CN104540383A - 具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的人源化非人动物 - Google Patents

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Abstract

提供了具有受限制的免疫球蛋白重链基因座和编码一种或多种ADAM6蛋白的异位序列的小鼠、胚胎、细胞和组织，在多个实施方案中，描述了具有人源化内源免疫球蛋白重链基因座并且能够表达在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能性片段的小鼠。还提供了具有特征在于单个人VH基因区段、多个人DH基因区段和多个人JH基因区段的免疫球蛋白重链基因座并能够表达ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能性片段的小鼠、胚胎、细胞和组织。

Description

具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的人源化非人动物
领域
提供了包含减少的免疫球蛋白重链可变基因复杂度的遗传工程化非人动物，其中所述非人动物能够表达ADAM6蛋白或其功能性片段。描述了从受限制的数量的免疫球蛋白重链可变基因区段和/或其变体表达抗体的遗传工程化非人动物，其中所述非人动物缺乏功能性内源ADAM6基因但保留ADAM6功能，描述的遗传工程化非人动物包括包含内源免疫球蛋白重链可变(VH)区基因座的修饰的小鼠，所述修饰使得小鼠不能够制造功能性ADAM6蛋白并且导致生育能力的丢失。描述了包含特征在于受限制的数量的VH基因区段(例如单个免疫球蛋白VH区段，例如人VH 1-69基因区段或人VH 1-2基因区段)的免疫球蛋白VH基因座并且还包含ADAM6功能的经遗传修饰的小鼠，包括包含恢复雄性小鼠的生育能力的异位核酸序列的小鼠。
描述了包含编码功能性ADAM6基因座的核酸序列的经遗传修饰的小鼠、细胞、胚胎和组织，其中所述小鼠、细胞、胚胎和组织表达来源于单个人VH基因区段的免疫球蛋白重链。此外，小鼠、细胞、胚胎和组织缺乏功能性内源ADAM6基因但保留ADAM6功能，其特征在于编码ADAM6蛋白的异位核酸序列的存在。提供了在可育的非人动物中制备可用于结合病原体包括人病原体的抗体序列的方法。
背景
已将非人动物例如小鼠遗传工程化以成为用于制备用于基于抗体的人治疗剂的抗体序列的方法的有用工具。将具有人源化可变区基因座(例如VH、DH和JH基因，以及VL和JL基因)的小鼠用于产生用于抗体治疗剂的同源重链和轻链可变结构域。产生具有同源重链和轻链的全长人抗体的小鼠在本领域是已知的。为了产生这些小鼠，需要使内源的小鼠免疫球蛋白基因失去功能以便随机整合的全长人转基因会在小鼠中用作免疫球蛋白的表达的库。这样的小鼠可制备适合用作人治疗剂的人抗体，但这些小鼠显示出其免疫系统的实质性问题。这些问题导致若干个实验障碍，例如，小鼠不能实际用于产生充分多样化的抗体库，需要使用广泛的再工程化修复，可能因人和小鼠元件之间的不相容性而提供次优的克隆选择过程，和需要真正用于制备人治疗剂的人可变序列的大量和多样化群体的不可靠的来源。
基于针对选择的抗原所期望的特性来工程化人抗体治疗剂。利用选择的抗原免疫人源化小鼠，并将人源化小鼠用于产生抗体群以从所述抗体群鉴定具有期望的结合特性的高亲和性的同源重链和轻链可变结构域。一些人源化小鼠，例如仅在内源小鼠基因座的可变区具有人源化的小鼠，产生在性质和数量上与野生型小鼠B细胞群相似的B细胞群。因此，在这些小鼠中可得到非常大量且多样化的B细胞群，这反映了大量不同的免疫球蛋白重排，从所述B细胞群筛选抗体以鉴定具有最期望的特性的重链和轻链可变结构域。
然而，并非所有抗原引起显示来自可变(V)区段的广泛选择的非常大量的重排的免疫应答。换句话说，针对某些抗原的人体液免疫反应是明显受限制的。该限制反映在仅表达以足够高的亲和性和特异性结合该特定抗原的某些V区段的B细胞的克隆选择中。一些这样的抗原是临床上重要的，即许多是广为人知的人病原体。产生了如下推测：在人免疫应答中表达的V区段是这样的V区段，其与人D和人J区段组合而比未在针对该抗原的人抗体应答中被观察到的经随机选择的V区段更可能地产生有用的高亲和性抗体。
假定自然选择在人与病原体之间数千年的经验后已选择了最高效的基础或根据，从该基础或根据设计其最有效的用于中和病原体的武器——经选择的V基因区段。本领域存在对结合和/或中和抗原(如上文所讨论的病原体)的优良抗体的需要。需要更快速地从经选择的V基因区段产生有用的序列，包括多态的和/或体细胞突变的经选择的V基因区段，以及需要更快速地产生具有V基因区段与不同的D和J基因区段的重排(包括其体细胞突变形式)，特别是具有独特而有用的CDR3区的重排的有用的B细胞群。存在对于改良的生物系统例如非人动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的需要，所述生物系统可从经选择的V基因区段产生增加的量和多样性的治疗上有用的抗体可变区序列(例如可在现有的经修饰的动物中实现的)，而同时减少或消除可因遗传修饰而引起的有害改变。存在对改良的生物系统的需要，所述生物系统经工程化而具有定型的用于克隆地选择来源于受限制的经选择的V基因区段的抗体可变序列(包括但不限于同源的人重链和轻链可变结构域)的体液免疫系统，所述生物系统可用于生产针对选择的抗原(包括某些人病原体)的基于人抗体的治疗剂。在本领域中仍然存在对于制备改良的经遗传修饰的小鼠的需要，所述经遗传修饰的小鼠可用于产生定向消除对人类群体带来负担的病原体的免疫球蛋白序列，包括人抗体序列。
在本领域中存在对于能够中和病毒抗原例如HIV和HCV的治疗性抗体的需要，所述治疗性抗体包括包含来源于单个人可变基因区段的重链的抗原特异性抗体。还存在对于用于制备有用的抗体的其它方法和非人动物的需要，包括包含来源于单个人VH区段并且具有不同组的CDR序列的重链(包括与同源人轻链表达的重链)库的抗体，以及包括因人基因组序列至非人动物的基因组中的插入而引起的不利效应的恢复。需要用于选择CDR以用于基于免疫球蛋白的结合蛋白的方法，所述方法提供从其进行选择的结合蛋白的增加的多样性，和免疫球蛋白可变结构域的增加的多样性，包括用于产生例如用于制备人治疗剂的经体细胞突变和经克隆选择的免疫球蛋白可变结构域的组合物和方法。
概述
提供了经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，其包含受限制的量的不同的重链可变区基因区段(即V基因、VH基因、VH基因区段或V基因区段)，例如不多于1个、2个或3个不同的V基因；或不多于1个V基因区段家族成员例如以单个拷贝或以多个拷贝存在和/或包含一个或多个多态性，并且在多个实施方案中所述基因座缺乏编码内源的功能性ADAM6蛋白的序列。
提供了能够重排和形成编码重链可变结构域的基因的基因座，所述重链可变结构域来源于受限制的重链V基因库，例如，所述受限制的重链V基因库是单个VH基因区段或选自单个VH基因区段的多个多态变体，其中在多个实施方案中，所述基因座缺乏内源的功能性ADAM6基因或其功能性片段。
提供了包括缺乏内源的功能性ADAM6基因并包含人免疫球蛋白序列的基因座的经修饰的免疫球蛋白基因座，例如可操作地连接至人或(或人/非人嵌合的)非人免疫球蛋白恒定序列(并与例如D和/或J区段可操作地连接)的人V区段。提供了包含多个拷贝的单个VH基因区段(包括其中一个或多个拷贝包含多态变体)和编码在非人动物中具有功能的ADAM6蛋白或其片段的异位核苷酸序列的经修饰的基因座。提供了包含可操作地连接至一个或多个D区段和一个或多个J区段、可操作地连接至非人免疫球蛋白恒定序列例如小鼠或大鼠或人序列的单个VH区段的多个拷贝的经修饰的基因座。还提供了包含这样的人源化基因座的非人动物，其中所述非人动物具有野生型生育能力。
提供了包含免疫球蛋白重链可变基因座(例如一个在内源非人动物重链可变基因座的转基因或在该基因座作为插入物或置换物)的非人动物，所述基因座包含可操作地连接至D和/或J基因区段的单个VH区段。在多个实施方案中，单个VH基因区段在非人动物的内源免疫球蛋白重链可变基因座可操作地连接至一个或多个D和/或一个或多个J基因区段。在多个实施方案中，非人动物还包含编码在包含经修饰的重链基因座的雄性非人动物中具有功能的ADAM6蛋白或其同源物或直系同源物的异位核苷酸序列。在多个实施方案中，异位核苷酸序列与单个VH区段、D基因区段或J基因区段是连续的。在多个实施方案中，异位核苷酸序列与非人动物的基因组中的非免疫球蛋白序列是连续的。在一个实施方案中，异位核苷酸序列在与经修饰的重链基因座相同的染色体上。在一个实施方案中，异位核苷酸序列在与经修饰的重链基因座不同的染色体上。
提供了非人动物，所述非人动物在其免疫球蛋白重链可变区基因座上经修饰以删除所有的或基本上所有的(例如所有的功能性区段，或几乎所有的功能性区段)内源免疫球蛋白VH区段，并且所述非人动物包含在非人动物的内源免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地连接至D和J区段或J区段的人VH1-69区段(或人VH1-2区段)。还提供了包含这样的基因座和缺乏内源ADAM6基因的非人动物。
提供了用于在非人动物中制备人免疫球蛋白序列的方法。在多个实施方案中，人免疫球蛋白序列来源于基本上由单个人V区段例如VH1-69或VH1-2和一个或多个D和J区段或一个或多个J区段组成的免疫球蛋白V序列库。提供了用于在非人动物、组织和细胞中制备人免疫球蛋白序列的方法，其中所述人免疫球蛋白序列结合病原体。
在一个方面，提供了用于制备包含导致非功能性内源小鼠ADAM6蛋白或ADAM6基因(例如内源ADAM6基因的敲除或删除)的修饰的小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，其中被制备的小鼠包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段的核酸序列。在一个实施方案中，小鼠包含编码啮齿类动物ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能性片段的异位核苷酸序列；在特定实施方案中，啮齿类动物ADAM6蛋白是小鼠ADAM6蛋白。
在一个方面，提供了用于制备包含内源小鼠免疫球蛋白基因座的修饰的小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，其中被制备的小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段。在一个实施方案中，内源小鼠免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座，并且修饰减弱或消除雄性小鼠的细胞或组织的ADAM6活性。在一个实施方案中，内源小鼠免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座，并且修饰保持或维持雄性小鼠的细胞或组织的ADAM6活性。
在一个方面，提供了经修饰的免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含在V区段的同一性方面受到限制的重链V区段库并且包含一个或多个D区段和一个或多个J区段或一个或多个J区段。在一个实施方案中，重链V区段是人区段。在一个实施方案中，经修饰的免疫球蛋白重链基因座缺乏内源ADAM6基因。在一个实施方案中，经修饰的重链基因座还包含编码ADAM6蛋白的核苷酸序列。在特定实施方案中，核苷酸序列在经修饰的免疫球蛋白重链基因座上与V、D和/或J基因区段是连续的。
在一个实施方案中，经修饰的基因座是非人基因座。在一个实施方案中，非人基因座被至少一个人免疫球蛋白序列修饰。在一个实施方案中，非人基因座被至少一个人免疫球蛋白序列和编码ADAM6蛋白的序列修饰。
在一个实施方案中，限制至一个V区段家族成员。在一个实施方案中，所述一个V区段家族成员以两个或更多个拷贝存在。在一个实施方案中，所述一个V区段家族成员存在为两个或更多个变体(例如V区段家族成员的两个或更多个多态形式)。在一个实施方案中，一个V区段是人V区段家族成员。在一个实施方案中，一个V区段家族成员以在人群体中针对该变体所观察到的变体的数量存在。在一个实施方案中，V区段家族成员选自表1。在一个实施方案中，V区段家族成员以如1个等位基因至表1的右栏中显示的等位基因的数量的等位基因的数量所显示(针对每一种V区段)的变体的数量存在。
在一个方面，提供了包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或功能性片段的异位核苷酸序列的小鼠；还提供了包含编码小鼠ADAM6或直系同源物或其同源物或片段的内源核苷酸序列和重链免疫球蛋白基因座的至少一个遗传修饰的小鼠。在一个实施方案中，编码小鼠ADAM6或直系同源物或其同源物或片段的内源核苷酸序列位于相较于野生型小鼠的内源ADAM6基因异位的位置。
在一个方面，提供了用于制备包含内源小鼠免疫球蛋白基因座的修饰的小鼠的方法，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段。
在一个方面，提供了用于制备包含免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠的方法，其中所述方法的应用导致包含经修饰的免疫球蛋白重链基因座(或其删除)的雄性小鼠，并且所述雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方案中，雄性小鼠能够产生可从小鼠子宫运输通过小鼠输卵管以使小鼠卵细胞受精的精子。
在一个方面，提供了用于制备包含免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠的方法，其中所述方法的应用导致包含经修饰的免疫球蛋白重链基因座(或其删除)的雄性小鼠，所述雄性小鼠显示生育能力的减弱，并且小鼠包含全部或部分恢复生育能力的减弱的遗传修饰。在多个实施方案中，生育能力的减弱的特征在于雄性小鼠的精子不能够从小鼠子宫迁移通过小鼠输卵管以使小鼠卵细胞受精。在多个实施方案中，生育能力的减弱的特征在于精子显示体内迁移缺陷。在多个实施方案中，全部或部分恢复生育能力的减弱的遗传修饰是编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6基因或直系同源物或其同源物或片段的核酸序列。
在一个实施方案中，遗传修饰包括利用另一个物种(例如非小鼠物种)的受限制的数量例如不超过一个、两个或三个不同的重链可变(VH)基因区段、一个或多个重链多样性(DH)基因区段和一个或多个重链连接(JH)基因区段来置换内源免疫球蛋白重链可变基因座。在一个实施方案中，遗传修饰包括单个直系同源免疫球蛋白VH基因区段、至少一个DH基因区段和至少一个JH基因区段至内源免疫球蛋白重链可变基因座的插入。在特定实施方案中，物种是人。在一个实施方案中，遗传修饰包括内源免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分的删除，其中所述删除导致内源ADAM6功能的丢失。在特定实施方案中，内源ADAM6功能的丢失与雄性小鼠中生育能力的减弱相关。在一个实施方案中，遗传修饰包括内源免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分的失活，其中删除不导致内源ADAM6功能的丢失。失活可包括一个或多个内源基因区段的置换或删除，所述置换或删除导致基本上不能够重排以编码包含内源基因区段的抗体的重链的内源免疫球蛋白重链基因座。失活可包括使得内源免疫球蛋白重链基因座不能够重排以编码抗体的重链的其它修饰，其中所述修饰不包括内源基因区段的置换或删除。示例性修饰包括由分子技术例如使用位点特异性重组位点的精确置换(例如Cre-lox技术)介导的染色体倒位和/或易位。
在一个实施方案中，遗传修饰包括将可操作地连接至一个或多个恒定区序列(例如IgM和/或IgG基因)的包含另一个物种(例如非小鼠物种)的受限制的数量例如不超过一个、两个或三个不同的重链可变(VH)基因区段、一个或多个重链多样性(DH)基因区段和一个或多个重链连接(JH)基因区段的DNA片段插入小鼠的基因组。在一个实施方案中，DNA片段能够经历重排以形成编码抗体的重链的序列。在一个实施方案中，遗传修饰包括单个直系同源免疫球蛋白VH基因区段、至少一个DH基因区段和至少一个JH基因区段至小鼠的基因组中的插入。在特定实施方案中，物种是人。在一个实施方案中，遗传修饰包括内源免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分的删除以使得内源免疫球蛋白重链基因座不具有功能，其中所述删除还导致内源ADAM6功能的丢失。在特定实施方案中，内源ADAM6功能的丢失与雄性小鼠中生育能力的减弱相关。
在一个方面，提供了包含修饰的小鼠，所述修饰减弱或消除来自内源ADAM6等位基因的小鼠ADAM6表达以使得具有修饰的雄性小鼠因内源ADAM6功能的减弱或消除而显示减弱的生育能力(例如高度减弱的通过交配产生后代的能力)或基本上是不能生育的，其中小鼠还包含异位的ADAM6序列或其直系同源物或同源物或功能性片段。在一个方面，减弱或消除小鼠ADAM6表达的修饰是小鼠免疫球蛋白基因座中的修饰(例如插入、删除、置换等)。在一个实施方案中，免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座。
在一个实施方案中，ADAM6功能的减弱或丢失包括小鼠不能够或基本上不能够产生可从小鼠子宫运动通过小鼠输卵管以使小鼠卵细胞受精的精子。在特定实施方案中，所产生的小鼠精液体积中至少约95％、96％、97％、98％或99％的精子细胞不能够在体内于交配后穿越通过输卵管并使小鼠卵子受精。
在一个实施方案中，ADAM6功能的减弱或丢失包括不能够或基本上不能够在小鼠的精子细胞的表面上形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物。在一个实施方案中，ADAM6功能的丢失包括基本上不能够通过与雌性小鼠交配使小鼠卵细胞受精。
在一个方面，提供了缺乏功能性内源ADAM6基因并包含对小鼠赋予ADAM6功能性的蛋白(或编码蛋白的异位核苷酸序列)的小鼠。在一个实施方案中，小鼠是雄性小鼠并且功能性包括相较于缺乏功能性内源ADAM6基因的小鼠增强的生育能力。
在一个实施方案中，蛋白由位于小鼠的种系中的免疫球蛋白基因座内的基因组序列编码。在特定实施方案中，免疫球蛋白基因座是重链基因座。在另一个特定的实施方案中，重链基因座包含单个人VH、至少一个人DH和至少一个人JH基因区段。在另一个特定的实施方案中，重链基因座包含一个人VH基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段。在一个实施方案中，异位蛋白由位于小鼠的种系中的非免疫球蛋白基因座内的基因组序列编码。在一个实施方案中，非免疫球蛋白基因座是转录活性基因座。在特定实施方案中，转录活性基因座是ROSA26基因座。在特定实施方案中，转录活性基因座与组织特异性表达相关。在一个实施方案中，组织特异性表达存在于生殖组织中。在一个实施方案中，蛋白由随机插入小鼠的种系中的基因组序列编码。
在一个实施方案中，小鼠包含人或嵌合的人/小鼠或嵌合的人/大鼠轻链(例如人可变区、小鼠或大鼠恒定区)和嵌合的人可变区/小鼠或大鼠恒定重链。在特定实施方案中，小鼠包含具有可操作地连接至转录活性启动子例如ROSA26启动子的嵌合的人可变区/大鼠或小鼠恒定轻链基因的转基因。在其它特定的实施方案中，嵌合的人/小鼠或大鼠轻链转基因包含在小鼠的种系中重排的人轻链可变区序列。
在一个实施方案中，异位核苷酸序列位于小鼠的种系中的免疫球蛋白基因座内。在特定实施方案中，免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方案中，重链基因座包含单个人VH、至少一个人DH和至少一个人JH基因区段。在特定实施方案中，重链基因座包含单个人VH、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段。在一个实施方案中，异位核苷酸序列位于小鼠的种系中的非免疫球蛋白基因座内。在一个实施方案中，非免疫球蛋白基因座是转录活性基因座。在特定实施方案中，转录活性基因座是ROSA26基因座。在一个实施方案中，异位核苷酸序列位于随机插入小鼠的种系中的位置。
在一个方面，提供了缺乏功能性内源ADAM6基因的小鼠，其中所述小鼠包含补充小鼠ADAM6功能的丢失的异位核苷酸序列。在一个实施方案中，异位核苷酸序列赋予小鼠产生可与对应的包含功能性内源ADAM6基因的野生型小鼠相比较的后代的能力。在一个实施方案中，序列赋予小鼠在小鼠的精子细胞的表面上形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物的能力。在一个实施方案中，序列赋予小鼠从小鼠子宫运动通过小鼠输卵管至小鼠卵子以使卵子受精的能力。
在一个实施方案中，缺乏功能性内源ADAM6基因和包含异位核苷酸序列的小鼠产生相同年龄和品系的野生型小鼠在六个月时期中产生的胚仔数量的至少约50％、60％、70％、80％或90％。
在一个实施方案中，缺乏功能性内源ADAM6基因和包含异位核苷酸序列的小鼠当在六个月的时期内繁殖时，比在基本上相同的时期内和在基本上相同的条件下繁殖的相同年龄和相同或相似品系的缺乏功能性内源ADAM6基因和缺乏异位核苷酸序列的小鼠，产生至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约4倍、约6倍、约7倍、约8倍或约10倍或更多的后代。
在一个实施方案中，缺乏功能性内源ADAM6基因和包含异位核苷酸序列的小鼠在4或6个月繁殖期内，比繁殖相同时期的缺乏功能性内源ADAM6基因和缺乏异位核苷酸序列的小鼠，产生平均的至少约2倍、3倍或4倍更高数量的幼崽/窝。
在一个实施方案中，缺乏功能性内源ADAM6基因和包含异位核苷酸序列的小鼠是雄性小鼠，并且所述雄性小鼠产生这样的精子：当在交配后约5-6小时从输卵管回收时，所述精子反映了比缺乏功能性内源ADAM6基因和缺乏异位核苷酸序列的小鼠，至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、100倍、110倍或120倍或更多的输卵管迁移。
在一个实施方案中，缺乏功能性内源ADAM6基因和包含异位核苷酸序列的小鼠当与雌性小鼠交配时，产生能够以约等于来自野生型小鼠的精子的效率在约6小时内穿过子宫和进入并穿过输卵管的精子。
在一个实施方案中，缺乏功能性内源ADAM6基因和包含异位核苷酸序列的小鼠在可比较的时期内比缺乏功能性ADAM6基因和缺乏异位核苷酸序列的小鼠，产生约1.5倍、约2倍、约3倍或约4倍或更多的胚仔。
在一个方面，提供了在其种系中包含编码免疫球蛋白蛋白质的非小鼠核酸序列的小鼠，其中非小鼠免疫球蛋白序列包含小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段的插入。在一个实施方案中，非小鼠免疫球蛋白序列包含人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，序列包含人免疫球蛋白重链序列。在一个实施方案中，序列包含人免疫球蛋白轻链序列。在一个实施方案中，序列包含单个VH基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段；在一个实施方案中，序列包含一个或多个VL基因区段和一个或多个JL基因区段。在一个实施方案中，单个VH、一个或多个DH和一个或多个JH基因区段或一个或多个VL和JL基因区段是未重排的。在一个实施方案中，单个VH、一个或多个DH和一个或多个JH基因区段或一个或多个VL和JL基因区段是经重排的。在一个实施方案中，在单个VH、一个或多个DH和一个或多个JH基因区段或一个或多个VL和JL基因区段的重排后，小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，在重排后，小鼠在其基因组中包含至少两个编码小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，在重排后，小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方案中，小鼠在B细胞中包含ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方案中，小鼠在非B细胞中包含ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段。
在一个方面，提供了从内源小鼠免疫球蛋白重链基因座表达人免疫球蛋白重链可变区或其功能性片段的小鼠，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。在一个实施方案中，人免疫球蛋白重链可变区包含多态人VH基因区段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白重链可变区包含人VH1-69基因区段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白重链可变区包含人VH1-2基因区段。
在一个实施方案中，雄性小鼠在内源ADAM6基因座上包含单个未经修饰的内源ADAM6等位基因或其直系同源物或同源物或功能性片段。
在一个实施方案中，雄性小鼠包含编码赋予ADAM6功能的蛋白的异位的小鼠ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能性片段。
在一个实施方案中，雄性小鼠在小鼠基因组中接近内源小鼠ADAM6等位基因的位置的位置(例如V基因区段序列的3’和起始D基因区段的5’)上包含ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能性片段。在特定实施方案中，雄性小鼠在人VH基因区段的3’和人DH基因区段的5’包含ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能性片段。在另一个特定的实施方案中，雄性小鼠在人VH基因区段的5’包含ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能性片段。在另一个特定的实施方案中，雄性小鼠在包含单个人VH基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段的嵌合重链基因座的5’包含ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方案中，嵌合重链基因座包含人VH1-69基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段。在一个实施方案中，嵌合重链基因座包含人VH1-2基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段。
在一个实施方案中，雄性小鼠包含侧接于编码免疫球蛋白可变基因区段或免疫球蛋白多样性基因区段的核酸序列的上游、下游或上游和下游(针对ADAM6序列的转录方向而言)的ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能性片段。在特定实施方案中，免疫球蛋白可变基因区段是人基因区段。在一个实施方案中，免疫球蛋白可变基因区段是人基因区段，并且编码在小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或直系同源物或其同源物或片段的序列在人VH基因区段之间；在一个实施方案中，小鼠包含一个人VH基因区段，并且序列在VH基因区段的5’位置处；在一个实施方案中，序列在VH基因区段的3’位置处；在一个实施方案中，序列在VH基因区段与第一DH基因区段之间的位置处。在特定实施方案中，DH基因区段是第一DH基因区段。在一个实施方案中，小鼠包含两个VH基因区段，并且序列在两个VH基因区段之间的位置处；在一个实施方案中，序列在VH基因区段与DH基因区段之间的位置处。在特定实施方案中，DH基因区段是第一DH基因区段。
在一个实施方案中，雄性小鼠包含位于内源免疫球蛋白基因座中与野生型雄性小鼠中相同或基本上相同的位置的ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能性片段。在特定实施方案中，内源基因座不能够编码抗体的重链。在特定实施方案中，内源基因座位于雄性小鼠的基因组中使得其不能够编码抗体的重链的位置。在多个实施方案中，雄性小鼠包含位于与人免疫球蛋白基因区段相同的染色体上的ADAM6序列并且ADAM6序列编码功能性ADAM6蛋白。
在一个方面，提供了在其种系中包含非功能性内源ADAM6基因或内源ADAM6基因的删除的雄性小鼠；其中所述小鼠的精子细胞能够通过雌性小鼠的输卵管和使卵细胞受精。在一个实施方案中，小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6序列或其直系同源物或同源物或功能性片段的染色体外的拷贝。在一个实施方案中，小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的异位的小鼠ADAM6序列或其直系同源物或同源物或功能性片段。
在一个方面，提供了包含减弱内源小鼠ADAM6功能的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含由具有全部或部分功能的内源的未经修饰的等位基因(例如杂合子)或由来自编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列的表达所提供的至少一些ADAM6功能性。
在一个实施方案中，小鼠包含相较于缺乏功能性ADAM6的雄性小鼠，足以赋予雄性小鼠通过交配产生后代的能力的ADAM6功能。在一个实施方案中，ADAM6功能由编码小鼠ADAM6或其同源物或直系同源物或功能性片段的异位核苷酸序列的存在赋予。在一个实施方案中，ADAM6功能由存在于内源免疫球蛋白基因座中的内源ADAM6基因赋予，其中所述内源免疫球蛋白基因座不能够编码抗体的重链。在雄性小鼠中具有功能的ADAM6同源物或其直系同源物或片段包括全部或部分恢复在缺乏足够的内源小鼠ADAM6活性的雄性小鼠中观察到的产生后代的能力的丢失例如在ADAM6敲除小鼠中观察到的能力的丢失的ADAM6同源物或其直系同源物或片段。在这个意义上，ADAM6敲除小鼠包括包含内源基因座或其片段但其不具有功能，即根本不表达ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)或以不足以支持基本上正常的野生型雄性小鼠的产生后代的能力的水平表达ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)的小鼠。功能的丢失可以是因例如基因座的结构基因中的(即ADAM6a或ADAM6b编码区中的)或基因座的调节区中的(例如，ADAM6a基因的5’或ADAM6a或ADAM6b编码区的3’的序列中的，其中所述序列全部或部分地控制ADAM6基因的转录、ADAM6RNA的表达或ADAM6蛋白的表达)修饰而引起的。在多个实施方案中，在雄性小鼠中具有功能的直系同源物或其同源物或片段是使得雄性小鼠的精子(或雄性小鼠的精液中的大部分精子细胞)能够通过小鼠输卵管并使小鼠卵子受精的直系同源物或其同源物或片段。
在一个实施方案中，表达人免疫球蛋白可变区或其功能性片段的雄性小鼠包含足以赋予雄性小鼠通过与雌性小鼠交配以产生后代的能力的ADAM6活性，并且在一个实施方案中，当与雌性小鼠交配时，雄性小鼠显示出在一个实施方案中与具有一个或两个内源的未经修饰的ADAM6等位基因的小鼠的产生后代的能力大约相同的、在一个实施方案中其至少25％的、在一个实施方案中其至少30％的、在一个实施方案中其至少40％的、在一个实施方案中其至少50％的、在一个实施方案中其至少60％的、在一个实施方案中其至少70％的、在一个实施方案中其至少80％的和在一个实施方案中其至少90％的产生后代的能力。
在一个实施方案中，雄性小鼠表达足以使得来自雄性小鼠的精子细胞能够通过雌性小鼠输卵管并使小鼠卵细胞受精的ADAM6(或其直系同源物或同源物或功能性片段)。
在一个实施方案中，ADAM6功能性由与小鼠染色体序列连续的核酸序列(例如，核酸随机地整合入小鼠染色体中；或位于特定位置，例如通过将核酸靶向至特定位置，例如通过位点特异性重组酶介导的(例如Cre-介导的)插入或同源重组)赋予。在一个实施方案中，ADAM6序列存在于与小鼠的染色体不同的核酸之上(例如，ADAM6序列存在于附加体上，即染色体外地存在，例如存在于表达构建体、载体、YAC、转染色体(transchromosome)等中)。
在一个方面，提供了包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的经遗传修饰的小鼠和细胞，其中所述小鼠表达至少部分的免疫球蛋白重链序列，例如至少部分的人序列，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。在一个实施方案中，修饰减弱或消除小鼠的ADAM6活性。在一个实施方案中，小鼠被修饰以便编码ADAM6活性的两个等位基因不存在或表达基本上无法用于支持雄性小鼠中的正常交配的ADAM6。在一个实施方案中，小鼠还包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方案中，修饰维持小鼠的ADAM6活性并使得内源免疫球蛋白重链基因座不能够编码抗体的重链。在特定实施方案中，修饰包括使得内源免疫球蛋白重链基因座不能够编码抗体的重链的染色体倒位和/或易位。
