JP2023165683A - 限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するヒト化非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
【課題】限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するヒト化非ヒト動物を提供すること。【解決手段】限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、1つ以上のADAM6タンパク質をコードする異所性配列とを有するマウス、胚、細胞および組織を提供する。様々な実施形態において、ヒト化内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を発現することができるマウスを記載する。単一のヒトVH遺伝子セグメント、複数のヒトDH遺伝子セグメントおよび複数のヒトJH遺伝子セグメントを特徴とする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウス、胚、細胞および組織であって、ADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を発現することができるマウス、胚、細胞および組織も提供する。【選択図】なし
Description
分野
低減された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の複雑性を含む遺伝子操作非ヒト動物であって、ADAM6タンパク質またはその機能的断片を発現することができる遺伝子操作非ヒト動物を提供する。限られた数の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントおよび/またはその変異体から抗体を発現する遺伝子操作非ヒト動物であって、機能的内因性ADAM6遺伝子を欠くがADAM6機能を保持する遺伝子操作非ヒト動物、例えば、マウスを機能的ADAM6タンパク質作製不能にし、その結果、妊性を喪失させる内因性免疫グロブリン重鎖可変(VH)領域遺伝子座の改変を含むマウスを記載する。遺伝子改変マウスは、限られた数のVH遺伝子セグメント、例えば単一の免疫グロブリンVHセグメント、例えばヒトVH1-69遺伝子セグメントまたはヒトVH1-2遺伝子セグメントを特徴とする免疫グロブリンVH遺伝子座を含むマウスであって、ADAM6機能をさらに含むマウス、例えば、雄マウスに妊性を回復させる異所性核酸配列を含むマウスを記載する。
低減された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の複雑性を含む遺伝子操作非ヒト動物であって、ADAM6タンパク質またはその機能的断片を発現することができる遺伝子操作非ヒト動物を提供する。限られた数の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントおよび/またはその変異体から抗体を発現する遺伝子操作非ヒト動物であって、機能的内因性ADAM6遺伝子を欠くがADAM6機能を保持する遺伝子操作非ヒト動物、例えば、マウスを機能的ADAM6タンパク質作製不能にし、その結果、妊性を喪失させる内因性免疫グロブリン重鎖可変(VH)領域遺伝子座の改変を含むマウスを記載する。遺伝子改変マウスは、限られた数のVH遺伝子セグメント、例えば単一の免疫グロブリンVHセグメント、例えばヒトVH1-69遺伝子セグメントまたはヒトVH1-2遺伝子セグメントを特徴とする免疫グロブリンVH遺伝子座を含むマウスであって、ADAM6機能をさらに含むマウス、例えば、雄マウスに妊性を回復させる異所性核酸配列を含むマウスを記載する。
機能的ADAM6遺伝子座をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウス、細胞、胚および組織であって、単一のヒトVH遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現する遺伝子改変マウス、細胞、胚および組織を記載する。さらに、上記マウス、細胞、胚および組織は、機能的内因性ADAM6遺伝子を欠くが、ADAM6タンパク質をコードする異所性核酸配列の存在を特徴とするADAM6機能を保持する。ヒト病原体などの病原体に結合するのに有用である抗体配列を、妊性の非ヒト動物において作製するための方法が提供される。
背景
非ヒト動物、例えばマウスは、抗体ベースのヒト治療薬において使用するための抗体配列を作製するための方法において有用なツールになるように遺伝子操作されてきた。ヒト化可変領域遺伝子座(例えば、VH、DHおよびJH遺伝子ならびにVLおよびJL遺伝子)を有するマウスは、抗体治療薬において使用するための同種の(cognate)重鎖および軽鎖可変ドメインを生成するために使用される。同種の重鎖および軽鎖を有する完全ヒト抗体を生成するマウスは、当該技術分野において公知である。これらのマウスを作製する場合、ランダムに組み込まれた完全ヒト導入遺伝子が、該マウスにおいて発現する免疫グロブリンレパートリーとして機能するために、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を無能化する必要があった。かかるマウスは、ヒト治療薬としての使用に好適なヒト抗体を作製できるが、該マウスの免疫系に関わる重大な問題を提示する。これらの問題は、幾つかの実験的障害、例えば、マウスが十分に多様な抗体レパートリーの産生を実行できなくなる、広範なリエンジニアリングフィックス(re-engineering fixes)の使用を必要とする、おそらくヒト要素とマウス要素間の不適合性のため、最適以下のクローン選択過程を提供する、およびヒト治療薬の作製に真に有用であるために必要なヒト可変配列の大きな且つ多様な集団の信頼できない源、をもたらす。
非ヒト動物、例えばマウスは、抗体ベースのヒト治療薬において使用するための抗体配列を作製するための方法において有用なツールになるように遺伝子操作されてきた。ヒト化可変領域遺伝子座(例えば、VH、DHおよびJH遺伝子ならびにVLおよびJL遺伝子)を有するマウスは、抗体治療薬において使用するための同種の(cognate)重鎖および軽鎖可変ドメインを生成するために使用される。同種の重鎖および軽鎖を有する完全ヒト抗体を生成するマウスは、当該技術分野において公知である。これらのマウスを作製する場合、ランダムに組み込まれた完全ヒト導入遺伝子が、該マウスにおいて発現する免疫グロブリンレパートリーとして機能するために、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を無能化する必要があった。かかるマウスは、ヒト治療薬としての使用に好適なヒト抗体を作製できるが、該マウスの免疫系に関わる重大な問題を提示する。これらの問題は、幾つかの実験的障害、例えば、マウスが十分に多様な抗体レパートリーの産生を実行できなくなる、広範なリエンジニアリングフィックス(re-engineering fixes)の使用を必要とする、おそらくヒト要素とマウス要素間の不適合性のため、最適以下のクローン選択過程を提供する、およびヒト治療薬の作製に真に有用であるために必要なヒト可変配列の大きな且つ多様な集団の信頼できない源、をもたらす。
ヒト抗体治療薬は、選択された抗原に関して所望される特徴に基づき操作される。ヒト化マウスを選択抗原で免疫し、免疫したマウスを用いて、所望の結合特徴を有する高親和性の同種の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを同定するための抗体集団を生成する。内因性マウス遺伝子座において可変領域だけをヒト化させたヒト化マウスなど、一部のヒト化マウスは、特徴および数が野生型マウスのB細胞集団と類似するB細胞集団を生成する。結果として、多数の異なる免疫グロブリン再構成を反映する抗体をスクリーニングして、最も所望される特徴を有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを同定するためのこれらのマウスでは、極めて大きくかつ多様なB細胞集団が利用可能である。
しかし、すべての抗原が、可変(V)セグメントの広範な選択に由来する極めて多数の再構成を示す免疫応答を惹起するわけではない。すなわち、特定の抗原に対するヒト体液性免疫応答は見かけ上限定される。限定は、十分に高い親和性および特異性で特定の抗原に結合する特定のVセグメントのみを発現するB細胞のクローン選択に反映される。一部のかかる抗原は、臨床的に有意義である、すなわち、それらの一部は、周知のヒト病原体である。ヒト免疫応答において発現されるVセグメントは、その抗原に対するヒト抗体応答において観察されたことのないランダムに選択されたVセグメントよりも、ヒトDセグメントおよびヒトJセグメントを組み合わせて、有用な高親和性抗体を生成する可能性が高いVセグメントであるという仮説が提起されている。
ヒトと病原体との間の経験の千年間にわたる自然選択は、病原体を中和するためのその最も有効な武器をデザインするのに最も効率的な基礎または基盤(選択されたV遺伝子セグメント)を選択したと仮定されている。当該技術分野においては、上記で論じられた病原体のような抗原に結合し、および/またはこれらを中和する、優れた抗体が必要とされている。有用な配列を、多型および/または体細胞変異させた選択V遺伝子セグメントを含めた選択V遺伝子セグメントからより迅速に生成させること、および、その体細胞変異バージョンを含めた様々なDおよびJ遺伝子セグメントとのV遺伝子セグメントの再構成、特に、固有で有用なCDR3領域との再構成を有する有用なB細胞集団をより迅速に生成することが必要とされている。治療的に有用な抗体可変領域配列を、選択されたV遺伝子セグメントから、例えば、既存の改変動物において達成され得る数および多様性を増大させて生成させ、それと同時に、遺伝子改変に起因し得る有害な変化を低減または排除し得る改善された生物系、例えば、非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ウサギなど)が必要とされている。限定された選択V遺伝子セグメントであって、特定のヒト病原体を含め、選択された抗原に対するヒト抗体ベースの治療剤の製造において有用な同種のヒト重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが含まれるがこれらに限定されないV遺伝子セグメントに由来する抗体の可変配列をクローン選択するために拘束された体液性免疫系を有するように操作された改善された生物系が必要とされている。当該技術分野においては、ヒト集団の負担となる病原体の排除を対象とするヒト抗体配列を含む免疫グロブリン配列を生成するのに有用な改良された遺伝子改変マウスを作製することが依然として必要とされている。
当該技術分野においては、単一のヒト可変遺伝子セグメントに由来する重鎖を含有する抗原特異的抗体を含め、ウイルス抗原、例えば、HIVおよびHCVを中和することが可能な治療用抗体が必要とされている。また、単一のヒトVHセグメントに由来する重鎖であってCDR配列の多様なセットを有する重鎖(同種のヒト軽鎖と共に発現する重鎖を含む)のレパートリーを含む抗体を含め、ならびにヒトゲノム配列を非ヒト動物のゲノムに挿入することに起因する望ましくない効果の回復を含め、有用な抗体を作製するためのさらなる方法および非ヒト動物も必要とされている。例えば、ヒト治療薬の作製における使用のための体細胞変異した、およびクローン選択した免疫グロブリン可変ドメインを生成するための組成物および方法を含め、免疫グロブリンベースの結合タンパク質のCDRを選択するための方法であって、それから選ぶための結合タンパク質の多様性を増強する、および免疫グロブリン可変ドメインの多様性を増強する方法が必要とされている。
概要
限られた数の異なる重鎖可変領域遺伝子セグメント(すなわち、V遺伝子、VH遺伝子、VH遺伝子セグメント、またはV遺伝子セグメント)、例えば、1つ以下、2つ以下、もしくは3つ以下の異なるV遺伝子を含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座、あるいは、例えば、単一のコピーもしくは複数コピーで存在し、および/または1つ以上の多型を含む、1つ以下のV遺伝子セグメントのファミリーメンバーを含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を提供し、様々な実施形態において、遺伝子座は、内因性機能的ADAM6タンパク質をコードする配列を欠く。
限られた数の異なる重鎖可変領域遺伝子セグメント(すなわち、V遺伝子、VH遺伝子、VH遺伝子セグメント、またはV遺伝子セグメント)、例えば、1つ以下、2つ以下、もしくは3つ以下の異なるV遺伝子を含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座、あるいは、例えば、単一のコピーもしくは複数コピーで存在し、および/または1つ以上の多型を含む、1つ以下のV遺伝子セグメントのファミリーメンバーを含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を提供し、様々な実施形態において、遺伝子座は、内因性機能的ADAM6タンパク質をコードする配列を欠く。
限定される重鎖V遺伝子レパートリー、例えば、単一のVH遺伝子セグメントである重鎖V遺伝子レパートリー、または単一のVH遺伝子セグメントの複数の多型変異体から選択される重鎖V遺伝子レパートリーに由来する重鎖可変ドメインをコードする遺伝子を再構成および形成することが可能な遺伝子座を提供し、ここで、様々な実施形態において、該遺伝子座は、内因性機能的ADAM6遺伝子またはその機能的断片を欠く。
内因性機能的ADAM6遺伝子を欠き、ヒト免疫グロブリン配列、例えば、ヒトまたは(またはヒト/非ヒトキメラ)非ヒト免疫グロブリン定常配列に作動可能に連結された(かつ、例えば、Dセグメントおよび/またはJセグメントと作動可能な連結にある)ヒトVセグメントを含む遺伝子座を含む改変免疫グロブリン遺伝子座を提供する。単一のVH遺伝子セグメントの複数コピーを含む改変遺伝子座であって、コピーのうちの1つ以上が多型変異体を含み、非ヒト動物において機能的であるADAM6タンパク質またはその断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を包含する改変遺伝子座を提供する。非ヒト免疫グロブリン定常配列、例えば、マウス、ラットまたはヒト配列に作動可能に連結された、1つ以上のDセグメントおよび1つ以上のJセグメントと作動可能に連結された単一のVHセグメントの複数コピーを含む改変遺伝子座を提供する。また、かかるヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物であって、野生型妊性を有する非ヒト動物も提供する。
D遺伝子セグメントおよび/またはJ遺伝子セグメントに作動可能に連結された単一のVHセグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座(例えば、導入遺伝子上の(one a transgene)免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座、または内因性非ヒト動物重鎖可変遺伝子座における挿入もしくは置換としての免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座)を含む非ヒト動物を提供する。様々な実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物の上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座において、1つ以上のD遺伝子セグメントおよび/または1つ以上のJ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、改変重鎖遺伝子座を含む雄非ヒト動物において機能的なADAM6タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログをコードする異所性ヌクレオチド配列をさらに含む。様々な実施形態において、異所性ヌクレオチド配列は、上記単一のVHセグメント、D遺伝子セグメントまたはJ遺伝子セグメントに隣接している。様々な実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記非ヒト動物のゲノム内の非免疫グロブリン配列に隣接する。1つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。1つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座と異なる染色体上にある。
それらの免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性免疫グロブリンVHセグメント(例えば、すべての機能的セグメント、またはほぼすべての機能的セグメント)を欠失させるように改変され、非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、DセグメントおよびJセグメントまたはJセグメントに作動可能に連結されたヒトVH1-69セグメント(またはヒトVH1-2セグメント)を含む非ヒト動物を提供する。かかる遺伝子座を含む非ヒト動物であって、内因性ADAM6遺伝子(複数可)を欠く非ヒト動物も提供する。
非ヒト動物においてヒト免疫グロブリン配列を作製するための方法を提供する。様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、単一のヒトVセグメント、例えば、VH1-69またはVH1-2、ならびに1つ以上のDセグメントおよびJセグメントまたは1つ以上のJセグメントから本質的になる免疫グロブリンV配列のレパートリーに由来する。非ヒト動物、非ヒト組織、および非ヒト細胞において、ヒト免疫グロブリン配列を作製するための方法であって、上記ヒト免疫グロブリン配列が病原体に結合する方法を提供する。
1つの態様では、非機能的内因性マウスADAM6タンパク質またはADAM6遺伝子(例えば、内因性ADAM6遺伝子のノックアウトまたは内因性ADAM6遺伝子内での欠失)を生じさせる結果となる改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。1つの実施形態において、上記マウスは、齧歯動物ADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む;特定の実施形態において、上記齧歯動物ADAM6タンパク質は、マウスADAM6タンパク質である。
1つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。1つの実施形態において、上記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、上記改変は、雄マウスの細胞または組織のADAM6活性を低減させるかまたは除去する。1つの実施形態において、上記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、上記改変は、雄マウスの細胞または組織のADAM6活性を保持するまたは持続させる。
1つの態様では、Vセグメントの正体(identity)に関して限定された重鎖Vセグメントのレパートリーを含み、1つ以上のDセグメントおよび1つ以上のJセグメント、または1つ以上のJセグメントを含む、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する。1つの実施形態において、上記重鎖Vセグメントは、ヒトセグメントである。1つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性ADAM6遺伝子を欠く。1つの実施形態において、上記改変重鎖遺伝子座は、ADAM6タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座において上記V、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントに隣接している。
1つの実施形態において、上記改変遺伝子座は、非ヒト遺伝子座である。1つの実施形態において、上記非ヒト遺伝子座は、少なくとも1つのヒト免疫グロブリン配列で改変されている。1つの実施形態において、上記非ヒト遺伝子座は、少なくとも1つのヒト免疫グロブリン配列と、ADAM6タンパク質をコードする配列とで改変されている。
1つの実施形態において、上記限定は、1つのVセグメントファミリーメンバーに対するものである。1つの実施形態において、上記1つのVセグメントファミリーメンバーは、2コピー以上で存在する。1つの実施形態において、上記1つのVセグメントファミリーメンバーは、2つ以上の変異体(例えば、Vセグメントファミリーメンバーの2つ以上の多型形態)として存在する。1つの実施形態において、上記1つのVセグメントは、ヒトVセグメントファミリーメンバーである。1つの実施形態において、上記1つのVセグメントファミリーメンバーは、その変異体に関してヒト集団内で観察される多数の変異体で存在する。1つの実施形態において、上記Vセグメントファミリーメンバーは、表1から選択される。1つの実施形態において、上記Vセグメントファミリーメンバーは、各Vセグメントについて、1つの対立遺伝子~表1の右欄で示される数の対立遺伝子にわたる多数の対立遺伝子で示されるとおりの多数の変異体で存在する。
1つの態様では、マウスADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する;マウスADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも1つの遺伝子改変を含むマウスも提供する。1つの実施形態において、マウスADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする上記内因性ヌクレオチド配列は、野生型マウスの内因性ADAM6遺伝子と比較して異所位置にある。
1つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための方法を提供する。
1つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座(またはその欠失)を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは、交配によって子孫を産生することができる。1つの実施形態において、上記雄マウスは、マウス子宮からマウス卵管を通って移行してマウス卵子を受精させることができる精子を産生できる。
1つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座(またはその欠失)を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは妊性の低減を示し、および該マウスは、その妊性低減を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、雄マウスの精子が、マウス子宮からマウス卵管を通って移動してマウス卵子を受精させることができないことを特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、in vivo移動欠陥を示す精子を特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減を全部または一部回復させる遺伝子改変は、雄マウスにおいて機能的であるマウスADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列である。
1つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の、別の種(例えば、非マウス種)の限られた数、例えば、1つ以下、2つまたは3つの異なる重鎖可変(VH)遺伝子セグメント、1つ以上の重鎖多様性(DH)遺伝子セグメントおよび1つ以上の重鎖連結(JH)遺伝子セグメントによる置換を含む。1つの実施形態において、上記遺伝子改変は、単一のオルソロガス免疫グロブリンVH遺伝子セグメント、少なくとも1つのDH遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJH遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座への挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトである。1つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の欠失を含み、該欠失は、内因性ADAM6機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、上記内因性ADAM6機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連づけられる。1つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の不活性化を含み、上記欠失は、内因性ADAM6機能の喪失を生じさせる結果とならない。不活性化は、内因性遺伝子セグメントを含む抗体の重鎖をコードするように再構成するのが実質的にできない内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を生じさせる結果となる1つ以上の内因性遺伝子セグメントの置換または欠失を含み得る。不活性化は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が抗体の重鎖をコードするように再構成するのを不可能にする他の改変を含み得、該改変は、内因性遺伝子セグメントの置換または欠失を含まない。例示的な改変としては、例えば、部位特異的な組換え部位の正確な配置を使用する分子技術(例えば、Cre-lox技術)によって媒介される染色体の逆位および/または転座が挙げられる。
1つの実施形態において、上記遺伝子改変は、1つ以上の定常領域配列(例えば、IgMおよび/またはIgG遺伝子)に作動可能に連結された別の種(例えば、非マウス種)の限られた数の、例えば、1つ以下、2つまたは3つの異なる重鎖可変(VH)遺伝子セグメント、1つ以上の重鎖多様性(DH)遺伝子セグメントおよび1つ以上の重鎖連結(JH)遺伝子セグメントを含有するDNA断片の、上記マウスのゲノムへの挿入を含む。1つの実施形態において、上記DNA断片は、抗体の重鎖をコードする配列を形成するように再構成を受けることができる。1つの実施形態において、上記遺伝子改変は、単一のオルソロガス免疫グロブリンVH遺伝子セグメント、少なくとも1つのDH遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJH遺伝子セグメントの、上記マウスのゲノムへの挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトである。1つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を非機能的にする内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の欠失を含み、該欠失はさらに、内因性ADAM6機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、上記内因性ADAM6機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連づけられる。
1つの態様では、内因性ADAM6対立遺伝子からのマウスADAM6発現を低減させるまたは除去する改変を有する雄マウスが、内因性ADAM6機能の低減または除去に起因して、妊性低減(例えば、交配による子孫産生能力の高度低減)を示すまたは本質的に不妊性であるように、該改変を含み、さらに、異所性ADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む、マウスを提供する。1つの態様において、マウスADAM6発現を低減させるまたは除去する改変は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変(例えば、挿入、欠失、置換など)である。1つの実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座である。
1つの実施形態において、ADAM6機能の低減または喪失は、マウスが、マウス子宮からマウス卵管を通って進んでマウス卵子を受精させることのできる精子を産生できないことまたは実質的に産生できないこと含む。特定の実施形態において、上記マウスの射精体積中の産生された精子細胞の少なくとも約95%、96%、97%、98%または99%は、交尾後にin vivoで卵管を通って進むことができず、マウス卵子を受精させることができない。
1つの実施形態において、ADAM6機能の低減または喪失は、上記マウスの精子細胞の表面でADAM2および/またはADAM3および/またはADAM6の複合体を形成できないことまたは実質的に形成できないことを含む。1つの実施形態において、ADAM6機能の喪失は、雌マウスとの交尾によってマウス卵子を受精させることが実質的にできないことを含む。
1つの態様において、機能的内因性ADAM6遺伝子を欠いているマウスであって、該マウスにADAM6機能性を付与するタンパク質(またはタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列)を含むマウスを提供する。1つの実施形態において、上記マウスは雄マウスであり、上記機能性は、機能的内因性ADAM6遺伝子を欠いているマウスと比較して強化された妊性を含む。
1つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。もう1つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトVH、少なくとも1つのヒトDHおよび少なくとも1つのヒトJH遺伝子セグメントを含む。もう1つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、1つのヒトVH遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記異所性タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。1つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ROSA26遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、組織特異的発現と関連づけられる。1つの実施形態において、上記組織特異的発現は、生殖組織に存在する。1つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入されたゲノム配列によってコードされている。
1つの実施形態において、上記マウスは、ヒトまたはキメラヒト/マウスまたはキメラヒト/ラット軽鎖(例えば、ヒト可変、マウスまたはラット定常)とキメラヒト可変/マウスまたはラット定常重鎖とを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、転写活性プロモーター、例えばROSA26プロモーター、に作動可能に連結されているキメラヒト可変/ラットまたはマウス定常軽鎖遺伝子を含む導入遺伝子を含む。さらなる特定の実施形態において、上記キメラヒト/マウスまたはラット軽鎖導入遺伝子は、上記マウスの生殖細胞系内に再構成ヒト軽鎖可変領域配列を含む。
1つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にある。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。1つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトVH、少なくとも1つのヒトDHおよび少なくとも1つのヒトJH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトVH、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にある。1つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ROSA26遺伝子座である。1つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入された位置にある。
1つの態様では、機能的内因性ADAM6遺伝子を欠いているマウスであって、マウスADAM6機能の喪失を補う異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する。1つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスに、機能的内因性ADAM6遺伝子を含有する対応する野生型マウスに匹敵する子孫産生能力を付与する。1つの実施形態において、上記配列は、上記マウスの精子細胞の表面でADAM2および/またはADAM3および/またはADAM6の複合体を形成する能力を、上記マウスに付与する。1つの実施形態において、上記配列は、上記マウスに、マウス子宮からマウス卵管を通ってマウス卵子へと進んで該卵子を受精させる能力を付与する。
1つの実施形態において、上記機能的内因性ADAM6遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、同じ年齢および系統の野生型マウスが6ヶ月の期間に産生する同腹子の数の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%の数の同腹子を産生する。
1つの実施形態において、上記機能的内因性ADAM6遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、6ヶ月に期間にわたって交配させたとき、実質的に同じ期間にわたって実質的に同じ条件下で交配させた、該機能的内因性ADAM6遺伝子を欠き該異所性ヌクレオチド配列を欠いている同じ年齢および同じまたは類似系統のマウスに比べて、少なくとも約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約6倍、約7倍、約8倍または約10以上後代を産生する。
1つの実施形態において、上記機能的内因性ADAM6遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、4または6ヶ月の交配期間中に、該機能的内因性ADAM6遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無い、同じ期間交配させたマウスより、同腹子あたり平均少なくとも約2倍、3倍、4倍多い数の子を産生する。
1つの実施形態において、上記機能的内因性ADAM6遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは雄マウスであり、該雄マウスは、交尾後約5~6時間の時点で卵管から回収したとき、該機能的内因性ADAM6遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無いマウスに比べて少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、100倍、110倍または120倍以上である卵管移動を表わす精子を産生する。
1つの実施形態において、上記機能的内因性ADAM6遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、雌マウスと交尾させたとき、野生型マウスからの精子にほぼ等しい効率で約6時間以内に子宮を通り抜けて卵管に入って卵管を通り抜けることができる精子を産生する。
1つの実施形態において、上記機能的内因性ADAM6遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、該機能的ADAM6遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無いマウスに比べて、匹敵する期間内に約1.5倍、約2倍、約3倍または約4倍以上の同腹子を産生する。
1つの態様では、免疫グロブリンタンパク質をコードする非マウス核酸配列をその生殖細胞系内に含むマウスを提供し、上記非マウス免疫グロブリン配列は、マウスADAM6遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片の挿入を含む。1つの実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列を含む。1つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列を含む。1つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配列を含む。1つの実施形態において、上記配列は、単一のVH遺伝子セグメント、1つ以上のDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のJH遺伝子セグメントを含む;1つの実施形態において、上記配列は、1つ以上のVL遺伝子セグメントおよび1つ以上のJL遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記単一のVH、1つ以上のDHおよび1つ以上のJH遺伝子セグメント、または1つ以上のVLおよびJL遺伝子セグメントは、再構成されない。1つの実施形態において、上記単一のVH、1つ以上のDHおよび1つ以上のJH遺伝子セグメント、または1つ以上のVLおよびJL遺伝子セグメントは、再構成される。1つの実施形態において、上記単一のVH、1つ以上のDHおよび1つ以上のJH遺伝子セグメント、または1つ以上のVLおよびJL遺伝子セグメントの再構成後、上記マウスは、マウスADAM6遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも1つの核酸配列をそのゲノム内に含む。1つの実施形態において、再構成後、上記マウスは、マウスADAM6遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも2つの核酸配列をそのゲノム内に含む。1つの実施形態において、再構成後、上記マウスは、マウスADAM6遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも1つの核酸配列をそのゲノム内に含む。1つの実施形態において、上記マウスは、上記ADAM6遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をB細胞内に含む。1つの実施形態において、上記マウスは、上記ADAM6遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を非B細胞内に含む。
1つの態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその機能的断片を内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるADAM6活性を含むマウスを提供する。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、多型ヒトVH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトVH1-2遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記雄マウスは、単一の未改変内因性ADAM6対立遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログ(ortholog of homolog)もしくは機能的断片を内因性ADAM6遺伝子座に含む。
1つの実施形態において、上記雄マウスは、ADAM6機能を付与するタンパク質をコードする異所性マウスADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
1つの実施形態において、上記雄マウスは、上記内因性マウスADAM6対立遺伝子の場所に近いマウスゲノム内の場所、例えば、V遺伝子セグメント配列の3’および最初のD遺伝子セグメントの5’にADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記雄マウスは、ヒトVH遺伝子セグメントの3’およびヒトDH遺伝子セグメントの5’にADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。もう1つの特定の実施形態において、上記雄マウスは、ヒトVH遺伝子セグメントの5’にADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。もう1つの特定の実施形態において、上記雄マウスは、単一のヒトVH遺伝子セグメント、1つ以上のDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のJH遺伝子セグメントを含むキメラ重鎖遺伝子座の5’にADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。1つの実施形態において、上記キメラ重鎖遺伝子座は、ヒトVH1-69遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記キメラ重鎖遺伝子座は、ヒトVH1-2遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記雄マウスは、免疫グロブリン可変遺伝子セグメントまたは免疫グロブリン多様性遺伝子セグメントをコードする核酸配列の(ADAM6配列の転写方向に関して)上流、下流、または上流および下流に隣接するADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、マウスにおいて機能的である上記マウスADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする上記配列は、ヒトVH遺伝子セグメント間にある;1つの実施形態において、上記マウスは、1つのヒトVH遺伝子セグメントを含み、上記配列は、上記VH遺伝子セグメントの5’の位置にある;1つの実施形態において、上記配列は、上記VH遺伝子セグメントの3’の位置にある;1つの実施形態において、上記配列は、上記VH遺伝子セグメントと上記最初のDH遺伝子セグメントとの間の位置にある。特定の実施形態において、上記DH遺伝子セグメントは、上記最初のDH遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記マウスは、2つのVH遺伝子セグメントを含み、上記配列は、上記2つのVH遺伝子セグメント間の位置にある;1つの実施形態において、上記配列は、VH遺伝子セグメントとDH遺伝子セグメントとの間の位置にある。特定の実施形態において、上記DH遺伝子セグメントは、上記最初のDH遺伝子セグメントである。
1つの実施形態において、上記雄マウスは、野生型雄マウスと同じまたは実質的に同じ内因性免疫グロブリン遺伝子座内の位置にあるADAM6配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、抗体の重鎖をコードできない。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、それが抗体の重鎖をコードできないようにする上記雄マウスのゲノム内の場所に配置される。様々な実施形態において、上記雄マウスは、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと同じ染色体上にあるADAM6配列を含み、上記ADAM6配列は、機能的ADAM6タンパク質をコードする。
1つの態様では、非機能的内因性ADAM6遺伝子、または内因性ADAM6遺伝子の欠失をその生殖細胞系内に含む雄マウスを提供し、該マウスの精子細胞は、雌マウスの卵管を通過することができ、卵子を受精させることができる。1つの実施形態において、上記マウスは、雄マウスにおいて機能的であるマウスADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片の染色体外コピーを含む。1つの実施形態において、上記マウスは、雄マウスにおいて機能的である異所性マウスADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。
1つの態様において、内因性マウスADAM6機能を低減させる遺伝子改変を含むマウスであって、全部もしくは一部機能的である内因性未改変対立遺伝子(例えば、ヘテロ接合体)によってあるいは雄マウスにおいて機能的であるADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性配列からの発現によってもたらされる、少なくともいくらかのADAM6機能性を含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスは、機能的ADAM6を欠いている雄マウスと比較して、交配により子孫を産生する能力を雄マウスに付与するのに十分なADAM6機能を含む。1つの実施形態において、上記ADAM6機能は、マウスADAM6またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列の存在によって付与される。1つの実施形態において、上記ADAM6機能は、内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在する内因性ADAM6遺伝子によって付与され、該内因性免疫グロブリン遺伝子座は、抗体の重鎖をコードできない。雄マウスにおいて機能的であるADAM6ホモログもしくはオルソログまたはその断片としては、十分な内因性マウスADAM6活性が無い雄マウスにおいて観察される子孫産生能力の喪失、例えば、ADAM6ノックアウトマウスにおいて観察される能力の喪失を全部または一部回復させるものが挙げられる。この意味で、ADAM6ノックアウトマウスには、内因性遺伝子座またはその断片を含むが機能的でない、すなわち、ADAM6(ADAM6aおよび/もしくはADAM6b)をまったく発現しない、または野生型雄マウスの本質的に正常な子孫産生能力を支持するのに不十分であるレベルでADAM6(ADAM6aおよび/もしくはADAM6b)を発現するマウスが含まれる。機能の喪失は、例えば、上記遺伝子座の構造遺伝子(すなわちADAM6aもしくはADAM6bコーディング領域)の改変、または上記遺伝子座の調節領域(例えば、ADAM6a遺伝子に対して5’のまたはADAM6aもしくはADAM6bコーディング領域の3’の配列であって、ADAM6遺伝子の転写、ADAM6 RNAの発現またはADAM6タンパク質の発現を全部または一部制御する配列)の改変に起因し得る。様々な実施形態において、雄マウスにおいて機能的であるオルソログもしくはホモログまたはその断片は、雄マウスの精子(または雄マウスの射精液中の大部分の精子細胞)がマウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることを可能にするものである。
1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン可変領域またはその機能的断片を発現する雄マウスは、雌マウスとの交配により子孫を産生する能力を該雄マウスに付与するのに十分なADAM6活性を含み、1つの実施形態において、雌マウスと交配するとき、上記雄マウスは、1つまたは2つの内因性未改変ADAM6対立遺伝子を有するマウスの子孫産生能力の、1つの実施形態では少なくとも25%、1つの実施形態では少なくとも30%、1つの実施形態では少なくとも40%、1つの実施形態では少なくとも50%、1つの実施形態では少なくとも60%、1つの実施形態では少なくとも70%、1つの実施形態では少なくとも80%、1つの実施形態では少なくとも90%、および1つの実施形態では該マウスの子孫産生能力とほぼ同じである、子孫産生能力を示す。
1つの実施形態において、雄マウスは、該雄マウスからの精子細胞が雌マウス卵巣を通り抜けることおよびマウス卵子を受精させることを可能にするために十分なADAM6(またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片)を発現する。
1つの実施形態において、上記ADAM6機能性は、マウス染色体配列に隣接する核酸配列によって付与される(例えば、上記核酸は、マウス染色体にランダムに組み込まれている;または例えば、上記核酸を特定の場所にターゲティングすることにより、例えば部位特異的リコンビナーゼ媒介(例えば、Cre媒介)挿入もしくは相同組換えにより、特定の場所に配置されている)。1つの実施形態において、上記ADAM6配列は上記マウスの染色体とは異なる核酸上に存在する(例えば、上記ADAM6配列は、エピソーム上に、すなわち染色体外に、例えば、発現構築物、ベクター、YAC、導入染色体などに存在する)。
1つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該マウスは、免疫グロブリン重鎖配列の少なくとも一部分、例えば、ヒト配列の少なくとも一部分を発現し、該マウスは、雄マウスにおいて機能的であるADAM6活性を含む。1つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのADAM6活性を低減させるまたは根絶する。1つの実施形態では、上記マウスは、ADAM6活性をコードする両方の対立遺伝子が、不在であるように、または雄マウスにおいて正常交配を支持するように実質的に機能しないADAM6を発現するように、改変される。1つの実施形態において、上記マウスは、マウスADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性核酸配列をさらに含む。1つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのADAM6活性を維持し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が抗体の重鎖をコードできないようにする。特定の実施形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が抗体の重鎖をコードできないようにする染色体の逆位およびまたは転座を含む。
1つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該改変は、該遺伝子座のADAM6配列から発現するADAM6活性を低減させるまたは除去するものであり、および該マウスは、ADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。様々な実施形態において、上記ADAM6タンパク質またはその断片は、異所性ADAM6配列によってコードされている。様々な実施形態において、上記ADAM6タンパク質またはその断片は、内因性ADAM6対立遺伝子から発現する。様々な実施形態において、上記マウスは、第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ADAM6の発現を低減させるまたは除去する第一の改変を含む第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子と、第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ADAM6の発現を実質的に低減させないまたは除去しない第二の改変を含む第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子とを含む。
1つの実施形態において、上記第二の改変は、最後のマウスV遺伝子グメントの(マウスV遺伝子セグメントの転写方向性に対して)3’にあり、およびマウス(またはキメラヒト/マウス)免疫グロブリン重鎖定常遺伝子またはその断片(例えば、ヒトおよび/またはマウス:CH1および/またはヒンジおよび/またはCH2および/またはCH3をコードする核酸配列)の(定常配列の転写方向性に対して)5’にある。
1つの実施形態において、上記改変は、第一のADAM6対立遺伝子をコードする第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ADAM6機能は、機能的ADAM6をコードする第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での内因性ADAM6の発現の結果として生じ、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、V、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの少なくとも1つの改変を含む。特定の実施形態において、上記V、DおよびまたはJ遺伝子セグメントの上記少なくとも1つの改変は、欠失、単一のヒトVH、1つ以上のDHおよび/または1つ以上のJH遺伝子セグメントによる置換、ラクダ科動物VH(またはVHH)、DHおよび/またはJH遺伝子セグメントによる置換、ヒト化またはラクダ化VH(またはVHH)、DHおよび/またはJH遺伝子セグメントによる置換、重鎖配列の軽鎖配列による置換、ならびにその組み合わせである。1つの実施形態において、上記少なくとも1つの改変は、上記重鎖遺伝子座における1つ以上のVH、DHおよび/またはJH遺伝子セグメントの欠失ならびに1つ以上のVLおよび/またはJL遺伝子セグメント(例えば、ヒトVLおよび/またはJL遺伝子セグメント)での置換である。
1つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子、および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ADAM6機能は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座での異所性ADAM6発現の結果として生ずる。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ROSA26遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、生殖組織において転写活性である。
1つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ADAM6機能は、上記第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ADAM6の発現の結果として生じる。1つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ADAM6機能は、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ADAM6の発現の結果として生じる。
1つの態様では、ADAM6のヘテロ接合またはホモ接合ノックアウトを含むマウスを提供する。1つの実施形態において、上記マウスは、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン配列またはラクダ科動物もしくはラクダ化ヒトもしくはマウス免疫グロブリン配列である、改変免疫グロブリン配列をさらに含む。1つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座に存在する。1つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にヒト重鎖可変遺伝子配列を含む。1つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変遺伝子配列は、上記内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性マウス重鎖可変遺伝子配列を置換する。
1つの態様では、内因性マウスADAM6遺伝子座から機能的内因性マウスADAM6を発現できないマウスを提供する。1つの実施形態において、上記マウスは、該マウスにおいて機能的であるADAM6またはその機能的断片をコードする異所性核酸配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、ADAM6ノックアウトに関してホモ接合性である雄マウスによって示される子孫産生能力の喪失をレスキューするタンパク質をコードする。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、マウスADAM6タンパク質をコードする。
1つの態様では、機能的内因性ADAM6遺伝子座を欠いているマウスであって、該マウスにADAM6機能を付与する異所性核酸配列を含むマウスを提供する。1つの実施形態において、上記核酸配列は、内因性マウスADAM6配列またはその機能的断片を含む。1つの実施形態において、上記内因性マウスADAM6配列は、野生型マウスにおける最も3’側の(the 3’-most)マウス免疫グロブリン重鎖V遺伝子セグメント(VH)と最も5’側の(the 5’-most)マウス免疫グロブリン重鎖D遺伝子セグメント(DH)との間にあるADAM6aおよびADAM6bコード配列を含む。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、マウスADAM6aもしくはその機能的断片をコードする配列、および/またはマウスADAM6bもしくはその機能的断片をコードする配列を含み、該ADAM6aおよび/もしくはADAM6bまたはその機能的断片(単数もしくは複数)は、プロモーターに作動可能に連結されている。1つの実施形態において、上記プロモーターは、ヒトプロモーターである。1つの実施形態において、上記プロモーターは、マウスADAM6プロモーターである。特定の実施形態において、上記ADAM6プロモーターは、最も5’側のマウスDH遺伝子セグメントに最も近い第一のADAM6遺伝子の第一コドンと、最も5’側のDH遺伝子セグメントの組換えシグナル配列との間にある配列を含み、ここで、5’は、マウス免疫グロブリン遺伝子の転写方向に関して示される。1つの実施形態において、上記プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態において、上記ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。1つの実施形態において、上記プロモーターは、ユビキチンプロモーターである。
1つの実施形態において、上記プロモーターは、誘導性プロモーターである。1つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、非生殖組織での発現を調節する。1つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、生殖組織での発現を調節する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6aおよび/もしくはADAM6b配列またはその機能的断片(単数もしくは複数)の発現は、生殖組織において誘導性プロモーターによって発生調節される。
1つの実施形態において、上記マウスADAM6aおよび/またはADAM6bは、配列番号1のADAM6aおよび/または配列番号2(sequence SEQ ID NO:2)のADAM6bから選択される。
1つの実施形態において、上記マウスADAM6プロモーターは、配列番号3のプロモーターである。特定の実施形態において、上記ADAM6プロモーターは、ADAM6aの第一コドンの(ADAM6aの転写方向に関して)直ぐ上流の配列番号3の核酸配列であって、ADAM6コーディング領域の上流の配列番号3の端にわたる(extending)核酸配列を含む。もう1つの特定の実施形態において、上記ADAM6プロモーターは、ADAM6aの開始コドンの上流約5から約20ヌクレオチド以内からADAM6aの開始コドンの上流約0.5kb、1kb、2kbまたは3kb以上にわたる断片である。
1つの実施形態において、上記マウスADAM6プロモーターは、配列番号73のプロモーターである。特定の実施形態において、上記マウスADAM6プロモーターは、ADAM6aの第一コドンの(ADAM6aの転写方向に関して)直ぐ上流の配列番号73の核酸配列であって、ADAM6コーディング領域の上流の配列番号73の端にわたる核酸配列を含む。もう1つの特定の実施形態において、上記ADAM6プロモーターは、ADAM6aの開始コドンの上流約5から約20ヌクレオチド以内からADAM6aの開始コドンの上流約0.5kb、1kb、2kbまたは3kb以上にわたる断片である。
1つの実施形態において、上記マウスADAM6プロモーターは、配列番号77のプロモーターである。特定の実施形態において、上記ADAM6プロモーターは、ADAM6aの第一コドンの(ADAM6aの転写方向に関して)直ぐ上流の配列番号77の核酸配列であって、ADAM6コーディング領域の上流の配列番号77の端にわたる核酸配列を含む。もう1つの特定の実施形態において、上記ADAM6プロモーターは、ADAM6aの開始コドンの上流約5から約20ヌクレオチド以内からADAM6aの開始コドンの上流約0.5kb、1kb、2kbまたは3kb以上にわたる断片である。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、ADAM6欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号3またはその断片を含む。1つの実施形態において、配列番号3またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、ADAM6欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号73またはその断片を含む。1つの実施形態において、配列番号73またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、ADAM6欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号77またはその断片を含む。1つの実施形態において、配列番号77またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
1つの態様では、ADAM6タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列の欠失と、内因性マウスVH遺伝子セグメントの、ヒトVH遺伝子セグメントによる置換と、雄マウスにおいて機能的であるマウスADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列とを含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスは、内因性ADAM6遺伝子を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座ヌクレオチド配列の欠失を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含み、および上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にある、または該1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。
1つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトVH遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、すべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの置換を含み、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該単一のヒトVH遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にあるか、該単一のヒトVH遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。1つの実施形態において、上記マウスは、内因性DH遺伝子遺伝子座における1つ以上のヒトDH遺伝子セグメントでの、1つ以上の内因性DH遺伝子セグメントの置換をさらに含む。1つの実施形態において、上記マウスは、内因性JH遺伝子遺伝子座における1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントでの、1つ以上の内因性JH遺伝子セグメントの置換をさらに含む。1つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトVH、1つ以上のヒトDHおよび1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントでの、すべてのまたは実質的にすべての内因性VH、DHおよびJH遺伝子セグメントの置換ならびに内因性VH、DHおよびJH遺伝子遺伝子座における置換を含み、この場合のマウスは、マウスADAM6タンパク質をコードする異所性配列を含む。特定の実施形態において、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性配列は、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントの上流または5’に配置される。もう1つの特定の実施形態において、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性配列は、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントの下流または3’に配置される。もう1つの特定の実施形態において、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性配列は、存在する上記単一のヒトVH遺伝子セグメントと第一のヒトDH遺伝子セグメントとの間に配置される。もう1つの特定の実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH遺伝子セグメントの欠失、および単一のヒトVH遺伝子セグメントによる置換を含み、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子セグメントVH1-69の下流かつヒト遺伝子セグメントDH1-1の上流に配置されている。もう1つの特定の実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH遺伝子セグメントの欠失、および単一のヒトVH遺伝子セグメントによる置換を含み、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子セグメントVH1-2の下流かつヒト遺伝子セグメントDH1-1の上流に配置されている。
特定の実施形態において、上記マウスは、単一のVH遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、すべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの置換を含み、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該単一のヒトVH遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にあるか、該単一のヒトVH遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。
1つの実施形態において、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の導入遺伝子上に存在する。1つの実施形態において、上記マウスADAM6タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの染色体外に存在する。
1つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むマウスであって、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列を含むB細胞を発現するマウスを提供し、該B細胞は、雄マウスにおいて機能的であるADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする遺伝子をそのゲノム内(例えば、B細胞染色体上)に含む。1つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列は、ヒト重鎖V、Dおよび/またはJ配列;マウス重鎖V、Dおよび/またはJ配列;ヒトまたはマウス軽鎖Vおよび/またはJ配列を含む。1つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3およびその組み合わせからなる群より選択されるヒトまたはマウス重鎖配列を含む。
1つの態様では、マウスであって、機能的にサイレンシングされた内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子を含み、ADAM6機能が上記マウスにおいて保持されており、1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの挿入をさらに含み、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、単一のヒトVH遺伝子セグメント、1つ以上のヒトDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。1つの実施形態において、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトVH1-69遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトVH1-2遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む。
1つの態様では、遺伝子改変マウスであって、機能的にサイレンシングされた免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含み、1つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの、単一のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントによる置換をさらに含み、機能的内因性ADAM6遺伝子座を欠き、および雄マウスにおいて機能的であるマウスADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
1つの態様では、機能的内因性マウスADAM6遺伝子座または配列を欠き、およびマウスADAM6遺伝子座またはマウスADAM6遺伝子座もしくは配列の機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスであって、異性のマウスと交配して、該異所性ADAM6遺伝子座または配列を含む後代を産生することができるマウスを提供する。1つの実施形態において、上記マウスは雄である。1つの実施形態において、上記マウスは雌である
1つの態様では、遺伝子改変マウスであって、内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座にヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含み;該内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座に内因性機能的ADAM6配列を欠き;および雄マウスにおいて機能的であるマウスADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスADAM6タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、染色体外のものである。1つの実施形態において、上記マウスADAM6タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の1つ以上の遺伝子座に組み込まれている。特定の実施形態において、上記1つ以上の遺伝子座は、免疫グロブリン遺伝子座を含む。
1つの態様では、ヒトV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖配列を改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、該マウスにおいて機能的であるADAM6活性を含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスは、一つのヒトV遺伝子セグメント、複数のD遺伝子セグメント、および複数のJ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記D遺伝子セグメントは、ヒトD遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記J遺伝子セグメントは、ヒトJ遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記マウスは、ヒト化重鎖定常領域配列をさらに含み、該ヒト化は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3およびその組み合わせから選択される配列の置換を含む。特定の実施形態において、上記重鎖は、上記ヒトV遺伝子セグメント、ヒトD遺伝子セグメント、ヒトJ遺伝子セグメント、ヒトCH1配列、ヒトまたはマウスヒンジ配列、マウスCH2配列、およびマウスCH3配列に由来する。もう1つの特定の実施形態において、上記マウスは、ヒト軽鎖定常配列をさらに含む。
1つの実施形態において、上記マウスは、5’および3’が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに隣接するADAM6遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖をコードできない。特定の実施形態において、上記マウスの上記ADAM6遺伝子は、野生型マウスの場合と同じ位置にあり、上記マウスの上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座は、抗体の重鎖をコードするように再構成できない。
1つの実施形態において、上記V遺伝子セグメントは、(該V遺伝子セグメントの転写方向に関して)5’が、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性をコードする配列に隣接する。
1つの実施形態において、上記V遺伝子セグメントは、(該V遺伝子セグメントの転写方向に関して)3’が、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性をコードする配列に隣接する。
1つの実施形態において、上記D遺伝子セグメントは、(該D遺伝子セグメントの転写方向に関して)5’が、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性をコードする配列に隣接する。
1つの実施形態において、上記J遺伝子セグメントは、(該J遺伝子セグメントの転写方向に関して)5’が、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性をコードする配列に隣接する。
1つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の(V遺伝子セグメントの転写方向を基準して)最も5’側のD遺伝子セグメントの5’および単一のV遺伝子セグメントの3’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
1つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の(D遺伝子セグメントの転写方向を基準して)最も5’側のJ遺伝子セグメントの5’および最も3’側のD遺伝子セグメントの3’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
1つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の(V遺伝子セグメントの転写方向を基準して)上記単一のヒトV遺伝子セグメントの5’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
1つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、マウスADAM6b配列またはその機能的断片、マウスADAM6a配列またはその機能的断片、およびその組み合わせから選択される配列を含む。
1つの実施形態において、上記単一のヒトV遺伝子セグメントの上流(5’)または下流(3’)に位置するヌクレオチド配列は、該ヒトV遺伝子セグメントに対して反対の転写配向に配置されている。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、ADAM6遺伝子の転写方向に関して5’から3’へ、ADAM6a配列、続いてADAM6b配列をコードする。
1つの実施形態において、上記マウスは、マウスADAM6配列またはその機能的断片に並置または隣接する単一のヒトVH遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記マウスは、マウスADAM6配列またはその機能的断片に並置または隣接するヒトVH1-69遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記マウスは、マウスADAM6配列またはその機能的断片に並置または隣接するヒトVH1-2遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトVH遺伝子セグメントを含み、上記マウスADAM6配列またはその機能的断片は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに並置または隣接しており、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖をコードするように再構成できない。
1つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるADAM6活性をコードする配列は、マウスADAM6配列またはその機能的断片である。
1つの態様では、非再構成B細胞系列のDNA保有細胞内にマウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列を含むが、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含むB細胞内に該マウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列を含まないマウスを提供し、該マウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列は、マウスADAM6遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。1つの実施形態において、上記マウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列は、再構成B細胞系列のものではないすべてのまたは実質的にすべてのDNA保有細胞に存在する;1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記マウスの生殖細胞系細胞には存在するが、再構成B細胞の染色体には存在しない。
1つの態様では、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含むB細胞をはじめとするすべてのまたは実質的にすべてのDNA保有細胞内にマウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列を含むマウスを提供し、該マウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列は、マウスADAM6遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。1つの実施形態において、上記マウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列は、上記再構成免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸上にある。1つの実施形態において、上記再構成免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸は、染色体である。1つの実施形態において、上記染色体は、野生型マウスにおいて見出される染色体であり、該染色体は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む。
1つの態様では、ADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログをそのゲノムに含むB細胞を含む、遺伝子改変マウスを提供する。1つの実施形態において、上記ADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、抗体の重鎖をコードするように再構成できない内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座にある。1つの実施形態において、上記ADAM6配列は、異種プロモーターによって駆動される導入遺伝子上にある。特定の実施形態において、上記異種プロモーターは、非免疫グロブリンプロモーターである。特定の実施形態において、B細胞は、ADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する。
1つの実施形態において、上記マウスのB細胞の90%以上は、該マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはそのホモログまたはその断片をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記マウスは雄マウスである。
1つの実施形態において、上記B細胞ゲノムは、上記ADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子を含む。1つの実施形態において、上記B細胞ゲノムは、上記ADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子を含むが第二の対立遺伝子を含まない。
1つの態様では、1つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子における改変を含むマウスであって、上記改変が1つ以上の内因性ADAM6対立遺伝子を維持するマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、少なくとも1つの重鎖対立遺伝子から、再構成内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現できないようにし、少なくとも1つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子内にある内因性ADAM6対立遺伝子を維持する。
1つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子の少なくとも1つから、再構成内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現できず、および該マウスは、内因性ADAM6対立遺伝子からADAM6タンパク質を発現する。特定の実施形態において、上記マウスは、2つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子から、再構成内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現できず、および該マウスは、1つ以上の内因性ADAM6対立遺伝子からADAM6タンパク質を発現する。
1つの実施形態において、上記マウスは、各内因性重鎖対立遺伝子から機能的重鎖を発現できず、および該マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の(マウス重鎖遺伝子座の転写方向に関して)上流1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110または120Mbp以内または120kb超にある機能的ADAM6対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記機能的ADAM6対立遺伝子は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に(例えば、遺伝子間V-D領域内、2つのV遺伝子セグメント間、V遺伝子セグメントとD遺伝子セグメントとの間、D遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間などに)ある。特定の実施形態において、上記機能的ADAM6対立遺伝子は、最後のマウスV遺伝子セグメントと最初のマウスD遺伝子セグメントの間の90から100kb遺伝子間配列内にある。
1つの態様では、1つ以上の内因性ADAM6対立遺伝子における改変を含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、1つ以上の内因性ADAM6対立遺伝子の少なくとも1つから、機能的ADAM6タンパク質を発現できないようにする。特定の実施形態において、上記マウスは、上記内因性ADAM6対立遺伝子それぞれから機能的ADAM6タンパク質を発現できない。
1つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ADAM6対立遺伝子から機能的ADAM6タンパク質を発現できず、および該マウスは、異所性ADAM6配列を含む。
1つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ADAM6対立遺伝子から機能的ADAM6タンパク質を発現できず、および該マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の(マウス重鎖遺伝子座の転写の方向に対して)上流1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110または120kb以内または120kb超にある異所性ADAM6配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性ADAM6配列は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に(例えば、遺伝子間V-D領域内、2つのV遺伝子セグメント間、V遺伝子セグメントとD遺伝子セグメントとの間、D遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間などに)ある。特定の実施形態において、上記異所性ADAM6配列は、最後のマウスV遺伝子セグメントと最初のマウスD遺伝子セグメントの間の90から100kb遺伝子間配列内にある。もう1つの特定の実施形態において、上記内因性90から100kb遺伝子間V-D配列が除去され、上記異所性ADAM6配列が、単一のヒトV遺伝子セグメントと最初のヒトD遺伝子セグメントとの間に配置されている。もう1つの特定の実施形態において、上記内因性90から100kb遺伝子間V-D配列が除去され、上記異所性ADAM6配列が、上記単一のヒトV遺伝子セグメントの5’または上流に配置されている。
1つの態様では、2つ以上の内因性ADAM6対立遺伝子の欠失を含む、不妊性雄マウスを提供する。1つの態様では、雄性不妊形質の保有者である雌マウスであって、非機能的ADAM6対立遺伝子または内因性ADAM6対立遺伝子ノックアウトをその生殖細胞系に含む雌マウスを提供する。
1つの態様では、抗体の重鎖をコードするように再構成できない内因性免疫グロブリン重鎖V、DおよびまたはJ遺伝子セグメントを含むマウスであって、上記マウスのB細胞の大部分が機能的ADAM6遺伝子を含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスは、抗体の機能的重鎖をコードするように再構成できないインタクトな内因性免疫グロブリン重鎖V、DおよびJ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも1つ、かつ89以下のV遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ13以下のD遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ4以下のJ遺伝子セグメント、およびその組み合わせを含み、上記少なくとも1つ、かつ89以下のV遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ13以下のD遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ4以下のJ遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再構成できない。特定の実施形態において、上記マウスは、上記インタクトな内因性免疫グロブリン重鎖V、DおよびJ遺伝子セグメント内にある機能的ADAM6遺伝子を含む。1つの実施形態において、上記マウスは、内因性ADAM6遺伝子座を含む内因性重鎖遺伝子座を含み、上記内因性重鎖遺伝子座は、89のV遺伝子セグメント、13のD遺伝子セグメントおよび4のJ遺伝子セグメントを含み、上記内因性重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再構成できず、上記ADAM6遺伝子座は、上記マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質をコードする。
1つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖V、DおよびJ遺伝子セグメントが無いマウスであって、該マウスのB細胞の大部分がADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログを含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスには、2つ以上のV遺伝子セグメント、2つ以上のD遺伝子セグメント、2つ以上のJ遺伝子セグメントおよびその組み合わせから選択される内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが無い。1つの実施形態において、上記マウスには、少なくとも1つ、かつ89以下のV遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ13以下のD遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ4以下のJ遺伝子セグメント、およびその組み合わせから選択される免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが無い。1つの実施形態において、上記マウスには、約3メガ塩基の上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む染色体12由来のゲノムDNA断片が無い。特定の実施形態において、上記マウスには、すべての機能的内因性重鎖V、DおよびJ遺伝子セグメントが無い。特定の実施形態において、上記マウスには、89のVH遺伝子セグメント、13のDH遺伝子セグメントおよび4つのJH遺伝子セグメントが無い。
1つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを生殖細胞系に有し、該免疫グロブリン重鎖遺伝子座への改変が、1つ以上のマウス免疫グロブリン可変領域配列の、1つの非マウス免疫グロブリン可変領域配列による置換を含むものであるマウスであって、マウスADAM6タンパク質をコードする核酸配列を含むマウスを提供する。好ましい実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のDHおよびJH配列ならびに少なくとも3、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも40、少なくとも60または少なくとも80のVH配列は、非マウス免疫グロブリン重鎖配列によって置換されている。さらなる好ましい実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のDH、JHおよびすべてのVH配列は、単一の非マウス免疫グロブリンV遺伝子セグメント配列、1つ以上のD遺伝子セグメント配列および1つ以上のJ遺伝子セグメント配列によって置換されている。上記非マウス免疫グロブリン配列は、再構成されていない場合がある。好ましい実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、非マウス種の完全な非再構成DHおよびJH領域ならびに単一の非再構成VH配列を含む。さらなる好ましい実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、非マウス種の完全可変領域(すなわち、互いに結合して、重鎖可変領域をコードする配列を形成するVH、DHおよびJHセグメントを含有する再構成可変領域)を形成することができる。上記非マウス種は、ホモサピエンスである場合があり、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト配列である場合がある。
1つの態様では、単一の機能的ヒトVセグメントを含む重鎖免疫グロブリン遺伝子座を提供する。1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトVセグメントは、VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1およびVH7-81セグメントから選択される。1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトVセグメントは、VH1-69セグメントである;特定の実施形態において、上記単一の機能的ヒトVセグメントは、ヒト集団内で見出される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、または13の多型形態で存在する。1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトVセグメントは、VH1-2セグメントである;特定の実施形態において、上記単一の機能的ヒトVセグメントは、ヒト集団内で見出される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの多型形態で存在する。
1つの実施形態において、上記重鎖免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の改変遺伝子座である。1つの実施形態において、上記改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム内の位置であって、対応する非改変非ヒト遺伝子座が野生型非ヒト動物において見出される位置に存在する。1つの実施形態において、上記改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の導入遺伝子上に存在する。
1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトV遺伝子セグメントは、VH1-69遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記VH1-69遺伝子セグメントは、配列番号37を含む。1つの実施形態において、上記VH1-69遺伝子セグメントは、配列番号37に由来する。1つの実施形態において、上記VH1-69遺伝子セグメントは、配列番号37と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一である。
1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトV遺伝子セグメントは、配列番号37のヌクレオチド配列によりコードされる。
1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトV遺伝子セグメントは、VH1-2遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記VH1-2遺伝子セグメントは、配列番号63を含む。1つの実施形態において、上記VH1-2遺伝子セグメントは、配列番号63に由来する。1つの実施形態において、上記VH1-2遺伝子セグメントは、配列番号63と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一である。
1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトV遺伝子セグメントは、配列番号63を含むヌクレオチド配列によりコードされる。
1つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトVセグメントは、1つ以上のDセグメントおよび1つ以上のJセグメント、または1つ以上のJセグメントに作動可能に連結されている。1つの実施形態において、上記Vセグメント、ならびに1つ以上のDセグメントおよび/またはJセグメントは、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。1つの実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびその組み合わせから選択される。1つの実施形態において、上記CH1、ヒンジ、CH2、CH3、またはその組み合わせは、各々非ヒト内因性定常配列である。1つの実施形態において、上記CH1、ヒンジ、CH2、CH3、またはその組み合わせのうちの少なくとも1つは、ヒト配列である。特定の実施形態において、上記CH1および/またはヒンジは、ヒト配列である。
1つの態様では、すべての機能的Vセグメントの、単一のヒトVセグメントによる置換を含む改変内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、単一のヒトVセグメント以外のVセグメントに由来する重鎖可変遺伝子を形成するように再構成できない非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する。
1つの実施形態において、上記単一のヒトVセグメントは、VH1-69である。1つの実施形態において、上記単一のヒトVセグメントは、VH1-2である。
1つの実施形態において、上記遺伝子座は、少なくとも1つのヒトDHセグメントまたは非ヒトDHセグメント、および1つのヒトJHセグメントまたは非ヒトJHセグメントを含む。特定の実施形態において、上記遺伝子座は、ヒトDHセグメントおよびヒトJHセグメントを含む。特定の実施形態において、上記遺伝子座は、ヒトJHセグメントを含む。もう1つの特定の実施形態において、上記遺伝子座は、ヒトVH1-69、すべての機能的ヒトDHセグメント、およびすべての機能的ヒトJHセグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒトVセグメント、ヒトDセグメント、およびヒトJセグメント(またはヒトVセグメントおよびヒトJセグメント)は、内因性マウス重鎖遺伝子座において、マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記マウス重鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン定常領域配列の野生型レパートリーを含む。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、上記非ヒト動物の機能的免疫グロブリン重鎖V遺伝子セグメントのみが、ヒトVH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1およびVH7-81セグメントから選択される遺伝子改変非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記重鎖V遺伝子セグメントは、ヒトVH1-69遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記重鎖V遺伝子セグメントは、ヒトVH1-2遺伝子セグメントである。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、単一の機能的ヒトVHセグメントを含み、上記単一の機能的ヒトVHセグメントを欠く再構成免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子を実質的に形成できない遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、上記非ヒト動物において発現される免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、ヒトVH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1およびVH7-81遺伝子セグメントから選択されるヒトセグメントのうちの1つに由来する、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記ヒトセグメントは、VH1-69セグメントである。1つの実施形態において、上記ヒトセグメントは、VH1-2セグメントである。1つの実施形態において、上記マウスによって発現される免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、単一のVセグメントファミリーメンバーに由来し、1つの実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、上記単一のVセグメントファミリーメンバーの多型変異体に由来する。
1つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖V遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変セグメント(Vκ)をさらに含む非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記1つ以上のVκセグメントは、1つ以上のヒトJセグメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記Jセグメントは、ヒトJκセグメントである。もう1つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、免疫グロブリンλ軽鎖を発現しない。もう1つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、機能的ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子座も機能的内因性免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子座も含まない。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスである。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンVκ遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての機能的内因性Vκセグメントの、1つ以上の機能的ヒトVκセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンVκセグメントによるものである。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンJκ遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての機能的内因性非ヒト免疫グロブリンJκセグメントの、1つ以上の機能的ヒト免疫グロブリンJκセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンJκセグメントによるものである。
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のVセグメントおよび/またはその多型変異体から本質的になるVセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。1つの実施形態において、上記単一の免疫グロブリン重鎖Vセグメントは、ヒトVH1-69セグメントであり、上記非ヒト動物は、すべての機能的非ヒトDHセグメントの、すべての機能的ヒトDHセグメントによる置換をさらに含み、すべての機能的非ヒトJHセグメントの、すべての機能的ヒトJHセグメントによる置換をさらに含み、上記免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトVH1-69配列、ヒトDH配列、ヒトJH配列、およびマウス定常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成するように再構成する。
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のVセグメントおよび/またはその多型変異体から本質的になるVセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。1つの実施形態において、上記単一の免疫グロブリン重鎖Vセグメントは、ヒトVH1-2セグメントであり、上記非ヒト動物は、すべての機能的非ヒトDHセグメントの、すべての機能的ヒトDHセグメントによる置換をさらに含み、すべての機能的非ヒトJHセグメントの、すべての機能的ヒトJHセグメントによる置換をさらに含み、上記免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトVH1-2配列、ヒトDH配列、ヒトJH配列、およびマウス定常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成するように再構成する。
