BR112014030852B1

BR112014030852B1 - Método ex vivo para modificar um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de uma célula de camundongo

Info

Publication number: BR112014030852B1
Application number: BR112014030852-7A
Authority: BR
Inventors: Lynn MacDonald; Andrew J. Murphy; Sean Stevens; John McWhirter; Naxin Tu
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2023-04-11
Also published as: AU2020202185A1; JP6697430B2; DK2858487T3; PL2858487T3; PT3597037T; US20240065238A1; PL3597037T3; CN104540383B; CY1122482T1; ES2874515T3; AU2020202185B2; AU2022291579A1; KR102436654B1; RS62121B1; SI2858487T1; US20190200588A1; KR102266274B1; JP2020110187A; LT3597037T; JP2022090103A

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM CAMUNDONGO. Camundongos, embriões, células, e tecidos tendo um local da cadeia pesada da imunoglobulina restrito e uma sequência ectópica que codifica uma ou mais proteínas ADAM6 são fornecidos. Em várias modalidades, são descritos camundongos que têm locais de cadeia pesada da imunoglobulina endógenos humanizados e são capazes de expressar uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo que seja funcional em um camundongo macho. Os camundongos, embriões, células, e tecidos tendo um local da cadeia pesada da imunoglobulina caracterizado por um segmento de gene VH humano único, uma pluralidade de segmentos de gene de DH humano e uma pluralidade de segmentos de gene JH humanos e capazes de expressar uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo também são fornecidos.

Description

[001] Animais não humanos geneticamente engenheirados que compreendem uma complexidade de gene variável da cadeia pesada da imunoglobulina reduzida são fornecidos, em que os animais não humanos são capazes de expressar uma proteína ADAM6 ou fragmento funcional do mesmo. Os animais não humanos geneticamente engenheirados que expressam anticorpos de um número restrito de segmentos e/ou variantes de gene variável da cadeia pesada da imunoglobulina dos mesmos, em que os animais não humanos carecem de um gene ADAM6 endógeno funcional mas retêm a função de ADAM6, são descritos, incluindo camundongos que compreendem uma modificação de um local da região variável (VH) endógena da cadeia pesada da imunoglobulina que torna o camundongo incapaz de fabricar uma proteína ADAM6 funcional e resulta em uma perda na fertilidade. Os camundongos geneticamente modificados compreendem um local VH da imunoglobulina caracterizado por um número restrito de segmentos de gene VH, por exemplo, um único segmento da imunoglobulina VH, por exemplo, um segmento de gene VH1-69 humano ou um segmento de gene VH1-2 humano, e que compreendem ainda função de ADAM6 são descritos, incluindo camundongos que compreendem uma sequência de ácido nucléico ectópica que restaura a fertilidade para um camundongo macho.

[002] Os camundongos, células, embriões, e tecidos geneticamente modificados que compreendem uma sequência de ácido nucléico que codifica um local ADAM6 funcional são descritos, em que os camundongos, células, embriões, e tecidos expressam uma cadeia pesada da imunoglobulina derivada de um segmento de gene VH humano úncoo. Alm disso, os camundongo,, células, embriles, e tecidos carecem de um gene ADAM6 endógeno funcional mas retém a função de ADAM6 caracterizada pela presenÁa de uma sequíncia de •cido nucléico ectópica que codifica uma proteína ADAM6. Métodos para fabricar sequíncias de anticorpo em animais férteis não humanos que são úteis para ligar patógenos, incluindo patógenos humanos são fornecidos.

FUNDAMENTOS

[003] Os animais não humanos, por exemplo, camundongos, foram geneticamente engenheirados para serem ferramentas úteis nos méoodos paru fabricar sequíncias de anticorpo para o uso em produtos terapíuticos humanos com base em anticorpo. Os camundongos com locais de região variável humanizados (por exemplo, os genes VH, DH, e JH, e os genes VL e JL) são usados para gerar domínios variáveis de cadeias pesada e leve cognatas para o uso em produtos terapíuticos de anticorpo. Os camundongos que geram anticorpos totalmente humanos com cadeias pesada e leve cognatas são conhecidos na técnica. Para a criação destes camundongos, foi necessário desativar os genes endógenos da imunoglobulina do camundongo de modo que os transgenes totalmente humanos aleatoriamente integrados funcionassem como o repertório expressado de imunoglobulinas no camundongo. Tais camundongos podem fabricar anticorpos humanos adequados para o uso como produtos terapíuticos humanos, mas estes camundongos demonstram problemas substanciais com seus sistemas imunes. Estes problemas levam a vários obstáculos experimentais, por exemplo, os camundongos são impraticáveis para gerar repertórios de anticorpo suficientemente diversos, requerem o uso de correÁies extensivas de re- engenheiramento, fornecem um processo de seleção clonal subótimo provavelmente devido à incompatibilidade entre elementos humanos e de camundongo, e uma fonte não confiável de populaÁies grandes e diversas de sequíncias variáveis humanas necessárias para serem verdadeiramente úe^ss para fabricar produtos terapíuticos humanos.

[004] Os produtos terapíuticos de anticorpo humano são engenheirados com base nas características desejadas em relação aos antígenos selecionados. Os camundongos humanizados são imunizados com os antígenos selecionados, e os camundongos imunizados são usados para gerar populaÁies de anticorpo a partir dos quais identificar domínios variáveis pesados e leves cognatos de alta afinidade com características de ligação desejadas. Alguns camundongos humanizados, tais como aqueles tendo uma humanização apenas de regiles variáveis nos locais endógenos de camundongo, geram populaÁies de cÈlulas B que são similares em carater e número para as populaÁies de cÈlula B de camundongo do tipo selvagem. Como um resultado, uma população extremamente grande e diversa de cÈlulas B está disponível nestes camundongos a partir dos quais triar anticorpos, refletindo um grande número de rearranjos de imunoglobulina diferentes, para identificar domínios variáveis pesados e leves com as características mais desejáveis.

[005] Entretanto, nem todos os antígenos provocam uma resposta imune que exibe um número muito grande de rearranjos de uma ampla seleção de segmentos variáveis (V). Isto È, a resposta imune humoral humana a certos antígenos È evidentemente restrita. A restrição È refletida na seleção clonal de cÈlulas B que expressam apenas certos segmentos V que ligam este antígeno particular com afinidade e especificidade suficientemente alta. Alguns de tais antígenos são clinicamente significantes, isto È, vários patógenos humanos são bem conhecidos. Uma suposição surge que o segmento V expressado na resposta imune humana È um segmento V que, em combinação com um segmento D humano e um J humano, È mais provavelmente para gerar um anticorpo útil de alta afimdade do qee um segmento V aleatoriamente selecionado que não foi observado em uma resposta de anticorpo humano a este antígeno.

[006] É levantada a hipótese de que a seleção natural, ao longo de milínios de experiíncia entre seres humanos e o patógeno, tem selecionado a fundação ou base mais eficiente a partir da qual planejar a sua arma mais eficaz para neutralizar o patógeno - o segmento de gernv V selecionado. Existe uma necessidade na tÈcnica quanto a anticorpos superiores que liguem e/ou neutralizem antígenos como os patógenos debatidos acima. Existe uma necessidade para gerar mais rapidamente sequíncias etss a partir de segmentos V de gene selecionados, incluindo segmentos V de gene selecionados polimórficos e/ou somaticamente mutados e para gerar mais rapidamente populaÁies úteis cie células B tendo rearanijos doos segmentos V de gene com vários segmentos de gene D e J, incluindo versles somaticamente mutadas do mesmo, e em particular rearranjos com regiles de CDR3 úmass e úieis. Esteíu umn necsssú^ade quanto s sistumas -lólógicos melhorados, por exemplo, animais não humanos (tais como, por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, etc.) que possam gerar sequíncias da região variável de anticorpo terapeuticamente útsis de seumelltos V de gene selecionados em nemero e diversidade aumentados que, por exemplo, podem ser obtidos em animais modificados existentes, enquanto que ao mesmo tempo reduz ou elimina mudanÁas nocivas que resultariam das modificaÁies genÈticas. Existe uma necessidade quanto a sistemas biológicos melhorados engenheirados para ter um sistema imune humoral comprometido para selecionar clonalmente sequíncias variáveis de anticorpo derivadas de segmentos V de gene restritos, selecionados, incluindo mas não limitados a domínios variáveis de cadeias pesadas e leves cognatas humanas, atris aa fabricação de produtos terapíuticos com base em anticorpos humanos contra antígenos selecionados, incluindo certos patógenos humanos. Permanece uma necessidade na tÈcnica para fabricar camundongos modificados geneticamente melhorados que são útsis na geraçào de selµlgc]oias de imunoglobulina, incluindo sequíncias de anticorpo humanas, direcionadas para a eliminação de patógenos que afligem a população humana.

[007] Existe uma necessidade na tÈcnica quanto a anticorpos terapíuticos que são capazes de neutralizar antígenos virais, por exemplo, HIV e HCV, incluindo anticorpos específicos de antígeno contendo cadeias pesadas derivadas de um úmoo segmento arrived de gene liunivno. Ix\it>te tambÈm uma necessidade quanto a outros mÈtodos e animais não humanos para fabricar anticorpos leiss. ínclumoo entino^nos qee ngmpseendgm mn repertório de cadeias pesadas derivadas de um único segmento VH humano e tendo um conjunto diverso de sequíncias de CDR incluindo cadeias pesadas que expressam com cadeias leves humanas cognatas, e incluindo a restauração de efeitos desfavoráveis que resultam da inserç„o de sequíncias genômicas humanas dentro do genoma dos animais não humanos. Os mÈtodos são necessários para selecionar as CDRs para proteínas de ligação com base na imunoglobulina que fornecem uma diversidade reatada de proteínas de ligação a partir das quais a escolha, e diversidade reatada de domínios variáveis da imunoglobulina, incluindo composiÁies e mÈtodos para gerar domínios variáveis da imunoglobulina somaticamente mutadas e clonalmente selecionadas para o uso, por exemplo, na fabricação de produtos terapíuticos humanos.

SUMÁRIO

[008] Os locais de imunoglobulina geneticamente modificados são fornecidos que compreendem um número restrito de segmentos de gene da região variável da cadeia pesada diferentes (isto È, genes V, genes VH, segmentos de gene VH, ou segmentos de gene V), por exemplo, não mais do que um, dois, ou trís genes V diferentes; ou não mais do que um membro da família de segmento de gene V presente, por exemplo, em uma única cópia oui em cópias múltiplas e/ou compreendendo um ou mais polimorfismos, e em várias modalidades os locais carecem de uma sequíncia que codifica uma proteína ADAM6 funcional endógena.

[009] Locais são fornecidos que são capazes de rearranjar e formar um gene que codifica um domínio variável da cadeia pesada que È derivado de um repertório de gene V da cadeia pesada que È restrito, por exemplo, que È um uni o) segmento de gene VH ou selecionado de uma pluralidade de variantes polimórficas do unioo segmento ee enee VH, em que em várias modalidades os locais carecem de um gene ADAM6 funcional endógeno ou fragmento funcional do mesmo.

[0010] Locais da imunoglobulina modificados incluem locais que carecem de um gene ADAM6 funcional endógeno e compreendem sequíncias da imunoglobulina humana são fornecidos, por exemplo, um segmento V humano operavelmente ligado a uma sequíncia constante da imunoglobulina humana ou (ou quimÈrica humana/não humana) não humana (e em ligação operável com, por exemplo, um Segmento D e/ou um J). Os locais modificados que compreendem cópias múltiplas de um UUÍCO segmento ee gene VH, incluindo em que uma ou mais das cópias compreendem uma variante polimórfica, e uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica uma proteína ADAM6 ou fragmento da mesma que seja funcional no animal não humano, são fornecidos. Locais modificados que compreendem cópias múltiplas de um único segmento VH, operavelmente ligadas com um ou mais segmentos D e um ou mais segmentos J, operavelmente ligados a uma sequíncia constante da imunoglobulina não humana, por exemplo, uma sequíncia de camundongo ou rato ou ser humano, são fornecidos. Animais não humanos compreendendo tais locais humanizados tambÈm são fornecidos, em que os animais não humanos tím fertilidade tipo selvagem.

[0011] Os animais não humanos são fornecidos que compreendem um local variável da cadeia pesada da imunoglobulina (por exemplo, um transgene ou como uma inserç„o ou substituÍção em um local variável da cadeia pesada endógeno de animal não humano) que compreende um único segmento VH operavelmente ligado a um Segmento de gene D e/ou J. Em varias modalidades, o úncoo eegmmto de gene VH È operavelmente ligado a um ou mais segmentos de gene D e/ou um ou mais J no local de gene variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno do animal não humano. Em varias modalidades, os animais não humanos compreendem ainda uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica uma proteína ADAM6 ou homólogo ou ortólogo da mesma que seja funcional no animal não humano macho que compreende o local da cadeia pesada modificado. Em varias modalidades, a sequíncia de nucleotídeo ectópica È contígua com o nncco segmento VH, um segmento de gene D, ou um segmento de gene J. Em várias modalidades, a sequíncia de nucleotídeo ectópica È contígua com uma sequíncia que não da imunoglobulina no genoma do animal não humano. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica está no mesmo cromossoma como o local da cadeia pesada modificado. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica está em um cromossoma diferente como o local da cadeia pesada modificado.

[0012] Animais não humanos são fornecidos que são modificados nos seus locais da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina para deletar todos ou substancialmente todos (por exemplo, todos os segmentos funcionais, ou quase todos os segmentos funcionais) os segmentos VH da imunoglobulina endógena e que compreende um segmento VH1-69 humano (ou um segmento VH1-2 humano) operavelmente ligado a um segmento D e J ou um segmento J no local da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno do animal não humano. Animais não humanos compreendendo tais locais e que carecem de um gene(s) ADAM6 endógeno(s) tambÈm são fornecidos.

[0013] MÈtodos são fornecidos para fabricar sequíncias da imunoglobulina humana em animais não humanos. Em várias modalidades as sequíncias da imunoglobulina humana são derivadas de um repertório das sequíncias V da imunoglobulina que consiste essencialmente de um úmoo segmento V humano, por exemplo, VH1-69 ou VH1-2, e um ou mais segmentos D e J ou um ou mais segmentos J. MÈtodos para fabricar sequÍncias da imunoglobulina humana em animais, tecidos, e cÈlulas não humanos são fornecidos, em que as sequÍncias da imunoglobulina humana se ligam a um patógeno.

[0014] Em um aspecto, as construÁies de •cido nuclÈico, cÈlulas, embriles, camundongos, e mÈtodos são fornecidos para fabricar camundongos que compreendem uma modificação que resulta em uma proteína ADAM6 de camundongo endógena não funcional ou gene ADAM6 (por exemplo, um silenciamento de ou uma deleção em um gene ADAM6 endógeno), em que os camundongos compreendem uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, os camundongos compreendem uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de roedor ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo; em uma modalidade específica, a proteína ADAM6 de roedor È uma proteína ADAM6 de camundongo.

[0015] Em um aspecto, as construÁies de •cido nuclÈico, cÈlulas, embriles, camundongos, e mÈtodos são fornecidas para fabricar camundongos que compreendem uma modificação de um local da imunoglobulina de camundongo endógeno, em que os camundongos compreendem uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, o local da imunoglobulina de camundongo endógeno È uma cadeia pesada da imunoglobulina local, e a modificação reduz ou elimina a atividade de ADAM6 de uma cÈlula ou tecido de um camundongo macho. Em uma modalidade, o local da imunoglobulina de camundongo endógeno È uma cadeia pesada da imunoglobulina local, e a modificação mantÈm ou sustenta a atividade de ADAM6 de uma cÈlula ou tecido de um camundongo macho.

[0016] Em um aspecto, um local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado È fornecido que compreende um repertório de segmento V da cadeia pesada que È restrito em relação à identidade do segmento V, e que compreende um ou mais segmentos D e um ou mais segmentos J, ou um ou mais segmentos J. Em uma modalidade, o segmento V da cadeia pesada È um segmento humano. Em uma modalidade, os locais de cadeia pesada da imunoglobulina modificado carecem de um gene ADAM6 endógeno. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada modificado compreende ainda uma sequíncia de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6. Em uma modalidade específica, a sequíncia de nucleotídeo È contígua com os segmentos de gene V, D e/ou J no local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado.

[0017] Em uma modalidade, o local modificado È um local não humano. Em uma modalidade, o local não humano È modificado com pelo menos uma sequíncia da imunoglobulina humana. Em uma modalidade, o local não humano È modificado com pelo menos uma sequíncia da imunoglobulina humana e uma sequíncia que codifica uma proteína ADAM6.

[0018] Em uma modalidade, a restrição È para um membro da família do segmento V. Em uma modalidade, o um membro da família do segmento V está presente em duas ou mais cópias. Em uma modalidade, o um membro da família do segmento V está presente como duas ou mais variantes (por exemplo, duas ou mais formas polimÈricas do membro da família do segmento V). Em uma modalidade, o um segmento V È um membro da família do segmento V humano. Em uma modalidade, o um membro da família do segmento V está presente em várias variantes como È observado na população humana em relação a esta variante. Em uma modalidade, o membro da família do segmento V È selecionado da Tabela 1. Em uma modalidade, o membro da família do segmento V está presente em várias variantes como mostrado, para cada segmento V, em vários alelos do alelo 1 atÈ o número de alelos mostrados na coluna da direita da Tabela 1.

[0019] Em um aspecto, camundongos são fornecidos que compreendem uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica um camundongo ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo; camundongos tambÈm são fornecidos que compreendem uma sequíncia de nucleotídeo endógena que codifica um camundongo ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo, e pelo menos uma modificação genÈtica de um local da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo endógena que codifica um camundongo ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo esta localizada em uma posição ectópica quando comparada a um gene ADAM6 endógeno de um camundongo tipo selvagem.

[0020] Em um aspecto, mÈtodos são fornecidos para fabricar camundongos que compreendem uma modificação de um local da imunoglobulina de camundongo endógeno, em que os camundongos compreendem uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[0021] Em um aspecto, mÈtodos são fornecidos para fabricar camundongos que compreendem uma modificação genÈtica de uma cadeia pesada da imunoglobulina local, em que a aplicação dos mÈtodos resulta em camundongos machos que compreendem um local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado (ou uma deleção do mesmo), e os camundongos machos são capazes de gerar descendíncia pelo acasalamento. Em uma modalidade, os camundongos machos são capazes de produzir esperma que pode transitar de um útero de cmnundonoo atraves de um oviduto de camundongo para fertilizar um óvulo de camundongo.

[0022] Em um aspecto, mÈtodos são fornecidos para fabricar camundongos que compreendem uma modificação genÈtica de uma cadeia pesada da imunoglobulina local, em que a aplicação dos mÈtodos resulta em camundongos machos que compreendem um local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado (ou uma deleção do mesmo), e os camundongos machos exibem uma redução na fertilidade, e os camundongos compreendem uma modificação genÈtica que restaura no todo ou em parte a redução na fertilidade. Em várias modalidades, a redução na fertilidade v caracterizada por uma incapacidade do esperma dos camundongos machos para migrarem de um utero de amnnndonoo através de um oviduto de aamnndonoo para fertilizar um óvulo de camundongo. Em várias modalidades, a redução na fertilidade v caracterizada pelo esperma que exibe um defeito de migração in vivo. Em várias modalidades, a modificação genvtica que restaura no todo ou em parte a redução na fertilidade v uma sequíncia de •cido nuclvico que codifica um gene ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[0023] Em uma modalidade, a modificação genvtica compreende substituir locais variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina endógenos com um número restrito, por exemplo, não mais do que um, dois ou trís segmentos de gene variáveis da cadeia pesada (VH) diferentes, um ou mais segmentos de gene da diversidade da cadeia pesada (DH) e um ou mais segmentos de gene de uni„o da cadeia pesada (JH) de uma outra espvcie (por exemplo, uma espvcie que não de camundongo). Em uma modalidade, a modificação genvtica compreende a inserç„o de um único segmento de gene VH da imunoglobulina ortólogo, pelo menos um segmento de gene DH, e pelo menos um segmento de gene JH em locais variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina endógenos. Em uma modalidade específica, a espvcie v a humana. Em uma modalidade, a modificação genvtica compreende a deleção de um local variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno no todo ou em parte, em que a deleção resulta em uma perda de função de ADAM6 endógena. Em uma modalidade específica, a perda de função de ADAM6 endógena está associada com uma redução na fertilidade em camundongos machos. Em uma modalidade, a modificação genÈtica compreende a inativação de um local variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno no todo ou em parte, em que a deleção não resulta em uma perda de função de ADAM6 endógena. A inativação pode incluir a substituição ou deleção de um ou mais segmentos de gene endógenos que resultam em um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno que È substancialmente incapaz de rearranjo para codificar uma cadeia pesada de um anticorpo que compreende segmentos de gene endógenos. A inativação pode incluir outras modificaÁies que tornam o local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno incapaz de rearranjar para codificar a cadeia pesada de um anticorpo, em que a modificação não inclui substituição ou deleção de segmentos de gene endógenos. As modificaÁies exemplares incluem inversles cromossômicas e/ou translocaÁies mediadas pelas tÈcnicas moleculares, por exemplo, usando a colocação precisa de sítios de recombinação específicos de sitio (por exemplo, tecnologia Cre-lox).

[0024] Em uma modalidade, a modificação genÈtica compreende inserir dentro do genoma do camundongo um fragmento de DNA contendo um número restrito, por exemplo, não mais do que um, dois ou tris segmentos de gene variáveis da cadeia pesada (VH) diferentes, um ou mais segmentos de gene da diversidade da cadeia pesada (DH) e um ou mais segmentos de gene de uni„o da cadeia pesada (JH) de uma outra espÈcie (por exemplo, uma espÈcie que não de camundongo) operavelmente ligados a uma ou mais sequíncias da região constante (por exemplo, um gene de IgM e/ou um de IgG). Em uma modalidade, o fragmento de DNA È capaz de sofrer rearranjo para formar uma sequíncia que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade, a modificação genÈtica compreende a inserç„o de um único segmento de gene VH da imunoglobulina ortólogo, pelo menos um segmento de gene DH, e pelo menos um segmento de gene JH dentro do genoma do camundongo. Em uma modalidade específica, a espÈcie È a humana. Em uma modalidade, a modificação genÈtica compreende a deleção de um local variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno no todo ou em parte para tornar o local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno não funcional, em que a deleção resulta ainda em uma perda de função de ADAM6 endógena. Em uma modalidade específica, a perda de função de ADAM6 endógena esta associada com uma redução na fertilidade em camundongos machos.

[0025] Em um aspecto, camundongos são fornecidos que compreendem uma modificação que reduz ou elimina a expressão de ADAM6 de camundongo de um alelo ADAM6 endógeno tal que um camundongo macho tendo a modificação exiba uma fertilidade reduzida (por exemplo, uma capacidade altamente reduzida para gerar descendíncia pelo acasalamento), ou È essencialmente infÈrtil, devido à redução ou eliminação da função de ADAM6 endógena, em que os camundongos compreendem ainda uma sequíncia de ADAM6 ectópica ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em um aspecto, a modificação que reduz ou elimina a expressão de ADAM6 de camundongo È uma modificação (por exemplo, uma inserç„o, uma deleção, uma substituição, etc.) em um local da imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, o local da imunoglobulina È um local da cadeia pesada da imunoglobulina.

[0026] Em uma modalidade, a redução ou perda de função de ADAM6 compreende uma incapacidade ou incapacidade substancial do camundongo para produzir esperma que possa viajar de um útero de camundongo atravÈs de um oviduto de camundongo para fertilizar um óvulo de camundongo. Em uma modalidade específica, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% das cÈlulas de esperma produzidas em um volume ejaculado do camundongo são incapazes de viajar atravÈs de um oviduto m vivo a seguir da copulação e fertliizar um ovulo de camundongo.

[0027] Em uma modalidade, a redução ou perda de função de ADAM6 compreende uma incapacidade para formar ou incapacidade substancial para formar um complexo de ADAM2 e/ou ADAM3 e/ou ADAM6 em uma superfície de uma cÈlula de esperma do camundongo. Em uma modalidade, a perda de função de ADAM6 compreende uma incapacidade substancial para fertilizar um óvulo de camundongo pela copulação com um camundongo fímea.

[0028] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que carece de um gene ADAM6 endógeno funcional, e compreende uma proteína (ou uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica uma proteína) que confere funeào de ADAM6)aitty nocamnndonoo. Em uma modalidade, ocamnndonoo È um camundongo macho e a funcionalidade compreende a fertilidade realÁada quando comparada com um camundongo que carece de um gene ADAM6 endógeno funcional.

[0029] Em uma modalidade, a proteína È codificada por uma sequíncia genômica localizada dentro de um local da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade específica, o local da imunoglobulina È um local da cadeia pesada. Em uma outra modalidade específica, o local da cadeia pesada compreende um único segmento cie gene VH humano, pelo menos um DH humano e pelo menos um JH humano. Em uma outra modalidade específica, o local da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH humano, 27 segmentos de gene DH humanos, e seis segmentos de gene JH humanos. Em uma modalidade, a proteína ectópica È codificada por uma sequíncia genômica localizada dentro de um local que não da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade, o local que não da imunoglobulina È um local transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o local transcricionalmente ativo È o local ROSA26. Em uma modalidade específica, o local transcricionalmente ativo está associado com a expressão específica de tecido. Em uma modalidade, a expressão específica de tecido esta presente nos tecidos reprodutivos. Em uma modalidade, a proteína È codificada por uma sequÍncia genômica aleatoriamente inserida dentro da linha germinativa do camundongo.

[0030] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma cadeia leve humana ou humana/camundongo quimÈrica ou humana/rato quimÈrica (por exemplo, variável humana, constante de camundongo ou rato) e uma cadeia pesada variável humana/constante de camundongo ou rato quimÈrica. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um transgene que compreende um gene da cadeia leve constante quimÈrica variável humana/rato ou camundongo operavelmente ligado a um promotor transcricionalmente ativo, por exemplo, um promotor ROSA26. Em uma outra modalidade específica, o transgene de cadeia leve humano/camundongo ou rato quimÈrico compreende uma sequíncia da região variável de cadeia leve humana rearranjada na linha germinativa do camundongo.

[0031] Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica está localizada dentro de um local da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade específica, o local da imunoglobulina È um local da cadeia pesada. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada compreende um línico segmento de gene VH humano, pelo menos um DH humano e pelo menos um JH humano. Em uma modalidade específica, o local da cadeia pesada compreende um úmco VH humano, 27 segmentos de gene de DH humano e seis segmentos de gene JH humanos. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica está localizada dentro de um local que não da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade, o local que não da imunoglobulina È um local transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o local transcricionalmente ativo È o local ROSA26. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica È posicionada aleatoriamente inserida dentro da linha germinativa do camundongo.

[0032] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que carece de um gene ADAM6 endógeno funcional, em que o camundongo compreende uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que complementa a perda da função de ADAM6 do camundongo. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica confere ao camundongo uma capacidade para produzir descendíncia que È comparável a uma que corresponde ao camundongo do tipo selvagem que contÈm um gene ADAM6 endógeno funcional. Em uma modalidade, a sequíncia confere ao camundongo uma capacidade para formar um complexo de ADAM2 e/ou ADAM3 e/ou ADAM6 sobre a superfície da cÈlula de esperma do camundongo. Em uma modalidade, a sequíncia confere ao camundongo uma capacidade para viajar de um úfero & camnndonoo atravÈs de um oviduto de camundongo a um óvulo de camundongo para fertilizar o óvulo.