在一个方面，提供了包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的经遗传修饰的小鼠和细胞，其中所述修饰减弱或消除从基因座的ADAM6序列表达的ADAM6活性，并且其中所述小鼠包含ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能性片段。在多个实施方案中，ADAM6蛋白或其片段由异位ADAM6序列编码。在多个实施方案中，ADAM6蛋白或其片段从内源ADAM6等位基因表达。在多个实施方案中，小鼠包含第一免疫球蛋白重链等位基因，所述第一免疫球蛋白重链等位基因包含减弱或消除来自第一免疫球蛋白重链等位基因的功能性ADAM6的表达的第一修饰，并且小鼠包含第二免疫球蛋白重链等位基因，所述第二免疫球蛋白重链等位基因包含不消除或基本上不减弱来自第二免疫球蛋白重链等位基因的功能性ADAM6的表达的第二修饰。
在一个实施方案中，第二修饰位于最后的小鼠V基因区段的3’(针对小鼠V基因区段的转录方向性而言)和位于小鼠(或嵌合的人/小鼠)免疫球蛋白重链恒定基因或其片段(例如，编码人和/或小鼠CH1和/或铰链和/或CH2和/或CH3的核酸序列)的5’(针对恒定序列的转录方向性而言)。
在一个实施方案中，修饰是在编码第一ADAM6等位基因的第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因上的，并且ADAM6功能是由编码功能性ADAM6的第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上的内源ADAM6的表达所引起的，其中第二免疫球蛋白重链等位基因包含V、D和/或J基因区段的至少一个修饰。在特定实施方案中，V、D和/或J基因区段的至少一个修饰是删除、利用单个人VH、一个或多个DH和/或一个或多个JH基因区段的置换、利用骆驼科VH(或VHH)、DH和/或JH基因区段的置换、利用人源化或骆驼科化的VH(或VHH)、DH和/或JH基因区段的置换、利用轻链序列对重链序列的置换及其组合。在一个实施方案中，至少一个修饰是重链基因座上一个或多个VH、DH和/或JH基因区段的删除以及利用一个或多个VL和/或JL基因区段(例如人VL和/或JL基因区段)的置换。
在一个实施方案中，修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上的，并且ADAM6功能是由小鼠的种系中的非免疫球蛋白基因座上的异位ADAM6的表达所引起的。在特定实施方案中，非免疫球蛋白基因座是ROSA26基因座。在特定实施方案中，非免疫球蛋白基因座是在生殖组织中具有转录活性的。
在一个实施方案中，修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上的，并且ADAM6功能是由第一免疫球蛋白重链等位基因上的异位ADAM6的表达所引起的。在一个实施方案中，修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上的，并且ADAM6功能是由第二免疫球蛋白重链等位基因上的异位ADAM6的表达所引起的。
在一个方面，提供了包含ADAM6的杂合或纯合敲除的小鼠。在一个实施方案中，小鼠还包含经修饰的免疫球蛋白序列，所述经修饰的免疫球蛋白序列是人或人源化的免疫球蛋白序列或骆驼科或骆驼科化的人或小鼠的免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，经修饰的免疫球蛋白序列存在于内源小鼠重链免疫球蛋白基因座上。在一个实施方案中，经修饰的免疫球蛋白序列包含内源小鼠免疫球蛋白重链基因座上的人重链可变基因序列。在一个实施方案中，人重链可变基因序列置换内源小鼠免疫球蛋白重链基因座上的内源小鼠重链可变序列。
在一个方面，提供了不能够从内源小鼠ADAM6基因座表达功能性内源小鼠ADAM6的小鼠。在一个实施方案中，小鼠包含编码在小鼠中具有功能的ADAM6或其功能性片段的异位核酸序列。在特定实施方案中，异位核酸序列编码恢复由针对ADAM6敲除为纯合的雄性小鼠所显示的产生后代的能力的丢失的蛋白。在特定实施方案中，异位核酸序列编码小鼠ADAM6蛋白。
在一个方面，提供了缺乏功能性内源ADAM6基因座和包含给小鼠赋予ADAM6功能的异位核酸序列的小鼠。在一个实施方案中，核酸序列包含内源小鼠ADAM6序列或其功能性片段。在一个实施方案中，内源小鼠ADAM6序列包含在野生型小鼠中位于最3’的小鼠免疫球蛋白重链V基因区段(VH)与最5’的小鼠免疫球蛋白重链D基因区段(DH)之间的ADAM6a-和ADAM6b-编码序列。
在一个实施方案中，核酸序列包含编码小鼠ADAM6a或其功能性片段的序列和/或编码小鼠ADAM6b或其功能性片段的序列，其中ADAM6a和/或ADAM6b或其功能性片段可操作地连接至启动子。在一个实施方案中，启动子是人启动子。在一个实施方案中，启动子是小鼠ADAM6启动子。在特定实施方案中，ADAM6启动子包含位于最靠近小鼠最5’的DH基因区段的第一ADAM6基因的第一密码子与最5’的DH基因区段的重组信号序列之间的序列，其中5’是针对小鼠免疫球蛋白基因的转录方向而指出的。在一个实施方案中，启动子是病毒启动子。在特定实施方案中，病毒启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方案中，启动子是泛素启动子。
在一个实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一个实施方案中，诱导型启动子调节非生殖组织中的表达。在一个实施方案中，诱导型启动子调节生殖组织中的表达。在特定实施方案中，诱导型启动子在生殖组织中发育性地调节小鼠ADAM6a和/或ADAM6b序列或其功能性片段的表达。
在一个实施方案中，小鼠ADAM6a和/或ADAM6b选自SEQ IDNO:1的ADAM6a和/或序列SEQ ID NO:2的ADAM6b。
在一个实施方案中，小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:3的启动子。在特定实施方案中，小鼠ADAM6启动子包含ADAM6a的第一密码子的直接上游(针对ADAM6a的转录方向而言)的SEQ ID NO:3并延伸至ADAM6编码区上游的SEQ ID NO:3的末端的核酸序列。在另一个特定的实施方案中，ADAM6启动子是从ADAM6a的起始密码子上游的约5至约20个核苷酸内延伸至ADAM6a的起始密码子上游的约0.5kb、1kb、2kb或3kb或更多的片段。
在一个实施方案中，小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:73的启动子。在特定实施方案中，小鼠ADAM6启动子包含ADAM6a的第一密码子的直接上游(针对ADAM6a的转录方向而言)的SEQ ID NO:73并延伸至ADAM6编码区上游的SEQ ID NO:73的末端的核酸序列。在另一个特定的实施方案中，ADAM6启动子是从ADAM6a的起始密码子上游的约5至约20个核苷酸内延伸至ADAM6a的起始密码子上游的约0.5kb、1kb、2kb或3kb或更多的片段。
在一个实施方案中，小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:77的启动子。在特定实施方案中，小鼠ADAM6启动子包含ADAM6a的第一密码子的直接上游(针对ADAM6a的转录方向而言)的SEQ ID NO:77并延伸至ADAM6编码区上游的SEQ ID NO:77的末端的核酸序列。在另一个特定的实施方案中，ADAM6启动子是从ADAM6a的起始密码子上游的约5至约20个核苷酸内延伸至ADAM6a的起始密码子上游的约0.5kb、1kb、2kb或3kb或更多的片段。
在一个实施方案中，核酸序列包含当置入因缺乏ADAM6而具有低生育能力或不能生育的小鼠中时改善生育能力或恢复生育能力至大致的野生型生育能力的SEQ ID NO:3或其片段。在一个实施方案中，SEQ ID NO:3或其片段赋予雄性小鼠产生能够穿过雌性小鼠输卵管以使小鼠卵细胞受精的精子细胞的能力。
在一个实施方案中，核酸序列包含当置入因缺乏ADAM6而具有低生育能力或不能生育的小鼠中时改善生育能力或恢复生育能力至大致的野生型生育能力的SEQ ID NO:73或其片段。在一个实施方案中，SEQ ID NO:73或其片段赋予雄性小鼠产生能够穿过雌性小鼠输卵管以使小鼠卵细胞受精的精子细胞的能力。
在一个实施方案中，核酸序列包含当置入因缺乏ADAM6而具有低生育能力或不能生育的小鼠中时改善生育能力或恢复生育能力至大致的野生型生育能力的SEQ ID NO:77或其片段。在一个实施方案中，SEQ ID NO:77或其片段赋予雄性小鼠产生能够穿过雌性小鼠输卵管以使小鼠卵细胞受精的精子细胞的能力。
在一个方面，提供了这样的小鼠，所述小鼠包含编码ADAM6蛋白的内源核苷酸序列的删除、人VH基因区段对内源小鼠VH基因区段的置换和编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个实施方案中，小鼠包含：包括包含内源ADAM6基因的内源免疫球蛋白基因座核苷酸序列的删除的免疫球蛋白重链基因座，编码一个或多个人免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列，并且其中编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列在编码一个或多个人免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列之内或与其直接相邻。
在一个实施方案中，小鼠包含利用编码单个人VH基因区段的核苷酸序列对所有的或基本上所有的内源VH基因区段的置换，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列在编码单个人VH基因区段的核苷酸序列之内或与其直接相邻。在一个实施方案中，小鼠还包含在内源DH基因座上用一个或多个人DH基因区段对一个或多个内源DH基因区段的置换。在一个实施方案中，小鼠还包含在内源JH基因座上用一个或多个人JH基因区段对一个或多个内源JH基因区段的置换。在一个实施方案中，小鼠包含所有的或基本上所有的内源VH、DH和JH基因区段的置换和在内源VH、DH和JH基因座上利用单个人VH、一个或多个人DH和一个或多个人JH基因区段的置换，其中小鼠包含编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列。在特定实施方案中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列位于单个人VH基因区段的上游或5’。在另一个特定的实施方案中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列位于单个人VH基因区段的下游或3’。在另一个特定的实施方案中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列位于单个人VH基因区段与存在的第一人DH基因区段之间。在另一个特定的实施方案中，小鼠包含所有的或基本上所有的小鼠VH基因区段的删除和利用单个人VH基因区段的置换，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于人基因区段VH1-69的下游和人基因区段DH1-1的上游。在另一个特定的实施方案中，小鼠包含所有的或基本上所有的小鼠VH基因区段的删除和利用单个人VH基因区段的置换，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于人基因区段VH1-2的下游和人基因区段DH1-1的上游。
在特定实施方案中，小鼠包含利用编码单个VH基因区段的核苷酸序列对所有的或基本上所有的内源VH基因区段的置换，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列在编码单个人VH基因区段的核苷酸序列之内或与其直接相邻。
在一个实施方案中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠的基因组中的转基因上。在一个实施方案中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列染色体外地存在于小鼠中。
在一个方面，提供了包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的小鼠，其中小鼠表达包含可操作地连接至重链恒定区基因序列的经重排的免疫球蛋白序列的B细胞，并且B细胞在其基因组中(例如在B细胞染色体上)包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或直系同源物或其同源物或片段的基因。在一个实施方案中，可操作地连接至重链恒定区基因序列的经重排的免疫球蛋白序列包含人重链V、D和/或J序列；小鼠重链V、D和/或J序列；人或小鼠轻链V和/或J序列。在一个实施方案中，重链恒定区基因序列包含选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人或小鼠重链序列。
在一个方面，提供了包含功能性沉默的内源免疫球蛋白重链基因座的小鼠，其中ADAM6功能在小鼠中得到维持，并且所述小鼠还包含一个或多个人免疫球蛋白基因区段的插入，其中一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括单个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段。在一个实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括人VH1-69基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段。在一个实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括人VH1-2基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含功能性沉默的免疫球蛋白轻链基因，并还包含利用单个人免疫球蛋白重链可变区基因区段对一个或多个内源免疫球蛋白重链可变区基因区段的置换，其中所述小鼠缺乏功能性内源ADAM6基因座，并且其中所述小鼠包含表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个方面，提供了缺乏功能性内源小鼠ADAM6基因座或序列并且包含编码小鼠ADAM6基因座或小鼠ADAM6基因座或序列的功能性片段的异位核苷酸序列的小鼠，其中所述小鼠能够与异性小鼠交配以产生包含异位ADAM6基因座或序列的后代。在一个实施方案中，小鼠是雄性的。在一个实施方案中，小鼠是雌性的。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其中小鼠在内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座上包含人免疫球蛋白重链可变区基因区段，小鼠在内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座上缺乏内源功能性ADAM6序列，并且其中小鼠包含表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段的异位核苷酸序列.
在一个实施方案中，表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列是染色体外的。在一个实施方案中，表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列整合在小鼠基因组中的一个或多个基因座上。在特定实施方案中，一个或多个基因座包括免疫球蛋白基因座。
在一个方面，提供了从经修饰的内源小鼠免疫球蛋白重链基因座表达免疫球蛋白重链序列的小鼠，其中重链来源于人V基因区段、D基因区段和J基因区段，其中小鼠包含在小鼠中具有功能的ADAM6活性。
在一个实施方案中，小鼠包含单个人V基因区段、多个D基因区段和多个J基因区段。在一个实施方案中，D基因区段是人D基因区段。在一个实施方案中，J基因区段是人J基因区段。在一个实施方案中，小鼠还包含人源化重链恒定区序列，其中所述人源化包括选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的序列的置换。在特定实施方案中，重链来源于人V基因区段、人D基因区段、人J基因区段、人CH1序列、人或小鼠铰链序列、小鼠CH2序列和小鼠CH3序列。在另一个特定的实施方案中，小鼠还包含人轻链恒定序列。
在一个实施方案中，小鼠包含在其5’和3’由内源免疫球蛋白重链基因区段侧接的ADAM6基因。在特定实施方案中，内源免疫球蛋白重链基因区段不能够编码抗体的重链。在特定实施方案中，小鼠的ADAM6基因在与野生型小鼠中相同的位置上并且小鼠的内源免疫球蛋白重链可变基因座不能够重排以编码抗体的重链。
在一个实施方案中，V基因区段在其5’(针对V基因区段的转录方向而言)由编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列侧接。
在一个实施方案中，V基因区段在其3’(针对V基因区段的转录方向而言)由编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列侧接。
在一个实施方案中，D基因区段在其5’(针对D基因区段的转录方向而言)由编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列侧接。
在一个实施方案中，J基因区段在其5’(针对J基因区段的转录方向而言)由编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列侧接。
在一个实施方案中，在小鼠中具有功能的ADAM6活性因位于经修饰的内源小鼠重链免疫球蛋白基因座的最5’的D基因区段的5’和单个V基因区段的3’(针对V基因区段的转录方向而言)的核苷酸序列的表达而引起。
在一个实施方案中，在小鼠中具有功能的ADAM6活性因位于经修饰的内源小鼠重链免疫球蛋白基因座的最5’的J基因区段的5’和最3’的D基因区段的3’(针对D基因区段的转录方向而言)的核苷酸序列的表达而引起。
在一个实施方案中，在小鼠中具有功能的ADAM6活性因位于经修饰的内源小鼠重链免疫球蛋白基因座的单个V基因区段的5’(针对V基因区段的转录方向而言)的核苷酸序列的表达而引起。
在一个实施方案中，核苷酸序列包含选自小鼠ADAM6b序列或其功能性片段、小鼠ADAM6a序列或其功能性片段及其组合的序列。
在一个实施方案中，位于单个人V基因区段的上游(5’)或下游(3’)的核苷酸序列置于针对人V基因区段相反的转录方向。在特定实施方案中，核苷酸序列从5’至3’(针对ADAM6基因的转录方向而言)编码ADAM6a序列和之后的ADAM6b序列。
在一个实施方案中，小鼠包含与小鼠ADAM6序列或其功能性片段并列或连续的单个人VH基因区段。
在一个实施方案中，小鼠包含与小鼠ADAM6序列或其功能性片段并列或连续的人VH1-69基因区段。
在一个实施方案中，小鼠包含与小鼠ADAM6序列或其功能性片段并列或连续的人VH1-2基因区段。
在一个实施方案中，小鼠包含单个人VH基因区段，并且小鼠ADAM6序列或其功能性片段与内源免疫球蛋白重链基因区段并列或连续，其中所述内源免疫球蛋白重链基因区段不能够重排以编码抗体的重链。
在一个实施方案中，编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列是小鼠ADAM6序列或其功能性片段。
在一个方面，提供了在未经重排的B细胞谱系的携带DNA的细胞中包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，但在包含经重排的免疫球蛋白基因座的B细胞中包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列的小鼠，其中编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列存在于基因组中与在野生型小鼠中小鼠ADAM6基因出现的位置不同的位置。在一个实施方案中，编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列存在于所有的或基本上所有的不属于经重排的B细胞谱系的携带DNA的细胞中；在一个实施方案中，核酸序列存在于小鼠的种系细胞中，但不存在于经重排的B细胞的染色体中。
在一个方面，提供了在所有的或基本上所有的携带DNA的细胞包括包含经重排的免疫球蛋白基因座的B细胞中包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列的小鼠，其中编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列存在于基因组中与在野生型小鼠中小鼠ADAM6基因出现的位置不同的位置。在一个实施方案中，编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列在与经重排的免疫球蛋白基因座连续的核酸上。在一个实施方案中，与经重排的免疫球蛋白基因座连续的核酸是染色体。在一个实施方案中，染色体是发现于野生型小鼠中的染色体并且染色体包含小鼠免疫球蛋白基因座的修饰。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含在其基因组中包含ADAM6序列或其直系同源物或同源物的B细胞。在一个实施方案中，ADAM6序列或其直系同源物或同源物在免疫球蛋白重链基因座上。在特定实施方案中，重链基因座包含不能够重排以编码抗体的重链的内源免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方案中，ADAM6序列或其直系同源物或同源物在不是免疫球蛋白基因座的基因座上。在一个实施方案中，ADAM6序列在由异源启动子驱动的转基因上。在特定实施方案中，异源启动子是非免疫球蛋白启动子。在特定实施方案中，B细胞表达ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，小鼠的90％或更多的B细胞包含编码在小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或其其同源物或片段的基因。在特定实施方案中，小鼠是雄性小鼠。
在一个实施方案中，B细胞基因组包括包含ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第一等位基因和第二等位基因。在一个实施方案中，B细胞基因组包括包含ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第一等位基因但不包括第二等位基因。
在一个方面，提供了在一个或多个内源免疫球蛋白重链等位基因上包含修饰的小鼠，其中所述修饰维持一个或多个内源ADAM6等位基因。
在一个实施方案中，修饰使得小鼠不能够从至少一个重链等位基因表达包含经重排的内源重链基因区段的功能性重链并且维持位于至少一个内源免疫球蛋白重链等位基因内的内源ADAM6等位基因。
在一个实施方案中，小鼠不能够从至少一个内源免疫球蛋白重链等位基因表达包含经重排的内源重链基因区段的功能性重链，并且小鼠从内源ADAM6等位基因表达ADAM6蛋白。在特定实施方案中，小鼠不能够从两个内源免疫球蛋白重链等位基因表达包含经重排的内源重链基因区段的功能性重链，并且小鼠从一个或多个内源ADAM6等位基因表达ADAM6蛋白。
在一个实施方案中，小鼠不能够从每一个内源重链等位基因表达功能性重链，并且小鼠包含位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120或更多Mbp之内的功能性ADAM6等位基因。在特定实施方案中，功能性ADAM6等位基因在内源免疫球蛋白重链基因座上(例如，在基因间V-D区中，在两个V基因区段之间，在V与D基因区段之间，在D与J基因区段之间等)。在特定实施方案中，功能性ADAM6等位基因位于最后的小鼠V基因区段与第一小鼠D基因区段之间的90-100kb基因间序列之内。
在一个方面，提供了在一个或多个内源ADAM6等位基因上包含修饰的小鼠。
在一个实施方案中，修饰使得小鼠不能够从一个或多个内源ADAM6等位基因的至少一个表达功能性ADAM6蛋白。在特定实施方案中，小鼠不能够从每一个内源ADAM6等位基因表达功能性ADAM6蛋白。
在一个实施方案中，小鼠不能够从每一个内源ADAM6等位基因表达功能性ADAM6蛋白，并且小鼠包含异位ADAM6序列。
在一个实施方案中，小鼠不能够从每一个内源ADAM6等位基因表达功能性ADAM6蛋白，并且小鼠包含位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120或更多kb之内的异位ADAM6序列。在特定实施方案中，异位ADAM6序列在内源免疫球蛋白重链基因座上(例如，在基因间V-D区中，在两个V基因区段之间，在V与D基因区段之间，在D与J基因区段之间等)。在特定实施方案中，异位ADAM6序列位于最后的小鼠V基因区段与第一小鼠D基因区段之间的90至100kb的基因间序列之内。在另一个特定的实施方案中，去除内源的90至100kb基因间V-D序列，并且异位ADAM6序列置于单个人V基因区段与第一人D基因区段之间。在另一个特定的实施方案中，去除内源的90至100kb基因间V-D序列，并且异位ADAM6序列置于单个人V基因区段5’或上游。
在一个方面，提供了不能生育的雄性小鼠，其中所述小鼠包含两个或更多个内源ADAM6等位基因的删除。在一个方面，提供了作为雄性不育性状的载体的雌性小鼠，其中所述雌性小鼠在其种系中包含非功能性ADAM6等位基因或内源ADAM6等位基因的敲除。
在一个方面，提供了包含不能够重排以编码抗体的重链的内源免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段的小鼠，其中小鼠的大部分B细胞包含功能性ADAM6基因。
在一个实施方案中，小鼠包含不能够重排以编码抗体的功能性重链的完整的内源免疫球蛋白重链V、D和J基因区段。在一个实施方案中，小鼠包含至少一个和多至89个V基因区段、至少一个和多至13个D基因区段、至少一个和多至4个J基因区段及其组合；其中至少一个和多至89个V基因区段、至少一个和多至13个D基因区段、至少一个和多至4个J基因区段不能够重排以编码抗体的重链可变区。在特定实施方案中，小鼠包含位于完整的内源免疫球蛋白重链V、D和J基因区段之内的功能性ADAM6基因。在一个实施方案中，小鼠包含包括内源ADAM6基因座的内源重链基因座，其中内源重链基因座包含89个V基因区段、13个D基因区段和4个J基因区段，其中内源重链基因区段不能够重排以编码抗体的重链可变区并且ADAM6基因座编码在小鼠中具有功能的ADAM6蛋白。
在一个方面，提供了缺乏内源免疫球蛋白重链V、D和J基因区段的小鼠，其中小鼠的大部分B细胞包含ADAM6序列或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，小鼠缺乏选自两个或更多个V基因区段、两个或更多个D基因区段、两个或更多个J基因区段及其组合的内源免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方案中，小鼠缺乏选自至少一个和多至89个V基因区段、至少一个和多至13个D基因区段、至少一个和多至4个J基因区段及其组合的免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方案中，小鼠缺乏来自染色体12的包含内源免疫球蛋白重链基因座的约3个兆碱基的基因组DNA片段。在特定实施方案中，小鼠缺乏所有的功能性内源重链V、D和J基因区段。在特定实施方案中，小鼠缺乏89个VH基因区段、13个DH基因区段和4个JH基因区段。
在一个方面，提供了小鼠，其中所述小鼠在种系中具有包含免疫球蛋白重链基因座的修饰的基因组，其中对免疫球蛋白重链基因座的修饰包括利用一个非小鼠免疫球蛋白可变区序列对一个或多个小鼠免疫球蛋白可变区序列的置换，并且其中小鼠包含编码小鼠ADAM6蛋白的核酸序列。在优选实施方案中，内源免疫球蛋白重链基因座的DH和JH序列以及至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个VH序列被非小鼠免疫球蛋白重链序列置换。在其他优选实施方案中，内源免疫球蛋白重链基因座的DH、JH和所有的VH序列被单个非小鼠免疫球蛋白V基因区段、一个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段序列置换。非小鼠免疫球蛋白序列可以是未经重排的。在优选实施方案中，非小鼠免疫球蛋白序列包含非小鼠物种的完整的未经重排的DH和JH区以及单个未经重排的VH序列。在其它优选实施方案中，非小鼠免疫球蛋白序列能够形成非小鼠物种的完整的可变区，即包含连接在一起以形成编码重链可变区的序列的VH、DH和JH区段的经重排的可变区。非小鼠物种可以是智人并且非小鼠免疫球蛋白序列可以是人序列。
在一个方面，提供了包含单个功能性人V区段的重链免疫球蛋白基因座。在一个实施方案中，单个功能性人V区段选自VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81区段。在一个实施方案中，单个功能性人V区段是VH1-69区段；在特定实施方案中，单个功能性人V区段以在人群体中发现的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个多态形式存在。在一个实施方案中，单个功能性人V区段是VH1-2区段；在特定实施方案中，单个功能性人V区段以在人群体中发现的1、2、3、4或5个多态形式存在。
在一个实施方案中，重链免疫球蛋白基因座是非人动物的经修饰的基因座。在一个实施方案中，经修饰的非人免疫球蛋白重链基因座在非人动物中存在于基因组中的位置上，在该位置中在野生型非人动物中发现对应的未经修饰的非人基因座。在一个实施方案中，经修饰的非人免疫球蛋白重链基因座存在于非人动物中的转基因上。
在一个实施方案中，单个功能性人V基因区段是VH1-69基因区段。在一个实施方案中，VH1-69基因区段包含SEQ ID NO:37。在一个实施方案中，VH1-69基因区段来源于SEQ ID NO:37。在一个实施方案中，VH1-69基因区段与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。
在一个实施方案中，单个功能性人V基因区段由SEQ ID NO:37的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，单个功能性人V基因区段是VH1-2基因区段。在一个实施方案中，VH1-2基因区段包含SEQ ID NO:63。在一个实施方案中，VH1-2基因区段来源于SEQ ID NO:63。在一个实施方案中，VH1-2基因区段与SEQ ID NO:63具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。
在一个实施方案中，单个功能性人V基因区段由包含SEQ ID NO:63的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，单个功能性人V基因区段可操作地连接至一个或多个D区段和一个或多个J区段或一个或多个J区段。在一个实施方案中，V区段和一个或多个D和/或一个或多个J区段可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区序列。在一个实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区序列选自CH1、铰链、CH2、CH3序列及其组合。在一个实施方案中，CH1、铰链、CH2、CH3或其组合各自是非人内源恒定序列。在一个实施方案中，CH1、铰链、CH2、CH3或其组合的至少一个是人序列。在特定实施方案中，CH1和/或铰链是人序列。
在一个方面，提供了经修饰的内源非人免疫球蛋白重链基因座，包括利用单个人V区段对所有的功能性V区段的置换，其中非人免疫球蛋白重链基因座不能够重排以形成来源于V区段而非单个人V区段的重链可变基因。
在一个实施方案中，单个人V区段是VH1-69。在一个实施方案中，单个人V区段是VH1-2。
在一个实施方案中，基因座包含至少一个人或非人DH区段和一个人或非人JH区段。在特定实施方案中，基因座包含人DH区段和人JH区段。在特定实施方案中，基因座包含人JH区段。在另一个特定的实施方案中，基因座包含人VH1-69、所有的功能性人DH区段和所有的功能性人JH区段。在一个实施方案中，人V、D和J区段(或V和J区段)在内源小鼠重链基因座上可操作地连接至小鼠恒定区基因。在特定实施方案中，小鼠重链基因座包含小鼠免疫球蛋白恒定区序列的野生型库。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其中非人动物的仅有的功能性免疫球蛋白重链V基因区段选自人VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81区段。在一个实施方案中，重链V基因区段是人VH1-69基因区段。在一个实施方案中，重链V基因区段是人VH1-2基因区段。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其中所述非人动物包含单个功能性人VH区段，并且其中所述非人动物基本上不能够形成缺乏单个功能性人VH区段的经重排的免疫球蛋白重链可变结构域基因。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其中在非人动物中表达的仅有的免疫球蛋白重链可变区来源于选自人VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81基因区段的人区段的一个。在一个实施方案中，人区段是VH1-69区段。在一个实施方案中，人区段是VH1-2区段。在一个实施方案中，由小鼠表达的仅有的免疫球蛋白重链可变区来源于单个V区段家族成员，并且在一个实施方案中，仅有的免疫球蛋白重链可变区来源于单个V区段家族成员的多态变体。
