JP2023526346A

JP2023526346A - 三環式化合物を含む組み合わせ及びｈｂｖ治療薬物の製造におけるその使用

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Publication number: JP2023526346A
Application number: JP2022570093A
Authority: JP
Inventors: 文▲強▼ ▲呉▼; ▲東▼ ▲張▼; 志▲強▼ ▲馬▼; ▲義▼▲シン▼ 周; ▲偉▼忠毛; 志▲ガン▼ 江; 静王; ▲海▼▲鷹▼ ▲賀▼
Original assignee: Fujian Akeylink Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Fujian Akeylink Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2023-06-21
Also published as: EP4151221A4; CN115515596A; WO2021228213A1; EP4151221A1; US20230190768A1

Abstract

三環式化合物を含む組み合わせ及びＨＢＶ治療薬物の製造におけるその使用に関し、前記組み合わせは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩と以下のａ～ｃのいずれかの群の薬物の組み合わせである：ａ、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤、ｂ、逆転写酵素阻害剤、ｃ、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤及び逆転写酵素阻害剤。【化１】TIFF2023526346000088.tif27168

Description

本出願は出願日が２０２０年５月１５日である中国特許出願ＣＮ２０２０１０４１２７６０．９、及び出願日が２０２０年１２月３１日である中国特許出願ＣＮ２０２０１１６３３３７３．４の優先権を主張する。本出願は上記の中国特許出願の全文を引用する。

［技術分野］
本発明は医薬組み合わせに関し、具体的には三環式構造を有する化合物又はその薬学的に許容される塩、及び任意選択でＢ型肝炎表面抗原阻害剤及び／又は逆転写酵素阻害剤の一つ又は二つを含む組み合わせ、及びＢ型肝炎治療薬物の製造における当該組み合わせの使用に関する。具体的には式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び任意選択でＢ型肝炎表面抗原阻害剤及び／又は逆転写酵素阻害剤の一つ又は二つを含む組み合わせ、及びＢ型肝炎治療薬物の製造における当該組み合わせの使用を開示する。

Ｂ型肝炎はＢ型肝炎ウイルスの侵入による炎症反応であり、肝臓の痛み、肝臓や脾臓の腫大、肝線維症などの一連の問題を引き起こす可能性があり、重症の場合は肝硬変、乃至は肝癌を引き起こす可能性がある。統計によると、世界にで約３億５０００万～４億人のＢ型肝炎ウイルスキャリアがあり、そのうち３分の１が中国にあり、中国ではＢ型肝炎による死亡者数は毎年５０万人に上る。

現段階では世界中でＢ型肝炎の特効薬は存在せず、中国のＢ型肝炎治療の第一選択薬は主にヌクレオシド系薬物、インターフェロン、漢方薬であるが、高価で根治できないなどの問題があるため、新規の抗Ｂ型肝炎薬物の開発が不可欠である。既存の薬物単剤療法は、薬剤耐性と治療効果が理想的ではない問題があり、Ｂ型肝炎治療薬物の併用、特に異なるメカニズムのＢ型肝炎薬物の併用は、研究のホットスポットと臨床使用の方向になる傾向がある。

特許ＷＯ２０１８１５３２８５Ａ１は、Ｂ型肝炎コアタンパク質阻害剤である式（Ｉ）の化合物及びその使用を開示し；ＷＯ２０１８２１４８７５Ａ１及びＷＯ２０１８１６１９６０Ａ１は、それぞれ式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物のＢ型肝炎表面抗原阻害剤及びその使用を開示した。現在臨床的に推奨されているヌクレオシド又はヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤には、エンテカビル、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩などがある。

国際公開第２０１８１５３２８５号国際公開第２０１８２１４８７５号国際公開第２０１８１６１９６０号

本発明は、異なるメカニズムの薬物の組み合わせ及び使用を通じて、相乗的にＨＢＶを治療する目的を達成することを意図する。

本発明は、医薬組み合わせを開示し、前記組み合わせは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び以下のａ～ｃの任意の群の医薬組み合わせである：
ａ、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤、
ｂ、逆転写酵素阻害剤、
ｃ、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤及び逆転写酵素阻害剤。

ここで、式（Ｉ）において、
Ｌ_１は単結合又はＣ_１－６アルキルであり、
Ｒ_１はＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、或いは任意選択で１、２又は３個のＲ_ａで置換されたＣ_１－３アルキルであり、
環Ａは、４～８員ヘテロシクロアルキル又はＣ_３－８シクロアルキルであり、
Ｒ_２はＨ及びＣ_１－３アルキルであり、
Ｒ_３はＨ及びＣ_１－３アルキルであり、
Ｒ_ａはそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ_２、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ_１－６アルキル又はＣ_１－６ヘテロアルキル、或いは任意選択で１、２又は３個のＲ’で置換されたＣ_１－６アルキル及びＣ_１－６ヘテロアルキルであり、
Ｒ’はそれぞれ独立してＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ_２、ＣＨ_３、ＣＮ及び－Ｎ（ＣＨ_３）_２から選択され、
前記４～８員ヘテロシクロアルキル及びＣ_１－６ヘテロアルキルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－及びＮから選択されるヘテロ原子又はヘテロ原子団を含む。

好ましくは、
ここで、Ｒ_ａはそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ_２、ＯＨ又はＣＮである。

ここで、環Ａは、５～６員ヘテロシクロアルキルである。

ここで、環Ａは、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル又はジオキサニルである。

ここで、環Ａは、

である。

ここで、Ｒ_１はＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、或いは任意選択で１、２又は３個のＲ_ａで置換されたＣＨ_３である。より好ましくは、ここで、Ｒ_１はＨ、Ｃｌ又はＣＨ_３である。

ここで、Ｒ_２はＨ又はＣＨ_３である。

Ｒ_３はＨ又はＣＨ_３である。

ここで、Ｌ_１は－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２ＣＨ_２－である。

一つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－１）で表される構造を有する：

ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＬ_１の定義は、上記と同じである。

本発明の特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、下記式の特定の化合物から選択される：

本発明のいくつかの態様において、上記の組み合わせにおいて、前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物のうちの一つ又はその薬学的に許容される塩から選択される。

ここで、
Ｒ_１はＨ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６ヘテロアルキル、Ｃ_２－５アルケニル、Ｃ_２－５ヘテロアルケニル、Ｃ_３－６シクロアルキル又は３～６員ヘテロシクロアルキルから選択される。
Ｒ_２はＨ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２、ハロゲンから選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－３アルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル又は３～６員ヘテロシクロアルキルから選択され、
Ｒ_３は任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－６アルキル、Ｃ_３－６シクロアルキルから選択され、
ｍは、０、１、２、３、４又は５から選択され、
ｍが０の場合、Ｒ_１はＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択されなく、
ＲはＨ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲ’で置換されたＣ_１－３アルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキルから選択され、
Ｒ’はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２、ＣＨ_３、ＣＨ_３ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｏ、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨ_２Ｆから選択され、
「ヘテロ」は、ヘテロ原子又はヘテロ原子団を表し、前記Ｃ_１－６ヘテロアルキル、Ｃ_２－５ヘテロアルケニル、３～６員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキルの「ヘテロ」は、それぞれ独立して－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、－Ｎ（Ｒ）－、－Ｃ（＝ＮＲ）－、－（Ｒ）Ｃ＝Ｎ－、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）－、－Ｓ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、Ｎ、－Ｏ－、－Ｓ－、＝Ｏ、＝Ｓ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）－から選択され、
上記の場合のいずれにおいても、ヘテロ原子又はヘテロ原子団の数は、それぞれ独立して１、２又は３から選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、上記の組み合わせにおいて、前記式（ＩＩ）の化合物は、下記式の化合物のうちの一つから選択される。

好ましくは、前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記の式（ＩＩａ）で表される構造を有し、

好ましくは、前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記の式（ＩＩｂ）で表される構造を有する。

もう一つの実施形態において、前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式（ＩＩＩ）の化合物のうちの一つ又はその薬学的に許容される塩から選択される。

ここで、
Ｒ_１はＨ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－５アルキル、Ｃ_１－５ヘテロアルキル、Ｃ_２－５アルキニル、Ｃ_３－６シクロアルキル及び３～６員ヘテロシクロアルキルから選択され、
Ｒ_２はＨ、ハロゲンから選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－３アルキル及びＣ_１－３ヘテロアルキルから選択され、
ｍは、０、１、２、３、４及び５から選択され、
Ａは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたフェニル又は５～６員ヘテロアリールから選択され、
ＲはＨ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２、＝Ｏ、ＣＨ_３、ＣＨ_３ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｏ、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨ_２Ｆから選択され、
前記Ｃ_１－５ヘテロアルキル、３～６員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキル、５～６員ヘテロアリールの「ヘテロ」は、それぞれ独立してＮ、－Ｏ－、＝Ｏ、－Ｓ－、－ＮＨ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｓ＝Ｏ）－、－（Ｓ＝Ｏ）_２－から選択され、
上記の場合のいずれにおいても、ヘテロ原子又はヘテロ原子団の数は、それぞれ独立して１、２又は３から選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、上記の組み合わせにおいて、前記式（ＩＩＩ）の化合物は、以下の化合物のうちの一つから選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、上記の組み合わせにおいて、前記式（ＩＩＩ）の化合物は、下記式の化合物のうちの一つから選択される。