[0033] Em uma modalidade, o camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e compreende a sequíncia de nucleotídeo ectópica produz pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% do número de companheiros de ninhada que um camundongo do tipo selvagem da mesma idade e cepa produz em um período de tempo de seis meses.

[0034] Em uma modalidade, o camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e compreende a sequíncia de nucleotídeo ectópica produz pelo menos cerca de 1,5 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 7 vezes, cerca de 8 vezes, ou cerca de 10 vezes ou mais de progínie quando cruzados em um período de tempo de seis meses do que um camundongo da mesma idade e da mesma cepa ou similar que careÁa do gene ADAM6 endógeno funcional e que carece da sequíncia de nucleotídeo ectópica que È cruzada substancialmente no mesmo período de tempo e sob substancialmente as mesmas condiÁies.

[0035] Em uma modalidade, o camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e compreende a sequíncia de nucleotídeo ectópica produz um número mÈdio de pelo menos cerca de 2 vezes, 3 vezes, ou 4 vezes mais alto de filhotes por ninhada em um período de cruzamento de 4 ou 6 meses do que um camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e que carece da sequíncia de nucleotídeo ectópica, e que È cruzado durante o mesmo período de tempo.

[0036] Em uma modalidade, o camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e compreende a sequíncia de nucleotídeo ectópica È um camundongo macho, e o camundongo macho produz esperma que quando recuperado dos ovidutos em cerca de 5 a 6 horas após a cópula reflete uma migração em oviduto que È pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, 100 vezes, 110 vezes, ou 120 vezes ou mais alto do que um camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e que carece da sequíncia de nucleotídeo ectópica.

[0037] Em uma modalidade, o camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e compreende a sequíncia de nucleotídeo ectópica quando copulado com um camundongo fímea gera esperma que È capaz de atravessar o úeero e entrar e atravessar o oviduto dentro de cerca de 6 horas em uma eficiíncia que È quase igual à do esperma de um camundongo do tipo selvagem.

[0038] Em uma modalidade, o camundongo que carece do gene ADAM6 endógeno funcional e compreendendo a sequíncia de nucleotídeo ectópica produz cerca de 1,5 vez, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, ou cerca de 4 vezes ou mais companheiros de ninhada em um período de tempo comparável do que um camundongo que carece do gene ADAM6 funcional e que carece da sequíncia de nucleotídeo ectópica.

[0039] Em um aspecto, um camundongo compreendendo na sua linha germinativa uma sequíncia de •cido nuclÈico que não de camundongo que codifica uma proteína da imunoglobulina È fornecido, em que a sequíncia de imunoglobulina que não de camundongo compreende uma inserç„o de um gene ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, a sequíncia de imunoglobulina que não de camundongo compreende uma sequíncia da imunoglobulina humana. Em uma modalidade, a sequíncia compreende uma sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina humana. Em uma modalidade, a sequíncia compreende uma sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana. Em uma modalidade, a sequíncia compreende um único segmento de gene VH, um ou mais Segmentos de gene DH, e um ou mais segmentos de gene JH; em uma modalidade, a sequíncia compreende um ou mais segmentos de gene VL e um ou mais segmentos de gene JL. Em uma modalidade, o úmco VH, um ou mais DH, e um ou mais segmentos de gene JH, ou um ou mais segmentos de gene VL e JL, não são rearranjados. Em uma modalidade, o úmco VH, um ou mais DH, e um ou mais segmentos de gene JH, ou um ou mais segmentos de gene VL e JL, são rearranjados. Em uma modalidade, a seguir do rearranjo do único VH, um ou mais DH, e um ou mais segmentos de gene JH, ou um ou mais segmentos de gene VL e JL, o camundongo compreende no seu genoma pelo menos uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica um gene ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, a seguir do rearranjo o camundongo compreende no seu genoma pelo menos duas sequíncias de •cido nuclÈico que codificam um gene ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, a seguir do rearranjo o camundongo compreende no seu genoma pelo menos uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica um gene ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, o camundongo compreende o gene ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo em uma cÈlula B. Em uma modalidade, o camundongo compreende o gene ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo em uma cÈlula que não B.

[0040] Em um aspecto, camundongos são fornecidos que expressam uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana ou fragmento funcional da mesma de um local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógena, em que os camundongos compreendem uma atividade de ADAM6 que È funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana compreende um segmento de gene VH humano polimórfico. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana compreende um segmento de gene VH1-69 humano. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana compreende um segmento de gene VH1-2 humano.

[0041] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem um unia) alelo de AAAM6 endógena não mofificado ou oótólgoo de homólogo ou fragmento funcional do mesmo em um local ADAA6 endógeno.

[0042] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequíncia de ADAA6 ectópica de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo que codifica uma proteína que confere função de ADAA6.

[0043] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequíncia de ADAA6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo em um local no genoma de camundongo que se aproxima do local do alelo ADAM6 de camundongo endógeno, por exemplo, sequência 3’ e 5’ de um segmento de gene V de um segmento de gene D inicial. Em uma modalidade específica, os camundongos machos compreendem uma sequíncia de ADAA6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional da mesma 3’ de um segmento de gene VH humano e 5’ de um segmento de gene DH humano. Em uma outra modalidade específica, os camundongos machos compreendem uma sequÍncia de ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo 5’ de um segmento de gene VH humano. Em uma outra modalidade específica, os camundongos machos compreendem uma sequíncia de ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo 5’ de um local da cadeia pesada quimérico compreendendo um segmento de gene VH humano úmoo, um cm mass ^^111^1105 de gnne DH, e um ou mais segmentos de gene JH. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada quimérico compreende um segmento de gene VH1-69 humano, 27 segmentos de gene de DH humano, e seis segmentos de gene JH humanos. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada quimérico compreende um segmento de gene VH1-2 humano, 27 segmentos de gene de DH humano, e seis segmentos de gene JH humanos.

[0044] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequíncia de ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo flanqueados a montante, a jusante, ou a montante e a jusante (em relação à direção de transcrição da sequíncia de ADAM6) de uma sequíncia de •cido nucléico que codifica um segmento de gene variável da imunoglobulina ou um segmento de gene de diversidade da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o segmento de gene variável da imunoglobulina é um segmento de gene humano. Em uma modalidade, o segmento de gene variável da imunoglobulina é um segmento de gene humano, e a sequíncia que codifica o camundongo ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo funcional em um camundongo está entre os segmentos de gene VH humanos; em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene VH humano, e a sequíncia está em uma posição 5’ do segmento de gene VH; em uma modalidade, a sequíncia está em uma posição 3’ do segmento de gene VH; em uma modalidade, a sequíncia está em uma posÍção entre o segmento de gene VH e o primeiro segmento de gene DH. Em uma modalidade específica, o segmento de gene DH È o primeiro segmento de gene DH. Em uma modalidade, o camundongo compreende dois segmentos de gene VH, e a sequíncia está em uma posição entre os dois segmentos de gene VH; em uma modalidade, a sequíncia está em uma posição entre um segmento de gene VH e um segmento de gene DH. Em uma modalidade específica, o segmento de gene DH È o primeiro segmento de gene DH.

[0045] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequíncia de ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo que está localizada em uma posição em um local da imunoglobulina endógeno que È o mesmo ou substancialmente o mesmo como em um camundongo tipo selvagem macho. Em uma modalidade específica, o local endógeno È incapaz de codificar a cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade específica, o local endógeno está posicionado em um local no genoma do camundongo macho que torna o mesmo incapaz de codificar a cadeia pesada de um anticorpo. Em várias modalidades, os camundongos machos compreendem uma sequíncia de ADAM6 localizada no mesmo cromossoma como segmentos de gene da imunoglobulina humana e a sequíncia de ADAM6 codifica uma proteína ADAM6 funcional.

[0046] Em um aspecto, um camundongo macho È fornecido que compreende um gene ADAM6 endógeno não funcional, ou uma deleção de um gene ADAM6 endógeno, na sua linha germinativa; em que as cÈlulas de esperma do camundongo são capazes de transitar em um oviduto de um camundongo femea e fertilizar um óvulo. Em uma modalidade, os camundongos compreendem uma cópia extracromossômica de um gene ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo que seja funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, os camundongos compreendem um gene ADAM6 de camundongo ectópico ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[0047] Em um aspecto, camundongos são fornecidos que compreendem uma modificação genÈtica que reduz a funçào de ADAM6 de camundongo endógena, em que o camundongo compreende pelo menos alguma função de DAM6aatyf fornecida por um afofo não modificado endógeno que seja funcional no todo ou em parte (por exemplo, um heterozigoto), ou pela expressão de uma sequíncia ectópica que codifica um ADAM6 ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[0048] Em uma modalidade, os camundongos compreendem a função de ADAM6 suficiente para conferir nos camundongos machos a capacidade para gerar descendíncia pelo acasalamento, quando comparados com camundongos machos que carecem de um ADAM6 funcional. Em uma modalidade, a função de ADAM6 È conferida pela presenÁa de uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica um camundongo ADAM6 ou um homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, a função de ADAM6 È conferida por um gene ADAM6 endógeno presente em um local endógeno da imunoglobulina, em que o local endógeno da imunoglobulina È incapaz de codificar a cadeia pesada de um anticorpo. ADAM6 homólogo ou ortólogo ou fragmentos do mesmo que são funcionais em um camundongo macho incluem aqueles que restauram, no todo ou em parte, a perda de capacidade para gerar descendíncia observada em um camundongo macho que carece de atividade de ADAM6 de camundongo endógena suficiente, por exemplo, a perda na capacidade observada em um camundongo silenciado em ADAM6. Neste sentido os camundongos silenciados em ADAM6 incluem camundongos que compreendem um local endógeno ou fragmento do mesmo, mas que não são funcionais, isto È, que não expressam ADAM6 (ADAM6a e/ou ADAM6b) de modo algum, ou que expressam ADAM6 (ADAM6a e/ou ADAM6b) em um nível que È insuficiente para sustentar uma capacidade essencialmente normal para gerar descendÍncia de um camundongo do tipo selvagem macho. A perda de função pode ser devido, por exemplo, a uma modificação em um gene estrutural do local (isto È, em uma região que codifica ADAM6a ou ADAM6b) ou em uma região reguladora do local (por exemplo, em uma sequÍncia 5’ em relação ao gene ADAM6a, ou 3’ da região codificadora de ADAM6a ou ADAM6b, em que a sequÍncia controla, no todo ou em parte, a transcrição de um gene ADAM6, a expressão de um RNA de ADAM6, ou a expressão de uma proteína ADAM6). Em varias modalidades, ortólogos ou homólogos ou fragmentos do mesmo que são funcionais em um camundongo macho são aqueles que possibilitam um esperma de um camundongo macho (ou uma maioria de cÈlulas de esperma no ejaculado de um camundongo macho) transitar um oviduto de camundongo e fertilizar um óvulo de camundongo.

[0049] Em uma modalidade, camundongos machos que expressam a região variável da imunoglobulina humana ou fragmento funcional da mesma compreendem atividade de ADAM6 suficiente para conferir nos camundongos machos a capacidade para gerar descendÍncia pelo acasalamento com camundongos fÍmeas e, em uma modalidade, os camundongos machos exibem uma capacidade para gerar descendÍncia quando do acasalamento com camundongos fÍmeas que È em uma modalidade pelo menos 25%, em uma modalidade, pelo menos 30%, em uma modalidade pelo menos 40%, em uma modalidade pelo menos 50%, em uma modalidade pelo menos 60%, em uma modalidade pelo menos 70%, em uma modalidade pelo menos 80%, em uma modalidade pelo menos 90%, e em uma modalidade quase a mesma como, aquela de camundongos com um ou dois alelos ADAM6 não modificados endógenos.

[0050] Em uma modalidade os camundongos machos expressam ADAM6 suficiente (ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo) para possibilitar uma cÈlula de esperma dos camundongos machos atravessar um oviduto de camundongo fímea e fertilizar um óvulo de camundongo.

[0051] Em uma modalidade, a função de ADAMÍóality éconferida por uma sequíncia de •cido nuclÈico que È contígua com uma sequíncia cromossômica de camundongo (por exemplo, o •cido nuclÈico È aleatoriamente integrado dentro de um cromossoma de camundongo; ou colocados em um local específico, por exemplo, pelo alvejamento do •cido nuclÈico a um local específico, por exemplo, pela inserç„o mediada pela recombinase específica de sitio (por exemplo, mediada por Cre) ou recombinação homóloga). Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 esta presente em um acido nuclÈico que È distinto de um cromossoma do camundongo (por exemplo, a sequíncia de ADAM6 esta presente em um epissoma, isto È, extracromossomicamente, por exemplo, em uma construção de expressão, um vetor, um YAC, um transcromossoma, etc.).

[0052] Em um aspecto, camundongos geneticamente modificados e cÈlulas são fornecidas que compreendem uma modificação de um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógena, em que os camundongos expressam pelo menos uma porç„o de uma sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina, por exemplo, pelo menos uma porç„o de uma sequíncia humana, em que os camundongos compreendem uma atividade ADAM6 que seja funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a modificação reduz ou erradica a atividade de ADAM6 do camundongo. Em uma modalidade, o camundongo È modificado tal que ambos os alelos que codificam a atividade de ADAM6 estejam ausentes ou expressem um ADAM6 que não funcione substancialmente para sustentar o acasalamento normal em um camundongo macho. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma sequíncia de acido nuclÈico ectópica que codifica um camundongo ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, a modificação mantÈm a atividade ADAM6 do camundongo e torna um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno incapaz de codificar uma cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade específica, a modificação inclui inversles cromossômicas e ou translocaÁies que tornam o local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno incapaz de codificar uma cadeia pesada de um anticorpo.

[0053] Em um aspecto, camundongos e cÈlulas geneticamente modificadas são fornecidas que compreendem uma modificação de um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno, em que a modificação reduz ou elimina a atividade de ADAM6 expressada a partir de uma sequíncia de ADAM6 do local, e em que os camundongos compreendem uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo. Em varias modalidades, a proteína ADAM6 ou fragmento da mesma são codificados por uma sequíncia de ADAM6 ectópica. Em várias modalidades, a proteína ADAM6 ou fragmento da mesma são expressados a partir de um alelo de ADAM6 endógeno. Em várias modalidades, o camundongo compreende um primeiro alelo de cadeia pesada da imunoglobulina que compreende uma primeiro modificação que reduz ou elimina a expressão de um ADAM6 funcional do primeiro alelo de cadeia pesada da imunoglobulina, e o camundongo compreende um segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina que compreende uma segunda modificação que não reduz substancialmente ou não elimina a expressão de um ADAM6 funcional do segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina.

[0054] Em uma modalidade, a segunda modificação está localizada 3’ (em relação à direcionalidade transcricional do segmento de gene V de camundongo) de um segmento de gene V de camundongo final e localizada a 5’ do gene constante da cadeia pesada da imunoglobulina (em relação à direcionalidade transcricional da sequíncia constante) de um camundongo (ou humana/camundongo quimÈrica) ou fragmento do mesmo (por exemplo, uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica uma humana e/ou de camundongo: CH1 e/ou dobradiÁa e/ou CH2 e/ou CH3).

[0055] Em uma modalidade, a modifícação esta em um primeiro alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um primeiro local que codifica um primeiro alelo ADAM6, e a função de ADAM6 resulta da expressão de um ADAM6 endógeno em um segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um segundo local que codifica um ADAM6 funcional, em que o segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina compreende pelo menos uma modificação de um segmento de gene V, D, e/ou J. Em uma modalidade específica, a pelo menos uma modificação dos segmentos de gene V, D, e ou J È uma deleção, uma substituição com um úmco VH humano, um ou mais DH, e/ou um ou mais segmentos de gene JH, uma substituição com um VH (ou VHH), DH, e/ou segmento de gene JH camelídeos, uma substituição com um segmento de gene VH (ou VHH), DH, e/ou JH humanizados ou camelizados, uma substituição de uma sequíncia de cadeia pesada com uma sequíncia de cadeia leve, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação È a deleção de um ou mais segmentos de gene VH, DH, e/ou JH e uma substituição com um ou mais segmentos de gene VL e/ou JL (por exemplo, um segmento de gene VL e/ou JL humano) no local da cadeia pesada.

[0056] Em uma modalidade, a modificação esta em um primeiro alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um primeiro local e um segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um segundo local, e a função de ADAM6 resulta da expressão de um ADAM6 ectópico em um local que não da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade específica, o local que não da imunoglobulina È o local ROSA26. Em uma modalidade específica, o local que não da imunoglobulina È transcricionalmente ativo no tecido reprodutivo.

[0057] Em uma modalidade, a modificação esta em um primeiro alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um primeiro local e um segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um segundo local, e a função de ADAM6 resulta da expressão de um ADAM6 ectópico no primeiro alelo de cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade, a modificação esta em um primeiro alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um primeiro local e um segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina em um segundo local, e a função de ADAM6 resulta da expressão de um ADAM6 ectópico no segundo alelo de cadeia pesada da imunoglobulina.

[0058] Em um aspecto, um camundongo compreendendo um silenciamento de ADAM6 heterozigoto ou um homozigoto È fornecido. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma sequíncia da imunoglobulina modificada que È uma sequíncia da imunoglobulina humana ou uma humanizada, ou uma sequíncia da imunoglobulina de camelídeo ou humana ou de camundongo camelizada. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina modificada está presente no local da cadeia pesada de camundongo endógeno da imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina modificada compreende uma sequíncia de gene vartável da cadeia pesada humana em um local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógeno. Em uma modalidade, a sequíncia de gene vartável da cadeia pesada humana substitui uma sequíncia de gene vartável da cadeia pesada de camundongo no local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógena.

[0059] Em um aspecto, um camundongo incapaz de expressar um ADAM6 de camundongo endógeno funcional de um local ADAM6 de camundongo endógeno È fornecido. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma sequíncia de •cido nuclÈico ectópica que codifica um ADAM6, ou fragmento funcional do mesmo, que seja funcional no camundongo. Em uma modalidade específica, a sequíncia de •cido nuclÈico ectópica codifica uma proteína que resgata uma perda na capacidade para gerar descendíncia exibida por um camundongo macho que È homozigoto para um silenciamento de ADAM6. Em uma modalidade específica, a sequíncia de •cido nuclÈico ectópica codifica uma proteína ADAM6 de camundongo.

[0060] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que carece de um local ADAM6 endógeno funcional, e que compreende uma sequíncia de •cido nuclÈico ectópica que confere ao camundongo funr„o de ADAM6. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico compreende uma sequíncia de ADAM6 de camundongo endógena ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 de camundongo endógena compreende a sequíncia que codifica ADAM6a e ADAM6b localizada em um camundongo do tipo selvagem entre o segmento de gene V (VH) da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo mais a 3’ e o segmento de gene D (DH) da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo mais a 5’.

[0061] Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico compreende uma sequíncia que codifica ADAM6a de camundongo ou fragmento funcional do mesmo e/ou uma sequíncia que codifica ADAM6b de camundongo ou fragmento funcional do mesmo, em que ADAM6a e/ou ADAM6b ou fragmento(s) funcional(is) dos mesmos est„o operavelmente ligados a um promotor. Em uma modalidade, o promotor È um promotor humano. Em uma modalidade, o promotor È o promotor ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 compreende a sequíncia localizada entre o primeiro códon do primeiro gene ADAM6 mais próximo ao segmento de gene DH de camundongo mais a 5’ e a sequíncia de sinal de recombinação do segmento de gene DH mais a 5’, em que 5’ é indicada em relac?^) à di:reç^2> de transcrição dos genes da imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, o promotor È um promotor viral. Em uma modalidade específica, o promotor viral È um promotor de citomegalovírus (CMV). Em uma modalidade, o promotor È um promotor da ubiquitina.

[0062] Em uma modalidade, o promotor È um promotor indutível. Em uma modalidade, o promotor indutível regula a expressão em tecidos não reprodutivos. Em uma modalidade, o promotor indutível regula a expressão em tecidos reprodutivos. Em uma modalidade específica, a expressão das sequíncias de ADAM6a e/ou ADAM6b de camundongo ou fragmento(s) funcional(is) dos mesmos È desenvolvimentalmente regulada pelo promotor indutível em tecidos reprodutivos.

[0063] Em uma modalidade, o ADAM6a e/ou ADAM6b de camundongo são selecionados do ADAM6a da SEQ ID NO: 1 e/ou ADAM6b da sequíncia SEQ ID NO: 2.

[0064] Em uma modalidade, o promotor ADAM6 de camundongo È um promotor da SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 de camundongo compreende a sequíncia de •cido nuclÈico da SEQ ID NO: 3 diretamente a montante (em relação à direção da transcrição de ADAM6a) do primeiro códon de ADAM6a e estendendo para a extremidade da SEQ ID NO: 3 a montante da região codificadora de ADAM6. Em uma outra modalidade específica, o promotor ADAM6 È um fragmento que se estende de dentro de cerca de 5 a cerca de 20 nucleotídeos a montante do códon de partida de ADAM6a a cerca de 0,5 kb, 1 kb, 2 kb, ou 3 kb ou mais a montante do códon de partida de ADAM6a.

[0065] Em uma modalidade, o promotor ADAM6 de camundongo È um promotor da SEQ ID NO: 73. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 de camundongo compreende a sequíncia de •cido nuclÈico da SEQ ID NO: 73 diretamente a montante (em relação à direção da transcrição de ADAM6a) do primeiro códon de ADAM6a e que se estende atÈ a extremidade da SEQ ID NO: 73 a montante da região codificadora de ADAM6. Em uma outra modalidade específica, o promotor ADAM6 È um fragmento que se estende de dentro de cerca de 5 a cerca de 20 nucleotídeos a montante do códon de partida de ADAM6a a cerca de 0,5 kb, 1 kb, 2 kb, ou 3 kb ou mais a montante do códon de partida de ADAM6a.

[0066] Em uma modalidade, o promotor ADAM6 de camundongo È um promotor da SEQ ID NO: 77. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 de camundongo compreende a sequíncia de •cido nuclÈico da SEQ ID NO: 77 diretamente a montante (em relação à direção de transcrição de ADAM6a) do primeiro códon de ADAM6a e que se estende atÈ a extremidade da SEQ ID NO: 77 a montante da região codificadora de ADAM6. Em uma outra modalidade específica, o promotor de ADAM6 È um fragmento que se estende de dentro de cerca de 5 a cerca de 20 nucleotídeos a montante do códon de partida de ADAM6a a cerca de 0,5 kb, 1 kb, 2 kb, ou 3 kb ou mais a montante do códon de partida de ADAM6a.

[0067] Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico compreende a SEQ ID NO: 3 ou um fragmento do mesmo que quando colocados em um camundongo que seja infértil ou que tenha fertilidade baixa devido a uma falta de ADAM6, melhora a fertilidade ou restaura a fertilidade a uma fertilidade quase do tipo selvagem. Em uma modalidade, a SEQ ID NO: 3 ou um fragmento do mesmo conferem em um camundongo macho a capacidade para produzir uma cÈlula de esperma que È capaz de atravessar um oviduto de camundongo fímea de modo a fertilizar um óvulo de camundongo.

[0068] Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico compreende a SEQ ID NO: 73 ou um fragmento do mesmo que quando colocados em um camundongo que seja infÈrtil ou que tenha fertilidade baixa devido a uma falta de ADAM6, melhora a fertilidade ou restaura a fertilidade a uma fertilidade quase do tipo selvagem. Em uma modalidade, a SEQ ID NO: 73 ou um fragmento do mesmo confere em um camundongo macho a capacidade para produzir uma cÈlula de esperma que seja capaz de atravessar um oviduto de camundongo fímea de modo a fertilizar um óvulo de camundongo.

[0069] Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico compreende a SEQ ID NO: 77 ou um fragmento do mesmo que quando colocado em um camundongo que seja infÈrtil ou que tenha fertilidade baixa devido a uma falta de ADAM6, melhora a fertilidade ou restaura a fertilidade a cerca de uma fertilidade tipo selvagem. Em uma modalidade, SEQ ID NO: 77 ou um fragmento do mesmo confere em um camundongo macho a capacidade para produzir uma cÈlula de esperma que È capaz de atravessar um oviduto de camundongo fímea de modo a fertilizar um óvulo de camundongo.

[0070] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que compreende uma deleção de uma sequíncia de nucleotídeo endógena que codifica uma proteína ADAM6, uma substituição de um segmento de gene VH de camundongo endógeno com um segmento de gene VH humano, e uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[0071] Em uma modalidade, o camundongo compreende um local da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende uma deleção de um local endógeno da sequíncia da imunoglobulina de nucleotídeo que compreende um gene ADAM6 endógeno, compreende uma sequíncia de nucleotídeo que codifica um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana, e em que a sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo esta dentro ou diretamente adjacente à sequíncia de nucleotídeo que codifica o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana.

[0072] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH endógenos com uma sequíncia de nucleotídeo que codifica um segmento de gene VH humano único, e a sequência de nucleotídeo ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo esta dentro, ou diretamente adjacente à sequíncia de nucleotídeo que codifica o segmento de gene VH humano único. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituÍção de um ou mais segmentos de gene DH endógeno com um ou mais segmentos de gene de DH humano no local de gene DH endógeno. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituição de um ou mais segmentos de gene JH endógeno com um ou mais segmentos de gene JH humano no local de gene JH endógeno. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todo ou substancialmente os segmentos de gene VH, DH, e JH endógenos e uma substituição nos locais de gene VH, DH, e JH endógenos com um único segmento de gene VH humano, um ou mais DH humanos, e um ou mais JH humanos, em que o camundongo compreende uma sequíncia ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequíncia ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo é colocada a montante ou 5’ do segmento de gene VH humano único. Em uma outra modalidade específica, a sequíncia ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo é colocada a jusante ou 3’ do segmento de gene VH humano único. Imi uma outra modalidade (SS [S^^CÍÍK:ÍL a sequíncia ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo È colocada entre o segmento de gene VH humano único e o primeúo e^^s^ne^^nk) de gene DH humano presente. Em uma outra modalidade específica, o camundongo compreende uma deleção de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo, e uma substituÍção com um segmento de gene VH humano único, e a sequêncãa de nucSeotídeo ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo È colocada a jusante do segmento de gene VH1-69 humano e a montante do segmento de gene DH1-1 humano. Em uma outra modalidade específica, o camundongo compreende uma deleção de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo, e uma substituÍção com um segmento de gene VH humano único, e a sequêncãa de nucleotídeo ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo È colocada a jusante do segmento de gene VH1-2 humano e a montante do segmento de gene D humanoHl-1.

[0073] Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma substituÍção de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH endógenos com uma sequíncia de nucleotídeo que codifica um nnico segmento de gene VH, e a sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo esta dentro, ou diretamente adjacente à sequíncia de nucleotídeo que codifica o segmento de gene VH humano úmco.

[0074] Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo esta presente em um transgene no genoma do camundongo. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo esta presente extracromossomicamente no camundongo.