在一个方面，提供了包含受限制的免疫球蛋白重链V基因区段库的非人动物，其中所述非人动物还包含一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变区段(Vκ)。在一个实施方案中，一个或多个Vκ区段可操作地连接至一个或多个人J区段。在特定实施方案中，J区段是人Jκ区段。在另一个特定的实施方案中，非人动物不表达免疫球蛋白λ轻链。在另一个特定的实施方案中，非人动物不包含功能性人或功能性内源免疫球蛋白λ轻链可变基因座。
在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
在一个实施方案中，非人动物在内源非人免疫球蛋白Vκ基因座上包含利用一个或多个功能性人Vκ区段对所有的或基本上所有的功能性内源Vκ区段的置换。在其他的特定实施方案中，置换是利用所有的或基本上所有的功能性人免疫球蛋白Vκ区段的置换。
在一个实施方案中，非人动物在内源非人免疫球蛋白Jκ基因座上包含利用一个或多个功能性人免疫球蛋白Jκ区段对所有的或基本上所有的功能性内源非人免疫球蛋白Jκ区段的置换。在其他的特定实施方案中，置换是利用所有的或基本上所有的功能性人免疫球蛋白Jκ区段的置换。
在特定实施方案中，非人动物包含免疫球蛋白重链可变区基因座，所述基因座包含基本上由单个V区段和/或其多态变体组成的V区段库。在一个实施方案中，单个免疫球蛋白重链V区段是人VH1-69区段，并且非人动物还包含利用所有的功能性人DH区段对所有的功能性非人DH区段的置换，并且还包含利用所有的功能性人JH区段对所有的功能性非人JH区段的置换，并且其中免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地连接至人或非人恒定区基因序列。在特定实施方案中，恒定区基因序列是内源非人恒定区基因序列。在特定实施方案中，非人动物重排非人免疫球蛋白重链基因座上的区段以形成编码包含人VH1-69序列、人DH序列、人JH序列和小鼠恒定区序列的重链可变区的基因。
在特定实施方案中，非人动物包含免疫球蛋白重链可变区基因座，所述基因座包含基本上由单个V区段和/或其多态变体组成的V区段库。在一个实施方案中，单个免疫球蛋白重链V区段是人VH1-2区段，并且非人动物还包含利用所有的功能性人DH区段对所有的功能性非人DH区段的置换，并且还包含利用所有的功能性人JH区段对所有的功能性非人JH区段的置换，并且其中免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地连接至人或非人恒定区基因序列。在特定实施方案中，恒定区基因序列是内源非人恒定区基因序列。在特定实施方案中，非人动物重排非人免疫球蛋白重链基因座上的区段以形成编码包含人VH1-2序列、人DH序列、人JH序列和小鼠恒定区序列的重链可变区的基因。
在一个实施方案中，提供了包含经重排的基因的B细胞。在特定实施方案中，B细胞来自如所描述的已利用目的抗原进行免疫的小鼠，并且B细胞编码特异性结合目的抗原的抗体。在一个实施方案中，目的抗原是病原体。在特定实施方案中，病原体选自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在特定实施方案中，B细胞编码经体细胞突变的高亲和性(例如约10-9KD或更低)抗体，所述抗体包含人轻链可变区(例如人κ轻链可变区)并特异性结合目的抗原。
在一个方面，提供了包含受限制的免疫球蛋白重链V区段库的非人动物，其中所述非人动物包含一个或多个人λ轻链可变(Vλ)区段。在一个实施方案中，一个或多个人Vλ区段可操作地连接至一个或多个人J区段。在特定实施方案中，J区段是人Jλ区段。在另一个特定的实施方案中，非人动物不表达κ轻链。在另一个特定的实施方案中，非人动物不包含功能性人或非人κ轻链可变基因座。
在一个实施方案中，非人动物包含利用一个或多个功能性人免疫球蛋白Vλ区段对所有的或基本上所有的功能性非人免疫球蛋白Vλ区段的置换。在其他的特定实施方案中，置换是利用所有的或基本上所有的功能性人免疫球蛋白Vλ区段的置换。
在一个实施方案中，非人动物包含利用一个或多个功能性人免疫球蛋白Jλ区段对所有的或基本上所有的功能性非人免疫球蛋白Jλ区段的置换。在其他的特定实施方案中，置换是利用所有的或基本上所有的功能性人免疫球蛋白Jλ区段的置换。
在特定实施方案中，非人动物包括仅包含单个VH区段的免疫球蛋白重链可变(VH)区基因座，其中单个VH区段是人VH1-69区段或人VH1-2区段，并且非人动物还包含利用所有的功能性人DH区段对所有的功能性非人DH区段的置换，并且还包含利用所有的功能性人JH区段对所有的功能性非人JH区段的置换，并且其中VH区基因座可操作地连接至人或非人恒定区基因序列。在特定实施方案中，恒定区基因序列是非人恒定区基因序列，例如内源非人恒定基因序列。在特定实施方案中，非人动物重排非人免疫球蛋白重链基因座上的区段以形成编码包含人VH1-69序列(或人VH1-2序列)、人DH序列、人JH序列和内源非人恒定区序列的免疫球蛋白重链可变区的基因。
在一个实施方案中，提供了包含经重排的基因的B细胞。在特定实施方案中，B细胞来自如所描述的已利用目的抗原进行免疫的非人动物，并且B细胞编码特异性结合目的抗原的抗体。在一个实施方案中，抗原是选自配体、细胞表面受体和细胞内蛋白的人蛋白。在一个实施方案中，抗原是病原体。在特定实施方案中，病原体选自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在特定实施方案中，B细胞编码经体细胞突变的高亲和性(例如约10-9KD或更低)抗体，所述抗体包含人轻链可变区(例如人λ轻链可变区)并特异性结合目的抗原。
在一个方面，提供了包含受限制的免疫球蛋白重链V区段库的非人动物，其中非人动物在转基因上包含人VH1-69区段(或人VH1-2区段)，其中人VH1-69区段在转基因上可操作地连接至人或非人DH区段和/或人或非人J区段，并且转基因还包含人或非人恒定区基因或嵌合的人/非人恒定区(例如CH1、铰链、CH2、CH3或其组合，其中至少一个序列是非人的，例如选自铰链、CH2和CH3和/或铰链)在一个实施方案中，非人动物是小鼠或大鼠并且非人D、J和/或恒定区基因是小鼠或大鼠基因或嵌合的人/小鼠或大鼠。
在一个实施方案中，非人动物包括包含免疫球蛋白轻链可变区基因座的转基因，所述基因座包含一个或多个人免疫球蛋白Vλ区段和Jλ区段或一个或多个人免疫球蛋白Vκ区段和Jκ区段以及人免疫球蛋白κ或λ轻链恒定区基因，以便转基因在非人动物中重排以形成经重排的免疫球蛋白κ或λ轻链基因。
在特定实施方案中，非人动物包含具有免疫球蛋白重链可变基因座的转基因，所述重链可变基因座包含为人VH1-69区段(或人VH1-2区段)的单个V区段、一个或多个人D区段、一个或多个人J区段和可操作地连接至重链可变基因座的人恒定基因，以便小鼠从转基因表达来源于VH1-69区段(或VH1-2区段)的完全人抗体。在一个实施方案中，非人动物不包含功能性内源免疫球蛋白重链可变区基因座。在特定实施方案中，非人动物包括包含内源非人DH和/或内源非人JH区段的删除的非功能性内源免疫球蛋白重链可变区基因座，以便非人动物不能够重排内源免疫球蛋白重链可变区基因座以形成经重排的非人抗体基因。在特定实施方案中，非人动物包含可操作地连接至内源小鼠重链恒定区的转换序列的删除。在特定实施方案中，转换序列是非人(例如小鼠)μ转换序列。在另一个实施方案中，非人动物还包含选自免疫球蛋白κ基因座和免疫球蛋白λ基因座的功能性内源轻链可变基因座的缺失。在特定实施方案中，非人动物包含Jκ和/或Jλ序列的删除，以便非人动物不能够重排内源非人免疫球蛋白κ轻链和/或内源非人免疫球蛋白λ轻链可变区以形成经重排的内源非人免疫球蛋白κ轻链和/或经重排的内源非人免疫球蛋白λ轻链基因。
在一个实施方案中，非人动物包含内源非人免疫球蛋白κ轻链序列的删除，所述删除导致内源非人免疫球蛋白κ轻链的功能性敲除。在一个实施方案中，非人动物包含内源非人免疫球蛋白λ轻链序列的删除，所述删除导致内源非人免疫球蛋白λ轻链的功能性敲除。
在一个方面，提供了包含免疫球蛋白重链可变库的啮齿类动物，所述免疫球蛋白重链可变库来源于不多于一个人VH区段或其一个或多个多态体、来源于选自一个或多个D区段的库的D区段和来源于选自一个或多个J区段的库的J区段；其中所述啮齿类动物包含在雄性啮齿类动物中具有功能的异位ADAM6序列或直系同源物或其同源物或片段。
在一个实施方案中，人VH区段以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个多态变体的形式存在，其中每个多态变体可操作地连接至D和/或J区段以便每个多态变体能够与任何的一个或多个D区段和任何的一个或多个J区段重排并形成经重排的重链可变结构域。在一个实施方案中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一个实施方案中，D区段库包含两个或更多个D区段。在一个实施方案中，J区段库包含两个或更多个J区段。在一个实施方案中，D和/或J区段是人区段。在一个实施方案中，异位ADAM6序列是相同物种的野生型啮齿类动物的ADAM6序列。在一个实施方案中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一个实施方案中，在雄性啮齿类动物中具有功能的异位ADAM6序列或直系同源物或其同源物或片段在与经修饰的免疫球蛋白重链可变库相同的染色体上；在一个实施方案中，其在不同的染色体上。
在一个方面，提供了包含编码单个人免疫球蛋白重链VH区段和/或其多态变体以及一个或多个DH和一个或多个J序列的序列的核苷酸构建体，其中所述构建体包含至少一个与非人免疫球蛋白重链可变基因座同源的同源臂或重组酶识别位点(例如lox位点)。在一个实施方案中，V区段是VH1-69区段或VH1-2区段。
在一个方面，提供了包含编码单个人免疫球蛋白重链V区段的核苷酸序列的核苷酸构建体，其中单个VH区段是VH1-69(或VH1-2)区段。在一个实施方案中，构建体包含位点特异性重组酶识别位点。在一个实施方案中，构建体在VH1-69(或VH1-2)区段的上游包含第一小鼠同源臂并且在VH1-69(或VH1-2)区段的下游包含第二小鼠同源臂，并且其中第一小鼠同源臂与小鼠免疫球蛋白重链可变区直接上游的但不包括功能性小鼠免疫球蛋白重链可变区段的小鼠染色体的区域同源。在一个实施方案中，构建体包含SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，构建体包含SEQ ID NO:74。在一个实施方案中，构建体包含SEQ ID NO:75。在一个实施方案中，构建体包含SEQ ID NO:76。
在一个方面，受限制的单个VH区段是非人动物中的，或者受限制的VH区段是在非人免疫球蛋白重链基因座上(例如在原位或在转基因中)的，并且非人动物或非人免疫球蛋白重链基因座选自小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类(例如绒猴、恒河猴)基因座或动物。在特定实施方案中，非人动物或基因座是小鼠或大鼠基因座。
在一个方面，提供了靶向载体，其包括(a)与人可变区基因区段核苷酸序列相同或基本上相同的核苷酸序列；和(b)编码在小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或直系同源物或其同源物或片段的核苷酸序列。
在一个实施方案中，靶向载体还包含可操作地连接至编码小鼠ADAM6序列的启动子。在特定实施方案中，启动子是小鼠ADAM6启动子。
在一个方面，提供了用于修饰小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的核苷酸构建体，其中所述构建体包含至少一个位点特异性重组酶识别位点和编码在小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段的序列。
在一个方面，提供了核酸构建体，其包含上游同源臂和下游同源臂，其中上游同源臂包含与人免疫球蛋白重链可变区序列相同或基本上相同的序列，下游同源臂包含与人或小鼠免疫球蛋白可变区序列相同或基本上相同的序列，并且置于上游和下游同源臂之间的是包含编码小鼠ADAM6蛋白的核苷酸序列的序列。在特定实施方案中，编码小鼠ADAM6基因的序列可操作地连接至在野生型小鼠中小鼠ADAM6与其连接的小鼠启动子。
在一个方面，提供了从如本文中描述的经遗传修饰的小鼠分离的细胞。在一个实施方案中，细胞是淋巴细胞。在一个实施方案中，淋巴细胞是B细胞。在特定实施方案中，B细胞包含异位ADAM6序列或直系同源物或同源物或编码其功能性片段的序列，其中所述B细胞表达来源于人VH基因区段的重链可变结构域。
在一个方面，提供了细胞或组织，其中所述细胞或组织来源于如本文中描述的非人动物，并且包含受限制的VH区段库。在一个实施方案中，VH区段库限制至单个VH区段家族成员和/或其多态变体。在特定实施方案中，单个VH区段是人VH1-69区段或人VH1-2区段.在一个实施方案中，细胞或组织来源于非人动物的脾、淋巴结或骨髓。
在一个实施方案中，细胞是ES细胞。在一个实施方案中，细胞是B细胞。在一个实施方案中，细胞是生殖细胞。
在一个实施方案中，组织选自结缔、肌肉、神经和上皮组织。在特定实施方案中，组织是生殖组织。
在一个实施方案中，来源于如本文中描述的小鼠的细胞和/或组织是分离的以用于一种或多种离体分析。在多个实施方案中，一种或多种离体分析包括物理性质、热学性质、电学性质、力学性质或光学性质的测量、外科手术、不同组织类型的相互作用的测量、成像技术的开发或其组合。
在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
在一个方面，提供了包含如本文中描述的受限制的重链VH区段的非人胚胎。在一个实施方案中，胚胎包括包含受限制的VH区段的ES供体细胞和宿主胚胎细胞。
在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
在一个方面，非人细胞包含如本文中描述的非人动物的染色体或其片段。在一个实施方案中，非人细胞包含如本文中描述的非人动物的细胞核。在一个实施方案中，非人细胞包含作为核移植的结果的染色体或其片段。
在一个方面，提供了来源于如本文中描述的非人动物的细胞核。在一个实施方案中，细胞核来自非B细胞的二倍体细胞。
在一个方面，提供了来源于如本文中描述的非人动物的多能细胞、诱导多能细胞或全能细胞。在特定实施方案中，细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
在一个方面，提供了包含受限制的VH区段库的非人诱导多能细胞。在一个实施方案中，诱导多能细胞来源于如本文中描述的非人动物。
在一个方面，提供了杂交瘤，其包含如本文中描述的小鼠的淋巴细胞的序列。在一个实施方案中，淋巴细胞是B细胞。
在一个方面，提供了来源于如本文中描述的非人动物的细胞的杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)。在一个实施方案中，非人动物是小鼠或大鼠。
在一个方面，提供了包含如本文中描述的遗传修饰的小鼠细胞和小鼠胚胎，其包括但不限于ES细胞、多能细胞和诱导多能细胞。提供了为XX的细胞和为XY的细胞。还提供了包括包含如本文中描述的修饰例如通过原核注射被引入细胞的修饰的细胞核的细胞。还提供了包含经病毒引入的ADAM6基因的细胞、胚胎和小鼠，例如包括包含在小鼠中具有功能的ADAM6基因的转导构建体的细胞、胚胎和小鼠。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠细胞，其中所述细胞不能够表达包含经重排的内源免疫球蛋白重链基因区段的重链，并且细胞包含编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段的功能性ADAM6基因。在一个实施方案中，细胞还包含人免疫球蛋白基因区段的插入。在特定实施方案中，人免疫球蛋白基因区段是可操作地连接至小鼠重链恒定区以便经重排后编码包含人可变区的抗体的功能性重链的重链基因区段。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠细胞；其中细胞缺乏功能性内源小鼠ADAM6基因座，并且细胞包含编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段的异位核苷酸序列。在一个实施方案中，细胞还包含内源免疫球蛋白重链可变基因序列的修饰。在特定实施方案中，内源免疫球蛋白重链可变基因序列的修饰包括选自小鼠VH基因区段的删除、小鼠DH基因区段的删除、小鼠JH基因区段的删除及其组合的删除。在特定实施方案中，小鼠包含利用人免疫球蛋白序列对一个或多个小鼠免疫球蛋白VH、DH和/或JH序列的置换。在特定实施方案中，人免疫球蛋白序列选自人VH、人VL、人DH、人JH、人JL及其组合。
在一个实施方案中，细胞是全能细胞、多能细胞或诱导多能细胞。在特定实施方案中，细胞是小鼠ES细胞。
在一个方面，提供了小鼠B细胞，其中所述小鼠B细胞包含经重排的免疫球蛋白重链基因，其中所述B细胞在B细胞的染色体上包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段的核酸序列。在一个实施方案中，小鼠B细胞包含核酸序列的两个等位基因。
在一个实施方案中，核酸序列在与经重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座连续的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个实施方案中，核酸序列在与包含经重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座的核酸分子不同的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个实施方案中，小鼠B细胞包含可操作地连接至小鼠或人免疫球蛋白恒定区基因的经重排的非小鼠免疫球蛋白可变基因序列，其中B细胞包含编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或直系同源物或其同源物或片段的核酸序列
在一个实施方案中，核酸序列在位于针对经重排的非人免疫球蛋白可变基因序列最近的基因座或该基因座之内的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个实施方案中，核酸序列在与经重排的非人免疫球蛋白可变区序列连续的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个方面，提供了小鼠体细胞，其包括包含经修饰的免疫球蛋白重链基因座和编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或直系同源物或其同源物或片段的核酸序列的染色体。在一个实施方案中，核酸序列在与经修饰的免疫球蛋白重链基因座相同的染色体上。在一个实施方案中，核酸序列在与经修饰的免疫球蛋白重链基因座不同的染色体上。在一个实施方案中，体细胞包含单个拷贝的核酸序列。在一个实施方案中，体细胞包含至少两个拷贝的核酸序列。在特定实施方案中，体细胞是B细胞。在特定实施方案中，细胞是生殖细胞。在特定实施方案中，细胞是干细胞。
在一个方面，提供了小鼠生殖细胞，其在生殖细胞的染色体上包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，其中编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列在染色体中与野生型小鼠生殖细胞的染色体中的位置不同的位置上。在一个实施方案中，核酸序列在小鼠免疫球蛋白基因座上。在一个实施方案中，核酸序列在与小鼠免疫球蛋白基因座相同的生殖细胞的染色体上。在一个实施方案中，核酸序列在与小鼠免疫球蛋白基因座不同的生殖细胞的染色体上。在一个实施方案中，小鼠免疫球蛋白基因座包含利用至少一个非小鼠免疫球蛋白序列对至少一个小鼠免疫球蛋白序列的置换。在特定实施方案中，至少一个非小鼠免疫球蛋白序列是人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人免疫球蛋白序列是免疫球蛋白重链序列。
在一个方面，提供了在如本文中描述的非人动物中制备的抗体可变结构域序列。
在一个方面，提供了人治疗剂，其包括包含来源于如本文中描述的非人动物的序列的抗体可变结构域。
在一个方面，提供了从非人动物获得抗体可变区序列的方法，其中抗体可变区序列来源于人VH1-69区段或VH1-2区段，其中所述方法包括(a)用目的抗原免疫非人动物，其中非人动物在内源免疫球蛋白重链基因座上包含利用单个人可变区段对所有的或基本上所有的非人可变区段的置换，其中单个人可变区段是VH1-69区段或VH1-2区段，并且其中非人动物基本上不能够形成非来源于人VH1-69区段或VH1-2区段的免疫球蛋白重链可变区序列；(b)使非人动物发生针对目的抗原的免疫应答；和(c)鉴定或分离非人动物的免疫球蛋白重链可变区序列，其中抗体结合目的抗原。
在一个实施方案中，单个人可变区段是VH1-69区段。
在一个实施方案中，抗体可变区序列来源于SEQ ID NO:37。在一个实施方案中，抗体可变区序列与SEQ ID NO:37具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个实施方案中，抗体可变区序列包含SEQ ID NO:37。
在一个实施方案中，单个人可变区段是VH1-2区段。
在一个实施方案中，抗体可变区序列来源于SEQ ID NO:63。在一个实施方案中，抗体可变区序列与SEQ ID NO:63具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个实施方案中，抗体可变区序列包含SEQ ID NO:63。
在一个方面，提供了用于在非人动物中产生人抗体可变区库的方法，其中所述库的人重链可变区来源于相同的VH基因家族成员以及多个DH区段的一个和多个JH区段的一个，其中所述库的特征在于具有来自单个VH基因家族成员的重链免疫球蛋白FR1(框架1)、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一个实施方案中，库的特征还在于具有多个不同的CDR3+FR4序列。
在一个实施方案中，单个VH基因家族选自VH家族1、2、3、4、5、6和7。在特定实施方案中，单个VH基因家族是VH家族1。在一个实施方案中，单个VH基因家族成员选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。在特定实施方案中，单个VH基因家族成员是VH1-69。
在一个实施方案中，库包含来源于VH1-69区段的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在特定实施方案中，库包含来源于SEQ ID NO:38的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在特定实施方案中，库包含SEQ ID NO:38的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。
在一个实施方案中，库包含来源于VH1-2区段的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在特定实施方案中，库包含来源于SEQ IDNO:64的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在特定实施方案中，库包含SEQ ID NO:64的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。
在一个方面，提供了用于在非人动物中产生多个不同的CDR3和FR4序列的方法，包括将包含具受限制的制至单个VH区段家族成员的VH区段库的免疫球蛋白重链可变基因座的非人动物暴露于目的抗原，使非人动物产生针对抗原的免疫应答，其中所述免疫应答产生B细胞库，所述B细胞库的重链可变结构域各自来源于单个VH区段家族成员并且包含多个不同的CDR3和FR4序列。
在一个实施方案中，单个VH区段家族成员是人的区段。在一个实施方案中，非人动物选自小鼠、大鼠和兔。在一个实施方案中，目的抗原选自配体、受体、细胞内蛋白和分泌的蛋白。在一个实施方案中，目的抗原是人病原体。
在一个方面，提供了在如本文中描述的非人动物中制备的编码免疫球蛋白可变区的核苷酸序列。
在一个方面，提供了在如本文中描述的非人动物中制备的抗体的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列。
在一个方面，提供了在如本文中描述的非人中制备的编码抗体的可变区的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
在一个方面，提供了在如本文中描述的非人动物中制备的抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab)2、scFv)。
在一个方面，提供了用于制备经遗传修饰的非人动物的方法，包括利用一个或多个人免疫球蛋白重链基因区段置换非人动物的内源ADAM6基因座上游(针对免疫球蛋白重链基因区段的转录而言)的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段，和利用一个或多个人免疫球蛋白重链或轻链基因区段置换非人动物的ADAM6基因座下游(针对免疫球蛋白重链基因区段的转录而言)的一个或多个免疫球蛋白基因区段。在一个实施方案中，置换非人动物的内源ADAM6基因座上游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括V基因区段。在一个实施方案中，置换非人动物的内源ADAM6基因座上游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的人免疫球蛋白基因区段包括V和D基因区段。在一个实施方案中，置换非人动物的内源ADAM6基因座下游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括J基因区段。在一个实施方案中，置换非人动物的内源ADAM6基因座下游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括D和J基因区段。在一个实施方案中，置换非人动物的内源ADAM6基因座下游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括V、D和J基因区段。在特定实施方案中，置换非人动物的内源ADAM6基因座下游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个基因区段包括单个V基因区段、一个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段。
在一个实施方案中，在多能细胞、诱导多能细胞或全能细胞中ADAM6基因上游和/或下游的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段被置换以形成经遗传修饰的祖细胞；经遗传修饰的祖细胞被引入宿主中；和，使包含经遗传修饰的祖细胞的宿主怀孕以形成包含来源于经遗传修饰的祖细胞的基因组的非人动物。在一个实施方案中，宿主是胚胎。在特定实施方案中，宿主选自小鼠前-桑椹胚(例如8-或4-细胞期)、四倍体胚胎、胚胎细胞的聚集体或胚泡。
在一个方面，提供了非人动物，其中所述非人动物具有表达来源于单个V区段家族成员的免疫球蛋白重链可变结构域的B细胞库。在一个实施方案中，在B细胞库中表达的非人动物免疫球蛋白重链可变结构域的B细胞库的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90或至少95％来源于单个V区段家族成员。在特定实施方案中，百分比是至少90％。在一个实施方案中，B细胞库基本上由外周(血)B细胞组成。在一个实施方案中，B细胞库基本上由脾B细胞组成。在一个实施方案中，B细胞库基本上由骨髓B细胞组成。在一个实施方案中，B细胞库基本上由外周B细胞、脾B细胞和骨髓B细胞组成。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其中非人动物的多于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或多于90％的表达重链免疫球蛋白可变结构域的B细胞表达来源于单个VH基因区段家族成员的重链免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，非人动物的至少75％的表达免疫球蛋白重链可变结构域的B细胞表达来源于单个VH基因区段家族成员的免疫球蛋白重链可变结构域。在特定实施方案中，百分比是至少90％。在一个实施方案中，所有B细胞表达来源于单个VH基因家族成员的重链结构域。
在一个方面，提供了响应目的抗原的免疫而产生抗原特异性B细胞群的经遗传修饰的小鼠，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或多于90％的所述抗原特异性B细胞群表达全部来源于相同的VH基因区段的免疫球蛋白重链。在一个实施方案中，至少75％的抗原特异性B细胞群表达来源于相同的VH基因区段的免疫球蛋白重链。在一个实施方案中，所有的抗原特异性B细胞表达来源于相同的VH基因区段的重链。
在一个方面，提供了包含受限制的VH基因区段库的非人动物，其中限制至与VH1-69*01基因区段具有至少约75.5％、76.5％、86.7％、87.8％、94.9％、96.9％、98％或99％的同一性的人VH1-69基因区段或VH1-69基因区段。在特定实施方案中，受限制的库选自图7的VH1-69变体的一个或多个。
在一个方面，提供了包含受限制的VH基因区段库的非人动物，其中限制至与VH1-2基因区段具有至少约94.9％、95.9％、96.9％、98％或99％的同一性的人VH1-2基因区段或VH1-2基因区段。在特定实施方案中，受限制的库选自图10的VH1-2变体的一个或多个。
在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
在一个方面，提供了包含受限制的VH区段库的非人动物，其还包含人源化的免疫球蛋白轻链可变区段基因座，其中在小鼠中表达的λ对κ轻链的比率大致与野生型小鼠中的相同。
在一个方面，提供了非人动物，其包含特征在于单个VH基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段的存在的受限制的免疫球蛋白重链基因座，其中单个VH基因区段是多态VH基因区段。
在一个实施方案中，多态VH基因区段是与人群体中的高拷贝数相关的人VH基因区段。在一个实施方案中，人VH基因区段选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、VH3-23或其多态变体。在特定实施方案中，人VH基因区段是VH1-69基因区段。在另一个特定的实施方案中，人VH基因区段是VH1-2基因区段。
在一个实施方案中，单个VH基因区段可操作地连接至人、小鼠或嵌合的人/小鼠免疫球蛋白恒定区基因。在特定实施方案中，免疫球蛋白恒定区基因是小鼠恒定区基因。在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定基因包括选自人CH1、人铰链、人CH2、人CH3及其组合的人序列。在一个实施方案中，小鼠恒定基因在内源免疫球蛋白重链基因座上。
在一个实施方案中，非人动物还包含可操作地连接至J基因区段的人免疫球蛋白VL基因区段和轻链恒定基因。在特定实施方案中，VL基因区段和/或J基因区段选自人κ基因区段和人λ基因区段。在一个实施方案中，VL和/或J基因区段是人κ基因区段。
在多个实施方案中，非人动物包含所有的或基本上所有的内源VH基因区段的删除。
在多个实施方案中，非人动物包含失活的内源重链可变基因座。在多个实施方案中，失活的内源重链可变基因座不可操作地连接至内源重链恒定区基因。
在一个方面，提供了非人动物，其中所述非人动物的特征在于血清免疫球蛋白的表达，其中多于80％的血清免疫球蛋白表达人重链可变结构域和同源的人轻链可变结构域，其中人重链可变结构域来源于基本上由单个人VH基因区段和/或其多态变体组成的VH基因区段库。
在一个实施方案中，单个人VH基因区段是人VH1-69基因区段和/或其多态变体。在一个实施方案中，单个人VH基因区段是人VH1-2基因区段和/或其多态变体。
在一个方面，提供了非人动物，其在其种系中在内源免疫球蛋白重链基因座上包含利用单个人VH基因区段和/或其多态变体对所有的或基本上所有的内源VH基因区段的置换。
在一个实施方案中，非人动物还在内源免疫球蛋白轻链基因座上包含利用一个或多个人VL基因区段对所有的或基本上所有的内源VL基因区段的置换。在特定实施方案中，小鼠还包含一个或多个可操作地连接至人VL基因区段的人JL基因区段。
在一个方面，提供了表达包含至少一个人可变结构域/非人恒定结构域免疫球蛋白多肽的抗体的非人动物，其中非人动物从内源免疫球蛋白重链基因座表达非人ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。在一个实施方案中，内源免疫球蛋白重链基因座不能够重排以编码抗体的功能性重链。
在一个方面，提供了表达包含至少一个人可变结构域/非人恒定结构域免疫球蛋白多肽的抗体的非人动物，其中非人动物从非内源免疫球蛋白基因座的基因座表达非人ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物在非人动物的B细胞中表达，其中B细胞包括包含人可变序列和非人恒定序列的经重排的免疫球蛋白序列。