1つの実施形態において、上記再構成遺伝子を含むB細胞を提供する。特定の実施形態において、上記B細胞は、対象となる抗原で免疫された記載されるマウスに由来し、上記B細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合する抗体をコードする。1つの実施形態において、上記対象となる抗原は、病原体である。特定の実施形態において、上記病原体は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルス)、およびヒト免疫不全ウイルスから選択される。特定の実施形態において、上記B細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域(例えば、ヒトκ軽鎖可変領域)を含む体細胞変異高親和性(例えば、約10-9のKD以下)抗体をコードする。
1つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Vセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、1つ以上のヒトλ軽鎖可変(Vλ)セグメントを含む非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記1つ以上のヒトVλセグメントは、1つ以上のヒトJセグメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記Jセグメントは、ヒトJλセグメントである。もう1つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、κ軽鎖を発現しない。もう1つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、機能的ヒトκ軽鎖可変遺伝子座も非ヒトκ軽鎖可変遺伝子座も含まない。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、すべてのまたは実質的にすべての機能的非ヒト免疫グロブリンVλセグメントの、1つ以上の機能的ヒト免疫グロブリンVλセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンVλセグメントによるものである。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、すべてのまたは実質的にすべての機能的非ヒト免疫グロブリンJλセグメントの、1つ以上の機能的ヒト免疫グロブリンJλセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンJλセグメントによる置換である。
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のVHセグメントのみを含む免疫グロブリン重鎖可変(VH)領域遺伝子座を含み、上記単一のVHセグメントは、ヒトVH1-69セグメントまたはヒトVH1-2セグメントであり、すべての機能的非ヒトDHセグメントの、すべての機能的ヒトDHセグメントによる置換をさらに含み、すべての機能的非ヒトJHセグメントの、すべての機能的ヒトJHセグメントによる置換をさらに含み、上記VH領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、非ヒト定常領域の遺伝子配列、例えば、内因性非ヒト定常遺伝子配列である。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、上記非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトVH1-69配列(またはヒトVH1-2配列)、ヒトDH配列、ヒトJH配列、および内因性非ヒト定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成するように再構成する。
1つの実施形態において、上記再構成遺伝子を含むB細胞を提供する。特定の実施形態において、上記B細胞は、対象となる抗原で免疫された記載される非ヒト動物に由来し、上記B細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合する抗体をコードする。1つの実施形態において、上記抗原は、リガンド、細胞表面受容体、および細胞内タンパク質から選択されるヒトタンパク質である。1つの実施形態において、上記対象となる抗原は、病原体である。特定の実施形態において、上記病原体は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルス)、およびヒト免疫不全ウイルスから選択される。特定の実施形態において、上記B細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域(例えば、ヒトλ軽鎖可変領域)を含む体細胞変異高親和性(例えば、約10-9KD以下)抗体をコードする。
1つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Vセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、導入遺伝子上にヒトVH1-69セグメント(またはヒトVH1-2セグメント)を含み、上記ヒトVH1-69セグメントは、上記導入遺伝子上で、ヒトDHセグメントもしくは非ヒトDHセグメントおよび/またはヒトJセグメントもしくは非ヒトJセグメントに作動可能に連結され、上記導入遺伝子は、ヒト定常領域遺伝子もしくは非ヒト定常領域遺伝子、またはキメラヒト/非ヒト定常領域(例えば、少なくとも1つの配列は、非ヒトの、例えば、ヒンジ、CH2、ならびにCH3および/またはヒンジから選択されるCH1、ヒンジ、CH2、CH3、またはその組み合わせ)をさらに含む非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスまたはラットであり、上記非ヒトD遺伝子、非ヒトJ遺伝子、および/または非ヒト定常領域遺伝子は、マウス遺伝子もしくはラット遺伝子またはキメラヒト/マウスもしくはラット遺伝子である。
1つの実施形態において、上記導入遺伝子が、上記非ヒト動物において再構成免疫グロブリンκまたはλ軽鎖遺伝子を形成するように再構成するように、上記非ヒト動物は、1つ以上のヒト免疫グロブリンVλセグメントおよびヒト免疫グロブリンJλセグメント、または1つ以上のヒト免疫グロブリンVκセグメントおよびヒト免疫グロブリンJκセグメント、ならびにヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子またはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を含む導入遺伝子を含む。
特定の実施形態において、上記マウスが、導入遺伝子から、VH1-69セグメント(またはVH1-2セグメント)に由来する完全ヒト抗体を発現するように、上記非ヒト動物は、ヒトVH1-69セグメント(またはヒトVH1-2セグメント)である単一のVセグメント、1つ以上のヒトDセグメント、1つ以上のヒトJセグメント、および重鎖可変遺伝子座に作動可能に連結されたヒト定常遺伝子を含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を有する導入遺伝子を含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、機能的内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含まない。特定の実施形態において、上記非ヒト動物が内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を再構成して、再構成非ヒト抗体遺伝子を形成できないように、上記非ヒト動物は、内因性非ヒトDHセグメントおよび/または内因性非ヒトJHセグメントの欠失を含む非機能的内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性マウス重鎖定常領域に作動可能に連結されたスイッチ配列の欠失を含む。特定の実施形態において、上記スイッチ配列は、非ヒト(例えば、マウス)μスイッチ配列である。もう1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、免疫グロブリンκ遺伝子座および免疫グロブリンλ遺伝子座から選択される機能的内因性軽鎖可変遺伝子座の欠如をさらに含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖および/または内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を再構成して、再構成内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖および/または再構成内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子を形成できないように、上記非ヒト動物は、Jκ配列および/またはJλ配列の欠失を含む。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖の機能的ノックアウトを結果としてもたらす、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列の欠失を含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖の機能的ノックアウトを結果としてもたらす、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列の欠失を含む。
1つの態様では、1つ以下のヒトVHセグメントまたはその1つ以上の多型、1つ以上のDセグメントのレパートリーから選択されるDセグメント、および1つ以上のJセグメントのレパートリーから選択されるJセグメントに由来する免疫グロブリン重鎖可変レパートリーを含む齧歯動物であって、雄の齧歯動物において機能的である異所性ADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む齧歯動物を提供する。
1つの実施形態において、上記ヒトVHセグメントは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10以上の多型変異体で存在し、各多型変異体が、1つ以上のDセグメントのうちのいずれかおよび1つ以上のJセグメントのうちのいずれかを有する再構成重鎖可変ドメインを再構成および形成できるように、多型変異体は、Dセグメントおよび/またはJセグメントに作動可能に連結されている。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。1つの実施形態において、上記Dセグメントのレパートリーは、2つ以上のDセグメントを含む。1つの実施形態において、上記Jセグメントのレパートリーは、2つ以上のJセグメントを含む。1つの実施形態において、上記Dセグメントおよび/またはJセグメントは、ヒトセグメントである。1つの実施形態において、上記異所性ADAM6配列は、同じ種の野生型齧歯動物のADAM6配列である。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。1つの実施形態において、上記雄の齧歯動物において機能的である上記異所性ADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片は、上記改変免疫グロブリン重鎖可変レパートリーと同じ染色体上にある;1つの実施形態において、それは異なる染色体上にある。
1つの態様では、単一のヒト免疫グロブリン重鎖VHセグメントおよび/またはその多型変異体、ならびに1つ以上のDH配列および1つ以上のJ配列をコードする配列を含むヌクレオチド構築物であって、非ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座と相同な少なくとも1つのホモロジーアーム、またはリコンビナーゼ認識部位(例えば、lox部位)を含む構築物を提供する。1つの実施形態において、上記Vセグメントは、VH1-69セグメントまたはVH1-2セグメントである。
1つの態様では、単一のヒト免疫グロブリン重鎖Vセグメントをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、上記単一のVHセグメントがVH1-69(またはVH1-2)セグメントである構築物を提供する。1つの実施形態において、上記構築物は、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む。1つの実施形態において、上記構築物は、VH1-69(またはVH1-2)セグメントの上流に第一のマウスホモロジーアーム、およびVH1-69(またはVH1-2)セグメントの下流に第二のマウスホモロジーアームを含み、上記第一のマウスホモロジーアームは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域の直ぐ上流のマウス染色体の領域と相同であるが、機能的マウス免疫グロブリン重鎖可変セグメントを含まない。1つの実施形態において、上記構築物は、配列番号6を含む。1つの実施形態において、上記構築物は、配列番号74を含む。1つの実施形態において、上記構築物は、配列番号75を含む。1つの実施形態において、上記構築物は、配列番号76を含む。
1つの態様では、上記限定された単一のVHセグメントは、非ヒト動物内にあるか、または上記限定されたVHセグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあり(例えば、本来の位置に(in situ)または導入遺伝子内)、上記非ヒト動物または非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ(例えば、雌牛、雄牛、野牛)、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物(例えば、マーモセット、アカゲザル)の遺伝子座または動物から選択される。特定の実施形態において、上記非ヒト動物または非ヒト遺伝子座は、マウスまたはラット遺伝子座である。
1つの態様では、(a)ヒト可変領域遺伝子セグメントのヌクレオチド配列と同一または実質的に同一であるヌクレオチド配列と(b)マウスにおいて機能的であるマウスADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードするヌクレオチド配列とを含むターゲティングベクターを提供する。
1つの実施形態において、上記ターゲティングベクターは、上記マウスADAM6をコードする配列に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、マウスADAM6プロモーターである。
1つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を改変するためのヌクレオチド構築物であって、少なくとも1つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位と、マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列とを含む構築物を提供する。
1つの態様では、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを含む核酸構築物を提供し、該上流ホモロジーアームは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、該下流ホモロジーアームは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、マウスADAM6タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む配列が、該上流ホモロジーアームと該下流ホモロジーアームとの間に配置されている。特定に実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子をコードする配列は、野生型マウスの場合に該マウスADAM6が連結されているマウスプロモーターに作動可能と連結されている。
1つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変マウスから単離された細胞を提供する。1つの実施形態において、上記細胞はリンパ球である。1つの実施形態において、上記リンパ球はB細胞である。特定の実施形態において、上記B細胞は、異所性ADAM6配列またはそのオルソログまたはホモログまたはその機能的断片をコードする配列を含み、上記B細胞は、ヒトVH遺伝子セグメントに由来する重鎖可変ドメインを発現する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来し、限定されたVHセグメントのレパートリー含む細胞または組織を提供する。1つの実施形態において、上記VHセグメントのレパートリーは、単一のVHセグメントファミリーメンバーおよび/またはその多型変異体に限定される。特定の実施形態において、上記単一のVHセグメントは、ヒトVH1-69セグメントまたはヒトVH1-2セグメントである。1つの実施形態において、上記細胞または組織は、上記非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または骨髄に由来する。
1つの実施形態において、上記細胞は、ES細胞である。1つの実施形態において、上記細胞は、B細胞である。1つの実施形態において、上記細胞は、生殖細胞である。
1つの実施形態において、上記組織は、結合組織、筋肉組織、神経組織、および上皮組織から選択される。特定の実施形態において、上記組織は、生殖組織である。
1つの実施形態において、本明細書に記載のマウスに由来する細胞および/または組織は、1つ以上のエクスビボアッセイにおいて使用するために単離される。様々な実施形態において、上記1つ以上のエクスビボアッセイとしては、物理特性、熱特性、電気特性、機械的な特性、または光学特性の測定、手術手順、異なる組織型の相互作用の測定、画像化技術による顕色(development)、またはその組み合わせが挙げられる。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスである。
1つの態様では、本明細書に記載の限定された重鎖VHセグメントを含む非ヒト胚を提供する。1つの実施形態において、上記胚は、上記限定されたVHセグメントを含むESドナー細胞と、宿主胚細胞とを含む。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスである。
1つの態様では、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の染色体またはその断片を含む。1つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の核を含む。1つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、核移植の結果としての染色体またはその断片を含む。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する核を提供する。1つの実施形態において、上記核は、B細胞ではない二倍体細胞に由来する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する多能性細胞、人工多能性(induced pluripotent)細胞、または全能性細胞を提供する。特定の実施形態において、上記細胞は、マウス胚性幹(ES)細胞である。
1つの態様では、限定されたVHセグメントのレパートリーを含む非ヒト人工多能性細胞を提供する。1つの実施形態において、上記人工多能性細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する。
1つの態様では、本明細書に記載のマウスのリンパ球の配列を含むハイブリドーマを提供する。1つの実施形態において、上記リンパ球はB細胞である。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマを提供する。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスまたはラットである。
1つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む、ES細胞、多能性細胞および人工多能性(induced pluripotent)細胞をはじめとする(しかしこれらに限定されない)マウス細胞およびマウス胚を提供する。XXである細胞およびXYである細胞を提供する。本明細書に記載の改変、例えば、前核注入により細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提供する。ウイルス導入ADAM6遺伝子を含む細胞、胚およびマウス、例えば、該マウスにおいて機能的であるADAM6遺伝子を含む形質導入構築物を含む細胞、胚およびマウスも提供する。
1つの態様では、遺伝子改変マウス細胞であって、再構成内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む重鎖を発現できず、マウスADAM6タンパク質またはその機能的断片をコードする機能的ADAM6遺伝子を含む遺伝子改変マウス細胞を提供する。1つの実施形態において、上記細胞は、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの挿入をさらに含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成の際にヒト可変領域を含む抗体の機能的重鎖をコードするような、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結された重鎖遺伝子セグメントである。
1つの態様では、機能的内因性マウスADAM6遺伝子座を欠いている遺伝子改変マウス細胞であって、マウスADAM6タンパク質またはその機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウス細胞を提供する。1つの実施形態において、上記細胞は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変をさらに含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変は、マウスVH遺伝子セグメントの欠失、マウスDH遺伝子セグメントの欠失、マウスJH遺伝子セグメントの欠失およびその組み合わせから選択される欠失を含む。特定の実施形態において、上記マウスは、1つ以上のマウス免疫グロブリンVH、DHおよび/またはJH配列の、ヒト免疫グロブリン配列による置換を含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、ヒトVH、ヒトVL、ヒトDH、ヒトJH、ヒトJLおよびその組み合わせから選択される。
1つの実施形態において、上記細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または人工多能性細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、マウスES細胞である。
1つの態様では、再構成免疫グロブリン重鎖遺伝子を含むマウスB細胞であって、雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を該B細胞の染色体上に含むB細胞を提供する。1つの実施形態において、上記マウスB細胞は、上記核酸配列の2つの対立遺伝子を含む。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に隣接する核酸分子(例えば、B細胞染色体)上にある。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む核酸分子とは異なる核酸分子(例えば、B細胞染色体)上にある。
1つの実施形態において、上記マウスB細胞は、マウスまたはヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている再構成非マウス免疫グロブリン可変遺伝子配列を含み、ここで、B細胞は、雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含む。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成非ヒト免疫グロブリン可変遺伝子配列に対して最も近い遺伝子の遺伝子座にあるまたはその中にある核酸分子(例えば、B細胞染色体)上にある。
1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成非ヒト免疫グロブリン可変領域配列に隣接する核酸分子(例えば、B細胞染色体)上にある。
1つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、雄マウスにおいて機能的であるマウスADAM6またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列とを含む染色体を含む、マウス体細胞を提供する。1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。1つの実施形態において、上記核酸は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる染色体上にある。1つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の単一のコピーを含む。1つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の少なくとも2つのコピーを含む。特定の実施形態において、上記体細胞は、B細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、生殖細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、幹細胞である。
1つの態様では、マウス生殖細胞であって、マウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列を該生殖細胞の染色体上に含み、該マウスADAM6(またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片)をコードする核酸配列が、野生型マウス生殖細胞の染色体内の位置とは異なる染色体内の位置にあるマウス生殖細胞を提供する。1つの実施形態において、上記核酸配列は、マウス免疫グロブリン遺伝子座にある。1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座と同じ染色体上にある。1つの実施形態において、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座とは異なる染色体上にある。1つの実施形態において、上記マウス免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも1つのマウス免疫グロブリン配列の、少なくとも1つの非マウス免疫グロブリン配列による置換を含む。特定の実施形態において、上記少なくとも1つの非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列である。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン重鎖配列である。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体可変ドメイン配列を提供する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する配列を含む抗体可変ドメインを含むヒト治療薬を提供する。
1つの態様では、ヒトVH1-69セグメントまたはVH1-2セグメントに由来する抗体可変領域配列を非ヒト動物から得る方法であって、(a)非ヒト動物を対象となる抗原で免疫する工程であって、上記非ヒト動物が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての非ヒト可変セグメントの、単一のヒト可変セグメントによる置換を含み、上記単一のヒト可変セグメントが、VH1-69セグメントまたはVH1-2セグメントであり、上記非ヒト動物が、ヒトVH1-69セグメントまたはVH1-2セグメントに由来しない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を実質的に形成できない工程と、(b)上記非ヒト動物が上記対象となる抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、(c)上記非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単離する工程であって、上記抗体が上記対象となる抗原に結合する工程とを含む方法を提供する。
1つの実施形態において、上記単一のヒト可変セグメントは、VH1-69セグメントである。
1つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号37に由来する。1つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号37と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一である。1つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号37を含む。
1つの実施形態において、上記単一のヒト可変セグメントは、VH1-2セグメントである。
1つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号63に由来する。1つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号63と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一である。1つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号63を含む。
1つの態様では、非ヒト動物において、ヒト抗体可変領域のレパートリーを生成するための方法であって、上記レパートリーの上記ヒト重鎖可変領域が、同じVH遺伝子ファミリーメンバーならびに複数のDHセグメントのうちの1つおよび複数のJHセグメントのうちの1つに由来し、上記レパートリーが、単一のVH遺伝子ファミリーメンバーに由来する重鎖免疫グロブリンのFR1(フレームワーク1)配列、CDR1配列、FR2配列、CDR2配列、およびFR3配列を有することを特徴とする方法を提供する。1つの実施形態において、上記レパートリーは、複数の異なるCDR3+FR4配列を有することをさらに特徴とする。
1つの実施形態において、上記単一のVH遺伝子ファミリーは、VHファミリー1、2、3、4、5、6、および7から選択される。特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子ファミリーは、VHファミリー1である。1つの実施形態において、上記単一のVH遺伝子ファミリーメンバーは、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、およびVH3-23から選択される。特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子ファミリーメンバーは、VH1-69である。
1つの実施形態において、上記レパートリーは、VH1-69セグメントに由来する重鎖FR1配列、重鎖CDR1配列、重鎖FR2配列、重鎖CDR2配列、および重鎖FR3配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号38に由来する重鎖FR1配列、重鎖CDR1配列、重鎖FR2配列、重鎖CDR2配列、および重鎖FR3配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号38の重鎖FR1配列、重鎖CDR1配列、重鎖FR2配列、重鎖CDR2配列、および重鎖FR3配列を含む。
1つの実施形態において、上記レパートリーは、VH1-2セグメントに由来する重鎖FR1配列、重鎖CDR1配列、重鎖FR2配列、重鎖CDR2配列、および重鎖FR3配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号64に由来する重鎖FR1配列、重鎖CDR1配列、重鎖FR2配列、重鎖CDR2配列、および重鎖FR3配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号64の重鎖FR1配列、重鎖CDR1配列、重鎖FR2配列、重鎖CDR2配列、および重鎖FR3配列を含む。
1つの態様では、非ヒト動物において、複数の異なるCDR3配列およびFR4配列を生成するための方法であって、単一のVHセグメントファミリーメンバーに限定されたVHセグメントのレパートリーを有する免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座を含む非ヒト動物を、対象となる抗原に曝露する工程と、上記非ヒト動物が上記抗原に対する免疫応答を発生するようにする工程とを含み、上記免疫応答が、その重鎖可変ドメインの各々が上記単一のVHセグメントファミリーメンバーに由来するB細胞レパートリーであって、複数の異なるCDR3配列およびFR4配列を含むB細胞レパートリーを生成する方法を提供する。
1つの実施形態において、上記単一のVHセグメントファミリーメンバーは、ヒトのものである。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラット、およびウサギから選択される。1つの実施形態において、上記対象となる抗原は、リガンド、受容体、細胞内タンパク質、および分泌タンパク質から選択される。1つの実施形態において、上記対象となる抗原は、ヒト病原体である。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列を提供する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を提供する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体またはその抗原結合断片(例えば、Fab、F(ab)2、scFv)を提供する。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は、該非ヒト動物の内因性ADAM6遺伝子座の(免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写に対して)上流の1つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、1つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントで置換する工程、および該非ヒト動物の該ADAM6遺伝子座の(免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写に対して)下流の1つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントを、1つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントで置換する工程を含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ADAM6遺伝子座の上流の1つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、V遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ADAM6遺伝子座の上流の1つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、VおよびD遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ADAM6遺伝子座の下流の1つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、J遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ADAM6遺伝子座の下流の1つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、DおよびJ遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ADAM6遺伝子座の下流の1つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、V、DおよびJ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ADAM6遺伝子座の下流の1つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記1つ以上の遺伝子セグメントは、単一のV遺伝子セグメント、1つ以上のD遺伝子セグメントおよび1つ以上のJ遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記ADAM6遺伝子の上流および/または下流の上記1つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞中で置換して、遺伝子改変前駆細胞を形成し;該遺伝子改変前駆細胞を宿主に導入し;そして、該遺伝子改変前駆細胞を含む該宿主を妊娠させて、該遺伝子改変前駆細胞に由来するゲノムを含む非ヒト動物を形成する。1つの実施形態において、上記宿主は胚である。特定の実施形態において、上記宿主は、マウス前桑実胚(pre-morula)(例えば8または4細胞期)、4倍体胚、胚性細胞の集合体、または胚盤胞から選択される。
1つの態様では、単一のVセグメントファミリーメンバーに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現するB細胞レパートリーを有する非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記B細胞レパートリーにおいて発現される上記非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変ドメインの上記B細胞レパートリーのうちの少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%は、同じVセグメントファミリーメンバーに由来する。特定の実施形態において、上記割合は、少なくとも90%である。1つの実施形態において、上記B細胞レパートリーは、末梢(血)B細胞から本質的になる。1つの実施形態において、上記B細胞レパートリーは、脾性B細胞から本質的になる。1つの実施形態において、上記B細胞レパートリーは、骨髄B細胞から本質的になる。1つの実施形態において、上記B細胞レパートリーは、末梢B細胞、脾性B細胞、および骨髄B細胞から本質的になる。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを発現する上記非ヒト動物のB細胞のうちの10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%超または90%超が、単一のVH遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来する重鎖免疫グロブリン可変ドメインを発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する上記非ヒト動物のB細胞のうちの少なくとも75%は、上記単一のVH遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する。特定の実施形態において、上記割合は、少なくとも90%である。1つの実施形態において、上記B細胞のすべては、上記単一のVH遺伝子ファミリーメンバーに由来する重鎖ドメインを発現する。
1つの態様では、対象となる抗原による免疫に応答して抗原特異的B細胞集団を作製する遺伝子改変マウスであって、上記抗原特異的B細胞集団のうちの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%超が、同じVH遺伝子セグメントにすべて由来する免疫グロブリン重鎖を発現する遺伝子改変マウスを提供する。1つの実施形態において、上記抗原特異的B細胞集団のうちの少なくとも75%は、同じVH遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現する。1つの実施形態において、上記抗原特異的B細胞のすべては、同じVH遺伝子セグメントに由来する重鎖を発現する。
1つの態様では、限定されたVH遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、上記限定が、ヒトVH1-69遺伝子セグメントまたはVH1-69遺伝子セグメントに対するものであり、VH1-69*01遺伝子セグメントと少なくとも約75.5%、76.5%、86.7%、87.8%、94.9%、96.9%、98%、または99%同一である非ヒト動物を提供する。特定の実施形態において、上記限定されたレパートリーは、図7のVH1-69変異体のうちの1つ以上から選択される。
1つの態様では、限定されたVH遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、上記限定が、ヒトVH1-2遺伝子セグメントまたはVH1-2遺伝子セグメントに対するものであり、VH1-2遺伝子セグメントと少なくとも約94.9%、95.9%、96.9%、98%、または99%同一である非ヒト動物を提供する。特定の実施形態において、上記限定されたレパートリーは、図10のVH1-2変異体のうちの1つ以上から選択される。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。
1つの態様では、限定されたヒトVHセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロブリン軽鎖可変セグメント遺伝子座をさらに含み、上記マウスにおいて発現されるκ軽鎖に対するλ軽鎖の比率が、野生型マウスにおける場合とほぼ同じである非ヒト動物を提供する。
1つの態様では、単一のVH遺伝子セグメント、1つ以上のDH遺伝子セグメント、および1つ以上のJH遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、上記単一のVH遺伝子セグメントが、多型VH遺伝子セグメントである非ヒト動物を提供する。
1つの実施形態において、上記多型VH遺伝子セグメントは、ヒト集団における高コピー数に関連するヒトVH遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、VH3-23、またはこれらの多型変異体から選択される。特定の実施形態において、上記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1-69遺伝子セグメントである。もう1つの特定の実施形態において、上記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1-2遺伝子セグメントである。
1つの実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、またはキメラヒト/マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子である。1つの実施形態において、上記免疫グロブリン定常遺伝子は、ヒトCH1、ヒトヒンジ、ヒトCH2、ヒトCH3、およびその組み合わせから選択されるヒト配列を含む。1つの実施形態において、上記マウス定常遺伝子は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、J遺伝子セグメントおよび軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結されたヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントをさらに含む。特定の実施形態において、上記VL遺伝子セグメントおよび/またはJ遺伝子セグメントは、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択される。1つの実施形態において、上記VL遺伝子セグメントおよび/またはJ遺伝子セグメントは、ヒトκ遺伝子セグメントである。
様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、すべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの欠失を含む。
様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、不活性化内因性重鎖可変遺伝子遺伝子座を含む。様々な実施形態において、上記不活性化内因性重鎖可変遺伝子遺伝子座は、内因性重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されていない。
1つの態様では、血清免疫グロブリンの発現を特徴とする非ヒト動物であって、上記血清免疫グロブリンのうちの80%超が、ヒト重鎖可変ドメインおよび同種のヒト軽鎖可変ドメインを含み、上記ヒト重鎖可変ドメインが、単一のヒトVH遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体から本質的になるVH遺伝子セグメントのレパートリーに由来する非ヒト動物を提供する。
1つの実施形態において、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-69遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体である。1つの実施形態において、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-2遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体である。
1つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの、単一のヒトVH遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体での置換をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物を提供する。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての内因性VL遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトVL遺伝子セグメントによる置換をさらに含む。特定の実施形態において、上記マウスは、ヒトVL遺伝子セグメントに作動可能に連結された1つ以上のヒトJL遺伝子セグメントをさらに含む。
1つの態様では、少なくとも1つのヒト可変ドメイン/非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体を発現する非ヒト動物であって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から非ヒトADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、抗体の機能的重鎖をコードするように再構成できない。
1つの態様では、少なくとも1つのヒト可変ドメイン/非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体を発現する非ヒト動物であって、免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座から非ヒトADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する非ヒト動物を提供する。
1つの実施形態において、上記ADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、上記非ヒト動物のB細胞において発現され、該B細胞は、ヒト可変配列と非ヒト定常配列とを含む再構成免疫グロブリン配列を含む。
1つの実施形態において、上記非ヒト定常配列は、齧歯動物配列である。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
1つの態様では、不妊性雄非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は、ドナーES細胞の内因性ADAM6対立遺伝子を非機能的にすること(または該対立遺伝子をノックアウトすること)、該ドナーES細胞を宿主胚に導入すること、代理母において該宿主胚を妊娠させること、および該ドナーES細胞に全部または一部由来する後代を該代理母に出産させることを含む。1つの実施形態において、上記方法は、後代を交配させて不妊性雄非ヒト動物を得ることをさらに含む。
1つの態様では、対象となる遺伝子改変を有する非ヒト動物であって、不妊性である非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は、(a)対象となる遺伝子改変をゲノム内で行う工程;(b)上記ゲノムを改変して、内因性ADAM6対立遺伝子をノックアウトするか、または内因性ADAM6対立遺伝子を非機能的にする工程;および(c)上記ゲノムを非ヒト動物の作製に用いる工程を含む。様々な実施形態において、上記ゲノムは、ES細胞からのものであり、または核移植実験で使用される。
1つの態様では、本明細書に記載のターゲティングベクター、ヌクレオチド構築物または細胞を使用して作製される非ヒト動物を提供する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物と、野生型非ヒト動物であるまたは遺伝子改変されている第二の非ヒト動物との交配の後代を提供する。
1つの態様では、非ヒト免疫グロブリン重鎖配列の、1つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列による置換を含む非ヒト動物系統を維持するための方法を提供する。1つの実施形態において、上記1つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列である。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物系統は、1つ以上の非ヒトVH、DHおよび/またはJH遺伝子セグメントの欠失を含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のヒトVH遺伝子セグメント、1つ以上のヒトDH遺伝子セグメントおよび/または1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントをさらに含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のヒトVHセグメント、少なくとも27のヒトDH遺伝子セグメント、および少なくとも6のJH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、単一のヒトVHセグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、非ヒト定常領域遺伝子である。1つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3および/もしくはCH4またはその組み合わせから選択されるマウスまたはラット定常領域遺伝子配列を含む。様々な実施形態において、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-69またはヒトVH1-2遺伝子セグメントである。
1つの実施形態において、上記方法は、上記非ヒト免疫グロブリン重鎖配列の置換に関してヘテロ接合性の雄非ヒト動物を産生する工程、および上記ヘテロ接合雄非ヒト動物を野生型雌非ヒト動物とまたはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌非ヒト動物と交配させる工程を含む。1つの実施形態において、上記方法は、ヘテロ接合雄と、野生型である雌またはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌とを繰り返し交配させることにより上記非ヒト動物系統を維持する工程を含む。
1つの実施形態において、上記方法は、ヒト重鎖配列に関してホモ接合性またはヘテロ接合性の雄または雌非ヒト動物から細胞を得る工程と、これらの細胞をドナー細胞として、またはこれらの細胞からの核をドナー核として利用する工程と、上記細胞または核を使用する工程であって、宿主細胞を使用してならびに/または代理母において上記細胞および/もしくは核を妊娠させて遺伝子改変非ヒト動物を作製するする工程とを含む。