[0075] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que compreende uma modificação de um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno, em que o camundongo expressa uma cÈlula B que compreende uma sequíncia da imunoglobulina rearranjada operavelmente ligada a uma sequíncia de gene da região constante da cadeia pesada, e a cÈlula B compreende no seu genoma (por exemplo, em um cromossoma de cÈlula B) um gene que codifica um ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina rearranjada operavelmente ligada à sequíncia de gene da região constante da cadeia pesada compreende uma sequíncia V, D, e/ou J da cadeia pesada humana; uma sequíncia V, D, e/ou J da cadeia pesada de camundongo; uma sequíncia V e/ou J da cadeia leve humana ou de camundongo. Em uma modalidade, a sequíncia de gene da região constante da cadeia pesada compreende uma sequíncia de cadeia pesada humana ou uma de camundongo selecionada do grupo que consiste de uma CH1, uma dobradiÁa, uma CH2, uma CH3, e uma combinação do mesmo.

[0076] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que compreende um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno funcionalmente silenciado, em que a função de ADAM6 È mantida no camundongo, e compreende ainda uma inserç„o de um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana, em que o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana incluem um segmento de gene VH humano único, um ou mais segmentos de gene de DH humano, e um ou mais segmentos de gene JH humanos. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana inclui um segmento de gene VH1-69 humano, 27 segmentos de gene de DH humano, e seis segmentos de gene JH humanos. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana incluem um segmento de gene VH1-2 humano, 27 segmentos de gene de DH humano, e seis segmentos de gene JH humanos.

[0077] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado È fornecido, em que o camundongo compreende um gene da cadeia leve da imunoglobulina funcionalmente silenciado, e compreende ainda uma substituição de um ou mais segmentos de gene da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógenos com um único segmentos de gene da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana, em que o camundongo carece de um local ADAM6 endógeno funcional, e em que o camundongo compreende uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que expressa uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[0078] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que carece de um local ou sequíncia de ADAM6 de camundongo endógeno funcional e que compreende uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica um camundongo ADAM6 local ou fragmento funcional de um local ou sequíncia de ADAM6 de camundongo, em que o camundongo È capaz de acasalar com um camundongo do sexo oposto para produzir uma progínie que compreende o local ou sequíncia de ADAM6 ectópicos. Em uma modalidade, o camundongo È macho. Em uma modalidade, o camundongo È fímea.

[0079] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado È fornecido, em que o camundongo compreende um segmento de gene da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana em um local de gene da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógena, o camundongo carece de uma sequíncia de ADAM6 funcional endógena no local de gene da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógena, e em que o camundongo compreende uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que expressa uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[0080] Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica que expressa a proteína ADAM6 de camundongo È extracromossômica. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica que expressa a proteína ADAM6 de camundongo È integrada em um ou mais locais em um genoma do camundongo. Em uma modalidade específica, o um ou mais locais incluem um local da imunoglobulina.

[0081] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que expressa uma sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina de um local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógena modificado, em que a cadeia pesada È derivada de um segmento de gene V humano, um segmento de gene D, e um segmento de gene J, em que o camundongo compreende uma atividade de ADAM6 que È funcional no camundongo.

[0082] Em uma modalidade, o camundongo compreende um nnico segmento de gene V humano, uma pluralidade de segmentos de gene D, e uma pluralidade de segmentos de gene J. Em uma modalidade, os segmentos de gene D são segmentos de gene D humanos. Em uma modalidade, os segmentos de gene J são segmentos de gene J humanos. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma sequíncia da região constante da cadeia pesada humanizada, em que a humanização compreende a substituição de uma sequÍncia selecionada de uma CH1, dobradiÁa, CH2, CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade específica, a cadeia pesada È derivada do segmento de gene V humano, um segmento de gene D humano, um segmento de gene humano J, uma sequíncia de CH1 humana, uma sequíncia de dobradiÁa humana ou de camundongo, uma sequíncia CH2 de camundongo, e uma sequíncia CH3 de camundongo. Em uma outra modalidade específica, o camundongo compreende ainda uma sequíncia constante da cadeia leve humana.

[0083] Em uma modalidade, o camundongo compreende um gene ADAM6 que é flanqueado 5’ e 3’ pelos segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena são incapazes de codificar uma cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade específica, o gene ADAM6 do camundongo esta em uma posição que È a mesma como em um camundongo do tipo selvagem e os locais de gene variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógena do camundongo são incapazes de rearranjar para codificar uma cadeia pesada de um anticorpo.

[0084] Em uma modalidade, o segmento de gene V é flanqueado 5’ (em relação à direção transcricional do segmento de gene V) por uma sequíncia que codifica uma atividade de ADAM6 que È funcional no camundongo.

[0085] Em uma modalidade, o segmento de gene V é flanqueado 3’ (em relação à direção transcricional do segmento de gene V) por uma sequíncia que codifica uma atividade de ADAM6 que È funcional no camundongo.

[0086] Em uma modalidade, o segmento de gene D é flanqueado 5’ (em relação à direção transcricional do segmento de gene D) por uma sequíncia que codifica uma atividade ADAM6 que seja funcional no camundongo.

[0087] Em uma modalidade, o segmento de gnne J f flanquaddo ’’ (em relação à direção transcricional do segmento de gene J) por uma sequíncia que codifica uma atividade de ADAM6 que È funcional no camundongo.

[0088] Em uma modalidade, a atividade de ADAM6 que È funcional no camundongo resulta da expressão de uma sequíncia de nucleotídeo Idealizada 5’ dd segmentd de gene D mais a 5’ e 3’ dd únicd segmentd de gene V (em relação à direção de transcrição do segmento de gene V) do local da cadeia pesada de camundongo endógeno da imunoglobulina modificado.

[0089] Em uma modalidade, a atividade de ADAM6 que È funcional no camundongo resulta da expressão de uma sequíncia de nucleotídeo Idealizada 5’ dd segmentd de gene J mais a 5’ e 3’ dd segmentd de gene D mais a 3’ (em relação à direção de transcrição do segmento de gene D) do local da cadeia pesada de camundongo endógeno da imunoglobulina modificado.

[0090] Em uma modalidade, a atividade de ADAM6 que È funcional no camundongo resulta da expressão de uma sequíncia de nucleotídeo Idealizada 5 ’ dd únicd segmentd de gene V hqmano (em relação à direção de transcrição do segmento de gene V) do local da cadeia pesada de camundongo endógeno da imunoglobulina modificado.

[0091] Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo compreende uma sequíncia selecionada de uma sequíncia de ADAM6b de camundongo ou fragmento funcional do mesmo, uma sequíncia de ADAM6a de camundongo ou fragmento funcional do mesmo, e uma combinação do mesmo.

[0092] Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo posicionada a mdntante (5’) dq a jqsante (3’) dd únicd segmentd de gene V humano È colocado na orientação de transcrÍção oposta em relação ao segmento de gene V humano. Em uma modalidade específica, a sequíncia de nucleotídeo codifica, de 5’ para 3’ em rela„õo à dirÁ„ão de aranscri„ão dos genes ADAM6s, e a sequíncia de ADAM6a seguida por uma sequíncia de ADAM6b.

[0093] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene VH humano nmoo justaoosto ou oontiuoo omii maa sequíncia de ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma.

[0094] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene VH1-69 humano justaposto ou contíguo com uma sequíncia de ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma.

[0095] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene VH1-2 humano justaposto ou contíguo com uma sequíncia de ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma.

[0096] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene VH humano úmco, e a sequênaia de DAAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma È justaposta ou contígua com segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena, em que os segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena são incapazes de rearranjar para codificar uma cadeia pesada de um anticorpo.

[0097] Em uma modalidade, a sequíncia que codifica a atividade de ADAA6 que È funcional no camundongo È uma sequíncia de ADAA6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma.

[0098] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que compreende uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica um ADAA6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) em uma cÈlula que carrega o DNA da linhagem da cÈlula B não rearranjada, mas não compreende a sequíncia de •cido nuclÈico que codifica o ADAA6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) em uma cÈlula B que compreende locais de imunoglobulina rearranjados, em que a sequÍncia de •cido nuclÈico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) ocorre no genoma em uma posição que È diferente de uma posição em que um gene ADAM6 de camundongo aparece em um camundongo do tipo selvagem. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) está presente em todas ou substancialmente todas as cÈlulas que carregam o DNA que não são da linhagem de cÈlula B rearranjada; em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico está presente nas cÈlulas da linha germinativa do camundongo, mas não em um cromossoma de uma cÈlula B rearranjada.

[0099] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que compreende uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica um ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) em todas ou substancialmente todas as cÈlulas que carregam o DNA, incluindo cÈlulas B que compreendem locais de imunoglobulina rearranjados, em que a sequíncia de •cido nuclÈico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) ocorre no genoma em uma posição que È diferente de uma posição em que um gene ADAM6 de camundongo aparece em um camundongo do tipo selvagem. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) está em um •cido nuclÈico que È contígua com o local da imunoglobulina rearranjado. Em uma modalidade, o •cido nuclÈico que È contíguo com o local da imunoglobulina rearranjado È um cromossoma. Em uma modalidade, o cromossoma È um cromossoma que È encontrado em um camundongo do tipo selvagem e o cromossoma compreende uma modificação de um local da imunoglobulina de camundongo.

[00100] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado È fornecido, em que o camundongo compreende uma cÈlula B que compreende no seu genoma uma sequÍncia de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo está em um local da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o local da cadeia pesada compreende segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena que são incapazes de rearranjar para codificar a cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo está em um local que não È um local da imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 esta em um transgene induzido por um promotor heterólogo. Em uma modalidade específica, o promotor heterólogo È um promotor que não da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a cÈlula B expressa uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo.

[00101] Em uma modalidade, 90% ou mais das cÈlulas B do camundongo compreendem um gene que codifica uma proteína ADAM6 ou um ortólogo do mesmo ou um homólogo do mesmo ou um fragmento do mesmo que seja funcional no camundongo. Em uma modalidade específica, o camundongo È um camundongo macho.

[00102] Em uma modalidade, o genoma da cÈlula B compreende um primeiro alelo e um segundo alelo compreendendo a sequíncia de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo. Em uma modalidade, o genoma da cÈlula B compreende um primeiro alelo mas não um segundo alelo compreendendo a sequíncia de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo.

[00103] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que compreende uma modificação em um ou mais alelos da cadeia pesada da imunoglobulina endógena, em que a modificação mantÈm um ou mais alelos ADAM6 endógenos.

[00104] Em uma modalidade, a modificação torna o camundongo incapaz de expressar uma cadeia pesada funcional que compreende segmentos de gene da cadeia pesada rearranjada endógena de pelo menos um alelo de cadeia pesada e mantÈm um alelo de ADAM6 endógeno localizado dentro do pelo menos um alelo de cadeia pesada da imunoglobulina endógeno.

[00105] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma cadeia pesada funcional que compreende segmentos de gene da cadeia pesada rearranjada endógena de pelo menos um dos alelos da cadeia pesada da imunoglobulina endógena, e os camundongos expressam a proteína ADAM6 de um alelo de ADAM6 endógeno. Em uma modalidade específica, os camundongos são incapazes de expressar uma cadeia pesada funcional que compreende segmentos de gene da cadeia pesada rearranjada endógena de dois alelos da cadeia pesada da imunoglobulina endógena, e os camundongos expressam uma proteína ADAM6 de um ou mais alelos ADAM6 endógenos.

[00106] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma cadeia pesada funcional de cada alelo da cadeia pesada endógeno, e os camundongos compreendem um alelo de ADAM6 funcional localizado dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ou 120 ou mais Mbp a montante (em relação à direção de transcrição do local de cadeia pesada do camundongo) de uma sequíncia da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade específica, o alelo de ADAM6 funcional está no local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno (por exemplo, em uma região V-D intergínica, entre dois segmentos de gene V, entre um segmento de gene V e um D, entre um segmento de gene D e um J, etc.). Em uma modalidade específica, o alelo de ADAM6 funcional esta localizado dentro de uma sequíncia intergínica de 90 a 100 kb entre o segmento de gene V final do camundongo e o primeiro segmento de gene D do camundongo.

[00107] Em um aspecto, um camundongo È fornecido que compreende uma modificação em um ou mais alelos ADAM6 endógenos.

[00108] Em uma modalidade, a modificação torna o camundongo incapaz de expressar uma proteína ADAM6 funcional de pelo menos um do um ou mais alelos ADAM6 endógenos. Em uma modalidade específica, o camundongo È incapaz de expressar uma proteína ADAM6 funcional de cada um dos alelos ADAM6 endógenos.

[00109] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma proteína ADAM6 funcional de cada alelo de ADAM6 endógeno, e os camundongos compreendem uma sequíncia de ADAM6 ectópica.

[00110] Em uma modalidade, os camundongos são incapazes de expressar uma proteína ADAM6 funcional de cada alelo de ADAM6 endógeno, e os camundongos compreendem uma sequíncia de ADAM6 ectópica localizada dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ou 120 ou mais kb a montante (em relação à direção de transcrição do local de cadeia pesada do camundongo) de uma sequíncia da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequíncia de ADAM6 ectópica está no local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno (por exemplo, em uma região V- D intergínica, entre dois segmentos de gene V, entre um segmento de gene V e um D, entre um segmento de gene D e um J, etc.). Em uma modalidade específica, a sequíncia de ADAM6 ectópica está localizada dentro uma sequíncia intergínica de 90 a 100 kb entre o segmento de gene V final do camundongo e o primeiro segmento de gene D do camundongo. Em uma outra modalidade específica, a sequíncia intergínica V-D de 90 a 100 kb endógena È removida, e a sequíncia de ADAM6 ectópica È colocada entre um único segmento de gene V humano e um primeiro segmento de gene D humano. Em uma outra modalidade específica, a sequíncia intergínica V-D de 90 a 100 kb endógena È removida, e a sequíncia de ADAM6 ectópica È colocada 5’ ou a montante do único segmento de gene V humano.

[00111] Em um aspecto, um camundongo macho infértil È fornecido, em que o camundongo compreende uma deleção de dois ou mais alelos ADAM6 endógenos. Em um aspecto, um camundongo fímea È fornecido que È um carregador de um traÁo de infertilidade do macho, em que o camundongo fímea compreende na sua linha germinativa um alelo de ADAM6 não funcional ou um silenciamento de um alelo de ADAM6 endógeno.

[00112] Em um aspecto, um camundongo compreendendo um segmento de gene V, D, e ou J da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno que È incapaz de rearranjar para codificar uma cadeia pesada de um anticorpo È fornecida, em que a maioria das cÈlulas B do camundongo compreendem um gene ADAM6 funcional.

[00113] Em uma modalidade, o camundongo compreende um dos segmentos de gene V, D, e J da cadeia pesada da imunoglobulina endógenos intactos que são incapazes de rearranjar para codificar uma cadeia pesada funcional de um anticorpo. Em uma modalidade, o camundongo compreende pelo menos um e atÈ 89 segmentos de gene V, pelo menos um e atÈ 13 segmentos de gene D, pelo menos um e atÈ quatro segmentos de gene J, e uma combinação dos mesmos; em que o pelo menos um e atÈ 89 segmentos de gene V, pelo menos um e atÈ 13 segmentos de gene D, pelo menos um e atÈ quatro segmentos de gene J são incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um gene ADAM6 funcional localizado dentro dos segmentos de gene V, D, e J da cadeia pesada da imunoglobulina endógenos intactos. Em uma modalidade, o camundongo compreende um local da cadeia pesada endógeno que inclui um local ADAM6 endógeno, em que o local da cadeia pesada endógeno compreende 89 segmentos de gene V, 13 segmentos de gene D, e quatro segmentos de gene J, em que os segmentos de gene da cadeia pesada endógena são incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo e o local ADAM6 codifica uma proteína ADAM6 que seja funcional no camundongo.

[00114] Em um aspecto, um camundongo que carece de um segmento de gene V, D, e J da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno È fornecido, em que uma maioria das cÈlulas B do camundongo compreendem uma sequíncia de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo.

[00115] Em uma modalidade, o camundongo carece de segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena selecionada de dois ou mais segmentos de gene V, dois ou mais segmentos de gene D, dois ou mais segmentos de gene J, e uma combinação do mesmo. Em uma modalidade, o camundongo carece dos segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina selecionados de pelo menos um e atÈ 89 segmentos de gene V, pelo menos um e atÈ 13 segmentos de gene D, pelo menos um e atÈ quatro segmentos de gene J, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo carece de um fragmento genômico de DNA do cromossoma 12 compreendendo cerca de trís megabases do local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno. Em uma modalidade específica, o camundongo carece de todos os segmentos de gene V, D, e J da cadeia pesada funcional endógeno. Em uma modalidade específica, o camundongo carece dos 89 segmentos de gene VH, 13 segmentos de gene DH e quatro segmentos de gene JH.

[00116] Em um aspecto, um camundongo È fornecido, em que o camundongo tem um genoma na linha germinativa compreendendo uma modificação de um local da cadeia pesada da imunoglobulina, em que a modificação para o local da cadeia pesada da imunoglobulina compreende a substituição de uma ou mais sequíncias da região variável da imunoglobulina de camundongo com uma das sequíncias da região variável da imunoglobulina que não de camundongo, e em que o camundongo compreende uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade preferida, as sequíncias DH e JH e pelo menos 3, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 40, pelo menos 60, ou pelo menos 80 sequÍncias VH do local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno são substituídos pelas sequíncias de cadeia pesada da imunoglobulina que não de camundongo. Em uma outra modalidade preferida, as sequíncias DH, JH, e todas as VH do local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno são substituídas por um uníco segmento de gene V da imunoglobulina que não de camundongo, uma ou mais sequíncias de segmento de gene D, e uma ou mais de segmento de gene J. As sequíncias de imunoglobulina que não de camundongo podem ser não rearranjadas. Em uma modalidade preferida, a sequíncia de imunoglobulina que não de camundongos compreende regiles DH e JH não rearranjadas completas e uma única sequíncia VH não rearranjada da espÈcie que não de camundongo. Em uma outra modalidade preferida, as sequíncias de imunoglobulina que não de camundongo são capazes de formar uma região variável completa, isto È, uma região variável rearranjada contendo segmentos VH, DH, e JH unidos entre si para formar uma sequíncia que codifica uma região variável de cadeia pesada, da espÈcie que não de camundongo. A espÈcie que não de camundongo pode ser Homo aipnene eassequêncíad de iiinnioglobulinq ceie não de camundongo podem ser sequíncias humanas.

[00117] Em um aspecto, um local da cadeia pesada da imunoglobulina È fornecido que compreende um íiiiíoo segmento V liuninoo fancooiaal. Imi uma modalidade, o único segmento V Immuno ftmco^mll é seSectonado die um segmento VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3- 72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4- 31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, e um VH7- 81. Em uma modalidade, o nncoo sgmmnnto V Uumaoo UnncOonal é um segmento VH1-69; sm uma modalidade específica, o Omco sggmniiOo V humano funcional está presente em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou 13 formas polimÈricas encontradas na população humana. Em uma modalidade, o nina) sggmnnOo V hmanno foncOonal é mm eemnntito VHÍ-2; em uma modalidade específica, o úmoo eegmnnoo V luminno umcõonal está [resenule em 1, 2, 3, 4, ou 5 formas polimÈricas encontradas na população humana.

[00118] Em uma modalidade, o local da cadeia pesada da imunoglobulina È um local modificado de um animal não humano. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano modificado está presente no animal não humano em uma posição no genoma em que o local não humano não modificado correspondente È encontrado no animal não humano do tipo selvagem. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano modificado esta presente em um transgene em um animal não humano.

[00119] Em uma modalidade, o nnco eegmnsOo de enne V Ugmaco funcional È um segmento de gene VH1-69. Em uma modalidade, o segmento de gene VH1-69 compreende a SEQ ID NO: 37. Em uma modalidade, o segmento de gene VH1-69 È derivado da SEQ ID NO: 37. Em uma modalidade, o segmento de gene VH1-69 È pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idíntico à SEQ ID NO: 37.

[00120] Em uma modalidade, o nnco eegmnsOo ee eniee V Ugmaco funcional È codificado pela sequíncia de nucleotídeo da SEQ ID NO: 37.

[00121] Em uma modalidade, o nnco segmnnlo ee eniee V Ugmaco funcional È um segmento de gene VH1-2. Em uma modalidade, o segmento de gene VH1-2 compreende a SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade, o segmento de gene VH1-2 È derivado da SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade, o segmento de gene VH1-2 È de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idíntico à SEQ ID NO: 63.

[00122] Em uma modalidade, o unico sggmento de gene V Uumano funcional È codificado por uma sequíncia de nucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 63.

[00123] Em uma modalidade, o único segmento V humano funcional é operavelmente ligado a um ou mais segmentos D e um ou mais segmentos J, ou um ou mais segmentos J. Em uma modalidade, o segmento V e um ou mais segmentos D e/ou J são operavelmente ligados a uma sequíncia da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade a sequíncia da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina È selecionada de uma sequíncia CH1, uma dobradiÁa, uma CH2, uma CH3 e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, a CH1, dobradiÁa, CH2, CH3, ou combinação das mesmas são cada uma sequíncias não constantes endógenas humanas. Em uma modalidade, pelo menos uma da CH1, dobradiÁa, CH2, CH3, ou combinação das mesmas È uma sequíncia humana. Em uma modalidade específica, a CH1 e/ou dobradiÁa são sequíncias humanas.

[00124] Em um aspecto, um local da cadeia pesada da imunoglobulina modificado endógeno não humano È fornecido, compreendendo uma substituição de todos os segmentos V funcionais com um único eegmento V humano, em que o local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano È incapaz de rearranjar para formar um gene variável da cadeia pesada que seja derivado de um segmento V outro que não o úmco s>c'gmK.nio) V humano.

[00125] Em uma modalidade, o úmoo legnlento V humano é VHÍ-69. Em uma modalidade, o úmco segn'ienoo V humano é VH1-2.

[00126] Em uma modalidade, o local compreende pelo menos um segmento DH humano ou não humano, e um segmento JH humano ou não humano. Em uma modalidade específica, o local compreende um segmento DH humano e um segmento JH humano. Em uma modalidade específica, o local compreende um segmento JH humano. Em uma outra modalidade específica, o local compreende um VH1-69 humano, todos os segmentos DH humanos funcionais, e todos os segmentos JH humanos funcionais. Em uma modalidade, os segmentos V, D, e J humanos (ou segmentos V e J) são operavelmente ligados a um gene da região constante de camundongo em um local da cadeia pesada de camundongo endógeno. Em uma modalidade específica, o local de cadeia pesada do camundongo compreende um repertório do tipo selvagem das sequíncias da região constante da imunoglobulina de camundongo.

[00127] Em um aspecto, um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, em que o único segmento de gene V da cadeia pesada da imunoglobulina funcional do animal não humano È selecionado de um segmento de VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1- 58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3- 15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3- 72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4- 31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, e um VH7-81 humano. Em uma modalidade, o segmento de gene V da cadeia pesada È um segmento de gene VH1-69 humano. Em uma modalidade, o segmento de gene V da cadeia pesada È um segmento de gene VH1-2 humano.

[00128] Em um aspecto, um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, em que o animal não humano compreende um imo segmento VH humano funcional, e em que o animal não humano È substancialmente incapaz de formar um gene do domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina rearranjado que carece do uuíco segmento VH humano funcional.

[00129] Em um aspecto, um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, em que a úmca eggião variável de ca(eem peaada da imunoglobulina expressada no animal não humano È derivada de um segmento humano selecionado de um segmento de gene de VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, e um VH7-81 humano. Em uma modalidade, o segmento humano È um segmento VH1-69. Em uma modalidade, o segmento humano È um segmento VH1-2. Em uma modalidade, a úniaa região vrriavcl de cadeia pesada da iiiunioglobulina expressada pelo camundongo È derivada de um único membro da aamiHa do segmento V. e em uma modalidade a única região vaiiavel de cadeia peaada da mumogool^uin^a È derivada de uma variante polimórfica do nmoo rnemboo da famíHa oo segmento V.

[00130] Em um aspecto, um animal não humano compreendendo um repertório restrito de segmento de gene V da cadeia pesada da imunoglobulina È fornecido, em que o animal não humano compreende ainda um ou mais segmentos variáveis da cadeia leve K da imuooglbbulina luimnoo(V\'i<). lan uma modalidade, o um ou mais segmentos VK ãOo opervvelmnnte iigados a um ou mais segmentos J humanos. Em uma modalidade específica, os segmentos J são segmentos JK Inmanos. Em mma oufra modalidade específica, o animal não humano não expressa uma cadeia leve d da imunoglobulina X. mi mma ouara madalidane espefirica. o animal nào humano não compreende um local variável da cadeia leve a da imunoglobulina U fancladal Uamaão uu fontinaa! aaógnaão.

[00131] Em uma modalidade, o animal nno humano È um camundongo.

[00132] Em uma modalidade, o animal nno humano compreende uma substituição no local VK da imunogoobuiina noo luimniio niidognno de todos ou substancialmente todos os segmentos VK ftincOonaSs endogenos com um ou mais segmentos VK humanos ftmcionais. Em uma outra inodaliclucle específica, a substituÍção È com todos ou substancialmente todos os segmentos VK da imunogoobuima hiumanos ftmcionais.

[00133] Em uma modalidade, o animal não humano compreende uma substituição no local JK cti imunoglobiilína nào hiumano endógeno de todos ou substancialmente todos os segmentos JK da imunoolobuima fimoíonal endógeno não humano com um ou mais segmentos JK imnnggoouulina funcional humano. Em uma outra modalidade específica, a substituição È com todos ou substancialmente todos os segmentos JK da imunooOobuima funcionais humanos.

[00134] Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende um local da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende um repertório dos segmentos V consistindo essencialmente de um nnico semeento V c/ou variante poliiiioríicas do mnemno. Emm mna modalidade, o umoo segman/o V da addaa [tevada da imunoglobulina é um segmento VH1-69 humano, e o animal não humano compreende ainda uma substituição de todos os segmentos DH funcionais não humanos com todos os segmentos DH funcionais humanos, e compreende ainda uma substituição de todos os segmentos JH funcionais não humanos com todos os segmentos JH funcionais humanos, e em que o local da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina È operavelmente ligado a uma sequíncia de gene da região constante humana ou não humana. Em uma modalidade específica, a sequíncia de gene da região constante È uma sequíncia de gene da região constante endógena não humana. Em uma modalidade específica, o animal não humano rearraaja segmentos no local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano para formar um gene que codifica a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequíncia VH1-69 humana, uma sequíncia DH humana, uma sequíncia JH humana, e uma sequíncia da região constante de camundongo.

[00135] Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende um local da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende um repertório dos segmentos V que consiste essencialmente de um umoo segmento V e/ou aariantes polimórficas do mesmo. Imi uma modalidade, o úmoo segmen/o V da addiãa psadda da imuuoglobulma é um segmento VH1-2 humano, e o animal não humano compreende ainda uma substituição de todos os segmentos DH funcionais não humanos com todos os segmentos DH funcionais humanos, e compreende ainda uma substituição de todos os segmentos JH funcionais não humanos com todos os segmentos JH funcionais humanos, e em que o local da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina È operavelmente ligado a uma sequíncia de gene da região constante humana ou não humana. Em uma modalidade específica, a sequíncia de gene da região constante È uma sequíncia de gene da região constante endógena não humana. Em uma modalidade específica, o animal não humano rearranja segmentos no local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano para formar um gene que codifica a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequíncia VH1-2 humana, uma sequíncia DH humana, uma sequíncia JH humana, e uma sequíncia da região constante de camundongo.