好ましくは、前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記の式（ＩＩＩａ）で表される構造を有し、

好ましくは、前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記の式（ＩＩＩｂ）で表される構造を有する。

本発明に記載の組み合わせにおいて、前記逆転写酵素阻害剤は、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩又はテノホビルアラフェナミドフマル酸塩から選択される。

好ましくは、ここで、前記逆転写酵素阻害剤は、エンテカビル又はテノホビルジソプロキシルフマル酸塩から選択される。

本発明に記載の組み合わせは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩とａ～ｃのいずれかの群の医薬を医薬活性成分として混合して、医薬組成物を製造することである。

ここで、前記薬物活性成分として混合し、医薬組成物を製造することは、二つ又は三つの異なる薬物を医薬活性成分として一緒に混合して、複合医薬組成物を製造することである。

本発明に記載の組み合わせは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩とａ～ｃのいずれかの群の薬物をそれぞれ医薬活性成分として、それぞれ医薬組成物を製造し、さらに別々の包装し、服用時に別々に服用するものであってもよい。

ここで、前記別々に服用することは、１種又は２種を先に服用し、次に別の１種又は２種を服用し、及び２種又は３種を同時に服用することを含む。

Ｂ型肝炎ウイルス感染症治療薬物の製造における本発明に記載の組み合わせの使用である。

本発明に記載の組み合わせ及び少なくとも一つの薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤である、本発明に記載の薬物製剤組成物である。

本発明はさらに、本発明に記載の組み合わせ、又は本発明に記載の薬物製剤組成物を含むキットを提供する。

本発明はさらに、Ｂ型肝炎を治療するための薬物の製造における前記医薬組成物又はキットの使用を提供する。

本発明の組み合わせにおける別々の包装し、服用時に別々に服用する方法は、以下の方法から選択されることができる。

［投与方法］
以下の内容は、本発明の組み合わせの投与方法を限定するものではない。

本発明の組み合わせの成分は、別々に医薬組成物に製剤化することができ、又はそれらの一部又は全部を一緒に医薬組成物に製剤化することができる。いくつかの態様において、本発明の組み合わせは、単回又は複数回の投与に適した医薬組成物に製剤化することができる。

本発明の組み合わせの成分は、それぞれ単独で投与することができ、又はそれらの一部又は全部を一緒に投与することができる。本発明の組み合わせの成分は、実質的に同時に投与しないことができ、又はそれらの一部又は全部を実質的に同時に投与することができる。本発明の組み合わせの成分は、同じ又は異なる投与サイクルを有してもよい。

本発明の組み合わせの成分はそれぞれ独立して適切な様々な経路で投与することができ、経口又は非経口投与（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄又は他の非経口投与による経路であり、例えば注射又は注入による投与である）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の組み合わせの成分は、それぞれ独立して経口投与又は注射投与することができ、例えば、静脈内又は腹腔内注射である。

本発明の組み合わせの成分は、それぞれ独立して適切な剤形であってもよく、錠剤、トローチ、丸薬、カプセル（例えば、ハードカプセル、ソフトカプセル、腸溶性カプセル、マイクロカプセル）、エリキシル剤、顆粒剤、シロップ、注射剤（筋肉内、静脈内、腹腔内）、顆粒剤、乳剤、懸濁液、溶液、分散液及び経口又は非経口投与の徐放性製剤の剤形を含むが、これらに限定されない。

本発明の組み合わせの成分は、それぞれ独立して薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含むことができる。

［技術効果］
本発明の式（Ｉ）の化合物は、Ｂ型肝炎コアタンパク質阻害剤であり、ウイルスｃｃｃＤＮＡライブラリーを妨害し、ＨＢＶウイルスの複製を阻害することができ；本発明の式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤であり、ＨＢｓＡｇを効果的に低減することができ、式（Ｉ）の化合物と前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤を併用するか、又は式（Ｉ）の化合物とヌクレオシド系又はヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤を併用するか、又はこれら３種類のメカニズムの薬物を併用することにより、ＨＢＶウイルスの複製プロセスをマルチチャンネルで阻害し、治療効果の向上、毒性副作用の低減、治療サイクル及び投与量の短縮、薬剤耐性の低減等の目的を達成することができ、ＨＢＶ負荷量の低下、ＨＢｓＡｇの減少、さらには除去の効果を達成することができる。

［定義及び説明］
別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語及び連語は以下の意味を含む。一つの特定の用語又は連語は、特別に定義されない場合、不確定又は不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品又はその活性成分を指す。

本明細書で用いられる「薬学的許容される」は、それらの化合物、材料、組成物及び／又は剤形に対するもので、これらは信頼できる医学判断の範囲内にあり、ヒト及び動物の組織との接触に適し、毒性、刺激性、アレルギー反応又はほかの問題又は合併症があまりなく、合理的な利益／リスク比に合う。

用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の塩で、本発明で発見された特定の置換基を有する化合物と比較的に無毒の酸又は塩基とで製造される。本発明の化合物に比較的に酸性の官能基が含まれる場合、単独の溶液又は適切な不活性溶媒において十分な量の塩基でこれらの化合物と接触することで塩基付加塩を得ることができる。薬学的許容される塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミン又はマグネシウム塩あるいは類似の塩を含む。本発明で化合物に比較的塩基性の官能基が含まれる場合、単独の溶液又は、適切な不活性溶媒において十分な量の酸でこれらの化合物と接触することで酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の実例は、無機酸塩及び有機酸塩、さらにアミノ酸（例えばアルギニンなど）の塩、及びグルクロン酸のような有機酸の塩を含み、上記無機酸は、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸水素イオン、リン酸、リン酸一水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸、硫酸水素イオン、ヨウ化水素酸、亜リン酸などを含み、上記有機酸は、例えば酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸やメタンスルホン酸などの類似の酸を含む。本発明の一部の特定的の化合物は、塩基性及び酸性の官能基を含有するため、任意の塩基付加塩又は酸付加塩に転換することができる。

本発明の薬学的許容される塩は、酸基又は塩基性基を含む母体化合物から通常の方法で合成することができる。通常の場合、このような塩の製造方法は、水又は有機溶媒あるいは両者の混合物において、遊離酸又は塩基の形態のこれらの化合物を化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させて製造する。

用語「医薬組成物」とは、本明細書の一つ又は複数の活性成分又はそれらの薬物組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤との混合物を指す。医薬組成物の目的は、本明細書の化合物又はその薬物組み合わせの被験者への投与を容易にすることである。

用語「薬学的に許容される担体」は、有効量の本発明の活性物質を送達することができ、活性物質の生物学的活性を妨害せず、且つ宿主又は患者に毒性・副作用を有さない任意の製剤又は水、油、野菜及びミネラル、クリームベース、ローションベース、軟膏ベースなどを含む担体媒体を指す。これらの基剤には、懸濁剤、粘着付与剤、浸透促進剤などが含まれる。それらの製剤は、化粧品又は局所医薬品分野の当業者によく知られている。

用語「賦形剤」とは、一般に、有効な医薬組成物の製剤化に必要な担体、希釈剤及び／又は媒体を指す。

用語「含む」又は「含まれる」とは、オープンで非排他的な意味、即ち「含むが、これらに限定されない」として理解されるべきである。

用語「治療」とは、疾患又は当該疾患に関連する一つ又は複数の症状を予防、改善、又は排除するために、本明細書に記載の化合物又は製剤を投与することを意味し、以下を含む：
（１）哺乳動物における疾患又は疾患状態の出現を予防すること、特にそのような哺乳動物が当該疾患状態にかかりやすいが、その疾患状態に罹患したと診断されていない場合、
（２）疾患又は疾患状態を阻害すること、即ち、その進行を阻止すること、
（３）疾患又は疾患状態を緩和すること、即ち、疾患又は疾患状態を退行させること。

医薬又は薬理学的に活性な薬剤に関する「有効量」又は「治療有効量」という用語は、所望の効果を達成するための無毒であるが十分な量の医薬又は薬剤を指す。本発明の経口剤形の場合、組成物中の一つの活性物質の「有効量」は、組成物中の別の活性物質と組み合わせて使用される際に所望の効果を達成するために必要な量を指す。有効量の決定は、人によって異なり、被検者の年齢及び一般状態に依存し、また、特定の活性物質にも依存し、個々の場合の適切な有効量は、日常的な実験に基づいて当業者によって決定され得る。

用語「投与」とは、当業者に知られている様々な方法及び送達システムのいずれか一つを使用して、治療薬を含む組成物を対象に物理的に導入することを指す。投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄又は他の非経口投与による経路を含み、例えば、注射又は注入による投与である。本明細書に用いられる「非経口投与」という語句は、通常、注射による腸内及び局所投与以外の投与パターンを意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心内、真皮内、腹膜内、経気管、皮下、皮下、関節内、嚢胞下、くも膜下、脊椎内、硬膜外と胸骨内注射と注入、及び生体内電気穿孔を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記組み合わせは非経口ではない経路によって投与され、いくつかの実施形態において、経口投与される。他の非経口ではない経路は、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、膣、直腸、舌下又は局所投与を含む。投与はまた、例えば、１回、複数回、及び／又は一つ又は複数の延長期間にわたって行うことができる。