在一个实施方案中，非人恒定序列是啮齿类动物序列。在一个实施方案中，啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个方面，提供了用于制备不能生育的雄性非人动物的方法，包括使供体ES细胞的内源ADAM6等位基因无功能(或敲除所述等位基因)，将供体ES细胞引入宿主胚胎，使宿主胚胎在代孕母体中孕育和使代孕母体生育全部或部分来源于供体ES细胞的后代。在一个实施方案中，方法还包括繁殖后代以获得不能生育的雄性非人动物。
在一个方面，提供了用于制备具有目的遗传修饰的非人动物的方法，其中所述非人动物是不能生育的，所述方法包括如下步骤：(a)在基因组中制备目的遗传修饰；(b)修饰基因组以敲除内源ADAM6等位基因或使得内源ADAM6等位基因无功能；和(c)将基因组用于制备非人动物。在多个实施方案中，基因组来自ES细胞或用于核移植实验。
在一个方面，提供了使用如本文中描述的靶向载体、核苷酸构建体或细胞制备的非人动物。
在一个方面，提供了如本文中描述的非人动物与为野生型非人动物或经遗传修饰的第二非人动物的交配的后代。
在一个方面，提供了用于维持非人动物品系的方法，其中非人动物品系包含利用一个或多个异源免疫球蛋白重链序列对非人免疫球蛋白重链序列的置换。在一个实施方案中，一个或多个异源免疫球蛋白重链序列是人免疫球蛋白重链序列。
在一个实施方案中，非人动物品系包含一个或多个非人VH、DH和/或JH基因区段删除。在一个实施方案中，非人动物还包含单个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和/或一个或多个人JH基因区段。在一个实施方案中，非人动物包含单个人VH基因区段、至少27个人DH基因区段和至少6个人JH基因区段。在特定实施方案中，非人动物包含单个人VH基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段，其中所述单个人VH基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段可操作地连接至恒定区基因。在一个实施方案中，恒定区基因是非人恒定区基因。在一个实施方案中，恒定区基因包含选自CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4及其组合的小鼠或大鼠恒定区基因序列。在多个实施方案中，单个人VH基因区段是人VH1-69或人VH1-2基因区段。
在一个实施方案中，方法包括产生对于非人免疫球蛋白重链序列的置换是杂合的雄性非人动物，和将杂合的雄性非人动物与野生型雌性非人动物或对于人重链序列是纯合或杂合的雌性非人动物进行繁殖。在一个实施方案中，方法包括通过将杂合的雄性与野生型的或对于人重链序列是纯合或杂合的雌性进行反复繁殖来维持非人动物品系。
在一个实施方案中，方法包括从对于人重链序列是纯合或杂合的雄性或雌性非人动物获得细胞，和将那些细胞用作供体细胞或将来自其的细胞核用作供体细胞核，以及将细胞或细胞核用于通过使用宿主细胞和/或使细胞和/或细胞核在代孕母体中孕育来制备经遗传修饰的非人动物。
在一个实施方案中，仅将对于重链基因座上的置换是杂合的雄性非人动物与雌性非人动物繁殖。在特定实施方案中，雌性非人动物针对经置换的重链基因座是纯合、杂合或野生型的。
在一个实施方案中，非人动物还在内源免疫球蛋白轻链基因组上包含利用异源免疫球蛋白轻链序列对λ和/或κ轻链可变序列的置换。在一个实施方案中，异源免疫球蛋白轻链序列是人免疫球蛋白λ和/或κ轻链可变序列。
在一个实施方案中，非人动物还在非内源免疫球蛋白基因座上包含转基因，其中所述转基因包含编码可操作地连接(对于未经重排的)或融合(对于经重排的)至免疫球蛋白轻链恒定区序列的经重排的或未经重排的异源λ或κ轻链序列(例如未经重排的VL和未经重排的JL或经重排的VLJL)的序列。在一个实施方案中，异源λ或κ轻链序列是人的序列。在一个实施方案中，恒定区序列选自啮齿类动物、人和非人灵长类动物。在一个实施方案中，恒定区序列选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方案中，转基因包含驱动轻链序列的表达的非免疫球蛋白启动子。在特定实施方案中启动子是转录活性启动子。在特定实施方案中，启动子是ROSA26启动子。
在一个方面，提供了用于制备经遗传修饰的非人动物的方法，包括对于第一修饰将包含非人免疫球蛋白基因区段的非人核苷酸序列插入动物的基因组中，其中所述插入维持内源ADAM6基因，随后对于第二修饰使得非人动物的内源免疫球蛋白重链基因座无功能。在一个实施方案中，在内源免疫球蛋白重链恒定区基因的上游进行第一修饰并且进行第二修饰以将内源免疫球蛋白重链基因座倒置、易位或置于可操作的连接之外以便内源免疫球蛋白重链基因座不能够重排以编码功能性重链可变区。
在一个方面，提供了用于制备经遗传修饰的非人动物的方法，包括利用包含人免疫球蛋白基因区段的序列置换包含非人免疫球蛋白基因区段和非人ADAM6(或在雄性非人动物中具有功能的直系同源物或其同源物或片段)核苷酸序列的非人核苷酸序列以形成第一嵌合基因座，随后将包含非人ADAM6-编码序列(或编码其直系同源物或同源物或功能性片段的序列)的序列插入包含人免疫球蛋白基因区段的序列以形成第二嵌合基因座。
在一个实施方案中，第二嵌合基因座包含人免疫球蛋白重链可变(VH)基因区段。在一个实施方案中，第二嵌合基因座包含人免疫球蛋白轻链可变(VL)基因区段。在特定实施方案中，第二嵌合基因座包含可操作地连接至人DH基因区段和人JH基因区的人VH基因区段或人VL基因区段。在其它特定的实施方案中，第二嵌合基因座可操作地连接至包含与小鼠CH2+CH3序列融合的人CH1序列或人CH1和人铰链序列的第三嵌合基因座。
在一个方面，提供了包括包含小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠用于制备可生育的雄性小鼠的用途，其中所述用途包括将包括包含小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠与缺乏功能性内源小鼠ADAM6基因座或序列的小鼠交配，和获得作为能够产生具有异位ADAM6基因座或序列的后代的雌性或作为包含异位ADAM6基因座或序列的雄性的后代，并且雄性显示出与野生型雄性小鼠所显示的生育能力大致相同的生育能力。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备免疫球蛋白可变区核苷酸序列的用途。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备完全人Fab或完全人F(ab)2的用途。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备永生化细胞系的用途。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备杂交瘤或四源杂交瘤的用途。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备包含人重链可变区和人轻链可变区的噬菌体文库的用途。
在一个实施方案中，人重链可变区来源于包含选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:59的序列的人VH1-69基因区段。
在一个实施方案中，人重链可变区来源于包含选自SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的序列的人VH1-69基因区段。
在一个实施方案中，人重链可变区全部来源于包含选自SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和SEQ IDNO:71的序列的人VH1-2基因区段。
在一个实施方案中，人重链可变区全部来源于包含选自SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70和SEQ IDNO:72的序列的人VH1-2基因区段。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于产生用于制备人抗体的可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原免疫如本文中描述的小鼠，(b)从(a)的经免疫的小鼠分离淋巴细胞，(c)将淋巴细胞暴露于一种或多种经标记的抗体，(d)鉴定能够结合目的抗原的淋巴腺，和(e)从淋巴细胞扩增一种或多种可变区核酸序列从而产生可变区序列。
在一个实施方案中，淋巴细胞来源于小鼠的脾。在一个实施方案中，淋巴细胞来源于小鼠的淋巴结。在一个实施方案中，淋巴细胞来源于小鼠的骨髓。
在一个实施方案中，经标记的抗体是荧光团缀合的抗体。在一个实施方案中，一种或多种荧光团缀合的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在一个实施方案中，淋巴细胞是B细胞。
在一个实施方案中，一种或多种可变区核酸序列包括重链可变区序列。在一个实施方案中，一种或多种可变区核酸序列包括轻链可变区序列。在特定实施方案中，轻链可变区序列是免疫球蛋白κ轻链可变区序列。在一个实施方案中，一种或多种可变区核酸序列包括重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方案中，提供了如本文中描述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原免疫如本文中描述的小鼠，(b)从(a)的经免疫的小鼠分离脾，(c)将来自脾的B淋巴细胞暴露于一种或多种经标记的抗体，(d)鉴定能够结合目的抗原的(c)的B淋巴细胞，和(e)从B淋巴细胞扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列从而产生重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方案中，提供了如本文中描述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原免疫如本文中描述的小鼠，(b)从(a)的经免疫的小鼠分离一个或多个淋巴结，(c)将来自一个或多个淋巴结的B淋巴细胞暴露于一种或多种经标记的抗体，(d)鉴定能够结合目的抗原的(c)的B淋巴细胞，和(e)从B淋巴细胞扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列从而产生重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方案中，提供了如本文中描述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原免疫如本文中描述的小鼠，(b)从(a)的经免疫的小鼠分离骨髓，(c)将来自骨髓的B淋巴细胞暴露于一种或多种经标记的抗体，(d)鉴定能够结合目的抗原的(c)的B淋巴细胞，和(e)从B淋巴细胞扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列从而产生重链和κ轻链可变区序列。在多个实施方案中，一种或多种经标记的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在多个实施方案中，目的抗原是折磨人受试者的病原体，包括例如病毒抗原。示例性病毒病原体包括例如主要地腺病毒科、细菌细小RNA病毒科、疱疹病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科、多瘤病毒属、弹状病毒科和披膜病毒科的家族的那些病原体。这样的示例性病毒通常在20-300纳米的长度范围内。在多个实施方案中，目的抗原是选自肝炎病毒(例如HCV、HBV等)、人免疫缺陷病毒(HIV)或流感病毒的病毒抗原。
在多个实施方案中，提供了如本文中描述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，其还包括将扩增的重链和轻链可变区序列与人重链和轻链恒定区序列融合，将融合的重链和轻链序列在细胞中表达，和回收表达的重链和轻链序列从而产生人抗体。
在多个实施方案中，人重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在多个实施方案中，IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在多个实施方案中，人重链恒定区包含CH1、铰链、CH2、CH3、CH4或其组合。在多个实施方案中，轻链恒定区是免疫球蛋白κ恒定区。在多个实施方案中，细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、PC3细胞、T47D细胞、THP-1细胞、U87细胞、SHSY5Y(人神经母细胞瘤)细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CHO细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)和MC3T3细胞。在特定实施方案中，细胞是CHO细胞。
在一个方面，提供了用于产生特异性针对目的抗原的反向嵌合的啮齿类动物-人抗体的方法，包括如下步骤：用抗原免疫如本文中描述的小鼠，从小鼠分离至少一种产生特异性针对抗原的反向嵌合的小鼠-人抗体的细胞，培养所述至少一种产生特异性针对抗原的反向嵌合的小鼠-人抗体的细胞，和获得所述抗体。
在一个实施方案中，反向嵌合的小鼠-人抗体包含与小鼠或大鼠重链恒定基因融合的人重链可变结构域和与小鼠或大鼠或人轻链恒定基因融合的人轻链可变结构域。在特定实施方案中，人重链可变结构域包含经重排的人VH1-69或人VH1-2基因区段。
在一个实施方案中，培养至少一种产生特异性针对抗原的反向嵌合的啮齿类动物-人抗体的细胞是在至少一种由从小鼠分离的至少一种细胞产生的杂交瘤细胞上进行的。
在一个方面，提供了用于产生特异性针对抗原的完全人抗体的方法，其包括如下步骤：用抗原免疫如本文中描述的小鼠，从小鼠分离至少一种产生特异性针对抗原的反向嵌合的啮齿类动物-人抗体的细胞，产生至少一种产生来源于特异性针对抗原的反向嵌合的啮齿类动物-人抗体的完全人抗体的细胞，和培养至少一种产生完全人抗体的细胞，和获得所述完全人抗体。
在多个实施方案中，从小鼠分离的产生特异性针对抗原的反向嵌合的啮齿类动物-人抗体的至少一种细胞是脾细胞或B细胞。
在多个实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在多个实施方案中，抗体包括包含经重排的人VH1-69或人VH1-2基因区段的人重链可变结构域。
在多个实施方案中，利用目的抗原的免疫是利用蛋白、DNA、DNA和蛋白的组合或表达抗原的细胞来进行的。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的方法。在一个实施方案中，核酸序列用于制备人抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，小鼠用于制备选自抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、双特异性scFv、diabody、triabody、tetrabody、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即双重可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即单可变结构域抗原结合蛋白)、或双特异性T细胞衔接器(BiTE)的抗原结合蛋白。
在一个方面，提供了用于制备人抗原结合蛋白的方法，包括将如本文中描述的经遗传修饰的非人动物暴露于目的抗原，使非人动物发生针对抗原的免疫应答，从非人动物获得编码特异性结合目的抗原的人重链可变结构域的重链可变结构域核酸序列，将重链可变结构域核酸序列与人恒定区序列融合，和在哺乳动物细胞中表达包含人重链可变结构域核酸序列和人恒定区序列的抗体。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个实施方案中，非人动物包含基本上由可操作地连接至一个或多个人D和/或J区段的单个人VH基因区段(任选的以两种或更多种多态变体存在)组成的人VH基因区段库。在一个实施方案中，人VH基因区段库在内源非人VH基因区段基因座上。在一个实施方案中，人VH基因区段库在非内源VH基因区段基因座的基因座上。在一个实施方案中，人VH基因区段与人D区段和人J区段重排以形成可操作地连接至恒定区序列的经重排的人VDJ基因，其中恒定区序列选自人序列和啮齿类动物序列(例如小鼠或大鼠或仓鼠序列)。在一个实施方案中，恒定区序列包含选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的序列；在特定实施方案中，恒定区序列包含CH1、铰链、CH2和CH3。在一个实施方案中，将人可变结构域和恒定序列与获自相同小鼠的同源人轻链可变结构域(例如获自与人可变结构域序列相同的B细胞的序列)在哺乳动物细胞中表达；在一个实施方案中，随后将获自小鼠的编码人轻链可变结构域的序列与编码人轻链恒定序列的序列融合，并在哺乳动物细胞中表达轻链序列和重链序列。
在一个方面，提供了用于制备结合目的抗原的抗体重链可变结构域的方法，包括在单个细胞中表达(a)经免疫的如本文中描述的非人动物的第一VH序列，其中第一VH序列与CH基因序列融合；和(b)经免疫的如本文中描述的非人动物的VL基因序列，其中VL基因序列与人CL基因序列融合；在足以表达抗体的条件下维持细胞；和分离抗体重链可变结构域。在一个实施方案中，VL基因序列与第一VH序列是同源的。
在一个实施方案中，细胞包含经免疫的如本文中描述的非人动物的第二VH基因序列，其中第二VH基因序列与CH基因序列融合，其中第一VH基因序列编码特异性结合第一表位的VH结构域，并且第二VH基因序列编码特异性结合第二表位的VH结构域，其中第一表位和第二表位是不相同的。
在一个实施方案中，恒定区序列全是人恒定区序列。
在一个方面，提供了用于制备人双特异性抗体的方法，包括使用如本文中描述的非人动物的B细胞的人可变区基因序列制备双特异性抗体。
在一个实施方案中，方法包括(a)鉴定非人动物的经克隆选择的淋巴细胞，其中已使非人动物暴露于目的抗原并使其产生针对目的抗原的免疫应答，并且其中淋巴细胞表达特异性结合目的抗原的抗体，(b)从淋巴细胞或抗体获得编码特异性结合目的抗原的人重链可变区的核苷酸序列，和(c)将编码特异性结合目的抗原的人重链可变区的核苷酸序列用于制备双特异性抗体。在特定实施方案中，人重链可变区包含经重排的VH1-2或VH1-69基因区段。
在一个实施方案中，在第一次针对第一目的抗原进行步骤(a)至(c)以产生第一人重链可变区序列，并在第二次针对第二目的抗原进行步骤(a)至(c)以产生第二人重链可变区序列，并且其中第一人重链可变区序列与第一人重链恒定区融合地表达以形成第一人重链，第二人重链可变区序列与第二人重链恒定区融合地表达以形成第二人重链，其中第一和第二人重链在从经重排的人Vκ1-39或人Vκ3-20基因区段表达的单个人轻链存在的情况下表达。在特定实施方案中，单个人轻链包含种系序列。
在一个实施方案中，方法包括(a)从来自已暴露于第一目的抗原的如本文中描述的非人动物和已暴露于第二目的抗原的相同的非人动物或遗传上相同的不同的非人动物的B细胞克隆重链可变区；和(b)在细胞中表达(a)的重链可变区与相同的重链恒定区和相同的轻链以制备双特异性抗体。
在一个方面，提供了如本文中描述的非人动物用于获得编码人重链可变结构域的核酸序列的用途。在一个实施方案中，重链可变结构域包含经重排的选自VH1-2和VH1-69的人VH基因区段。
在一个方面，提供了如本文中描述的非人动物用于获得编码人重链可变结构域的细胞的用途。在一个实施方案中，重链可变结构域包含经重排的选自VH1-2和VH1-69的人VH基因区段。
在一个方面，提供了如本文中描述的非人动物用于制备人抗体可变结构域的用途。在一个方面，提供了如本文中描述的非人动物用于制备人抗体的用途。在一个实施方案中，人抗体是人双特异性抗体。在多个实施方案中，可变结构域和/或抗体包含经重排的选自VH1-2和VH1-69的人VH基因区段。
在一个方面，提供了如本文中描述的非人动物用于选择人免疫球蛋白重链可变结构域的用途。在一个实施方案中，重链可变结构域包含经重排的选自VH1-2和VH1-69的人VH基因区段。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于将异位ADAM6序列引入缺乏功能性内源小鼠ADAM6序列的小鼠的用途，其中所述用途包括将如本文中描述的小鼠与缺乏功能性内源小鼠ADAM6序列的小鼠交配。
在一个方面，提供了来自如本文中描述的小鼠的遗传物质用于制备具有异位ADAM6序列的小鼠的用途。在一个实施方案中，用途包括使用如本文中描述的小鼠的细胞的细胞核的核移植。在一个实施方案中，用途包括克隆如本文中描述的小鼠的细胞以产生来源于所述细胞的动物。在一个实施方案中，用途包括将如本文中描述的小鼠的精子或卵子用于制备包含异位ADAM6序列的小鼠的方法。
在一个方面，提供了用于制备包含经修饰的免疫球蛋白重链基因座的可生育的雄性小鼠的方法，包括利用包含在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因或直系同源物或其同源物或片段的第二小鼠生殖细胞使包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的第一小鼠生殖细胞受精；形成受精的细胞；使受精的细胞发育成胚胎；和，在代孕体中孕育胚胎以获得小鼠。
在一个实施方案中，通过交配雄性小鼠和雌性小鼠来实现受精。在一个实施方案中，雌性小鼠包含ADAM6基因或直系同源物或其同源物或片段。在一个实施方案中，雄性小鼠包含ADAM6基因或直系同源物或其同源物或片段。
在一个方面，提供了编码小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或对应的ADAM6蛋白的功能性片段的核酸序列用于恢复或增强具有包含免疫球蛋白重链基因座的修饰的基因组的小鼠的生育能力的用途，其中所述修饰减少或消除内源ADAM6功能。
在一个实施方案中，核酸序列在异位的位置整合至小鼠的基因组中。在一个实施方案中，核酸序列在内源免疫球蛋白基因座上整合至小鼠的基因组中。在特定实施方案中，内源免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方案中，核酸序列在非内源免疫球蛋白基因座的位置上整合至小鼠的基因组中。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于生产药剂(例如抗原结合蛋白)或用于生产编码药剂(例如抗原结合蛋白)的可变序列的序列以用于治疗人类疾病或病症的用途。在一个实施方案中，药剂的可变序列包括多态人VH基因区段。在一个实施方案中，药剂的可变序列包括人VH1-69基因区段。药剂的可变序列包括人VH1-2基因区段。
在一个方面，提供了在小鼠中制备的编码免疫球蛋白可变结构域的核酸构建体。在一个实施方案中，可变结构域是治疗可变结构域。在特定实施方案中，重链可变结构域包括选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23的人VH基因区段。在另一个特定的实施方案中，重链可变结构域包括人VH1-2基因区段。在另一个特定的实施方案中，重链可变结构域包括人VH1-69基因区段。
在一个实施方案中，可变结构域是轻链可变结构域。在特定实施方案中，可变结构域是与包含经重排的人VH1-69基因区段的人重链可变结构域同源的κ轻链可变结构域。在特定实施方案中，可变结构域是与包含经重排的人VH1-2基因区段的人重链可变结构域同源的κ轻链可变结构域。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备编码人免疫球蛋白可变结构域的核酸构建体的用途。在一个实施方案中，可变结构域是轻链可变结构域。在一个实施方案中，可变结构域是包含经重排的选自Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40的人Vκ基因区段的κ轻链可变结构域。
在一个实施方案中，可变结构域是重链可变结构域。在特定实施方案中，重链可变结构域包括经重排的选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23的人Vκ基因区段。在特定实施方案中，重链可变结构域包括经重排的人VH1-69基因区段。在特定实施方案中，重链可变结构域包括经重排的人VH1-2基因区段。
在一个方面，提供了如本文中描述的小鼠用于制备人免疫球蛋白可变结构域的用途。在一个实施方案中，可变结构域是轻链可变结构域。在一个实施方案中，可变结构域是包含经重排的选自Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40的人Vκ基因区段的κ轻链可变结构域。
在一个实施方案中，可变结构域是重链可变结构域。在特定实施方案中，重链可变结构域包括经重排的选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23的人VH基因区段。在特定实施方案中，重链可变结构域包括经重排的人VH1-69基因区段。在特定实施方案中，重链可变结构域包括经重排的人VH1-2基因区段。
多个方面和实施方案能够一起使用，除非明确地另外指出或上下文清楚地禁止一起使用。
附图概述
图1显示用于制备用于构建在内源免疫球蛋白重链基因座上包含单个人VH1-69基因区段、27个人DH和6个人JH基因区段的经修饰的重链基因座的靶向载体的一系列靶向和分子工程化步骤的一般性图解(不按照比例的)。
图2显示用于制备用于构建在内源免疫球蛋白重链基因座上包含单个人VH1-2基因区段、27个人DH和6个人JH基因区段的经修饰的重链基因座的靶向载体的一系列靶向和分子工程化步骤的一般性图解(不按照比例的)。
图3显示用于制备用于构建在内源免疫球蛋白重链基因座上包含单个人VH1-69基因区段、27个人DH、6个人JH基因区段和编码小鼠ADMA6的异位基因组片段的经修饰的重链基因座的靶向载体的一系列靶向和分子工程化步骤的一般性图解(不按照比例的)。
图4显示用于制备用于构建在内源免疫球蛋白重链基因座上包含单个人VH1-2基因区段、27个人DH、6个人JH基因区段和编码小鼠ADMA6的异位基因组片段的经修饰的重链基因座的靶向载体的一系列靶向和分子工程化步骤的一般性图解(不按照比例的)。
图5显示人VH1-69基因的13个被报道的等位基因的每一个的第二外显子的核苷酸比对。小写字体的碱基表示等位基因之间的种系核苷酸差异。互补决定区(CDR)用序列周围的方框指出。破折号表示用于恰当的序列比对的人工缺口。VH1-69*01(SEQ ID NO:37)；VH1-69*02(SEQ ID NO:39)；VH1-69*03(SEQ ID NO:41)；VH1-69*04(SEQ ID NO:43)；VH1-69*05(SEQ ID NO:45)；VH1-69*06(SEQ IDNO:47)；VH1-69*07(SEQ ID NO:49)；VH1-69*08(SEQ ID NO:51)；VH1-69*09(SEQ ID NO:53)；VH1-69*10(SEQ ID NO:55)；VH1-69*11(SEQ ID NO:57)；VH1-69*12(SEQ ID NO:59)；VH1-69*13(SEQ IDNO:61)。
图6显示人VH1-69基因的13个被报道的等位基因的每一个的成熟重链可变基因序列的蛋白比对。小写字体的氨基酸表示等位基因之间的种系差异。互补决定区(CDR)用序列周围的方框指出。破折号表示用于恰当的序列比对的人工缺口。VH1-69*01(SEQ ID NO:38)；VH1-69*02(SEQ ID NO:40)；VH1-69*03(SEQ ID NO:42)；VH1-69*04(SEQ ID NO:44)；VH1-69*05(SEQ ID NO:46)；VH1-69*06(SEQ IDNO:48)；VH1-69*07(SEQ ID NO:50)；VH1-69*08(SEQ ID NO:52)；VH1-69*09(SEQ ID NO:54)；VH1-69*10(SEQ ID NO:56)；VH1-69*11(SEQ ID NO:58)；VH1-69*12(SEQ ID NO:60)；VH1-69*13(SEQ IDNO:62)。
图7显示经比对的人VH1-69基因的13个被报道的等位基因的每一个的成熟可变基因的蛋白序列的百分比同一性/百分比相似性矩阵。VH1-69等位基因之间的百分比同一性显示在深色方框上方，百分比相似性显示在深色方框下方。百分比同一性和百分比相似性的分数通过ClustalW(v1.83)比对工具使用MacVector软件(MacVector,Inc.,North Carolina)来评价。
图8显示人VH1-2基因的5个被报道的等位基因的每一个的第二外显子的核苷酸比对。小写字体的碱基表示等位基因之间的种系核苷酸差异。互补决定区(CDR)用序列周围的方框指出。破折号表示用于恰当的序列比对的人工缺口。VH1-2*01(SEQ ID NO:63)；VH1-2*02(SEQ ID NO:65)；VH1-2*03(SEQ ID NO:67)；VH1-2*04(SEQ ID NO:69)；VH1-2*05(SEQ ID NO:71)。
图9显示人VH1-2基因的5个被报道的等位基因的每一个的成熟重链可变基因序列的蛋白比对。小写字体的氨基酸表示等位基因之间的种系差异。互补决定区(CDR)用序列周围的方框指出。破折号表示用于恰当的序列比对的人工缺口。VH1-2*01(SEQ ID NO:64)；VH1-2*02(SEQ ID NO:66)；VH1-2*03(SEQ ID NO:68)；VH1-2*04(SEQ ID NO:70)；VH1-2*05(SEQ ID NO:72)。
图10显示经比对的人VH1-2基因的5个被报道的等位基因的每一个的成熟可变基因的蛋白序列的百分比同一性/百分比相似性矩阵。VH1-2等位基因之间的百分比同一性显示在深色方框上方，百分比相似性显示在深色方框下方。百分比同一性和百分比相似性的分数通过ClustalW(v1.83)比对工具使用MacVector软件(MacVector,Inc.,North Carolina)来评价。
详述
本发明不限于描述的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可变化。还应理解本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意欲是限制性的，因为本发明的范围由权利要求来限定。
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语和短语包含该术语和短语在本领域中已具有的意义，除非明确地相反指出或从使用术语或短语的上下文可明显得出相反的方面。尽管相似或等价于本文中描述的方法和材料的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但仍然于此处描述具体的方法和材料。
当用于指基因区段的量(例如“基本上所有的”V基因区段)时，短语“基本上”或“基本上的”包括功能性和非功能性基因区段并且在多个实施方案中，包括例如所有基因区段的80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多；在多个实施方案中，“基本上所有的”基因区段包括例如功能性(例如非假基因)基因区段的至少95％、96％、97％、98％或99％。
术语“置换”包括其中将DNA以这样的方式置入细胞的基因组中以便利用异源序列(例如小鼠中的人序列)在基因组序列的基因座上置换基因组内的序列。这样置入的DNA序列可包括一种或多种作为用于获得这样置入的序列的源DNA的部分的调节性序列(例如，启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区、适当的重组信号序列等)。例如，在多个实施方案中，置换是导致来自这样置入的DNA序列(包含异源序列)的基因产物的产生而非内源序列的表达的异源序列对内源序列的取代；置换是利用编码具有与由内源基因组序列编码的蛋白相似功能的蛋白的DNA序列(例如，内源基因组序列编码免疫球蛋白基因或结构域，DNA片段编码一个或多个人免疫球蛋白基因或结构域)对内源基因组序列的置换。在多个实施方案中，内源基因或其片段被对应的人基因或其片段置换。对应的人基因或其片段是作为被置换的内源基因或其片段的直系同源物、同源物或与其在结构和/或功能上相同或基本上相同的人基因或片段。