[00136] Em uma modalidade, uma cÈlula B È fornecida que compreende o gene rearranjado. Em uma modalidade específica, a cÈlula B È de um camundongo como descrito que foi imunizado com um antígeno de interesse, e a cÈlula B codifica um anticorpo que especificamente liga o antígeno de interesse. Em uma modalidade, o antígeno de interesse È um patógeno. Em uma modalidade específica, o patógeno È selecionado de um vírus da influenza, um vírus da hepatite (por exemplo, vírus da hepatite B ou hepatite C), e um vírus da imunodeficiíncia humana. Em uma modalidade específica, a cÈlula B codifica um anticorpo somaticamente mutado, de alta afinidade (por exemplo, de cerca de 10-9 KD ou mais baixo) compreendendo uma região variável de cadeia leve humana (por exemplo, uma região variável da cadeia leve K Ummnn)) ueeepeccifiamnnnte liaa o antíenno eemteeesse.

[00137] Em um aspecto, um animal não humano compreendendo um repertório de segmento V da cadeia pesada da imunoglobulina restrito È fornecido, em que o animal não humano compreende um ou mais segmentos variáveis da cadeia leve À((\'Z) limrnanaE mn maia modalidade, o um ou mais segmentos VÀ humanos são (pKeaveimKaik.' ligados a um ou mias segmentos J humanos. Em uma modalidade sspecifica, os sa^menHos J soo eígmantos Àk humanos. Em uma outra modalidade específica, o animal não humano não expressa uma cadeia leve K. Imi uma outrn modahdade pspeoífica, o animal não humano não compreende um local variável da addem! lave K humano ou não humano funcional.

[00138] Em uma modalidade, o animal não humano compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de VÀ aa imunoglobulina nso humanos funcionais com um ou mais segmentos de VÀ da imunoglobulina humanos funcionais. Em uma outra modalidade específica, a substituição é com todos ou substancialmente todos os segmentos de VÀ chi imunoglobulina humanos funcionais.

[00139] Em uma modalidade, o animal não humano compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de JÀ da imunoglobulina nso humanos fUncionais com um ou mais segmentos de JÀ da imunoglobulina humanos funcionais. Em uma outra modalidade específica, a substituição é com todos ou substancialmente todos os segmentos de JÀ da imunoglobulina humanos funcionais.

[00140] Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende um local da região variável da cadeia pesada (VH) da imunoglobulina que compreende apenas um úmoo eegmenoo VH, em que o único segmento VH È um segmento VH1-69 humano ou um segmento VH1-2 humano, e compreende ainda uma substituÍção de todos os segmentos DH não humanos funcionais com todos os segmentos DH humanos funcionais, e compreende ainda uma substituição de todos os segmentos JH não humanos funcionais com todos os segmentos JH humanos funcionais, e em que o local da região VH È operavelmente ligado a uma sequÍncia de gene da região constante humana ou não humana. Em uma modalidade específica, a sequíncia de gene da região constante È uma sequíncia de gene da região constante não humana, por exemplo, uma sequíncia de gene constante endógena não humana. Em uma modalidade específica, o animal não humano rearranja segmentos no local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano para formar um gene que codifica uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo uma sequíncia VH1-69 humana (ou uma sequíncia VH1-2 humana), uma sequíncia DH humana, uma sequíncia JH humana, e uma sequíncia da região constante não humana endógena.

[00141] Em uma modalidade, uma cÈlula B È fornecida que compreende o gene rearranjado. Em uma modalidade específica, a cÈlula B È de um animal não humano como descrito que foi imunizado com um antígeno de interesse, e a cÈlula B codifica um anticorpo que especificamente liga o antígeno de interesse. Em uma modalidade, o antígeno È uma proteína humana selecionada de um ligando, um receptor da superfície da cÈlula e uma proteína intracelular. Em uma modalidade, o antígeno de interesse È um patógeno. Em uma modalidade específica, o patógeno È selecionado de um vírus da influenza, um vírus da hepatite (por exemplo, vírus da hepatite B ou hepatite C), e um vírus da imunodeficiíncia humana. Em uma modalidade específica, a cÈlula B codifica um anticorpo somaticamente mutado, de alta afinidade (por exemplo, de cerca de 10-9 KD ou mais baixo) compreendendo uma região variável da cadeia leve humana (por exemplo, uma região variável da cadeia leve h Ummana) ueeepeccifiamennte giaa o antíenoo eemteeesse.

[00142] Em um aspecto, um animal não humano compreendendo um repertório de segmento V da cadeia pesada da imunoglobulina restrito È fornecido, em que o animal não humano compreende um segmento VH1-69 humano (ou um segmento VH1-2 humano) em um transgene, em que o segmento VH1-69 humano È operavelmente ligado no transgene a um segmento DH humano ou não humano, e/ou um segmento J humano ou não humano, e o transgene compreende ainda um gene da região constante humano ou não humano, ou uma região constante humana/não humana quimÈrica (por exemplo, uma CH1, dobradiÁa, CH2, CH3 ou combinação das mesmas em que pelo menos uma sequíncia È não humana, por exemplo, selecionada de dobradiÁa, CH2, e CH3 e/ou dobradiÁa). Em uma modalidade, o animal não humano È um camundongo ou rato e o gene da região constante D, J, e/ou não humano È um gene de camundongo ou rato ou quimÈrica de ser humano/camundongo ou rato.

[00143] Em uma modalidade, o animal não humano compreende um transgene que compreende um local da região variável da cadeia leve da imunoglobulina que compreende um ou mais segmentos VU e segmnnOos ÀÀ. da imunoglobulina humana, ou um ou mais segmentos VK e segmentos JK da imunoglobulina humana, e um gene da região constante da cadeia leve KOU À da imunoglobulina humana, tal que o transgene rearranja no animal não humano para formar um gene da cadeia leve o UU/. mu imunogloaulina rearranjado.

[00144] Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende um transgene tendo um local variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende um único segmento V que é um segmento VH1-69 humano (ou um segmento VH1-2 humano), um ou mais segmentos D humanos, um ou mais segmentos J humanos, e um gene constante humano operavelmente ligados ao local variável da cadeia pesada, tal que o camundongo expressa a partir do transgene um anticorpo totalmente humano derivado do segmento VH1-69 (ou do segmento VH1-2). Em uma modalidade, o animal não humano não compreende um local da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina funcional endógeno. Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende um local da região variável de cadeia pesada que não da imunoglobulina funcional endógeno que compreende uma deleção de um segmento DH endógeno não humano e/ou JH endógeno não humano, tal que o animal não humano seja incapaz de rearranjar a local da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina endógeno para formar um gene de anticorpo não humano rearranjado. Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende uma deleção de uma sequíncia de comutação operavelmente ligada a uma região constante da cadeia pesada de camundongo endógena. Em uma modalidade específica, a sequíncia comutadora È uma sequíncia comutadora µ não humana (por exemplo, de camundongo). Em uma outra modalidade, o animal não humano compreende ainda uma falta de um local variável da cadeia leve funcional endógeno selecionado de um local d dim imogoobobuline u um Cacal À. da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende oma deleção de oma sequência JK e/ou uma JÀ, ial que o animal não humano seja incapaz de rearranjar oma região variável da cadeia leve K da imunoglobulina endógena não humana e/oo oma cadeia leve da da imunoglobulina endógena não homana para formar om gene da cadeia leve K da imunoglobulina não humana endógena rearranjada e/ou um da cadeia leve J da ^^^^^1^ li ào human a endógena rearnnijada.

[00145] Em uma modalidade, o animal não humano compreende uma deleção de oma sequência de cadeia leve K da imnãoglbbufinaeddggena não homana qoe resulta em om silenciamento funcional da cadeia leve d da imunoglobulina endógena não humana. Em uma modalidade, o animal não humano compreende oma deleção de oma sequência de cadeia leve d da imunoglobulina endógena não humana que resulta em um silenciamento funcional da cadeia leve d daimnãgg/bUulina eddggenanoo Omnana.

[00146] Em um aspecto, um roedor È fornecido que compreende um repertório da cadeia pesada da imunoglobulina variável derivada de não mais do que um segmento VH humano ou um ou mais polimorfos do mesmo, de um segmento D selecionado de um repertório de um ou mais segmentos D, e de um segmento J selecionado de um repertório de um ou mais segmentos J; em que o roedor compreende uma sequíncia de ADAM6 ectópica ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um roedor macho.

[00147] Em uma modalidade, o segmento VH humano está presente em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais variantes polimórficas, em que cada variante polimórfica esta operavelmente ligada a um segmento D e/ou J tal que cada variante polimórfica È capaz de rearranjar e formar um domínio variável da cadeia pesada rearranjado com qualquer um de um ou mais segmentos D e qualquer um de um ou mais segmentos J. Em uma modalidade, o roedor È um camundongo ou um rato. Em uma modalidade, o repertório de segmentos D compreende dois ou mais segmentos D. Em uma modalidade, o repertório de segmentos J compreende dois ou mais segmentos J. Em uma modalidade, os segmentos D e/ou J são segmentos humanos. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 ectópica È uma sequíncia de ADAM6 de um roedor do tipo selvagem da mesma espÈcie. Em uma modalidade, o roedor È um camundongo ou um rato. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 ectópica ou ortólogo ou homólogo ou fragmento da mesma que seja funcional no roedor macho está no mesmo cromossoma como o repertório variável da cadeia pesada da imunoglobulina modificada; em uma modalidade, o mesmo está em um cromossoma diferente.

[00148] Em um aspecto, uma construção de nucleotídeo È fornecida que compreende uma sequíncia que codifica um único segmento da cadeia pesada VH da imunoglobulina humana e/ou variantes polimórficas do mesmo e uma ou mais sequíncias DH e uma ou mais J, em que a construção compreende pelo menos um ramo de homologia homólogo a um local variável da cadeia pesada da imunoglobulina não humano, ou um sítio de reconhecimento da recombinase (por exemplo, um sítio lox). Em uma modalidade, o segmento V È um segmento VH1-69 ou um segmento VH1-2.

[00149] Em um aspecto, uma construção de nucleotídeo È fornecida, compreendendo uma sequíncia de nucleotídeo que codifica um único segmento V da cadeia pesada da imunoglobulina humano, em que o único segmento VH È um segmento VH1-69 (ou VH1-2). Em uma modalidade, a construção compreende um sítio de reconhecimento da recombinase específica de sitio. Em uma modalidade, a construção compreende um primeiro ramo de homologia de camundongo a montante do segmento VH1-69 (ou VH1-2) e um segundo ramo de homologia de camundongo a jusante do segmento VH1-69 (ou VH1-2), e em que o primeiro ramo de homologia de camundongo È homólogo a uma região de um cromossoma de camundongo imediatamente a montante de uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo mas não incluindo um segmento variável da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo funcional. Em uma modalidade, a construção compreende a SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a construção compreende a SEQ ID NO: 74. Em uma modalidade, a construção compreende a SEQ ID NO: 75. Em uma modalidade, a construção compreende a SEQ ID NO: 76.

[00150] Em um aspecto, o segmento VH único restrito está em um animal não humano, ou o segmento VH restrito esta em um local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano (por exemplo, in siio ou em um transgene), e o animal não humano ou local da cadeia pesada da imunoglobulina não humano são selecionados de um local ou animal de camundongo, rato, coelho, porco, bovino (por exemplo, vaca, touro, búfalo), veado, ovelha, cabra, galinha, gato, c„o, tár„o, primata (por exemplo, sagui, macaco rhesus). Em uma modalidade específica, o animal ou local não humanos È um local de camundongo ou um de rato.

[00151] Em um aspecto, um vetor de alvejamento È fornecido, compreendendo (a) uma sequÍncia de nucleotídeo que È idíntica ou substancialmente idíntica a um segmento de sequíncia de gene de nucleotídeo da região variável humana; e, (b) uma sequíncia de nucleotídeo que codifica um ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo.

[00152] Em uma modalidade, o vetor de alvejamento compreende ainda um promotor operavelmente ligado à sequíncia que codifica o ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, o promotor È um promotor ADAM6 de camundongo.

[00153] Em um aspecto, uma construção de nucleotídeo para modificar um local variável de cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo È fornecida, em que a construção compreende pelo menos um sítio de reconhecimento da recombinase específica de sitio e uma sequíncia que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento da mesma que seja funcional em um camundongo.

[00154] Em um aspecto, uma construção de •cido nuclÈico È fornecida, compreendendo um ramo de homologia a montante e um ramo de homologia a jusante, em que o ramo de homologia a montante compreende uma sequíncia que È idíntica ou substancialmente idíntica a uma sequíncia da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana, o ramo de homologia a jusante compreende uma sequíncia que È idíntica ou substancialmente idíntica a uma sequíncia da região variável da imunoglobulina de ser humano ou camundongo, e disposto entre os ramos de homologia a montante e a jusante È uma sequíncia que compreende uma sequíncia de nucleotídeo que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequíncia que codifica o gene ADAM6 de camundongo È operavelmente ligada com um promotor de camundongo com que o ADAM6 de camundongo È ligado em um camundongo do tipo selvagem.

[00155] Em um aspecto, uma cÈlula isolada de um camundongo geneticamente modificado como aqui descrito È fornecida. Em uma modalidade, a cÈlula È um linfócito. Em uma modalidade, o linfócito È uma cÈlula B. Em uma modalidade específica, a cÈlula B compreende uma sequíncia de ADAM6 ectópica ou ortólogo ou homólogo ou sequíncia que codifica um fragmento funcional do mesmo, em que a cÈlula B expressa um domínio variável da cadeia pesada derivada de um segmento de gene VH humano.

[00156] Em um aspecto, uma cÈlula ou tecido são fornecidos, em que a cÈlula ou tecido são derivados de um animal não humano como aqui descrito, e compreendem um repertório de segmento VH restrito. Em uma modalidade, o repertório de segmento VH È restrito a um nmoo membro da lamílai de segmento VH e/ou variantes polimórficas do mesmo. Em uma modalidade específica, o umo) eemmento VH È um segmento VH1-69 humano ou um segmento VH1-2 humano. Em uma modalidade, a cÈlula ou tecido são derivados do baÁo, linfonodo ou medula óssea do animal não humano.

[00157] Em uma modalidade, a cÈlula È uma cÈlula ES. Em uma modalidade, a cÈlula È uma cÈlula B. Em uma modalidade, a cÈlula È uma cÈlula germinativa.

[00158] Em uma modalidade, o tecido È selecionado de tecido conectivo, muscular, nervoso e epitelial. Em uma modalidade específica, o tecido È o tecido reprodutivo.

[00159] Em uma modalidade, a cÈlula e/ou tecido derivados de um camundongo como aqui descrito são isolados para o uso em um ou mais ensaios ex vivo. Em •'ririas modalidades, o mm ou mais nuaMOS ex oivo incluem mediÁies de propriedades físicas, tÈrmicas, elÈtricas, mec,nicas ou ópticas, um procedimento cirúrgico, mediÁies de interaÁies de tipos de tecido diferentes, o desenvolvimento de tÈcnicas de formação de imagem, ou uma combinação dos mesmos.

[00160] Em uma modalidade, o animal não humano È um camundongo.

[00161] Em um aspecto, um embri„o não humano È fornecido compreendendo um segmento VH da cadeia pesada como aqui descrito. Em uma modalidade, o embri„o compreende uma cÈlula doadora ES que compreende o segmento VH restrito, e cÈlulas hospedeiras do embri„o.

[00162] Em uma modalidade, o animal não humano È um camundongo.

[00163] Em um aspecto, uma cÈlula não humana compreendendo um cromossoma ou fragmento do mesmo de um animal não humano como aqui descrito. Em uma modalidade, a cÈlula não humana compreende um núcleo de um animal não humano como aqui descrito. Em uma modalidade, a cÈlula não humana compreende o cromossoma ou fragmento do mesmo como o resultado de uma transferência nuclear.

[00164] Em um aspecto, um núcleo derivado de um animal não humano como aqui descrito È fornecido. Em uma modalidade, o núcleo È de uma cÈlula diploide que não È uma cÈlula B.

[00165] Em um aspecto, uma cÈlula pluripotente, pluripotente induzida, ou totipotente derivada de um animal não humano como aqui descrito È fornecida. Em uma modalidade específica, a cÈlula È uma cÈlula tronco embrionária (ES) de camundongo.

[00166] Em um aspecto, uma cÈlula pluripotente induzida não humana compreendendo um repertório de segmento VH restrito È fornecida. Em uma modalidade, a cÈlula pluripotente induzida È derivada de um animal não humano como aqui descrito.

[00167] Em um aspecto um hibridoma È fornecido, compreendendo uma sequíncia de um linfócito de um camundongo como aqui descrito. Em uma modalidade, o linfócito È uma cÈlula B.

[00168] Em um aspecto, um hibridoma ou quadroma são fornecidos, derivados de uma cÈlula de um animal não humano como aqui descrito. Em uma modalidade, o animal não humano È um camundongo ou rato.

[00169] Em um aspecto, cÈlulas de camundongo e embriles de camundongo são fornecidos, incluindo mas não limitados às cÈlulas ES, cÈlulas pluripotentes, e cÈlulas pluripotentes induzidas, que compreendem modificaÁies genÈticas como aqui descritas. As cÈlulas que são XX e as cÈlulas que são XY são fornecidas. As cÈlulas que compreendem um núcleo contendo uma modificação como aqui descrita tambÈm são fornecidas, por exemplo, uma modificação introduzida dentro de uma cÈlula pela injeção pronuclear. As cÈlulas, embriles, e camundongos que compreendem um gene ADAM6 viralmente introduzido tambÈm são fornecidos, por exemplo, cÈlulas, embriles, e camundongos compreendendo uma construção de transdução compreendendo um gene ADAM6 que seja funcional no camundongo.

[00170] Em um aspecto, uma cÈlula de camundongo geneticamente modificada È fornecida, em que a cÈlula È incapaz de expressar uma cadeia pesada compreendendo segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena rearranjados, e a cÈlula compreende um gene ADAM6 funcional que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional do mesmo. Em uma modalidade, a cÈlula compreende ainda uma inserç„o de segmentos de gene da imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene da imunoglobulina humana são segmentos de gene da cadeia pesada que são operavelmente ligados às regiles constantes da cadeia pesada de camundongo tal que no rearranjo codifiquem uma cadeia pesada funcional de um anticorpo que compreende uma região variável humana.

[00171] Em um aspecto, uma cÈlula de camundongo geneticamente modificada È fornecida; em que a cÈlula carece de um local de ADAM6 de camundongo endógeno funcional, e a cÈlula compreende uma sequíncia de nucleotídeo ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, a cÈlula compreende ainda uma modificação de uma sequÍncia de gene variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógena. Em uma modalidade específica, a modificação da sequíncia de gene variável da cadeia pesada da imunoglobulina endógena compreende uma deleção selecionada de uma deleção de um segmento de gene VH de camundongo, uma deleção de um segmento de gene DH de camundongo, uma deleção de um segmento de gene JH de camundongo, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma substituição de uma ou mais sequíncias VH, DH, e/ou JH da imunoglobulina de camundongo com uma sequíncia da imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, a sequíncia da imunoglobulina humana È selecionada de um VH humano, um VL humano, um humano DH, um JH humano, um JL humano, e uma combinação do mesmo.

[00172] Em uma modalidade, a cÈlula È uma cÈlula totipotente, uma cÈlula pluripotente, ou uma cÈlula pluripotente induzida. Em uma modalidade específica, a cÈlula È uma cÈlula ES de camundongo.

[00173] Em um aspecto, uma cÈlula B de camundongo È fornecida, em que a cÈlula B de camundongo compreende um gene da cadeia pesada da imunoglobulina rearranjada, em que a cÈlula B compreende em um cromossoma da cÈlula B uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a cÈlula B de camundongo compreende dois alelos da sequíncia de •cido nuclÈico.

[00174] Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico está em uma molÈcula de •cido nuclÈico (por exemplo, um cromossoma de cÈlula B) que seja contígua com o local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo rearranjado.

[00175] Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico está em uma molÈcula de •cido nuclÈico (por exemplo, um cromossoma de cÈlula B) que È distinta da molÈcula de •cido nuclÈico que compreende o local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo rearranjado.

[00176] Em uma modalidade, a cÈlula B de camundongo compreende uma sequíncia variável do gene da imunoglobulina que não de camundongo rearranjada operavelmente ligada a um gene da região constante da imunoglobulina de camundongo ou ser humano, em que a cÈlula B compreende uma sequíncia de ácido nuclÈico que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho.

[00177] Em uma modalidade, a sequíncia de ácido nuclÈico está em uma molÈcula de ácido nuclÈico (por exemplo, um cromossoma de cÈlula B) que está localizada no ou dentro do local de gene mais próximo em relação à sequíncia variável de gene da imunoglobulina não humana rearranjada.

[00178] Em uma modalidade, a sequíncia de ácido nuclÈico está em uma molÈcula de ácido nuclÈico (por exemplo, um cromossoma de cÈlula B) que È contíguo com a sequíncia da região variável da imunoglobulina não humana rearranjada.

[00179] Em um aspecto, uma cÈlula somática de camundongo È fornecida, compreendendo um cromossoma que compreende um local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado, e uma sequíncia de ácido nuclÈico que codifica um ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, a sequíncia de ácido nuclÈico está no mesmo cromossoma como o local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado. Em uma modalidade, o ácido nuclÈico está em um cromossoma diferente do que o local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado. Em uma modalidade, a cÈlula somática compreende uma cópia única cai sequência cie ácido nucléico. Em uma modalidade, a cÈlula somática compreende pelo menos duas cópias da sequíncia de ácido nuclÈico. Em uma modalidade específica, a cÈlula somática È uma cÈlula B. Em uma modalidade específica, a cÈlula È uma cÈlula germinativa. Em uma modalidade específica, a cÈlula È uma cÈlula tronco.

[00180] Em um aspecto, uma cÈlula germinativa de camundongo È fornecida, compreendendo uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica um ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) em um cromossoma da cÈlula germinativa, em que a sequíncia de •cido nuclÈico que codifica o ADAM6 de camundongo (ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional do mesmo) está em uma posição no cromossoma que È diferente de uma posição em um cromossoma de uma cÈlula germinativa de camundongo do tipo selvagem. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico está em um local da imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico esta no mesmo cromossoma da cÈlula germinativa como um local da imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, a sequíncia de ácido nuclÈico está em um cromossoma diferente da cÈlula germinativa do que o local da imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, o local da imunoglobulina de camundongo compreende uma substituição de pelo menos uma sequíncia da imunoglobulina de camundongo com pelo menos uma sequíncia de imunoglobulina que não de camundongo. Em uma modalidade específica, a pelo menos uma sequíncia de imunoglobulina que não de camundongo È uma sequíncia da imunoglobulina humana. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina humana È uma sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina.

[00181] Em um aspecto, uma sequíncia do domínio vartável de anticorpo fabricada em um animal não humano como aqui descrito È fornecida.

[00182] Em um aspecto, um produto terapíutico humano È fornecido, compreendendo um domínio vartável de anticorpo compreendendo uma sequíncia derivada de um animal não humano como aqui descrito.

[00183] Em um aspecto, um mÈtodo de obter uma sequÍncia da região variável de anticorpo de um animal não humano È fornecido, em que a sequíncia da região variável de anticorpo È derivada de um segmento VH1-69 humano ou um segmento VH1-2, em que o mÈtodo compreende (a) imunizar um animal não humano com um antígeno de interesse, em que o animal não humano compreende uma substituição no local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno de todos ou substancialmente todos os segmentos variáveis não humanos com um único segmento variável humano. em que o único segmento variável humano È um segmento VH1-69 ou um segmento VH1-2, e em que o animal não humano È substancialmente incapaz de formar uma sequíncia da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina que não È derivada de um segmento VH1-69 humano ou um segmento VH1-2; (b) permitir que o animal não humano monte uma resposta imune em relação ao antígeno de interesse; e, (c) identificar ou isolar uma sequíncia da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina do animal não humano, em que o anticorpo liga o antígeno de interesse.

[00184] Em uma modalidade, o úmeo segmento vanavel humano é um segmento VH1-69.

[00185] Em uma modalidade, a sequíncia da região variável de anticorpo È derivada da SEQ ID NO: 37. Em uma modalidade, a sequíncia da região variável de anticorpo È pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idíntica à SEQ ID NO: 37. Em uma modalidade, a sequíncia da região variável de anticorpo compreende a SEQ ID NO: 37.

[00186] Em uma modalidade o úmeo e^^s^me^^nto vanavel humano é um segmento VH1-2.

[00187] Em uma modalidade, a sequíncia da região variável de anticorpo È derivada da SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade, a sequíncia da região variável de anticorpo È pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idíntica à SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade, a sequíncia da região variável de anticorpo compreende a SEQ ID NO: 63.

[00188] Em um aspecto, um mÈtodo para gerar um repertório das regiles variáveis de anticorpo humano em um animal não humano È fornecido, em que as regiles variáveis da cadeia pesada humana do repertório são derivadas do mesmo membro da família de gene VH e um de uma pluralidade de segmentos DH e um de uma pluralidade de segmentos JH, em que o repertório È caracterizado por ter sequíncias da cadeia pesada da imunoglobulina FR1 (armação 1), CDR1, FR2, CDR2, e FR3 de um único membro da família de gene VH. Em uma modalidade, o repertório È caracterizado ainda por ter uma pluralidade de sequíncias CDR3 + FR4 diferentes.

[00189] Em uma modalidade, a família de gene VH único È selecionada da família de VH 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7. Em uma modalidade específica, a família de gene Vh úmco é a úmiílai VH 1. Em uma modalidade, o membro da família de gene VH único È selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, e VH3- 23. Em uma modalidade específica, o membro da família VH de gene úmco é VH1-69.

[00190] Em uma modalidade, o repertório compreende as sequíncias FR1, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 da cadeia pesada derivadas de um segmento VH1-69. Em uma modalidade específica, o repertório compreende as sequíncias FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 da cadeia pesada derivadas da SEQ ID NO: 38. Em uma modalidade específica, o repertório compreende as sequíncias FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 38.

[00191] Em uma modalidade, o repertório compreende as sequíncias FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 da cadeia pesada derivada de um segmento VH1-2. Em uma modalidade específica, o repertório compreende as sequíncias FR1, CDR1, FR2, CDR2 e FR3 da cadeia pesada derivada da SEQ ID NO: 64. Em uma modalidade específica, o repertório compreende as sequíncias FR1, CDR1, FR2, CDR2 e FR3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 64.

[00192] Em um aspecto, um mÈtodo para gerar uma pluralidade de sequíncias de CDR3 e FR4 diferentes em um animal não humano È fornecido, compreendendo expor um animal não humano que compreende um local de gene variável da cadeia pesada da imunoglobulina com um repertório de segmento VH restrito a um membro da família de segmento VH único a um antígeno de interesse, permitindo que o animal não humano desenvolva uma resposta imune ao antígeno, em que a resposta imune gera um repertório de cÈlula B cujos domínios variáveis de cadeia pesada são cada um derivados do membro da família de segmento VH único e que compreende uma pluralidade de sequíncias CDR3 e FR4 diferente.

[00193] Em uma modalidade, o membro da família de segmento VH único È humano. Em uma modalidade, o animal não humano È selecionado de um camundongo, um rato, e um coelho. Em uma modalidade, o antígeno de interesse È selecionado de um ligando, um receptor, uma proteína intracelular e uma proteína secretada. Em uma modalidade, o antígeno de interesse È um patógeno humano.