用語「被験者」とは哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記被験者はマウスである。いくつかの実施形態において、前記被験者はヒトである。

本明細書で使用されるように、「併用」又は「組み合わせて使用」は、二つ以上の活性物質がそれぞれ、単一の製剤として同時に対象に投与され得るか、又はそれぞれが単一の製剤として任意の順序で連続的に投与され得ることを意味する。

用語「活性成分」「治療剤」「活性物質」又は「活性剤」とは、標的の障害、疾患又は状態を治療するのに有効な化学物質を指す。

本発明の化合物は、特定の幾何又は立体異性体の形態が存在してもよい。本発明は、全てのこのような化合物を想定し、シス及びトランス異性体、（－）－及び（＋）－エナンチオマー、（Ｒ）－及び（Ｓ）－エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）－異性体、（Ｌ）－異性体、及びそのラセミ混合物並びに他の混合物、例えばエナンチオマー又は非エナンチオマーを多く含有する混合物を含み、全てのこれらの混合物は本発明の範囲内に含まれる。アルキル等の置換基に他の不斉炭素原子が存在してもよい。全てのこれらの異性体及びこれらの混合物はいずれも本発明の範囲内に含まれる。

別途に説明しない限り、用語「エナンチオマー」又は「光学異性体」とは互いに鏡像の関係にある立体異性体である。

別途に説明しない限り、用語「シス－トランス異性体」又は「幾何異性体」とは二重結合又は環構成炭素原子の単結合が自由に回転できないことによるものである。

別途に説明しない限り、用語「ジアステレオマー」とは分子が二つ又は複数のキラル中心を有し、かつ分子同士は非鏡像の関係にある立体異性体である。

別途に説明しない限り、「（＋））」は右旋性を意味し、「（－）」は左旋性を意味し、「（±）」はラセミ体を意味する。

別途に説明しない限り、楔形実線結合

及び、
楔形点線結合

で一つの立体中心の絶対配置を、
棒状実線結合

及び、
棒状点線結合

で立体中心の相対配置を、
波線

で
楔形実線結合

又は、
楔形点線結合

を、或いは、
波線

で、
棒状実線結合

及び
棒状点線結合

を表す。

用語「置換された」は特定の原子における任意の一つ又は複数の水素原子が置換基で置換されたことで、特定の原子価状態が正常でかつ置換後の化合物が安定していれば、重水素及び水素の変形体を含んでもよい。置換基がケト基（即ち＝Ｏ）である場合、二つの水素原子が置換されたことを意味する。ケト基置換は、芳香族基で生じない。用語「任意に置換される」は、置換されてもよく、置換されなくてもよく、別途に定義しない限り、置換基の種類と数は化学的に安定して実現できれば任意である。

変量（例えばＲ）のいずれかが化合物の組成又は構造に１回以上現れた場合、その定義はいずれの場合においても独立である。そのため、例えば、一つの基が０～２個のＲで置換された場合、上記基は任意に２個以下のＲで置換され、かついずれの場合においてもＲは独立して選択肢を有する。また、置換基及び／又はその変形体の組み合わせは、このような組み合わせであれば安定した化合物になる場合のみ許容される。

連結基の数が０の場合、例えば、－（ＣＲＲ）_０－は、当該連結基が単結合であることを意味する。

そのうち一つの変量が単結合の場合、それで連結する二つの基が直接連結し、例えばＡ－Ｌ－ＺにおけるＬが単結合を表す場合、この構造は実際にＡ－Ｚになる。

置換基がない場合、当該置換基が存在しないことを表し、例えば、Ａ－ＸのＸがない場合、当該構造が実際にＡとなることを表す。挙げられた置換基に対してどの原子を通して置換された置換基が明示しない場合、このような置換基はその任意の原子を通して結合することができ、例えば、置換基としてのピリジニル基は、ピリジン環の任意の炭素原子を通して置換基に結合してもよい。

挙げられた連結基がほかの連結方向を明示しない場合、その連結方向は任意であり、例えば、

における連結基Ｌは－Ｍ－Ｗ－であり、この時－Ｍ－Ｗ－は左から右への読み取る順序と同じ方向に環Ａと環Ｂを構成

することができ、また、左から右への読み取る順序と逆方向に環Ａと環Ｂを構成

することもできる。上記連結基、置換基及び／又はその変形体の組み合わせは、このような組み合わせであれば安定した化合物になる場合のみ許容される。

特に明記しない限り、ある基が一つ以上の結合可能な部位を有する場合、該基の任意の一つ以上の部位は、化学結合によって他の基に結合することができる。該化学結合の結合方式が非局在であり、且つ結合可能な部位にＨ原子が存在する場合、化学結合を結合すると、該部位のＨ原子の個数は、結合された化学結合の個数に応じて相応の価数の基に減少する。前記部位が他の基と結合する化学結合は、
直線実線結合

直線破線結合

又は、
波線

で表すことができる。例えば、－ＯＣＨ_３の直線実線結合は、該基の酸素原子を介して他の基に結合されていることを意味する。

中の直線の破線結合は、該基内の窒素原子の両端が他の基に結合されていることを意味する。

中の波線は、当該フェニル基の部位１と２の炭素原子を介して他の基に結合されていることを意味する。

は、当該ピペリジニル基の任意の結合可能な部位が一つの化学結合によって他の基に結合できることを意味し、少なくとも

の四つの結合形態を含み、Ｈ原子が－Ｎ－に描かれていても、

には

この結合形態の基が含まれるが、一つの化学結合が接続されると、その部位のＨは一つ減少して対応する一価ピペリジン基になる。

別途に説明しない限り、環内の原子数は一般に環員の数として定義され、例えば、「５～７員環」とは、その周囲に配置された５～７個の原子の「環」を指す。

別途に定義しない限り、用語「Ｃ_１～３アルキル」は直鎖又は分枝鎖の１～３個の炭素原子で構成された飽和炭化水素基を表す。前記Ｃ_１－３アルキル基にはＣ_１～２とＣ_２～３アルキル基などが含まれ、それは１価（例えばメチル基）、２価（例えばメチレン基）及び多価（例えばメチン基）であってもよい。Ｃ_１～３アルキル基の実例は、メチル基（Ｍｅ）、エチル基（Ｅｔ）、プロピル（ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む）を含むが、これらに限定されない。別途に定義しない限り、「Ｃ_２－８アルケニル」は直鎖又は分枝鎖の少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を含む２～８個の炭素原子で構成された飽和炭化水素基を表し、炭素－炭素二重結合は基中の任意の位置にあってもよい。

別途に定義しない限り、用語、「４～６員のヘテロシクロアルキル」自体又は他の用語と組み合わせて４～６個の環原子で構成された飽和環状基であり、その１、２、３及び４個の環原子は独立してＯ、Ｓ及びＮから選ばれるヘテロ原子であり、残りは炭素原子である。ここで、窒素原子が任意に四級化されており、窒素及び硫黄ヘテロ原子は任意に酸化される（即ち、ＮＯ及びＳ（Ｏ）_ｐ、ｐは１又は２である）。それは、単環式及び二環式環系を含み、ここで、二環式環系にはスピロ環、縮合環及び架橋環が含まれる。さらに、「４～６員のヘテロシクロアルキル」に関して、ヘテロ原子はヘテロシクロアルキルと分子他の部分の連結される位置を占めることができる。前記４～６員のヘテロシクロアルキルは５～６員、４員、５員及び６員のヘテロシクロアルキルなどを含む。４～６員のヘテロシクロアルキルの実例は、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロチエニル（テトラヒドロチエン－２－イル及びテトラヒドロチエン－３－イルなどを含む）、テトラヒドロフラニル（テトラヒドロフランー２―イルなどを含む）、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル（１－ピペリジニル、２－ピペリジニル及び３－ピペリジニルなどを含む）、ピペラジニル（１－ピペラジニル及び２－ピペラジニルなどを含む）、モルホリニル（３－モルホリニル及び４－モルホリニルなどを含む）、ジオキサニル、ジチアニル、イソキサゾリジニル、イソチアゾリジニル、１，２－オキサジニル、１，２－チアジニル、ヘキサヒドロピリダジニル、ホモピペラジニル又はホモピペリジニルを含むが、これらに限定されない。

別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語及び連語は以下の意味を含む。一つの特定の連語又は用語は、特別に定義されない場合、不確定又は不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品又はその活性成分を指す。

本発明の中間体化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、他の化学合成方法と合わせた実施形態及び当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。

本発明の具体的な実施形態の化学反応は適切な溶媒で完成され、前記の溶媒は本発明の化学変化及びそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を得るため、当業者が既存の実施形態に基づいて合成工程又は反応スキームを変更又は選択することが必要であることもある。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の何らの制限にもならない。