作为遗传模型的小鼠已通过允许研究特定基因的定向过表达或删除的作用的转基因和敲除技术而得到极大的加强。尽管其有很多优势，但小鼠仍然显示出使得其成为用于人类疾病的有缺陷的模型和用于测试人治疗剂或制备其的有缺陷的平台的遗传障碍。首先，尽管约99％的人基因具有小鼠同源物(Waterston等人,2002,Initial sequencingand comparative analysis of the mouse genome,Nature 420:520-562)，但潜在的治疗剂常常不能与期望的人靶标的小鼠同源物交叉反应或不充分地交叉反应。为了避免这个问题，选择的靶基因可以是“人源化的”，即小鼠基因可以被去除并用对应的人直系同源基因序列置换(例如US 6,586,251,US 6,596,541和US 7,105,348)。最初，通过“敲除加转基因人源化”策略人源化小鼠基因的工作需要将具有内源基因的删除(即敲除)的小鼠与具有经随机整合的人转基因的小鼠杂交(参见例如，Bril等人,2006,Tolerance to factor VIII in a transgenicmouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593)toCys substitution,Thromb Haemost 95:341-347；Homanics等人,2006,Production and characterization of murine models of classic andintermediate maple syrup urine disease,BMC Med Genet 7:33；Jamsai等人,2006,A humanized BAC transgenic/knockout mouse model forHbE/beta-thalassemia,Genomics 88(3):309-15；Pan等人,2006,Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer inpreT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilonheterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma-and CD3gammadelta-deficient mice,Mol Immunol 43:1741-1750)。但尺寸限制阻碍了这些工作；常规敲除技术不足以将大的小鼠基因直接置换为其大的人基因组对应物。因技术困难而很少尝试其中在小鼠基因的相同的精确遗传位置上(即在内源小鼠基因座上)利用人对应基因直接置换内源小鼠基因的直接的同源置换的径直方法。直到现在，对于直接置换的工作仍牵涉精细而繁重的程序，从而限制了可处理的遗传物质的长度和其可被操作的精确度。
外源引入的人免疫球蛋白转基因在小鼠的前体B细胞中重排(Alt等人,1985,Immunoglobulin genes in transgenic mice,Trends Genet1:231-236)。通过使用敲除加转基因法工程化小鼠以表达人抗体来对该发现进行了利用(Green等人,1994,Antigen-specific humanmonoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavyand light chain YACs,Nat Genet 7:13-21；Lonberg等人,1994,Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinctgenetic modifications,Nature 368:856-859；Jakobovits等人,2007,From XenoMouse technology to panitumumab,the first fully humanantibody product from transgenic mice,Nat Biotechnol25:1134-1143)。在这些小鼠中通过每个内源基因座的小而关键部分的靶向删除来失活小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座，随后将人免疫球蛋白基因座作为随机整合的大转基因(如上所述的)或微型染色体引入(Tomizuka等人,2000,Double trans-chromosomic mice:maintenance of two individual human chromosome fragmentscontaining Ig heavy and kappa loci and expression of fully humanantibodies,PNAS USA 97:722-727)。这样的小鼠代表了遗传工程的重大进步；从其分离的完全人单克隆抗体产生可潜在用于治疗众多人类疾病的有前景的治疗剂(Gibson等人,2006,Randomized phase IIItrial results of panitumumab,a fully human anti-epidermal growthfactor receptor monoclonal antibody,in metastatic colorectal cancer,Clin Colorectal Cancer 6:29-31；Jakobovits等人,2007；Kim等人,2007,Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax-CD4):two Phase II studiesin refractory cutaneous T-cell lymphoma,Blood 109(11):4655-62；Lonberg,2005,Human antibodies from transgenic animals,NatBiotechnol 23:1117-1125；Maker等人,2005,Tumor regression andautoimmunity in patients treated with cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4blockade and interleukin 2:a phaseI/II study,Ann Surg Oncol 12:1005-1016；McClung等人,2006,Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density,New Engl J Med 354:821-831)。但如上讨论的，当与野生型小鼠相比较时，这些小鼠显示受损的B细胞发育和免疫缺陷。这样的问题潜在地限制了小鼠支持强力的体液应答和从而产生针对一些抗原的完全人抗体的能力。缺陷可能是因由人免疫球蛋白转基因的随机引入和因上游和下游控制元件的缺乏而导致的不正确表达(Garrett等人,2005,Chromatin architecture near a potential 3'end of the IgH locusinvolves modular regulation of histone modifications during B-Celldevelopment and in vivo occupancy at CTCF sites,Mol Cell Biol25:1511-1525；Manis等人,2003,Elucidation of a downstreamboundary of the 3'IgH regulatory region,Mol Immunol 39:753-760；Pawlitzky等人,2006,Identification of a candidate regulatory elementwithin the 5'flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-Bcell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1,Pax5,and E2A,J Immunol 176:6839-6851)而导致的无效的功能性、可削弱B细胞的正常成熟、增殖和存活所需的信号转导过程的人恒定结构域与细胞表面上B细胞受体信号复合物的小鼠组分(Hombach等人,1990,Molecular components of the B-cell antigen receptor complex ofthe IgM class,Nature 343:760-762)之间的无效的种间相互作用和可减少亲和性选择(Rao等人,2002,Differential expression of theinhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells:implications for selection of high-affinity B cells,J Immunol169:1859-1868)和免疫球蛋白血清浓度(Brambell等人,1964,ATheoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism,Nature203:1352-1354；Junghans and Anderson,1996,The protectionreceptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containingneonatal intestinal transport receptor,PNAS USA 93:5512-5516；Rao等人,2002；Hjelm等人,2006,Antibody-mediated regulation of theimmune response,Scand J Immunol 64:177-184；Nimmerjahn andRavetch,2007,Fc-receptors as regulators of immunity,Adv Immunol96:179-204)的可溶性人免疫球蛋白与小鼠Fc受体之间的无效的种间相互作用而引起的。这些缺陷可仅通过小鼠免疫球蛋白基因座的可变区在其在内源重链和轻链基因座上的天然位置内的原位人源化来矫正。这可有效地导致制备能够基于保留的小鼠恒定区与小鼠环境正常相互作用和选择的“反向嵌合的”(即人V：小鼠C)抗体的小鼠。采用该方法，可基于期望的嵌合基因座的复杂度构建特定形式的人源化基因座。还可将这样的反向嵌合抗体容易地重新改造为用于治疗剂目的的完全人抗体。
在内源免疫球蛋白重链基因座上包含利用异源(例如来自其它物种)免疫球蛋白序列的插入或置换的经遗传修饰的动物可连同内源免疫球蛋白轻链基因座上的插入或置换或连同免疫球蛋白轻链转基因(例如嵌合的免疫球蛋白轻链转基因或完全人完全鼠等)来制备。异源免疫球蛋白重链序列所来源于的物种可广泛地不同；用于免疫球蛋白轻链序列置换或免疫球蛋白轻链转基因的免疫球蛋白轻链序列也如此。示例性异源免疫球蛋白重链序列包括人序列。
免疫球蛋白可变区核酸序列例如V、D和/或J区段在多个实施方案中获自人或非人动物。适合用于提供V、D和/或J区段的非人动物包括例如硬骨鱼、软骨鱼例如鲨鱼和鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、鸟类(例如鸡)。非人动物包括例如哺乳动物。哺乳动物包括例如非人灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、骆驼、雪貂和啮齿类动物和非人灵长类动物(例如黑猩猩、猩猩、大猩猩、绒猴、恒河猴、狒狒)。适当的非人动物选自啮齿类动物家族包括大鼠、小鼠和仓鼠。在一个实施方案中，非人动物是小鼠。如由上下文明确的，将不同的非人动物可用作可变结构域或可变区基因区段的来源(例如鲨鱼、鳐鱼、哺乳动物例如骆驼、啮齿类动物例如小鼠和大鼠)。
根据上下文，还将非人动物用作用于连接可变序列或区段的恒定区序列的来源，例如将啮齿类动物恒定序列用于可操作地连接至人或非人可变序列(例如可操作地连接至例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠或仓鼠恒定序列的人或非人灵长类动物可变序列)的转基因中。因此，在多个实施方案中，人V、D和/或J区段可操作地连接至啮齿类动物(例如小鼠或大鼠或仓鼠)恒定区基因序列。在一些实施方案中，人V、D和/或J区段(或一个或多个经重排的VDJ或VJ基因)可操作地连接至或融合至在例如在非内源免疫球蛋白基因座的基因座上整合的转基因中的小鼠、大鼠或仓鼠恒定区基因序列。
在特定实施方案中，提供了在内源免疫球蛋白重链基因座上包含利用单个人VH、一个或多个DH和一个或多个JH基因区段对VH、DH和JH基因区段的置换的小鼠，其中单个人VH、一个或多个DH和一个或多个JH基因区段可操作地连接至内源免疫球蛋白重链基因；其中小鼠在非内源免疫球蛋白基因座的基因座上包含转基因，其中转基因包含可操作地连接至小鼠或大鼠或人恒定区的未经重排的或经重排的人VL和人JL基因区段。在多个实施方案中，单个人VH基因区段是多态基因区段。在一个实施方案中，单个人VH基因区段是人VH1-69基因区段或人VH1-2基因区段。
描述了用于利用受限制的人种系免疫球蛋白重链基因座对小鼠种系免疫球蛋白重链可变基因座的原位遗传置换和利用人种系免疫球蛋白κ轻链基因座对小鼠种系免疫球蛋白κ轻链可变基因座的原位遗传置换同时维持小鼠产生后代的能力的方法。特别地，描述了利用人免疫球蛋白重链和κ轻链序列对小鼠重链和κ轻链免疫球蛋白可变基因座的六个兆碱基的精确置换同时留下完整的小鼠恒定区。因此，已产生了具有利用人种系免疫球蛋白可变序列对其整个种系免疫球蛋白可变库的精确置换同时维持小鼠恒定区的小鼠。人可变区连接至小鼠恒定区以形成在生理上恰当的水平上重排和表达的嵌合的人-小鼠免疫球蛋白基因座。表达的抗体是“反向嵌合体”，即其包含人可变区序列和小鼠恒定区序列。
本文中描述的经遗传修饰的小鼠显示完全功能性体液免疫系统并提供用于制备有效用于对抗病原性抗原例如病毒抗原的药学上可接受的抗体和其它抗原结合蛋白的经天然亲和性成熟的人免疫球蛋白可变区序列的丰富来源。
人免疫球蛋白序列在小鼠的基因组中(即使在精确位置例如在内源小鼠免疫球蛋白基因座上)的工程化可因免疫球蛋白基因座在小鼠与人之间的趋异进化而呈现某些挑战。例如，散布在免疫球蛋白基因座之内的基因间序列在小鼠与人之间是不相同的并且在一些情况下可是功能上不等价的。小鼠与人之间在其免疫球蛋白基因座中的差异还可导致人源化小鼠的异常，特别地当人源化或操作内源小鼠免疫球蛋白重链基因座的某些部分时。在小鼠免疫球蛋白重链基因座上的一些修饰是有害的。有害的修饰可包括例如经修饰的小鼠交配和产生后代的能力的丢失。在多个实施方案中，在小鼠的基因组中工程化人免疫球蛋白序列包括维持当在经修饰的小鼠品系中不存在时是有害的内源序列的方法。示例性有害效应可包括不能够繁殖经修饰的品系、必需基因的功能的丢失、不能够表达多肽等。这样的有害效应可直接地或间接地与经工程化至小鼠基因组中的修饰相关。
尽管在具有人源化免疫球蛋白基因座的小鼠中观察到接近野生型的体液免疫功能，但当使用免疫球蛋白序列的直接置换时会遇到其它的在一些使用随机整合的转基因的方法中不会遇到的挑战。免疫球蛋白基因座的遗传组成在小鼠与人之间的差异已导致有益于具有经置换的免疫球蛋白基因区段的小鼠的繁殖的序列的发现。具体地，位于内源免疫球蛋白基因座之内的小鼠ADAM基因因其在生育能力中的作用而最适宜地在具有经置换的免疫球蛋白基因座的小鼠中存在。
进行了利用受限制的人免疫球蛋白重链基因座对小鼠重链免疫球蛋白基因座(VH-DH-JH)的可变区的六个兆碱基的精确的原位置换，同时在杂种的基因座内留下完整的和功能性的侧翼小鼠序列，包括所有的小鼠恒定链基因和基因座转录控制区(图1和图8)。进行了进一步的工程化步骤以维持赋予小鼠以可与野生型小鼠相比较的方式交配和产生后代的能力的小鼠序列(图9和图10)。具体地，使用遗传工程技术(参见例如，US Pat.No.6,586,251和Valenzuela等人,2003,High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis,NatBiotechnol 21:652-659)通过嵌合BAC靶向载体将单个人VH、27个DH和6个JH基因区段以及小鼠ADAM6基因引入小鼠ES细胞中。
具有受限制的免疫球蛋白重链可变基因区段的小鼠
提供了包括包含受限制的数量的VH基因、一个或多个D基因和一个或多个J基因的免疫球蛋白基因座的非人动物以及制备和使用其发方法。当用目的抗原免疫时，非人动物产生具有仅来源于受限制的经预选择的VH基因或一组VH基因(例如经预选择的VH基因及其变体)的抗体可变区的B细胞群。在多个实施方案中，提供了产生表达人抗体可变结构域的B细胞群的非人动物，所述人抗体可变结构域是与同源人轻链可变结构域一起的人重链可变结构域。在多个实施方案中，非人动物重排来自包含利用人未经重排的可变区序列对非人未经重排的可变区序列的置换或插入的经修饰的内源小鼠免疫球蛋白基因座的人重链可变基因区段和人轻链可变基因区段。
对免疫球蛋白基因的组织、结构和功能的早期工作部分地在具有失去功能的内源基因座和经工程化以具有在人轻链转基因存在或不存在的情况下随机地插入基因组的转基因的基因座(随机置入的)的小鼠上进行，所述转基因的基因座具有部分人免疫球蛋白基因，例如与人恒定基因连接的人重链基因的部分库。尽管这些小鼠对于制备有用的高亲和性抗体稍微较不是最优的，但它们促进了免疫球蛋白基因座的某些功能性分析。这些小鼠的一些具有少至两个或三个或仅单个重链可变基因。
已报道了表达来源于经随机插入的转基因(和失去功能的内源免疫球蛋白基因座)上的单个人VH5-51基因、10个人DH基因和6个人JH基因的具有人μ和γ1恒定基因的完全人免疫球蛋白重链的小鼠(Xuand Davis,2000,Diversity in the CDR3Region of VH Is Sufficient forMost Antibody Specificities,Immunity 13:37-45)。这些小鼠的完全人免疫球蛋白重链大部分与来源于内源小鼠λ轻链基因座(仅Vλ1-Jλ1或Vλ2-Jλ2)的仅两个完全小鼠λ轻链的一个表达，并且可不表达κ轻链(小鼠是Igκ-/-)。这些小鼠在B细胞发育和抗体表达上显示严重异常的功能障碍。据报道B细胞数量是野生型的5-10％，IgM水平是野生型的5-10％，以及IgG1水平仅是野生型的0.1-1％。被观察到的IgM库显示高度受限制的接合多样化(junctional diversity)。完全人重链显示抗原间高度相同的CDR3长度、抗原间相同的JH(JH2)使用和起始的接合Q残基，从而反映CDR3多样性的某些缺失。完全小鼠λ轻链几乎都在Jλ1中具有W96L取代作为起始接合残基。据报道小鼠不能够产生针对细菌多糖的任何抗体。因为人可变结构域与小鼠轻链偶联，所以人可变区的实用性是高度受限制的。
已报道了其它的仅具有单个人VH3-23基因、人DH和JH基因以及小鼠轻链基因的小鼠，但它们部分地因人VH与小鼠VL结构域之间的错配潜能而显示受限制的多样性(和因此受限制的可用性)(参见例如Mageed等人,2001,Rearrangement of the human heavy chainvariable region gene V3-23in transgenic mice generates antibodiesreactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3and residuesintrinsic to the heavy chain variable region,Clin.Exp.Immunol.123:1-5)。类似地，具有包含人μ恒定基因的转基因中的两个VH基因(3-23和6-1)以及人DH和JH基因(Bruggemann等人,1991,Human antibody production in transgenic mice:expression from 100kb of the human IgH locus,Eur.J.Immmunol.21:1323-1326)并在具有小鼠轻链的人IgM链中表达它们的小鼠可显示受到错配限制的库(Mackworth-Young等人,2003,The role of antigen in the selection of the human V3-23immunoglobulin heavy chain variable region gene,Clin.Exp.Immunol.134:420-425)。
还已报道了其它的从随机插入基因组的人转基因表达VH受限制的完全人重链的具有从经随机插入的完全人转基因表达的受限制的人λ库的转基因小鼠(参见例如，Taylor等人,1992,A transgenic mousethat expresses a diversity of human sequence heavy and light chainimmunoglobulins,Nucleic Acids Res.20(23):6287-6295；Wagner等人,1994,Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci intransgenic mice,Nucleic Acids Res.22(8):1389-1393)。然而，已知从随机整合至小鼠基因组中的转基因表达完全人抗体并且包含损坏的内源基因座的转基因小鼠相较于野生型小鼠显示免疫应答的实质性差异，这些差异影响可从这样的小鼠获得的抗体可变结构域的多样性。
优选地在一些实施方案中，产生从受限制的VH基因库和一个或多个D基因以及一个或多个J基因表达人抗体可变结构域的多样化B细胞群的有用的非人动物将能够产生将充分多样化的经重排的可变区基因库。在多个实施方案中，多样化包括接合多样化、体细胞高变和VH基因序列的多态多样性(对于其中VH基因以多态形式存在的实施方案)。组合多样化在VH基因与多个同源的人轻链可变结构域(其在多个实施方案中包括接合多样化和/或体细胞高变)的一个的配对中发生。
包含受限制的人VH基因库和完整的或基本上完整的人VL基因库的非人动物将在多个实施方案中产生反映不同来源的多样化例如接合多样化(例如VDJ、VJ连接、P添加、N添加)、组合多样化(例如同源的VH受限制的人重链、人轻链)和体细胞高变的B细胞群。在包括VH库至一个人VH基因的限制的实施方案中，一个人VH基因可以以两个或更多个变体存在。在多个实施方案中，VH基因的两个或更多个多态形式的存在将丰富B细胞群的可变结构域的多样性。
基因区段(例如V基因)的种系序列中的变化促成人中抗体应答的多样化。因V基因序列差异而导致的对多样化的相对贡献在V基因之间不同。多态性的程度在基因家族间不同，并反映在如在人群体中相关的与不相关的个体之间的VH单元型差异中所观察到的(参见例如，Souroujon等人,1989,Polymorphisms in Human H Chain VRegion Genes from the VHIII Gene Family,J.Immunol.143(2):706-711)能够产生其它多样性的多个单元型(具有共遗传的多态性的序列段)中。基于特别地来自多态人VH基因家族的数据，一些人认为种系中的单元型多样化是人群体中VH基因异质性的主要贡献因素，这反映在人群体间不同的种系VH基因的高度多样化中(参见,Sasso等人,1990,Prevalence and Polymorphism ofHuman VH3Genes,J.Immunol.145(8):2751-2757)。
尽管人群体因普遍的多态性而显示针对VH基因库的单元型高度多样化，但某些多态性反映在与人群体中观察到的普遍(即保守)等位基因中(Sasso等人,1990)。可以以两种原理形式描述VH多态性。第一种是从与相同基因区段的等位基因之间的核苷酸序列之间的差异相关的等位基因变异产生的变化。第二种产生自已在免疫球蛋白重链基因座上存在的众多复制、插入和/或删除。这导致独特的情形，其中通过复制来源于相同基因的VH基因因一个或多个核苷酸取代而与其各自的等位基因不同。这还直接地影响重链基因座上的VH基因的拷贝数。
人免疫球蛋白重链可变基因区段(VH基因)的多态等位基因大部分是因编码区内基因区段的插入/删除以及单个核苷酸差异(这两种均具有对免疫球蛋白分子产生功能性影响的潜能)引起的。表1示出了以人VH基因家族和经鉴定的每个VH基因在人免疫球蛋白重链基因座中的等位基因的数量列出的功能性VH基因。存在一些发现显示多态VH基因牵涉对某些疾病例如风湿性关节炎的易感性，然而在其它情况下VH与疾病之间的联系不太清楚。这样的不清楚可归因于不同的等位基因在不同的人群体中的拷贝数和存在。事实上，几个人VH基因显示拷贝数的变化(例如，VH1-2,VH1-69,VH2-26,VH2-70和VH3-23)。在多个实施方案中，具有受限制的VH库的如本文中描述的人源化小鼠包含个体VH家族成员的多个多态变体(例如在内源小鼠基因座上置换所有的或基本上所有的功能性小鼠VH区段的VH1-2,VH1-69,VH2-26,VH2-70或VH3-23的两个或更多个多态变体)。在特定实施方案中，本文中描述的小鼠的两个或更多个多态变体在数量上多至并包含表1中对于对应的VH家族成员所指出数量(例如，对于VH1-69，13个变体；对于VH1-2，5个变体等)。
特定人VH基因的普遍观察到的变体在本领域是已知的。例如，VH基因座的最复杂的多态性的一个属于VH1-69基因。人VH1-69基因具有13个被报道的等位基因(Sasso等人,1993,A fetally expressedimmunoglobulin VH1gene belongs to a complex set of alleles,Journalof Clinical Investigation 91:2358-2367；Sasso等人,1996,Expression ofthe immunoglobulin VH gene 51p1is proportional to its germline genecopy number,Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080)并且以具有VH1-69基因的复制的至少3个单元型存在，这导致VH基因在给定基因座上的多个拷贝。这些多态等位基因包括可显著影响抗原特异性的互补决定区(CDR)中的差异。表2示出了人VH1-69和人VH1-2基因的被报道的等位基因以及成熟重链可变区的DNA和蛋白序列的SEQ ID NO。
VH1-69基因的代表性基因组DNA和全长蛋白序列分别示于SEQID NO:4和SEQ ID NO:5中。图5和图6分别示出13个被报道的VH1-69等位基因的DNA和蛋白比对。VH1-2基因的代表性基因组DNA和全长蛋白序列分别示于SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64中。图8和图9分别示出5个被报道的VH1-2等位基因的DNA和蛋白比对。图7和图10分别示出对应于13个被报道的人VH1-69和5个被报道的人VH1-2等位基因的经比对的蛋白序列的百分比同一性/相似性矩阵。在多个实施方案中，本发明的经修饰的基因座包含以两个或更多个拷贝数存在的选自表1的VH基因，其中拷贝数包含多至和包括表1中所显示的等位基因的数量。在一个实施方案中，本发明的经修饰的基因座包含以两个或更多个拷贝数存在的选自表2的VH1-69或VH1-2基因，其中拷贝数包含多至和包括表1中所显示的等位基因的数量。
表1
表2
抗原依赖性重链可变基因使用
可在靶向临床上重要的抗原的人治疗剂的开发中利用VH基因的抗原依赖性优先使用。可使用特定VH基因产生抗体可变结构域库的能力可为用于人治疗剂的高亲和性抗体可变结构域的寻找提供重要的有利方面。对首次接受试验的小鼠和抗体可变结构域中人VH基因使用的研究显示大部分重链可变结构域不是来源于任何特定的单个或主要使用的VH基因。在另一方面，针对某些抗原的抗体应答的研究显示在一些情况下特定抗体应答显示在免疫后在B细胞库中特定VH基因的偏好使用。
虽然人VH库是相当多样化的，但是据一些估计，任何给定VH基因(假定随机选自VH基因)的使用的期望频率是约2％(Brezinschek等人,1995,Analysis of the Heavy Chain Repertoire of HumanPeripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction,J.Immunol.155:190-202)。但人的外周B细胞中的VH使用是不对称的。在一个研究中，功能性V基因丰度是按照模式VH3>VH4>VH1>VH2>VH5>VH6的(Davidkova等人,1997,Selective Usage of VHGenes in Adult Human Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)。一个早期的研究估计VH3家族使用频率是约0.65，然而VH1家族使用频率是约0.15；这些以及其它的观察表明人VH库的种系复杂性没有准确反映在具有正常的种系VH库的人中的外周B细胞区域中，这个情形与在小鼠中所观察到的相似——即，VH基因表达是非随机性的(Zouali and These,1991,Probing VHGene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In SituHybridization,J.Immunol.146(8):2855-2864)。根据一个报道，人中的VH基因使用是VH3>VH4>VH1>VH5>VH2>VH6(从最多到最少)；外周B细胞中的重排显示VH3家族使用比基于种系VH3基因的相对数量所预期的要更高(Brezinschek等人,1995)。根据另一个报道，基于商陆有丝分裂原激活的外周小免疫活性B细胞的分析，人中的VH使用按照模式VH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6(Davidkova等人,1997,Selective Usage of VH Genes in Adult HumanB Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)。一个报道提出最频繁使用的VH3家族成员是3-23、3-30和3-54(Brezinschek等人,1995)。在VH4家族中，发现成员4-59和4-46以及4-39和4-34是相对更频繁(Id.)的(Brezinscheck等人,1997,Analysis of theHuman VH Gene Repertoire,J.Clin.Invest.99(10):2488-2501)。其它研究推测活化的重链库不对称地偏好高VH5表达和较低的VH3表达(Van Dijk-Hard and Lundkvist,2002,Long-term kinetics of adulthuman antibody repertoires,Immunology 107:136-144)。其它研究提出在成人库中最普遍使用的VH基因是VH4-59随后是VH3-23和VH3-48(Arnaout等人,2001,High-Resolution Description of AntibodyHeavy-Chain Repertoires in Humans,PLoS ONE 6(8):108)。尽管使用研究是基于相对小的样本数量并因而显示高的方差，但是综合起来这些研究显示V基因表达不是单纯随机的。事实上，使用特定抗原的研究已确定在某些情况下抗拒某些使用并倾向于其它的使用。
随时间过去，越来越清楚地发现所观察到的响应某些抗原产生的人重链可变结构域库是高度受限制的。一些抗原几乎唯一地与仅具有某些特定VH基因的中和抗体相关，在这个意义上有效的中和抗体基本上仅来源于一种VH基因。对于许多临床上重要的人病原体也是如此。
已在许多具有治疗重要性的抗原特异性抗体库中观察到VH1-69来源的重链。例如，在患有特应性疾病的幼儿的外周血淋巴细胞的IgE库的重链转录本中频繁地观察到VH1-69(Bando等人,2004,Characterization of VHεgene expressed in PBL from children withatopic diseases:detection of homologous VH1-69derived transcriptsfrom three unrelated patients,Immunology Letters 94:99-106)。具有高程度的体细胞高变的VH1-69来源的重链还出现在B细胞淋巴瘤中(Perez等人,2009,Primary cutaneous B-cell lymphoma is associatedwith somatically hypermutated immunoglobulin variable genes andfrequent use of VH1-69and VH4-59segments,British Journal ofDermatology 162:611-618)，而在患有血液病的患者的自身抗体之间已观察到一些具有实质性种系序列(即很少至没有体细胞高变)VH1-69来源的重链(Pos等人,2008,VH1-69germline encoded antibodiesdirected towards ADAMTS13in patients with acquired thromboticthrombocytopenic purpura,Journal of Thrombosis and Haemostasis7:421-428)。
此外，已发现针对病毒抗原例如HIV、流感和丙型肝炎(HCV)的中性抗体利用种系和/或体细胞突变的VH1-69来源的序列(Miklos等人,2000,Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissuelymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of V1-69withdistinctive CDR3features,Blood 95(12):3878-3884；Kunert等人,2004,Characterization of molecular features,antigen-binding,and in vitroproperties of IgG and IgM variants of 4E10,an anti-HIV type Ineutralizing monoclonal antibody,Aids Research and HumanRetroviruses 20(7):755-762；Chan等人,2001,VH1-69gene ispreferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomasand by normal B cells responding to the E2viral antigen,Blood97(4):1023-1026；Carbonari等人,2005,Hepatitis C virus drives theunconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory Bcells in type II cryoglobulinemia:A model of infection-drivenlymphomagenesis,Journal of Immunology 174:6532-6539；Wang andPalese,2009,Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins？,Nature Structural&Molecular Biology 16(3):233-234；Sui等人,2009,Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization ofavian and human influenza A viruses,Nature Structural&MolecularBiology 16(3):265-273；Marasca等人,2001,Immunoglobulin GeneMutations and Frequent Use of VH1-69and VH4-34Segments inHepatitis C Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative NodalMarginal Zone B-Cell Lymphoma,Am.J.Pathol.159(1):253-261)。