[00194] Em um aspecto, uma sequíncia de nucleotídeo que codifica uma região variável da imunoglobulina fabricada em um animal não humano como aqui descrito È fornecida.

[00195] Em um aspecto, uma cadeia pesada da imunoglobulina ou sequíncia de aminoaciclo da região variável da cadeia leve da imunoglobulina de um anticorpo fabricado em um animal não humano como aqui descrito È fornecida.

[00196] Em um aspecto, uma cadeia pesada da imunoglobulina ou sequíncia de nucleotídeo da região variável da cadeia leve da imunoglobulina que codifica uma região variável de um anticorpo fabricado em um não humano como aqui descrito È fornecida.

[00197] Em um aspecto, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo (por exemplo, Fab, F(ab)2, scFv) fabricado em um animal não humano como aqui descrito È fornecido.

[00198] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, compreendendo substituir um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina a montante (em relação à transcrição de segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina) de um local ADAM6 endógeno do animal não humano com um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina humanos, e substituir um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina a jusante (em relação à transcrição dos segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina) do local de ADAM6 do animal não humano com um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada ou cadeia leve da imunoglobulina humanos. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana que substituem um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina endógenos a montante de um local de ADAM6 endógeno do animal não humano incluem segmentos de gene V. Em uma modalidade, os segmentos de gene da imunoglobulina humana que substituem um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina endógenos a montante de um local ADAM6 endógeno do animal não humano incluem segmentos de gene V e D. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana que substituem um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina endógena a jusante de um local ADAM6 endógeno do animal não humano incluem segmentos de gene J. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana que substituem um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina endógena a jusante de um local ADAM6 endógeno do animal não humano incluem segmentos de gene D e J. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina humana que substituem um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina endógenos a jusante de um local ADAM6 endógeno do animal não humano incluem segmentos de gene V, D e J. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene que substituem um ou mais segmentos de gene da imunoglobulina endógenos a jusante de um local ADAM6 endógeno do animal não humano incluem um único segmento de gene V/, um ou mais segmentos de gene D e um ou mais segmentos de gene J.

[00199] Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina a montante e/ou a jusante do gene ADAM6 são substituídos em uma cÈlula pluripotente, pluripotente induzida, ou totipotente para formar uma cÈlula progenitora geneticamente modificada; a cÈlula progenitora geneticamente modificada È introduzida dentro de um hospedeiro; e, o hospedeiro compreendendo a cÈlula progenitora geneticamente modificada È gestada para formar um animal não humano compreendendo um genoma derivado da cÈlula progenitora geneticamente modificada. Em uma modalidade, o hospedeiro È um embri„o. Em uma modalidade específica, o hospedeiro È selecionado de uma prÈ-mórula de camundongo (por exemplo, estágio de 8 ou 4 cÈlulas), um embri„o tetraploide, um agregado de cÈlulas embrionárias, ou uma btástula.

[00200] Em um aspecto, um animal não humano È fornecido, em que o animal não humano tem um repertório de cÈlula B que expressa domínios vartáveis de cadeia pesada da imunoglobulina derivada de um único membro da família do segmento V. Em uma modalidade, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90, ou pelo menos 95% do repertório de cÈlula B do domínio vartável da cadeia pesada da imunoglobulina do animal não humano expressado no repertório de cÈlula B são derivados do mesmo membro da família do segmento V. Em uma modalidade específica, a porcentagem È de pelo menos 90%. Em uma modalidade, o repertório da cÈlula B consiste essencialmente de cÈlulas B perifÈricas (sangue). Em uma modalidade, o repertório da cÈlula B consiste essencialmente de cÈlulas B esplínicas. Em uma modalidade, o repertório da cÈlula B consiste essencialmente de cÈlulas B da medula óssea. Em uma modalidade, o repertório da cÈlula B consiste essencialmente de cÈlulas B perifÈricas, cÈlulas B esplínicas, e cÈlulas B da medula óssea.

[00201] Em um aspecto, um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, em que mais do que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou mais do que 90% das cÈlulas B do animal não humano que expressam um domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina expressam um domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina derivada de um único membro da familia de segmento de gene VH. Em uma modalidade, pelo menos 75% das cÈlulas B do animal não humano que expressam um domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina expressam um domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina derivada do únioo membro da íamília de gegmenro de gnne VH. Em uma modalidade específica, a porcentagem È de pelo menos 90%. Em uma modalidade, todas as cÈlulas B que expressam um domínio de cadeia pesada que seja derivado do úmco membro da amíba de gene VH.

[00202] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado È fornecido que fabrica uma população de cÈlula B específica de antígeno em resposta à imunização com um antígeno de interesse, em que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou mais do que 90%, da dita população de cÈlula B específica de antígeno expressa cadeias pesadas da imunoglobulina que são todas derivadas do mesmo segmento de gene VH. Em uma modalidade, pelo menos 75% da população de cÈlula B específica de antígeno expressam cadeias pesadas da imunoglobulina derivadas do mesmo segmento de gene VH. Em uma modalidade, todas as cÈlulas B específicas de antígeno expressam uma cadeia pesada que È derivada do mesmo segmento de gene VH.

[00203] Em um aspecto, um animal não humano compreendendo um repertório de segmento de gene VH restrito È fornecido, em que a restrição È para um segmento de gene VH1-69 humano ou um segmento de gene VH1-69 que È pelo menos cerca de 75,5%, 76,5%, 86,7%, 87,8%, 94,9%, 96,9%, 98%, ou 99% idíntico a um segmento de gene VH1-69*01. Em uma modalidade específica, o repertório restrito È selecionado de uma ou mais das variantes VH1-69daFIG. 7.

[00204] Em um aspecto, um animal não humano compreendendo um repertório de segmento de gene VH restrito È fornecido, em que a restrição È para um segmento de gene VH1-2 humano ou um segmento de gene VH1-2 que È pelo menos cerca de 94,9%, 95,9%, 96,9%, 98%, ou 99% idíntico a um segmento de gene VH1-2. Em uma modalidade específica, o repertório restrito È selecionado de uma ou mais das variantes VH1-2 da FIG. 10.

[00205] Em uma modalidade, o animal não humano È um camundongo.

[00206] Em um aspecto, um animal não humano compreendendo um repertório de segmento VH humano restrito È fornecido, compreendendo ainda um local de segmento variável da cadeia leve da imunoglobulina humanizado, em que a razão de cadeias leves P rara p cescj^^es^an.^ no camundongo é aproximadamente a mesma como em um camundongo do tipo selvagem.

[00207] Em um aspecto, um animal não humano È fornecido, compreendendo um local da cadeia pesada da imunoglobulina restrito caracterizado pela presenÁa de um único segmento de gene VH, um ou mais segmentos de gene DH, e um ou mais segmentos de gene JH, em que o úmco segmento de gene VH È um segmento de gene VH polimórfico.

[00208] Em uma modalidade, o segmento de gene VH polimórfico È um segmento de gene VH humano que está associado com um número de cópia alto nas populaÁies humanas. Em uma modalidade, o segmento de gene VH humano È selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, VH3-23, ou uma variante polimórfica do mesmo. Em uma modalidade específica, o segmento de gene VH humano È um segmento de gene VH1-69. Em uma outra modalidade específica, o segmento de gene VH humano È um segmento de gene VH1-2.

[00209] Em uma modalidade, o único segmento de gene VH È operavelmente ligado a um gene da região constante da imunoglobulina humano, de camundongo, ou quimÈrico humano/camundongo. Em uma modalidade específica, o gene da região constante da imunoglobulina È um gene da região constante de camundongo. Em uma modalidade, o gene constante da imunoglobulina compreende uma sequíncia humana selecionada de uma CH1 humana, uma dobradiÁa humana, uma CH2 humana, uma CH3 humana, e uma combinação do mesmo. Em uma modalidade, o gene constante de camundongo está em um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno.

[00210] Em uma modalidade, o animal não humano compreende ainda um segmento de gene VL da imunoglobulina humano operavelmente ligado a um segmento de gene J e um gene constante da cadeia leve. Em uma modalidade específica, o segmento de gene VL e/ou o segmento de gene J são selecionados de um segmento de gene K Uimnnmo u um semmeoto de gene X humano. Em uma modalidade, os segmentos de gene VL e/ou J são segmentos de gene K Uumanos.

[00211] Em várias modalidades, o animal não humano compreende uma deleção de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH.

[00212] Em várias modalidades, o animal não humano compreende um local de gene variável da cadeia pesada endógeno inativado. Em várias modalidades, o local de gene variável da cadeia pesada endógeno inativado não È operavelmente ligado a um gene da região constante da cadeia pesada endógena.

[00213] Em um aspecto, um animal não humano È fornecido, em que o animal não humano È caracterizado pela expressão de imunoglobulina sÈrica, em que mais do que 80% da imunoglobulina sÈrica compreende um domínio variável da cadeia pesada humano e um domínio variável da cadeia leve humana cognato, em que o domínio variável da cadeia pesada humana È derivada de um repertório do segmento de gene VH que consiste essencialmente de um segmento de gene VH humano unico e/m variante polimórficas do mesmo.

[00214] Em uma modalidade, o segmento de gene VH humano único é um segmento de gene VH1-69 humano e/ou variantes polimórficas do mesmo. Em uma modalidade, o segmento de gene VH humano único é um eegmento de gene VH1-2 humano e/ou variantes polimórficas do mesmo.

[00215] Em um aspecto, um animal não humano È fornecido, compreendendo, na sua linha germinativa, uma substituição em um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno de todos ou substancialmente todos segmentos de gene VH endógenos com um segmento de gene VH humano único e/ou vanaules poiimórficas do mesmo.

[00216] Em uma modalidade, o animal não humano compreende ainda uma substituição em um local de cadeia leve da imunoglobulina endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VL endógeno com um ou mais segmentos de gene VL humanos. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende ainda um ou mais segmentos de gene JL humanos operavelmente ligados aos segmentos de gene VL humanos.

[00217] Em um aspecto, um animal não humano que expressa um anticorpo que compreende pelo menos um polipeptídeo da imunoglobulina de domínio variável humano/domínio constante não humano È fornecido, em que o animal não humano expressa uma proteína ADAM6 não humana ou ortólogo ou homólogo do mesmo de um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno È incapaz de rearranjar para codificar uma cadeia pesada funcional de um anticorpo.

[00218] Em um aspecto, um animal não humano que expressa um anticorpo que compreende pelo menos um polipeptídeo da imunoglobulina de domínio variável humano/domínio constante não humano È fornecido, em que o animal não humano expressa uma proteína ADAM6 não humana ou ortólogo ou homólogo do mesmo de um local outro que não um local da imunoglobulina.

[00219] Em uma modalidade, a proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo do mesmo È expressada em uma cÈlula B do animal não humano, em que a cÈlula B compreende uma sequíncia da imunoglobulina rearranjada que compreende uma sequíncia variável humana e uma sequíncia constante não humana.

[00220] Em uma modalidade, a sequíncia constante não humana È uma sequíncia de roedor. Em uma modalidade, o roedor È selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[00221] Em um aspecto, um mÈtodo È fornecido para fabricar um animal não humano macho infÈrtil, compreendendo tornar um alelo de ADAM6 endógeno de uma cÈlula ES doadora não funcional (ou silenciar o dito alelo), introduzindo a cÈlula ES doadora dentro de um embri„o hospedeiro, gestar o embri„o hospedeiro em uma m„e substituta, e permitir que a m„e substituta gere a progínie derivada no todo ou em parte da cÈlula ES doadora. Em uma modalidade, o mÈtodo compreende ainda cruzar a progínie para obter um animal não humano macho infÈrtil.

[00222] Em um aspecto, um mÈtodo È fornecido para fabricar um animal não humano com uma modificação genÈtica de interesse, em que o animal não humano È infÈrtil, o mÈtodo compreendendo as etapas de (a) fabricar uma modificação genÈtica de interesse em um genoma; (b) modificar o genoma para o silenciamento de um alelo de ADAM6 endógeno, ou tornar um alelo de ADAM6 endógeno não funcional; e, (c) utilizar o genoma na fabricação de um animal não humano. Em várias modalidades, o genoma È de uma cÈlula ES ou usado em um experimento de transferíncia nuclear.

[00223] Em um aspecto, um animal não humano fabricado usando um vetor de alvejamento, construção de nucleotídeo, ou cÈlula como aqui descrito È fornecido.

[00224] Em um aspecto, uma progínie de um acasalamento de um animal não humano como aqui descrito com um segundo animal não humano que È um animal não humano do tipo selvagem ou geneticamente modificado È fornecido.

[00225] Em um aspecto, um mÈtodo para manter uma cepa de animal não humano È fornecido, em que a cepa do animal não humano compreende uma substituição de uma sequíncia de cadeia pesada não da imunoglobulina humana com uma ou mais sequíncias de cadeia pesada da imunoglobulina heteróloga. Em uma modalidade, a uma ou mais sequíncias de cadeia pesada da imunoglobulina heteróloga são sequíncias da cadeia pesada da imunoglobulina humana.

[00226] Em uma modalidade, a cepa de animal não humano compreende uma deleção de um ou mais segmentos de gene não humanos VH, DH, e/ou JH. Em uma modalidade, o animal não humano compreende ainda um segmento de gene VH humano único, um ou mais segmentos de gene de DH humano, e/ou um ou mais segmentos de gene JH humanos. Em uma modalidade, o animal não humano compreende um nica) segmento VH humano, pelo menos 27 segmentos de gene de DH humano, e pelo menos seis segmentos de gene JH. Em uma modalidade específica, o animal não humano compreende um úmoo segmento VH humano, 27 segmentos de gene de DH humano, e seis segmentos de gene JH humanos, em que o dito segmento de gene VH humano nnioo, 27 segmentos de enee de DH humano, e seis segmentos de gene JH humanos são operavelmente ligados a um gene da região constante. Em uma modalidade, o gene da região constante È um gene da região constante não humano. Em uma modalidade, o gene da região constante compreende uma sequÍncia de gene da região constante de camundongo ou rato selecionada de uma CH1, uma dobradiÁa, uma CH2, uma CH3, e/ou uma CH4 ou uma combinação do mesmo. Em varias modalidades, o segmento de gene VH humano único é um segmento cie gene VH1-69 humano ou um VH1-2 humano.

[00227] Em uma modalidade, o mÈtodo compreende gerar um animal não humano heterozigoto macho para a substituição da sequíncia de cadeia pesada da imunoglobulina não humana, e cruzar o animal não humano macho heterozigoto com um animal não humano fímea do tipo selvagem ou um animal não humano fímea que seja homozigoto ou heterozigoto para a sequíncia humana de cadeia pesada. Em uma modalidade, o mÈtodo compreende manter a cepa de animal não humano cruzando-se repetidamente machos heterozigotos com fímeas que são do tipo selvagem ou homozigotos ou heterozigotos para a sequíncia de cadeia pesada humana.

[00228] Em uma modalidade, o mÈtodo compreende obter cÈlulas de animais não humanos machos ou fímeas homozigotos ou heterozigotos para a sequíncia humana de cadeia pesada, e utilizar estas cÈlulas como cÈlulas doadoras ou núcleos dos mesmos como núcleos doadores, e usando as cÈlulas ou núcleos para fabricar animais não humanos geneticamente modificado usando cÈlulas hospedeiras e/ou gestando as cÈlulas e/ou núcleos em m„es substitutas.

[00229] Em uma modalidade, apenas animais não humanos macho que sejam heterozigotos para a substituição no local da cadeia pesada são cruzados com animais não humanos fímea. Em uma modalidade específica, os animais não humanos fímeas são homozigotos, heterozigotos, ou do tipo selvagem em relação a um local da cadeia pesada substituído.

[00230] Em uma modalidade, os animais não humanos compreendem ainda uma substituição das sequências e e/ou K dacadeie leveváriável em um local de cadeia leve da imunoglobulina endógena com as sequíncias de cadeia leve da imunoglobulina heteróloga. Em uma modalidade, as sequíncias de cadeia leve da imunoglobulina heterólogas são sequíncias variáveis da cadeia leve Jáe/uu K da imugoglubnlina lumana.

[00231] Em uma modalidade, o animal não humano compreende ainda um transgene em um local outro que não um local endógeno da imunoglobulina, em que o transgene compreende uma sequíncia que codifica uma sequência de cadeia leve U oeK icap'aii/ada uu eào reocranjada heteróloga (por exemplo, VL não rearranjada e JL não rearranjada, ou VLJL rearranjada) operavelmente ligadas (para não rearranjadas) ou fundidas (para rearranjadas) a uma sequíncia da região constante de cadeia leve da imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve U uu K heteróloga È humana. Em uma modalidade, a sequíncia da região constante È selecionada de roedor, ser humano, e primata não humano. Em uma modalidade, a sequíncia da região constante È selecionada de camundongo, rato, e hamster. Em uma modalidade, o transgene compreende um promotor que não da imunoglobulina que dirige a expressão das sequíncias de cadeia leve. Em uma modalidade específica, o promotor È um promotor transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o promotor È um promotor ROSA26.

[00232] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, compreendendo inserir uma sequíncia de nucleotídeo não humana que compreende um segmento de gene de imunoglobulina não humano no genoma do animal para uma primeira modificação, em que a inserç„o mantÈm um gene ADAM6 endógeno, depois de tornar o local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno do animal não humano não funcional para uma segunda modificação. Em uma modalidade, a primeira modificação È realizada a montante de um gene da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena e a segunda modificação È realizada para inverter, translocar, ou colocar fora de ligação operavel o local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno tal que o local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno seja incapaz de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada funcional.

[00233] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, compreendendo substituir uma sequíncia de nucleotídeo não humana que compreende um segmento de gene da imunoglobulina não humana e uma sequíncia de nucleotídeo de ADAM6 não humano (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo funcional em um animal não humano macho) com uma sequíncia compreendendo um segmento de gene da imunoglobulina humana para formar um primeiro local quimÈrico, depois de inserir uma sequíncia compreendendo uma sequíncia que codifica ADAM6 não humano (ou uma sequíncia que codifica um ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo) dentro da sequíncia compreendendo o segmento de gene da imunoglobulina humana para formar um segundo local quimÈrico.

[00234] Em uma modalidade, o segundo local quimÈrico compreende um segmento de gene da cadeia pesada da imunoglobulina variável humana (VH). Em uma modalidade, o segundo local quimÈrico compreende um segmento de gene da cadeia leve variável da imunoglobulina humana (VL). Em uma modalidade específica, o segundo local quimÈrico compreende um segmento de gene VH humano ou um segmento de gene VL humano operavelmente ligado a um segmento de gene DH humano e um segmento de gene JH humano. Em uma outra modalidade específica, o segundo local quimÈrico È operavelmente ligado a um terceiro local quimÈrico que compreende uma sequíncia CH1 humana, ou uma CH1 humana e dobradiÁa humana, fundidas com uma sequíncia CH2 + CH3 de camundongo.

[00235] Em um aspecto, o uso de um camundongo que compreende uma sequÍncia de nucleotídeo ectópica compreendendo um local ou sequíncia de ADAM6 de camundongo para fabricar um camundongo macho fÈrtil È fornecido, em que o uso compreende acasalar o camundongo compreendendo a sequíncia de nucleotídeo ectópica que compreende o local ou sequíncia de ADAM6 de camundongo com um camundongo que carece de um local ou sequíncia de ADAM6 de camundongo endógeno funcional, e obter uma progínie que seja uma fímea capaz de produzir progínie tendo o local ou sequíncia ADAM6 ectópicos ou que seja um macho que compreende o local ou sequíncia ADAM6 ectópicos, e o macho exiba um fertilidade que seja aproximadamente a mesma como uma fertilidade exibida por um camundongo do tipo selvagem macho.

[00236] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar uma sequíncia de nucleotídeo da região variável da imunoglobulina È fornecido.

[00237] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar um Fab totalmente humano ou um F(ab)2 totalmente humano È fornecido.

[00238] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar uma linhagem de cÈlula imortalizada È fornecido.

[00239] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar um hibridoma ou quadroma È fornecido.

[00240] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar uma biblioteca de fago contendo regiles variáveis de cadeia pesada humana e regiles variáveis de cadeia leve humana È fornecido.

[00241] Em uma modalidade, as regiles variáveis de cadeia pesada humana são derivadas de um segmento de gene VH1-69 humano que compreende uma sequíncia selecionada da SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 59.

[00242] Em uma modalidade, as regiles variáveis de cadeia pesada humana são derivadas de um segmento de gene VH1-69 humano que compreende uma sequíncia selecionada da SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 62.

[00243] Em uma modalidade, as regiles variáveis de cadeia pesada humana são todas derivadas de um segmento de gene VH1-2 humano que compreende uma sequíncia selecionada da SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 71.

[00244] Em uma modalidade, as regiles variáveis de cadeia pesada humana são derivadas de um segmento de gene VH1-2 humano que compreende uma sequíncia selecionada da SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 72.

[00245] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para gerar uma sequíncia da região variável para fabricar um anticorpo humano È fornecido, compreendendo (a) imunizar um camundongo como aqui descrito com um antígeno de interesse, (b) isolar um linfócito do camundongo imunizado de (a), (c) expor o linfócito a um ou mais anticorpos rotulados, (d) identificar um linfócito que seja capaz de ligação ao antígeno de interesse, e (e) amplificar uma ou mais sequíncias de •cido nuclÈico da região variável do linfócito gerando deste modo uma sequíncia da região variável.

[00246] Em uma modalidade, o linfócito È derivado do baÁo do camundongo. Em uma modalidade, o linfócito È derivado de um linfonodo do camundongo. Em uma modalidade, o linfócito È derivado da medula óssea do camundongo.

[00247] Em uma modalidade, o anticorpo rotulado È um anticorpo conjugado a fluoróforo. Em uma modalidade, o um ou mais anticorpos conjugados a fluoróforo são selecionados de uma IgM, uma IgG, e/ou uma combinação das mesmas.

[00248] Em uma modalidade, o linfócito È uma cÈlula B.

[00249] Em uma modalidade, a uma ou mais sequíncias de •cido nuclÈico da região variável compreendem uma sequíncia da região variável de cadeia pesada. Em uma modalidade, a uma ou mais sequíncias de ácido nuclÈico da região variável compreendem uma sequíncia da região variável da cadeia leve. Em uma modalidade específica, a sequíncia da região variável da cadeia leve È uma eqcµiniicia eggãão variáeel aa adeeía teve a da imunoglobulina. Em uma modalidade, a uma ou mais sequíncias de ácido nuclÈico da região variável compreendem uma sequíncia da região variável da cadeia pesada v uma cadeia leve K.

[00250] Em uma modalidade, o uso de um camundongo como aqui descrito para gerar uma sequíncia da região variável da cadeia pesada e uma leve K paa babricar umanticooh humano f Comecido,cumddnendend( )a) imunizar um camundongo como aqui descrito com um antígeno de interesse, (b) isolar o baÁo do camundongo imunizado de (a), (c) expor os linfócitos B do baÁo a um ou mais anticorpos rotulados, (d) identificar um linfócito B de (c) que seja capaz de ligação ao antígeno de interesse, e (e) amplificar uma sequíncia de ácido nuclÈico da região variável de cadeia pesada e uma sequíncia de ácido nuclÈico da região variável da cadeia leve K ão linfócito B gerando deste modo a sequíncias da região variável da cadeia pesada e cadeia leve K.

[00251] Em uma modalidade, o uso de um camundongo como aqui descrito para gerar uma sequíncia da região variável da cadeia pesada e uma leve K para babricar um anticorpo humano f fornecida, compreendendo )a) imunizar um camundongo como aqui descrito com um antígeno de interesse, (b) isolar um ou mais linfonodos do camundongo imunizado de (a), (c) expor os linfocitos B do um ou mais linfonodos a um ou mais anticorpos rotulados, (d) identificar um linfocito B de (c) que seja capaz de ligação ao antígeno de interesse, e (e) amplificar uma sequíncia de •cido nuclÈico da região variável de cadeia pesada e uma sequíncia de •cido nuclÈico da região variável da cadeia leve a p partid do liníbcito B gendido cít?stm modo as qequências da região veriávsl Oe ceOsie psseOe s ceOsie lsvs K.

[00252] Em uma modalidade, o uso de um camundongo como aqui descrito para gerar uma sequíncia da região variável da cadeia pesada e uma leve p pera babricar umanticorpo humano f fomecido,compreendendo )a) imunizar um camundongo como aqui descrito com um antígeno de interesse, (b) isolar a medula óssea do camundongo imunizado de (a), (c) expor os linfocitos B da medula óssea a um ou mais anticorpos rotulados, (d) identificar um linfocito B de (c) que seja capaz de ligação ao antígeno de interesse, e (e) amplificar uma sequíncia de ácido nuclÈico da região variável de cadeia pesada e uma sequíncia de ácido nuclÈico da região variável da ceOsie leve o do linfocito B ge'crnCp deste modo ae ríonencici da rcoiào veriávsl Oe ceOeie peseOe e ceOeie leve K. Imi ornam modalidades. o mn ou mais anticorpos rotulados são selecionada de uma IgM, uma IgG, e/ou uma combinação das mesmas.

[00253] Em várias modalidades, o antígeno de interesse È um patógeno que aflige os indivíduos humanos incluindo, por exemplo, um antígeno viral. Os patógenos virais exemplares incluem, por exemplo, principalmente aqueles das famílias de Adonoymdae, bactérias Picornaxiridae, Herpeseiridae, la’i'icidnav iriaae, Rlaxivroinae, Retroxiridae, Orthnmyxneiridae, l>ay.ineroi)nir / Pae, Popov avinúOie, P oliomavirus, Rhabdneiridae, e ngaavirdaae. Tuas vinis exompiípos tipraoPLonre dariom entre 20 e 300 nanômetros no comprimento. Em várias modalidades, o antígeno de interesse È um antígeno viral selecionado de um vírus da hepatite (por exemplo, HCV, HBV, etc.), um vírus da imunodeficiíncia humana (HIV), ou um vírus da influenza.

[00254] Em várias modalidades, o uso de um camundongo como aqui descrito para gerar uma sequíncia da região variável da cadeia pesado e leve K para aabricar um antimrpo hiumano é fornecido. comipreencle firndk ainda as sequíncias da região variável das cadeias pesada e leve amplificadas às sequíncias da região constante de cadeias pesada e leve humanas, expressar as sequíncias das cadeias pesada e leve fundidas em uma cÈlula, e recuperar as sequíncias das cadeias pesadas e leve expressadas gerando deste modo um anticorpo humano.

[00255] Em várias modalidades, a regiles constantes da cadeia pesada humana são selecionadas de IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. Em varias modalidades específicas, a IgG È selecionada de uma IgG1, uma IgG2, uma IgG3 e uma IgG4. Em várias modalidades, a região constante da cadeia pesada humana compreende uma CH1, uma dobradiÁa, uma CH2, uma CH3, uma CH4, ou uma combinação das mesmas. Em várias modalidades, a região constante da cadeia leve é uma regiãf constante K da imunofbobulrna. Em várias modalidades, a cÈlula È selecionada de uma cÈlula HeLa, uma cÈlula DU145, uma cÈlula Lncap, uma cÈlula MCF-7, uma cÈlula MDA-MB-438, uma cÈlula PC3, uma cÈlula T47D, uma cÈlula THP-1, uma cÈlula U87, uma cÈlula SHSY5Y (neuroblastoma humano), uma cÈlula Saos-2, uma cÈlula Vero, uma cÈlula CHO, uma cÈlula GH3, uma cÈlula PC12, uma cÈlula retinal humana (por exemplo, uma cÈlula PER.C6®), e uma cÈlula MC3T3. Em uma modalidade específica, a cÈlula È uma cÈlula CHO.