本発明に使用されたすべての溶媒は市販品で、さらに精製せずにそのままで使用してもよい。

本発明に使用されたすべての溶媒は市販品から得ることができる。本発明は下記の略語を用いる：ＥｔＯＨはエタノールを表し、ＭｅＯＨはメタノールを表し、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表し、ＴｓＯＨはｐ－トルエンスルホン酸を表し、ｍｐは融点を表し、ＥｔＳＯ_３Ｈはエタンスルホン酸を表し、ＭｅＳＯ_３Ｈはメタンスルホン酸を表し、ＴＨＦはテトラヒドロフランを表し、ＥｔＯＡｃは酢酸エチルを表し、ＴＨＦはテトラヒドロフランを表し、ＥＡは酢酸エチルを表し、ＤＭＡＰは４－ジメチルアミノピリジンを表し、ＤＣＭはジクロロメタンを表し、ＤＩＰＥＡはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを表す。

図１は化合物１とＴＤＦの体外併用投与効果図である。図２はＡＡＶ／ＨＢＶマウスの血清ＨＢＶＤＮＡに対する試験化合物の２８日間の治療効果図である。図３はＡＡＶ／ＨＢＶマウスの肝臓ＨＢＶＤＮＡに対する試験化合物の治療効果図である。図４はＡＡＶ／ＨＢＶマウスの血清ＨＢＶＲＮＡに対する試験化合物の治療効果図である。図５はＡＡＶ／ＨＢＶモデルマウスの血清における試験化合物の濃度図である。図６は各群のマウスの体重変化図である。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の不利な制限を意味するものではない。本発明は本明細書で詳細に説明されており、その特定の実施形態も開示されており、当業者にとって、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の特定の実施形態において様々な変更及び修正を行うことができることは明らかである。

実施例１化合物１の製造

合成ルート：

ステップ１：化合物１－Ａの合成
乾いた１０Ｌの三口フラスコに無水ジクロロメタン（５Ｌ）を加え、攪拌を開始し、化合物１－ＳＭＡ（５００．００ｇ）とニトロメタンを三口フラスコに順次添加し、反応系をドライアイスエタノール浴に入れ、－１０℃に冷却させた。温度を－１０℃～０℃に制御し、三塩化アルミニウム（１．１５ｋｇ）を反応フラスコにゆっくりと添加し、温度を－０℃以下に制御し、α，α－ジクロロジメチルメチルエーテル（４９５．００ｇ）を反応釜にゆっくりと加え、室温までゆっくりと上昇させ、１８時間攪拌した。ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ３：１）モニタリングにより、原料点が消失し、極性の大きい新しい点が生成された。反応液を抜き出し、１０％硫酸水素カリウム溶液（３Ｌ）にゆっくりと滴下し、２０分間攪拌し、過熱を防ぐためにクラッシュアイスを加えた。混合溶液を２５Ｌ分液ロートに移し、静置して分離させ、ジクロロメタン層を分離して得、水相をジクロロメタン（２Ｌ×２）で抽出した。有機相を１０％硫酸水素カリウム溶液（５Ｌ×２）で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム（１ｋｇ）で乾燥させた。有機相を減圧濃縮して、暗緑色固体化合物１－Ａを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ ＝９．９７（ｂｒｓ，１Ｈ），９．８７－９．８２（ｍ，１Ｈ），７．５８（ｄｄ，Ｊ＝１．５，３．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３６－７．２９（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．３８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）．

ステップ２：化合物１－Ｂの合成
化合物１－Ａ（２ｋｇ、１１．９６ｍｏｌ）のＴＨＦ（２０Ｌ）溶液にｐ－トルエンスルホニルヒドラジド（２．２３ｋｇ、１１．９６ｍｏｌ）を加えた。２０℃で約１時間攪拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認した後、反応系を６０℃に加熱し、その後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（９０２ｇ、１４．３６ｍｏｌ）をバッチで添加し、添加完了後、反応を７０℃に加熱して３時間攪拌した。加熱を停止し、室温まで冷却させた後、５Ｌの水を加えて反応をクエンチし、ＴＨＣの大部分を減圧下で除去し、残留物をＥＡ（１．５Ｌ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過し、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィーで分離して淡黄色固体化合物１－Ｂを得た。

ステップ３：化合物１－Ｃの合成
メタノール（３２Ｌ）を５０Ｌジャケット釜に加え、攪拌を開始し、化合物１－ＳＭＢ（４０００．００ｇ）とジイソプロピルエチルアミン（５．２５Ｌ）を順次に加え、内部温度を５～１０℃に下げ、ベンジルメルカプタン（２４９０．００ｇ）をゆっくりと滴下し、内部温度を５～１５℃に維持させた。滴下終了後、冷却システムを閉じ、自然に昇温させ、２．５時間攪拌を続けた。攪拌を停止し、回転速度を１００ｒｐｍに調節し、反応液を放出し、卓上フィルターで濾過し、ケーキを水（５Ｌ）で３回洗浄し、次いでＥｔＯＨ（３Ｌ）を加えて１回洗浄し、ケーキが粘稠でなくなるまで吸引濾過して、淡黄色固体化合物１－Ｃを得た。

ステップ４：化合物１－Ｄの合成
ジクロロメタン（７．５Ｌ）を５０Ｌのジャケット釜に加え、攪拌を開始し、化合物１－Ｃ（１５００ｇ）を加え、内部温度を０～１０℃に下げ、ＨＣｌ溶液（６Ｍ、４．１２Ｌ）を加えた。０～１０℃の条件で、次亜塩素酸ナトリウム溶液（市販の８％溶液、２３．０ｋｇ）を開口で滴下し、滴下終了後、冷却システムを閉じ、開口で約１７時間攪拌を続けた。次いで亜硫酸水素ナトリウム溶液（１０００ｇ、５Ｌ水溶液）をそれに滴下し、ヨウ化カリウムデンプン試験紙で水相に酸化剤が残っていないことを検出した。攪拌を停止し、静置して分離し、ジクロロメタン層を収集し、水層をジクロロメタン（２．５Ｌ）で抽出し、ジクロロメタン層を合わせた。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去して白色固体化合物１－Ｄを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ ＝８．５０－８．４３（ｍ，２Ｈ），８．３４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｓ，３Ｈ）。

ステップ５：化合物１－Ｅの合成
テトラヒドロフラン（１０Ｌ）を乾いた５０Ｌジャケット釜に加え、攪拌を開始し、化合物１－Ｂ（２０００ｇ）を加え、内部温度を０～１０℃に下げた。約１．５時間以内で、温度を０～１５℃に維持して、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１ＭのＴＨＦ溶液、１５．６７Ｌ）を加え、終了後、温度を約２０℃まで上げ、１時間攪拌を続けた。温度を０～１０℃に下げ、化合物１－Ｄ（４３８０ｇ）のテトラヒドロフラン（１０Ｌ）溶液をゆっくりと加えた。滴下終了後、ゆっくりと１５℃まで昇温させ、約１６時間攪拌を続けた。酢酸エチル（１０Ｌ）を加えて抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０Ｌ）で２回洗浄し、水相を合わせ、ＥＡ（５Ｌ）抽出し、有機相を合わせた。有機相を減圧下で溶媒を除去して、淡黄色固体化合物１－Ｅを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ＝８．５５（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３７（ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．

ステップ６：化合物１－ＳＭ１の合成
化合物１－Ｅ（１０００．０ｇ）を乾いた１０Ｌ三口フラスコに加え、攪拌を開始し、氷酢酸（５Ｌ）を加え、反応内温を２５～３０℃に制御した。鉄粉末（１ｅｑ、１４０．９ｇ）をゆっくりと加え、３０分攪拌した後、第２バッチの鉄粉末（０．５ｅｑ、７０．４４ｇ）をゆっくりと加え、３０分攪拌を続けた後、第３バッチの鉄粉末（０．５ｅｑ、７０．４４ｇ）をゆっくりと加え、再び３０分攪拌した後、第４バッチの鉄粉末（０．５ｅｑ、７０．４４ｇ）を加え、原料が消失するまで攪拌を続けて反応させ、極性の大きな新たな点を生成した。攪拌を停止し、反応液を２５Ｌ分液フラスコに移し、１０Ｌ酢酸エチルを加え、飽和硫酸水素ナトリウム水溶液５Ｌ×２で洗浄し、分離し、水相を酢酸エチル５Ｌで逆抽出した。有機相を合わせ、１０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ＞８まで洗浄し、有機相を分離して収集した。有機相を減圧濃縮して、白色固体化合物１－ＳＭ１を得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ＝７．７９－７．７１（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝１．７，８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）

ステップ７：化合物１－Ｆの合成
トルエン（１２Ｌ）を乾いた５０Ｌジャケット釜に加え、攪拌を開始し、２－ブロモエタノール（９９３０ｇ）を加え、次いで三フッ化ホウ素エチルエーテル（２６８ｇ）を加え、反応を３０～３５℃に昇温させた。化合物１－ＳＭＣ（３５００ｇ）をゆっくりと滴下し、約１．５時間で滴下を完了させ、この時、反応の内部温度は約５５～６５℃に上げ、ヒーター温度を６０℃に調節し、内部温度を５５～６５℃に１時間維持させた。反応系の内部温度を約１０℃に下げ、反応系内に約２０℃の水酸化ナトリウム水溶液（３７８３ｇ、水１７．５Ｌ）をゆっくりと加え、内部温度を１０～２０℃に維持させた。ＮａＯＨ溶液を加えた後、温度制御器を停止させ、反応を約１６時間攪拌し続けた。撹拌を停止させ、静置し、分離し、水層を２－メチルテトラヒドロフラン（１０Ｌ）で抽出し、有機相を合わせ、水（１０Ｌ）で洗浄し、静置し、分離し、有機相を収集した。有機相を減圧濃縮して、無色の油状化合物１－Ｆを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ ＝３．８７－３．７１（ｍ，４Ｈ），３．６６－３．５９（ｍ，３Ｈ），３．４２（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２０－３．１３（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），２．６５－２．５９（ｍ，１Ｈ）