1つの実施形態では、重鎖遺伝子座における置換に関してヘテロ接合性である雄非ヒト動物のみを雌非ヒト動物に交配させる。特定の実施形態において、上記雌非ヒト動物は、置換される重鎖遺伝子座に関してホモ接合性、ヘテロ接合性または野生型である。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるλおよび/またはκ軽鎖可変配列の、異種免疫グロブリン軽鎖配列による置換をさらに含む。1つの実施形態において、上記異種免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒト免疫グロブリンλおよび/またはκ軽鎖可変配列である。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に(非再構成配列については)作動可能に連結されているまたは(再構成配列については)融合されている、再構成または非再構成異種λまたはκ軽鎖配列(例えば、非再構成VLおよび非再構成JL、または再構成VLJL)をコードする配列を含む。1つの実施形態において、上記異種λまたはκ軽鎖配列はヒトのものである。1つの実施形態において、上記定常領域配列は、齧歯動物、ヒトおよび非ヒト霊長類から選択される。1つの実施形態において、上記定常領域配列は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。1つの実施形態において、上記導入遺伝子は、上記軽鎖配列の発現を駆動する非免疫グロブリンプロモーターを含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、転写活性プロモーターである。特定の実施形態において、上記プロモーターは、ROSA26プロモーターである。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法を提供し、この方法は、第一の改変のために、非ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む非ヒトヌクレオチド配列を上記動物のゲノムに挿入する工程であって、上記挿入が内因性ADAM6遺伝子を維持する工程、その後、第二の改変のために、上記非ヒト動物の上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を非機能的にする工程を含む。1つの実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が機能的重鎖可変領域をコードするように再構成できないように、上記第一の改変は、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流において行われ、上記第二の改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を逆位させるように、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を転座させるように、または上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を作動可能な連結の外側に配置するように行われる。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法を提供し、この方法は、非ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと非ヒトADAM6(または雄非ヒト動物において機能的なそのオルソログもしくはホモログもしくは断片)ヌクレオチド配列とを含む非ヒト動物ヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列で置換して、第一のキメラ遺伝子座を形成する工程、その後、非ヒトADAM6コード配列(またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする配列)を含む配列を、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列に挿入して、第二のキメラ遺伝子座を形成する工程を含む。
1つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変(VH)遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントに作動可能に連結されているヒトVH遺伝子セグメントまたはヒトVL遺伝子セグメントを含む。さらなる特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、マウスCH2+CH3配列と融合されているヒトCH1配列、またはヒトCH1およびヒトヒンジ配列を含む第三のキメラ遺伝子座に作動可能に連結されている。
1つの態様では、妊性雄マウスを作製するための、マウスADAM6遺伝子座または配列を含む異所性ヌクレオチド配列を含むマウスの使用を提供し、この使用は、上記マウスADAM6遺伝子座または配列を含む上記異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを、機能的内因性マウスADAM6遺伝子座または配列を欠いているマウスと交配させること、および該異所性ADAM6遺伝子座もしくは配列を有する後代を産生できる雌である後代を得ること、または該異所性ADAM6遺伝子座もしくは配列を含む雄であって、野生型雄マウスによって示される妊性とほぼ同じである妊性を示す雄である後代を得ることを含む。
1つの態様では、免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
1つの態様では、完全ヒトFabまたは完全ヒトF(ab)2を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
1つの態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
1つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
1つの態様では、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含有するファージライブラリーを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
1つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57および配列番号59から選択される配列を含むヒトVH1-69遺伝子セグメントに由来する。
1つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60および配列番号62から選択される配列を含むヒトVH1-69遺伝子セグメントに由来する。
1つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69および配列番号71から選択される配列を含むヒトVH1-2遺伝子セグメントにすべて由来する。
1つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70および配列番号72から選択される配列を含むヒトVH1-2遺伝子セグメントに由来する。
1つの態様では、ヒト抗体を作製するための可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、(a)本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、(b)(a)の免疫したマウスからリンパ球を単離すること、(c)上記リンパ球を1つ以上の標識抗体に曝露すること、(d)上記対象となる抗原に結合できるリンパ球を同定すること、および(e)上記リンパ球からの1つ以上の可変領域核酸配列を増幅し、それによって可変領域配列を生成することを含む。
1つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの脾臓に由来する。1つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスのリンパ節に由来する。1つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの骨髄に由来する。
1つの実施形態において、上記標識抗体は、蛍光団結合体化抗体である。1つの実施形態において、1つ以上の上記蛍光団結合体化抗体は、IgM、IgGおよび/またはその組み合わせから選択される。
1つの実施形態において、上記リンパ球は、B細胞である。
1つの実施形態において、上記1つ以上の可変領域核酸配列は、重鎖可変領域配列を含む。1つの実施形態において、上記1つ以上の可変領域核酸配列は、軽鎖可変領域配列を含む。1つの特定の実施形態において、上記軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域配列である。1つの実施形態において、上記1つ以上の可変領域核酸配列は、重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を含む。
1つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、(a)本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、(b)(a)の免疫したマウスから脾臓を単離すること、(c)上記脾臓からのBリンパ球を1つ以上の標識抗体に曝露すること、(d)上記対象となる抗原に結合できる(c)のBリンパ球を同定すること、および(e)上記Bリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
1つの実施形態において、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、(a)本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、(b)(a)の免疫したマウスから1つ以上のリンパ節を単離すること、(c)上記1つ以上のリンパ節からのBリンパ球を1つ以上の標識抗体に曝露すること、(d)上記対象となる抗原に結合できる(c)のBリンパ球を同定すること、および(e)上記Bリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
1つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、(a)本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、(b)(a)の免疫したマウスから骨髄を単離すること、(c)上記骨髄からのBリンパ球を1つ以上の標識抗体に曝露すること、(d)上記対象となる抗原に結合できる(c)のBリンパ球を同定すること、および(e)上記Bリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。様々な実施形態において、上記1つ以上の標識抗体は、IgM、IgGおよび/またはその組み合わせから選択される。
様々な実施形態において、上記対象となる抗原は、例えば、ウイルス抗原を含め、ヒト被験体が罹患する病原体である。例示的なウイルス性病原体としては、例えば、主に、アデノウイルス科、細菌ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ポリオーマウイルス、ラブドウイルス科、およびトガウイルス科のものが挙げられる。かかる例示的なウイルスは典型的に、長さが20~300ナノメートルの間の範囲にある。様々な実施形態において、上記対象となる抗原は、肝炎ウイルス(例えば、HCV、HBVなど)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、またはインフルエンザウイルスから選択されるウイルス抗原である。
様々な実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、増幅重鎖および軽鎖可変領域配列をヒト重鎖および軽鎖定常領域配列に融合させること、融合した重鎖および軽鎖配列を細胞において発現させること、および発現された重鎖および軽鎖配列を回収し、それによってヒト抗体を産生させることをさらに含む。
様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、IgM、IgD、IgA、IgEおよびIgGから選択される。様々な特定の実施形態において、上記IgGは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択される。様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、CH4またはその組み合わせを含む。様々な実施形態において、上記軽鎖定常領域は、免疫グロブリンκ定常領域である。様々な実施形態において、上記細胞は、HeLa細胞、DU145細胞、Lncap細胞、MCF-7細胞、MDA-MB-438細胞、PC3細胞、T47D細胞、THP-1細胞、U87細胞、SHSY5Y(ヒト神経芽腫)細胞、Saos-2細胞、Vero細胞、CHO細胞、GH3細胞、PC12細胞、ヒト網膜細胞(例えば、PER.C6(商標)細胞)およびMC3T3細胞から選択される。特定の実施形態において、上記細胞は、CHO細胞である。
1つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物-ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラマウス-ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも1つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラマウス-ヒト抗体を産生する少なくとも1つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程を含む。
1つの実施形態において、上記逆キメラマウス-ヒト抗体は、マウス重鎖定常遺伝子またはラット重鎖定常遺伝子と融合されたヒト重鎖可変ドメイン、およびマウス軽鎖定常遺伝子またはラット軽鎖定常遺伝子またはヒト軽鎖定常遺伝子と融合されたヒト軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態において、上記ヒト重鎖可変ドメインは、再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントまたはヒトVH1-2遺伝子セグメントを含有する。
1つの実施形態において、上記抗原に対して特異的な上記逆キメラ齧歯動物-ヒト抗体を産生する少なくとも1つの細胞の培養は、上記マウスから単離された少なくとも1つの細胞から産生された少なくとも1つのハイブリドーマ細胞で行う。
1つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物-ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも1つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラ齧歯動物-ヒト抗体に由来する完全ヒト抗体を産生する少なくとも1つの細胞を産生させる工程、および該完全ヒト抗体を産生する少なくとも1つの細胞を培養する工程、および該完全ヒト抗体を得る工程を含む。
様々な実施形態において、上記抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物-ヒト抗体を産生するマウスから単離される少なくとも1つの細胞は、脾細胞またはB細胞である。
様々な実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体である。
様々な実施形態において、上記抗体は、再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントまたはヒトVH1-2遺伝子セグメントを含有する重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、上記対象となる抗原での免疫を、タンパク質、DNA、DNAとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞を用いて行う。
1つの態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。1つの実施形態では、上記核酸配列を使用して、ヒト抗体またはその抗原結合断片を作製する。1つの実施形態では、上記マウスを使用して、抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、scFv、二重特異性scFv、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質)、SVD(すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質)または二重特異性T細胞エンゲージャー(bispecific T-cell engager:BiTE)から選択される抗原結合タンパク質を作製する。
1つの態様では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作非ヒト動物を、対象となる抗原に曝露する工程と、上記ヒト動物が上記抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、上記非ヒト動物から、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする重鎖可変ドメインの核酸配列を得る工程と、上記重鎖可変ドメインの核酸配列を、ヒト定常領域配列に融合する工程と、哺乳動物細胞内で、上記ヒト重鎖可変ドメイン配列および上記ヒト定常領域配列を含む抗体を発現させる工程とを含む方法を提供する。1つの実施形態において、上記哺乳動物細胞は、CHO細胞である。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、必要に応じてその2つ以上の多型変異体で存在する単一のヒトVH遺伝子セグメントから本質的になるヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーであって、1つ以上のヒトDセグメントおよび/またはヒトJセグメントに作動可能に連結されたヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーを含む。1つの実施形態において、上記ヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーは、内因性非ヒトVH遺伝子セグメントの遺伝子座にある。1つの実施形態において、上記ヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーは、内因性VH遺伝子セグメントの遺伝子座ではない遺伝子座にある。1つの実施形態において、上記ヒトVH遺伝子セグメントはヒトDセグメントおよびヒトJセグメントと共に再構成して、ヒト配列および齧歯動物配列(例えば、マウス配列またはラット配列またはハムスター配列)から選択される定常領域配列に作動可能に連結された再構成ヒトVDJ遺伝子を形成する。1つの実施形態において、上記定常領域配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびその組み合わせから選択される配列を含む;特定の実施形態において、上記定常領域配列は、CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3を含む。1つの実施形態において、上記ヒト可変ドメインおよび上記定常配列を、同じマウスから得られる同種のヒト軽鎖可変ドメイン(例えば、上記ヒト可変ドメイン配列と同じB細胞から得られる配列)と共に哺乳動物細胞内で発現させる;1つの実施形態において、次いで、上記マウスから得られるヒト軽鎖可変ドメインをコードする配列を、ヒト軽鎖定常配列をコードする配列と融合させ、上記軽鎖配列および上記重鎖配列を哺乳動物細胞内で発現させる。
1つの態様では、対象となる抗原に結合する抗体重鎖可変ドメインを作製するための方法であって、単一の細胞内で、(a)本明細書に記載の免疫した非ヒト動物の第一のVH配列であって、CH遺伝子配列と融合された第一のVH配列、および(b)本明細書に記載の免疫した非ヒト動物のVL遺伝子配列であって、ヒトCL遺伝子配列と融合されたVL遺伝子配列を発現させる工程と;上記細胞を、抗体を発現させるのに十分な条件下で維持する工程と;上記抗体重鎖可変ドメインを単離する工程とを含む方法を提供する。1つの実施形態において、VL遺伝子配列は、第一のVH配列と同種である。
1つの実施形態において、上記細胞は、本明細書に記載の免疫した非ヒト動物の第二のVH遺伝子配列を含み、上記第二のVH遺伝子配列は、CH遺伝子配列と融合され、上記第一のVH遺伝子配列は、第一のエピトープに特異的に結合するVHドメインをコードし、上記第二のVH遺伝子配列は、第二のエピトープに特異的に結合するVHドメインをコードし、上記第一のエピトープと上記第二のエピトープとが同一でない。
1つの実施形態において、上記定常領域配列は、すべてのヒト定常領域配列である。
1つの態様では、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物のB細胞のヒト可変領域遺伝子配列を用いて二重特異性抗体を作製する工程を含む方法を提供する。
1つの実施形態において、上記方法は、(a)対象となる抗原に曝露されて上記対象となる抗原に対する免疫応答を発生するようにされた非ヒト動物のクローン選択リンパ球を同定する工程であって、上記リンパ球が、上記対象となる抗原に特異的に結合する抗体を発現する工程と、(b)上記リンパ球または上記抗体から、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得る工程と、(c)上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、上記二重特異性抗体の作製において使用する工程とを含む。特定の実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、再構成VH1-2またはVH1-69遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、工程(a)~(c)を、1回目は、第一のヒト重鎖可変領域配列を生成するために、第一の対象となる抗原に対して実施し、工程(a)~(c)を、2回目は、第二のヒト重鎖可変領域配列を生成するために、第二の対象となる抗原に対して実施し、第一のヒト重鎖定常領域と融合された上記第一のヒト重鎖可変領域配列を発現させて、第一のヒト重鎖を形成し、第二のヒト重鎖定常領域と融合された上記第二のヒト重鎖可変領域配列を発現させて、第二のヒト重鎖を形成し、上記第一のヒト重鎖および上記第二のヒト重鎖を、再構成ヒトVκ1-39遺伝子セグメントまたはヒトVκ3-20遺伝子セグメントから発現される単一のヒト軽鎖の存在下で発現させる。特定の実施形態において、上記単一のヒト軽鎖は、生殖細胞系配列を含む。
1つの実施形態において、上記方法は、(a)第一の対象となる抗原に曝露された本明細書に記載の非ヒト動物のB細胞、および同じ非ヒト動物、または遺伝的に同じで第二の対象となる抗原に曝露された異なる非ヒト動物のB細胞から重鎖可変領域をクローニングする工程と、(b)(a)の上記重鎖可変領域を、上記同じ重鎖定常領域および上記同じ軽鎖と共に細胞内で発現させて、二重特異性抗体を作製する工程とを含む。
1つの態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得るための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。1つの実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、VH1-2、およびVH1-69から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含む。
1つの態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする細胞を得るための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。1つの実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、VH1-2、およびVH1-69から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含む。
1つの態様において、ヒト抗体可変ドメインを作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。1つの態様において、ヒト抗体を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。1つの実施形態において、上記ヒト抗体は、ヒト二重特異性抗体である。様々な実施形態において、上記可変ドメインおよび/または上記抗体は、VH1-2およびVH1-69から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含む。
1つの態様において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。1つの実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、VH1-2およびVH1-69から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含む。
1つの態様では、機能的内因性マウスADAM6配列が無いマウスに異所性ADAM6配列を導入するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、本明細書に記載のマウスと、該機能的内因性マウスADAM6配列が無いマウスとを交配させることを含む。
1つの態様では、異所性ADAM6配列を有するマウスを作製するための、本明細書に記載のマウスからの遺伝子材料の使用を提供する。1つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞の核を使用する核移植を含む。1つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞を、該細胞に由来する動物を産生するためにクローングすることを含む。1つの実施形態において、上記使用は、上記異所性ADAM6配列を含むマウスを作製するためのプロセスにおける、本明細書に記載のマウスの精子または卵子の利用を含む。
1つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む妊性雄マウスを作製するための方法であって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む第一のマウス生殖細胞を、雄マウスにおいて機能的であるADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む第二のマウス生殖細胞で受精させる工程;受精細胞を形成する工程;上記受精細胞を胚へと発生させる工程;および代理母において上記胚を妊娠させてマウスを得る工程を含む方法を提供する。
1つの実施形態において、上記受精は、雄マウスと雌マウスを交配させることによって達成される。1つの実施形態では、上記雌マウスが上記ADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。1つの実施形態では、上記雄マウスが上記ADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。
1つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有するマウスの妊性を回復させるまたは強化するための、マウスADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログまたは対応するADAM6タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列の使用を提供し、この場合の改変は、内因性ADAM6機能を低減させるまたは除去する。
1つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの異所位置に組み込む。1つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み込む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。1つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込む。
1つの態様では、ヒト疾患または障害の処置のために、薬物(例えば、抗原結合タンパク質)を製造するための、または薬物(例えば、抗原結合タンパク質)の可変配列をコードする配列を製造するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。1つの実施形態において、医薬の上記可変配列は、多型ヒトVH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、医薬の上記可変配列は、ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、医薬の上記可変配列は、ヒトVH1-2遺伝子セグメントを含む。
1つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸構築物を提供する。1つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、またはVH3-23から選択されるヒトVH遺伝子セグメントを含む。もう1つの特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ヒトVH1-2遺伝子セグメントを含む。もう1つの特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記可変ドメインは、再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインと同種のκ軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記可変ドメインは、再構成ヒトVH1-2遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインと同種のκ軽鎖可変ドメインである。
1つの態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸構築物を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。1つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。1つの実施形態において、上記可変ドメインは、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39、およびVκ2-40から選択される再構成ヒトVκ遺伝子セグメントを含むκ軽鎖可変ドメインである。
1つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、またはVH3-23から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトVH1-2遺伝子セグメントを含む。
1つの態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。1つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。1つの実施形態において、上記可変ドメインは、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39、およびVκ2-40から選択される再構成ヒトVκ遺伝子セグメントを含むκ軽鎖可変ドメインである。
1つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、またはVH3-23から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトVH1-2遺伝子セグメントを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
マウスであって、
(a)単一のヒトVH遺伝子セグメント、1つ以上のDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のJH遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列;および
(b)雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質をコードする配列であって、野生型マウスのADAM6遺伝子座とは異なる位置にある配列
をその生殖細胞系に有する、マウス。
(項目2)
前記単一のヒトVH遺伝子セグメントが多型VH遺伝子セグメントである、項目1に記載のマウス。
(項目3)
前記ADAM6をコードする配列がマウス配列である、項目1に記載のマウス。
(項目4)
前記マウスゲノム配列が前記ヒトゲノム配列に並置または隣接している、項目1に記載のマウス。
(項目5)
前記ヒトゲノム配列および前記マウスゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する、項目1に記載のマウス。
(項目6)
前記ヒトゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在し、前記マウスゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座以外の該マウスゲノム内の位置に存在する、項目1に記載のマウス。
(項目7)
すべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの欠失を含む、項目1に記載のマウス。
(項目8)
前記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、VH3-23またはそれらの多型変異体から選択される、項目1に記載のマウス。
(項目9)
前記ヒトVH遺伝子セグメントがVH1-69である、項目8に記載のマウス。
(項目10)
前記ヒトVH遺伝子セグメントがVH1-2である、項目8に記載のマウス。
(項目11)
前記単一のVH遺伝子セグメントが、ヒト、マウスまたはキメラヒト/マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、項目1に記載のマウス。
(項目12)
前記免疫グロブリン定常領域遺伝子がマウス定常領域遺伝子である、項目11に記載のマウス。
(項目13)
前記免疫グロブリン定常遺伝子が、ヒトCH1、ヒトヒンジ、ヒトCH2、ヒトCH3およびそれらの組み合わせから選択されるヒト配列を含む、項目11に記載のマウス。
(項目14)
前記マウス定常遺伝子が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目12に記載のマウス。
(項目15)
前記ヒトゲノム配列が、ヒトVH1-69遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む、項目1に記載のマウス。
(項目16)
前記ヒトゲノム配列が、ヒトVH1-2遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む、項目1に記載のマウス。
(項目17)
1つ以上のヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つ以上のJκ遺伝子セグメントをさらに含む、項目1、15または16に記載のマウス。
(項目18)
前記1つ以上のヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つ以上のJκ遺伝子セグメントが内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、項目17に記載のマウス。
(項目19)
少なくとも1つのヒトDH遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのヒトJH遺伝子セグメントに作動可能に連結された少なくとも1つのヒトVH遺伝子セグメントを含むマウスであって、異所性マウスADAM6配列を含む、マウス。
(項目20)
前記核酸配列が異所位置に存在する、項目19に記載のマウス。
(項目21)
前記核酸配列が内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在する、項目19に記載のマウス。
(項目22)
前記核酸配列がマウスゲノム内の内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に存在する、項目19に記載のマウス。
(項目23)
血清免疫グロブリンを発現するマウスであって、該マウスの該血清免疫グロブリンの80%超がヒト重鎖可変ドメインおよび同種のヒト軽鎖可変ドメインを含み、該ヒト重鎖可変ドメインが、単一のヒトVH遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体から本質的になるVH遺伝子セグメントのレパートリーに由来する、マウス。
(項目24)
マウスであって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの、単一のヒトVH遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体による置換をその生殖細胞系に含む、マウス。
(項目25)
マウスであって、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性軽鎖V遺伝子セグメントの、1つ以上のヒト軽鎖V遺伝子セグメントによる置換をさらに含む、項目24に記載のマウス。
(項目26)
前記ヒト軽鎖V遺伝子セグメントに作動可能に連結された1つ以上のヒト軽鎖J遺伝子セグメントをさらに含む、項目25に記載のマウス。
(項目27)
項目1、19、23または24に記載のマウスに由来する、細胞または組織。
(項目28)
単一のヒトVH遺伝子セグメントに由来する重鎖を含むヒト抗体集団を作製するための方法であって、以下:
(a)項目1に記載のマウスを対象となる抗原で免疫する工程;
(b)該マウスが該対象となる抗原に関して免疫応答を開始するようにする工程;および(c)該抗体が該対象となる抗原に結合する、該非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単離する工程
を含む、方法。
(項目29)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号5と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号5を含む、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号64と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号64を含む、項目28に記載の方法。
(項目33)
マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変するための方法であって、以下:
(a)雄マウスにおいて内因性マウスADAM6活性の低減または除去を結果としてもたらす、該マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一の改変を行う工程;および
(b)該マウスに対してADAM6活性を回復させるための該マウスの第二の改変を行う工程
を含む、方法。
(項目34)
工程(b)の核酸配列が異所位置に存在する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記第一の改変が、1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の存在を含む、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記第一の改変が、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の1つ以上の配列の、該マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列による置換を含む、項目33に記載の方法。
(項目37)
前記第一の改変が、1つ以上の内因性VH遺伝子セグメントの、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の単一のヒトVH遺伝子セグメントによる置換を含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記第一の改変が、内因性重鎖可変遺伝子配列の、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内のヒト重鎖可変遺伝子配列による置換を含む、項目33に記載の方法。
(項目39)
前記第一および前記第二の改変が同時に行われる、項目33に記載の方法。
(項目40)
抗原に対して特異的な抗体を産生させるための方法であって、以下の工程:
(a)項目1に記載のマウスを該抗原で免疫する工程;
(b)該抗原に対して特異的な抗体を産生する該マウスから少なくとも1つの細胞を単離する工程;および
(c)工程b)の抗体を産生する少なくとも1つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程
を含む、方法。
(項目41)
工程(c)における前記培養する工程が、工程(b)において得た前記少なくとも1つの細胞から産生された少なくとも1つのハイブリドーマ細胞で行われる、項目40に記載の方法。
(項目42)
工程(b)において得られる前記少なくとも1つの細胞が、工程(a)からの前記マウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する、項目40に記載の方法。
(項目43)
工程(a)の前記抗原での免疫が、タンパク質、DNA、DNAとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞で行われる、項目40に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
マウスであって、
(a)単一のヒトVH遺伝子セグメント、1つ以上のDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のJH遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列;および
(b)雄マウスにおいて機能的であるADAM6タンパク質をコードする配列であって、野生型マウスのADAM6遺伝子座とは異なる位置にある配列
をその生殖細胞系に有する、マウス。
(項目2)
前記単一のヒトVH遺伝子セグメントが多型VH遺伝子セグメントである、項目1に記載のマウス。
(項目3)
前記ADAM6をコードする配列がマウス配列である、項目1に記載のマウス。
(項目4)
前記マウスゲノム配列が前記ヒトゲノム配列に並置または隣接している、項目1に記載のマウス。
(項目5)
前記ヒトゲノム配列および前記マウスゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する、項目1に記載のマウス。
(項目6)
前記ヒトゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在し、前記マウスゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座以外の該マウスゲノム内の位置に存在する、項目1に記載のマウス。
(項目7)
すべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの欠失を含む、項目1に記載のマウス。
(項目8)
前記単一のヒトVH遺伝子セグメントが、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、VH3-23またはそれらの多型変異体から選択される、項目1に記載のマウス。
(項目9)
前記ヒトVH遺伝子セグメントがVH1-69である、項目8に記載のマウス。
(項目10)
前記ヒトVH遺伝子セグメントがVH1-2である、項目8に記載のマウス。
(項目11)
前記単一のVH遺伝子セグメントが、ヒト、マウスまたはキメラヒト/マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、項目1に記載のマウス。
(項目12)
前記免疫グロブリン定常領域遺伝子がマウス定常領域遺伝子である、項目11に記載のマウス。
(項目13)
前記免疫グロブリン定常遺伝子が、ヒトCH1、ヒトヒンジ、ヒトCH2、ヒトCH3およびそれらの組み合わせから選択されるヒト配列を含む、項目11に記載のマウス。
(項目14)
前記マウス定常遺伝子が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目12に記載のマウス。
(項目15)
前記ヒトゲノム配列が、ヒトVH1-69遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む、項目1に記載のマウス。
(項目16)
前記ヒトゲノム配列が、ヒトVH1-2遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む、項目1に記載のマウス。
(項目17)
1つ以上のヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つ以上のJκ遺伝子セグメントをさらに含む、項目1、15または16に記載のマウス。
(項目18)
前記1つ以上のヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つ以上のJκ遺伝子セグメントが内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、項目17に記載のマウス。
(項目19)
少なくとも1つのヒトDH遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのヒトJH遺伝子セグメントに作動可能に連結された少なくとも1つのヒトVH遺伝子セグメントを含むマウスであって、異所性マウスADAM6配列を含む、マウス。
(項目20)
前記核酸配列が異所位置に存在する、項目19に記載のマウス。
(項目21)
前記核酸配列が内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在する、項目19に記載のマウス。
(項目22)
前記核酸配列がマウスゲノム内の内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に存在する、項目19に記載のマウス。
(項目23)
血清免疫グロブリンを発現するマウスであって、該マウスの該血清免疫グロブリンの80%超がヒト重鎖可変ドメインおよび同種のヒト軽鎖可変ドメインを含み、該ヒト重鎖可変ドメインが、単一のヒトVH遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体から本質的になるVH遺伝子セグメントのレパートリーに由来する、マウス。
(項目24)
マウスであって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性VH遺伝子セグメントの、単一のヒトVH遺伝子セグメントおよび/またはその多型変異体による置換をその生殖細胞系に含む、マウス。
(項目25)
マウスであって、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性軽鎖V遺伝子セグメントの、1つ以上のヒト軽鎖V遺伝子セグメントによる置換をさらに含む、項目24に記載のマウス。
(項目26)
前記ヒト軽鎖V遺伝子セグメントに作動可能に連結された1つ以上のヒト軽鎖J遺伝子セグメントをさらに含む、項目25に記載のマウス。
(項目27)
項目1、19、23または24に記載のマウスに由来する、細胞または組織。
(項目28)
単一のヒトVH遺伝子セグメントに由来する重鎖を含むヒト抗体集団を作製するための方法であって、以下:
(a)項目1に記載のマウスを対象となる抗原で免疫する工程;
(b)該マウスが該対象となる抗原に関して免疫応答を開始するようにする工程;および(c)該抗体が該対象となる抗原に結合する、該非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単離する工程
を含む、方法。
(項目29)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号5と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号5を含む、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号64と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号64を含む、項目28に記載の方法。
(項目33)
マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変するための方法であって、以下:
(a)雄マウスにおいて内因性マウスADAM6活性の低減または除去を結果としてもたらす、該マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一の改変を行う工程;および
(b)該マウスに対してADAM6活性を回復させるための該マウスの第二の改変を行う工程
を含む、方法。
(項目34)
工程(b)の核酸配列が異所位置に存在する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記第一の改変が、1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の存在を含む、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記第一の改変が、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の1つ以上の配列の、該マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の1つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列による置換を含む、項目33に記載の方法。
(項目37)
前記第一の改変が、1つ以上の内因性VH遺伝子セグメントの、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の単一のヒトVH遺伝子セグメントによる置換を含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記第一の改変が、内因性重鎖可変遺伝子配列の、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内のヒト重鎖可変遺伝子配列による置換を含む、項目33に記載の方法。
(項目39)
前記第一および前記第二の改変が同時に行われる、項目33に記載の方法。
(項目40)
抗原に対して特異的な抗体を産生させるための方法であって、以下の工程:
(a)項目1に記載のマウスを該抗原で免疫する工程;
(b)該抗原に対して特異的な抗体を産生する該マウスから少なくとも1つの細胞を単離する工程;および
(c)工程b)の抗体を産生する少なくとも1つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程
を含む、方法。
(項目41)
工程(c)における前記培養する工程が、工程(b)において得た前記少なくとも1つの細胞から産生された少なくとも1つのハイブリドーマ細胞で行われる、項目40に記載の方法。
(項目42)
工程(b)において得られる前記少なくとも1つの細胞が、工程(a)からの前記マウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する、項目40に記載の方法。
(項目43)
工程(a)の前記抗原での免疫が、タンパク質、DNA、DNAとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞で行われる、項目40に記載の方法。
特に明確な注記がない限り、または併用が文脈上明らかに禁止されていない限り、様々な態様および実施形態を併用することができる。
詳細な説明
本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されない。かかる方法および条件は変わることがあるからである。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義するので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されない。かかる方法および条件は変わることがあるからである。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義するので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての用語および句は、その用語または句が用いられている文脈から相反することが明確に指摘されるまたは明確に分かる場合を除き、その用語および句が当該技術分野において獲得している意味を含む。本明細書に記載するものに類似したまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、今は特定の方法および材料を記載する。
