にわたり、種々の公開物、特許及び特許出願を参照してきた。これらの文献の開示全体を参照により本明細書に援用する。しかしながら、かかる文書への言及は、それらの文献が本出願に対する先行技術であるという承認と解釈されるべきではない。
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