ステップ８：化合物１－Ｇの合成
水酸化ナトリウム（３２４０ｇ、水１５Ｌ）水溶液を５０Ｌジャケット釜に加え、化合物１－Ｆ（４４３０ｇ）を加え、加熱を開始し、反応を９０℃に昇温させた後、１時間攪拌を続けた。冷却を開始し、約１５℃まで下げ、ｐ－トルエンスルホニルクロリドのテトラヒドロフラン溶液（６１８０ｇ、テトラヒドロフラン１５Ｌ）を加え、温度制御器を閉じ、反応を約１５℃で約１６時間攪拌を続けた。攪拌を停止し、静置し、分離し、水相を２－メチルテトラヒドロフラン（１０Ｌ）で抽出し、２－メチルテトラヒドロフラン相（白色不溶物があり、水で洗浄した後消失した）を水（５Ｌ）で洗浄し、有機相を合わせた。有機相にＤＭＡＰ（５００ｇ）、トリエチルアミン（２．５Ｌ）を加え、３０分間攪拌し、飽和塩化ナトリウム溶液（１０Ｌ）を加えて洗浄し、静置して分離し、水相を廃棄した。有機相を硫酸水素カリウム溶液（３８００ｇ、水１５Ｌ）、飽和塩化ナトリウム溶液（５Ｌ×２）で洗浄し、静置して分離し、有機相を収集した。有機相を減圧濃縮して溶媒を除去し、粗生成物化合物１－Ｇを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ ＝７．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０３－３．９１（ｍ，２Ｈ），３．８０－３．４９（ｍ，８Ｈ），３．３３（ｄｄ，Ｊ＝９．９，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ）

ステップ９：化合物１－Ｈの合成
アセトン（３０Ｌ）を清浄な５０Ｌジャケット釜に加え、攪拌を開始し、化合物１－Ｇ（４５００ｇ）を加え、次いでヨウ化ナトリウム（６１９０ｇ）を加え、加熱を開始し、反応を７５℃に昇温させた後、１６時間攪拌を続けた。室温まで下げた後で濾過し、濾液を５０℃で減圧濃縮した。濃縮後の粗生成物に酢酸エチル（１５Ｌ）、水（１０Ｌ）を加え、攪拌し、静置して分離し、有機相を０．５Ｍチオ硫酸ナトリウム（１０Ｌ）で洗浄した。水相とチオ硫酸ナトリウム溶液を合わせた後、ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で抽出した。有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（１０Ｌ）で洗浄し、静置し、分離し、有機相を収取した。有機相を減圧濃縮して溶媒を除去し、粗生成物化合物１－Ｈを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ ＝３．９０－３．８３（ｍ，２Ｈ），３．８１－３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７４－３．６５（ｍ，５Ｈ），３．６３－３．４９（ｍ，７Ｈ），３．３１－３．１８（ｍ，３Ｈ），３．０６－３．０４（ｍ，２Ｈ）

ステップ１０：化合物１－Ｉの合成
ＤＭＳＯ（２０Ｌ）を清浄な５０Ｌジャケット釜に加え、攪拌を開始し、化合物１－Ｈ（４７００ｇ）を加え、温度を３５℃に上げ、次いでシアン化ナトリウム（１０１０ｇ）を加え、反応の内部温度を２０分以内に約６０℃まで上げ、その後徐々に３５℃まで下げ、約１６時間攪拌を続けた。反応系内に炭酸水素ナトリウム溶液（炭酸水素ナトリウム２０００ｇ、水１０Ｌ）を加え、約５分間攪拌を続け、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（２０Ｌ、２Ｌ）を加え、２分間攪拌を続け、約１時間静置した。分離し、下層の溶液を約３０Ｌ分離し、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（１回目は１５Ｌ：１．５Ｌ、２回目は５Ｌ：０．５Ｌ）で２回抽出した。抽出後の上層有機相及び残りの反応液上層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（各１０Ｌ）で３回洗浄し、静置し、分離し、水相を廃棄し、有機相を収取した。有機相を減圧して溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィーで分離して無色の油状物化合物１－Ｉを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ ＝３．８４－３．６５（ｍ，６Ｈ），３．６１－３．５３（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），２．４９－２．４４（ｍ，２Ｈ）．

ステップ１１：化合物１－Ｊの合成
アルゴンガスの保護下で、ラネーニッケル（１０．００ｇ、１１６．７３ｍｍｏｌ）とＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）を乾いた水素化フラスコに加え、さらに１－Ｉ（２０ｇ、１５７．３１ｍｍｏｌ）、ＮＨ_３．Ｈ_２Ｏ（１３．６５ｇ、９７．３６ｍｍｏｌ、１５．００ｍＬ、２５％純度）を反応系に加え、その後置換し、反応を５０ｐｓｉ、５０℃で３．５時間攪拌した。反応液を珪藻土で濾過し、濾液を減圧濃縮して黄色の油状物化合物１－Ｊを得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化クロロホルム） δ ＝３．８２－３．５７（ｍ，６Ｈ），３．３４－３．１８（ｍ，１Ｈ），２．８６－２．７２（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．３８（ｍ，２Ｈ）。

ステップ１２：化合物１－ＳＭ２の合成
１－Ｊ（８００．００ｇ）を５Ｌ三口フラスコに加え、攪拌を開始し、酢酸エチル（８００ｍＬ）を約０．５時間以内に加え、ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（１．６Ｌ）４Ｍを反応系のｐＨ＜５までゆっくりと滴下し、内部温度を５～１５℃に維持させた。冷却システムを閉じ、室温まで昇温させ、１時間攪拌を続けた。撹拌を停止し、卓上フィルターで濾過して、ケーキを得た。ケーキを減圧濃縮し（４０～４５℃）て、粗生成物を得た。上記生成物にアセトニトリル（２ｍＬ／ｇ）を加え、１時間スラリー化させた。卓上フィルターで濾過し、ケーキを収取し、有機溶液を減圧下で除去して、白色固体化合物１－ＳＭ２を得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ） δ ＝３．８８－３．７２（ｍ，５Ｈ），３．６７－３．５９（ｍ，１Ｈ），３．３６ -３．３１（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．８７－１．６７（ｍ，２Ｈ）．

ステップ１３：化合物１－１－Ａ及び化合物１－１－Ｂの合成
トルエン（２０Ｌ）を乾いた５０Ｌジャケット釜に加え、攪拌を開始し、化合物１－ＳＭ１（２５００ｇ）を加え、内部温度を３０～３５℃に上げた。窒素ガスでパージングして釜内を不活性ガス雰囲気を維持させ、トリメチルアルミニウム（３．０Ｌ、Ａｌ（ＣＨ_３）_３添加によりケトルの内部温度度が緩やかな上昇）を滴下し、終了後、窒素ガスを閉じ、温度を８０～８５℃まで上げ、約１６時間攪拌を続けた。冷却を開始し、反応温度を２０～３０℃に下げ、反応液の半分の約１２Ｌを移し、ＥＴｏＡｃ（１０Ｌ）を加え、均一に混合した。攪拌しながら、１０％ＫＨＳＯ_４溶液（１０Ｌ）に混合液を加え、２分間攪拌し、静置し、分離し、有機層をさらに１０％ＫＨＳＯ_４溶液（１０Ｌ）で洗浄し、水相を合わせ、ＤＣＭ（各７．５Ｌ）を用いて２回抽出した。残りの半分の反応液約１２Ｌを移し、処理方法は上記と同様であり、有機相を合わせ、有機相を減圧濃縮して粗生成物を得、２倍体積のｎ－ヘプタンを加えて１時間スラリー化させた。濾過し、真空乾燥させた（＞１２時間、温度４０℃、Ｐ≦－０．１ＭＰａ）。化合物１－１－Ａ及び化合物１－１－Ｂの混合物を得た。

ステップ１４：化合物１－２の合成
テトラヒドロフラン（３８４０ｍＬ）を１０Ｌ三口フラスコに加え、攪拌を開始し、化合物１－１－Ａと化合物１－１－Ｂの混合物（４８０．００ｇ）を加え、ＬｉＯＨ．Ｈ_２Ｏ（１１８．８４ｇ）のＨ_２Ｏ（９６０ｍＬ）溶液をゆっくりと滴下した。滴下終了後、６０℃まで昇温させ、１時間攪拌し、反応液に濃ＨＣｌを加え、反応系ｐＨを２に調節し、攪拌を停止した。静置し、分離した。水相をＴＨＦ（６００ｍＬ）で２回抽出し、有機相を合わせた。有機相を減圧濃縮（４０～４５℃）し、固体を純水（２ｍＬ／ｇ）で０．５時間スラリー化させ、ろ過し、ケーキを真空乾燥させて（＞１２時間、温度４０℃、Ｐ≦－０．１ＭＰａ）、化合物１－２を得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ＝１１．１９（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄ，Ｊ＝１．２，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ）．