遺伝子セグメントの量を指すために用いるときの句「実質的な」または「実質的に」(例えば、「実質的にすべての」V遺伝子セグメント)は、機能的遺伝子セグメントと非機能的遺伝子セグメントの両方を含み、および様々な実施形態において、例えば、すべての遺伝子セグメントの80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上または99%以上を含む;様々な実施形態において、「実質的にすべての」遺伝子セグメントは、例えば、機能的(すなわち、非偽遺伝子)遺伝子セグメントの少なくとも95%、96%、97%、98%または99%を含む。
用語「置換」は、ゲノム内の配列を該ゲノム配列の遺伝子座において異種配列(例えば、マウスにおけるヒト配列)で置換するようなやり方でDNA配列を細胞のゲノムに配置する場合のものを含む。そのようにして配置されたDNAは、そのようにして配置された配列を得るために使用した源DNAの一部である1つ以上の調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、5’または3’非翻訳領域、適切な組換えシグナル配列など)を含み得る。例えば、様々な実施形態において、上記置換は、そのように置かれた(placed)DNA配列(異種配列を含む)から遺伝子産物の産生をもたらす結果となる、異種配列に代えての内因性配列の置き換えであり、該内因性配列の発現ではない;上記置換は、内因性ゲノム配列の、該内因性ゲノム配列によってコードされているタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードするDNA配列による置換である(例えば、上記内因性ゲノム配列は、免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードしており、上記DNA断片は、一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードする)。様々な実施形態において、内因性遺伝子またはその断片は、対応するヒト遺伝子またはその断片で置換される。対応するヒト遺伝子またはその断片は、置換される内因性遺伝子もしくは断片のオルソログである、置換される内因性遺伝子もしくは断片のホモログである、または置換される内因性遺伝子もしくは断片と構造および/もしくは機能の点で実質的に同一もしくは同じである、ヒト遺伝子または断片である。
遺伝モデルとしてのマウスは、トランスジェニックおよびノックアウト技術によって大きく向上され、これらの技術により特定の遺伝子の指向性過発現または欠失の効果の研究が可能になった。あらゆるその利点にもかかわらず、上記マウスは、マウスをヒト疾患についての不完全なモデルにならしめるおよびヒト治療薬を試験するまたはそれらを作製するための不完全なプラットホームにならしめる遺伝的障害をやはり提示する。第一に、ヒト遺伝子の約99%はマウスホモログを有する(Waterstonら、2002、Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome、Nature 420:520-562)が、可能性のある治療薬は、多くの場合、所期のヒト標的のマウスオルソログと交叉反応することができない、または不適切に交叉反応する。この問題を未然に防ぐために、選択標的遺伝子を「ヒト化」することができる、すなわち、マウス遺伝子を除去して、対応するオルソロガスヒト遺伝子配列により置換することができる(例えば、米国特許第6,586,251号、同第6,596,541号および同第7,105,348号明細書)。最初、「ノックアウト・プラス・トランスジェニックヒト化(knockout-plus-transgenic humanization)」戦略によりマウス遺伝子をヒト化する努力は、上記内因性遺伝子の欠失(すなわち、ノックアウト)を保有するマウスとランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を保有するマウスとの交配を必要とした(例えば、Brilら、2006、Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution、Thromb Haemost 95:341-347;Homanicsら、2006、Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease、BMC Med Genet 7:33;Jamsaiら、2006、A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia、Genomics 88(3):309-15;Panら、2006、Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer
in preT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice、Mol Immunol 43:1741-1750参照)。しかし、これらの努力は、サイズ制限によって妨げられた;従来のノックアウト技術は、大きなマウス遺伝子を該遺伝子の大きなヒトゲノムカウンターパートで直接置換するのに十分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにその遺伝子の場所で(すなわち内因性マウス遺伝子座で)ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子を直接置換する直接相同置換の直接的なアプローチは、技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要とし、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さおよび操作することができる精度が限定された。
in preT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice、Mol Immunol 43:1741-1750参照)。しかし、これらの努力は、サイズ制限によって妨げられた;従来のノックアウト技術は、大きなマウス遺伝子を該遺伝子の大きなヒトゲノムカウンターパートで直接置換するのに十分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにその遺伝子の場所で(すなわち内因性マウス遺伝子座で)ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子を直接置換する直接相同置換の直接的なアプローチは、技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要とし、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さおよび操作することができる精度が限定された。
外因的に導入されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスの前駆体B細胞内で再構成する(Altら、1985、Immunoglobulin genes in transgenic mice、Trends Genet 1:231-236)。この発見は、ヒト抗体を発現させるためにノックアウト・プラス・トランスジェニックアプローチを用いるマウスの工学的作製に活用された(Greenら、1994、Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs、Nat Genet 7:13-21;Lonbergら、1994、Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications、Nature 368:856-859;Jakobovitsら、2007、From XenoMouse technology to panitumumab,the first fully human antibody product from transgenic mice、Nat Biotechnol 25:1134-1143)。マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大きな導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化された(Tomizukaら、2000、Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies、PNAS USA 97:722-727)。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴した;それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をもたらした(Gibsonら、2006、Randomized phase III trial results of panitumumab、a fully human anti-epidermal growth factor receptor
monoclonal antibody,in metastatic colorectal cancer、Clin Colorectal Cancer 6:29-31;Jakobovitsら、2007;Kimら、2007、Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax-CD4):two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma、Blood 109(11):4655-62;Lonberg、2005、Human antibodies from transgenic animals、Nat Biotechnol 23:1117-1125;Makerら、2005、Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic
T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2:a phase I/II study、Ann Surg Oncol 12:1005-1016;McClungら、2006、Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density、New Engl J Med 354:821-831)。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたB細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。上記不全は、 ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現(Garrettら、2005、Chromatin architecture near a potential 3’end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites、Mol Cell Biol 25:1511-1525;Manisら、2003、Elucidation of a downstream boundary of the 3’IgH regulatory region、Mol Immunol 39:753-760;Pawlitzkyら、2006、Identification of a candidate regulatory element within the 5’flanking region of the mouse
IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5,and E2A、J Immunol 176:6839-6851); B細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のB細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用(Hombachら、1990、Molecular
components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class、Nature 343:760-762);および 親和性選択(Raoら、2002、Differential
expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells、J Immunol 169:1859-1868)および免疫グロブリン血清濃度(Brambellら、1964、A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism、Nature 203:1352-1354;Junghans and Anderson、1996、The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor、PNAS USA 93:5512-5516;Raoら、2002;Hjelmら、2006、Antibody-mediated regulation of the immune response、Scand J Immunol 64:177-184;Nimmerjahn and Ravetch、2007、Fc-receptors as regulators of immunity、Adv
Immunol 96:179-204)を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスFc受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのin situヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」(すなわち、ヒトV:マウスC)抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。この方法を用いることにより、所望のキメラ遺伝子座の複雑性に基づいて、ヒト化遺伝子座の特定のバージョンを構築することができる。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる。
monoclonal antibody,in metastatic colorectal cancer、Clin Colorectal Cancer 6:29-31;Jakobovitsら、2007;Kimら、2007、Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax-CD4):two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma、Blood 109(11):4655-62;Lonberg、2005、Human antibodies from transgenic animals、Nat Biotechnol 23:1117-1125;Makerら、2005、Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic
T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2:a phase I/II study、Ann Surg Oncol 12:1005-1016;McClungら、2006、Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density、New Engl J Med 354:821-831)。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたB細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。上記不全は、 ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現(Garrettら、2005、Chromatin architecture near a potential 3’end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites、Mol Cell Biol 25:1511-1525;Manisら、2003、Elucidation of a downstream boundary of the 3’IgH regulatory region、Mol Immunol 39:753-760;Pawlitzkyら、2006、Identification of a candidate regulatory element within the 5’flanking region of the mouse
IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5,and E2A、J Immunol 176:6839-6851); B細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のB細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用(Hombachら、1990、Molecular
components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class、Nature 343:760-762);および 親和性選択(Raoら、2002、Differential
expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells、J Immunol 169:1859-1868)および免疫グロブリン血清濃度(Brambellら、1964、A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism、Nature 203:1352-1354;Junghans and Anderson、1996、The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor、PNAS USA 93:5512-5516;Raoら、2002;Hjelmら、2006、Antibody-mediated regulation of the immune response、Scand J Immunol 64:177-184;Nimmerjahn and Ravetch、2007、Fc-receptors as regulators of immunity、Adv
Immunol 96:179-204)を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスFc受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのin situヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」(すなわち、ヒトV:マウスC)抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。この方法を用いることにより、所望のキメラ遺伝子座の複雑性に基づいて、ヒト化遺伝子座の特定のバージョンを構築することができる。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる。
内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における挿入または置換と共に、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子(例えば、キメラ免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子もしくは完全ヒト完全マウスなど)と共に、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における異種(例えば、別の種からの)免疫グロブリン配列による挿入または置換を含む遺伝子改変動物を作製することができる。上記異種免疫グロブリン重鎖配列が由来する種は多種多様であり得、免疫グロブリン軽鎖配列置換に利用される免疫グロブリン軽鎖配列、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子に関しても多種多様であり得る。例示的な異種免疫グロブリン重鎖配列としては、ヒト配列が挙げられる
様々な実施形態において、免疫グロブリン可変領域核酸配列、例えば、V、Dおよび/またはJセグメントは、ヒトまたは非ヒト動物から得られる。V、Dおよび/またはJセグメントの供給に好適な非ヒト動物としては、例えば、硬骨魚、軟骨魚、例えばサメおよびエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、鳥類(例えば、ニワトリ)が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ(例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー)、シカ、ラクダ、フェレットおよび齧歯動物および非ヒト霊長類(例えば、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、マーモセット、アカゲザル、ヒヒ)が挙げられる。好適な非ヒト動物は、ラット、マウスおよびハムスターを含む齧歯動物のファミリーから選択される。1つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。この文脈から明白であるように、様々な非ヒト動物(例えば、サメ、エイ、哺乳類、例えば、ラクダ、齧歯動物、例えばマウスおよびラット)を可変ドメインまたは可変領域遺伝子セグメントの源として使用することができる。
上記文脈によると、非ヒト動物は、可変配列またはセグメントと併用される定常領域配列の源としても使用される。例えば、ヒトまたは非ヒト可変配列に作動可能に連結される導入遺伝子(例えば、齧歯動物、例えばマウスもしくはラットもしくはハムスター、定常配列に作動可能に連結されたヒトまたは非ヒト霊長類可変配列)において齧歯動物定常配列を使用することができる。したがって、様々な実施形態において、ヒトV、Dおよび/またはJセグメントを齧歯動物(例えば、マウスまたはラットまたはハムスター)定常領域遺伝子配列に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、上記ヒトV、Dおよび/またはJセグメント(または1つ以上の再構成VDJもしくはVJ遺伝子)を、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座に組み込まれる導入遺伝子におけるマウス、ラットまたはハムスター定常領域遺伝子配列に作動可能に連結または融合させる。
特定の実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるVH、DHおよびJH遺伝子セグメントの、単一のヒトVH、1つ以上のDHおよび1つ以上のJH遺伝子セグメントによる置換を含み、該単一のヒトVH、1つ以上のDHおよび1つ以上のJH遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結されているものであるマウスを提供し、この場合のマウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、マウスまたはラットまたはヒト定常領域に作動可能に連結された非再構成または再構成ヒトVLおよびヒトJL遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントは、多型遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-69遺伝子セグメントまたはヒトVH1-2遺伝子セグメントである。
子孫を産生するマウスの能力を維持しながら、限定されたヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖遺伝子座での、マウス生殖細胞系免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座のin situ遺伝子置換、およびヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座での、マウス生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座のin situ遺伝子置換のための方法を記載する。具体的には、上記マウス定常領域をインタクトで残しながら、6メガ塩基のマウス重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座の両方をヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖配列で正確に置換することを記載する。結果として、マウス定常領域を維持しながら、マウスの生殖細胞系免疫グロブリン可変レパートリーすべてがヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変配列で正確に置換されたマウスを生み出した。上記ヒト可変領域をマウス定常領域に連結させて、再構成して生理的に適切なレベルで発現するキメラヒト-マウス免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現する抗体は、「逆キメラ」である。すなわち、それらはヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。
本明細書に記載の遺伝子改変マウスは、完全に機能的な体液性免疫系を示し、病原性抗原、例えばウイルス抗原と闘うために有効である薬学的に許容され得る抗体および他の抗原結合タンパク質を作製するための自然親和性成熟ヒト免疫グロブリン可変領域配列の豊富な供給源を提供する。
マウスゲノム内の正確な位置(例えば、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座)におけるヒト免疫グロブリンの操作は、マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の分岐進化のため、一定の課題を提起し得る。例えば、免疫グロブリン遺伝子座内に散在する遺伝子間配列は、マウスとヒトの間で同一ではなく、一部の状況では、機能的に等価でないこともある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座におけるその相違は、特に内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一定の部分をヒト化または操作するとき、やはりヒト化マウスに異常を生じさせる結果となる場合がある。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における一部の改変は有害である。有害な改変としては、例えば、改変されたマウスの交配および子孫産生能力の喪失を挙げることができる。様々な実施形態において、マウスゲノム内におけるヒト免疫グロブリン配列の操作は、改変マウス系統に無いと有害な内因性配列を維持する方法を含む。例示的な有害効果としては、改変系統の繁殖不能、必須遺伝子の機能喪失、ポリペプチドの発現不能などを挙げることができる。かかる有害効果は、上記マウスゲノムに行われる改変に直接的または間接的に関係する場合がある。
免疫グロブリン遺伝子座がヒト化されたマウスにおいて観察される野生型に近い体液性免疫機能にもかかわらず、ランダムに組み込まれた導入遺伝子を利用する一部のアプローチでは遭遇しない、免疫グロブリン配列の直接置換を利用すると遭遇する他の課題がある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子組成の相違は、免疫グロブリン遺伝子セグメントが置換されたマウスの繁殖にとって有益な配列の発見をもたらした。具体的には、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座内にあるマウスADAM遺伝子は、妊性におけるその役割のため、免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウスに最適に存在する。
すべてのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座の転写制御領域を含め、ハイブリッド遺伝子座内の隣接するマウス配列はインタクト、かつ、機能的のままとしながら、6メガ塩基のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座(VH-DH-JH)可変領域の、限定されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座による、in situにおける正確な置換を実施した(図1および図8)。さらに、操作工程を実施して、野生型マウスと幾分同程度に交配して子孫を生む能力をマウスに付与するマウス配列を維持した(図9および図10)。具体的には、VELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作技術(例えば、米国特許第6,586,251号、およびValenzuelaら、2003,High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis,Nat Biotechnol 21:652-659参照)を用いて、キメラBACターゲティングベクターを介し、単一のヒトVH遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメント、および6のヒトJH遺伝子セグメントおよびマウスADAM6遺伝子を、マウスES細胞に導入した。
限定された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントを有するマウス
限定された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントを有するマウス
限られた数のVH遺伝子、および1つ以上のD遺伝子および1つ以上のJ遺伝子を含む免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を、それらを作製する方法およびそれらを用いる方法と同様に、提供する。対象となる抗原で免疫されると、上記非ヒト動物は、予め限定された選択VH遺伝子またはVH遺伝子のセット(例えば、予め選択されたVH遺伝子およびその変異体)のみに由来する抗体の可変領域を有するB細胞集団を生成する。様々な実施形態において、ヒト重鎖可変ドメインであるヒト抗体可変ドメインを、同種のヒト軽鎖可変ドメインと共に発現するB細胞集団を生成する非ヒト動物を提供する。様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、非再構成非ヒト可変領域配列の、非再構成ヒト可変領域配列による置換または挿入を含む改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座に由来するヒト重鎖可変遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを再構成する。
免疫グロブリン遺伝子の組織化、構造、および機能についての初期の研究は、内因性遺伝子座を無能とし、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子、例えば、ヒト定常遺伝子と連結されたヒト重鎖遺伝子の部分的なレパートリーであって、ヒト軽鎖導入遺伝子の存在下または非存在下で、ゲノムにランダムに挿入されたレパートリーを有するトランスジェニック遺伝子座(ランダムに配置された)を有するように操作されたマウスについて部分的になされた。これらのマウスは、有用な高親和性抗体を作製するには何らかの点で最適に満たなかったが、免疫グロブリン遺伝子座についての特定の機能的な解析を容易とした。これらのマウスのうちの一部は、2つもしくは3つ程度、なおまたは単一の重鎖可変遺伝子だけという少数の重鎖可変遺伝子を有した。
ランダムに挿入された導入遺伝子(および無能とした内因性免疫グロブリン遺伝子座)上のヒトμ定常遺伝子およびヒトγ1定常遺伝子と共に、単一のヒトVH5-51遺伝子および10のヒトDH遺伝子および6のヒトJH遺伝子に由来する完全ヒト免疫グロブリン重鎖を発現するマウスが報告されている(Xu and Davis,2000,Diversity in the CDR3 Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities,Immunity 13:37-45)。これらのマウスの完全ヒト免疫グロブリン重鎖は大半が、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に由来する2つの完全マウスλ軽鎖だけのうちの1つ(Vλ1-Jλ1またはVλ2-Jλ2のみ)と共に発現され、κ軽鎖を発現することができない(これらのマウスは、Igκ-/-である)。これらのマウスは、B細胞の発生および抗体の発現において重度に異常な機能不全を呈示する。報告によれば、B細胞数が野生型の5~10%であり、IgMレベルが野生型の5~10%であり、IgG1レベルは野生型の0.1~1%に過ぎない。観察されたIgMレパートリーは、高度に限定された接合部の多様性を明らかにした。完全ヒト重鎖は、大部分が抗原をわたって同一のCDR3の長さ、抗原をわたって同じJH(JH2)の使用、および最初の接合部のQ残基を提示し、したがって、CDR3の多様性のある程度の欠如を反映する。完全マウスλ軽鎖はほぼすべてが、Jλ1内に最初の接合部残基としてのW96L置換を有した。報告によれば、マウスは、細菌性多糖に対するいかなる抗体を生成することもできない。ヒト可変ドメインをマウス軽鎖とカップリングさせるため、ヒト可変領域の有用性は、大きく制限される。
単一のヒトVH3-23遺伝子だけ、ヒトDH遺伝子およびヒトJH遺伝子、およびマウス軽鎖遺伝子を有する他のマウスが報告されているが、これらは、ヒトVHドメインとマウスVLドメインとの誤対合の可能性(例えば、Mageedら、2001,Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice
generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain
variable region,Clin.Exp.Immunol.123:1-5参照)に部分的に起因して、多様性の制限を呈示する(したがって、有用性の制限も呈示する)。同様に、ヒトμ定常遺伝子を含有する導入遺伝子内に、ヒトDH遺伝子およびヒトJH遺伝子と共に2つのVH遺伝子(3-23および6-1)を保有し(Bruggemannら、1991,Human antibody production in
transgenic mice:expression from 100kb of the human IgH locus,Eur.J.Immmunol.21:1323-1326)、マウス軽鎖を有するヒトIgM鎖においてそれらを発現するマウスは、誤対合によるレパートリーの制限を呈示し得る(Mackworth-Youngら、2003,The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene,Clin.Exp.Immunol.134:420-425)。
generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain
variable region,Clin.Exp.Immunol.123:1-5参照)に部分的に起因して、多様性の制限を呈示する(したがって、有用性の制限も呈示する)。同様に、ヒトμ定常遺伝子を含有する導入遺伝子内に、ヒトDH遺伝子およびヒトJH遺伝子と共に2つのVH遺伝子(3-23および6-1)を保有し(Bruggemannら、1991,Human antibody production in
transgenic mice:expression from 100kb of the human IgH locus,Eur.J.Immmunol.21:1323-1326)、マウス軽鎖を有するヒトIgM鎖においてそれらを発現するマウスは、誤対合によるレパートリーの制限を呈示し得る(Mackworth-Youngら、2003,The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene,Clin.Exp.Immunol.134:420-425)。
また、ゲノム内にランダムに挿入されたヒト導入遺伝子からVHが限定された完全ヒト重鎖を発現する他のトランスジェニックマウスであって、ランダムに挿入された完全ヒト導入遺伝子から発現するヒトλレパートリーが制限されたトランスジェニックマウスも報告されている(例えば、Taylorら、1992,A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins,Nucleic Acids Res.20(23):6287-6295;Wagnerら、1994,Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice,Nucleic Acids Res.22(8):1389-1393参照)。しかし、マウスゲノムにランダムに組み込まれた導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現させ、内因性遺伝子座の損傷を含むトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較した免疫応答の実質的な差違であって、かかるマウスから得ることができる抗体可変ドメインの多様性に影響を及ぼす差違を呈示することが公知である。
一部の実施形態において、ヒト抗体可変ドメインを、限定されたVH遺伝子レパートリーならびに1つ以上のD遺伝子および1つ以上のJ遺伝子から発現する、多様なB細胞集団を生成する有用な非ヒト動物は、十分に多様な再構成可変領域遺伝子レパートリーを生成することが可能であることが好ましい。様々な実施形態において、多様性は、接合部の多様性、体細胞超変異、およびVH遺伝子配列内の多型的多様性(VH遺伝子が多型形態で存在する実施形態の場合)を包含する。組み合わせの(combinatorial)多様性は、VH遺伝子が複数の同種のヒト軽鎖可変ドメイン(様々な実施形態において、接合部の多様性および/または体細胞超変異を含む)のうちの1つと対合するときに生じる。
様々な実施形態において、限定されたヒトVH遺伝子レパートリーおよび完全または実質的に完全なヒトVL遺伝子レパートリーを含む非ヒト動物は、接合部の多様性(例えば、VDJ、VJ接合、P付加、N付加)、組み合わせの多様性(例えば、VHが限定された同種のヒト重鎖、ヒト軽鎖)、および体細胞超変異など、多様性の様々な供給源を反映するB細胞集団を生成する。VHレパートリーの、1つのヒトVH遺伝子への限定を含む実施形態において、この1つのヒトVH遺伝子は、2つ以上の変異体において存在し得る。様々な実施形態において、VH遺伝子の2つ以上の多型形態が存在することにより、B細胞集団の可変ドメインの多様性が富化される。
遺伝子セグメント(例えば、V遺伝子)の生殖細胞系配列におけるバリエーションは、ヒトにおける抗体応答の多様性に寄与する。V遺伝子配列の差違に起因する多様性に対する相対的寄与は、V遺伝子間で変化する。多型の程度は、遺伝子ファミリーにわたって変化し、ヒト集団における近縁個体と非近縁個体とのVHハプロタイプの差違において観察されるさらなる多様性を生成することが可能な複数のハプロタイプ(共遺伝多型(coinherited polymorphism)を有する配列のストレッチ)に反映される(例えば、Souroujonら、1989,Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the VHIII Gene Family,J.Immunol.143(2):706-711参照)。特に、多型ヒトVH遺伝子ファミリーに由来するデータに基づき、一部の研究者は、生殖細胞系におけるハプロタイプの多様性が、ヒト集団におけるVH遺伝子の異質性に対する主要な寄与因子であり、これが、ヒト集団にわたる異なる生殖細胞系VH遺伝子の大きな多様性に反映されることを示唆している(Sassoら、1990,Prevalence and Polymorphism of Human VH3 Genes,J.Immunol.145(8):2751-2757参照)。
ヒト集団は、広範な多型に起因して、VH遺伝子レパートリーに対して、ハプロタイプの大きな多様性を提示するが、ヒト集団内で観察される高頻度の(すなわち、保存的な)対立遺伝子には、特定の多型が反映される(Sassoら、1990)。VHの多型は、2つの主要形態において記載され得る。第一の形態は、同じ遺伝子セグメントの対立遺伝子の間のヌクレオチド配列間における差違に関連する対立遺伝子バリエーションから生じるバリエーションである。第二の形態は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座において生じた多数の複製、挿入、および/または欠失から生じる。これは、複製により同一の遺伝子から派生するVH遺伝子が、それらの各々の対立遺伝子と、1つ以上のヌクレオチド置換により異なる固有の状況を結果としてもたらしている。これはまた、重鎖遺伝子座におけるVH遺伝子のコピー数にも直接影響する。
ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント(VH遺伝子)の多型対立遺伝子は、大部分が遺伝子セグメントの挿入/欠失およびコーディング領域内の単一のヌクレオチド差違の結果であり、これらのいずれもが、免疫グロブリン分子に対して機能的結果を及ぼす潜在性を有する。表1は、ヒトVH遺伝子ファミリーにより列挙される機能的VH遺伝子およびヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座における各VH遺伝子について同定された対立遺伝子の数を示す。多型VH遺伝子は、例えば、関節リウマチなど、特定の疾患に対する感受性に関与していることを示唆する知見も存在するが、他の場合には、VHと疾患との連関がそれほど明瞭ではない。この多義性は、異なるヒト集団における様々な対立遺伝子のコピー数および存在に帰せられている。実際、幾つかのヒトVH遺伝子(例えば、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、およびVH3-23)は、コピー数の変動を示している。様々な実施形態において、限定されたVHレパートリーを有する本明細書に記載のヒト化マウスは、個別のVHファミリーメンバーの複数の多型変異体を含む(例えば、内因性マウス遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての機能的マウスVHセグメントを置換する、VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、またはVH3-23の2つ以上の多型変異体)。特定の実施形態において、本明細書に記載のマウスの2つ以上の多型変異体は、表1の対応するVHファミリーメンバーについて示される数以下の数およびこの数を含めた数(例えば、VH1-69には13の変異体があり、VH1-2には5つの変異体があるなど)である。
当該技術分野においては、特定のヒトVH遺伝子の一般に観察される変異体が公知である。例えば、VH遺伝子座において最も複雑な多型のうちの1つは、VH1-69遺伝子に属する。ヒトVH1-69遺伝子には、13の対立遺伝子が報告されており(Sassoら、1993,A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set of alleles,Journal of Clinical Investigation 91:2358-2367;Sassoら、1996,Expression of
the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional to its germline gene copy number,Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080)、ヒトVH1-69遺伝子は、VH1-69遺伝子の複製を保有する少なくとも3つのハプロタイプであって、所与の遺伝子座においてこのVH遺伝子の複数コピーを結果としてもたらすハプロタイプで存在する。これらの多型対立遺伝子は、相補性決定領域(CDR)に差違を包含し、これは、抗原の特異性に劇的に影響し得る。表2は、ヒトVH1-69およびヒトVH1-2遺伝子について報告される対立遺伝子ならびに成熟重鎖可変領域のDNA配列およびタンパク質配列の配列番号を示す。
the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional to its germline gene copy number,Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080)、ヒトVH1-69遺伝子は、VH1-69遺伝子の複製を保有する少なくとも3つのハプロタイプであって、所与の遺伝子座においてこのVH遺伝子の複数コピーを結果としてもたらすハプロタイプで存在する。これらの多型対立遺伝子は、相補性決定領域(CDR)に差違を包含し、これは、抗原の特異性に劇的に影響し得る。表2は、ヒトVH1-69およびヒトVH1-2遺伝子について報告される対立遺伝子ならびに成熟重鎖可変領域のDNA配列およびタンパク質配列の配列番号を示す。
VH1-69遺伝子の代表的なゲノムDNA配列および全長タンパク質配列を、それぞれ、配列番号4および配列番号5に示す。図5および図6はそれぞれ、VH1-69について報告される13の対立遺伝子のDNAアライメントおよびタンパク質アライメントを示す。VH1-2遺伝子の代表的なDNA配列およびタンパク質配列を、それぞれ、配列番号63および配列番号64に示す。図8および図9はそれぞれ、VH1-2について報告される5つの対立遺伝子のDNAアライメントおよびタンパク質アライメントを示す。図7および図10はそれぞれ、ヒトVH1-69について報告される13の対立遺伝子およびヒトVH1-2について報告される5つの対立遺伝子に対応する、アラインメントされたタンパク質配列についての同一性/類似性のパーセントマトリクスを示す。様々な実施形態において、本発明の改変遺伝子座は、表1から選択される2コピー以上の数で存在するVH遺伝子を含み、コピー数は、表1に示される対立遺伝子の数以下のコピー数および表1に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包含する。1つの実施形態において、本発明の改変遺伝子座は、表2から選択される2コピー以上の数で存在するVH1-69またはVH1-2遺伝子を含み、コピー数は、表1に示される対立遺伝子の数以下のコピー数および表1に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包含する。
抗原依存性重鎖可変遺伝子の使用
抗原依存性重鎖可変遺伝子の使用
VH遺伝子の抗原依存性の優先的使用を、臨床的に有意義な抗原を標的とするヒト治療剤を開発するのに利用することができる。特定のVH遺伝子を用いて抗体可変ドメインレパートリーを生成することができれば、ヒト治療剤において用いるための高親和性の抗体可変ドメインの探索に大きな利点をもたらすことができる。ナイーブマウスおよび抗体可変ドメインにおけるヒトVH遺伝子の使用についての研究は、大半の重鎖可変ドメインが、特定の単一のVH遺伝子にも、主として用いられるVH遺伝子にも由来しないことを明らかにする。他方、特定の抗原に対する抗体応答についての研究は、場合によって、特定の抗体応答は、免疫後のB細胞レパートリーにおける特定のVH遺伝子の偏った使用を提示することを明らかにする。
ヒトVHレパートリーは、極めて多様であるが、VH遺伝子のランダムな選択を仮定するある推定値によれば、所与の任意のVH遺伝子使用の予測される頻度は、約2%である(Brezinschekら、1995,Analysis of the Heavy
Chain Repertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain
Reaction,J.Immunol.155:190-202)。しかし、ヒトの末梢B細胞におけるVHの使用は、偏ったものである。一研究では、機能的V遺伝子の存在度は、VH3>VH4>VH1>VH2>VH5>VH6というパターンに従った(Davidkovaら、1997,Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)。初期の一研究では、VH3ファミリーの使用頻度が約0.65であるのに対し、VH1ファミリーの使用頻度は約0.15であることが推定され、これらの観察および他の観察は、ヒトVHレパートリーの生殖細胞系の複雑性は、正常の生殖細胞系VHレパートリーを有するヒトの末梢B細胞区画では正確には反映されないという、マウスにおいて観察される状況(すなわち、VH遺伝子発現は非確率論的であるという状況)と類似する状況を示唆する(Zouali and These,1991,Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization,J.Immunol.146(8):2855-2864)。一報告によれば、ヒトにおけるVH遺伝子使用は、最大から最小の順にVH3>VH4>VH1>VH5>VH2>VH6であり、末梢B細胞における再構成は、VH3ファミリーの使用は、生殖細胞系VH3遺伝子の相対数に基づき予測される使用より高度であることを明らかにする(Brezinschekら、1995)。別の報告によれば、ヒトにおけるVH使用は、ヨウシュヤマゴボウのマイトジェンにより活性化させた末梢の小型免疫応答性B細胞の解析(Davidkovaら、1997,Selective Usage of VH Genes in Adult Human B
Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)に基づくパターンVH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6に従う。一報告は、最も高頻度で用いられるVH3ファミリーメンバーの中には、3-23、3-30、および3-54があることを主張している(Brezinschekら、1995)。VH4ファミリーでは、メンバー4-59および4-4b(同上)のほか、4-39および4-34が比較的高頻度であることが見出された(Brezinscheckら、1997,Analysis of the Human VH Gene Repertoire,J.Clin.Invest.99(10):2488-2501)。他の報告は、活性化した重鎖レパートリーが、VH5の高度な発現およびVH3の低度な発現を利するように偏っていることを仮定している(Van Dijk-Hard and Lundkvist,2002,Long-term kinetics of
adult human antibody repertoires,Immunology 107:136-144)。他の研究は、成人ヒトレパートリーにおいて最も一般的に用いられるVH遺伝子が、VH4-59に続いて、VH3-23およびVH3-48であることを主張している(Arnaoutら、2001,High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain
Repertoires in Humans,PLoS ONE 6(8):108)。使用についての研究は、比較的小さな試料数に基づき、したがって、大きな分散を呈示するが、まとめると、研究は、V遺伝子の発現が、純粋に確率論的ではないことを示唆する。実際、特定の抗原による研究は、ある場合には、発現の状況は、特定の使用には全く不利であり、他の使用には有利であることを確立している。
Chain Repertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain
Reaction,J.Immunol.155:190-202)。しかし、ヒトの末梢B細胞におけるVHの使用は、偏ったものである。一研究では、機能的V遺伝子の存在度は、VH3>VH4>VH1>VH2>VH5>VH6というパターンに従った(Davidkovaら、1997,Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)。初期の一研究では、VH3ファミリーの使用頻度が約0.65であるのに対し、VH1ファミリーの使用頻度は約0.15であることが推定され、これらの観察および他の観察は、ヒトVHレパートリーの生殖細胞系の複雑性は、正常の生殖細胞系VHレパートリーを有するヒトの末梢B細胞区画では正確には反映されないという、マウスにおいて観察される状況(すなわち、VH遺伝子発現は非確率論的であるという状況)と類似する状況を示唆する(Zouali and These,1991,Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization,J.Immunol.146(8):2855-2864)。一報告によれば、ヒトにおけるVH遺伝子使用は、最大から最小の順にVH3>VH4>VH1>VH5>VH2>VH6であり、末梢B細胞における再構成は、VH3ファミリーの使用は、生殖細胞系VH3遺伝子の相対数に基づき予測される使用より高度であることを明らかにする(Brezinschekら、1995)。別の報告によれば、ヒトにおけるVH使用は、ヨウシュヤマゴボウのマイトジェンにより活性化させた末梢の小型免疫応答性B細胞の解析(Davidkovaら、1997,Selective Usage of VH Genes in Adult Human B
Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)に基づくパターンVH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6に従う。一報告は、最も高頻度で用いられるVH3ファミリーメンバーの中には、3-23、3-30、および3-54があることを主張している(Brezinschekら、1995)。VH4ファミリーでは、メンバー4-59および4-4b(同上)のほか、4-39および4-34が比較的高頻度であることが見出された(Brezinscheckら、1997,Analysis of the Human VH Gene Repertoire,J.Clin.Invest.99(10):2488-2501)。他の報告は、活性化した重鎖レパートリーが、VH5の高度な発現およびVH3の低度な発現を利するように偏っていることを仮定している(Van Dijk-Hard and Lundkvist,2002,Long-term kinetics of
adult human antibody repertoires,Immunology 107:136-144)。他の研究は、成人ヒトレパートリーにおいて最も一般的に用いられるVH遺伝子が、VH4-59に続いて、VH3-23およびVH3-48であることを主張している(Arnaoutら、2001,High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain
Repertoires in Humans,PLoS ONE 6(8):108)。使用についての研究は、比較的小さな試料数に基づき、したがって、大きな分散を呈示するが、まとめると、研究は、V遺伝子の発現が、純粋に確率論的ではないことを示唆する。実際、特定の抗原による研究は、ある場合には、発現の状況は、特定の使用には全く不利であり、他の使用には有利であることを確立している。
徐々に、特定の抗原に応答して生成したヒト重鎖可変ドメインについて観察されるレパートリーは、高度に限定されることが明らかとなった。一部の抗原は、有効な中和抗体は1つのVH遺伝子のみに本質的に由来するという意味で、ほとんどもっぱらある特定のVH遺伝子のみを有する中和抗体と会合する。臨床的に重要な多数のヒト病原体についても同じことが当てはまる。
VH1-69に由来する重鎖は、治療的に有意義である多様な抗原特異的抗体レパートリーにおいて観察されている。例えば、VH1-69は、アトピー性疾患を有する幼齢小児における末梢血リンパ球のIgEレパートリーの重鎖転写物において高頻度で観察された(Bandoら、2004,Characterization of VHε gene expressed in PBL from children with atopic diseases:detection of homologous VH1-69 derived transcripts from three unrelated patients,Immunology Letters 94:99-106)。B細胞リンパ腫ではまた、高度の体細胞超変異を有するVH1-69に由来する重鎖が生じる(Perezら、2009,Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of VH1-69 and VH4-59 segments,British Journal of Dermatology 162:611-618)一方、血液障害を有する患者における自己抗体の中では、本質的に生殖細胞系配列を有する(すなわち、体細胞超変異がわずかである~体細胞超変異がみられない)一部のVH1-69に由来する重鎖が観察されている(Posら、2008,VH1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients
with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura,Journal of Thrombosis and Haemostasis 7:421-428)。
with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura,Journal of Thrombosis and Haemostasis 7:421-428)。
さらに、HIV、インフルエンザウイルス、およびC型肝炎ウイルス(HCV)などのウイルス抗原に対する中和抗体であって、生殖細胞系のVH1-69に由来する配列および/または体細胞変異させたVH1-69に由来する配列を使用する中和抗体も見出されている(Miklosら、2000,Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of V1-69 with distinctive CDR3 features,Blood 95(12):3878-3884;Kunertら、2004,Characterization of molecular features,antigen-binding,and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10,an anti-HIV type
I neutralizing monoclonal antibody,Aids
Research and Human Retroviruses 20(7):755-762;Chanら、2001,VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen,Blood 97(4):1023-1026;Carbonariら、2005,Hepatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory B cells in type II cryoglobulinemia:A model of infection-driven lymphomagenesis,Journal of Immunology 174:6532-6539;Wang and Palese,2009,Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?,Nature Structural&Molecular Biology 16(3):233-234;Suiら、2009,Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses,Nature Structural&Molecular Biology 16(3):265-273;Marascaら、2001,Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1-69 and VH4-34 Segments in Hepatitis C
Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma,Am.J.Pathol.159(1):253-261)。
I neutralizing monoclonal antibody,Aids
Research and Human Retroviruses 20(7):755-762;Chanら、2001,VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen,Blood 97(4):1023-1026;Carbonariら、2005,Hepatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory B cells in type II cryoglobulinemia:A model of infection-driven lymphomagenesis,Journal of Immunology 174:6532-6539;Wang and Palese,2009,Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?,Nature Structural&Molecular Biology 16(3):233-234;Suiら、2009,Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses,Nature Structural&Molecular Biology 16(3):265-273;Marascaら、2001,Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1-69 and VH4-34 Segments in Hepatitis C
Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma,Am.J.Pathol.159(1):253-261)。
VH使用の偏向はまた、ヒトにおけるb型Haemophilus influenzae(Hib PS)に対する体液性免疫応答においても観察される。研究は、VHIIIファミリー(VHIIIbサブファミリー、特に、VH9.1)が、多様なD遺伝子およびJ遺伝子と共に、Hib PSに対するヒト体液性応答をもっぱら特徴づけることを示唆する(Addersonら、1991,Restricted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide,J.Immunol.147(5):1667-1674;Addersonら、1993,Restricted Immunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations
in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide,J.Clin.Invest.91:2734-2743)。ヒトJH遺伝子もまた、偏向性の使用を提示し、JH4およびJH6は、ヒトの末梢B細胞中の約38~41%で観察されている(Brezinschekら、1995)。
in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide,J.Clin.Invest.91:2734-2743)。ヒトJH遺伝子もまた、偏向性の使用を提示し、JH4およびJH6は、ヒトの末梢B細胞中の約38~41%で観察されている(Brezinschekら、1995)。
HIV-1に感染したヒトにおけるVH使用は、VH3使用に対して不利に偏向し、VH1およびVH4遺伝子ファミリーに有利である(Wisnewskiら、1996,Human Antibody Variable Region Gene Usage
in HIV-1 Infection,J.Acquired Immune Deficiency Syndromes&Human Retroviology 11(1):31-38)。しかし、罹患した患者に由来する骨髄のcDNA解析は、機能的B細胞レパートリーでは発現しない有意なVH3使用を明らかにし、そこでは、VH3使用を反映するFabが、in vitroにおける有効なHIV-1の中和を呈示した(同上)。HIV-1感染に対する体液性免疫応答はおそらくVHにおける限定に起因して減衰するので、本明細書に記載の改変非ヒト動物(HIV-1により感染可能でない)は、本明細書に記載の遺伝子改変動物において存在する特定のVH遺伝子に由来するが、罹患したヒトの限定されたレパートリーにおいて観察されるVH遺伝子とは異なるVH遺伝子に由来する中和抗体ドメインを生成するのに有用となり得ることを仮定し得る。
in HIV-1 Infection,J.Acquired Immune Deficiency Syndromes&Human Retroviology 11(1):31-38)。しかし、罹患した患者に由来する骨髄のcDNA解析は、機能的B細胞レパートリーでは発現しない有意なVH3使用を明らかにし、そこでは、VH3使用を反映するFabが、in vitroにおける有効なHIV-1の中和を呈示した(同上)。HIV-1感染に対する体液性免疫応答はおそらくVHにおける限定に起因して減衰するので、本明細書に記載の改変非ヒト動物(HIV-1により感染可能でない)は、本明細書に記載の遺伝子改変動物において存在する特定のVH遺伝子に由来するが、罹患したヒトの限定されたレパートリーにおいて観察されるVH遺伝子とは異なるVH遺伝子に由来する中和抗体ドメインを生成するのに有用となり得ることを仮定し得る。
したがって、例えば、HIV-1で免疫された、VHが限定されたマウス(例えば、VH3ファミリーメンバーおよびその(1つ以上の)多型に限定されたマウス)において、高親和性ヒト抗体可変ドメインを生成することができれば、かかる免疫したマウスの限定された(例えば、VH3ファミリーメンバーまたはその(1つ以上の)変異体に限定された)レパートリーを徹底的に発掘することにより、HIV-1を中和する有効なヒト治療剤をデザインするための豊富な資源を提供し得る。
ヒト抗体応答の、特定の病原体への限定は、抗体の可変領域であって、病原体に対する高親和性の中和抗体をデザインするための足がかりとして機能し得る可変領域を、罹患したヒトから得る可能性を低減し得る。例えば、HIV-1感染に対するヒト免疫応答は、HIV-1感染を通じて、かつ、AIDSへの進行においてクローン的に限定される(Mullerら、1993,B-cell abnormalities in AIDS:stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection,Scand.J.Immunol.38:327-334;Wisnewskiら、1996)。さらに、VH遺伝子は一般に、個体においてすべての多型形態では存在せず、特定の集団内の特定の個体が1つの変異体を保有するのに対し、他の集団内の個体は異なる変異体を保有する。したがって、様々な実施形態において、単一のVH遺伝子およびその変異体に限定された生物系が利用可能であれば、限定されたVH遺伝子に基づき抗体の可変領域(例えば、ヒト重鎖および軽鎖の同種のドメイン)を生成するための、これまで利用されなかった多様性の供給源がもたらされる。
限定されたVH遺伝子セグメントを使用してヒト重鎖可変領域を発現する遺伝子改変マウスは、接合部が多様であり、組み合わせが多様であり、体細胞変異させた、高親和性ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の比較的大きなレパートリーを、他の点では限定されたレパートリーから生成するのに有用である。この場合、限定されたレパートリーは、予め選択されたV遺伝子以外のいかなるV遺伝子に由来する再構成重鎖遺伝子も形成できないマウスを結果としてもたらす、生殖細胞系遺伝子の所定の制限を指す。予め選択されたV遺伝子は使用するが、予め選択されたD遺伝子および/またはJ遺伝子は使用しない実施形態において、レパートリーは、V遺伝子の正体に関しては限定されるが、D遺伝子および/またはJ遺伝子の正体に関しては限定されない。予め選択されたV遺伝子(ならびに任意の予め選択されたD遺伝子および/またはJ遺伝子)の正体は、いかなる特定のV遺伝子にも制限されない。
マウスが、単一のVH遺伝子(単一のセグメントまたは変異体のセットとして存在する)を、多様なヒトDおよびJ遺伝子セグメント(例えば、DHセグメントおよびJHセグメント)と共に再構成するように、マウスをデザインすることにより、in vivoにおける、接合部多様性/組み合わせ多様性/体細胞超変異の並べ替え機構であって、結果として得られる再構成重鎖可変領域配列(場合によって、例えば、V/D/JまたはV/J)における変異を繰り返すのに用いられ得る並べ替え機構がもたらされる。かかるマウスでは、単一の予め選択されたVH遺伝子(またはその変異体)に基づくクローン選択工程を行って、対象となる抗原に結合する適切な可変領域を選択する。マウスのクローン選択成分は、単一の予め選択されたVH遺伝子セグメントに基づく選択に使われる(dedicated)ため、バックグラウンドノイズは大部分が根絶される。VH遺伝子セグメントを慎重に選択することにより、クローン的に選択される比較的多数の抗原特異的抗体を、Vセグメントの多様性が大きなマウスによる場合より短い期間でスクリーニングすることができる。
様々な実施形態において、マウスを予め選択して単一のVセグメントに限定することにより、V/D/J接合部を、D領域およびJ領域で組み換えるためのVセグメントが単一ではなくて最高40以上あるマウスにおいて観察される速度より速い速度で並べ替えるための系がもたらされる。他のVセグメントを除去することにより、遺伝子座は、予め選択されたVセグメントに対して、他のVセグメントを除去しない場合に観察されるV/D/Jの組み合わせより多くのV/D/Jの組み合わせを形成するように解放される。予め選択されたVの、複数のDセグメントのうちの1つおよび複数のJセグメントのうちの1つによる組換えから生じる転写物数が増大すると、これらの転写物は、プレB細胞の形態にあるクローン選択系に供給され、このため、クローン選択系は、予め選択されたV領域を発現するB細胞の循環に使われる。このようにして、予め選択されたVセグメントに由来するV領域であって、所与の時間量において他の形で可能となるより固有性の高い領域を、生物体を介してスクリーニングすることができる。
様々な態様では、予め選択されたV領域についての、接合部におけるV/D組換えの多様性を増強するマウスが記載される。なぜなら、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座のすべてのまたは実質的にすべての組換えは、かかるマウスにおいて配置される、予め選択されたVセグメントおよびDセグメントおよびJセグメントの組換えであるためであるしたがって、マウスは、ベースのVH遺伝子レパートリーまたは限定されたVH遺伝子レパートリーを用いて、CDR3セグメントの多様性を生成するための方法をもたらす。
マウスADAM6のゲノムの場所および機能
マウスADAM6のゲノムの場所および機能
いずれかの機能的ADAM6タンパク質を発現する能力が無い雄マウスは、驚くべきことに、交配して子孫を産生する該マウスの能力の欠陥を示す。これらのマウスには、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントをヒト可変領域遺伝子セグメントで置換することによって機能的ADAM6タンパク質を発現する能力が無い。ADAM6遺伝子座が、DH遺伝子セグメントの上流にあるVH遺伝子セグメント遺伝子座の3’末端の近位の、上記内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座の領域内にあるため、このADAM6機能の喪失が生ずる結果となる。すべてのまたは実質的にすべての内因性マウス重鎖可変配列の、限定されたヒト重鎖可変配列による置換に関してホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞれが該限定されたヒト重鎖配列に関してホモ接合性であり、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、頻度が低く、サイズが小さい。その代り、上記限定されたヒト重鎖配列に関してヘテロ接合性の雄を用いて、上記置換に関してホモ接合性の雌と交配させて、上記限定されたヒト重鎖可変配列に関してヘテロ接合性の後代を産生し、その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させる。上記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は、ホモ接合型雄マウスにおいて機能的ADAM6タンパク質が存在しないことによると本発明者らは決定した。
様々な態様において、損傷した(すなわち、非機能的またはわずかに機能的な)ADAM6遺伝子を含む雄マウスは、妊性の低減または除去を示す。マウス(および他の齧歯動物)ではADAM6遺伝子が免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあるため、本発明者らは、ヒト化された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを繁殖させるために、または該マウスの系統を作り、維持するために、様々な改変交配または繁殖スキームを利用することを決定した。ヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性の雄マウスの低い妊性または不妊性は、マウス系統のかかる改変の維持を困難にする。様々な実施形態において、上記系統の維持は、上記ヒト化重鎖遺伝子座に関してホモ接合性の雄マウスによって示される不妊問題の回避を含む。
1つの態様では、本明細書に記載のマウスの系統を維持するための方法を提供する。マウスの上記系統は、異所性ADAM6配列を含む必要がなく、様々な実施形態において、マウスの上記系統は、ADAM6のノックアウト(例えば、機能的ノックアウト)に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
上記マウス系統は、雄マウスにおいて妊性の低減または喪失を生じさせる結果となる内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む。1つの実施形態において、上記改変は、ADAM6遺伝子の調節領域および/またはコーディング領域の欠失を含む。特定の実施形態において、上記改変は、その改変を含む雄マウスの妊性を低減させるまたは除去する内因性ADAM6遺伝子(調節領域および/またはコーディング領域)の改変を含む;特定の実施形態において、上記改変は、その改変に関してホモ接合性である雄マウスの妊性を低減させるまたは除去する。
1つの実施形態において、上記マウス系統は、ADAM6遺伝子のノックアウト(例えば、機能的ノックアウト)または欠失に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
1つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから細胞を単離すること、および宿主胚において上記ドナー細胞を用いること、および代理母において上記宿主胚およびドナー細胞を妊娠させること、および上記遺伝子改変を含む後代を上記代理母から得ることによって、上記マウス系統を維持する。1つの実施形態において、上記ドナー細胞は、ES細胞である。1つの実施形態において、上記ドナー細胞は、多能性細胞、例えば導入多能性細胞である。
1つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから、上記改変を含む核酸配列を単離すること、および上記核酸配列を宿主核に導入すること、および好適な動物において上記核酸配列および上記宿主核を含む細胞を妊娠させることによって、上記マウス系統を維持する。1つの実施形態では、上記核酸配列を宿主卵母細胞の胚に導入する。
1つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから核を単離すること、および上記核を宿主細胞に導入すること、および好適な動物において上記核および宿主細胞を妊娠させて、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。
1つの実施形態では、上記遺伝子改変を含む雄マウスからの精液を用いる、雌マウス(野生型、上記改変に関してホモ接合性、または上記改変に関してヘテロ接合性)のin vitro受精(IVF)を用いることによって、上記マウス系統を維持する。1つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である。1つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してホモ接合性である。
1つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄マウスを雌マウスと交配させて、上記遺伝子改変を含む後代を得ること、上記遺伝子改変を含む雄および雌後代を同定すること、および上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄を、野生型である、上記遺伝子改変に関してホモ接合性であるまたはヘテロ接合性である雌との交配に用いて、上記遺伝子改変を含む後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。1つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雄と、野生型雌、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性の雌とを交配させる工程を繰り返して、上記マウス系統での上記遺伝子改変を維持する。
1つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の、1つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖配列による置換を含むマウス系統を維持するための方法であって、上記マウス系統を交配させて、ヘテロ接合型雄マウスを産生する工程を含み、上記ヘテロ接合性雄マウスを交配させて、上記系統において上記遺伝子改変を維持する方法を提供する。特定の実施形態において、上記系統は、ホモ接合性雄と野生型雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性の雌とのいずれの交配によっても維持されない。
上記ADAM6タンパク質は、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ(A Disintegrin And Metalloprotease)(ADAM)タンパク質ファミリーのメンバーであり、これは、細胞接着をはじめとする多様な機能を有するタンパク質のラージファミリーである。ADAMファミリーの一部のメンバーは、精子形成および受精に関与する。例えば、ADAM2は、精子-卵子相互作用に関与するタンパク質ファーティリンのサブユニットをコードする。ADAM3、すなわちシリテスチンは、透明帯への精子の結合に必要であるようである。ADAM2またはADAM3いずれかの不在は不妊性を生じさせる結果となる。ADAM2、ADAM3およびADAM6は、マウス精子細胞の表面で複合体を形成すると仮定されている。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座においてヒトVH遺伝子セグメントVH1-2とVH6-1の間で通常見出されるヒトカウンターパート遺伝子(ヒトADAM6)は、偽遺伝子であるようである。マウスには2つのADAM6遺伝子-ADAM6aおよびADAM6b-があり、これらは、マウスVH遺伝子セグメントとDH遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域において見出され、上記マウスにおいて、ADAM6a遺伝子およびADAM6b遺伝子は、周囲の免疫グロブリン遺伝子セグメントのものとは反対の転写配向に配向する。マウスの場合、正常な受精には機能的ADAM6遺伝子座が明らかに要求される。そこで、機能的ADAM6遺伝子座または配列は、内因性ADAM6遺伝子座が欠けているまたは非機能的内因性ADAM6遺伝子座を有する雄マウスにおいて示される大幅に低減された受精を補うまたはレスキューすることができる、ADAM6遺伝子座または配列を指す。
ADAM6aおよびADAM6bをコードする、マウスにおける上記遺伝子間配列の位置が、内因性マウス重鎖を改変するとき該遺伝子間配列に改変を受けやすくさせる。VH遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、またはDH遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、結果として得られるマウスは重度の妊性欠損を示す確率が高い。この欠損を補償するために、内因性マウスADAM6遺伝子座の改変に起因するADAM6活性の喪失を補うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むようにマウスを改変する。様々な実施形態において、補足性ヌクレオチド配列は、妊性欠損をレスキューするマウスADAM6a、マウスADAM6b、またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードするものである。あるいは、上記マウスADAM6遺伝子座に隣接する内因性免疫グロブリン重鎖配列が機能的内因性重鎖可変領域をコードするように再構成できないようにしながら、内因性ADAM6遺伝子座を保持する適切な方法を用いることができる。例示的な代替方法は、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を配置するマウス染色体の大部分が、内因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結された機能的重鎖可変領域をコードするように再構成できないように、それらを操作することを含む。様々な実施形態において、上記方法は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含有するマウス染色体断片の逆位および/または転座を含む。
妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を任意の好適な位置に配置することができる。上記配列を上記遺伝子間領域に配置することができ、またはゲノム内の任意の好適な位置に(すなわち、異所的に)配置することができる。1つの実施形態では、上記ヌクレオチド配列を、マウスゲノムにランダムに組み込む導入遺伝子に導入することができる。1つの実施形態では、上記配列をエピソームで、すなわちマウス染色体上ではなく別々の核酸上で、維持することができる。好適な位置としては、転写許容性または活性である位置、例えば、ROSA26遺伝子座(Zambrowiczら、1997、PNAS USA 94:3789-3794)、BT-5遺伝子座(Michaelら、1999、Mech.Dev.85:35-47)またはOct4遺伝子座(Wallaceら、2000、Nucleic Acids Res.28:1455-1464)が挙げられる。転写活性遺伝子座へのヌクレオチド配列のターゲティングは、例えば米国特許第7,473,557号明細書に記載されている。
あるいは、妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を誘導性プロモーターとカップリングさせて、適切な細胞および/または組織、例えば生殖組織、での最適な発現を促進することができる。例示的誘導性プロモーターとしては、物理的手段によって活性化されるプロモーター(例えば、熱ショックプロモーター)および/または化学的手段によって活性化されるプロモーター(例えば、IPTGもしくはテトラサイクリン)が挙げられる。
さらに、上記ヌクレオチド配列の発現を他の遺伝子に関連づけて、特定の発生段階または特定の組織内での発現を実現することができる。かかる発現は、上記ヌクレオチド配列を、特定の発生段階で発現する遺伝子のプロモーターと作動可能に連結させることによって実現することができる。例えば、宿主種のゲノムへと工学的に作製された1つの種からの免疫グロブリン配列を、その宿主種からのCD19遺伝子(B細胞特異的遺伝子)のプロモーター配列と作動可能に連結させる。免疫グロブリンが発現する正確な発生段階でのB細胞特異的発現が実現される。
挿入されたヌクレオチド配列の頑強な発現を実現するためのさらにもう1つの方法は、構成的プロモーターの利用である。例示的構成的プロモーターとしては、SV40、CMV、UBC、EF1A、PGKおよびCAGGが挙げられる。同様に、所望のヌクレオチド配列を選択された構成的プロモーターと作動可能に連結させ、それにより、該ヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質(単数または複数)の高い発現レベルが得られる。
用語「異所性」は、自然界で通常は遭遇しない位置への転位または配置(例えば、核酸配列の、該核酸配列が野生型マウスにおいて見出されるのと同じ位置でない位置への配置)を含むことを意図したものである。様々な実施形態において、この用語は、その対象がその正常なまたは正しい位置外にあるという意味で用いられる。例えば、「...をコードする異所性ヌクレオチド配列」という句は、マウスでは通常遭遇しない位置に出現するヌクレオチド配列を指す。例えば、マウスADAM6タンパク質(または雄マウスに対して同じまたは同様の妊性の恩恵をもたらすそのオルソログもしくはホモログもしくは断片)をコードする異所性ヌクレオチド配列の場合、該配列は、野生型マウスにおいて通常見出される位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に配置されることがある。かかる場合、野生型マウスにおける位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に上記配列を配置することにより、マウス配列の新規配列接合部を生み出すこととなる。マウスADAM6の機能的ホモログまたはオルソログは、ADAM6-/-マウスにおいて観察される妊性喪失(例えば、交配により子孫を産生する雄マウスの能力の喪失)のレスキューをもたらす配列である。機能的ホモログまたはオルソログは、ADAM6aのアミノ酸配列に対しておよび/またはADAM6bのアミノ酸配列に対して少なくとも約89%以上の同一性、例えば99%以下の同一性を有するタンパク質、ならびにADAM6aおよび/またはADAM6bの欠失またはノックアウトを含む遺伝子型を有するマウスの首尾よく交配する能力を補うまたはレスキューすることができるタンパク質を含む。
上記異所位置は、(例えば、マウスADAM6配列を含有する導入遺伝子のランダム挿入の場合のように)どこでもよく、または例えば、野生型マウスにおける(例えば、改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座内だがその天然の位置の上流または下流のいずれか、例えば、改変免疫グロブリン遺伝子座内だが、異なる遺伝子セグメント間、またはマウスV-D遺伝子間配列内の異なる位置における)その場所に近い(しかし、正確に同じではない)位置であってもよい。異所性配置の一例は、上記周囲の内因性重鎖遺伝子セグメントが、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードするように再構成できるようにしながら、野生型マウスにおいて上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内に通常見出される位置を維持することである。この例では、例えば、上記可変領域遺伝子座に隣接する位置に配置された操作された部位特異的組換え部位を使用して、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含有する染色体断片の逆位によって、これを達成することができる。したがって、組換えの際に、上記内因性重鎖可変領域遺伝子座を上記内因性重鎖定常領域遺伝子から遠距離に配置することにより、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードする再構成を防止する。本開示を読むことにより、および/または当該技術分野において公知の方法と組み合わせて、当業者であれば、機能的ADAM6遺伝子座を維持しながら、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の機能的サイレンシングを達成する他の例示的な方法が明らかである。上記内因性重鎖遺伝子座のかかる配置により、上記内因性ADAM6遺伝子は維持され、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は機能的にサイレンシングされる。
異所性配置の別の例は、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座内への配置である。例えば、1つ以上の内因性VH遺伝子セグメントの、単一のヒトVH遺伝子セグメントによる置換であって、内因性ADAM6配列を除去する置換を含むマウスを、マウスADAM6配列が、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントとヒトDH遺伝子セグメントとの間にある遺伝子間配列内に配置されるように操作することができる。異所性配置の別の例は、上記マウスADAM6配列が、上記ヒトVH遺伝子セグメントに対して(単一のヒトVH遺伝子セグメントの転写方向に対して)5’の位置にある配置である。上記単一のヒトVH遺伝子セグメントに対する5’の位置は、上記ヒトVH遺伝子セグメントに対して、例えば数百塩基対~数kbにごく接近しているか、または例えば数kb~数百kbもしくはさらにメガ塩基以上離れている場合がある。結果として得られる改変は、ヒト遺伝子配列内にまたはそれに隣接してまたはさらにそれと同じ染色体上に(異所性)マウスADAM6配列を生じさせることとなり、このヒト遺伝子配列内へのマウスADAM6配列の(異所性)配置は、マウスADAM6配列の位置(すなわち、V-D遺伝子間領域内)に近い場合がある。マウスの生殖細胞系内のヒト遺伝子配列(例えば、免疫グロブリン遺伝子配列)内にまたは該ヒト遺伝子配列に隣接した(異所性)マウスADAM6配列の接合により作られる、結果として生ずる配列接合部は、野生型マウスのゲノム内の同じまたは同様の位置と比較して新しいものになる。
様々な実施形態において、ADAM6またはそのオルソログもしくはホモログが無い非ヒト動物を提供し、この欠如が該非ヒト動物を不妊性にするか、該非ヒト動物の妊性を実質的に低減させる。様々な実施形態において、上記ADAM6またはそのオルソログもしくはホモログ欠如は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因する。妊性の実質的低減は、例えば、妊性(例えば、交配頻度、同腹子あたりの子、1年あたりの同腹子、など)の約50%、60%、70%、80%、90%または95%またはそれより多くの低減である。様々な実施形態では、非ヒト動物の雄において機能的であるマウスADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を上記非ヒト動物に補充し、この補充されたADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片により、妊性低減の全部または実質的部分がレスキューされる。妊性の実質的部分のレスキューは、例えば、上記非ヒト動物が、非改変(すなわち、ADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログへの改変を有さない動物)重鎖遺伝子座と比較して少なくとも70%、80%または90%またはそれより多い妊性を示すような妊性の回復である。
様々な実施形態において、上記遺伝子改変動物(すなわち、例えば免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因して、機能的ADAM6またはそのオルソログもしくはホモログが無い動物)に付与する配列は、ADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログから選択される。例えば、マウスにおけるADAM6機能の喪失は、1つの実施形態では、マウスADAM6遺伝子の付加によってレスキューされる。1つの実施形態において、マウスにおけるADAM6機能の喪失は、マウス、例えば齧歯動物、に対して近縁の種、例えば、異なる系統または種のマウス、任意の種のラット、齧歯動物、のオルソログまたはホモログを付加することによってレスキューされ、この場合、上記マウスのオルソログまたはホモログの付加により、ADAM6機能の喪失またはADAM6遺伝子の喪失に起因する妊性の喪失がレスキューされる。他の種からのオルソログおよびホモログは、様々な実施形態において系統発生的に関連した種から選択され、および様々な実施形態において、約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上または97%以上である内因性ADAM6(またはオルソログ)との同一性パーセントを示し、およびADAM6に関連したまたは(非マウスの場合は)ADAM6オルソログに関連した妊性喪失をレスキューする。例えば、ADAM6機能が無い遺伝子改変雄ラット(例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域で置換された内因性免疫グロブリン重鎖可変領域を有するラット、またはラット免疫グロブリン重鎖領域のノックアウトを有するラット)の場合、そのラットの妊性の喪失は、ラットADAM6の付加によって、または一部の実施形態ではラットADAM6のオルソログ(例えば、別のラット系統もしくは種からの、または1つの実施形態ではマウスからの、ADAM6オルソログ)の付加によってレスキューされる。
このように、様々な実施形態において、ADAM6タンパク質(またはそのオルソログもしくはホモログ)をコードする核酸配列、または該核酸配列と作動可能に連結された調節領域の改変に起因して妊性を示さないまたは妊性の低減を示す遺伝子改変動物は、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列を含み、この場合、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列は、同じ種の異なる系統からのものであるか、系統発生的に類縁の種からのものである。様々な実施形態において、上記補足性核酸配列は、ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片である。様々な実施形態において、上記補足性ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、妊性の欠陥を有する遺伝子改変動物に近縁である非ヒト動物からのものである。例えば、上記遺伝子改変動物が特定の系統のマウスである場合、ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片を、別の系統のマウスから得ることができ、類縁種のマウスから得ることができる。1つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物が齧歯目(order Rodentia)のものである場合、上記ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の別の動物からのものである。1つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物は、ネズミ亜目(suborder Myomoropha)(例えば、トビネズミ(jerboas)、ジャンピングマウス(jumping mice)、カンガルーハムスター、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ、純種のマウスおよびラット(true mice and rat)、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ、キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス、トゲヤマネ、デバネズミ、タケネズミ、モグラネズミ)のものであり、上記ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の動物、またはネズミ亜目の動物から選択される。
1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、トビネズミ上科(superfamily Dipodoidea)からのものであり、上記ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ネズミ上科(superfamily Muroidea)からのものである。1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、ネズミ上科からのものであり、上記ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、トビネズミ上科からのものである。
1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は齧歯動物である。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科から選択され、上記ADAM6オルソログまたはホモログは、ネズミ上科内の異なる種からのものである。1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科(Calomyscidae)(例えば、カンガルーハムスター)、キヌゲネズミ科(Cricetidae)(例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ)、ネズミ科(Muridae)(純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ)、アシナガマウス科(Nesomyidae)(キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス)、トゲヤマネ科(Platacanthomyidae)(例えば、トゲヤマネ)およびメクラネズミ科(例えば、デバネズミ、タケネズミおよびモグラネズミ)から選択される科からのものであり;および上記ADAM6オルソログまたはホモログは、同じ科の異なる種から選択される。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、純種のマウスまたはラット(ネズミ科)から選択され、上記ADAM6オルソログまたはホモログは、アレチネズミ、トゲマウス、またはタテガミネズミから選択される種からのものである。1つの実施形態において、上記遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバーからのものであり、および上記ADAM6オルソログまたはホモログは、ネズミ科の異なる種からのものである。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、ネズミ科のマウスであり、および上記ADAM6オルソログまたはホモログは、ネズミ科のラット、アレチネズミ、トゲマウスまたはタテガミネズミからのものである。
様々な実施形態において、1つの科の中の齧歯動物の1つ以上の齧歯動物ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ADAM6オルソログまたはホモログが無い同じ科(例えば、キヌゲネズミ科(例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ);ネズミ科(例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ))の遺伝子改変齧歯動物に妊性を回復させる。
様々な実施形態において、ADAM6オルソログ、ホモログおよびその断片を、該オルソログ、ホモログまたは断片が、ADAM6活性が無い遺伝子改変雄非ヒト動物(例えば、ADAM6またはそのオルソログのノックアウトを含む齧歯動物、例えばマウスまたはラット)に妊性を回復させるかどうか確認することにより、機能性について評価する。様々な実施形態において、機能性は、内因性ADAM6またはそのオルソログもしくはホモログが無い遺伝子改変動物の精子の、遺伝子改変動物の同じ種の卵管を移動して卵子を受精させる能力と定義される。
様々な態様において、マウスADAM6(例えば、雄マウスにおいて機能的であるそのオルソログまたはホモログまたは断片)に同様の妊性の恩恵をもたらすタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含有する、内因性重鎖可変領域遺伝子座またはその部分の欠失または置換を含むマウスを作製することができる。上記異所性ヌクレオチド配列としては、異なるマウス系統または異なる種、例えば異なる齧歯動物種、のADAM6ホモログまたはオルソログ(またはその断片)であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、妊性の恩恵、例えば、指定された期間にわたっての同腹子数の増加、および/または同腹子あたりの子の数の増加、および/またはマウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させる雄マウスの精子細胞の能力、を付与するヌクレオチド配列が挙げられる。
1つの実施形態において、上記ADAM6は、マウスADAM6タンパク質と少なくとも89%から99%同一である(例えば、マウスADAM6aまたはマウスADAM6bと少なくとも89%から99%同一である)ホモログまたはオルソログである。1つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、マウスADAM6aと少なくとも89%同一のタンパク質、マウスADAM6bと少なくとも89%同一のタンパク質、およびその組み合わせから独立して選択される1つ以上のタンパク質をコードする。1つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスADAM6aおよび/またはマウスADAM6bと同一であるまたはマウスADAM6aおよび/またはマウスADAM6bと約89%以上同一であるように改変されているラット、ハムスター、マウス、またはモルモットタンパク質である。1つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスADAM6aおよび/またはマウスADAM6bと同一であるか、マウスADAM6aおよび/またはマウスADAM6bと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である。
ヒト化重鎖マウスにおける異所性ADAM6
遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体(BAC)の開発により、今や、比較的大きいゲノム断片の組換えが可能である。BAC工学は、マウスES細胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるようにした。
遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体(BAC)の開発により、今や、比較的大きいゲノム断片の組換えが可能である。BAC工学は、マウスES細胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるようにした。
ヒト抗体を作るマウスは、ここしばらくの間に利用可能になった。これらのマウスは、ヒト治療用抗体の開発の重要な前進の代表であるが、その有用性を制限する多数の重大な異常を提示する。例えば、これらのマウスは、損なわれたB細胞発生を提示する。この損なわれた発生は、トランスジェニックマウスと野生型マウスの間の様々な相違に起因し得る。
ヒト抗体は、成熟、増殖、またはクローン選択中の生存についてのシグナルを伝達するマウス細胞の表面のマウスプレB細胞受容体またはB細部受容体と最適に相互作用しない可能性がある。完全ヒト抗体は、マウスFc受容体系と最適に相互作用しない可能性があるし、マウスは、ヒトFc受容体との1対1の対応を提示しないFc受容体を発現する。結局、完全ヒト抗体を作る様々なマウスは、野生型B細胞発生に要求され得るすべての真正マウス配列を含まない、例えば、下流エンハンサー要素および他の遺伝子座制御要素を含まない。
完全ヒト抗体を作製するマウスは、何らかの形で無能化されている内因性免疫グロブリン遺伝子座を一般に含み、可変および定常免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むヒト導入遺伝子が、そのマウスゲノム内のランダムな場所に導入される。内因性遺伝子座が、機能的免疫グロブリン遺伝子を形成するように遺伝子セグメントを再構成できないほど無能化されている限り、たとえB細胞発生が損なわれていたとしても、かかるマウスにおいて完全ヒト抗体を作製するという目的を達成することができる。
ヒト導入遺伝子遺伝子座から完全ヒト抗体を作製せざるを得ないのだが、マウスにおけるヒト抗体の産生は、好ましくない過程であるようである。一部のマウスでは、この過程は、トランススイッチの機序によりキメラヒト可変/マウス定常重鎖(軽鎖ではなく)が形成される結果をもたらすには好ましいものではない。この機序により、完全ヒト抗体をコードする転写産物は、ヒトアイソタイプからマウスアイソタイプへとトランスでアイソタイプスイッチされる。完全ヒト導入遺伝子は、マウス重鎖定常領域遺伝子の非損傷コピーを保持する内因性遺伝子座から離れた場所にあるため、この過程はトランスでの過程となる。かかるマウスではトランススイッチが容易に分かるが、この現象はB細胞発生のレスキューにやはり不十分であり、B細胞発生は明らかに害されたままである。いずれにせよ、トランススイッチ現象は軽鎖に関して起こらないので、かかるマウスにおいてトランススイッチされた抗体は、完全ヒト軽鎖を保持する;おそらく、トランススイッチは、シスでの正常なアイソタイプスイッチに(それとは異なるにせよ)用いられる内因性遺伝子座におけるスイッチ配列に依存する。したがって、完全ヒト抗体を作製するように工学的に作製されたマウスが、マウス定常領域を有する抗体を作製するためにトランススイッチ機序を選択する場合であっても、その戦略は、正常B細胞発生のレスキューにやはり不十分である。