还在针对b型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(Hib PS)的体液免疫应答中观察到VH使用偏好。研究显示具有多样化的D和J基因的VHIII家族(特别地VHIIIb亚家族VH9.1)唯一地表征针对Hib PS的人体液应答(Adderson等人,1991,Restricted Ig H Chain VGene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilusinfluenzae Type b Capsular Polysaccharide,J.Immunol.147(5):1667-1674；Adderson等人,1993,RestrictedImmunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the HumanResponse to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide,J.Clin.Invest.91:2734-2743)。人JH基因也显示偏好的使用；在人的外周B细胞中观察到约38-41％的JH4和JH6(Brezinschek等人,1995)。
在HIV-1感染的人中VH使用是偏好抗拒VH3使用的并且倾向于VH1和VH4基因家族(Wisnewski等人,1996,Human AntibodyVariable Region Gene Usage in HIV-1Infection,J.Acquired ImmuneDeficiency Syndromes&Human Retroviology 11(1):31-38)。然而，来自受侵袭的患者的骨髓的cDNA分析显示显著的未在功能性B细胞库中表达的VH3使用，其中反应VH3使用的Fab显示HIV-1的有效体外中和(Id.)。可推测针对HIV-1感染的体液免疫应答可能因VH限制而被减弱；因此如本文中描述的经修饰的非人动物(HIV-1不可感染的)可用于产生来源于存在于如本文中描述的经遗传修饰的动物中的特定VH基因但来源于与在受侵袭的人的受限制的库中所观察到的VH基因不同的VH基因的中和抗体结构域。
因此，在例如用HIV-1免疫的VH受限制的小鼠(限制至例如VH3家族成员及其多态体)中产生高亲和性人抗体可变结构域的能力可为通过彻底挖掘这样的经免疫的小鼠的受限(例如限制至VH3家族成员及其变体)的库来设计有效的HIV-1中和性人治疗剂提供丰富的资源。
针对某些病原体的人抗体应答的限制可降低从受侵袭的人获得可用作设计针对病原体的高亲和性中和抗体的跳板的抗体可变区的可能性。例如，在HIV-1感染的自始自终和AIDS进展中针对HIV-1感染的人免疫应答是克隆受限制的(Muller等人,1993,B-cellabnormalities in AIDS:stable and clonally restricted antibodyresponse in HIV-1infection,Scand.J.Immunol.38:327-334；Wisnewski等人,1996)。此外，VH基因一般不以所有的多态形式存在于个体中；某些群体中的某些个体具有一个变体，而其它群体中的个体具有不同的变体。因此，限制至单个VH基因及其变体的生物系统的可用性将在多个实施方案中提供用于产生基于受限制的VH基因的抗体可变区(例如人重链和轻链同源结构域)的多样性的迄今未经开发的来源。
表达具有受限制的VH基因区段使用的人重链可变区的经遗传修饰的小鼠可用于产生来自在其它方面受限制的库的接合多样化、组合多样化和经体细胞突变的高亲和性人免疫球蛋白重链可变区的相对大的库。在该实例中，受限制的库是指导致小鼠不能够形成来源于非预选择的V基因的任何V基因的经重排的重链基因的种系基因中的预先确定的限制。在使用预选择的V基因而非预选择的D和/或J基因的实施方案中，库针对V基因而非D和/或J基因的同一性而受限。预选择的V基因(和任何预选择的D和/或J基因)的同一性不限制于任何特定的V基因。
设计小鼠以便其将单个VH基因(以单个区段或一组变体存在)与许多人D和J基因区段(例如DH和JH区段)重排，这提供可用于迭代所产生的经重排的重链可变区序列(例如，根据可能的情况，V/D/J或V/J)中的突变的体内接合多样化/组合多样化/体细胞高变排列装置。在这样的小鼠中，克隆选择过程用于选择适当的基于单个预选择的VH基因(或其变体)的结合目的抗原的可变区。因为小鼠的克隆选择组分致力于基于单个预选择的VH基因区段的选择，所以背景噪声被大幅消除。利用VH基因区段的明智选择，可相较于利用具有高度多样化的V区段的小鼠在更短的时期内筛选相对较大数量的经克隆选择的抗原特异性抗体。
将小鼠预选择和限制至单个V区段提供了用于以在多个实施方案中比在另外地具有多至40或更多个V区段以与D和J区重组的小鼠中所观察到的速率更高的速率排列V/D/J连接的系统。其它V区段的去除释放基因座以形成预选择的V区段比另外地所观察到的更多的V/D/J组合。因预选择的V与多个D的一个和多个J区段的一个的重组而引起的增加的转录本数量会使这些转录本进入前体B细胞形式的克隆选择系统，从而克隆选择系统致力于循环表达预选择的V区的B细胞。以此方式，生物体可在给定的时期内筛选比另外地可能的数量更多的来源于预选择的V区段的独特V区。
在多个方面，描述了增强预选择的V区的V/D重组的接合多样性的小鼠，因为免疫球蛋白重链可变基因座的所有的或基本上所有的重组将是置入这样的小鼠中的预选择的V区段与D和J区段的重组。因此，小鼠提供了用于使用基础或受限制的VH基因库来产生多样化的CDR3区段的方法。
小鼠ADAM6的基因组位置和功能
缺乏表达任何功能性ADAM6蛋白的能力的雄性小鼠令人惊讶地显示小鼠交配和产生后代的能力的缺陷。小鼠由于利用人可变区基因区段对所有的或基本上所有的小鼠免疫球蛋白可变区基因区段的置换而缺乏表达功能性ADAM6蛋白的能力。因为ADAM6基因座位于内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座之内接近于DH基因区段上游的VH基因区段基因座的3’末端的位置，所以导致ADAM6功能的丢失。为了繁殖对于利用受限制的人重链序列对所有的或基本上所有的内源小鼠重链可变序列的置换是纯合的小鼠，建立各自对于受限制的人重链序列是纯合的雄性和雌性并等待有效交配，这通常是繁重的方法。成功的胚仔在频率和规模上是低的。相反，已将对于受限制的人重链序列是杂合的雄性用于与对于该置换是纯合的雌性交配以产生对于受限制的人重链序列是杂合的后代，随后从其繁殖纯合的小鼠。本发明人已确定雄性小鼠中生育能力的丢失的可能原因是功能性ADAM6蛋白在纯合雄性小鼠中的不存在。
在多个方面，包含受损(即无功能或最低限度功能性)的ADAM6基因的雄性小鼠显示生育能力的减弱或消除。因为在小鼠(和其它啮齿类动物)中ADAM6基因位于免疫球蛋白重链基因座中，本发明人已确定为了繁殖包含人源化免疫球蛋白重链基因座的小鼠或产生和维持该小鼠品系，使用不同的经修饰的繁殖或增殖方案。对于人源化的免疫球蛋白重链可变基因座是纯合的雄性小鼠的低生育能力或不育性使得在小鼠品系中维持这样的修饰是困难的。在多个实施方案中，维持品系包括避免由对于人源化重链基因座是纯合的雄性小鼠显示的不育问题。
在一个方面，提供了用于维持如本文中描述的小鼠的品系的方法。小鼠的品系不需要包含异位ADAM6序列，并且在多个实施方案中小鼠的品系对于ADAM6的敲除(例如功能性敲除)是纯合或杂合的。
小鼠品系包含导致雄性小鼠中生育能力的减弱或丢失的内源免疫球蛋白重链基因座的修饰。在一个实施方案中，修饰包括ADAM6基因的调节器和/或编码区的删除。在特定实施方案中，修饰包括减弱或消除包含修饰的雄性小鼠的生育能力的内源ADAM6基因(调节和/或编码区)的修饰；在特定实施方案中，修饰减弱或消除对于修饰是纯合的雄性小鼠的生育能力。
在一个实施方案中，小鼠品系对于ADAM6基因的敲除(例如功能性敲除)或删除是纯合或杂合的。
在一个实施方案中，通过从对于修饰是纯合或杂合的小鼠分离细胞，将供体细胞用于宿主胚胎，将宿主胚胎和供体细胞在代孕母体中孕育和从代孕母体获得包含遗传修饰的后代来维持小鼠品系。在一个实施方案中，供体细胞是ES细胞。在一个实施方案中，供体细胞是多能细胞例如诱导多能细胞。
在一个实施方案中，通过从对于修饰是纯合或杂合的小鼠分离包含修饰的核酸序列，将核酸序列引入宿主细胞核，和将包含核酸序列和宿主细胞核的细胞在适当的动物中孕育来维持小鼠品系。在一个实施方案中，核酸序列被引入宿主卵母细胞胚胎。
在一个实施方案中，通过从对于修饰是纯合或杂合的小鼠分离细胞核，将细胞核引入宿主细胞和将细胞核和宿主细胞在适当的动物中孕育以获得对于修饰是纯合或杂合的后代来维持小鼠品系。
在一个实施方案中，通过使用利用来自包含遗传修饰的雄性小鼠的精子的雌性小鼠(野生型、对于修饰是纯合的或对于修饰是杂合的)的体外受精(IVF)来维持小鼠品系。在一个实施方案中，雄性小鼠对于遗传修饰是杂合的。在一个实施方案中，雄性小鼠对于遗传修饰是纯合的。
在一个实施方案中，通过将对于遗传修饰是杂合的雄性小鼠与雌性小鼠交配以获得包含遗传修饰的后代，鉴定包含遗传修饰的雄性和雌性后代，和将对于遗传修饰是杂合的雄性用于与野生型的、对于遗传修饰是纯合或杂合的雌性交配以获得包含遗传修饰的后代来维持小鼠品系。在一个实施方案中，重复将对于遗传修饰是杂合的雄性与野生型雌性、对于遗传修饰是杂合的雌性或对于遗传修饰是纯合的雌性交配的步骤以维持小鼠品系中的遗传修饰。
在一个方面，提供了用于维持包含利用一个或多个人免疫球蛋白重链序列对内源免疫球蛋白重链可变基因座的置换的小鼠品系的方法，包括繁殖小鼠品系以产生杂合的雄性小鼠，其中繁殖杂合的雄性小鼠以维持品系中的遗传修饰。在特定实施方案中，不通过纯合雄性与野生型雌性或对于遗传修饰是纯合或杂合的雌性的任何交配来维持品系。
ADAM6蛋白是解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)蛋白家族的成员，该家族是一个大的具有多样化的功能包括细胞粘附的蛋白家族。ADAM家族的一些成员牵涉精子发生和受精。例如，ADAM2编码牵涉精子-卵子相互作用的蛋白致育素的亚基。ADAM3或cyritestin对于精子与透明带的结合似乎是必需的。ADAM2或ADAM3的不存在导致不育。已假定ADAM2、ADAM3和ADAM6在小鼠精子细胞的表面上形成复合物。通常在人免疫球蛋白重链基因座的人VH基因区段VH1-2与VH6-1之间发现的人对应基因(人ADAM6)似乎是假基因。在小鼠中，存在在小鼠VH与DH基因区段之间的基因间区域中发现的两个ADAM6基因(ADAM6a和ADAM6b)，并且在小鼠中ADAM6a和ADAM6b基因定向于与周围的免疫球蛋白基因区段的转录方向相反的转录方向。在小鼠中，功能性ADAM6基因座显然是正常的受精所需要的。那么功能性ADAM6基因座或序列是指可补充或复原在具有丢失的或无功能的内源ADAM6基因座的雄性小鼠中显示的显著减弱的受精作用。
编码ADAM6a和ADAM6b的基因间序列在小鼠中的位置使得基因间序列在修饰内源小鼠重链时对修饰易感。当VH基因区段被删除或置换时，或当DH基因区段被删除或置换时，很可能所产生的小鼠将显示生育能力的严重不足。为了补偿该不足，小鼠被修饰以包含编码将补充ADAM6活性因内源小鼠ADAM6基因座的修饰而引起的丢失的蛋白的核苷酸序列。在多个实施方案中，补充性核苷酸序列是编码复原生育能力不足的小鼠ADAM6a、小鼠ADAM6b或其同源物或直系同源物或功能性片段的核苷酸序列。或者，可使用保留内源ADAM6基因座的适当方法，同时使得侧接小鼠ADAM6基因座的内源免疫球蛋白重链序列不能够重排以编码功能性内源重链可变区。示例性的可选择的方法包括操作大部分的小鼠染色体，其以这样的方式定位内源免疫球蛋白重链可变区基因座以便其不能够重排以编码可操作地连接至内源重链恒定基因的功能性重链可变区。在多个实施方案中，方法包括包含内源免疫球蛋白重链基因区段的小鼠染色体片段的倒位和/或易位。
复原生育能力的核苷酸序列可被置于任何适当的位置。其可被置于基因间区域，或基因组中的任何适当的位置(即易位地)。在一个实施方案中，核苷酸序列可被引入随机整合至小鼠基因组中的转基因中。在一个实施方案中，可附加型地维持序列，即维持在分离的核酸上而非小鼠染色体上。适当的位置包括转录许可或转录活性的位置，例如ROSA26基因座(Zambrowicz等人,1997,PNAS USA94:3789-3794)、BT-5基因座(Michael等人,1999,Mech.Dev.85:35-47)或Oct4基因座(Wallace等人,2000,Nucleic Acids Res.28:1455-1464)。核苷酸序列至转录活性基因座的靶向描述于例如US 7,473,557中。
或者，可将复原生育能力的核苷酸序列与诱导型启动子偶联以促进适当的细胞和/或组织例如生殖组织中的优化表达。示例性诱导型启动子包括通过物理(例如热激启动子)和/或化学方法(例如IPTG或四环素)激活的启动子。
此外，可将核苷酸序列的表达与其它基因联系起来以实现在发育的特定阶段或在特定组织内的表达。这样的表达可通过将核苷酸序列与在发育的特定阶段表达的基因的启动子可操作地连接来实现。例如，将被工程化至宿主物种的基因组中的一个物种的免疫球蛋白序列与来自宿主物种的CD19基因(B细胞特异性基因)的启动子序列可操作地连接起来。实现了当免疫球蛋白被表达时在精确发育阶段的B细胞特异性表达。
实现经插入的核苷酸序列的强健表达的另一种方法是使用组成型启动子。示例性组成型启动子包括SV40,CMV,UBC,EF1A,PGK和CAGG。以类似的方式，将期望的核苷酸序列与选择的组成型启动子可操作地连接，其提供由核苷酸序列编码的蛋白的高水平的表达。
术语“异位”意欲包括在天然情况下不会通常出现的位置上的置换或置入(例如，核酸序列在与核酸序列在野生型小鼠中被发现的位置不相同的位置上的置入)。在多个实施方案中，术语以其主体位于其正常的或恰当的位置之外的意义使用。例如，短语“编码…的异位核苷酸序列”意指出现在其在小鼠中通常不会出现的位置上的核苷酸序列。例如，在编码小鼠ADAM6蛋白(或其对雄性小鼠提供相同或相似的生育能力益处的直系同源物或同源物或片段)的异位核苷酸序列的实例中，序列可被置入在小鼠基因组中与其在野生型小鼠中通常被发现的位置不同的位置上。在这样的情况下，将序列置于小鼠基因组中与野生型小鼠中不同的位置将产生小鼠序列的新的序列连接。小鼠ADAM6的功能性同源物或直系同源物是赋予在ADAM6-/-小鼠中观察到的生育能力的丢失(例如雄性小鼠通过交配产生后代的能力的丢失)的复原的序列。功能性同源物或直系同源物包括与ADAM6a的氨基酸序列和/或ADAM6b的氨基酸序列具有至少约89％同一性或更高例如高至99％同一性的蛋白，以及可补充或复原具有包括ADAM6a和/或ADAM6b的删除或敲除的基因型的小鼠成功交配的能力的蛋白。
异位的位置可以是任何位置(例如如同包含小鼠ADAM6序列的转基因的随机插入)或可以是例如靠近(但不精确的相同于)其在野生型小鼠中的定位的位置(例如，在经修饰的内源小鼠免疫球蛋白基因座中，但在其天然位置的上游或下游，例如在经修饰的免疫球蛋白基因座内但在不同的基因区段之间或在小鼠V-D基因间序列中的不同位置)。异位置入的一个实例是维持在野生型小鼠中通常发现的在内源免疫球蛋白重链基因座内的位置同时使得周围的内源重链基因区段不能够重排以编码包含内源重链恒定区的功能性重链。这该实例中，这可通过包含内源免疫球蛋白重链可变基因座的染色体片段的例如使用置于侧接可变区基因座的位置的经工程化的位点特异性重组位点的倒位来实现。因此，经重组后，内源重链可变区基因座被置于离内源重链恒定区基因非常远的位置从而阻止重排以编码包含内源重链恒定区的功能性重链。用于实现内源免疫球蛋白重链可变基因座的功能性沉默同时保持功能性ADAM6基因座的其它示例性方法对于阅读本公开内容的本领域技术人员和/或结合本领域中已知的方法将是明显的。通过这样的内源重链基因座的置入，内源ADAM6基因得到维持并且内源免疫球蛋白重链基因座被功能性沉默。
异位置入的另一个实例是人源化免疫球蛋白重链基因座内的置入。例如，可将包含利用单个人VH基因区段对一个或多个内源VH基因区段的置换(其中所述置换移去内源ADAM6序列)的小鼠工程化以具有位于处在单个人VH基因区段与人DH基因区段之间的基因间序列内的小鼠ADAM6序列。异位置入的另一个实例是小鼠ADAM6序列在人VH基因区段的5’(针对单个人VH基因区段的转录方向而言)位置上的置入。单个人VH基因区段的5’位置可相对于人VH基因区段是紧密靠近的例如几百碱基对至几kb或是远离的例如数kb至数百kb或兆碱基或更多。所产生的修饰会产生在人基因序列之内或与其连续或在与其相同的染色体上的(异位的)小鼠ADAM6序列，并且人基因序列之内的小鼠ADAM6序列的(异位)置入可靠近小鼠ADAM6序列的位置(即在V-D基因间区域之内)。通过(异位的)小鼠ADAM6序列在小鼠的种系内于人基因序列(例如免疫球蛋白基因相邻)之内或与其相邻的连接产生的所得的序列连接相较于野生型小鼠的基因组中相同或相似的位置会是新的。
在多个实施方案中，提供了缺乏ADAM6或其直系同源物或同源物的非人动物，其中所述缺乏使得非人动物不能生育或实质性减弱非人动物的生育能力。在多个实施方案中，ADAM6或其直系同源物或同源物的缺失是因内源免疫球蛋白重链基因座的修饰而引起的。生育能力的实质性减弱是例如生育能力(例如繁殖频率、幼崽/窝、胚仔/年等)的约50％,60％,70％,80％,90％或95％或更多的减弱。在多个实施方案中，非人动物补充有在非人动物的雄性中具有功能的小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能性片段，其中补充的ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能性片段全部地或实质性部分地复原生育能力的减弱。生育能力的实质性部分地复原是例如生育能力的恢复以便非人动物显示相较于未经修饰(即不具有对ADAM6基因或其直系同源物或同源物的修饰的动物)的重链基因座的至少70％、80％或90％或更多的生育能力。
赋予经遗传修饰的动物(即因例如免疫球蛋白重链基因座的修饰而引起的缺乏功能性ADAM6或其直系同源物或同源物的动物)的序列在多个实施方案中选自ADAM6基因或其直系同源物或同源物。例如，在小鼠中，ADAM6功能的丢失通过在一个实施方案中添加小鼠ADAM6基因来复原。在一个实施方案中，小鼠中ADAM6功能的丢失通过添加对于小鼠紧密相关的物种例如啮齿类动物例如不同品系或种类的小鼠、任何种类的大鼠、啮齿类动物的直系同源物或同源物来复原；其中直系同源物或同源物至小鼠的添加复原因ADAM6功能的丢失或ADAM6基因的丢失而引起的生育能力的丢失。来自其它物种的直系同源物和同源物在多个实施方案中选自系统发育相关的物种并且在多个实施方案中显示与内源ADAM6(或直系同源物)具有约80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多或97％或更多的百分比同一性；并且其复原ADAM6相关的或(在非小鼠中)ADAM6直系同源物相关的生育能力的丢失。例如，在缺乏ADAM6功能的经遗传修饰的雄性大鼠(例如具有用人免疫球蛋白重链可变区置换的内源免疫球蛋白重链可变区或具有大鼠免疫球蛋白重链区中的敲除的大鼠)中，大鼠的生育能力的丢失通过大鼠ADAM6或在一些实施方案中大鼠ADAM6的直系同源物(例如来自其它大鼠品系或物种或在一个实施方案中来自小鼠的的ADAM6直系同源物)的添加来复原。
因此，在多个实施方案中，因编码ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物)的核酸序列或可操作地连接至核酸序列的调节区的修饰而显示无生育能力或生育能力的减弱的经遗传修饰的动物，包含补充或恢复生育能力的丢失的核酸序列，其中补充或恢复生育能力的丢失的核酸序列来自相同物种的不同品系或来自系统发育相关的物种。在多个实施方案中，补充性核酸序列是ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段。在多个实施方案中，补充性ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段来自与具有生育能力缺陷的经遗传修饰的动物紧密相关的非人动物。例如，当经遗传修饰的动物是特定品系的小鼠时，ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段可获自另一个品系的小鼠或相关种类的小鼠。在一个实施方案中，当包含生育能力缺陷的经遗传修饰的动物是啮齿目的动物时，ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段来自啮齿目的另一种动物。在一个实施方案中，包含生育能力缺陷的经遗传修饰的动物是鼠形亚目的动物(例如飞鼠、跳鼠(jumping mouse)、小鼠样仓鼠、仓鼠、New World大鼠和小鼠、田鼠、真小鼠(true mice)或大鼠、沙鼠、棘鼠、鬃毛大鼠(crestedrat)、攀鼠(climbing mouse)、岩鼠(rock mouse)、白尾鼠、Malagasy大鼠和小鼠、多刺榛睡鼠、鼹鼠、竹鼠、鼢鼠)，并且ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段选自啮齿目或鼠形亚目的动物。
在一个实施方案中，经遗传修饰的动物来自超家族跳鼠总科(Dipodoidea)，并且ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段来自超家族鼠总科(Muroidea)。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物来自超家族鼠总科，并且ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段来自超家族跳鼠总科。
在一个实施方案中，经遗传修饰的动物是啮齿类动物。在一个实施方案中，啮齿类动物选自超家族鼠总科，并且ADAM6直系同源物或同源物来自超家族鼠总科内的不同种类。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、New World大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、鬃毛大鼠)、马岛鼠科(攀鼠、岩鼠、有尾大鼠(with-tailed rat)、Malagasy大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺榛睡鼠)和鼹形鼠科(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)的家族；并且ADAM6直系同源物或同源物选自相同家族的不同种类。在特定实施方案中，经遗传修饰的啮齿类动物选自真小鼠或大鼠(家族鼠科)，并且ADAM6直系同源物或同源物来自选自沙鼠、棘鼠或鬃毛大鼠的种类。在一个实施方案中，经遗传修饰的小鼠是家族鼠科的成员，并且ADAM6直系同源物或同源物来自家族鼠科的不同种类。在特定实施方案中，经遗传修饰的啮齿类动物是家族鼠科的小鼠，并且ADAM6直系同源物或同源物来自家族鼠科的大鼠、沙鼠、棘鼠或鬃毛大鼠。
在多个实施方案中，家族中啮齿类动物的一种或多种啮齿类动物ADAM6直系同源物或同源物或其功能性片段恢复缺乏ADAM6直系同源物或同源物的经遗传修饰的相同家族(例如仓鼠科(例如仓鼠、New World大鼠和小鼠、田鼠)；鼠科(例如真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、鬃毛大鼠))的啮齿类动物的生育能力。
在多个实施方案中，通过确定直系同源物、同源物或片段是否恢复缺乏ADAM6活性的经遗传修饰的雄性非人动物(例如包含ADAM6或其直系同源物的敲除的啮齿类动物例如小鼠或大鼠)的生育能力来评价ADAM6直系同源物、同源物及其片段的功能性。在多个实施方案中，将功能性定义为缺乏内源ADAM6或其直系同源物或同源物的经遗传修饰的动物的精子迁移通过输卵管和使经遗传修饰的动物的相同种类的卵子受精的能力。
在多个方面，可将包含内源重链可变区基因座或其部分的删除或置换的小鼠制备为包含编码将相似的生育能力益处赋予小鼠ADAM6(例如其在雄性小鼠中具有功能的直系同源物或同源物或片段)的蛋白的异位核苷酸序列。异位核苷酸序列可包括编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白是不同小鼠品系或不同物种例如不同的啮齿类动物物种的ADAM6同源物或直系同源物(或其片段)，并且赋予生育能力的益处，例如在指定时期内增加的胚仔数量，和/或增加的幼崽/窝数量，和/或雄性小鼠的精子细胞穿过小鼠输卵管以使小鼠卵细胞受精的能力。
在一个实施方案中，ADAM6是与小鼠ADAM6蛋白具有至少89％至99％的同一性(例如与小鼠ADAM6a或小鼠ADAM6b具有至少89％至99％的同一性)的同源物或直系同源物。在一个实施方案中，异位核苷酸序列编码独立地选自与小鼠ADAM6a具有至少89％同一性的蛋白、与小鼠ADAM6b具有至少89％同一性的蛋白及其组合的一种或多种蛋白。在一个实施方案中，同源物或直系同源物是与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b具有或经修饰具有约89％或更高的同一性的大鼠、仓鼠、小鼠或荷兰猪蛋白。在一个实施方案中，同源物或直系同源物与小鼠ADAM6a和/或ADAM6b具有或至少具有90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性。
人源化重链小鼠中的异位ADAM6
基因靶向的开发例如细菌人工染色体(BAC)的开发如今已使得能够重组相对大的基因组片段。BAC工程化已使得能够在小鼠ES细胞中进行大的删除和大的插入。
制备人抗体的小鼠现已可用了一段时间。虽然它们代表了人治疗性抗体的发展的重要进步，但这些小鼠显示许多限制其可用性的显著异常。例如，它们显示受损的B细胞发育。受损的发育可能是因转基因小鼠与野生型小鼠之间的多种差异造成的。
人抗体可能不能最佳地与小鼠细胞的表面上的在克隆选择期间传递用于成熟、增殖或存活的信号的小鼠前体B细胞或B细胞受体相互作用。完全人抗体可能不能最佳地与小鼠Fc受体系统相互作用；小鼠表达不显示与人Fc受体一一对应的Fc受体。最后，制备完全人抗体的多种小鼠不包含所有的真实小鼠序列例如下游增强子元件和其它基因座控制元件，其可能是野生型B细胞发育所需要的。
制备完全人抗体的小鼠通常包含以某种方式失去功能的内源免疫球蛋白基因座，并且将包含可变和恒定免疫球蛋白基因区段的人转基因引入至小鼠基因组的随机位置中。只要内源基因座充分地失去功能以便不重排基因区段以形成功能性免疫球蛋白基因，则在这样的小鼠中制备完全人抗体的目标可得以实现(纵使B细胞发育受损)。
尽管迫使从人转基因基因座制备完全人抗体，但在小鼠中产生人抗体显然是不利的过程。在一些小鼠中，过程如此不利以至于导致嵌合的人可变/小鼠恒定重链(但非轻链)通过反式转换的机制形成。通过该机制，编码完全人抗体的转录本经历从人同种型至小鼠同种型的反式同种异型转换。过程是反式的，因为完全人转基因位于远离保留未损坏拷贝的小鼠重链恒定区基因的内源基因座的位置。虽然在这样的小鼠中反式转换是容易表现的，但该现象仍不足以复原B细胞发育，其仍然是高度受损的。在任何情况下，在这样的小鼠中制备的反式转换抗体保留完全人轻链，因为反式转换的现象显然不会针对轻链发生；反式转换大概依赖于在正常的顺式同种异型转换中使用(虽然不同地)的内源基因座中的转换序列。因此，即使当经工程化以制备完全人抗体的小鼠选择反式转换机制来制备具有小鼠恒定区的抗体，该策略仍然不足以复原正常的B细胞发育。
制备基于抗体的人治疗剂例如抗病原体抗体的主要关心的事是鉴定特异性识别特定表位并以期望的亲和性通常(但不总是)以高亲和性结合其的有用的可变结构域。本文中描述的包含利用受限制的数量的人免疫球蛋白重链可变基因区段在内源小鼠基因座上对小鼠免疫球蛋白重链可变区的精确置换的小鼠，显示接近野生型的B细胞发育并且响应免疫产生的可变区是完全人的，其中重链来源于单个人VH基因区段。因此，这样的小鼠提供了用以产生一组特异地定向结合给定抗原例如病原性病毒的重链互补决定区(CDR)的平台。
如本文中描述的小鼠在内源基因座上包含利用受限制的人免疫球蛋白重链可变基因座对小鼠免疫球蛋白重链(IgH)的种系可变基因座和利用等价的人免疫球蛋白κ轻链可变基因座对免疫球蛋白轻链(例如κ轻链，Igκ)的精确的大规模置换。该精确置换导致具有产生具有人可变区和小鼠恒定区的重链和轻链的杂种的免疫球蛋白基因座的小鼠。小鼠VH-DH-JH和Vκ-Jκ区段的精确置换在杂种的免疫球蛋白基因座上留下完整的和功能性的侧翼小鼠序列。小鼠的体液免疫系统与野生型小鼠的体液免疫系统类似地发挥功能。B细胞发育在任何重要的方面均不受阻碍并且在抗原激发后在小鼠中产生经体细胞突变的人重链CDR组。
本文中描述的小鼠是可能的，因为用于重链和κ轻链的免疫球蛋白基因区段在人和小鼠中相似地重排，这并不是说它们的基因座是相同或甚至差不多相同的——显然它们是不同的。然而，基因座是足够相似的以便重链可变基因基因座的人源化可通过利用包含受限制的人重链基因座的连续人基因组序列置换约3×106个碱基对的包含所有VH、DH和JH基因区段的连续小鼠序列来完成。
在一些实施方案中，其它的利用人基因序列对某些小鼠恒定区基因序列的置换(例如，利用人CH1序列对小鼠CH1序列的置换，和利用人CL序列对小鼠CL序列的置换)导致适合用于例如制备完全人抗体片段例如完全人Fab’的具有产生具有人可变区和部分地人恒定区的抗体的杂种的免疫球蛋白基因座的小鼠。具有杂种的免疫球蛋白基因座的小鼠显示正常的可变基因区段重排、正常的体细胞高变频率和正常的种类转换。这些小鼠显示与野生型小鼠无差别的体液免疫系统，并且显示B细胞发育的所有阶段中的正常细胞群以及正常的淋巴器官结构——即使当小鼠缺乏完全的人可变区基因区段库时也如此。免疫这些小鼠导致呈现广泛多样化的重链CDR和轻链可变基因区段使用的强健的体液应答。
小鼠种系可变区基因区段的精确置换允许产生具有部分人的免疫球蛋白基因座的小鼠。因为部分人的免疫球蛋白基因座正常地重排、高变和种类转换，所以部分人的免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包含人可变区的抗体。编码可变区的核苷酸序列可被鉴定和克隆，随后与选择的任何序列例如适合用于特定用途的任何免疫球蛋白同种型融合(例如在体外系统中)，从而导致完全来源于人序列的抗体或抗原结合蛋白。
将利用重组工程方法的大规模人源化用于修饰小鼠胚胎干(ES)细胞以利用包括包含单个人VH基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段的受限制的人重链基因座的人基因组系列精确地置换包含基本上所有的小鼠VH、DH和JH基因区段的多至3个兆碱基的小鼠重链免疫球蛋白基因座。将包含两个编码基本上所有的人Vκ和Jκ基因区段的重复片段的一个的多至二分之一兆碱基区段的人基因组用于置换包含基本上所有的小鼠Vκ和Jκ基因区段的3个兆碱基区段的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座。
具有经这样置换的免疫球蛋白基因座的小鼠可包含内源小鼠ADAM6基因座的破坏或删除，所述ADAM6基因座通常发现于小鼠免疫球蛋白重链基因座上最3’的VH基因区段与最5’的DH基因区段之间。该区域的破坏可导致内源小鼠ADAM6基因座的功能性的减弱或消除。如果将人重链库的最3’的VH基因区段的一个或两个用于受限制的人重链基因座的构建，则包含似乎是人ADAM6假基因的假基因的基因间区域存在于这些VH基因区段之间即在人VH1-2与VH1-6之间。然而，包含该人基因间序列的雄性小鼠显示生育能力的减弱(参见USSN 13/404,075)。
描述了包含如上所述的受限制的人重链和等价的人κ轻链基因座并且还包含编码小鼠ADAM6的异位核酸序列的小鼠，其中所述小鼠显示基本上正常的生育能力。在一个实施方案中，异位核酸序列包含置于经修饰的内源重链基因座上的人VH1-69与人DH1-1之间的小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b序列或其功能性片段。在一个实施方案中，异位核酸序列是SEQ ID NO:77，其置于经修饰的内源重链基因座上的人VH1-69与人DH1-1之间。SEQ ID NO:77的ADAM6基因的转录方向针对周围的人基因区段的转录方向是相反的。在一个实施方案中，异位核酸序列包含置于经修饰的内源重链基因座上的人VH1-2基因区段的上游(或5’)的小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b序列或其功能性片段。在一个实施方案中，异位核酸序列是SEQ ID NO:73，其置于经修饰的内源重链基因座上的人VH1-2基因区段的上游(或5’)。SEQ ID NO:73的ADAM6基因的转录方向针对周围的人基因区段(例如人VH1-2基因区段)的转录方向是相反的。