ステップ１５：化合物１の合成
ＤＭＦ（２．２５Ｌ）を５Ｌ三口フラスコに加え、開始攪拌し、化合物１－２（４００．００ｇ）及びＨＡＴＵ（７４４．８３ｇ）を順次に加えて３０分間攪拌し、次いで化合物１－ＳＭ２（２２９．８６ｇ）を加えてた。１時間以内に、ＤＩＰＥＡ（５６８．６８ｍＬ）を室温でゆっくりと滴下し、滴下終了後、室温で攪拌し、１６時間攪拌した。反応液を分液ロートに移し、酢酸エチル（２Ｌ）と純水（１Ｌ）を加えて２分間攪拌した。静置し、水相を分離した。さらに純水（１Ｌ）を加えて洗浄し、攪拌し、静置し、分離した。合わせた水相をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で３回抽出し、有機相を合わせた。有機相を炭酸ナトリウム溶液（１．５Ｌ）で２回、硫酸水素カリウム溶液（１Ｌ）で２回、純水（１Ｌ）で２回順次に洗浄した。有機相を減圧濃縮して（４０～４５℃）、粗生成物を得た。粗生成物に酢酸エチル（２ｍＬ／ｇ）を加え、１時間スラリー化させた。濾過してケーキを収集し、化合物１を得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ＝１１．１３（ｂｒｓ，１Ｈ），８．７３（ｂｒｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７１－３．４８（ｍ，５Ｈ），３．４５－３．３１（ｍ，１Ｈ），３．４５－３．３０（ｍ，１Ｈ），３．２７－３．２１（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｄｄ，Ｊ＝９．９，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），１．５３（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）。

生物学的テスト実験

実験例１：ＨＢＶ阻害活性に対する化合物１及びテノホビルジソプロキシルフマル酸塩（Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌｆｕｍａｒａｔｅ、ＴＤＦ）の体外併用投与の研究

１．実験方法
１．１１日目に、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を９６ウェル細胞培養プレートに４０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、その後、細胞を５％ＣＯ_２、３７℃で一晩培養した。

１．２２日目に、化合物１とＴＤＦをそれぞれ７つの異なる濃度（約８×、４×、２×、１×、０．５×、０．２５×、０．１２５×ＥＣ_５０の濃度勾配を選択）で直交比例で配分し、９６ウェルプレートに加え、各組み合わせは三つの重複ウェルを設定し、ＤＭＳＯの最終濃度は０．５％であった。各化合物の検出濃度は表１に示される通りである。

１．３５日目に、細胞上清液を捨て、化合物を含む新しい培地を加え、細胞を５％ＣＯ_２、３７℃で３日間培養した。８日目に、化合物処理後の細胞プレートの上清液をＱＩＡａｍｐ９６ＤＮＡＢｌｏｏｄＫｉｔ（１２）の説明書に従って、ＤＮＡを抽出した。

１．４ＨＢＶＤＮＡをｑＰＣＲ法で定量化した。ＨＢＶプラスミドＤＮＡを標準品とし、標準品ＨＢＶプラスミドＤＮＡ濃度を１０^７ｃｏｐｉｅｓ／μＬから１０倍勾配で７点希釈した。各標準品のＨＢＶＤＮＡコピー数とＣＴ値を用いて標準曲線をフィッティングし、各テスト試料中のＨＢＶＤＮＡコピー数を算出した。

ＭａｃＳｙｎｅｇｙソフトウェア（Ｐｒｉｃａｒｄｅｔａｌ．，１９９０）を用いてＨＢＶＤＮＡコピー数試験データを処理し、化合物１とＴＤＦの併用投与の効果パラメータを分析した。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞に対する化合物の細胞毒性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキットを用いて検出した。各細胞ウェルの化学発光強度（ＲＬＵ）は、キットの説明書の方法に従ってマルチモードマイクロプレートリーダーを用いて検出した。

２．結果
化合物１とＴＤＦの体外併用投与によるＨＢＶの阻害活性をＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いて評価した。ＨＢＶの阻害活性と細胞毒性に対する医薬の併用投与結果のまとめは表２に示される通りであり、併用投与の効果図は図１に示される通りである。

実験の結果は、化合物１とＴＤＦの体外併用投与の９５％信頼空間における相乗指数と拮抗指数はそれぞれ１３．２７と－１．７４であり、プラス作用を示していることを表した。化合物はいずれもテスト濃度内で細胞毒性を示さなかった（表３参照）。

注：
薬物併用の総合指数の説明：指数の絶対値＜２５の場合、即ち、プラス効果であり、指数の絶対値が２５～５０の範囲の場合、即ち、軽度であるが明確な相乗効果又は拮抗効果であり、指数の絶対値が５０～１００の範囲の場合、即ち、中程度の相乗作用又は拮抗作用であり、体内作用に重要な意義を持つ可能性がある。指数の絶対値＞１００の場合、即ち、高度の相乗効果又は拮抗効果であり、体内作用に重要な意義を持つ可能性が高い。

３．結論
化合物１とＴＤＦの体外併用投与はＨＢＶの阻害活性にプラス効果を示し、化合物はテスト濃度内で細胞毒性を示さなかった。テスト結果は慢性ＨＢＶ感染患者の治療における化合物１とＴＤＦの臨床併用を支持した。

実験例２：ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルを用いて被験化合物の体内抗Ｂ型肝炎ウイルス薬効を評価

実験材料

１．動物
５週齢の特定病原体を含まないオスのＣ５７ＢＬ／６マウスであり、ＳＨＡＮＧＨＡＩＳＬＡＣＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＡＮＩＭＡＬＣＯ．ＬＴＤから購入した。

２．溶媒及び化合物
溶媒：
１０％ソリュートール水溶液

被験化合物：
適量の化合物１を上記溶媒に加え、ボルテックスした後、粒子の均一な懸濁液が得られ、製造した濃度は１．０、３．０及び１０．０ｍｇ／ｍＬであった。使用まで４℃に保存した。化合物１を製造時には、１．０の塩係数、１００％の純度に従って計算された。
テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ＴＤＦ）は、ＳｈａｎｇｈａｉＰａｎｈｏｎｇＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。適量のＴＤＦを秤量して、生理食塩水に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬの母液に調製し、ＴＤＦが完全に溶解するまでボルテックスし、１ｍＬ仕様に分注し、－２０℃で保存した。毎回投与する前に１ｍＬの母液を採取し、生理食塩水で１０倍で０．１ｍｇ／ｍＬの作業液に希釈し、当日の投与に用いた。

組換えウイルスｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ
ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ（タイプＤ、ａｙｗ）はＢｅｉｊｉｎｇＦｉｖｅＰｌｕｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｏ．Ｌｔｄ．，５＋ＭＭＩから購入し、バッチ番号がｘ２０１８０３２３０１であり、１×１０^１２ｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅ（ｖ．ｇ．）／ｍＬであった。実験前に無菌ＰＢＳで５×１０^１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈させた。各マウスに２００μＬを注射し、即ち、各マウスに１×１０^１１ｖ．ｇ．を注射した。

３．試験方法
ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルの構築
ＡＡＶ／ＨＢＶ注射：ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶは、注射前に予め無菌ＰＢＳを用いて１×１０^１１ｖ．ｇ．／２００μＬの濃度の溶液に調製した。

感染レベルの検出：
ウイルス注射後１４日目と２１日目に、血清の採取のためにすべての感染マウスの顎下静脈から～１２０μＬの血液を採取した。全血を３７℃インキュベーターに入れて３０分間培養した後、１３，２００×ｇ、４℃で３分間遠心分離して血清～３０μＬを収集した。血清は－８０℃に保存され、ＨＢＶＤＮＡ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの検出に使用された。

群分け：
ウイルス注射後２８日目に、ウイルス注射後１４日目及び２１日目の血清試料中のＨＢＶＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベル、及びマウス体重に基づいて群を分けた。

実験日の定義：
初回投与日を実験０日目とした。

４．体内実験設計
体内実験の投与とサンプリングのスキームは表４に示される通りである。

血清サンプルの製造：
血液試料を３７℃で～３０分間培養した後、４℃、１３，２００ｇの条件で３分間遠心分離し、分離した上清をドライアイスで急速凍結した。

血漿試料の製造と前処理：
血液試料をＫ_２ＥＤＴＡで抗凝固処理した後、４℃、７，０００ｇの条件で１０分間遠心分離して上清を分離した。分離した血漿に１：２０の比で沈殿剤を加え、［メタノール：アセトニトリル（ｖ：ｖ、５０：５０）溶液］、ボルテックスして混合し、ドライアイスで急速凍結した。

体重の記録：
体内実験の過程で、マウスの状態を定期的に観察し、感染、投与、採血、及び実験が終了した日にマウスの体重を記録した。

心臓採血により血清を収集し、ＨＢＶＤＮＡ検出に用い、第１、４群中のＨＢＶＲＮＡレベルを検出した。

５．試料の分析
１．ＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡ（ＡｎｔｕＢｉｏ、ＣＬ０３１０）キット説明書で、マウス血清中のＨＢｓＡｇ含有量を検出した。