抗体ベースのヒト治療薬、例えば抗病原体抗体の作製における主な関心事は、特定のエピトープを特異的に認識し、望ましい親和性で、通常は-常にではないが-高い親和性で、そのエピトープに結合する有用な可変ドメインを同定することである。マウス免疫グロブリン重鎖可変領域の、内因性マウス遺伝子座における限られた数のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントでの正確な置換を含有する本明細書に記載のマウスは、ほぼ野生型のB細胞発生を示し、免疫に応答して生成される可変領域は完全にヒトのものであり、上記重鎖は単一のヒトVH遺伝子セグメントに由来する。したがって、かかるマウスは、所与の抗原、例えば、病原性ウイルスへの結合に特異的に指向性を有する重鎖相補性決定領域(CDR)のパネルを作製するためのプラットホームを提供する。
本明細書に記載のマウスは、内因性遺伝子座におけるマウス免疫グロブリン重鎖(IgH)の生殖細胞系可変遺伝子遺伝子座の、限定されたヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座での、および免疫グロブリン軽鎖(例えば、κ軽鎖、Igκ)の、等価のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座での正確な大規模置換を含有する。この正確な置換により、結果として、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する重鎖および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。マウスVH-DH-JHおよびVκ-Jκセグメントの正確な置換は、隣接するマウス配列をインタクトなままおよび機能的なままハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座に残す。上記マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。B細胞発生はいかなる重要な点でも妨害されず、抗原チャレンジすると上記マウスにおいてヒト重鎖CDRの体細胞変異パネルが産生される。
本明細書に記載のマウスは、重鎖およびκ軽鎖についての免疫グロブリン遺伝子セグメントがヒトおよびマウスにおいて同様に再構成するので実現可能であるのだが、その遺伝子座は同じまたはほぼ同じであるというわけではない――明らかにそれらはそうではない。しかし、その遺伝子座は、すべてのVH、DHおよびJH遺伝子セグメントを含有する約300万塩基対の連続するマウス配列を、限定されたヒト重鎖遺伝子座を含有する連続するヒトゲノム配列で置換することによって重鎖可変遺伝子遺伝子座におけるヒト化を達成することができるほどに類似する。
一部の実施形態では、一定のマウス定常領域遺伝子配列の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置換(例えば、マウスCH1配列の、ヒトCH1での置換、およびマウスCL配列の、ヒトCL配列による置換)により、結果として、例えば完全ヒト抗体断片、例えば完全ヒトFabの作製に好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメント再構成、正常な体細胞超変異頻度および正常なクラススイッチを示す。これらのマウスは、野生型マウスと区別できない体液性免疫系を示し、および、マウスにヒト可変領域遺伝子セグメントの完全レパートリーが無い場合でさえ、正常な細胞集団をすべてのB細胞発生段階で提示し、正常なリンパ器官構造を提示する。これらのマウスを免疫することにより、多種多様な重鎖CDRおよび軽鎖可変遺伝子セグメントの使用を示す頑強な体液性応答が得られる。
マウス生殖細胞系可変領域遺伝子セグメントの正確な置換により、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの作製が可能になる。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再構成し、超変異し、正常にクラススイッチするため、ヒト可変領域を含むマウスでは部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座により抗体が産生される。その可変領域をコードするヌクレオチド配列を同定し、クローニングして、選ばれた任意の配列、例えば、特定の用途に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと(例えばin vitro系において)融合させ、その結果、全部がヒト配列に由来する抗体または抗原結合タンパク質を得ることができる。
リコンビニアリング法による大規模ヒト化を用いてマウス胚性幹(ES)細胞を改変して、マウスVH、DHおよびJH遺伝子セグメントの本質的にすべてを含む3メガ塩基以下のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を、単一のヒトVH遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含む限定されたヒト重鎖遺伝子座を含有するヒトゲノム配列で正確に置換した。本質的にすべてのヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントをコードする2つのリピートの一方を含むヒトゲノムの二分の一メガ塩基以下のセグメントを使用して、マウスVκおよびJκ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含有するマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の3メガ塩基セグメントを置換した。
かかる置換免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も3’側のVH遺伝子セグメントと最も5’側のDH遺伝子セグメントの間で通常は見出される内因性マウスADAM6遺伝子座の破壊または欠失を含み得る。この領域の破壊は、内因性マウスADAM6遺伝子座の機能性の低減または除去をもたらし得る。ヒト重鎖レパートリーの最も3’側のVH遺伝子セグメントの一方または両方を限定されたヒト重鎖遺伝子座の構築に使用すると、ヒトADAM6偽遺伝子であるように見える偽遺伝子を含有する遺伝子間領域がこれらのVH遺伝子セグメント間、すなわち、ヒトVH1-2とVH1-6との間に存在する。しかし、このヒト遺伝子間配列を含む雄マウスは、妊性の低減を示す(米国特許出願第13/404,075号参照)。
上記の限定されたヒト重鎖および等価のヒトκ軽鎖遺伝子座を含み、マウスADAM6をコードする異所性核酸配列も含むマウスであって、本質的に正常な妊性を示すマウスを記載する。1つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトVH1-69とヒトDH1-1との間に配置されたマウスADAM6a配列および/またはマウスADAM6b配列またはその機能的断片を含む。1つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトVH1-69とヒトDH1-1のと間に配置された配列番号77である。配列番号77のADAM6遺伝子の転写方向は、周囲のヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して逆である。1つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトVH1-2遺伝子セグメントの上流(または5’)に配置されたマウスADAM6aおよび/もしくはマウスADAM6b配列またはその機能的断片を含む。1つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトVH1-2遺伝子セグメントの上流(または5’)に配置された配列番号73である。配列番号73のADAM6遺伝子の転写方向は、周囲のヒト遺伝子セグメント(例えば、ヒトVH1-2遺伝子セグメント)の転写方向に関して逆である。
本明細書における例は、示されるヒト遺伝子セグメント間に異所性配列を配置することによる妊性のレスキューを示すが、マウスゲノム内の任意の好適な転写許容遺伝子座への(またはさらには染色体外に)異所性配列の配置が雄マウスの妊性を同様にレスキューすると予想されることは、当業者であれば認める。
マウスADAM6遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む異所性配列を有する機能的ADAM6遺伝子座を欠いているマウスを補足する現象は、非機能的なまたは最小機能的な内因性ADAM6遺伝子座を有する任意のマウスのレスキューに適用できる一般的な方法である。それ故、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のADAM6破壊改変を含む非常に多数のマウスを本発明の組成物および方法でレスキューすることができる。したがって、本発明は、内因性ADAM6機能を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多種多様な改変を有するマウスを含む。一部の(非限定的)例を本明細書に提供する。記載するVELOCIMMUNE(登録商標)マウスに加えて、ADAM6に関する組成物および方法を非常に多くの用途に、例えば、重鎖遺伝子座を多種多様な方法で改変するときに用いることができる。
1つの態様では、機能的ADAM6タンパク質(またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片)をコードする異所性ADAM6配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH遺伝子セグメントの、1つのVH遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスDH遺伝子セグメントおよびJH遺伝子セグメントの、ヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスであって、CH1領域および/またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。1つの実施形態において、上記マウスは、(a)ヒトVH-マウスCH1-マウスCH2-マウスCH3;(b)ヒトVH-マウスヒンジ-マウスCH2-マウスCH3;および(c)ヒトVH-マウスCH2-マウスCH3から選択される免疫グロブリン鎖の二量体である単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する。
1つの態様では、1つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント(mVH、mDHおよび/またはmJH)の、1つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント(hVH、hDHおよび/またはhJH)での置換を有するマウスであって、1つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント(mVκおよび/またはmJκ)の、1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント(hVκおよび/またはhJκ)での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の上流(または5’)(例えば、ヒトVH1-2またはVH1-69遺伝子セグメントの上流)に配置する。
1つの態様では、1つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント(mVH、mDHおよび/またはmJH)の、1つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント(hVH、hDHおよび/またはhJH)での置換を有するマウスであって、1つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント(mVκおよび/またはmJκ)の、1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント(hVκおよび/またはhJκ)での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列内(例えば、ヒトVH1-69またはヒトVH1-2遺伝子セグメントとヒトDH1-1遺伝子セグメントとの間)に配置する。
1つの実施形態において、上記1つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、約3メガ塩基のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。1つの実施形態において、上記1つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも89のVH遺伝子セグメント、少なくとも13のDH遺伝子セグメント、少なくとも4のJH遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。1つの実施形態において、上記1つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の限られた数の(例えば、1つ、2つまたは3つの)VH遺伝子セグメント、少なくとも27のDH遺伝子セグメント、少なくとも6のJH遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。特定の実施形態において、上記限られた数のヒトVH遺伝子セグメントは1つである。
1つの実施形態において、上記1つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約3メガ塩基のマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。1つの実施形態において、上記1つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも137のVκ遺伝子セグメント、少なくとも5のJκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。1つの実施形態において、上記1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約二分の一メガ塩基のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、上記1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の(免疫グロブリンκ定常領域に関して)近位リピートを含む。1つの実施形態において、上記1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも40のVκ遺伝子セグメント、少なくとも5のJκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。
1つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列を2つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの間に配置する。特定の実施形態において、上記2つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである。1つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列をヒトVH1-69遺伝子セグメントとヒトDH1-1遺伝子セグメントとの間に配置する。1つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列をヒトVH12遺伝子セグメントとヒトDH1-1遺伝子セグメントとの間に配置する。1つの実施形態において、そのように改変されたマウスは、単一のヒトVH遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの置換、および少なくとも40のヒトVκ遺伝子セグメントおよび5のヒトJκ遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントの置換を含む。
1つの態様において、機能的マウスADAM6遺伝子座(またはそのオルソログもしくはホモログもしくはその機能的断片)は、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードするように再構成できない内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座に存在するマウス遺伝子セグメントの中央に存在する。1つの実施形態において、上記内因性マウス重鎖遺伝子座は、少なくとも1つ、かつ89以下のVH遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ13以下のDH遺伝子セグメント、少なくとも1つ、かつ4以下のJH遺伝子セグメント、およびその組み合わせを含む。様々な実施形態において、機能的マウスADAM6遺伝子座(またはそのオルソログもしくはホモログもしくはその機能的断片)は、上記マウスにおいて機能的である1つ以上のADAM6タンパク質をコードし、上記1つ以上のADAM6タンパク質は、配列番号1、配列番号2および/またはその組み合わせを含む。
1つの態様において、機能的マウスADAM6遺伝子座(またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片)は、内因性マウス遺伝子セグメントを置換するヒト遺伝子セグメントの中央に存在する。1つの実施形態において、少なくとも89のマウスVH遺伝子セグメントを除去し、1つ、2つまたは3つのヒトVH遺伝子セグメントで置換し、およびマウスADAM6遺伝子座は、ヒトVH遺伝子セグメントの3’末端に直ぐ隣接して存在するか、2つのヒトVH遺伝子セグメント間に存在する。1つの実施形態において、少なくとも89のマウスVH遺伝子セグメントを除去し、単一のヒトVH遺伝子セグメントで置換し、およびマウスADAM6遺伝子座は、ヒトVH遺伝子セグメントの3’末端に直ぐ隣接して存在する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、挿入されたヒトVH遺伝子セグメントの3’末端の約20キロ塩基(kb)から約40キロ塩基(kb)以内のVH遺伝子セグメントの3’に存在する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、挿入されたヒトVH遺伝子セグメントの3’末端の約29kbから約31kb以内のVH遺伝子セグメントの3’に存在する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、挿入されたヒトVH遺伝子セグメントの3’末端の約30kb以内に存在する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、挿入されたヒトVH遺伝子セグメントの3’末端の約30,184bp以内に存在する。
特定の実施形態において、上記置換は、ヒト遺伝子セグメントVH1-69およびDH1-1を含み、上記マウスADAM6遺伝子座は、該VH1-69遺伝子セグメントの下流かつ該DH1-1遺伝子セグメントの上流に存在する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、ヒトVH1-69遺伝子セグメントとヒトDH1-1遺伝子セグメントとの間に存在し、この場合、該マウスADAM6遺伝子座の5’末端は、該ヒトVH1-69遺伝子セグメントの3’末端から約258bpであり、および該ADAM6遺伝子座の3’末端は、該ヒトDH1-1遺伝子セグメントの約3,263bp5’側に存在する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、マウスの細胞内にADAM6機能を付与する配列番号3またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、マウスの細胞内にADAM6機能を付与する配列番号73またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、マウスの細胞内にADAM6機能を付与する配列番号77またはその断片を含む。そこで、特定の実施形態において、ヒト遺伝子セグメントの構成は、以下のものである(ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に):ヒトVH1-69-マウスADAM6遺伝子座-ヒトDH1-1。1つの実施形態において、転写方向に関して、マウスADAM6遺伝子座のマウスADAM6aおよびマウスADAM6bのうちの1つ以上の配向は、ヒト遺伝子セグメントについての配向と比較して逆である。あるいは、マウスADAM6遺伝子座は、単一のヒトVH遺伝子セグメントに対して5’またはその上流に存在する。
特定の実施形態において、上記置換は、ヒト遺伝子セグメントVH1-2およびDH1-1を含み、上記マウスADAM6遺伝子座は、該VH1-2遺伝子セグメントの上流かつ該DH1-1遺伝子セグメントの上流に存在する。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、ヒトVH1-2遺伝子セグメントとヒトDH1-1遺伝子セグメントの上流または5’に存在し、この場合、該マウスADAM6遺伝子座の5’末端は、該ヒトVH1-2遺伝子セグメントの5’末端から約32,833bpであり、および該ADAM6遺伝子座の3’末端は、該ヒトVH1-2遺伝子セグメントの5’末端から約18,078bpである。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、マウスの細胞内にADAM6機能を付与する配列番号3またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、マウスの細胞内にADAM6機能を付与する配列番号73またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスADAM6遺伝子座は、マウスの細胞内にADAM6機能を付与する配列番号77またはその断片を含む。そこで、特定の実施形態において、ヒト遺伝子セグメントの構成は、以下のものである(ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に):マウスADAM6遺伝子座-ヒトVH1-2-ヒトDH1-1。1つの実施形態において、転写方向に関して、マウスADAM6遺伝子座のマウスADAM6aおよびマウスADAM6bのうちの1つ以上の配向は、ヒト遺伝子セグメントについての配向と比較して逆である。あるいは、マウスADAM6遺伝子座は、単一のヒトVH遺伝子セグメントに対して3’またはその下流に存在する。
同様に、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスVH遺伝子セグメントを置換する、上記1つ以上のヒトVL遺伝子セグメント(例えば、VκまたはVλセグメント)で改変されるマウスは、上に記載したように、例えばマウスADAM6遺伝子座もしくはその機能的断片を含む下流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターを利用することにより、内因性マウスADAM6遺伝子座を維持するように改変することができ、あるいは2つのヒトVL遺伝子セグメント間に、またはヒトVL遺伝子セグメントとDH遺伝子セグメントとの間(ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Vλ+m/hDH)もしくはJ遺伝子セグメントとの間(ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Vκ+JH)に位置する異所配列で損傷マウスADAM6遺伝子座を置換するように改変することができる。1つの実施形態において、上記置換は、2つ以上のヒトVL遺伝子セグメントを含み、および上記マウスADAM6遺伝子座またはその機能的断片は、2つの最も3’側のVL遺伝子セグメント間に存在する。そこで、特定の実施形態において、ヒトVL遺伝子セグメントの構成は、以下のものである(ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に):ヒトVL3’-1-マウスADAM6遺伝子座-ヒトVL3’。1つの実施形態において、転写方向に関して、マウスADAM6遺伝子座のマウスADAM6aおよびマウスADAM6bのうちの1つ以上の配向は、ヒトVL遺伝子セグメントの配向と比較して逆である。あるいは、マウスADAM6遺伝子座は、最も3’側のヒトVL遺伝子セグメントと最も5’側のDH遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に存在する。最も5’側のDHセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうとこのとおりであるはずである。
1つの態様では、1つ以上の内因性マウスVH遺伝子セグメントの置換を有する、および少なくとも1つの内因性マウスDH遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。かかるマウスにおいて、上記内因性マウスVH遺伝子セグメントの改変は、最も5’側のDH遺伝子セグメントではなく、最も3’側のVH遺伝子セグメントの1つ以上についての改変を含み得、この場合、上記1つ以上の最も3’側のVH遺伝子セグメントの改変が、上記内因性マウスADAM6遺伝子座を破壊しないようにまたは非機能的にしないように注意する。例えば、1つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスVH遺伝子セグメントの、1つのヒトVH遺伝子セグメントによる置換を含み、および上記マウスは、1つ以上の内因性DH遺伝子セグメントおよび機能的内因性マウスADAM6遺伝子座を含む。
もう1つの実施形態において、上記マウスは、最も3’側の内因性マウスVH遺伝子セグメントの改変、および1つ以上の内因性マウスDH遺伝子セグメントの改変を含み、該改変は、内因性ADAM6遺伝子座が機能的なままである程度まで該内因性マウスADAM6遺伝子座の完全性が維持されるように行う。一例では、かかる改変を二工程で行う:(1)上流ホモロジーアームと、機能的マウスADAM6遺伝子座のすべてまたは部分を含む下流ホモロジーアームとを有するターゲティングベクターを利用して、最も3’側の内因性マウスVH遺伝子セグメントを1つのヒトVH遺伝子セグメントで置換する工程;(2)次に、マウスADAM6遺伝子座のすべてまたは機能的部分を含む上流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターで内因性マウスDH遺伝子セグメントを置換する工程。
様々な態様において、改変が内因性マウスADAM6の機能を破壊する場合、マウスADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的ホモログをコードする異所性配列を含有するマウスの利用は有用である。内因性マウスADAM6機能を破壊する確率は、マウス免疫グロブリン遺伝子座への改変を行うとき、特に、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域および周囲の配列を改変するときに高い。したがって、かかるマウスは、全部もしくは一部が欠失している、全部もしくは一部がヒト化されている、または全部もしくは一部が(例えば、VκもしくはVλ配列で)置換されている免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製するときに特に有益である。下に記載するマウスに対して記載の遺伝子改変を行うための方法は当業者に公知である。
マウスADAM6タンパク質をコードする異所性配列またはマウスADAM6タンパク質の妊性の恩恵をもたらす実質的に同一もしくは同様のタンパク質をコードする異所性配列を含有するマウスは、内因性マウスADAM6配列を破壊するかまたは欠失させるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座への改変に関連して特に有用である。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するマウスに関連して主として記載したが、かかるマウスは、内因性マウスADAM6遺伝子を破壊する任意の遺伝子改変に関連して有用である。これが、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の改変を含有する多種多様な遺伝子改変マウスを包含することは、当業者であれば認める。これらには、例えば、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのすべてまたは一部分の欠失または置換を、他の改変にかかわらず有するマウスが含まれる。非限定的な例を下に記載する。
一部の態様では、マウスにおいて機能的な異所性マウス、齧歯動物または他のADAM6遺伝子(またはオルソログもしくはホモログもしくは断片)と1つ以上のヒト免疫グロブリン可変および/または定常領域遺伝子セグメントとを含む遺伝子改変マウスを提供する。様々な実施形態において、マウスにおいて機能的である他のADAM6遺伝子オルソログまたはホモログまたは断片は、ウシ、イヌ、霊長類、ウサギまたは他の非ヒト配列を含み得る。
1つの態様では、機能的ADAM6タンパク質をコードする異所性ADAM6配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH遺伝子セグメントの、1つのヒトVH遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスDH遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトDH遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスJH遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスは、マウスCH1ヌクレオチド配列の、ヒトCH1ヌクレオチド配列による置換をさらに含む。1つの実施形態において、上記マウスは、マウスヒンジヌクレオチド配列の、ヒトヒンジヌクレオチド配列による置換をさらに含む。1つの実施形態において、上記マウスは、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座(VLおよびJL)の、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座での置換をさらに含む。1つの実施形態において、上記マウスは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列による置換をさらに含む。特定の実施形態において、上記VL、JLおよびCLは、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。特定の実施形態において、上記マウスは、ヒトヒンジおよびヒトCH1配列と融合したマウスCH2およびマウスCH3免疫グロブリン定常領域配列を含むので、該マウス免疫グロブリン遺伝子座が再構成して、(a)ヒト可変領域、ヒトCH1領域、ヒトヒンジ領域ならびにマウスCH2およびマウスCH3領域を有する重鎖と、(b)ヒト可変ドメインおよびヒト定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子とを含む結合タンパク質をコードする遺伝子を形成する。
1つの態様では、機能的ADAM6タンパク質をコードする異所性ADAM6配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトVL遺伝子セグメントによる置換と、必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのDH遺伝子セグメントおよび/もしくはJH遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトDH遺伝子セグメントおよび/もしくはヒトJH遺伝子セグメントによる置換と、または必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのDH遺伝子セグメントおよびJH遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトJL遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH、DHおよびJH遺伝子セグメントの、1つ以上のVL、1つ以上のDH、および1つ以上のJ遺伝子セグメント(例えば、JκまたはJλ)での置換を含み、これらの遺伝子セグメントは、内因性マウスヒンジ領域に作動可能に連結されており、該マウスは、転写方向に5’から3’へと、ヒトVL-ヒトまたはマウスDH-ヒトまたはマウスJ-マウスヒンジ-マウスCH2-マウスCH3を含有する再構成免疫グロブリン鎖遺伝子を形成する。1つの実施形態において、上記J領域は、ヒトJκ領域である。1つの実施形態において、上記J領域は、ヒトJH領域である。1つの実施形態において、上記J領域は、ヒトJλ領域である。1つの実施形態において、上記ヒトVL領域は、ヒトVλ領域およびヒトVκ領域から選択される。
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスまたはヒト定常領域と、ヒトVκ、ヒトDHおよびヒトJκ;ヒトVκ、ヒトDHおよびヒトJH;ヒトVλ、ヒトDHおよびヒトJλ;ヒトVλ、ヒトDHおよびヒトJH;ヒトVκ、ヒトDHおよびヒトJλ;ヒトVλ、ヒトDHおよびヒトJκに由来する可変領域とを有する、単一可変ドメイン抗体を発現する。特定の実施形態では、列挙したV、DおよびJ遺伝子セグメント間でのまたは列挙したVおよびJ遺伝子セグメント間での生産的再構成の発生が可能になるように、組換え認識配列を改変する。
1つの態様では、機能的ADAM6タンパク質(またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片)をコードする異所性ADAM6配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトVL遺伝子セグメントによる置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのDH遺伝子セグメントおよびJH遺伝子セグメントの、ヒトJL遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスであって、CH1および/またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスにはCH1ドメインをコードする配列が無い。1つの実施形態において、上記マウスにはヒンジ領域をコードする配列が無い。1つの実施形態において、上記マウスにはCH1ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列が無い。
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスCH3ドメインに結合しているマウスCH2ドメインに融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(λまたはκ)を含む結合タンパク質を発現する
1つの態様では、機能的ADAM6タンパク質(またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片)をコードする異所性ADAM6配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスVH遺伝子セグメントの、1つ以上のヒトVL遺伝子セグメントによる置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのマウスDHおよびJH遺伝子セグメントの、ヒトJL遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスを提供する。
1つの実施形態において、上記マウスは、CH1領域、ヒンジ領域、CH1およびヒンジ領域、またはCH1領域およびヒンジ領域およびCH2領域をコードする免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列の欠失を含む。
1つの実施形態において、上記マウスは、以下のものから選択されるホモ二量体を含む単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する:(a)ヒトVL-マウスCH1-マウスCH2-マウスCH3;(b)ヒトVL-マウスヒンジ-マウスCH2-マウスCH3;(c)ヒトVL-マウスCH2-マウスCH3。
1つの態様では、無能化または欠失された内因性マウスADAM6遺伝子座を含む、無能化された内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスであって、ヒトまたはマウスまたはヒト/マウスもしくは他のキメラ抗体を発現する核酸配列を含むマウスを提供する。1つの実施形態において、上記核酸配列は、組み込まれた導入遺伝子上に存在し、該導入遺伝子は、マウスゲノムにランダムに組み込まれている。1つの実施形態において、上記核酸配列は、野生型マウスでは見出さないエピソーム(例えば、染色体)上にある。
1つの実施形態において、上記マウスは、無能化された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖遺伝子座から選択される。特定の実施形態において、上記マウスは、無能化された内因性κ軽鎖遺伝子座および無能化されたλ軽鎖遺伝子座を含み、この場合のマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインを含む抗体を発現する。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインは、ヒトκ軽鎖ドメインおよびヒトλ軽鎖ドメインから選択される。
1つの態様では、キメラ抗体を発現する遺伝子改変動物であって、該遺伝子改変動物において機能的であるADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する遺伝子改変動物を提供する。
1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、マウスおよびラットから選択される。1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物はマウスであり、上記ADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、該遺伝子改変動物とは異なる系統であるマウス系統からのものである。1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物(例えば、ハムスター、新世界ラットまたはマウス、ハタネズミ)であり、および上記ADAM6タンパク質オルソログまたはホモログは、ネズミ科の齧歯動物(例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ)からのものである。1つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、ネズミ科の齧歯動物であり、上記ADAM6タンパク質オルソログまたはホモログは、キヌゲネズミ科の齧歯動物からのものである。
1つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと齧歯動物の定常領域配列とを含む。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物およびネズミ科の齧歯動物から選択される。特定の実施形態において、上記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、マウスである。特定の実施形態において、上記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、ラットである。1つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと、マウスまたはラットから選択される動物からの定常ドメインとを含む;特定の実施形態において、上記マウスまたはラットは、キヌゲネズミ科およびネズミ科から選択される。1つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインと、ヒト軽鎖可変ドメインと、マウスおよびラットから選択される齧歯動物由来の定常領域配列とを含み、この場合のヒト重鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖は同種のものである。特定の実施形態において、同種のものとしては、ヒト重鎖およびヒト軽鎖可変ドメインが、該ヒト軽鎖可変ドメインと該ヒト重鎖可変ドメインを一緒に発現してその可変ドメインを個々のB細胞の表面に一緒に提示する単一B細胞からのものである、同種のものが挙げられる。
1つの実施形態において、上記キメラ抗体を免疫グロブリン遺伝子座から発現させる。1つの実施形態において、上記キメラ抗体の重鎖可変ドメインを再構成内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現させる。1つの実施形態において、上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現させる。1つの実施形態において、上記キメラ抗体の重鎖可変ドメインおよび/または上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成導入遺伝子(例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の、動物のゲノムに組み込まれている非再構成核酸配列から誘導された再構成核酸配列)から発現させる。1つの実施形態において、上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成導入遺伝子(例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の、動物のゲノムに組み込まれている非再構成核酸配列から誘導された再構成核酸配列)から発現させる。
特定の実施形態において、上記導入遺伝子を転写活性遺伝子座、例えば、ROSA26遺伝子座、例えばネズミ(例えばマウス)ROSA26遺伝子座から発現させる。
1つの態様では、非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、該ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座が非ヒトADAM6配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、非ヒト動物を提供する。
1つの実施形態において、上記非ヒトADAM6オルソログまたはホモログは、マウスADAM6配列とオルソロガスおよび/または相同性である配列であり、そのオルソログまたはホモログは、非ヒト動物において機能的である。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される齧歯動物である。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択され、上記ADAM6オルソログまたはホモログは、マウス、ラットおよびハムスターから選択される非ヒト動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ADAM6オルソログまたはホモログは、異なるマウス種、ラットおよびハムスターから選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はラットであり、上記ADAM6オルソログまたはホモログは、異なるラット種、マウスおよびハムスターから選択される齧歯動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はハムスターであり、上記ADAM6オルソログまたはホモログは、異なるハムスター種、マウスおよびラットから選択される齧歯動物からのものである。
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、ネズミ亜目からのものであり、上記ADAM6配列は、トビネズミ上科の齧歯動物およびネズミ上科の齧歯動物から選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のマウスであり、上記ADAM6オルソログまたはホモログは、ネズミ上科のマウスまたはラットまたはハムスターからのものである。
1つの実施形態において、上記ヒト化重鎖遺伝子座は、単一のヒトVH遺伝子セグメント、1つ以上のヒトDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、ヒトVH遺伝子セグメント、1つ以上のヒトDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントは、1つ以上のヒト、キメラおよび/または齧歯動物(例えば、マウスもしくはラット)定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。1つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はマウスである。1つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はラットである。1つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はハムスターである。1つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、CH2、CH3およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、CH2およびCH3配列を含む。
1つの実施形態において、上記非ヒトADAM6配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列に隣接する。1つの実施形態において、上記非ヒトADAM6配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列内に位置する。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、V、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記非ヒトADAM6配列は、V遺伝子セグメントに並置されている。1つの実施形態において、上記非ヒトADAM6配列は、2つのV遺伝子セグメント間に位置する。1つの実施形態において、上記非ヒトADAM6配列は、V遺伝子セグメントとD遺伝子セグメントとの間に並置されている。1つの実施形態において、上記マウスADAM6配列は、V遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間に位置する。1つの実施形態において、上記マウスADAM6配列は、D遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間に並置されている。
1つの態様では、免疫グロブリン遺伝子座からヒトVLドメインと同種のヒトVHドメインを発現するB細胞を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、該免疫グロブリン遺伝子座から非免疫グロブリン非ヒトタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、ADAMタンパク質である。特定の実施形態において、上記ADAMタンパク質は、ADAM6タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片である。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物は、齧歯動物(例えば、マウスまたはラット)である。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記ネズミ上科の齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。
1つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、齧歯動物タンパク質である。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。1つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
1つの実施形態において、上記ヒトVHおよびVLドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に直接またはリンカーによって結合する。特定の実施形態において、上記定常ドメイン配列は、ヒンジ、CH2、CH3およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記ヒトVLドメインは、VκまたはVλドメインから選択される。
1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、その生殖細胞系にヒト免疫グロブリン配列を含み、雄非ヒト動物の精子がin vivo移動欠陥を特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記in vivo移動欠陥は、上記雄非ヒト動物の精子が同じ種の雌非ヒト動物の子宮から卵管を通って移動することができないことを含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物には、ADAM6タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列が無い。特定の実施形態において、上記ADAM6タンパク質またはその機能的断片は、ADAM6aおよび/もしくはADAM6bタンパク質またはその機能的断片を含む。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
1つの態様では、ADAM6タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする非ヒト配列に隣接するヒト免疫グロブリン配列を含む非ヒト動物を提供する。1つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン重鎖配列である。1つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、単一のVH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、1つ以上のDH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、1つ以上のJH遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、単一のVH遺伝子セグメント、1つ以上のDH遺伝子セグメントおよび1つ以上のJH遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、天然ヒトレパートリーにおける多型に関連づけられた単一のVH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70またはVH3-23から選択される。もう1つの特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、VH1-2である。もう1つの特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、VH1-69である。
1つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、天然ヒトレパートリーにおける複数のコピー数に関連づけられた単一のVH遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70またはVH3-23から選択される。もう1つの特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、VH1-2である。もう1つの特定の実施形態において、上記単一のVH遺伝子セグメントは、VH1-69である。
様々な実施形態において、上記VH遺伝子セグメントは、VH6-1、VH1-2、VH1-3、VH2-5、VH3-7、VH1-8、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH1-18、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH1-24、VH2-26、VH4-28、VH3-30、VH4-31、VH3-33、VH4-34、VH3-35、VH3-38、VH4-39、VH3-43、VH1-45、VH1-46、VH3-48、VH3-49、VH5-51、VH3-53、VH1-58、VH4-59、VH4-61、VH3-64、VH3-66、VH1-69、VH2-70、VH3-72、VH3-73およびVH3-74から選択される。