尽管本文中的实施例显示生育能力通过将异位序列置于指定的人基因区段之间来复原，但本领域技术人员将认可异位序列在小鼠基因组中的任何适当的转录许可基因座(或甚至染色体外地)的置入将期望会类似地复原雄性小鼠的生育能力。
利用包含小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列补充缺乏功能性ADAM6基因座的小鼠的现象是可用于复原任何具有无功能的或最低限度功能性的内源ADAM6基因座的小鼠的一般性方法。因此，非常多的包含免疫球蛋白重链基因座的ADAM6破坏性修饰的小鼠可利用本发明的组合物和方法来复原。因此，本发明包括具有免疫球蛋白重链基因座的多种多样的破坏内源ADAM6功能的修饰的小鼠。本说明书中提供了一些(非限制性的)实例。除了所描述的小鼠以外，可将与ADAM6相关的组合物和方法用于非常多的应用，例如当以多种多样方式修饰重链基因座时。
在一个方面，提供了包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列、利用单个人VH基因区段对所有的或基本上所有的小鼠VH基因区段的置换、利用人DH和人JH基因区段对对所有的或基本上所有的小鼠DH基因区段和JH基因区段的置换的小鼠；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。在一个实施方案中，小鼠制备单可变结构域结合蛋白，所述蛋白是选自(a)人VH–小鼠CH1–小鼠CH2–小鼠CH3；(b)人VH–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3；和(c)人VH–小鼠CH2–小鼠CH3的免疫球蛋白链的二聚体。
在一个方面，复原生育能力的核苷酸序列置于小鼠中人免疫球蛋白重链可变区序列的上游(或5’)(例如人VH1-2或VH1-69基因区段的上游)，所述小鼠具有利用一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段(hVH、hDH和/或hJH)对一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段(mVH、mDH和/或mJH)的置换，小鼠还包含利用一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ和/或hJκ)对一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(mVκ和/或mJκ)的置换。
在一个方面，复原生育能力的核苷酸序列置于小鼠中人免疫球蛋白重链可变区序列之内(例如人VH1-69或人VH1-2与人DH1-1基因区段之间)，所述小鼠具有利用一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段(hVH、hDH和/或hJH)对一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段(mVH、mDH和/或mJH)的置换，小鼠还包含利用一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ和/或hJκ)对一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(mVκ和/或mJκ)的置换。
在一个实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段包含约3个兆碱基的小鼠免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段包含小鼠免疫球蛋白重链基因座的至少89个VH基因区段、至少13个DH基因区段、至少4个JH基因区段或其组合。在一个实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段包含人免疫球蛋白重链基因座的受限制的数量(例如1个、2个或3个)的VH基因区段、至少27个DH基因区段、至少6个JH基因区段或其组合。在一个实施方案中，人VH基因区段的受限制的数量是1个。
在一个实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含约3个兆碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的至少137个Vκ基因区段、至少5个Jκ基因区段或其组合。在一个实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含约二分之一兆碱基的人免疫球蛋白κ轻链基因座。在特定实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含人免疫球蛋白κ轻链基因座的近端重复片段(针对免疫球蛋白κ恒定区而言)。在一个实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含人免疫球蛋白κ轻链基因座的至少40个Vκ基因区段、至少5个Jκ基因区段或其组合。
在一个实施方案中，核苷酸序列置于两个人免疫球蛋白基因区段之间。在特定实施方案中，两个人免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。在一个实施方案中，核苷酸序列置于人VH1-69基因区段与人DH1-1基因区段之间。在一个实施方案中，核苷酸序列置于人VH12基因区段与人DH1-1基因区段之间。在一个实施方案中，如此修饰的小鼠包含利用单个人VH基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段对小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段的置换和利用至少40个人Vκ基因区段和5个人Jκ基因区段对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段的置换。
在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或其直系同源物或同源物或功能性片段)存在于在内源小鼠重链可变区基因座上存在的小鼠基因区段的中间，所述基因座不能够重排以编码包含内源重链恒定区的功能性重链。在一个实施方案中，内源小鼠重链基因座包含至少一个和多至89个VH基因区段、至少一个和多至13个DH基因区段、至少一个和多至4个JH基因区段及其组合。在多个实施方案中，功能性小鼠ADMA6基因座(或其直系同源物或同源物或功能性片段)编码在小鼠中具有功能的一个或多个ADAM6蛋白，其中一个或多个ADAM6蛋白包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或其组合。
在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或其直系同源物或同源物或功能性片段)存在于置换内源小鼠基因区段的人基因区段的中间。在一个实施方案中，至少89个小鼠VH基因区段被去除并被置换为一个、两个或三个人VH基因区段，并且小鼠ADAM6基因座直接相邻于人VH基因区段的3’末端或在两个人VH基因区段之间存在。在一个实施方案中，至少89个小鼠VH基因区段被去除并被置换为单个人VH基因区段，并且小鼠ADAM6基因座直接相邻于人VH基因区段的3’末端地存在。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座在VH基因区段的3’存在于经插入的人VH基因区段的3’末端的约20000个碱基(20kb)至约40000个碱基(40kb)之内。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座在VH基因区段的3’存在于经插入的人VH基因区段的3’末端的约29kb至约31kb之内。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座存在于经插入的人VH基因区段的3’末端的约30kb之内。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座存在于经插入的人VH基因区段的3’末端的约30,184bp之内。
在特定实施方案中，置换包括人基因区段VH1-69和DH1-1，并且小鼠ADAM6基因座存在于VH1-69基因区段的下游和DH1-1基因区段的上游。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座存在于人VH1-69基因区段与人DH1-1基因区段之间，其中小鼠ADAM6基因座的5’末端离人VH1-69基因区段的3’末端约258bp并且ADAM6基因座的3’末端离人DH1-1基因区段的5’末端约3,263bp。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座包含在小鼠细胞内赋予ADAM6功能的SEQ IDNO:3或其片段。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座包含在小鼠细胞内赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:73或其片段。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座包含在小鼠细胞内赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:77或其片段。在特定实施方案中，人基因区段的排列是如下的(针对人基因区段的转录方向而言从上游至下游)：人VH1-69-小鼠ADAM6基因座-人DH1-1。在一个实施方案中，小鼠ADAM6基因座的小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的一个或多个的方向相较于人基因区段的方向对于转录方向而言是相反的。或者，小鼠ADAM6基因座存在于单个人VH基因区段的5’或上游。
在特定实施方案中，置换包括人基因区段VH1-2和DH1-1，并且小鼠ADAM6基因座存在于VH1-2基因区段的上游和DH1-1基因区段的上游。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座存在于人VH1-2基因区段和人DH1-1基因区段的上游或5’，其中小鼠ADAM6基因座的5’末端离人VH1-2基因区段的5’末端约32,833bp并且ADAM6基因座的3’末端离人VH1-2基因区段的5’末端约18,078bp。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座包含在小鼠细胞内赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:3或其片段。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座包含在小鼠细胞内赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:73或其片段。在特定实施方案中，小鼠ADAM6基因座包含在小鼠细胞内赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:77或其片段。在特定实施方案中，人基因区段的排列是如下的(针对人基因区段的转录方向而言从上游至下游)：小鼠ADAM6基因座-人VH1-2-人DH1-1。在一个实施方案中，小鼠ADAM6基因座的小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的一个或多个的方向相较于人基因区段的方向对于转录方向而言是相反的。或者，小鼠ADAM6基因座存在于单个人VH基因区段的3’或下游。
类似地，利用置换所有的或基本上所有的内源小鼠VH基因区段的一个或多个人VL基因区段(例如Vκ或Vλ区段)修饰的小鼠可被修饰以例如通过使用具有包含小鼠ADAM6基因座或其功能性片段的下游同源臂的靶向载体来维持内源小鼠ADAM6基因座(如上所述的)或利用位于两个人VL基因区段之间或人VL基因区段与DH基因区段(无论是人或小鼠的，例如Vλ+m/hDH)或J基因区段(无论是人或小鼠的，例如Vκ+JH)之间的异位序列来置换受损的小鼠ADAM6基因座。在一个实施方案中，置换包括两个或更多个人VL基因区段，并且小鼠ADAM6基因座或其功能性片段存在于两个最3’的VL基因区段之间。在特定实施方案中，人VL基因区段的排列是如下的(针对人基因区段的转录方向而言从上游至下游)：人VL3’-1-小鼠ADAM6基因座-人VL3’。在一个实施方案中，小鼠ADAM6基因座的小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的一个或多个的方向相较于人VL基因区段的方向对于转录方向而言是相反的。或者，小鼠ADAM6基因座存在于最3’的人VH基因区段与最5’的DH基因区段之间的基因间区域中。无论最5’的DH区段是小鼠或人的均可如此。
在一个方面，提供了具有一个或多个内源小鼠VH基因区段的置换并且包含至少一个内源小鼠DH基因区段的小鼠。在这样的小鼠中，内源小鼠VH基因区段的置换可包括一个或多个最3’的VH基因区段而非最5’的DH基因区段的修饰，其中小心操作以便一个或多个最3’的VH基因区段的修饰不破坏内源小鼠ADAM6基因座或使其无功能。例如，在一个实施方案中小鼠包含利用单个人VH基因区段对所有的或基本上所有的内源小鼠VH基因区段的置换，并且小鼠包含一个或多个内源DH基因区段和功能性内源小鼠ADAM6基因座。
在另一个实施方案中，小鼠包含内源小鼠最3’的VH基因区段的修饰和一个或多个内源小鼠DH基因区段的修饰，并且修饰被这样进行以维持内源小鼠ADAM6基因座的完整性至内源ADAM6基因座保持功能性的程度。在一个实例中，这样的修饰在两个步骤中进行：(1)通过使用具有上游同源臂和下游同源臂的靶向载体，其中下游同源臂包含所有的或部分的功能性小鼠ADAM6基因座，利用单个人VH基因区段置换最3’的内源小鼠VH基因区段；(2)随后利用具有包含所有的或功能性部分的小鼠ADAM6基因座的上游同源臂的靶向载体来置换内源小鼠DH基因区段。
在多个方面，当修饰破坏内源小鼠ADAM6的功能时，使用包含编码小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能性同源物的异位序列的小鼠是有用的。当对小鼠免疫球蛋白基因座进行修饰时，特别地当修饰小鼠免疫球蛋白重链可变区及周围的序列时，破环内源小鼠ADAM6功能的可能性是很高的。因此，当制备具有被全部或部分地删除、被全部或部分地人源化或被全部或部分地置换(利用Vκ或Vλ序列)的免疫球蛋白重链基因座的小鼠时，这样的小鼠提供特别的益处。用于产生对于如下所述的小鼠所描述的遗传修饰的方法对于本领域技术人员是已知的。
包含编码小鼠ADAM6蛋白或小鼠ADAM6蛋白的赋予生育能力益处的基本上相同或相似的蛋白的异位序列的小鼠可特别的用于与对小鼠免疫球蛋白重链可变基因基因座的破环或删除内源小鼠ADAM6序列的修饰结合。虽然主要描述了与表达具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的小鼠结合，但这样的小鼠可用于与任何破环内源小鼠ADAM6基因的遗传修饰结合。本领域技术人员将认可这包括了多种多样的包含小鼠免疫球蛋白重链可变基因基因座的修饰的经遗传修饰的小鼠。这些包括例如具有所有的或部分的小鼠免疫球蛋白重链基因区段的删除或置换(不论其它修饰)的小鼠。非限制性实例描述于下文中。
在一些方面中，提供了包含异位小鼠、啮齿类动物或其它的在小鼠中具有功能的ADAM6基因(或直系同源物或同源物或片段)、一个或多个人免疫球蛋白可变和/或恒定区基因区段的经遗传修饰的小鼠。在多个实施方案中，在小鼠中具有功能的ADAM6基因直系同源物或同源物或功能性片段可包括来自牛、犬、灵长类动物、兔或其它非人序列的序列。
在一个方面，提供了包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、利用单个人VH基因区段对所有的或基本上所有的小鼠VH基因区段的置换、利用一个或多个人DH基因区段对所有的或基本上所有的小鼠DH基因区段的置换、利用一个或多个人JH基因区段对所有的或基本上所有的小鼠JH基因区段的置换的小鼠。
在一个实施方案中，小鼠还包含利用人CH1核苷酸序列对小鼠CH1核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，小鼠还包含利用人铰链核苷酸序列对小鼠铰链核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，小鼠还包含利用人免疫球蛋白轻链可变基因座对免疫球蛋白轻链可变基因座(VL和JL)的置换。在一个实施方案中，小鼠还包含利用人免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列对小鼠免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列的置换。在特定实施方案中，VL、JL和CL是免疫球蛋白κ轻链序列。在特定实施方案中，小鼠包含与人铰链和人CH1序列融合的小鼠CH2和小鼠CH3免疫球蛋白恒定区序列，以便小鼠免疫球蛋白基因座重排以形成编码包含(a)具有人可变区、人CH1区、人铰链区和小鼠CH2和小鼠CH3区的重链结合蛋白的基因；和(b)编码包含人可变结构域和人恒定区的免疫球蛋白轻链的基因。
在一个方面，提供了包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、利用一个或多个人VL基因区段对所有的或基本上所有的小鼠VH基因区段的置换和任选地利用一个或多个人DH基因区段和/或人JH基因区段对所有的或基本上所有的DH基因区段和/或JH基因区段的置换或任选地利用一个或多个人JL基因区段对所有的或基本上所有的DH基因区段和JH基因区段的置换的小鼠。
在一个实施方案中，小鼠包含利用一个或多个VL、一个或多个DH和一个或多个J基因区段(例如Jκ或Jλ)对所有的或基本上所有的小鼠VH、DH和JH基因区段的置换，其中基因区段可操作地连接至内源小鼠铰链区，其中小鼠形成经重排的免疫球蛋白链基因，其在转录方向上从5’至3’包含人VL–人或小鼠DH–人或小鼠J–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3。在一个实施方案中，J区是人Jκ区。在一个实施方案中，J区是人JH区。在一个实施方案中，J区是人Jλ区。在一个实施方案中，人VL区选自人Vλ区和人Vκ区。
在特定实施方案中，小鼠表达具有来源于人Vκ、人DH和人Jκ；人Vκ、人DH和人JH；人Vλ、人DH和人Jλ；人Vλ、人DH和人JH；人Vκ、人DH和人Jλ；人Vλ、人DH和人Jκ的小鼠或人恒定区和可变区的单可变结构域抗体。在特定实施方案中，修饰重组识别序列以允许在所列V、D和J基因区段之间或在所列V和J基因区段之间发生有效重排。
在一个方面，提供了包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列、利用一个或多个人VL基因区段对所有的或基本上所有的小鼠VH基因区段的置换、利用人JL基因区段对所有的或基本上所有的小鼠DH基因区段和JH基因区段的置换的小鼠；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。
在一个实施方案中，小鼠缺乏编码CH1结构域的序列。在一个实施方案中，小鼠缺乏编码铰链区的序列。在一个实施方案中，小鼠缺乏编码CH1结构域和铰链区的序列。
在特定实施方案中，小鼠表达包含融合至连接于小鼠CH3结构域的小鼠CH2结构域的人免疫球蛋白轻链可变结构域(λ或κ)。
在一个方面，提供了包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列、利用一个或多个人VL基因区段对所有的或基本上所有的小鼠VH基因区段的置换、利用人JL基因区段对所有的或基本上所有的小鼠DH和JH基因区段的置换的小鼠。
在一个实施方案中，小鼠包含编码CH1区、铰链区、CH1和铰链区或CH1区和铰链区和CH2区的免疫球蛋白重链恒定区基因序列的删除。
在一个实施方案中，小鼠制备单可变结构域结合蛋白，所述蛋白包含选自(a)人VL–小鼠CH1–小鼠CH2–小鼠CH3；(b)人VL–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3；和(c)人VL–小鼠CH2–小鼠CH3的免疫球蛋白链的同源二聚体。
在一个方面，提供了具有失去功能的内源重链免疫球蛋白基因座的小鼠，其包含失去功能的或被删除的内源小鼠ADAM6基因座，其中所述小鼠包含表达人或小鼠或人/小鼠或其它的嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方案中，核酸序列存在于整合的转基因上，所述转基因随机整合至小鼠基因组中。在一个实施方案中，核酸序列在未在野生型小鼠中发现的附加体(例如染色体)上。
在一个实施方案中，小鼠还包含失去功能的内源免疫球蛋白轻链基因座。在特定实施方案中，内源免疫球蛋白轻链基因座选自kappa(κ)和lambda(λ)轻链基因座。在特定实施方案中，小鼠包含失去功能的内源κ轻链基因座和失去功能的λ轻链基因座，其中小鼠表达包含人免疫球蛋白重链可变结构域和人免疫球蛋白轻链结构域的抗体。在一个实施方案中，人免疫球蛋白轻链结构域选自人κ轻链结构域和人λ轻链结构域。
在一个方面，提供了表达嵌合抗体和表达在经遗传修饰的动物中具有功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物的经遗传修饰的动物。
在一个实施方案中，经遗传修饰的动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物是小鼠，并且ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物来自是与经遗传修饰的动物不同的品系的小鼠品系。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物是家族仓鼠科的啮齿类动物(例如仓鼠、New World大鼠或小鼠、田鼠)，并且ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自家族鼠科的啮齿类动物(例如真小鼠或大鼠、沙鼠、棘鼠、鬃毛大鼠)。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物是家族仓鼠科的啮齿类动物，并且ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自家族仓鼠科的啮齿类动物。
在一个实施方案中，嵌合抗体包含人可变结构域和啮齿类动物的恒定区序列。在一个实施方案中，啮齿类动物选自家族仓鼠科的啮齿类动物和家族鼠科的啮齿类动物。在特定实施方案中，家族仓鼠科和家族鼠科的啮齿类动物是小鼠。在特定实施方案中，家族仓鼠科和家族鼠科的啮齿类动物是大鼠。在一个实施方案中，嵌合抗体包含人可变结构域和来自选自小鼠或大鼠的动物的恒定结构域；在特定实施方案中，小鼠或大鼠选自家族仓鼠科和家族鼠科。在一个实施方案中，嵌合抗体包含人重链可变结构域、人轻链可变结构域和来源于选自小鼠和大鼠的啮齿类动物的恒定区序列，其中人重链可变结构域和人轻链是同源的。在特定实施方案中，同源包括人重链和人轻链可变结构域来自单个B细胞，所述单个B细胞将人轻链可变结构域和人重链可变结构域一起表达并将可变结构域一起呈递在个体B细胞的表面。
在一个实施方案中，嵌合抗体是从免疫球蛋白基因座表达的。在一个实施方案中，嵌合抗体的重链可变结构域是从经重排的内源免疫球蛋白重链基因座表达的。在一个实施方案中，嵌合抗体的轻链可变结构域是从经重排的内源免疫球蛋白轻链基因座表达的。在一个实施方案中，嵌合抗体的重链可变结构域和/或嵌合抗体的轻链可变结构域是从经重排的转基因(例如来源于在非内源免疫球蛋白基因座的基因座上整合至动物基因组中的未经重排的核酸序列的经重排的核酸序列)表达的。在一个实施方案中，嵌合抗体的轻链可变结构域是从经重排的转基因(例如来源于在非内源免疫球蛋白基因座的基因座上整合至动物基因组中的未经重排的核酸序列的经重排的核酸序列)表达的。
在特定实施方案中，转基因是从转录活性基因座例如ROSA26基因座例如鼠类(例如小鼠)ROSA26基因座表达的。
在一个方面，提供了包含人源化免疫球蛋白重链基因座的非人动物，其中人源化免疫球蛋白重链基因座包含非人ADAM6序列或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，非人ADAM6直系同源物或同源物是与小鼠ADAM6序列直系同源和/或同源的序列，其中直系同源物或同源物在非人动物中是具有功能的。
在一个实施方案中，非人动物是选自小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿类动物。
在一个实施方案中，非人动物选自小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿类动物并且ADAM6直系同源物或同源物来自选自小鼠、大鼠和仓鼠的非人动物。在特定实施方案中，非人动物是小鼠并且ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同的小鼠种类、大鼠和仓鼠的动物。在特定实施方案中，非人动物是大鼠，并且ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同的大鼠种类、小鼠和仓鼠的啮齿类动物。在特定实施方案中，非人动物是仓鼠，并且ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同的仓鼠种类、小鼠和大鼠的啮齿类动物。
在特定实施方案中，非人动物来自鼠形亚目，并且ADAM6序列来自选自超家族跳鼠总科的啮齿类动物和超家族鼠总科的啮齿类动物的动物。在特定实施方案中，啮齿类动物是超家族鼠总科的小鼠，并且ADAM6直系同源物或同源物来自超家族鼠总科的小鼠或大鼠或仓鼠。
在一个实施方案中，人源化重链基因座包含单个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段。在特定实施方案中，人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段可操作地连接至一个或多个人、嵌合的和/或啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)的恒定区基因。在一个实施方案中，恒定区基因是小鼠的。在一个实施方案中，恒定区基因是大鼠的。在一个实施方案中，恒定区基因是仓鼠的。在一个实施方案中，恒定区基因包含选自铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在特定实施方案中，恒定区基因包含铰链、CH2和CH3序列。
在一个实施方案中，非人ADAM6序列与人免疫球蛋白重链序列是连续的。在一个实施方案中，非人ADAM6序列位于人免疫球蛋白重链序列之内。在特定实施方案中，人免疫球蛋白重链序列包含V、D和/或J基因区段。
在一个实施方案中，非人ADAM6序列与V基因区段是并列的。在一个实施方案中，非人ADAM6序列位于两个V基因区段之间。在一个实施方案中，非人ADAM序列并列在V与D基因区段之间。在一个实施方案中，小鼠ADAM6序列位于V与J基因区段之间。在一个实施方案中，小鼠ADAM6序列并列在D与J基因区段之间。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其包含从免疫球蛋白基因座表达与人VL结构域同源的人VH结构域的B细胞，其中非人动物从免疫球蛋白基因座表达非免疫球蛋白非人蛋白。在一个实施方案中，非免疫球蛋白非人蛋白ADAM蛋白。在特定实施方案中，ADAM蛋白是ADAM6蛋白或其同源物或直系同源物或功能性片段。
在一个实施方案中，非人动物是啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)。在一个实施方案中，啮齿类动物是家族鼠科的啮齿类动物。在一个实施方案中，啮齿类动物是鼠亚科的啮齿类动物。在特定实施方案中，鼠亚科的啮齿类动物选自小鼠和大鼠。
在一个实施方案中，非免疫球蛋白非人蛋白是啮齿类动物蛋白。在一个实施方案中，啮齿类动物是家族鼠科的啮齿类动物。在一个实施方案中，啮齿类动物是鼠亚科的啮齿类动物。在特定实施方案中，啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方案中，人VH和VL结构域直接地或通过接头连接于免疫球蛋白恒定结构域序列。在特定实施方案中，恒定结构域序列包含选自铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在特定实施方案中，人VL结构域选自Vκ或Vλ结构域。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其在其种系中包含人免疫球蛋白序列，其中雄性非人动物的精子的特征在于体内迁移缺陷。在一个实施方案中，体内迁移缺陷包括雄性非人动物的精子不能够从子宫迁移通过相同物种的雌性非人动物的输卵管。在一个实施方案中，非人动物缺乏编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在特定实施方案中，ADAM6蛋白或其功能性片段包括ADAM6a和/或ADAM6b蛋白或其功能性片段。在一个实施方案中，非人动物是啮齿类动物。在特定实施方案中，啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个方面，提供了非人动物，其包含与编码ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能性片段的非人序列连续的人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，非人动物是啮齿类动物。在特定实施方案中，啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白序列是免疫球蛋白重链序列。在一个实施方案中，免疫球蛋白序列包含单个VH基因区段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白序列包含一个或多个DH基因区段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白序列包含一个或多个JH基因区段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白序列包含单个VH基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段。
在一个实施方案中，免疫球蛋白序列包含与天然人库中的多态性相关的单个VH基因区段。在特定实施方案中，单个VH基因区段选自人VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23。在另一个特定的实施方案中，单个VH基因区段是VH1-2。在另一个特定的实施方案中，单个VH基因区段是VH1-69。
在一个实施方案中，免疫球蛋白序列包含与天然人库中的多个拷贝数量相关的单个VH基因区段。在特定实施方案中，单个VH基因区段选自人VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23。在另一个特定的实施方案中，单个VH基因区段是VH1-2。在另一个特定的实施方案中，单个VH基因区段是VH1-69。
在多个实施方案中，VH基因区段选自VH6-1、VH1-2、VH1-3、VH2-5、VH3-7、VH1-8、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH1-18、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH1-24、VH2-26、VH4-28、VH3-30、VH4-31、VH3-33、VH4-34、VH3-35、VH3-38、VH4-39、VH3-43、VH1-45、VH1-46、VH3-48、VH3-49、VH5-51、VH3-53、VH1-58、VH4-59、VH4-61、VH3-64、VH3-66、VH1-69、VH2-70、VH3-72、VH3-73和VH3-74。
在多个实施方案中，VH基因区段选自表1并在天然人库中由5个或更多个等位基因代表。在特定实施方案中，VH基因选自VH1-2、VH1-69、VH2-5、VH2-70、VH3-15、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-49、VH3-64、VH4-4、VH4-28、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51和VH7-4-1。