２．ＨＢｅＡｇＥＬＩＳＡキット（ＡｎｔｕＢｉｏ、ＣＬ０３１２）説明書で、マウス血清中のＨＢｅＡｇ含有量を検出した。

３．マウス血清及び肝臓中のＨＢＶＤＮＡ含有量を定量ＰＣＲで検出した。

データ分析：
データは、各群の試料の平均±標準誤差として表され、特に明記しない限り、第１～６群：ｎ＝８である。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔｔｅｓｔを用いて統計分析を行った。

６．結果
１）ＡＡＶ／ＨＢＶマウス実験における血清ＨＢＶＤＮＡに対する被験化合物の影響
各群のマウスの血清におけるＨＢＶＤＮＡの含有量は図２にまとめられた通りである。
溶媒群（Ｇｒｏｕｐ１）のマウスの血清ＨＢＶＤＮＡ含有量は投与後安定を維持し、化合物１の単剤群は：溶媒群（Ｇｒｏｕｐ１）と比較して、化合物１の低（１０ｍｐｋ、Ｇｒｏｕｐ２）、中（３０ｍｐｋ）、高（１００ｍｐｋ）の３つの用量群のマウス血清中のＨＢＶＤＮＡ含有量は投与３日後に用量依存的な低下を示し始め、低、中用量群は投与７日後にＨＢＶＤＮＡ含有量が安定性を維持し、高用量群は投与７～２８日間血清中のＨＢＶＤＮＡ含有量は持続的に低下し、溶媒群（ｐ＜０．０１）よりも有意に低かった。

化合物１とＴＤＦとの併用投与群（Ｇｒｏｕｐ６、１０＋１ｍｐｋ）は：溶媒群（Ｇｒｏｕｐ１）と比較して、マウス血清中のＨＢＶＤＮＡ含有量は投与３日後に減少し、投与７～２８日間血清中のＨＢＶＤＮＡ含有量は安定性を維持した。化合物１（Ｇｒｏｕｐ２、１０ｍｐｋ）及びＴＤＦ（Ｇｒｏｕｐ５、１ｍｐｋ）単剤群と比較して、併用投与はマウス血清中のＨＢＶＤＮＡ含有量を有意に低下させる効果を示した（ｐ＜０．０１）。

２）ＡＡＶ／ＨＢＶマウス実験における肝臓中のＨＢＶＤＮＡに対する被験化合物の影響
各群のマウスの肝臓におけるＨＢＶＤＮＡの含有量は図３にまとめられた通りである。
溶媒群（Ｇｒｏｕｐ１）と比較して、投与２８日後、化合物１の低（１０ｍｐｋ）、中（３０ｍｐｋ）、高（１００ｍｐｋ）の３つの用量群のマウス肝臓におけるＨＢＶＤＮＡ含有量は低下した。化合物１とＴＤＦとの併用投与群（Ｇｒｏｕｐ６、１０＋１ｍｐｋ）は、投与２８日後、肝臓におけるＨＢＶＤＮＡ含有量は化合物１の１０ｍｐｋ単剤群より有意に低かった（ｐ＜０．００１）。

３）ＡＡＶ／ＨＢＶマウス実験における血清ＨＢＶＲＮＡに対する被験化合物の影響
各群のマウス血清におけるＨＢＶＲＮＡの含有量は図４にまとめられる通りである。
溶媒群（Ｇｒｏｕｐ１）と比較して、投与２８日後、化合物１の高（１００ｍｐｋ）用量投与群のマウス血清におけるＨＢＶＲＮＡ含有量は低下した。

４）ＡＡＶ／ＨＢＶモデルマウスにおける被験化合物の薬物動態解析
第２群のマウス血清中の薬物濃度は図５及び表６にまとめられる通りである。
２７日目の、最初の投与後０時間（投与前）、１、４、８、９、１２、２４時間後、マウス血清における薬物濃度の平均値は、それぞれ７８、１２２２００、１６３０、６０５、１０３００、１２８０及び６６ｎＭであった。薬物吸収は投与後１時間でピークに達し、血漿半減期は２．２３時間であり、ＡＵＣ_{０－ｉｎｆ}は４７６００ｎＭ．ｈであった。

５）マウスの健康及び体重のモニタリング
実験中、マウスの健康状態及び体重を定期的にモニタリングした。
０日目の体重を基準として比較し、マウスの体重変化結果は図６にまとめられる通りである。
投与期間中、全部のマウスの体重は安定しており、有意な減少はなく、マウスの状態は良好であった。

注：
マウスの体重変化を－２８日目から２８日目に記録した（最初の投与日を０日目とした）。０日目の体重を基準として比較し、ＩＡＣＵＣの規定により２０％の体重減少を人道的エンドポイントとし、マウス体重が２０％以上低下した場合、実験から除去する必要があった。

７．結論
溶媒対照群と比較して、化合物１の治療後のマウスの血清及び肝臓のＨＢＶＤＮＡは有意に減少し、血清の中で用量依存的な傾向を示した。化合物１とＴＤＦとの併用後、効果が化合物１単独治療よりも有意に優れており、良好な併用投与効果を示した。実験期間中、マウスの体重が有意に減少せず、被験化合物に対するマウスの耐性が良好であることを示した。

８．説明
上記実験におけるＴＤＦをＥＴＶ（エンテカビル）に置き換えて、化合物１とＥＴＶとを併用した体内抗ウイルス効果を得、マウス血清及び肝臓ＨＢＶＤＮＡは有意に低下し、化合物１単独治療よりも優れていた。

実験例３：化合物１と下記の式（ＩＩｂ）の化合物、式（ＩＩＩｂ）の化合物の体外併用によるＨＢＶ阻害活性に関する研究

１．実験材料
細胞株：
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞はＷｕＸｉＡｐｐＴｅｃによって構築・提供され、細胞培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したものであった。

試薬：
本研究で使用された主な試薬には、ＦａｓｔＳｔａｒｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅＭａｓｔｅｒＭａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９１４０５８００１）、ＤＮＡ抽出キットＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：５１１６２）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ－Ｇ７５７３）が含まれた。

機器：
本研究で使用された主な機器は、７９００リアルタイムＰＣＲ装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ^TM６ＦｌｅｘＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。

被験化合物：
化合物１、式（ＩＩｂ）の化合物、式（ＩＩＩｂ）の化合物。

２．実験方法

２．１化合物単剤の抗ＨＢＶ活性

２．１．１１日目に、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を９６ウェル細胞培養プレートに６０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、その後、細胞を５％ＣＯ_２、３７℃で一晩培養した。２日目に、化合物１と式（ＩＩｂ）の化合物、式（ＩＩＩｂ）の化合物を希釈し、９６ウェルプレートに加え、各組み合わせに三つの重複ウェルを設定し、細胞を５％ＣＯ_２、３７℃の条件で３日間培養した。各化合物の検出濃度は表７に示される通りである。５日目に化合物を含む新しい培地に交換し、８日目に上清を収集した。ＥＬＩＳＡで上清のＨＢｓＡｇを検出し、同時に上清中のＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを用いて上清中のＨＢＶＤＮＡの含有量を測定した。細胞上清を収集した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを加えて細胞の生存率を検出した。

２．２化合物併用抗ＨＢＶ活性

２．２．１１日目に、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を９６ウェル細胞培養プレートに６０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、その後、細胞を５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で一晩培養した。２日目に、異なる濃度の化合物を加えて細胞を処理した。化合物を勾配で希釈し、７×７濃度の組み合わせで、三つの重複ウェルを設定して平行に測定した。併用活性試験の化合物濃度は、各化合物のＥＣ_５０値に基づき、７つの濃度勾配は、それぞれ約２×、１×、１／２×、１／４×、１／８×、１／１６×及び１／３２×ＥＣ_５０であった。併用活性テスト実験の化合物濃度は表８に示される通りであり、併用投与の配置は表９に示される通りである。５日目に、化合物を含む新鮮な培地に交換した。８日目に、培養上清を収集し、ＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲによりＨＢＶＤＮＡの含有量を測定した。同時に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬で細胞生存率を検出し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙソフトウェアを使用して二つの薬物の併用効果を分析した。

注：
ａ＝化合物１、ｂ＝式（ＩＩｂ）の化合物又は式（ＩＩＩｂ）の化合物であり、０は化合物がないことを表し、１～７は７個の濃度を表す。

３．実験結果：
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いて、ＨＢＶに対する化合物１と式（ＩＩｂ）の化合物、化合物１と式（ＩＩＩｂ）の化合物の体外併用投与の阻害活性を評価した。ＨＢＶに対する化合物単剤の阻害活性及び細胞毒性は表１０にまとめられる通りであり、ＨＢＶに対する併用投与の阻害活性及び細胞毒性の結果は表１１～表１３にまとめられる通りである。