様々な実施形態において、上記VH遺伝子セグメントは表1から選択され、5つ以上の対立遺伝子によって天然ヒトレパートリーで表される。特定の実施形態において、上記VH遺伝子は、VH1-2、VH1-69、VH2-5、VH2-70、VH3-15、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-49、VH3-64、VH4-4、VH4-28、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51およびVH7-4-1から選択される。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、該マウスは、内因性マウスVH遺伝子セグメントの、単一のヒトVH遺伝子セグメントによる置換を含み、該ヒトVH遺伝子セグメントはマウスCH領域遺伝子に作動可能に連結されているので、該マウスは、ヒトVH遺伝子セグメントを再構成し、およびヒトVHドメインとマウスCHとを含む逆キメラ免疫グロブリン重鎖を発現する。1つの実施形態において、非再構成マウスVH遺伝子セグメントの90~100%が、1つの非再構成ヒトVH遺伝子セグメントで置換されている。特定の実施形態において、上記内因性マウスVH遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、1つの非再構成ヒトVH遺伝子セグメントで置換されている。1つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントでのものである。1つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトVH1-2遺伝子セグメントでのものである。1つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトVH2-26遺伝子セグメントでのものである。1つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトVH2-70遺伝子セグメントでのものである。1つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトVH3-23遺伝子セグメントでのものである。
1つの実施形態において、上記マウスは、すべてのマウスDHおよびJHセグメントの、少なくとも1つの非再構成ヒトDHセグメントおよび少なくとも1つの非再構成ヒトJHセグメントによる置換を含む。1つの実施形態において、上記少なくとも1つの非再構成ヒトDHセグメントは、1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13、7-27およびその組み合わせから選択される。1つの実施形態において、上記少なくとも1つの非再構成ヒトJHセグメントは、1、2、3、4、5、6およびその組み合わせから選択される。
様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、非ヒト動物(例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター)の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。1つの実施形態において、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト/マウスまたはキメラヒト/ラットまたはキメラヒト/ハムスター、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。1つの実施形態において、上記定常領域は、齧歯動物(例えば、マウスまたはラットまたはハムスター)定常領域である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。様々な実施形態において、上記定常領域は、少なくともCH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。
1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物(例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター)の生殖細胞系における免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあり、この非重鎖遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非重鎖遺伝子座は、ROSA26遺伝子座である。
様々な態様において、上記非ヒト動物は、該非ヒト動物の生殖細胞系にヒト免疫グロブリン軽鎖配列(例えば、1つ以上の非再構成軽鎖VおよびJ配列、または1つ以上の再構成VJ配列)をさらに含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン軽鎖配列は、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、1つ以上のVL遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、1つ以上のJL遺伝子セグメントを含む。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、1つ以上のVL遺伝子セグメントおよび1つ以上のJL遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも16のVκ遺伝子セグメントおよび5つのJκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも30のVκ遺伝子セグメントおよび5つのJκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも40のVκ遺伝子セグメントおよび5つのJκ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物(例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター)の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。1つの実施形態において、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト/齧歯動物、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。特定の実施形態において、上記定常領域は、マウスまたはラット定常領域である。特定の実施形態において、上記定常領域は、マウスκ定常(mCκ)領域またはラットκ定常(rCκ)領域である。
1つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、該マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのVκおよびJκ遺伝子セグメントの、少なくとも6のヒトVκ遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントによる置換を含む。1つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのVκおよびJκ遺伝子セグメントが、少なくとも16のヒトVκ遺伝子セグメント(ヒトVκ)および少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントで置換されている。1つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのVκおよびJκ遺伝子セグメントが、少なくとも30のヒトVκ遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントで置換されている。1つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのVκおよびJκ遺伝子セグメントが、少なくとも40のヒトVκ遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントで置換されている。1つの実施形態において、上記少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントは、2、3、4または5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5およびVκ1-6を含む。1つの実施形態において、上記Vκ遺伝子セグメントは、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15およびVκ1-16を含む。1つの実施形態において、上記ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29およびVκ2-30を含む。1つの実施形態において、上記ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39およびVκ2-40を含む。
特定の実施形態において、上記Vκ遺伝子セグメントは、Vκ4-1からVκ2-40までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続したヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを含み、上記Jκ遺伝子セグメントは、Jκ1からJκ5までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続した遺伝子セグメントを含む。
1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。1つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、転写活性である非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ROSA26遺伝子座である。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞において、コードされている1つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含むヒト抗体を作製する方法を提供する。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞において、コードされている1つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含む抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物を、ヒト可変ドメインを含む抗体に曝露することを含む方法を提供する。1つの実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。1つの実施形態において、上記抗体は、ヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、VH6-1、VH1-2、VH1-3、VH2-5、VH3-7、VH1-8、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH1-18、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH1-24、VH2-26、VH4-28、VH3-30、VH4-31、VH3-33、VH4-34、VH3-35、VH3-38、VH4-39、VH3-43、VH1-45、VH1-46、VH3-48、VH3-49、VH5-51、VH3-53、VH1-58、VH4-59、VH4-61、VH3-64、VH3-66、VH1-69、VH2-70、VH3-72、VH3-73およびVH3-74から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、VH1-2、VH1-69、VH2-5、VH2-70、VH3-15、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-49、VH3-64、VH4-4、VH4-28、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51およびVH7-4-1から選択される再構成ヒトVH遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39およびVκ2-40から選択される再構成ヒトVκ遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、再構成ヒトVκ1-39遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ3-32、Vλ2-33、Vλ2-34、Vλ1-36、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ5-48、Vλ9-49、Vλ1-50、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ10-54、Vλ11-55、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61およびVλ4-69から選択される再構成ヒトVλ遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
1つの実施形態において、単一のヒトVH遺伝子セグメント、27のDH遺伝子セグメントおよび6のJH遺伝子セグメントを含む限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物の細胞において、コードされている1つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含む抗イディオタイプ抗体であって、再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、上記非ヒト動物を、上記再構成ヒトVH1-69遺伝子セグメントを含む抗体に曝露すること、および上記非ヒト動物から上記抗イディオタイプ抗体を単離することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-2およびヒトVH1-69遺伝子セグメントから選択される。
1つの実施形態において、単一のヒトVH遺伝子セグメント、27のDH遺伝子セグメントおよび6のJH遺伝子セグメントを含む限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物の細胞において、コードされている1つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含む抗イディオタイプ抗体であって、再構成ヒトVκ1-39遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、上記非ヒト動物を、上記ヒトVκ1-39遺伝子セグメントを含む抗体に曝露すること、および上記非ヒト動物から上記抗体を単離することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、上記単一のヒトVH遺伝子セグメントは、ヒトVH1-2およびヒトVH1-69遺伝子セグメントから選択される。
1つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物から単離された1つ以上の可変領域核酸配列に由来する抗体または抗体断片を含むポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。1つの実施形態において、上記ポリペプチドは抗体である。1つの実施形態において、上記ポリペプチドは、重鎖のみの抗体である。1つの実施形態において、上記ポリペプチドは、一本鎖可変断片(例えば、scFv)である。
1つの態様では、抗体を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。様々な実施形態において、上記抗体は、上記非ヒト動物から単離された1つ以上の可変領域核酸配列に由来する1つ以上の可変ドメインを含む。特定の実施形態において、上記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製および使用の仕方を当業者に説明するために提供するものであり、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を制限することを意図したものではない。別の指示が無い限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または大気圧近くである。
実施例1
限定されたヒト化IgH遺伝子座の構築
実施例1
限定されたヒト化IgH遺伝子座の構築
すべてのヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントの上流にある単一のヒトVH遺伝子セグメントを含有する、固有に操作されたヒト重鎖遺伝子座を、細菌人工染色体(BAC)DNAを用いる相同組換えにより構築することができる。かかる免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築に用いられる例示的なヒトVH遺伝子セグメントとしては、コピー数の変動に関連づけられた多型VH遺伝子セグメントおよび/またはVH遺伝子セグメント、例えばVH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70およびVH3-23などが挙げられる。数個のターゲティング構築物を使用して単一のVHを含有する重鎖遺伝子座を作るために、VELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作技術を用いることができる(例えば、米国特許第6,586,251号、およびValenzuela,D.M.ら、2003,High-throughput engineering
of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.Nature Biotechnology 21(6):652-659参照)。
of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.Nature Biotechnology 21(6):652-659参照)。
ヒトVH1-69の限定されたIgH遺伝子座の例示的な構築戦略(図1)。第一の工程では、VH1-69、上流選択カセット(例えば、ハイグロマイシン)、および5’マウスホモロジーアームを含む複数の遠位側(5’)ヒトVH遺伝子セグメントを含有する改変ヒトBACを、やはり改変組換えシグナル配列を含有する第二の選択カセット(例えば、スペクチノマイシン)による相同組換えによってターゲティングした(工程1、図1)。この改変組換えシグナル配列(RSS)により、ヒトVH1-69遺伝子の3’RSS領域内に2つの点変異(TからAへの変異およびGからAへの変異)を導入し、RSS九量体を最適なコンセンサス配列に変化させた。したがって、工程1の結果、改変3’RSS、RSSの約180bp下流の固有AsiSI制限部位、およびスペクチノマイシンカセットを有するヒトVH1-69遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片が得られた。
工程2には、Frt部位が隣接するネオマイシン(Neo)カセットを使用して、選択カセット(ハイグロマイシン)およびさらに上流(5’)ヒトVH遺伝子セグメントを欠失させることが含まれていた。相同組換えによってヒトVH1-69遺伝子セグメントに対して5’にこの改変をターゲティングして、ヒトVH1-69の約8.2kbのプロモーター領域および5’マウスホモロジーアームをインタクトにした。
工程3には、固有操作制限部位(例えば、PI-SceIおよびAsiSI)が隣接する別の選択カセット(スペクチノマイシン)を相同組換えによってターゲティングして、最初の3つの機能的ヒトVH遺伝子セグメントならびにすべてのヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片にすることが含まれていた(図1)。ヒトゲノム断片は、ネオマイシンカセットによる相同組換えによって予めターゲティングされ、3’イントロンエンハンサーおよびIgM遺伝子を含む内因性重鎖遺伝子座の5’および3’にマウスゲノム配列を含有する5’ホモロジーアームおよび3’ホモロジーアームを含有していた。この改変により、5’マウスゲノム配列およびヒトVH遺伝子セグメントを欠失させ、ヒトDH1-1遺伝子セグメントの上流の約3.3kbのVH-DH遺伝子間領域、ヒトDHセグメントおよびヒトJHセグメントのすべて、ならびに3’イントロンエンハンサーおよびIgM遺伝子を含有する3’マウスゲノム断片がもたらされた(図1)。
固有制限部位(上記)を使用して工程2および工程3からの2つの改変BACを切断し、続いてライゲーションすることによって工程4を行い、最終ターゲティング構築物を得た。ES細胞内にヒトVH1-69遺伝子セグメント、すべてのヒトDH遺伝子セグメントおよびすべてのヒトJH遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝子座を作るための最終ターゲティング構築物は、5’から3’に向けて、内因性重鎖遺伝子座の上流に約20kbのマウスゲノム配列を含有する5’ホモロジーアーム、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、約8.2kbのヒトVH1-69プロモーター、改変3’RSSを有するヒトVH1-69遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメント、6のヒトJHセグメント、ならびに3’イントロンエンハンサーおよびIgM遺伝子を含むマウスJH遺伝子セグメントの下流の約8kbのマウスゲノム配列を含有する3’ホモロジーアームを含有していた(図1)。
ヒトVH1-2の限定されたIgH遺伝子座の例示的な構築戦略(図2)。同様に、他の多型VH遺伝子セグメントをマウス重鎖定常領域との関連で使用して、限られた数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)の免疫グロブリン重鎖Vセグメントを有する一連のマウスであって、上記VセグメントがV遺伝子ファミリーメンバーの多型変異体であるマウスを構築する。例示的な多型VH遺伝子セグメントは、例えば、VH1-2、VH2-26、VH2-70、およびVH3-23を含めたヒトVH遺伝子セグメントに由来する。かかるヒトVH遺伝子セグメントは、例えば、公開されたデータベース上で利用可能な配列を用いてde novo合成(例えば、Blue Heron Biotechnology,Bothell,WA)により得られる。したがって、一部の実施形態において、各VH遺伝子をコードするDNA断片は、本明細書に記載のターゲティングベクターへの組み込みとは独立に生成される。このように、マウス重鎖定常領域との関連では、限られた数のVH遺伝子セグメントを含む複数の改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を操作する。ヒトVH1-2遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメント、および6のヒトJH遺伝子セグメントを含有する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を作るための例示的なターゲティング戦略を図2に示す。
簡単に言うと、3つのヒトVH遺伝子セグメント(VH6-1、VH1-2、VH1-3)、27のヒトDH遺伝子セグメント、および6のヒトJH遺伝子セグメントを含有する改変ヒトBACクローン(2012年2月24日に出願された米国特許出願第13/404,075号参照)を用いて、ヒトVH1-2遺伝子セグメントを含有する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を作る。この改変BACクローンは、上記のヒト重鎖遺伝子セグメントを、マウスイントロンエンハンサーおよびIgM定常領域と機能的に連結する。限定されたヒトVH1-2ベースの重鎖遺伝子座は、上記の改変ヒトBACクローンを用いて2回の相同組換えにより達成する。第一の相同組換えでは、改変ヒトBACクローン内の205bpのヒトVH6-1遺伝子セグメント(エクソン1内のVH6-1開始コドンの約10bp上流(5’)からエクソン2の開始部の約63bp下流(3’)まで)を、固有PI-SceI制限部位が隣接するスペクチノマイシン(aadA)カセットを用いて細菌性相同組換えにより欠失させる(図2、BHR1)。これにより、限定された重鎖遺伝子座内の他のヒト遺伝子セグメントを破壊せずに、続いてaadAカセットを除去することが可能となる。第二の相同組換えでは、ヒトVH1-3遺伝子セグメントの全体およびこの遺伝子セグメントの約60bp下流(3’)を含む改変ヒトBACクローンの5’末端を、隣接する5’AsiSI制限部位および3’AscI制限部位を含有するハイグロマイシンカセットを用いて相同組換えにより欠失させる(図2、BHR2)。上記の通り、ヒトVH1-2遺伝子セグメントに隣接する2つのヒトVH遺伝子セグメントの欠失を含め、最終ターゲティングベクターの確認後に、スペクチノマイシンカセットを必要に応じて除去する(図2、下)。例示的なヒトVH1-2ターゲティングベクターを配列番号75に示す。
限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座において多型VH遺伝子セグメントを使用することは、抗体、抗体集団、および単一のヒトVH遺伝子セグメントに由来する多様なCDRを有する重鎖を有する抗体を発現するB細胞集団を生成するための新規アプローチの代表的なものである。宿主動物の体細胞超変異機構を、再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと組み合わせて共に利用することにより、遺伝子改変動物の免疫レパートリーを拡張し、ヒト病原体に対して特異的な中和抗体を作製するためのプラットホームとして特に有用なヒト治療薬を作製するための次世代プラットホームとしてのそれらの有用性を増強する固有の重鎖および固有のVH/VL対の操作がもたらされる。
最終的な所望の遺伝子座構造に基づいて、所望のヒトVH遺伝子セグメントを含有するヒトBACクローンを使用して、他のヒトVH遺伝子セグメントの1つを同様に置換することができる。したがって、さらなる多型VH遺伝子セグメントおよび/または他の多型VH遺伝子セグメントをマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組み込むための上記戦略を用いることにより、別の方法では宿主免疫系を有効に回避し得るヒト病原体を中和するのに用いられる新規抗体レパートリーの生成が可能となる。
上記ターゲティングES細胞をドナーES細胞として用いて、VELOCIMOUSE(登録商標)法(上掲)により8細胞期のマウス胚に導入する。マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトVH遺伝子セグメント、すべてのヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスは、ネオマイシンカセット、ヒトVH遺伝子セグメント、ならびにヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメント内の領域、ならびに内因性重鎖配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ(Valenzuelaら、上掲)の変法を用いて遺伝子型解析により同定する。表3は、単一のヒトVH1-69遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含有する限定された重鎖遺伝子座を保有するマウスを確認するために用いられるプライマーおよびプローブを示す。
ターゲティングベクターにより導入されるFrtを組み込んだあらゆるネオマイシンカセットであって、例えば、ES細胞期でも胚でも除去されない該ネオマイシンカセットを除去するために、単一のヒトVH遺伝子セグメントを含有する操作された重鎖遺伝子座を保有するマウスを、FLPe欠失マウス系統へと繁殖させることができる(例えば、Rodriguez,C.I.ら、(2000)High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140参照)。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、マウスにおいて保持される。
子を遺伝子型解析し、免疫グロブリン重鎖レパートリーを特徴づけるために、内因性マウス免疫グロブリン定常遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトVH遺伝子セグメント、すべてのヒトDHセグメントおよびヒトJHセグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を選択する。
実施例2
限定されたヒト化IgH遺伝子座へのADAM遺伝子のリエンジニアリング
実施例2
限定されたヒト化IgH遺伝子座へのADAM遺伝子のリエンジニアリング
内因性可変領域遺伝子セグメント(VDJ)が置換および/または欠失されたヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスは、内因性ADAM6遺伝子の発現を欠く。特に、かかるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む雄マウスは、妊性の低減を示す。したがって、通常の交配法を使用して改変マウス系統を持続させるために、ヒト化(しかし制限的)重鎖遺伝子座を有するマウスにADAM6発現能をリエンジニアリングした。
ヒトVH1-69の限定されたIgH遺伝子座へのADAM6遺伝子のリエンジニアリング(図3)。すべてのヒトDHおよびJH遺伝子セグメントの上流にある単一のヒトVH1-69遺伝子セグメントを含有する限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、マウスADAM6aおよびADAM6b(配列番号77)をコードするゲノム断片を含有するように、BAC DNAを使用して相同組換えによってリエンジニアリングした。VELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作技術(上掲)によって、マウスおよびヒト配列を含有するBAC DNAの改変を含む一連の6の工程(これにより、マウス重鎖定常領域およびマウスADAM6遺伝子に隣接する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を含有する最終ターゲティングベクターが得られた)において、これを達成した。
第一に、マウスADAM6遺伝子周囲の独自位置の制限部位に様々な選択カセットをもたらす一連の3回の細菌性相同組換えによって、単一のVH遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座への挿入のために、マウスADAM6aおよびADAM6bをコードするマウスゲノム断片を調製した(図3、工程1~3)。第一の工程では、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一部を含有するマウスBAC DNAを、組換え部位に隣接するネオマイシンカセット(固有AsiSI制限部位を含有するようにこれを操作したもの)でターゲティングした。次いで、第二の工程では、マウスADAM6遺伝子およびネオマイシンカセットを含有する改変マウス断片をターゲティングして、マウスDHおよびJH遺伝子セグメントを欠失させ、選択遺伝子の5’に位置する固有AscI制限部位を含有するスペクチノマイシンカセットでそれらを置換した。第三の工程では、マウスADAM6遺伝子とスペクチノマイシンカセットとの間に位置するネオマイシンカセットを含有する二重改変マウス断片をターゲティングして、ネオマイシンカセットをハイグロマイシンカセットに交換した。単一のVH遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座に適合性ゲノム断片をライゲーションすることによって、ADAM6遺伝子を含有する改変マウスゲノム断片を挿入することができるように、これを行った。
工程4では、ヒトVH1-69遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメントおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座を、それぞれカセットの5’および3’の場所に固有I-CeuIおよびAscI制限部位を含有するスペクチノマイシンカセットによる細菌性相同組換えによって別々にターゲティングした(図3、左上)。この工程の後、限定されたヒト化重鎖遺伝子座、ネオマイシンおよびスペクチノマイシンカセットを含有する改変ゲノム断片、ならびにADAM6遺伝子、ハイグロマイシンおよびスペクチノマイシンカセットを含有する改変マウス断片をI-CeuIおよびAscI制限酵素で別々に消化して、ライゲーション用の改変ゲノム断片を作った(図3、中央)。工程5では、消化した適切なゲノム断片を精製および共にライゲーションして、単一のヒトVH遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメント、6のヒトJH遺伝子セグメント、ならびにネオマイシンおよびハイグロマイシン耐性を有するADAM6aおよびADAM6bをコードする組み込まれたマウスゲノム断片を含有するリエンジニアリングヒト化重鎖遺伝子座を得た。最後の工程(工程6)では、AsiSI消化によってハイグロマイシンカセットを欠失させ、続いて適合性末端を再ライゲーション(relegation)した。
この工程により、マウスADAM6aおよびADAM6b配列を限定されたヒト化重鎖遺伝子座に再挿入するための最終ターゲティングベクターであって、5’から3’に向けて、内因性重鎖遺伝子座の上流に約20kbのマウスゲノム配列を含有する5’ホモロジーアーム、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、約8.2kbのヒトVH1-69プロモーター、改変3’RSSを有するヒトVH1-69遺伝子セグメント、マウスADAM6aおよびADAM6b遺伝子(配列番号77)を含む約17711bpのマウスゲノム配列を含有するマウスゲノム断片、27のヒトDHおよび6のヒトJH遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片、ならびにイントロンエンハンサーおよびIgM定常領域遺伝子を含む内因性重鎖遺伝子座の下流に約8kbのマウスゲノム配列を含有する3’ホモロジーアームを含有する最終ターゲティングベクターを生産した(ヒトVH1-69/A6ターゲティングベクター、配列番号74;図3、下)。
ヒトVH1-2の限定されたIgH遺伝子座へのADAM6遺伝子のリエンジニアリング(図4)。
すべてのヒトDHおよびJH遺伝子セグメントの上流にある単一のヒトVH1-2遺伝子セグメントを含有する限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、マウスADAM6aおよびADAM6b(配列番号73)をコードするゲノム断片を含有するように、BAC
DNAを使用して相同組換えによってリエンジニアリングする。VELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作技術(上掲)によって、マウスおよびヒト配列を含有するBAC
DNAの改変を含む一連の工程(これにより、マウス重鎖定常領域およびマウスADAM6遺伝子に隣接する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を含有する最終ターゲティングベクターが得られた)において、これを達成した。
DNAを使用して相同組換えによってリエンジニアリングする。VELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作技術(上掲)によって、マウスおよびヒト配列を含有するBAC
DNAの改変を含む一連の工程(これにより、マウス重鎖定常領域およびマウスADAM6遺伝子に隣接する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を含有する最終ターゲティングベクターが得られた)において、これを達成した。
ハイグロマイシンカセットが5’に隣接しスペクチノマイシンカセットが3’に隣接する単一のヒトVH1-2遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメント、6のヒトJH遺伝子セグメント、マウス重鎖イントロンエンハンサー、およびマウスIgM定常領域を含有する改変ヒトBACクローン(実施例1において上記)を、マウスADAM6遺伝子をコードするゲノム断片を含有するように改変した。これは、本明細書ではオリゴ媒介等温アセンブリ(oligo-mediated isothermal assembly)と称される改良等温DNAアセンブリ法によって達成されるが、この方法は、Gibsonら、(2009,Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,Nature Methods 6(5):343-345)に記載されている方法に基づくものである。この改良法は、ライゲーションされる断片間の配列同一性を必要としない。代わりに、2つの断片を結合する働きをするオリゴによって配列同一性が付与される。さらに、上記オリゴは、上記断片の一方の末端に配列同一性を与える鋳型として働く。延長された断片により、第二の断片とのハイブリダイゼーションが可能になる。具体的には、オリゴ媒介等温アセンブリを用いて、20kbの遠位マウスIgHホモロジーアーム、マウスADAM6a遺伝子、Frt部位が隣接するネオマイシンカセット、およびマウスADAM6b遺伝子を含有するNotI-AscI断片でハイグロマイシンカセットを置換した。
簡単に言うと、限定されたヒトVH1-2重鎖遺伝子座を含有する改変ヒトBACクローン(図4、左上)をAsiSIおよびAscIで消化してハイグロマイシンカセットを除去し、マウスADAM6遺伝子を含有する改変マウスBAC(図4、右上)をNotIおよびAscIで消化して、5’マウスアームを含有する断片を除去し、ネオマイシンカセットに隣接するマウスADAM6遺伝子を放出させる。続いて、消化した2つのBAC断片を5’および3’結合(joiner)オリゴヌクレオチドと共に混合し、アセンブリ反応混合物(T5エキソヌクレアーゼ、Phusion DNAポリメラーゼ、Taq
DNAリガーゼ、10mM DTT、5%PEG8000(w/v)、1mM NAD、0.2mM dNTP、10mM MgCl2および100mM Tris-HCl)中、50℃で1時間インキュベートする。5’結合オリゴは、ヒトVH1-2を含有する改変ヒトBACクローンのAsiSI部位の5’配列と38bpのオーバーラップを含有し、ADAM6遺伝子を含有する改変マウスBACクローンのNotI部位および隣接3’配列と30bpのオーバーラップを含有する。3’結合オリゴは、ADAM6遺伝子、AscI部位を含有する改変マウスBACクローンのAscI部位の5’配列と26bpのオーバーラップを含有し、ヒトVH1-2を含有する改変ヒトBACクローンのAscI部位の3’配列と35bpのオーバーラップを含有する。アセンブリ反応物を大腸菌にトランスフォームし、カナマイシンおよびスペクチノマイシン選択を用いて正しい生成物を選択する。最終ターゲティングベクターを作るために、スペクチノマイシンカセットをPI-SceI消化によって除去し、続いて再ライゲーションする。
DNAリガーゼ、10mM DTT、5%PEG8000(w/v)、1mM NAD、0.2mM dNTP、10mM MgCl2および100mM Tris-HCl)中、50℃で1時間インキュベートする。5’結合オリゴは、ヒトVH1-2を含有する改変ヒトBACクローンのAsiSI部位の5’配列と38bpのオーバーラップを含有し、ADAM6遺伝子を含有する改変マウスBACクローンのNotI部位および隣接3’配列と30bpのオーバーラップを含有する。3’結合オリゴは、ADAM6遺伝子、AscI部位を含有する改変マウスBACクローンのAscI部位の5’配列と26bpのオーバーラップを含有し、ヒトVH1-2を含有する改変ヒトBACクローンのAscI部位の3’配列と35bpのオーバーラップを含有する。アセンブリ反応物を大腸菌にトランスフォームし、カナマイシンおよびスペクチノマイシン選択を用いて正しい生成物を選択する。最終ターゲティングベクターを作るために、スペクチノマイシンカセットをPI-SceI消化によって除去し、続いて再ライゲーションする。
最終ターゲティングベクターは、5’から3’に向けて、20kbの遠位マウスIgHホモロジーアーム、マウスADAM6a遺伝子、5’Frt部位、ネオマイシンカセット、3’Frt部位、マウスADAM6b遺伝子、約18kbのヒトゲノム断片、ヒトVH1-2遺伝子セグメント、約46.6kbのヒトゲノム断片、不活性化ヒトVH6-1遺伝子セグメント、27のヒトDH遺伝子セグメント、6のヒトJH遺伝子セグメント、ならびにマウスIgHイントロンエンハンサーおよびIgM定常領域を含有する8kbの3’マウスホモロジーアームを含有する(配列番号76)。
各最終ターゲティングベクター(上記)を使用して、欠失した内因性遺伝子座を含有するマウスES細胞をエレクトロポレートして、限定されたヒト化重鎖遺伝子座内にマウスADAM6aおよびADAM6b配列を含む、異所に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ES細胞を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノム断片を含有する陽性ES細胞を、TAQMAN(商標)プローブを使用する定量的PCRアッセイ(Lie
and Petropoulos,1998,Advances in quantitative PCR technology:5’nuclease assays,Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48)によって同定した。
and Petropoulos,1998,Advances in quantitative PCR technology:5’nuclease assays,Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48)によって同定した。
上に記載した標的ES細胞をドナーES細胞として使用し、VELOCIMOUSE(登録商標)マウスの操作方法(例えば、米国特許第7,6598,442号、同第7,576,259号および同第7,294,754号参照)により8細胞期マウス胚に導入した。マウスADAM6aおよびADAM6b配列を含む限られた数のヒト遺伝子セグメントおよび異所性マウスゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスを、上記限定されたヒト化重鎖遺伝子座およびヒト重鎖配列内のマウスADAM6aおよびADAM6b遺伝子の存在を検出する対立遺伝子アッセイ(Valenzuelaら、2003)の改良法を用いる遺伝子型解析によって同定した。
子を遺伝子型解析し、マウスADAM6aおよびADAM6b配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有する限定されたヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を、マウスADAM6遺伝子発現および妊性を特徴づけるために選択する。
Claims (34)
- 対象となる抗原に結合する抗体を生成する方法であって、
(a)単一の細胞内において、
免疫グロブリン軽鎖をコードする第1の核酸配列と、免疫グロブリン重鎖をコードする第2の核酸配列とを発現させるステップであって、
前記第1の核酸配列が、遺伝子改変マウスのB細胞から同定されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、前記遺伝子改変マウスが、対象となる前記抗原で免疫されており、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、対象となる前記抗原に結合可能であるヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードし、
前記遺伝子改変マウスが、そのゲノムにおいて、
(i)単一のヒトV H 遺伝子セグメント、1つ以上のヒトD H 遺伝子セグメント、及び1つ以上のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む非再構成ヒトゲノム核酸であって、前記単一のヒトV H 遺伝子セグメント、前記1つ以上のヒトD H 遺伝子セグメント、及び前記1つ以上のヒトJ H 遺伝子セグメントが、ヒト、マウス又はキメラヒト/マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される、非再構成ヒトゲノム核酸と、
(ii)雄マウスにおいて機能的であるマウスADAM6タンパク質をコードする核酸配列であって、前記マウスが雄マウスである場合、前記マウスADAM6タンパク質が発現され、それによって、前記雄マウスが妊性である、核酸配列と
を含み、
前記マウスのB細胞が、抗原への曝露に応答して抗体を発現し、各抗体が、2つの免疫グロブリン重鎖と対となる2つの免疫グロブリン軽鎖を含み、各重鎖は、前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントと同一であるかもしくは前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントの体細胞超変異型であるV H 遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変領域配列から発現されるヒト重鎖可変ドメインを含み、
前記第2の核酸配列が、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含み、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントと同一であるかもしくは前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントの体細胞超変異型であるV H 遺伝子セグメントを含む、発現ステップと、
(b)前記抗体を発現するために十分である条件下で前記細胞を維持させるステップと、
(c)前記抗体を単離するステップと
を含む、方法。 - 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 1-2、V H 1-69、V H 2-26、V H 2-70、V H 3-11、V H 3-23、V H 3-30、V H 3-53、V H 3-66、又は、それらの多型変異体である、請求項1に記載の方法。
- 免疫グロブリン軽鎖をコードする前記第1の核酸配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域を含み、及び/又は、免疫グロブリン重鎖をコードする前記第2の核酸配列が、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ADAM6タンパク質が、ADAM6aタンパク質及び/又はADAM6bタンパク質である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マウスADAM6タンパク質をコードする前記核酸が、前記非再構成ヒトゲノム核酸に隣接するように、前記マウスのゲノムに挿入されている、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非構成ヒトゲノム核酸及び前記マウスADAM6タンパク質をコードする前記核酸が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において存在する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非構成ヒトゲノム核酸が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において存在し、前記マウスADAM6タンパク質をコードする前記核酸が、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座以外の前記マウス生殖細胞系ゲノムにおける位置に挿入されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内因性重鎖可変遺伝子座は、少なくとも前記内因性V H 遺伝子セグメントを前記非再構成ヒトゲノム核酸で置き換えることによって、不活性化される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 1-2又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 1-69又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 2-26又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 2-70又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 3-11又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 3-23又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 3-30又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 3-53又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単一のヒトV H 遺伝子セグメントが、V H 3-66又はその多型変異体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マウスの前記ゲノムにおける前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マウスの前記ゲノムにおける前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、ヒトC H 1、ヒトヒンジ、ヒトC H 2、ヒトC H 3、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、請求項18に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトゲノム核酸が、ヒトV H 1-2遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 1-69遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 2-26遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 2-70遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 3-11遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 3-23遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 3-30遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 3-53遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非再構成ヒトのゲノム核酸が、ヒトV H 3-66遺伝子セグメント又はその多型変異体、27のヒトD H 遺伝子セグメント、及び6のヒトJ H 遺伝子セグメントを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マウスがその生殖細胞系ゲノムにおいて1つ以上のヒトVκ遺伝子セグメントと1つ以上のヒトJκ遺伝子セグメントとを含むように、前記マウスを遺伝子改変することをさらに含む、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上のヒトVκ遺伝子セグメント及び前記1つ以上のヒトJκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において存在する、請求項30に記載の方法。
- 前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが1つ以上のヒトVλ遺伝子セグメントと1つ以上のヒトJλ遺伝子セグメントとをさらに含む、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上のヒトVλ遺伝子セグメント、及び前記1つ以上のヒトJλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において存在する、請求項32に記載の方法。
- 前記マウスが雄マウスである、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法。
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