[00256] Em um aspecto, um mÈtodo para gerar um anticorpo humano específico de roedor reverso-quimÈrico contra um antígeno de interesse È fornecido, compreendendo as etapas de imunizar um camundongo como aqui descrito com o antígeno, isolar pelo menos uma cÈlula do camundongo produzir uma anticorpo humano específico de camundongo reverso-quimÈrico contra o antígeno, cultivar pelo menos uma cÈlula para produzir o anticorpo humano específico de camundongo reverso-quimÈrico contra o antígeno, e obter o dito anticorpo.

[00257] Em uma modalidade, o anticorpo humano específico de camundongo reverso-quimÈrico compreende um domínio variável da cadeia pesada humano fundido com um gene constante da cadeia pesada de camundongo ou rato, e um domínio variável da cadeia leve humano fundido com um gene constante da cadeia leve de camundongo ou rato ou ser humano. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada humano contÈm um segmento de gene VH1-69 humano ou VH1-2 humano rearranjados.

[00258] Em uma modalidade, o cultivo de pelo menos uma cÈlula para produzir o anticorpo humano específico de roedor reverso-quimÈrico contra o antígeno È realizado em pelo menos uma cÈlula de hibridoma gerada a partir de pelo menos uma cÈlula isolada do camundongo.

[00259] Em um aspecto, um mÈtodo para gerar um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno de interesse È fornecido, compreendendo as etapas de imunizar um camundongo como aqui descrito com o antígeno, isolar pelo menos uma cÈlula do camundongo para produzir um anticorpo humano específico de roedor reverso-quimÈrico contra o antígeno, gerar pelo menos uma cÈlula para produzir um anticorpo totalmente humano derivado do anticorpo humano específico de roedor reverso- quimÈrico contra o antígeno, e cultivar pelo menos uma cÈlula para produzir o anticorpo totalmente humano, e obter o dito anticorpo totalmente humano.

[00260] Em várias modalidades, a pelo menos uma cÈlula isolada do camundongo para produzir um anticorpo humano específico de roedor reverso-quimÈrico contra o antígeno È um esplenócito ou uma cÈlula B.

[00261] Em várias modalidades, o anticorpo È um anticorpo monoclonal.

[00262] Em várias modalidades, o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada que contÈm um segmento de gene VH1-69 humano ou VH1-2 humano rearranjado.

[00263] Em várias modalidades, a imunização com o antígeno de interesse È realizada com proteína, DNA, uma combinação de DNA e proteína, ou cÈlulas que expressam o antígeno.

[00264] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica uma região variável da imunoglobulina ou fragmento do mesmo È fornecida. Em uma modalidade, a sequíncia de ácido nuclÈico È usada para fabricar um anticorpo humano ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o camundongo È usado para fabricar uma proteína de ligação de antígeno selecionada de um anticorpo, um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico), um scFv, um scFv biespecífico, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um V-NAR, um VHH, um VL, um F(ab), um F(ab)2, uma DVD (isto È, proteína de ligação de antígeno de domínio variável dual), uma SVD (isto È, proteína de ligação de antígeno de domínio variável único), ou um ocupador de célula T biespecífico (liTE)).

[00265] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar uma proteína de ligação de antígeno humana È fornecida, compreendendo expor um animal não humano geneticamente engenheirado como aqui descrito a um antígeno de interesse, permitindo que o animal não humano monte uma resposta imune ao antígeno, obtendo do animal não humano um domínio variável da sequíncia de cadeia pesada de ácido nuclÈico que codifica um domínio variável humano da cadeia pesada que especificamente liga o antígeno de interesse, fundindo o domínio variável da sequíncia de cadeia pesada de ácido nuclÈico a uma sequíncia humana da região constante, e expressar em uma cÈlula de mamífero um anticorpo compreendendo a sequíncia do domínio variável da cadeia pesada humana e a sequíncia da região constante humana. Em uma modalidade, a cÈlula de mamífero È uma cÈlula CHO. Em uma modalidade o animal não humano compreende um repertório do segmento de gene VH humano que consiste essencialmente de um segmento de gene VH humano único, opcionmmente presente em duas ou mais variantes polimórficas do mesmo, operavelmente ligados a um ou mais segmentos D e/ou J humanos. Em uma modalidade, o repertório do segmento de gene VH humano está em um local de segmento de gene VH não humano endógeno. Em uma modalidade, o repertório do segmento de gene VH humano está em um local que não È um local de segmento de gene VH endógeno. Em uma modalidade, o segmento de gene VH humano rearranja com um segmento D humano e um segmento J humano para formar um gene VDJ humano rearranjado operavelmente ligado a uma sequíncia da região constante, em que a sequíncia da região constante È selecionada de uma sequíncia humana e uma sequíncia de roedor (por exemplo, uma sequíncia de camundongo ou rato ou hamster). Em uma modalidade, a sequíncia da região constante compreende uma sequíncia selecionada de uma CH1, uma dobradiÁa, uma CH2, uma CH3, e uma combinação do mesmo; em uma modalidade específica, a sequíncia da região constante compreende uma CH1, uma dobradiÁa, uma CH2, e uma CH3. Em uma modalidade, o domínio vartável humano e a sequíncia constante são expressados na cÈlula de mamífero com um domínio vartável de cadeia leve cognato humano obtido do mesmo camundongo (por exemplo, a sequíncia obtida da mesma cÈlula B como o domínio vartável humano); em uma modalidade a sequíncia que codifica o domínio vartável de cadeia leve humano obtido do camundongo È depois fundido com uma sequíncia que codifica uma sequíncia constante da cadeia leve humana, e a sequíncia de cadeia leve e a sequíncia de cadeia pesada são expressadas na cÈlula de mamífero.

[00266] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um domínio vartável da cadeia pesada de anticorpo que liga um antígeno de interesse È fornecido, compreendendo expressar em uma úníaa célula (a) uma primeira eequnac^ia VH de um animal não humano imunizado como aqui descrito, em que a primeira sequÍncia VH È fundida com uma sequÍncia de gene CH; e (b) uma sequÍncia de gene VL de um animal não humano imunizado como aqui descrito, em que a sequÍncia de gene VL È fundida com uma sequÍncia de gene CL humana; mantendo a cÈlula sob condiÁies suficientes para expressar um anticorpo; e, isolar o domínio variável da cadeia pesada de anticorpo. Em uma modalidade, a sequÍncia de gene VL È cognata com a primeira sequÍncia VH.

[00267] Em uma modalidade, a cÈlula compreende uma segunda sequÍncia de gene VH de um animal não humano imunizado como aqui descrito, em que a segunda sequÍncia de gene VH È fundida com uma sequÍncia de gene CH, em que a primeira sequÍncia de gene VH codifica um domínio VH que especificamente liga um primeiro epítopo, e a segunda sequÍncia de gene VH codifica um domínio VH que especificamente liga um segundo epítopo, em que o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idÍnticos.

[00268] Em uma modalidade, as sequÍncias da região constante são todas sequÍncias humanas da região constante.

[00269] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um anticorpo biespecífico humano È fornecido, compreendendo fabricar o anticorpo biespecífico usando as sequÍncias de gene da região variável humana de cÈlulas B de um animal não humano como aqui descrito.

[00270] Em uma modalidade, o mÈtodo compreende (a) identificar um linfocito do animal não humano clonalmente selecionado, em que o animal não humano foi exposto a um antígeno de interesse e deixado desenvolver uma resposta imune ao antígeno de interesse, e em que o linfocito expressa um anticorpo que especificamente liga o antígeno de interesse, (b) obter a partir do linfocito ou do anticorpo uma sequÍncia de nucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada humana que especificamente liga o antígeno de interesse, e (c) utilizar a sequíncia de nucleotídeo que codifica a região variável de cadeia pesada humana que especificamente liga o antígeno de interesse na fabricação do anticorpo biespecífico. Em uma modalidade específica, a região variável de cadeia pesada humana compreende um segmento de gene VH1-2 ou VH1-69 rearranjados.

[00271] Em uma modalidade, as etapas (a) atÈ (c) são realizadas uma primeira vez para um primeiro antígeno de interesse para gerar uma primeira sequíncia da região variável de cadeia pesada humana, e as etapas (a) atÈ (c) são realizadas uma segunda vez para um segundo antígeno de interesse para gerar uma segunda sequíncia da região variável de cadeia pesada humana, e em que a primeira sequíncia da região variável de cadeia pesada humana È expressada fundida com uma primeira região constante da cadeia pesada humana para formar uma primeira cadeia pesada humana, a segunda sequíncia da região variável de cadeia pesada humana È expressada fundida com uma segunda região constante da cadeia pesada humana para formar uma segunda cadeia pesada humana, em que a primeira e a segunda cadeias pesadas humanas são expressadas na presenÁa de uma nicaa cadeia Ivve expressada humana de um segmento de gene VK1-39 humano ou um VK3-20 humano rearranjados. Em uma modalidade específica, a nníea adecaa Ivee humana compreende uma sequíncia da linha germinativa.

[00272] Em uma modalidade, o mÈtodo compreende (a) clonar as regiles variáveis da cadeia pesada de cÈlulas B de um animal não humano como aqui descrito que foi exposto a um primeiro antígeno de interesse, e o mesmo animal não humano, ou um animal não humano diferente que seja geneticamente o mesmo e tenha sido exposto a um segundo antígeno de interesse; e (b) expressar em uma cÈlula as regiles variáveis da cadeia pesada de (a) com a mesma região constante da cadeia pesada e a mesma da cadeia leve para fabricar um anticorpo biespecífico.

[00273] Em um aspecto, um uso de um animal não humano como aqui descrito È fornecido, para se obter uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica um domínio variável da cadeia pesada humano. Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH humano rearranjado selecionado de VH1-2 e VH1-69.

[00274] Em um aspecto, um uso de um animal não humano como aqui descrito È fornecido, para se obter uma cÈlula que codifica um domínio variável da cadeia pesada humano. Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH humano rearranjado selecionado de VH1-2 e VH1-69.

[00275] Em um aspecto, o uso de um animal não humano como aqui descrito para fabricar um domínio variável de anticorpo humano È fornecido. Em um aspecto, o uso de um animal não humano como aqui descrito para fabricar um anticorpo humano È fornecido. Em uma modalidade, o anticorpo humano È um anticorpo humano biespecífico. Em várias modalidades, o domínio variável e/ou o anticorpo compreendem um segmento de gene VH humano rearranjado selecionado de VH1-2 e VH1-69.

[00276] Em um aspecto, o uso de um animal não humano como aqui descrito È fornecido para selecionar um domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina humano. Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH humano rearranjado selecionado de VH1-2 e VH1-69.

[00277] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para introduzir uma sequíncia de ADAM6 ectópica dentro de um camundongo que carece de uma sequíncia de ADAM6 de camundongo endógena funcional È fornecida, em que o uso compreende acasalar um camundongo como aqui descrito com o camundongo que carece da sequíncia de ADAM6 de camundongo endógena funcional.

[00278] Em um aspecto, o uso de material genÈtico de um camundongo como aqui descrito para fabricar um camundongo tendo uma sequíncia de ADAM6 ectópica È fornecido. Em uma modalidade, o uso compreende transferência nuclear usando um núcleo de uma cÈlula de um camundongo como aqui descrito. Em uma modalidade, o uso compreende clonar uma cÈlula de um camundongo como aqui descrito para produzir um animal derivado da cÈlula. Em uma modalidade, o uso compreende utilizar um esperma ou um ovo de um camundongo como aqui descrito em um processo para fabricar um camundongo compreendendo a sequíncia de ADAM6 ectópica.

[00279] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um camundongo macho fÈrtil compreendendo um local de cadeia pesada da imunoglobulina modificado È fornecido, compreendendo fertilizar uma primeira cÈlula germinativa de camundongo que compreende uma modificação de um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno com uma segunda cÈlula germinativa de camundongo que compreende um gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo que seja funcional em um camundongo macho; formar uma cÈlula fertilizada; deixando a cÈlula fertilizada desenvolver em um embri„o; e, gestar o embri„o em um substituto para se obter um camundongo.

[00280] Em uma modalidade, a fertilização È obtida pelo acasalamento de um camundongo macho e um camundongo fímea. Em uma modalidade, o camundongo fímea compreende o gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade, o camundongo macho compreende o gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento do mesmo.

[00281] Em um aspecto, o uso de uma sequíncia de •cido nuclÈico que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo do mesmo ou um fragmento funcional da proteína ADAM6 correspondente para restaurar ou reatar a fertilidade de um camundongo tendo um genoma compreendendo uma modificação de um local da cadeia pesada da imunoglobulina È fornecido, em que a modificação reduz ou elimina a função de ADAM6 endógena.

[00282] Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico È integrada dentro do genoma do camundongo em uma posição ectópica. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico È integrada dentro do genoma do camundongo em um local endógeno da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o local endógeno da imunoglobulina È um local da cadeia pesada. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico È integrada dentro do genoma do camundongo em uma posição outra que não um local endógeno da imunoglobulina.

[00283] Em um aspecto, o uso do camundongo como aqui descrito para a fabricação de um medicamento (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno), ou para a fabricação de uma sequíncia que codifica uma sequíncia variável de um medicamento (por exemplo, uma proteína de ligação de antígeno), para o tratamento de uma doenÁa ou distúrbio humanos È fornecido. Em uma modalidade, a sequíncia variável de um medicamento compreende um segmento de gene VH humano polimórfico. Em uma modalidade, a sequíncia variável de um medicamento compreende um segmento de gene VH1-69 humano. Em uma modalidade, a sequíncia variável de um medicamento compreende um segmento de gene VH1-2 humano.

[00284] Em um aspecto, uma construção de ácido nuclÈico que codifica um domínio variável da imunoglobulina fabricada em um camundongo como aqui descrito È fornecida. Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia pesada. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH humano selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ou VH3-23. Em uma outra modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH1-2 humano. Em uma outra modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH1-69 humano.

[00285] Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia leve. Em uma modalidade específica, o domínio variável È um domínio variável da cadeia leve q qué c cognato oom um domínio de cadeia pesada variável humana que compreende um segmento de gene VH1- 69 humano rearranjado. Em uma modalidade específica, o domínio variável È um Onmínín variável da cadeia leve K que éncgnato nmi umnmrmniovariáeel da cadeia pesada humano que compreende um segmento de gene VH1-2 humano rearranjado.

[00286] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar uma construção de •cido nuclÈico que codifica um domínio variável da imunoglobulina humana È fornecido. Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia leve. Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia leve K quccmmpreende um secmentn Oe cene VK luimano rearranjado selecionacio de VK4I1, VK5-2, VK7-3, VK2-4, VK1-5, VK1-6, VK3-7, VK1-K, VK1-9, VK2-10, VK3-11, VK1- 12, VK1-13, VK2-14, VK3-15, VK1-16, VK1-17, VK2-1K, VK2-19, VK3-20, VK6-21, VK1-22, VK1-23, VK2-24, VK3-25, VK2-26, VK1-27, VK2-28, VK2- 29, VK2-30, VK3-31, VK1-32, VK1-33, VK3-34, VK1-35, VK2-36, VK1-37, VK2-3K, VK1-39, e VK2-40.

[00287] Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia pesada. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH humano rearranjado selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ou VH3-23. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH1-69 humano rearranjado. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH1-2 humano rearranjado.

[00288] Em um aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar um domínio variável da imunoglobulina humano È fornecido. Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia leve. Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia leve K uee compreende um semmciito ee eciie Vh hmmoioaeearanjodo selecionado de VV4-1, VV5-2, VV7-3, VV2-4, VV1-5, VV1-6, VV3-7, VV1-8, VV1-9, VK2-10, VK3-11, VV1-12, VV1-13, VK2-14, VK3-15, VV1-16, VV1-17, VK2-1K, VK2-19, VK3-20, VK6-21, VK1-22, VK1-23, VK2-24, VK3-25, VK2- 26, VK1-27, VK2-2K, VK2-29, VK2-30, VK3-31, VK1-32, VK1-33, VK3-34, VK1-35, VK2-36, VK1-37, VK2-38, VK1-39, e VK2-40.

[00289] Em uma modalidade, o domínio variável È um domínio variável da cadeia pesada. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH humano rearranjado selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ou VH3-23. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH1-69 humano rearranjado. Em uma modalidade específica, o domínio variável da cadeia pesada compreende um segmento de gene VH1-2 humano rearranjado.

[00290] Os vários aspectos e modalidades são suscetíveis a serem usados juntos, a menos que expressamente mencionado de outro modo ou o contexto claramente proíba o uso junto.

BREVE DESCRI«ÃO DAS FIGURAS

[00291] A FIG. 1 mostra nina üurtração geral, nãoemescala, de uma sÈrie de etapas de engenheiramento de alvejamento e molecular utilizada para fabricar um vetor de alvejamento para a construç„o de um local da cadeia pesada modificado contendo um nmoo eegmenoo ee gene VH1-69 humano, vinte e sete DH humanos e seis segmentos de gene JH humanos em um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno.

[00292] A FIG. 2 morlra nina ilurUçi„:ào geral. nãoemescala, de rima sÈrie de etapas de engenheiramento de alvejamento e molecular utilizadas para fabricar um vetor de alvejamento para a construção de um local de cadeia pesada modificado contendo um unia) sggmento de enee VR1-2 humano, vinte e sete segmentos de gene DH humanos e seis JH humanos em um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno.

[00293] A FIG. 35 mostra mia ilustração geral, noommescala, ee uma sÈrie de etapas de engenheiramento de alvejamento e molecular utilizadas para fabricar um vetor de alvejamento para a construção de um local de cadeia pesada modificado contendo um lino segmenão ee enee VH1-69 humano, vinte e sete segmentos de gene DH humanos, seis JH humanos e um fragmento genômico ectópico que codifica ADAM6 de camundongo em um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno.

[00294] A FIG. 4 morna mia ilurUÁic^ào geraln nãoamescala, de tima sÈrie de etapas de engenheiramento de alvejamento e molecular utilizado para fabricar um vetor de alvejamento para a construção de um local da cadeia pesada modificado contendo um inmo segmenão ee enee VH1-2 humano, vinte e sete segmentos de gene DH humanos, seis JH humanos e um fragmento genômico ectópico que codifica ADAM6 de camundongo em um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno.

[00295] A FIG. m mosto o almliamcnto dn nucleotíoeo do segundo Èxon POSO cada um dos treze alelos relatados POSO o gene VH1-69 humano. As bases em letras minúsculas indicam as diferenÁas de nucleotídeo da linha germinativa entre os alelos. As regiles determinadoras de complementaridade (CDRs) são indicadas com caixas em torno das sequíncias. Os travessles indicom intervalos ortificiais pora o alinhomento de sequíncia apropriado. VH1-69*01 (SEQ ID NO: 37); VH1-69*02 (SEQ ID NO: 39); VH1-69*03 (SEQ ID NO: 41); VH1-69*04 (SEQ ID NO: 43); VH1-69*05 (SEQ ID NO: 45); VH1-69*06 (SEQ ID NO: 47); VH1-69*07 (SEQ ID NO: 49); VH1-69*08 (SEQ ID NO: 51); VH1-69*09 (SEQ ID NO: 53); VH1-69*10 (SEQ ID NO: 55); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 57); VH1-69*12 (SEQ ID NO: 59); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 61).

[00296] A IIG. m moatra o nlinhamento dp peotemd ds suínência madura do gene variável do codeia pesado para coda um dos treze alelos relatados poro o gene VH1-69 humano. Os amino^cidos em letra minúsculo indicam os diferenÁos do linho germinativa entre os alelos. As regiles determinadoras de complementaridade (CDRs) são indicados com caixas em torno do sequência. Os trovessles indicam intervalos artificiais poro o alinhamento de sequência apropriado. VH1-69*01 (SEQ ID NO: 38); VH1- 69*02 (SEQ ID NO: 40); VH1-69*03 (SEQ ID NO: 42); VH1-69*04 (SEQ ID NO: 44); VH1-69*05 (SEQ ID NO: 46); VH1-69*06 (SEQ ID NO: 48); VH1- 69*07 (SEQ ID NO: 50); VH1-69*08 (SEQ ID NO: 52); VH1-69*09 (SEQ ID NO: 54); VH1-69*10 (SEQ ID NO: 56); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 58); VH1- 69*12 (SEQ ID NO: 60); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 62).

[00297] A FIG. 7 mouáa uma mafriz de ãdentidade percentuol/similaridode percentual paro os sequências de proteína alinhados do gene variável maduro poro coda um dos trezes alelos relatados poro o gene VH1-69 humano. A identidade percentual entre os alelos VH1-69 È indicado acima dos caixas sombreados e o similaridade percentual È indicado abaixo dos caixas sombreados. As contagens paro o identidade percentual e similaridade percentual foram contados por uma ferramenta de alinhamento ClustolW (vl.83) usando o software MocVector (MocVector, Inc., Carolina do Norte).

[00298] A FIG. m rsosOra a alúa^ametío dn nucleotídeo ds sugundo Èxon paro coda um dos cinco alelos relatados paro o gene VH1-2 humano. As bases em letra minúsculo indicam os diferenÁos de nucleotídeo do linho germinativa entre os alelos. As regiles determinadoras de complementaridade (CDRs) são indicados com caixas em torno do sequência. Os trovessles indicam intervalos artificiais paro o alinhamento de sequência apropriado. VH1-2*01 (SEQ ID NO: 63); VH1-2*02 (SEQ ID NO: 65); VH1-2*03 (SEQ ID NO: 67); VH1-2*04 (SEQ ID NO: 69); VH1-2*05 (SEQ ID NO: 71).

[00299] 9 I-OC^r 9 iiii)nhameíiOiheiK.'in<^e da proteíiui da sequência madura do gene variável da cadeia pesada para cada am dos cinco alelos relatados para o gene VH1-2 humano. Os aminoacidos em letra minúscula indicam as diferenÁas da linha germinativa entre os alelos. As regiles determinadoras de complementaridade (CDRs) são indicadas com caixas em torno da sequência. Os travessles indicam intervalos artificiais para o alinhamento de sequência apropriado. VH1-2*01 (SEQ ID NO: 64); VH1-2*02 (SEQ ID NO: 66); VH1-2*03 (SEQ ID NO: 68); VH1-2*04 (SEQ ID NO: 70); VH1-2*05 (SEQ ID NO: 72).

[00300] A FIG. rO mostra uma mairie. de identidade percentual/ similaridade percentual para as sequências de proteína alinhadas do gene variável maduro para cada um dos cinco alelos relatados para o gene VH1-2 humano. A identidade percentual entre os alelos VH1-2 È indicada acima das caixas sombreadas e a similaridade percentual È indicada abaixo das caixas sombreadas. As contagens para identidade percentual e similaridade percentual foram contadas por uma ferramenta de alinhamento ClustalW (vl.83) usando o software MacVector (MacVector, Inc., Carolina do Norte). DESCRI«ÃO DETALHADA

[00301] Esta invenção não È limitada a mÈtodos particulares, e condiÁies experimentais descritos, visto que tais mÈtodos e condiÁies podem variar. TambÈm deve ser entendido que a terminologia usada aqui È para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não È intencionada a ser limitante, visto que o escopo da presente invenção È definido pelas reivindicaÁies.

[00302] A menos que definido de outro modo, todos os termos e frases usados aqui incluem os significados que os termos e frases obtiveram na tÈcnica, a menos que o contrário seja claramente indicado ou claramente evidente a partir do contexto em que o termo ou frase È usado. Embora quaisquer mÈtodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na pratica ou teste da presente invenção, mÈtodos particulares e materiais são agora descritos.

[00303] A Srabs “subslaouiat” ou “suast?mcialmente” quando usada para referir-se a uma quantidade de segmentos de gene (por exemplo, “suOstancialmente todos” os segmentos de gene V) inclui tanto segmentos de gene funcionais quanto não funcionais e incluem, em várias modalidades, por exemplo, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais de todos os segmentos de gene; em várias modalidades, “suOstancialmente todos” os segmentos de gene inclui, por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de segmentos de gene funcionais (isto È, não pseudogene).

[00304] o teumo “subotltuicão” imchU em que uma sequenciN Ae DNA È colocada em um genoma de uma cÈlula em um tal modo como para substituir uma sequíncia dentro do genoma com uma sequíncia heteróloga (por exemplo, uma sequíncia humana em um camundongo), no loco da sequíncia genômica. A sequíncia de DNA assim colocada pode incluir uma ou mais sequíncias reguladoras que são parte do DNA de origem usado para obter a sequíncia assim colocada (por exemplo, promotores, realÁadores, regiões nbo traduzidas 5’ ou 3’, sequências de sinal de recomOinaçbo apropriadas, etc.). Por exemplo, em várias modalidades, a substituição È uma substituição de uma sequíncia endógena no lugar de uma sequíncia heteróloga que resulta na produção de um produto genÈtico da sequíncia de DNA assim colocada (compreendendo a sequíncia heteróloga), mas não a expressão da sequíncia endógena; a substituição È de uma sequíncia genômica endógena com uma sequíncia de DNA que codifica uma proteína que tem uma função similar como uma proteína codificada pela sequíncia genômica endógena (por exemplo, a sequíncia genômica endógena codifica um gene ou domínio de imunoglobulina, e o fragmento de DNA codifica um ou mais genes ou domínios de imunoglobulina humanos). Em várias modalidades, um gene endógeno ou fragmento deste È substituído com um gene humano correspondente ou fragmento deste. Um gene humano correspondente ou fragmento deste È um gene humano ou fragmento que È um ortólogo de, um homólogo de, ou È substancialmente idíntico ou o mesmo em estrutura e/ou função, como o gene endógeno ou fragmento deste que È substituído.

[00305] O camundongo como um modelo genÈtico foi muito reatado por tecnologias transgínicas e de silenciamento, que tím levado em consideração o estudo dos efeitos da superexpressão ou supressão direcionada de genes específicos. Apesar de todas as suas vantagens, o camundongo ainda apresenta obstáculos genÈticos que o torna um modelo imperfeito para doenÁas humanas e uma plataforma imperfeita para testar produtos terapíuticos humanos ou fabricá-los. Primeiro, embora cerca de 99% dos genes humanos tenham um homólogo de camundongo (Waterston tt a2. 2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 400:500 - 560), produtos terapíuticos potenciais frequentemente falham a reagir cruzado, ou reagir cruzado inadequadamente, com ortólogos de camundongo dos alvos humanos intencionados. Para evitar este problema, genes alvos selecionados podem ser “humanizados,” isto é, o gene de camundongo pode ser eliminado e substituído pela sequíncia de gene ortóloga humana correspondente (por exemplo, US 6.586.051, US 6.596.541 e US 7.105.348). Inicialmente, esforços para humanizar os genes do camundongo por uma estratégia de “humanização de silenciamento-mais-transgênica” acarretaram no cruzamento de um camundongo que carrega uma supressão (isto È, silenciamento) do gene endógeno com um camundongo que carrega um transgene humano aleatoriamente integrado (ver, por exemplo, Bril tt al., 0006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, TUromb Haomost 95:341 - 347; Homanics et aL, 0066, PodUccOion and haracceeriaaOion ff murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jmisaiea a/., 0066, A UumanizndBAC aanggamc/OnokOout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(33:309 - ISpami et al., 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta- deficient mice, MoI Immnnal 43:4741 - 10)0). Mas estes esfooços foram dificultados por limitaçles de tamanho; tecnologias de silenciamento convencionais não foram suficientes para substituir diretamente genes de camundongo grandes com suas contrapartes genômicas humanas grandes. Um mÈtodo direto de substituiç„o homóloga direta, em que um gene de camundongo endógeno È diretamente substituído pelo gene da contraparte humana no mesmo local genÈtico preciso do gene de camundongo (isto È, no loco do camundongo endógeno), È raramente tentado por causa de dificuldades tÈcnicas. AtÈ agora, esforços na substituiç„o direta envolveram procedimentos elaborados e onerosos, limitando assim o comprimento do material genÈtico que pode ser manejado e a precisão com que ele pode ser manipulado.