在一个实施方案中，非人动物是小鼠，并且小鼠包含利用单个人VH基因区段对内源小鼠VH基因区段的置换，其中人VH基因区段可操作地连接至小鼠CH区基因，以便小鼠重排人VH基因区段并表达包含人VH结构域和小鼠CH的反向嵌合的免疫球蛋白重链。在一个实施方案中，90-100％的未经重排的小鼠VH基因区段被一个未经重排的人VH基因区段置换。在特定实施方案中，所有的或基本上所有的内源小鼠VH基因区段被一个未经重排的人VH基因区段置换。在一个实施方案中，置换是利用未经重排的人VH1-69基因区段来进行的。在一个实施方案中，置换是利用未经重排的人VH1-2基因区段来进行的。在一个实施方案中，置换是利用未经重排的人VH2-26基因区段来进行的。在一个实施方案中，置换是利用未经重排的人VH2-70基因区段来进行的。在一个实施方案中，置换是利用未经重排的人VH3-23基因区段来进行的。
在一个实施方案中，小鼠包含利用至少一个未经重排的人DH区段和至少一个未经重排的人JH区段对所有的小鼠DH和JH区段的置换。在一个实施方案中，至少一个未经重排的人DH区段选自1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13、7-27及其组合。在一个实施方案中，至少一个未经重排的人JH区段选自1、2、3、4、5、6及其组合。
在多个实施方案中，人免疫球蛋白序列与非人动物(例如啮齿类动物例如小鼠、大鼠或仓鼠)种系中的恒定区可操作地连接。在一个实施方案中，恒定区是人、嵌合的人/小鼠或嵌合的人/大鼠或嵌合的人/仓鼠、小鼠、大鼠或仓鼠的恒定区。在一个实施方案中，恒定区是啮齿类动物(小鼠或大鼠或仓鼠)恒定区。在特定实施方案中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在多个实施方案中，恒定区包含至少CH2结构域和CH3结构域。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白重链序列位于非人动物(例如啮齿类动物例如小鼠、大鼠或仓鼠)种系中的免疫球蛋白重链基因座上。在一个实施方案中，人免疫球蛋白重链序列位于非人动物的种系中的非免疫球蛋白重链基因座上，其中非重链基因座是转录活性基因座。在特定实施方案中，非重链基因座是ROSA26基因座。
在多个方面，非人动物还在非人动物的种系中包含人免疫球蛋白轻链序列(例如一个或多个未经重排的轻链V和J序列或一个或多个经重排的VJ序列)。在特定实施方案中，免疫球蛋白轻链序列是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列包含一个或多个VL基因区段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列包含一个或多个JL基因区段。在一个实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列包含一个或多个VL基因区段和一个或多个JL基因区段。在特定实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列包含至少16个Vκ基因区段和5个Jκ基因区段。在特定实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列包含至少30个Vκ基因区段和5个Jκ基因区段。在特定实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列包含至少40个Vκ基因区段和5个Jκ基因区段。在多个实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列与非人动物(例如啮齿类动物例如小鼠或大鼠或仓鼠)种系中的恒定区可操作地连接。在一个实施方案中，恒定区是人、嵌合的人/啮齿类动物、小鼠、大鼠或仓鼠恒定区。在特定实施方案中，恒定区是小鼠或大鼠恒定区。在特定实施方案中，恒定区是小鼠κ恒定(mCκ)区或大鼠κ恒定(rCκ)区。
在一个实施方案中，非人动物是包含利用至少6个人Vκ基因区段和至少一个Jκ基因区段对所有的或基本上所有的Vκ和Jκ基因区段的置换。在一个实施方案中，所有的或基本上所有的Vκ和Jκ基因区段被至少16个人Vκ基因区段(人Vκ)和至少一个Jκ基因区段置换。在一个实施方案中，所有的或基本上所有的Vκ和Jκ基因区段被至少30个人Vκ基因区段和至少一个Jκ基因区段置换。在一个实施方案中，所有的或基本上所有的Vκ和Jκ基因区段被至少40个人Vκ基因区段和至少一个Jκ基因区段置换。在一个实施方案中，至少一个Jκ基因区段包含2、3、4或5个人Jκ基因区段。
在一个实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5和Vκ1-6。在一个实施方案中，Vκ基因区段包括Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15和Vκ1-16。在一个实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29和Vκ2-30。在一个实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40。
在特定实施方案中，Vκ基因区段包括从Vκ4-1至Vκ2-40跨过人免疫球蛋白κ轻链基因座的连续的人免疫球蛋白κ基因，Jκ基因区段包括从Jκ1至Jκ5跨过人免疫球蛋白κ轻链基因座的连续的基因区段。
在一个实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列位于非人动物的种系中的免疫球蛋白轻链基因座上。在特定实施方案中，非人动物的种系中的免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个实施方案中，人免疫球蛋白轻链序列位于非人动物的种系中的转录活性的非免疫球蛋白轻链基因座上。在特定实施方案中，非免疫球蛋白基因座是ROSA26基因座。
在一个方面，提供了制备人抗体的方法，其中人抗体包含来源于在如本文中描述的非人动物的细胞中编码的一个或多个可变区核酸序列的可变结构域。
在一个方面，提供了制备抗特异型抗体的方法，其中抗特异型抗体包含来源于在如本文中描述的非人动物的细胞中编码的一个或多个可变区核酸序列的可变结构域，方法包括将如本文中描述的非人动物暴露于包含人可变结构域的抗体。在一个实施方案中，抗特异型抗体特异于或能够结合人重链可变结构域。在一个实施方案中，抗体特异于或能够结合人轻链可变结构域。
在特定实施方案中，抗特异型抗体特异于或能够结合人重链可变结构域，其中人重链可变结构域包含经重排的选自VH6-1、VH1-2、VH1-3、VH2-5、VH3-7、VH1-8、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH1-18、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH1-24、VH2-26、VH4-28、VH3-30、VH4-31、VH3-33、VH4-34、VH3-35、VH3-38、VH4-39、VH3-43、VH1-45、VH1-46、VH3-48、VH3-49、VH5-51、VH3-53、VH1-58、VH4-59、VH4-61、VH3-64、VH3-66、VH1-69、VH2-70、VH3-72、VH3-73和VH3-74的人VH基因区段。
在特定实施方案中，抗特异型抗体特异于或能够结合人重链可变结构域，其中人重链可变结构域包含经重排的选自VH1-2、VH1-69、VH2-5、VH2-70、VH3-15、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-49、VH3-64、VH4-4、VH4-28、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51和VH7-4-1的人VH基因区段。
在特定实施方案中，抗特异型抗体特异于或能够结合人轻链可变结构域，其中人轻链可变结构域包含经重排的选自Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40的人Vκ基因区段。
在特定实施方案中，抗特异型抗体特异于或能够结合人轻链可变结构域，其中人轻链可变结构域包含经重排的人Vκ1-39基因区段。
在特定实施方案中，抗特异型抗体特异于或能够结合人轻链可变结构域，其中人轻链可变结构域包含经重排的选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ3-32、Vλ2-33、Vλ2-34、Vλ1-36、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ5-48、Vλ9-49、Vλ1-50、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ10-54、Vλ11-55、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69的人Vλ基因区段。
在一个实施方案中，提供了制备抗特异型抗体的方法，其中抗特异型抗体包含来源于在非人动物的细胞中编码的一个或多个可变区核酸序列的可变结构域，所述非人动物包括包含单个人VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段的受限制的免疫球蛋白重链基因座，并且其中抗特异型抗体特异于或能够结合包含经重排的人VH1-69基因区段的人重链可变结构域，方法包括将非人动物暴露于包含经重排的人VH1-69基因区段的抗体和从非人动物分离抗特异型抗体。在特定实施方案中，单个人VH基因区段选自人VH1-2和人VH1-69基因区段。
在一个实施方案中，提供了制备抗特异型抗体的方法，其中抗特异型抗体包含来源于在非人动物的细胞中编码的一个或多个可变区核酸序列的可变结构域，所述非人动物包括包含单个人VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段的受限制的免疫球蛋白重链基因座，并且其中抗特异型抗体特异于或能够结合包含经重排的人Vκ1-39基因区段的人轻链可变结构域，方法包括将非人动物暴露于包含经重排的人Vκ1-39基因区段的抗体和从非人动物分离抗体。在特定实施方案中，单个人VH基因区段选自人VH1-2和人VH1-69基因区段。
在一个方面，提供了药物组合物，其包括包含抗体或抗体片段的多肽，所述抗体或抗体片段来源于一个或多个从如本文中描述的非人动物分离的可变区核酸序列。在一个实施方案中，多肽是抗体。在一个实施方案中，多肽是仅有重链的抗体。在一个实施方案中，多肽是单链可变片段(例如scFv)。
在一个方面，提供了如本文中描述的非人动物用于制备抗体的用途。在多个实施方案中，抗体包含一个或多个来源于一个或多个从非人动物分离的可变区核酸序列的可变结构域。在特定实施方案中，可变区核酸序列包含免疫球蛋白重链基因区段。在特定实施方案中，可变区核酸序列包含免疫球蛋白轻链基因区段。
实施例
提供下列实施例以向本领域技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，并不意欲限制发明人认为是其发明的发明的范围。除非另有所指，否则温度以摄氏温度指出，压强为或接近大气压。
实施例1
受限制的人源化IgH基因座的构建
可通过同源重组利用细菌人工染色体(BAC)DNA来构建包含位于所有的人DH和JH基因区段的上游的单个人VH基因区段的独特工程化的人重链基因座。用于这样的免疫球蛋白重链基因座的构建的示例性人VH基因区段包括多态VH基因区段和/或与拷贝数的变化相关的VH基因区段，例如VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。可将遗传工程技术用于使用几种靶向构建体产生含单个VH的重链基因座(参见例如，US Pat.No.6,586,251and Valenzuela,D.M.等人,2003,High-throughput engineering of the mouse genomecoupled with high-resolution expression analysis.Nature Biotechnology21(6):652-659)。
用于构建人VH1-69受限制的IgH基因座的示例性策略(图1)。在第一步中，包含多个远端(5’)人VH基因区段包括VH1-69、上游选择盒(例如潮霉素)和5’小鼠同源臂的经修饰的人BAC通过与第二选择盒(例如大观霉素)(其还包含经修饰的重组信号序列)同源重组来靶向(图1，步骤1)。经修饰的重组信号序列(RSS)将两个点突变(T至A和G至A)引入人VH1-69基因的3’RSS区从而将RSS九聚体改变成最佳的共有序列。因此，步骤1产生了包含具有经修饰的3’RSS的人VH1-69基因区段、RSS下游约180bp的独特AsiSI限制性位点和大观霉素盒的人基因组片段。
步骤2包括将由Frt位点侧接的新霉素(Neo)盒用于删除选择盒(潮霉素)和另外的上游(5’)人VH基因区段。通过同源重组在人VH1-69基因区段的5’靶向该修饰以留下完整的人VH1-69的约8.2kb的启动子区和5’小鼠同源臂。
步骤3包括通过同源重组靶向至包含前3个功能性人VH基因区段和所有的人DH和JH基因区段的人基因组片段的由独特地经工程化的限制性位点(例如PI-SceI和AsiSI)侧接的另一个选择盒(大观霉素)(图1)。该人基因组片段先前已通过同源重组用新霉素盒靶向并且包含5’和3’同源臂，所述同源臂包含包括3’内含子增强子和IgM基因的内源重链基因座的5’和3’的小鼠基因组序列。该修饰删除5’小鼠基因组序列和人VH基因区段，留下人DH1-1基因区段上游的约3.3kb的VH-DH基因间区域、所有的人DH和JH区段以及包含3’内含子增强子和IgM基因的3’小鼠基因组片段(图1)。
步骤4通过使用独特限制性位点(如上所述)来切割和随后连接来自步骤2和步骤3的两个经修饰的BAC来完成，这产生最终的靶向构建体。用于在ES细胞中产生包含人VH1-69基因区段、所有的人DH和所有的人JH基因区段的经修饰的重链基因座的最终的靶向构建体从5’至3’包括包含：内源重链基因座上游的约20kb的小鼠基因组序列的5’同源臂、5’Frt位点、新霉素盒、3’Frt位点、约8.2kb的人VH1-69启动子、具有经修饰的3’RSS的人VH1-69基因区段、27个人DH基因区段、6个人JH基因区段和包含小鼠JH基因区段下游的约8kb的小鼠基因组序列的包含3’内含子增强子和IgM基因的3’同源臂(图1)。
用于构建人VH1-2受限制的IgH基因座的示例性策略(图2)。以类似的方式，将小鼠重链恒定区背景下的其它多态VH基因区段用于构建一系列具有受限制的数目(例如1、2、3、4或5个)的免疫球蛋白重链V区段的小鼠，其中V区段是V基因家族成员的多态变体。示例性多态VH基因区段来源于包括例如VH1-2、VH2-26、VH2-70和VH3-23的人VH基因区段。这样的人VH基因区段例如通过使用可从公开的数据库中获得的序列的从头合成(例如Blue Heron Biotechnology,Bothell,WA)来获得。因此，在一些实施方案中，独立地产生编码每个VH基因的DNA片段以用于掺入靶向载体，如本文中描述的。以此方式，在小鼠重链恒定区的背景下工程化包含受限制的数目的VH基因区段的多个经修饰的免疫球蛋白重链基因座。用于产生包含人VH1-2基因区段、27个人DH基因区段、6个人JH基因区段的受限制的人源化重链基因座的示例性靶向策略示于图2中。
简要地，将包含3个人VH基因区段(VH6-1,VH1-2,VH1-3)、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段的经修饰的人BAC克隆(参见2012年2月24日提交的USSN 13/404,075)用于产生包含人VH1-2基因区段的受限制的人源化重链基因座。该经修饰的BAC克隆将前述人重链基因区段与小鼠内含子增强子和IgM恒定区功能性连接起来。受限制的基于VH1-2的人重链基因座通过使用上述经修饰的人BAC克隆的两个同源重组来获得。在第一个同源重组中，通过使用由独特的PI-SceI限制性位点侧接的大观霉素(aadA)盒的细菌同源重组删除经修饰的人BAC克隆中205bp的人VH6-1基因区段(从外显子1中的VH6-1启动密码子上游(5’)的约10bp至外显子2起始端下游(3’)的约63bp)(图2，BHR1)。这允许随后的aadA盒的去除而不破环受限制的重链基因座内的其它人基因区段。在第二个同源重组中，通过使用包含侧翼5’AsiSI和3’AscI限制性位点的潮霉素盒的同源重组删除包含整个人VH1-3基因区段的经修饰的人BAC克隆的5’末端和基因区段下游(3’)的约60bp(图2，BHR2)。如上所述的，在确认了包含侧接人VH1-2基因区段的两个人VH基因区段的删除的最终的靶向载体之后任选地去除大观霉素盒(图2，底部)。示例性人VH1-2靶向载体示于SEQ ID NO:75中。
将多态VH基因区段用于受限制的免疫球蛋白重链基因座代表了用于产生抗体、抗体群和表达具有来源于单个人VH基因区段的具有多样化CDR的重链的B细胞群的新方法。利用宿主动物的体细胞高变机制连同与经重排的人免疫球蛋白轻链可变结构域的组合联合，导致独特重链和独特VH/VL对的工程化，这扩展经遗传修饰的动物的免疫库并加强其作为用于制备人治疗剂的下一代平台的可用性，特别是用作用于制备特异性针对人病原体的中和抗体的平台。
基于最终期望的基因座结构，可以以类似的方式使用包含期望的人VH基因区段的人BAC克隆取代其它人VH基因区段的一个。因此，将上文概述的策略用于另外的和/或其它的多态VH基因区段至小鼠免疫球蛋白重链基因座中的掺入允许产生用于中和人病原体(否则病原体可能有效地逃避宿主免疫系统)的新型抗体库。
上文描述的被靶向的ES细胞用作供体ES细胞并通过方法(同上)被引入8细胞阶段小鼠胚胎。使用检测新霉素盒、人VH基因区段和人DH和JH基因区段内的区域以及内源重链序列的存在的修改的等位基因测定(Valenzuela等人，同上)，通过基因分型鉴定具有包含可操作地连接至小鼠免疫球蛋白恒定区基因的单个人VH基因区段、所有的人DH和JH基因区段的人源化重链基因座的小鼠。表3示出了用于确认具有包含单个人VH1-69基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段的受限制的重链基因座的小鼠的引物和探针。
可将具有包含单个人VH基因区段的经工程化的重链基因座的小鼠与FLPe deletor小鼠品系(参见例如,Rodriguez,C.I.等人(2000)High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative toCre-loxP.Nature Genetics 25:139-140)繁殖以去除被靶向载体引入的未被去除的任何Frt化的新霉素盒，例如在ES细胞阶段或在胚胎中。任选地新霉素盒保留在小鼠中。
对幼崽基因分型，并选择对于包含可操作地连接至内源小鼠免疫球蛋白恒定基因的单个人VH基因区段、所有的人DH和JH区段的人源化重链基因座是杂合的幼崽以用于表征免疫球蛋白重链库。
表3
实施例2
ADAM基因至受限制的人源化IgH基因座的再工程化
具有其中内源可变区基因区段(VDJ)已被置换和/或删除的人源化免疫球蛋白重链基因座的小鼠缺乏内源ADAM6基因的表达。特别的，包含这样的人源化免疫球蛋白重链基因座的雄性小鼠显示生育能力的减弱。因此，将表达ADAM6的能力再工程化至具有人源化的受限制的重链基因座的小鼠以通过使用常规繁殖方法保存经修饰的小鼠品系。
ADAM6基因至人VH1-69受限制的IgH基因座的再工程化(图3)。将包含位于所有的人DH和JH基因区段上游的单个人VH1-69基因区段的受限制的免疫球蛋白重链基因座通过使用BAC DNA的同源重组再工程化以包含编码小鼠ADAM6a和ADAM6b的基因组片段(SEQ IDNO:77)。这通过遗传工程技术(同上)在一系列的六个步骤中完成，包括产生包含与小鼠重链恒定区连续的受限制的人源化重链基因座和小鼠ADAM6基因的最终靶向载体的包含小鼠和人序列的BAC DNA的修饰。
首先，通过一系列的牵涉不同的选择盒的3个细菌同源重组以将限制性位点独特地置于小鼠ADAM6基因周围来制备编码小鼠ADAM6a和ADAM6b的小鼠基因组片段以插入包含单个VH基因区段的人源化重链基因座(图3，步骤1-3)。在第一步中，利用由重组位点侧接的新霉素盒(其被工程化以包含独特的AsiSI限制性位点)靶向包含小鼠免疫球蛋白重链基因座的部分的小鼠BAC DNA。在第二步中，随后靶向包含小鼠ADAM6基因和新霉素盒的经修饰的小鼠片段以删除小鼠DH和JH基因区段和用包含位于选择基因的5’的独特的AscI限制性位点的大观霉素盒来置换它们。在第三步中，靶向包含位于小鼠ADAM6基因与大观霉素盒之间的新霉素盒的经双重修饰的小鼠片段以用潮霉素盒交换新霉素盒。进行该步骤以便包含ADAM6基因的经修饰的小鼠基因组片段可通过相容的基因组片段的连接来插入包含单个VH基因区段的人源化重链基因座中。
在步骤四中，利用分别在盒中的5’和3’位置包含独特的I-CeuI和AscI限制性位点的大观霉素盒通过细菌同源重组分别地靶向包含人VH1-69基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段的人源化重链基因座(图3，左上方)。在该步骤后，利用I-CeuI和AscI限制性内切酶分别地消化包含受限制的人源化重链基因座、新霉素和大观霉素盒的经修饰的基因组片段和包含ADAM6基因、潮霉素和大观霉素盒的经修饰的小鼠片段以产生用于连接的经修饰的基因组片段(图3，中间)。在步骤五中，将适当消化的基因组片段纯化和连接在一起以产生包含单个人VH基因区段、27个人DH基因区段、6个人JH基因区段和经整合的编码ADAM6a和ADAM6b的小鼠基因组片段的具有新霉素和潮霉素抗性的经再工程化的人源化重链基因座。在最后的步骤(步骤6)中，通过AsiSI消化和随后相容末端的再连接来删除潮霉素盒。
该步骤产生了用于小鼠ADAM6a和ADAM6b序列至受限制的人源化重链基因座中的再插入的最终的靶向载体，其从5’至3’包括：内源重链基因座上游的包含约20kb的小鼠基因组序列的5’同源臂、5’Frt位点、新霉素盒、3’Frt位点、约8.2kb的人VH1-69启动子、具有经修饰的3’RSS的人VH1-69基因区段、包含约17711bp的包含小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的小鼠基因组序列(SEQ ID NO:77)的小鼠基因组片段、包含27个人DH和6个人JH基因区段的人基因组片段和包含约8kb的内源重链基因组下游的包含内含子增强子和IgM恒定区基因的小鼠基因组序列的3’同源臂(人VH1-69/A6靶向载体，SEQ ID NO:74；图3，底部)。
ADAM6基因至人VH1-2受限制的IgH基因组的再工程化(图4)
将包含位于所有的人DH和JH基因区段上游的单个人VH1-2基因区段的受限制的免疫球蛋白重链基因座通过使用BAC DNA的同源重组再工程化以包含编码小鼠ADAM6a和ADAM6b的基因组片段(SEQ ID NO:73)。这通过遗传工程技术(同上)在一系列步骤中完成，包括产生包含与小鼠重链恒定区连续的受限制的人源化重链基因座和小鼠ADAM6基因的最终靶向载体的包含小鼠和人序列的BAC DNA的修饰。
修饰包含由5’潮霉素和3’大观霉素盒侧接的单个人VH1-2基因区段、27个人DH基因区段、6个人JH基因区段、小鼠重链内含子增强子和小鼠IgM恒定区的经修饰的人BAC克隆(描述于上文的实施例1中)以包含编码小鼠ADAM6基因的基因组片段。这通过经修改的等温DNA组装法(在本文中称作寡核苷酸介导的等温组装，其基于Gibson等人描述的方法(2009,Enzymatic assembly of DNA moleculesup to several hundred kilobases,Nature Methods 6(5):343-345))来完成。该经修改的方法不需要被连接的片段之间的序列同一性。相反，序列同一性通过用于连接两个片段的寡核苷酸来传递。此外，所述寡核苷酸用作将序列同一性添加至片段的一个的末端的模板。延伸的片段使得能够与第二片段杂交。具体地，将寡核苷酸介导的等温组装用于利用包含20kb的远端小鼠IgH同源臂、小鼠ADAM6a基因、由Frt位点侧接的新霉素盒和小鼠ADAM6b基因的NotI-AscI片段来置换潮霉素盒。
简要地，利用AsiSI和AscI消化包含受限制的人VH1-2重链基因座的经修饰的人BAC克隆(图4，左上方)以去除潮霉素盒，利用NotI和AscI消化包含小鼠ADAM6基因的经修饰的小鼠BAC(图4，右上方)以去除包含5’小鼠臂的片段和释放侧接新霉素盒的小鼠ADAM6基因。随后将两种经消化的BAC片段与5’和3’连接寡核苷酸混合在一起并在组装反应混合物(T5外切核酸酶,Phusion DNA聚合酶,Taq DNA连接酶,10mM DTT,5％PEG8000(w/v),1mM NAD,0.2mM dNTPs,10mM MgCl2和100mM Tris-HCl)中在50℃温育1小时。5’连接寡核苷酸与包含人VH1-2的经修饰的人BAC克隆的AsiSI位点的5’的序列包含38bp的重叠以及与NotI位点和相邻的包含ADAM6基因的经修饰的小鼠BAC克隆的3’序列包含30bp的重叠。3’连接寡核苷酸与包含ADAM6基因、AscI位点的经修饰的小鼠BAC克隆的AscI位点的5’的序列包含26bp的重叠，并与包含人VH1-2的经修饰的人BAC克隆的AscI位点的3’的序列包含35bp的重叠。将组装反应转化至大肠杆菌中并利用卡那霉素和大观霉素选择来选择正确的产物。为了产生最终的靶向载体，通过PI-SceI消化和随后的再连接来去除大观霉素盒。
最终的靶向载体从5’至3’包括约20kb的远端小鼠IgH同源臂、小鼠ADAM6a基因、5’Frt位点、新霉素盒、3’Frt位点、小鼠ADAM6b基因、～18kb的人基因组片段、人VH1-2基因区段、～46.6kb的人基因组片段、失活的人VH6-1基因区段、27个人DH基因区段、6个人JH基因区段和包含小鼠IgH内含子增强子和IgM恒定区基因的8kb的3’小鼠同源臂(SEQ ID NO:76)。
将每一种最终的靶向载体(如上所述)用于电穿孔包含被删除的内源重链基因座的小鼠ES细胞以产生包含被异位置入的包含受限制的人源化重链基因座内的小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的小鼠基因组序列。使用TAQMANTM探针(Lie and Petropoulos,1998,Advancesin quantitative PCR technology:5’nuclease assays,Curr OpinBiotechnol 9(1):43-48)通过定量PCR测定鉴定包含人源化重链基因座内的异位小鼠基因组片段的阳性ES细胞。
上文描述的被靶向的ES细胞用作供体ES细胞并通过小鼠工程化方法(参见例如，US Pat.No.7,6598,442、7,576,259、7,294,754)被引入8细胞阶段小鼠胚胎。使用检测小鼠ADAM6a和ADAM6b基因在受限制的人源化重链基因座内以及人重链序列的存在的修改的等位基因测定(Valenzuela等人，2003)，通过基因分型鉴定具有包含受限制的数量的人基因区段和包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组序列的人源化重链基因座的小鼠。
对幼崽基因分型，并选择对于包括包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组片段的受限制的人源化重链基因座是杂合的幼崽以用于表征小鼠ADAM6基因表达和生育能力。

Claims (43)

1.一种小鼠，所述小鼠在其种系中具有：
(a)包含单个人VH基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段的人基因组序列；和
(b)编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白的序列，其中编码ADAM6的序列位于与野生型小鼠的ADAM6基因座不同的位置。
2.权利要求1的小鼠，其中所述单个人VH基因区段是多态VH基因区段。
3.权利要求1的小鼠，其中所述编码ADAM6的序列是小鼠序列。
4.权利要求1的小鼠，其中小鼠基因组序列与人基因组序列是并列的或连续的。
5.权利要求1的小鼠，其中人基因组序列和小鼠基因组序列存在于内源免疫球蛋白重链基因座。
6.权利要求1的小鼠，其中人基因组序列存在于内源免疫球蛋白重链基因座并且小鼠基因组序列存在于小鼠基因组中非内源免疫球蛋白重链基因座的位置。
7.权利要求1的小鼠，其中所述小鼠包含所有的或基本上所有的内源VH基因区段的删除。
8.权利要求1的小鼠，其中所述单个人VH基因区段选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、VH3-23或其多态变体。
9.权利要求8的小鼠，其中所述人VH基因区段是VH1-69。
10.权利要求8的小鼠，其中所述人VH基因区段是VH1-2。
11.权利要求1的小鼠，其中单个VH基因区段可操作地连接至人、小鼠或嵌合的人/小鼠免疫球蛋白恒定区基因。
12.权利要求11的小鼠，其中所述免疫球蛋白恒定区基因是小鼠恒定区基因。
13.权利要求11的小鼠，其中免疫球蛋白恒定基因包含选自人CH1、人铰链、人CH2、人CH3及其组合的人序列。
14.权利要求12的小鼠，其中小鼠恒定基因在内源免疫球蛋白重链基因座上。
15.权利要求1的小鼠，其中所述人基因组序列包含人VH1-69基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段。
16.权利要求1的小鼠，其中所述人基因组序列包含人VH1-2基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段。
17.权利要求1、15或16的小鼠，其还包含一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个Jκ基因区段。
18.权利要求17的小鼠，其中所述一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个Jκ基因区段存在于内源免疫球蛋白轻链基因座。
19.一种小鼠，其包含可操作地连接于至少一个人DH基因区段和至少一个人JH基因区段的至少一个人VH基因区段，其中所述小鼠包含异位的小鼠ADAM6序列。
20.权利要求19的小鼠，其中所述核酸序列存在于异位的位置。
21.权利要求19的小鼠，其中核酸序列存在于内源免疫球蛋白基因座。
22.权利要求19的小鼠，其中核酸序列存在于小鼠基因组中非内源免疫球蛋白基因座的位置。
23.一种表达血清免疫球蛋白的小鼠，其中所述小鼠的多于80％的血清免疫球蛋白包含人重链可变结构域和同源的人轻链可变结构域，其中所述人重链可变结构域来源于基本上由单个人VH基因区段和/或其多态变体组成的VH基因区段库。
24.一种小鼠，所述小鼠在其种系中在内源免疫球蛋白重链基因座上包含利用单个人VH基因区段和/或其多态变体对所有或基本上所有的内源VH基因区段的置换。
25.权利要求24的小鼠，其还在内源免疫球蛋白轻链基因座上包含利用一个或多个人轻链V基因区段对所有或基本上所有的内源轻链V基因区段的置换。
26.权利要求25的小鼠，其还包含可操作地连接至人轻链V基因区段的一个或多个人轻链J基因区段。
27.一种细胞或组织，其来源于权利要求1、19、23或24的小鼠。
28.一种制备包含来源于单个人VH基因区段的重链的人抗体群的方法，所述方法包括：
(a)用目的抗原免疫权利要求1的小鼠；
(b)使所述小鼠发生针对所述目的抗原的免疫应答；和
(c)鉴定或分离非人动物的免疫球蛋白重链可变区序列，其中抗体结合所述目的抗原。
29.权利要求28的方法，其中所述免疫球蛋白重链可变区序列与SEQ ID NO:5具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。
30.权利要求28的方法，其中所述免疫球蛋白重链可变区序列包含SEQ ID NO:5。
31.权利要求28的方法，其中所述免疫球蛋白重链可变区序列与SEQ ID NO:64具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。
32.权利要求28的方法，其中所述免疫球蛋白重链可变区序列包含SEQ ID NO:64。
33.一种用于修饰小鼠的免疫球蛋白重链基因座的方法，包括：
(a)对小鼠免疫球蛋白重链基因座进行第一修饰，所述修饰导致雄性小鼠中内源小鼠ADAM6活性的减弱或消除；和
(b)对小鼠进行第二修饰以恢复小鼠的ADAM6活性。
34.权利要求33的方法，其中步骤(b)中的核酸序列存在于异位的位置。
35.权利要求33的方法，其中所述第一修饰包括一个或多个人免疫球蛋白基因序列的存在。
36.权利要求33的方法，其中所述第一修饰包括在小鼠免疫球蛋白重链基因座中利用一个或多个人免疫球蛋白基因序列对小鼠免疫球蛋白重链基因座中的一个或多个序列的置换。
37.权利要求36的方法，其中所述第一修饰包括在小鼠免疫球蛋白重链基因座中利用单个人VH基因区段对一个或多个内源VH基因区段的置换。
38.权利要求33的方法，其中所述第一修饰包括在小鼠免疫球蛋白重链基因座中利用人重链可变基因序列对内源重链可变基因序列的置换。
39.权利要求33的方法，其中同时进行所述第一和第二修饰。
40.一种用于产生特异性针对抗原的抗体的方法，其包括如下步骤：
(a)用抗原免疫权利要求1的小鼠；
(b)从小鼠分离至少一种产生特异性针对抗原的抗体的细胞；和
(c)培养步骤(b)的至少一种产生抗体的细胞和获得所述抗体。
41.权利要求40的方法，其中在从步骤(b)中获得的至少一种细胞产生的至少一种杂交瘤细胞上进行步骤(c)中的培养。
42.权利要求40的方法，其中步骤(b)中获得的至少一种细胞来源于来自步骤(a)的小鼠的脾、淋巴结或骨髓。
43.权利要求40的方法，其中步骤(a)的用抗原免疫是利用蛋白质、DNA、DNA和蛋白质的组合或表达抗原的细胞来进行的。
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