注：
薬物併用指数の説明：指数の絶対値＜２５の場合、即ち、プラス効果であり、指数の絶対値が２５～５０の範囲の場合、即ち、軽度であるが明確な相乗作用又は拮抗効果を示し、指数の絶対値が５０～１００の範囲の場合、即ち、中程度の相乗作用又は拮抗効果を示し、体内効果に重要な意義を持つ可能性がある。指数の絶対値＞１００の場合、即ち、高度の相乗又は拮抗効果を示し、体内効果に重要な意義を持つ可能性が高い。

４．実験結論
ＨｅｐＧ２．２．１５体外感染ＨＢＶモデルにおいて、被験化合物は用量依存的にＨＢＶＤＮＡを阻害し、化合物１と式（ＩＩｂ）の化合物、化合物１と式（ＩＩＩｂ）の化合物はプラスの併用結果を示し、併用試験濃度内では細胞毒性を示さなかった。試験結果は、慢性ＨＢＶ感染の治療における化合物１と前記式（ＩＩｂ）化合物、式（ＩＩＩｂ）化合物などのＢ型肝炎表面抗原阻害剤の、臨床的に併用を支持した。

５．説明
上記実施形態によれば、化合物１を化合物２

又は、化合物３

に置き換えて、化合物２と式（ＩＩｂ）の化合物、式（ＩＩＩｂ）の化合物との併用投与結果、及び化合物３と式（ＩＩｂ）の化合物、式（ＩＩＩｂ）の化合物との併用投与結果を得、いずれも効果がプラスするデータ結果を示し、かつ併用試験濃度内では細胞毒性を示さなかった。試験結果は、慢性ＨＢＶ感染の治療における化合物２、化合物３などの当該類化合物が前記式（ＩＩｂ）の化合物、式（ＩＩＩｂ）の化合物などのＢ型肝炎表面抗原阻害剤の、臨床的に併用を支持した。

Claims

式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び以下のａ～ｃの任意の群の医薬の組み合わせ：
ａ、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤、
ｂ、逆転写酵素阻害剤、
ｃ、Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤及び逆転写酵素阻害剤
である、医薬組み合わせ。

（ここで、式（Ｉ）において、
Ｌ_１は単結合又は－Ｃ_１－６アルキルであり、
Ｒ_１はＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、又は任意選択で１、２又は３個のＲ_ａで置換されたＣ_１－３アルキルであり、
環Ａは、４～８員のヘテロシクロアルキル又はＣ_３－８シクロアルキルであり、
Ｒ_２はＨ及びＣ_１－３アルキルであり、
Ｒ_３はＨ及びＣ_１－３アルキルであり、
Ｒ_ａはそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ_２、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ_１－６アルキル又はＣ_１－６ヘテロアルキル、或いは任意選択で１、２又は３個のＲ’で置換されたＣ_１－６アルキル及びＣ_１－６ヘテロアルキルであり、
Ｒ’はそれぞれ独立してＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ_２、ＣＨ_３、ＣＮ及び－Ｎ（ＣＨ_３）_２から選択され、
前記４～８員ヘテロシクロアルキル及びＣ_１－６ヘテロアルキルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－及びＮから選択されるヘテロ原子又はヘテロ原子団を含む。）
Ｒ_ａはそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ_２、ＯＨ又はＣＮである、請求項１に記載の組み合わせ。
環Ａは５～６員ヘテロシクロアルキルである、請求項１に記載の組み合わせ。
環Ａはテトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル又はジオキサニルである、請求項３に記載の組み合わせ。
環Ａは

である、請求項４に記載の組み合わせ。
Ｒ_１はＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉであるか、又は任意選択で１、２又は３個のＲ_ａで置換されたＣＨ_３である、請求項１に記載の組み合わせ。
Ｒ_１はＨ、Ｃｌ又はＣＨ_３である、請求項６に記載の組み合わせ。
Ｒ_２はＨ又はＣＨ_３である、請求項１に記載の組み合わせ。
Ｒ_３はＨ又はＣＨ_３である、請求項１に記載の組み合わせ。
Ｌ_１は－ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２ＣＨ_２－である、請求項１に記載の組み合わせ。
式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ－１）に示される構造を有する、請求項１に記載の組み合わせ。

（ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＬ_１は、請求項１に定義された通りである。）
式（Ｉ）の化合物は、下記式の具体的な化合物から選択される、請求項１に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩の一つから選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組み合わせ。

（ここで、
「＊」の付いた炭素原子はキラル炭素原子であり、（Ｒ）又は（Ｓ）単一エナンチオマー形態又はエナンチオマーに富む形態で存在し、
Ｒ_１はＨ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６ヘテロアルキル、Ｃ_２－５アルケニル、Ｃ_２－５ヘテロアルケニル、Ｃ_３－６シクロアルキル又は３～６員ヘテロシクロアルキルから選択され、
Ｒ_２はＨ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２、ハロゲンから選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－３アルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキル、Ｃ_３－６シクロアルキル又は３～６員ヘテロシクロアルキルから選択され、
Ｒ_３は任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－６アルキル、Ｃ_３－６シクロアルキルから選択され、
ｍは、０、１、２、３、４又は５から選択され、
ｍが０の場合、Ｒ_１はＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択されなく、
ＲはＨ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲ’で置換されたＣ_１－３アルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキルから選択され、
Ｒ’はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２、ＣＨ_３、ＣＨ_３ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｏ、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨ_２Ｆから選択され、
「ヘテロ」は、ヘテロ原子又はヘテロ原子団を表し、前記Ｃ_１－６ヘテロアルキル、Ｃ_２－５ヘテロアルケニル、３～６員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキルの「ヘテロ」は、それぞれ独立して－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、－Ｎ（Ｒ）－、－Ｃ（＝ＮＲ）－、－（Ｒ）Ｃ＝Ｎ－、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）－、－Ｓ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、Ｎ、－Ｏ－、－Ｓ－、＝Ｏ、＝Ｓ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）－から選択され、
上記の場合のいずれにおいても、ヘテロ原子又はヘテロ原子団の数は、それぞれ独立して１、２又は３から選択される。）
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物の一つから選択される、請求項１３に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物の一つから選択される、請求項１３に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物から選択される、請求項１４に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物から選択される、請求項１５に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、式（ＩＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩の一つから選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組み合わせ。

（ここで、
Ｒ_１はＨ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２から選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－５アルキル、Ｃ_１－５ヘテロアルキル、Ｃ_２－５アルキニル、Ｃ_３－６シクロアルキル及び３～６員ヘテロシクロアルキルから選択され、
Ｒ_２はＨ、ハロゲンから選択され、或いは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたＣ_１－３アルキル及びＣ_１－３ヘテロアルキルから選択され、
ｍは、０、１、２、３、４及び５から選択され、
Ａは任意選択で１、２又は３個のＲで置換されたフェニル又は５～６員ヘテロアリールから選択され、
ＲはＨ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ_２、＝Ｏ、ＣＨ_３、ＣＨ_３ＣＨ_２、ＣＨ_３Ｏ、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨ_２Ｆから選択され、
前記Ｃ_１－５ヘテロアルキル、３～６員ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１－３ヘテロアルキル、５～６員ヘテロアリールの「ヘテロ」は、それぞれ独立してＮ、－Ｏ－、＝Ｏ、－Ｓ－、－ＮＨ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｓ＝Ｏ）－、－（Ｓ＝Ｏ）_２－から選択され、
上記の場合のいずれにおいても、ヘテロ原子又はヘテロ原子団の数は、それぞれ独立して１、２又は３から選択される。）
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物の一つから選択される、請求項１８に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物の一つから選択される、請求項１８に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物から選択される、請求項１９に記載の組み合わせ。
前記Ｂ型肝炎表面抗原阻害剤は、下記式の化合物から選択される、請求項２０に記載の組み合わせ。
前記逆転写酵素阻害剤は、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩又はテノホビルアラフェナミドフマル酸塩から選択される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組み合わせ。
前記系逆転写酵素阻害剤はエンテカビル又はテノホビルジソプロキシルフマル酸塩から選択される、請求項２３に記載の組み合わせ。
前記組み合わせは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩とａ～ｃのいずれかの群の薬物を医薬活性成分として混合して、医薬組成物を製造することを特徴とする、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
前記薬物活性成分として混合して、医薬組成物を製造することは、二つ又は三つの異なる薬物を医薬活性成分として一緒に混合して、複合医薬組成物を製造することを特徴とする、請求項２５に記載の組み合わせ。
前記組み合わせは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩とａ～ｃのいずれかの群の薬物をそれぞれ薬物活性成分として、それぞれ医薬組成物を製造し、さらに別々の包装で、服用時に別々に服用することを特徴とする、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
前記別々に服用することは、１種又は２種を先に服用し、次に別の１種又は２種を服用し、及び２種又は３種を同時に服用することを含むこと特徴とする、請求項２７に記載の組み合わせ。
Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療のための医薬の製造における、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組み合わせの使用。
請求項１～２８のいずれか一項に記載の組み合わせと少なくとも一つの薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含むこと特徴とする、医薬組成物。
請求項１～２８のいずれか一項に記載の組み合わせ、又は請求項３０に記載の組成物を含むこと特徴とする、キット。
Ｂ型肝炎の治療のための薬物の製造における、請求項３０に記載の医薬組成物、又は請求項３１に記載のキットの使用。