[00306] Transgenes de imunoglobulina humana exogenamente introduzidos rearranjam em cÈlulas B precursoras em camundongos (Alt et el., -981, Immunoglobulin genes in transgenic mice, reedCs Genet 2:231 - 236). Esta descoberta foi explorada engenheirando-se camundongos usando o mÈtodo de silenciamento-mais-traosgínico para expressar anticorpos humanos (Green et al., 9941. Antigen-specific human monodonal Mitibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13 - 21; Lonberg et al,, 1994, Antigen-specitic human soltibodies room mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 381:856 - 859; Jakobovits et al., 2077, room XOUOMOUSC eccliiiolggy to pamtomumab, tlie first fully human antibody product from transgenic mice, NaB Biotcchnol 25:1134 - 1143). Os Oocos de cadeia pesada e cadeia leve K de mmunoobobunina de camundongo foram inativados nestes camundongos por supressão alvejada de porçles pequenas mas críticas de cada loco endógeno, seguido por introdução de locos de gene de imunoglobulina humana como transgenes grandes aleatoriamente integrados, como descrito acima, ou minicromossomos (Tomizuka et al., 22000, Double trnss-chromosomic miee: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, NASS USA 97:722 - 727). Tais camundongos representaram um avanÁo importante na engenharia genÈtica; anticorpos monoclonais completamente humanos isolados dos mesmos produziram potencial terapíutico promissor para tratar uma variedade de doenças humanas (Gibson et al., 2006, Randomized [hiau III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29 -311; Jkoobovit ret al., 2007K Imre el al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(115:4655 - 6L; Lonber2, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechno2 255:1117 - 1145^ Ma^^it et al., 2OO2, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Srrg Oncol 1.2:140- 1 10;6:VlcClueg at a/., 26,06, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, Nww Engl J Med 225-4^821 - 821)). Ma,, como debatido fcimo, ettes aamundongos exibem desenvolvimento de cÈlula B comprometido e imunodeficiincias quando comparados a camundongos do tipo selvagem. Tais problemas potencialmente limitam a capacidade dos camundongos de suportarem uma resposta humoral vigorosa e, consequentemente, geram anticorpos completamente humanos contra alguns antígenos. As deficiíncias podem ser devido à funcionalidade ineficiente devido à introdução aleatória dos transgenes de imunoglobulina humana e expressão incorreta resultante devido a uma caríncia de elementos de controle a montante e a jusante (Garrett ttal., 2005, Chromatin architecture near a potential 3' end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cod Bio I 25:1511 - 1525; Man is et al., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region, Mol Immunol 69:553 - 600; Pawlitkyy ee al., 2006, Identiftcanion of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immon11 176:6839 - 6851), interações interespÈcies ineficientes entre domínios constantes humanos e componentes do camundongo do complexo de sinalizat„o do receptor de cÈlula B sobre a superfície da cÈlula, que podem prejudicar processos de sinalizat„o necessários para a maturat„o, proliferat„o, e sobrevivíncia normais das cÈlulas B (Hombach tt al ,, 1990, Molecu^ components ff the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:060 7 262e, e eraerações interespÈcies ineficientes entre imunoglobulinas humanas solúveis e receptores Fc de camundongo que poderiam reduzir a selet„o de afinidade (Rao tt al., 0052, Differential expeesiinn ff hhe inliiliilfy ggG cc eeeepoor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high- affinity B cells, J Immno()1 669:1659 1 1868e c aenaentiaeõessCpicas de imunoglobulina (Brambell tt aL, 6664, A TÇafçetiaal Model oi’Gammii- Globulin Catabolism, Nature 003:1252 1 1264J JnnnPansaod Aodetaan, 6666, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin- containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5112 1 5516; Rao tt aL, 005;; Hellm et al., 00006, Antibfdy-mediated regulatifo ff tire immune response, Ceand J Immuno1 64:177 1 -64 N NimmHPfnnnaodRavetnll, 2007, Fc-receptors as regulators of immunity, AVx Immuno6 96:179 , 0204). Estas deficiíncias podem ser corrigidas por humanização m stua apenad das regiles variáveis dos locos de imunoglobulina de camundongo dentro de seus locais naturais nos locos de cadeia pesada e leve endógenos. Isto eficazmente resultaria em camundongos que fabricam anticorpos “quiméricos reversos” (isto È, humano V:camundongo C) que seriam capazes de interaÁies normais e seleção com o ambiente do camundongo com base em manter as regiles constantes do camundongo. Tomando este mÈtodo, uma versão particular de um loco humanizado pode ser construída com base na complexidade do loco quimÈrico que È desejado. AlÈm disso, tais anticorpos quimÈricos reversos podem ser facilmente reformados em anticorpos completamente humanos para propósitos terapíuticos.

[00307] Animais geneticamente modificados que compreendem uma inserç„o ou uma substituição no loco de cadeia pesada de imunoglobulina endógena com sequíncias de imunoglobulina heteróloga (por exemplo, de uma outra espÈcie) podem ser preparados em combinação com inserçles ou substituiÁies em locos de cadeia leve de imunoglobulina endógena ou em combinação com transgenes de cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, transgenes de cadeia leve de imunoglobulina quimÈrica ou completamente humanos completamente de camundongo, etc.). As espÈcies das quais as sequíncias de cadeia pesada de imunoglobulina heteróloga são derivadas podem variar amplamente; como com sequíncias de cadeia leve de imunoglobulina utilizadas em substituiÁies de sequíncia de cadeia leve de imunoglobulina ou transgenes de cadeia leve de imunoglobulina. Sequíncias de cadeia pesada de imunoglobulina heteróloga exemplares incluem sequíncia humanas.

[00308] Sequíncias de •cido nucleico de região variável de imunoglobulina, por exemplo, os segmentos V, D, e/ou J, são em várias modalidades obtidas de um ser humano ou um animal não humano. Animais não humanos adequados para fornecer os segmentos V, D, e/ou J incluem, por exemplo osteíctes, condrictes tais como tubarles e arraias, anfíbios, rÈpteis, mamíferos, aves (por exemplo, galinhas). Animais não humanos incluem, por exemplo, mamíferos. Mamíferos incluem, por exemplo, primatas não humanos, cabras, ovelhas, porcos, cachorros, bovinos (por exemplo, vaca, touro, búfalo), cervos, camelos, furles e roedores e primatas não humanos (por exemplo, chimpanzÈs, orangotangos, gorilas, saguis, macacos-resos, babuínos). Animais não humanos adequados são selecionados da família de roedores incluindo ratos, camundongos, e hamsteres. Em uma modalidade, os animais não humanos são camundongos. Conforme claro a partir do contexto, vários animais não humanos podem ser usados como fontes de domínios variáveis ou segmentos de gene de região variável (por exemplo, tubarles, arraias, mamíferos, por exemplo, camelos, roedores tais como camundongos e ratos).

[00309] De acordo com o contexto, animais não humanos são tambÈm usados como fontes de sequíncias de região constante a serem usadas em relação a sequíncias variáveis ou segmentos, por exemplo, sequíncias constantes de roedor podem ser usadas em transgenes operavelmente ligados a sequíncias variáveis humanas ou não humanas (por exemplo, sequíncias variáveis de primata humano ou não humano operavelmente ligadas a, por exemplo, roedor, por exemplo, camundongo ou rato ou hamster, sequíncias constantes). Assim, em varias modalidades, segmentos V, D, e/ou J humanos são operavelmente ligados a sequíncias de gene de região constante de roedor (por exemplo, camundongo ou rato ou hamster). Em algumas modalidades, os segmentos V, D, e/ou J humanos (ou um ou mais genes VDJ ou VJ rearranjados) são operavelmente ligados ou fundidos a uma sequíncia de gene de região constante de camundongo, rato, ou hamster em, por exemplo, um transgene integrado em um loco que não È um loco de imunoglobulina endógena.

[00310] Em uma modalidade específica, um camundongo È fornecido que compreende uma substituÍção de segmentos de gene VH, DH, e JH em um loco de cadeia pesada de imunoglobulina endógena com um unia) VH humano, um ou mais DH, e um ou mais segmentos de gene JH, em que o uníco VH humano, um ou mais DH, e um ou mais segmentos de gene JH são operavelmente ligados a um gene de cadeia pesada de imunoglobulina endógena; em que o camundongo compreende um transgene em um loco exceto um loco de imunoglobulina endógena, em que o transgene compreende um segmento de gene VL humano e JL humano não rearranjado ou rearranjado operavelmente ligado a uma região constante de camundongo ou rato ou humana. Em varias modalidades, o uníco segmento cie gene VH humano È um segmento de gene polimórfico. Em uma modalidade, o único segmento de gene VH humano È um segmento de gene VH1-69 humano ou um segmento de gene VH1-2 humano.

[00311] Um mÈtodo para uma substituição genÈtica m ituu do loco de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa de camundongo com um loco de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinativa humana restrita e substituição dos locos de gene variável de cadeia leve K de muiuiioolobuliiia de linha germinativd dccamundongo com locos de cadeia leve d de imuiioglmleuiina de linha gmimiiiativa liuniana. enquanto mantendo a capacidade do camundongo de gerar descendíncia, È descrito. Especificamente, a substituição precisa de seis megabases tanto dos locos de gene variável de imunoglobulina de cadeia pesada quanto de cadeia leve K decemudOunoouom squuUllcias decadeia pesada e leve K Oumanas de imunoglobulina, enquanto deixando as regiles constantes de camundongo intactas, È descrita. Como um resultado, camundongos foram criados que tím uma substituição precisa de seu repertório variável de imunoglobulina de linha germinativa inteiro com sequíncias variáveis de imunoglobulina de linha germinativa humana, enquanto mantendo as regiles constantes de camundongo. As regiles variáveis humanas são ligadas a regiles constantes de camundongo para formar locos de imunoglobulina humana e de camundongo quimÈrica que rearranjam e expressam em níveis fisiologicamente apropriados. Os anticorpos expressados são “quimeras reversos,” isto é, eles compreendem sequências de região variável humanas e sequíncias de região constante de camundongo.

[00312] Os camundongos geneticamente modificados descritos aqui exibem um sistema imune humoral completamente funcional e fornecem uma fonte abundante de sequíncias de região variável de imunoglobulina humana naturalmente amadurecidas por afinidade para fabricar anticorpos farmaceuticamente aceitáveis e outras proteínas de ligação a antígeno que são eficazes para combater antígenos patogínicos, por exemplo, antígenos virais.

[00313] A engenharia de sequíncias de imunoglobulina humana no genoma de um camundongo, mesmo em locais precisos, por exemplo, nos locos de imunoglobulina endógena de camundongo, pode apresentar certos desafios devido à evolução divergente dos locos de imunoglobulina entre o camundongo e o ser humano. Por exemplo, sequíncias intergínicas interpostas dentro dos locos de imunoglobulina não são idínticas entre camundongos e seres humanos e, em algumas circunstâncias, podem não ser funcionalmente equivalentes. DiferenÁas entre camundongos e seres humanos em seus locos de imunoglobulina ainda podem resultar em anormalidades em camundongos humanizados, particularmente quando da humanização ou manipulação de certas porçies de locos de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de camundongo. Algumas modificaÁies em locos de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo são deletÈrias. ModificaÁies deletÈrias podem incluir, por exemplo, perda da capacidade dos camundongos modificados de acasalar e produzir descendíncia. Em várias modalidades, as sequíncias de imunoglobulina humana engenheiradas no genoma de um camundongo incluem mÈtodos que mantím sequíncias endógenas que quando ausentes em cepas de camundongo modificadas são deletÈrias. Efeitos deletÈrios exemplares podem incluir incapacidade de propagar cepas modificadas, perda da função de genes essenciais, incapacidade de expressar polipeptídeos, etc. Tais efeitos deletÈrios podem ser direta ou indiretamente relacionados à modificação engenheirada no genoma do camundongo.

[00314] não obstante da íunçào imune humoral quase do tipo selvagem observada em camundongos com locos de imunoglobulina humanizados, existem outros desafios encontrados quando da utilização de uma substituição direta de sequíncias de imunoglobulina que não È encontrada em alguns mÈtodos que utilizam transgenes aleatoriamente integrados. As diferenÁas na composição genÈtica dos locos de imunoglobulina entre camundongos e seres humanos tem levado à descoberta de sequíncias benÈficas para a propagação de camundongos com segmentos de gene de imunoglobulina substituídos. Especificamente, genes ADAM de camundongo localizados dentro do loco de imunoglobulina endógena est„o idealmente presentes em camundongos com locos de imunoglobulina substituídos, devido ao seu papel na fertilidade.

[00315] Uma substituição m siUu, precisa de seis megabases das regiões variáveis dos locos de imunoglobulina de cadeia pesada de camundongo (VH- DH-JH) com um loco de cadeia pesada de imunoglobulina humana restrito foi realizada, enquanto deixando as sequíncias de camundongo de franqueamento intactas e funcionais dentro dos locos híbridos, incluindo todos os genes de cadeia constante de camundongo e regiões de controle transcricional de loco (FIG. 1 e FIG. 8). Outras etapas da engenharia foram realizadas para manter sequíncias de camundongo que conferem no camundongo a capacidade de acasalar e produzir descendÍncia em uma maneira comparável a um camundongo do tipo selvagem (FIG. 9 e FIG. 10). Especificamente, um único VH humano, 27 DH, e seis segmentos de gene JH e genes ADAM6 de camundongo foram introduzidos atravÈs de vetores de alvejamento de BAC quimÈrico em cÈlulas ES de camundongo usando a tecnologia de engenharia genÈtica VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Pat. US No 6.586.251 e Valenzuela tt al., 2003. Iligli-tlirougliput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659). Camundongos com Segmentos de Gene Variáveis de Cadeia Pesada de Imunoglobulina Restritos

[00316] Animais não humanos compreendendo locos de imunoglobulina que compreendem um número restrito de genes VH, e um ou mais genes D e um ou mais genes J, são fornecidos, como são os mÈtodos de fabrica-los e usa-los. Quando imunizados com um antígeno de interesse, os animais não humanos geram populaçles de cÈlula B com regiles variáveis de anticorpo derivadas apenas do gene VH prÈ-selecionado, restrito ou conjunto de genes VH (por exemplo, um gene VH prÈ-selecionado e variantes deste). Em várias modalidades, animais não humanos são fornecidos que geram populaçles de cÈlula B que expressam domínios variáveis de anticorpo humano que são domínios variáveis de cadeia pesada humanos, junto com domínios variáveis de cadeia leve humanos cognatos. Em várias modalidades, os animais não humanos rearranjam segmentos de gene variáveis de cadeia pesada humanos e segmentos de gene variáveis de cadeia leve humanos a partir de locos de imunoglobulina endógena de camundongo modificados que compreendem uma substituição ou inserç„o das sequíncias de região variável não rearranjadas não humanas com sequíncias de região variável não rearranjadas humanas.

[00317] Trabalho inicial sobre a organização, estrutura, e Ounção dos genes de imunoglobulina foi feito em parte em camundongos com locos endógenos incapacitados e engenheirado para ter locos transginicos (aleatoriamente colocados) com genes de imunoglobulina humana parciais, por exemplo, um repertório parcial de genes de cadeia pesada humanos ligado com um gene constante humano, aleatoriamente inserido no genoma, na presenÁa ou ausíncia de um transgene de cadeia leve humano. Embora estes camundongos fossem um pouco menos do que ideais para fabricar anticorpos de afinidade alta iríeis, eles facilitaram certas analises fimcionais de locos de imunoglobulina. Alguns destes camundongos tiveram t„o pouco quanto dois ou trís, ou ainda apenas um único gene vaiiavcl de cadea pesada.

[00318] Os camundongos que expressam completamente cadeias pesadas de imunoglobulina humana derivados de um rimco gene VH5-51 humano e 10 genes DH humanos e seis genes JH humanos, com os genes constantes µ e yl, em mi tensggnne aleatoriamente mserdOo Oooos ee imunoglobulina endógena incapacitados) foram relatados (Xu and Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37 - 45). As cadeias pasadas de imunoolobulma completamente humana destes camundongos são principalmente expressadas com uma de apenas duas cadeias leves c completamente dc camcndgngo derivadas do loco de cadeia leve X dc ccmundongo enclogcno(\'/.l-.l/J ou V\2-J\2 epenes), e podem expressar nenhuma oedeie leve o (os camundongos são IgK-/-). Estes camundongos exibem disfunção severamente anormal no desenvolvimento de cÈlula B e expressão de anticorpo. Números de cÈlula B são supostamente 5 a 10% de níveis de IgM do tipo selvagem, 5 a 10% do tipo selvagem, e níveis de IgG1 são apenas 0,1 a 1% do tipo selvagem. O repertório de IgM observado revelou diversidade juncional altamente restrita. As cadeias pesadas completamente humanas exibem comprimento de CDR3 basicamente idíntico atravÈs dos antígenos, o mesmo uso de JH (JH2) atravÈs dos antígenos, e um resíduo Q juncional inicial, assim refletindo uma certa caríncia de diversidade de CDR3. Quase todas as cadeias leves ü ccmgiatcmclltc dc ccmundongo tevarmn mms substituição dw W96L em J\1 como resíduo juncional inicial. Os camundongos são supostamente incapazes de gerar quaisquer anticorpos contra polissacarídeo bacteriano. Porque os domínios variáveis humanos acoplam com cadeias leves de camundongo, a utilidade das regiles variáveis humanas È altamente limitada.

[00319] Outros camundongos que tím apenas um único gene VH3-23 humano, genes DH e JH humanos, e genes de cadeia leve de camundongo foram relatados, mas eles exibem uma diversidade limitada (e assim uma utilidade limitada) devido em parte ao potencial de desemparelhamento entre os domínios de VH humano e VL de camundongo (ver, por exemplo, Mageed et al., 2001, Rarrsnegemgnt of the humni heavy chain variable region gnne V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region, Ciin. Xppi Immunol. 123:1 5 5).SimilarmenteiCmnundonoos que portam dois genes VH (3-23 e 6-1) junto com genes DH e JH humanos em um transgene contendo o gene constante µ humano (Bruggemann et aL, 1991, Human antibody production in transgenic mice: expression from 100kb of the human IgH locus, Eur. J. Immmuna 1 21:2323 - 1326e e oe expressam em cadeias de IgM humanas com cadeias leves de camundongo podem exibir um repertório limitado por desemparelhamento (Mackworth-Young et al., 2003, The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene, Clin. Exp. Immunol, 134:220 - 225).

[00320] Outros camundongos transgínicos que expressam cadeias pesadas completamente humanas restritas de VH de um transgene humano aleatoriamente inserido no genoma, com um repertório humano X mitaitodo expressado a partir de um transgene completamente humano aleatoriamente inserido, tambÈm foram relatados (ver, por exemplo, Taylor et al,, 1292, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic AcdS Rees. 20123):2277 - 2925; Wggner et al., 9994, Aniieoclies gneraated oorm huasgn immunoglobulin mmlioai m transgenic mice, Nueleic Acids Rs2 82^2138089 - 3393E. EnSgaianto, camundongos transgínicos que expressam anticorpos completamente humanos a partir de transgenes aleatoriamente integrados no genoma do camundongo, e que compreendem locos endógenos danificados, são conhecidos exibir diferenÁas substanciais em resposta imune quando comparado com camundongos do tipo selvagem que afetam a diversidade dos domínios variáveis de anticorpo obteníveis de tais camundongos.

[00321] Animais não humanos úteis que geram imai populaeào diversa de cÈlulas B que expressam domínios variáveis de anticorpo humano a partir de um repertório de gene VH restrito e um ou mais genes D e um ou mais genes J ser„o capazes de gerar, preferivelmente em algumas modalidades, repertórios de genes de região variável rearranjados que ser„o suficientemente diversos. Em várias modalidades, a diversidade inclui diversidade juncional, hipermutação somática, e diversidade polimórfica em sequíncia de gene VH (para modalidades onde genes VH est„o presentes em formas polimórficas). A diversidade combinatória ocorre no pareamento do gene VH com um de uma pluralidade de domínios variáveis de cadeia leve humanos cognatos (que, em várias modalidades, compreendem diversidade juncional e/ou hipermutaÁies somáticas).

[00322] Animais não humanos compreendendo um repertório de gene VH humano restrito e um repertório de gene VL humano completo ou substancialmente completo em várias modalidades gerar„o populaÁies de cÈlulas B que refletem as várias fontes de diversidade, tais como diversidade juncional (por exemplo, VDJ, junção de VJ, adiÁies de P, adiÁies de N), diversidade combinatória (por exemplo, pesada humana restrita de VH cognato, leve humana), e hipermutaÁies somáticas. Em modalidades compreendendo uma restrição do repertório de VH a um gene VH humano, o único gene VH humano pode estar presente em duas ou mais variantes. Em várias modalidades, a presenÁa de duas ou mais formas polimórficas de um gene VH enriquecera a diversidade dos domínios variáveis da população de cÈlula B.

[00323] VariaÁies nas sequíncias de linha germinativa de segmentos de gene (por exemplo, genes V) contribuem para a diversidade da resposta do anticorpo em seres humanos. A contribuição relativa para a diversidade devido às diferenÁas de sequíncia de gene V varia entre os genes V. O grau de polimorfismo varia atravÈs de famílias de genes, e È refletido em uma pluralidade de haplótipos (alongamentos de sequíncia com polimorfismos co- heredit^rios) capazes de gerar mais diversidade como observado em diferenÁas de haplótipo de VH entre indivíduos relacionados e não relacionados na população humana (ver, por exemplo, Souroujon tt al., 9989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the VHIII Gene Family, J. Immunol. 13322):0O6 -71)). Algnns sugerirmn,com baseemdados de famílias de genes VH humanos particularmente polimórficas, que a diversidade de haplótipo na linha germinativa È um principal contribuinte para a heterogeneidade de gene VH na população humana, que È refletido na grande diversidade de genes VH de linha germinativa diferente atravÈs da população humana (ver, Sasso tt al,, 889O.Prevelence £mdP<^] [mn(^ih)iimn of Human VH3 Genes, J Immunol, 15588):2551 - 2557).

[00324] Embora a população humana exiba uma grande diversidade de haplótipos em relação ao repertório de gene VH devido ao polimorfismo muito difundido, certos polimorfismos são refletidos em alelos prevalecentes (isto È, conservados) observados na população humana (Sasso et al., 8800). O polimorfismo de VH pode ser descrito em duas formas principais. A primeira È a variação que surge da variação alÈlica associada com diferenÁas entre a sequíncia de nucleotídeo entre alelos do mesmo segmento de gene. O segundo surge das numerosas duplicaÁies, inserçies, e/ou supressles que ocorreram no loco de cadeia pesada de imunoglobulina. Isto tem resultado na situação única em que U^<JIC^S VH derivados por duplicação de genes idínticos diferem de seus alelos respectivos por uma ou mais substituiÁies de nucleotídeo. Isto tambÈm diretamente influencia o número de cópia de genes VH no loco de cadeia pesada.

[00325] Alelos polimórficos dos segmentos de gene variáveis de cadeia pesada (genes VH) de imunoglobulina humana foram basicamente o resultado de inserç„o/supressão de segmentos de gene e diferenÁas de nucleotídeo únicas dentro das regiles de codificação, ambas as quais tím o potencial para ter consequíncias funcionais sobre a molÈcula de imunoglobulina. A Tabela 1 apresenta os genes VH funcionais listados pela família de gene VH humano e pelo número de alelos identificados para cada gene VH no loco de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Existem algumas descobertas para sugerir que genes VH polimórficos foram implicados na suscetibilidade a certas doenÁas tais como, por exemplo, artrite reumatoide, ao passo que em outros casos uma ligação entre VH e doenÁa foi menos clara. Esta ambiguidade foi atribuída ao número de cópia e presenÁa de vários alelos em diferentes populaÁies humanas. De fato, vários genes VH humanos demonstram variação de número de cópia (por exemplo, VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, e VH3- 23). Em várias modalidades, camundongos humanizados como descrito aqui com repertórios de VH restritos compreendem variantes polimórficas múltiplas de um membro da família de VH individual (por exemplo, duas ou mais variantes polimórficas de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ou VH3-23, substituindo todos ou substancialmente todos os segmentos de VH de camundongo funcionais em um loco de camundongo endógeno). Em uma modalidade específica, as duas ou mais variantes polimórficas de camundongos descritos aqui são em número atÈ e incluindo o número indicado para o membro da família de VH correspondente na Tabela 1 (por exemplo, para VH1-69, 13 variantes; para VH1-2, cinco variantes; etc.).

[00326] Variantes comumente observadas de genes VH humanos particulares são conhecidas na tÈcnica. Por exemplo, um dos polimorfismos mais complexos no loco de VH pertence ao gene VH1-69. O gene VH1-69 humano tem 13 alelos relatados (Sasso tt a/., 1993, A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set of alleles, Oormal ff Clinical Investigation 61:2588-2677; assoo et al, 16,6, Exesesoion of the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional tn its germline gene copy number, Journal ff Clintcal Investigation 97(9-:0O74-0O8Ot eexietemn polo menos tris haplótipos que carregam duplicaÁies do gene VH1-69, que resulta em cópias múltiplas do gene VH em um loco dado. Estes alelos polimórficos incluem diferenÁas nas regiles determinantes de complementaridade (CDRs), que podem influenciar dramaticamente a especificidade do antígeno. A Tabela 2 apresenta os alelos relatados para os genes VH1-69 humanos e VH1-2 humanos e as SEQ ID NOs para as sequíncias de DNA e proteína das regiles variáveis de cadeia pesada maduras.

[00327] Sequíncias de DNA genômico e de proteína de tamanho natural representativas de um gene VH1-69 são apresentadas na SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente. A FIG. 5 e FIG. 6 apresentaram alinhamentos de DNA e proteína de treze alelos de VH1-69 relatados, respectivamente. Sequíncias de DNA e proteína representativas de um gene VH1-2 são apresentadas na SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64, respectivamente. A FIG. 8 e FIG. 9 apresentaram alinhamentos de DNA e proteína de cinco alelos de VH1-2 relatados, respectivamente. A FIG. 7 e FIG. 10 apresentaram uma porcentagem de matriz de identidade/similaridade para sequíncias de proteína alinhadas correspondendo a treze alelos de VH1-69 humanos relatados e cinco alelos de VH1-2 humanos relatados, respectivamente. Em várias modalidades, o loco modificado da invenção compreende um gene VH selecionado da Tabela 1, presente em dois ou mais números de cópia, em que o número de cópia inclui atÈ e incluindo o número de alelos mostrado na Tabela 1. Em uma modalidade, o loco modificado da invenção compreende um gene VH1-69 ou VH1-2 selecionado da Tabela 2, presente em dois ou mais números de cópia, em que o número de cópia inclui atÈ e incluindo o número de alelos mostrado na Tabela 1.

Uso de Gene Variável de Cadeia Pesada Dependente de Antígeno

[00328] O uso preferencial dependente de antígeno de genes VH pode ser explorado no desenvolvimento de produtos terapíuticos humanos alvejando antígenos clinicamente significantes. A capacidade de gerar um repertório de domínios variáveis de anticorpo usando um gene VH particular pode fornecer uma vantagem significante na pesquisa por domínios variáveis de anticorpo de afinidade alta para usar em produtos terapíuticos humanos. Estudos sobre o uso de gene VH de camundongo ingínuo e humano em domínios variáveis de anticorpo revelam que na maioria de domínios variáveis de cadeia pesada não são derivados de qualquer gene VH particularmente único ou dominnitemente usado. lo^n outro lado, estudos da resposta do anticorpo a certos antígenos revelam que em alguns casos uma resposta do anticorpo particular exibe um uso tendencioso de um gene VH particular no repertório de cÈlula B a seguir da imunização.

[00329] Embora o repertório de VH humano seja bastante diverso, atÈ certo grau estima-se que a frequíncia esperada do uso de qualquer gene VH dado, assumindo a seleção aleatória de genes VH, È cerca de 2% (Brezinschek et al., 9955, Anaalysis of the Heavy Cham Repertore of Human Jeisrpjlurral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, J. Immunol. 155:190 - 202). Mas o uso de VH em cÈlulas B perifÈricas em seres humanos È tendencioso. Em um estudo, a abund,ncia de gene V funcional seguiu o padr„o VH3 > VH4 > VH1 > VH2 > VH5 > VH6 (Davidkova et al.. 1797, Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62 - 73.. Um estudo inicial estimou que a frequência de uso da família de VH3 foi cerca de 0,65, ao passo que a frequência de uso da família de VH1 foi cerca de 0,15; estas e outras observaÁies sugerem que a complexidade da linha germinativa do repertório de VH humano não È precisamente refletida no compartimento de cÈlula B perifÈrico em seres humanos que têm uma repertório de VH de linha germinativa normal, uma situação que È similar àquela observada no camundongo - isto È, expressão de gene VH È não estocastica (Zouali and These, 1991, Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by in Situ Hybridiaation, J.litmonol. 946(8):2899 - 2864). De acordo com um relato, o uso do gene VH em seres humanos, do maior ao menor, È VH3 > VH4 > VH1 > VH5 > VH2 > VH6; rearranjos em cÈlulas B perifÈricas revelam que o uso da família de VH3 È mais alto do que deve ser esperado com base no número relativo de genes VH3 de linha germinativa (Brezinschek et al.. 1995). Deccordocom mo ouoo relato, o uso de VH em seres humanos segue o padr„o VH3 > VH9 > VH2 > VH1 > VH4 > VH6, com base na analise de cÈlulas B imunocompetentes pequenas perifÈricas ativadas por mitógeno de erva-dos-cancros (Davidkova ei al., 1997, Seecctive Uaage of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immuno.. 45:62 - 3)3). ün t'cloto afirmq queenero os membros da família de VH3 mais frequentemente usados são 3-23, 3-30 e 394 (Brezinschek et al.. 1995). NO mmCbd de VH4, os membros 4-99 e 4-4b foram descobertos relativamente mais frequentemente (Id.), assim como 4-39 e 4-34 (Brezinscheck et a-997, Analssis of the I Hunan VH Gene Repertoire, J. Clin. inese9 99()0):2488 - 92501). Ouosos pseosupOem quo o repertório de cadeia pesada ativado È tendencioso em favor da expressão de VH9 alta e expressão de VH3 mais baixa (Van Dijk-Hard and Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Imannogygy 107:136-144). Outros estudos afirmam que o gene VH o mais comumente usado no repertório humano adulto È VH4-59, seguido por VH3-23 e VH3-48 (Arnaout tt al., 0001, High-Resolution Description f f Antiboyy Havyy-Chain Repertoires io Humans, LOsS NEE 6(8)008). Embora estodos de usosajam fundamentados em números de amostra relativameote pequenos e assim exibem vari,nsia alta, tomados juntos os estudos sugerem que a expressão do gene V não È puramente estos^stisa. De fato, estudos som antígenos particulares estabeleceram que - em sertos sasos - o sonjunto È firmemente empilhado sontra sertos usos e em favor de outros.

[00330] Com o passar do tempo, torna-se evidente que o repertório observado de domínios variáveis de sadeia pesada humanos gerados em resposta a sertos antígenos È altamente restrito. Alguns antígenos são assosiados quase exslusivamente som antisorpos neutralizantes tendo apenas sertos genes VH partisulares, no sentido de que antisorpos neutralizantes efisazes são derivados de essensialmente apenas um gene VH. Tal È o saso para vários patógenos humanos slinisamente importantes.

[00331] Cadeias pesadas derivadas de VH1-69 foram observadas em uma variedade de repertórios de antisorpo espesífisos de antígeno de signifis,nsia terapíutisa. Por exemplo, VH1-69 foi frequentemente observado em transsritos de sadeia pesada de um repertório de IgE de linfósitos sanguíneos perifÈrisos em srianÁas jovens som doenÁa atópisa (Bando tt al., 2004, Charasterization of VHO gene expressed in PBL from children with atopis diseases: detestion of homologous VH1-69 derived transsripts from three unrelated patients, Immunaloy eettrrs 99:99 - 0106). Cadaiap pedadas derivadas de VH1-69 som um grau alto de hipermutação som^tisa tambÈm osorrem em linfomas de sÈlula B (Perez et al., 2D09, Primaty cutaoiK B- sell lymphoma is assosiated with somatisally hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of VH1-69 and VH4-59 segments, Beitish Jourual of Dermatolooy !62:611 - 61)!), oo assoo uee aicEmas aadeaas pesadas derivadas de VH1-69 som sequinsias essensialmente de linha germinativa (isto È, pouca ou nenhuma hipermutação somática) foram observadas entre autoanticorpos em pacientes com transtornos sanguíneos (Pos et aL, 0008, anticorpos coiliíiaaclos por linha gernnnativa de VH1-69 dirigidos para ADAMTS13 em pacientes com púrpura trombocitopínica trombótica adquirida, Journal ffhhrombssis and Haemostasis 7:221 - 40)» ).

[00332] AlÈm disso, anticorpos neutralizantes contra antígenos virais tais como HIV, influenza e hepatite C (HCV) foram descobertos utilizar sequíncias derivadas de VH1-69 de linha germinativa e/ou somaticamente mutadas (Miklos et al2 0000, Salivaiy gndnd mnohsa-ansociaOed lymohdid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of K7-99 with distinctive CDR3 features, Blood 35(14):5070 - 3004; Kunert et a000,, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in ehro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research rnd Human Rrtroxiruse2 27)7):755 - 764; Chan et aL, 000,, VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E4 viral antigen, Blrn3 7(0)4-141023 - 1026;Carbonisi at a2, 0705, Hapatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VH1-69-expressing memory B cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal fflmmarolggy 104:7532-7539; Wang addPalese, 4009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nrtsre Sirrrirrat & Mrtsrrtar Biology -6(3::2533234; Sus et c^l., 2009, 0tructnral and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Natuse Strrctuaal & Molrrutar Biolggy 16(33:263-273; Marasca et al.( ^001,hmmunoglc4riiHn Gene MutiltionSimdFrequent Uso of VH1-63 and VH0-50 Segments in Hepatitis C Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Um. J. Palhol. 153(1):455-461).

[00333] A tendíncia de uso de VH tambÈm È observada na resposta imune humoral a Haemiophilus influeneae Poo b( I libP)')mm eersh Uumnnos. Estudos sugerem que a família de VHIII (a subfamília de VuIIIb em particular, VH9,1) exclusivamente caracteriza a resposta humoral humana a Hib PS, com genes D e J diversos (Adderson st al., 199l. Addr.sonn et a 1., 199R,ResPicted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilias influenzae Type b (appuular Polysachhrride, J.emmunol. 747(5): 1667-7674; Adderson et al1 1993, Respited Immunoblobuliii VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilias influnzeae Type b Capsular Polysaccharide, a. Ciin inesst 91:2734-2743). Genes JH humanos tambÈm exibem uso tendencioso; JH4 e JH6 são observados em torno de 38 a 41% em cÈlulas B perifÈricas em seres humanos (Brezinschek st al., 199)5).

[00334] O uso de VH em seres humanos infectados com HIV-1 È influenciado contra o uso de VH3 e em favor das famílias de genes VH1 e VH4 (Wisnewski st al., 1996, Human Anbibody a'apaeieReon'’11 Gene Usage in HIV-1 Infection, J. .-Cuaieed hemeae Defieiency yendromes & Hmmnn Retroviology 1111(311 - 38.. EnRetoito, a mnliie.' de cDNA da medida óseea de pacientes afetados revelou uso de VH3 significante não expressado no repertório de cÈlula B funcional, onde Fabs refletindo o uso de VH3 exibiu neutralização m etiioe cPcad de V-V-l(/d). dodeser pressuposto OUS a resposta imune humoral à infecção por HIV-1 È possivelmente atenuada devido à restrição de VH; animais não humanos modificados como descrito aqui (não infectáveis por HIV-1) poderiam assim ser útsis para gerar domínios de anticorpo neutralicante derivados de genes VH particulares presentes nos animais geneticamente modificados descritos aqui, mas derivados de genes VH diferentes daqueles observados no repertório restrito de seres humanos afetados.

[00335] Assim, a capacidade de gerar domínios variáveis de anticorpo humano de afinidade alta em camundongos restritos de VH, por exemplo, (restritos, por exemplo, a um membro da família de VH3 e polimorfo(s) deste) imunizados com HIV-1 poderia fornecer um recurso rico para designar produtos terapíuticos humanos neutralizantes de HIV-1 eficazes extraindo-se completamente o repertório restrito (por exemplo, restrito a um membro da família de VH3 ou variante(s) deste) de um tal camundongo imunizado.

[00336] A restrição da resposta do anticorpo humano a certos patógenos pode reduzir a probabilidade de obter regiles variáveis de anticorpo de seres humanos afetados que podem servir como trampolins para designar anticorpos neutralizantes de afinidade alta contra o patógeno. Por exemplo, a resposta imune humana à infecção por HIV-1 l clonalmente restrita por toda a infecção por HIV-1 e na progressão da AIDS (Muller tt al., 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Canddj J. Immutoil. 38:377 - 334: Wisiwwski et al., 19*66). Além disso, gnnes VH em geral não est„o presentes em todas as formas polimórficas em indivíduos; certos indivíduos em certas populaÁies possuem uma variante, ao passo que indivíduos em outras populaÁies possuem uma variante diferente. Assim, a disponibilidade de um sistema biológico que l restrito a um iinioo gnne VH e suas variantes em várias modalidades fornecera uma fonte atl agora inexplorada de diversidade para gerar regiles variáveis de anticorpo (por exemplo, domínios cognatos pesados e leves humanos) com base em um gene VH restrito.

[00337] Camundongos geneticamente modificados que expressam regiles variáveis de cadeia pesada humanas com uso de segmento de gene VH restrito são uleís para eerar mm epeeíóGi^k) gelativémsnte grande ee rei'es s variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina humana de afinidade alta juncionalmente diversas, combinatoriamente diversas, e somaticamente mutadas a partir de um repertório de outro modo restrito. Um repertório restrito, neste exemplo, refere-se a uma limitação predeterminada em genes de linha germinativa que resulta no camundongo sendo incapaz de formar um gene de cadeia pesada rearranjado que l derivado de qualquer gene V exceto um gene V prÈ-selecionado. Em modalidades que utilizam um gene V prÈ- selecionado mas não um gene D e/ou J prÈ-selecionado, o repertório È restrito em relação à identidade do gene V mas não ao gene D e/ou J. A identidade do gene V prÈ-selecionado (e quaisquer genes D e/ou J prÈ-selecionados) não È limitada a qualquer gene V particular.

[00338] Designar um camundongo de modo que ele rearranje um iiiiico gene VH (presente como um uuíco segmento ou um conjunto de amianto) com uma variedade de segmentos de gene D e J humano (por exemplo, segmentos DH e JH) fornece um mecanismo de permutação com diversidade juncional/diversidade combinatória/hipermutação somática in no o qup pode ser usado para repetir mutaÁies em sequíncias de região variável de cadeia pesada rearranjadas resultantes (por exemplo, V/D/J ou V/J, como o caso pode ser). Em um tal camundongo, o processo de seleção clonal funciona para selecionar regiles variáveis adequadas que ligam um antígeno de interesse que são fundamentadas em um umco gene VH prÈ-selecionado (ou variantes deste). Porque os componentes de seleção clonal do camundongo são dedicados à seleção com base no úmeo segmento cee gene VH prÈ-selecionado, o ruído de fundo È basicamente erradicado. Com a seleção judiciosa do segmento de gene VH, um número relativamente maior de anticorpos específicos de antígeno, clonalmente selecionados pode ser triado em um período de tempo mais curto do que com um camundongo com uma diversidade grande de segmentos V.

[00339] PrÈ-selecionar e restringir um camundongo a um úmeo segmento V fornece um sistema para permutar junÁies de V/D/J em uma taxa que È em várias modalidades mais alta do que aquela observada em camundongos que de outro modo tím atÈ 40 ou mais segmentos V para recombinar com as regiles de D e J. A remoção de outros segmentos V libera o loco para formar mais combinaÁies de V/D/J para o segmento V prÈ- selecionado do que de outro modo observado. O número aumentado de transcritos que resultam da recombinação do V prÈ-selecionado com um de uma pluralidade de segmentos D e um de uma pluralidade de segmentos J alimentara estes transcritos no sistema de seleção clonal na forma de cÈlulas prÈ-B, e o sistema de seleção clonal È assim dedicado para ciclar cÈlulas B que expressam a região de V prÈ-selecionada. Deste modo, mais regiles de V únicas derivadas do segmento V prÈ-selecionado podem ser triadas pelo organismo do que seria de outro modo possível em uma quantidade de tempo dada.

[00340] Em vários aspectos, camundongos são descritos que reajam a diversidade juncional de recombinaÁies de V/D para a região de V prÈ- selecionada, porque todas ou substancialmente todas as recombinaÁies do loco variável de cadeia pesada de imunoglobulina ser„o do segmento V prÈ- selecionado e os segmentos D e J que são colocados em tais camundongos. Portanto, os camundongos fornecem um mÈtodo para gerar uma diversidade de segmentos de CDR3 usando uma base, ou repertório de gene VH restrito.

[00341] Local e Função Genômicos de ADAM6 de Camundongo

[00342] Camundongos machos que carecem da capacidade para expressar qualquer proteína ADAM6 funcional surpreendentemente exibem um defeito na capacidade dos camundongos de acasalar e gerar descendÍncia. Os camundongos carecem da capacidade de expressar uma proteína ADAM6 funcional em virtude de uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene de região variável de imunoglobulina de camundongo com segmentos de gene de região variável humano. A perda da funeào de ADAM6 resulta porque o loco de ADAM6 esta localizado dentro de uma região do loco de gene variável de região de cadeia pesada de camundongo de imunoglobulina endógena, proximal à extremidade 3 ’ do loco de segmento de gene VH que está a montante dos segmentos de gene DH. De modo a criar camundongos que são homozigotos para uma substituição de todas ou substancialmente todas as sequíncias variáveis de cadeia pesada de camundongo endógenas com uma sequíncia de cadeia pesada humana restrita, È geralmente um mÈtodo inconveniente estabelecer machos e fêmeas que são todos homozigotos para a sequíncia de cadeia pesada humana restrita e espera-se uma cópula produtiva. Ninhadas bem sucedidas são baixas em frequíncia e tamanho. Ao contrario, machos heterozigotos para a sequíncia de cadeia pesada humana restrita foram utilizados para acasalar com fímeas homozigotas para a substituição para gerar progínies que são heterozigotas para a sequíncia de cadeia pesada humana restrita, depois um camundongo homozigoto È criado a partir desta. Os inventores determinaram que a causa provável da perda em fertilidade nos camundongos machos È a ausíncia em camundongos machos homozigotos de uma proteína ADAM6 funcional.

[00343] Em vários aspectos, camundongos machos que compreendem um gene de ADAM6 danificado (isto È, não funcional ou marginalmente funcional) exibem uma redução ou eliminação de fertilidade. Porque em camundongos (e outros roedores) o gene de ADAM6 È localizado no loco de cadeia pesada de imunoglobulina, os inventores determinaram que de modo a propagar os camundongos, ou criar e manter uma cepa de camundongos, que compreendem um loco de cadeia pesada de imunoglobulina humanizado, vários esquemas de criação ou propagação modificados são utilizados. A fertilidade baixa, ou infertilidade, de camundongo machos homozigotos para um loco de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizado torna manter uma tal modificação em uma cepa do camundongo difícil. Em varias modalidades, manter a cepa compreende evitar problemas de infertilidade exibidos por camundongos machos homozigotos para o loco de cadeia pesada humanizado.

[00344] Em um aspecto, um mÈtodo para manter uma cepa de camundongo como descrito aqui È fornecido. A cepa de camundongo não precisa compreender uma sequíncia de ADAM6 ectópica, e em varias modalidades a cepa de camundongo È homozigota ou heterozigota para um silenciamento (por exemplo, um silenciamento funcional) de ADAM6.

[00345] A cepa do camundongo compreende uma modificação de um loco de cadeia pesada de imunoglobulina endógena que resulta em uma redução ou perda na fertilidade em um camundongo macho. Em uma modalidade, a modificação compreende uma supressão de uma região reguladora e/ou uma região de codificação de um gene de ADAM6. Em uma modalidade específica, a modificação compreende uma modificação de um gene de ADAM6 endógeno (região reguladora e/ou de codificação) que reduz ou elimina a fertilidade de um camundongo macho que compreende a modificação; em uma modalidade específica, a modificação reduz ou elimina a fertilidade de um camundongo macho que È homozigoto para a modificação.

[00346] Em uma modalidade, a cepa do camundongo È homozigota ou heterozigota para um silenciamento (por exemplo, um silenciamento funcional) ou uma supressão de um gene ADAM6.

[00347] Em uma modalidade, a cepa do camundongo È mantida isolando-se de um camundongo que È homozigoto ou heterozigoto para a modificação de uma cÈlula, e utilizando a cÈlula doadora em embriles hospedeiros, e formando os embriles hospedeiros e a cÈlula doadora em uma m„e de aluguel, e obtendo da m„e de aluguel uma progínie que compreende a modificação genÈtica. Em uma modalidade, a cÈlula doadora È uma cÈlula ES. Em uma modalidade, a cÈlula doadora È uma cÈlula pluripotente, por exemplo, uma cÈlula pluripotente induzida.

[00348] Em uma modalidade, a cepa do camundongo È mantida isolando-se de um camundongo que È homozigoto ou heterozigoto para a modificação de uma sequíncia de •cido nucleico compreendendo a modificação, e introduzindo a sequíncia de •cido nucleico em um núcleo hospedeiro, e formando uma cÈlula compreendendo a sequíncia de •cido nucleico e o núcleo hospedeiro em um animal adequado. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nucleico È introduzida em um embri„o oocítico hospedeiro.

[00349] Em uma modalidade, a cepa do camundongo È mantida isolando-se de um camundongo que È homozigoto ou heterozigoto para a modificação de um núcleo, e introduzindo o núcleo em uma cÈlula hospedeira, e formando o núcleo e cÈlula hospedeira em um animal adequado para obter uma progÍnie que È homozigota ou heterozigota para a modificação.

[00350] Em uma modalidade, a cepa do camundongo È mantida utilizando-se fertilização m vilro VIVF) du umcunLundongofemea (tipo selvagem, homozigoto para a modificação, ou heterozigoto para a modificação) utilizando um esperma de um camundongo macho compreendendo a modificação genÈtica. Em uma modalidade, o camundongo macho È heterozigoto para a modificação genÈtica. Em uma modalidade, o camundongo macho È homozigoto para a modificação genÈtica.

[00351] Em uma modalidade, a cepa do camundongo È mantida criando-se um camundongo macho que È heterozigoto para a modificação genÈtica com um camundongo fímea para obter progínie que compreende a modificação genÈtica, identificando uma progínie de macho e de fímea compreendendo a modificação genÈtica, e utilizando um macho que È heterozigoto para a modificação genÈtica em uma criação com uma fímea que È do tipo selvagem, homozigota, ou heterozigota para a modificação genÈtica para obter progínie compreendendo a modificação genÈtica. Em uma modalidade, a etapa de criar um macho heterozigoto para a modificação genÈtica com uma fímea de tipo selvagem, uma fímea heterozigota para a modificação genÈtica, ou uma fímea homozigota para a modificação genÈtica È repetida de modo a manter a modificação genÈtica na cepa do camundongo.

[00352] Em um aspecto, um mÈtodo È fornecido para manter uma cepa do camundongo que compreende uma substituição de um loco de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena com uma ou mais sequíncias de cadeia pesada de imunoglobulina humana, compreendendo criar a cepa do camundongo de modo a gerar camundongos machos heterozigotos, em que os camundongos machos heterozigotos são criados para manter a modificação genÈtica na cepa. Em uma modalidade específica, a cepa não È mantida por qualquer criação de um macho homozigoto com uma fímea de tipo selvagem, ou uma fímea homozigota ou heterozigota para a modificação genÈtica.

[00353] A proteína ADAM6 È um membro da família de Uma Desintegrina E Metaloprotease (ADAM) de proteínas, que È uma família grande de proteínas tendo íunçies diversas incluindo adesão celular. Alguns membros da família de ADAM são implicados na espermatogínese e fertilização. Por exemplo, ADAM2 codifica uma subunidade da proteína fertilina, que È implicada em interaÁies de esperma-óvulo. ADAM3, ou ciritestina, parece necessária para a ligação do esperma à zona pelúcida. A ausíncia de ADAM2 ou ADAM3 resulta em infertilidade. Foi pressuposto que ADAM2, ADAM3, e ADAM6 formam um complexo na superfície de cÈlulas de esperma de camundongo. O gene de contraparte humano (ADAM6 humano), normalmente encontrado entre segmentos de gene VH humanos VH1-2 e VH6-1 no loco de cadeia pesada de imunoglobulina humana, parece ser um pseudogene. Em camundongos, existem dois genes de ADAM6 - ADAM6a e ADAM6b - que são encontrados em uma região intergínica entre segmentos de gene VH e DH de camundongo, e no camundongo os genes ADAM6a e ADAM6b são orientados em orientação transcricional oposta àquela dos segmentos de gene de imunoglobulina adjacentes. Em camundongos, um loco de ADAM6 funcional È evidentemente necessário para a fertilização normal. Um loco ou sequíncia de ADAM6 funcional, depois, refere-se a um loco ou sequíncia de ADAM6 que pode complementar, ou regatar, a fertilização drasticamente reduzida exibida em camundongos machos com locos de ADAM6 endógeno ausentes ou não funcionais.

[00354] A posÍção da sequíncia intergínica em camundongos que codificam ADAM6a e ADAM6b torna a sequÍncia intergÍnica suscetível à modificação quando da modificação de uma cadeia pesada de camundongo endógena. Quando segmentos de gene VH são suprimidos ou substituídos, ou quando segmentos de gene DH são suprimidos ou substituídos, existe uma probabilidade alta de que um camundongo resultante exiba um dÈficit severo na fertilidade. De modo a compensar quanto ao dÈficit, o camundongo È modificado para incluir uma sequíncia de nucleotídeo que codifica uma proteína que complementara a perda em atividade de ADAM6 devido a uma modificação do loco de ADAM6 de camundongo endógeno. Em várias modalidades, a sequíncia de nucleotídeo de complementação È uma que codifica um ADAM6a de camundongo, um ADAM6b de camundongo, ou um homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste que resgata o dÈficit de fertilidade. Alternativamente, mÈtodos adequados para preservar o loco de ADAM6 endógeno podem ser utilizados, enquanto tornando as sequíncias de cadeia pesada de imunoglobulina endógena flanqueando o loco de ADAM6 de camundongo incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada endógena funcional. MÈtodos alternativos exemplares incluem manipulação de grandes porçles de cromossomos de camundongo que posicionam a locos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena em um tal modo que eles sejam incapazes de rearranjar para codificar uma região variável de cadeia pesada funcional que È operavelmente ligada a um gene constante de cadeia pesada endógeno. Em várias modalidades, os mÈtodos incluem inversles e/ou translocaÁies de fragmentos cromossômicos de camundongo contendo segmentos de gene de cadeia pesada de imunoglobulina endógena.

[00355] A sequíncia de nucleotídeo que resgata a fertilidade pode ser colocada em qualquer posição adequada. Ela pode ser colocada na região intergínica, ou em qualquer posição adequada no genoma (isto È, ectopicamente). Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo pode ser introduzida em um transgene que aleatoriamente integra no genoma do camundongo. Em uma modalidade, a sequÍncia pode ser mantida epissomicamente, isto È, em um •cido nucleico separado ao invÈs de em um cromossomo de camundongo. PosiÁies adequadas incluem as posiÁies que são transcricionalmente permissivas ou ativas, por exemplo, um loco ROSA24 (Zambrowicz tt al., 997^1 ,PNJSUJN9 93:378- - 3794), um locoBT- 5 (Michael tt al., 1999, MDuhh. Dvs8 85:35 - 47o ou mm coco Oct4 (WaHaee et al., 2000, NucDeic AcdS Res. 28:4455 - -444). eequências de nueleotídeo de alvejamento a locos transcricionalmente ativos são descritas, por exemplo, em US 7.475.557.

[00356] Alternativamente, a sequíncia de nucleotídeo que resgata a fertilidade pode ser ligada com um promotor indutível de modo a facilitar a expressão ideal nas cÈlulas e/ou tecidos apropriados, por exemplo, tecidos reprodutivos. Os promotores indutíveis exemplares incluem promotores ativados pelos meios físicos (por exemplo, promotor de choque tÈrmico) e/ou meios químicos (por exemplo, IPTG ou Tetraciclina).

[00357] AlÈm disso, a expressão da sequíncia de nucleotídeo pode ser ligada a outros genes de modo a obter a expressão em estágios específicos de desenvolvimento ou dentro de tecidos específicos. Tal expressão pode ser obtida colocando-se a sequíncia de nucleotídeo em ligação operavei com o promotor de um gene expressado em um estagio específico de desenvolvimento. Por exemplo, as sequíncias de imunoglobulina de uma espÈcie engenheirada no genoma de uma espÈcie hospedeira são colocados em ligação operável com uma sequíncia promotora de um gene CD89 (um gene específico de cÈlula O) da espÈcie hospedeira. A expressão específica de cÈlula O nos estágios desenvolvimentais precisos quando as imunoglobulinas são expressadas È obtida.

[00358] Ainda um outro mÈtodo para obter a expressão robusta de uma sequíncia de nucleotídeo inserida È utilizar um promotor constitutivo. Os promotores constitutivos exemplares incluem SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK e CAGG. Em uma forma similar, a sequíncia de nucleotídeo desejada È colocada em ligação operavei com um promotor constitutivo selecionado, que fornece alto nível de expressão da(s) proteína(s) codificada(s) pela sequíncia de nucleotídeo.

[00359] O “ermp “ectópnco’’ é intencionndo r mcluò um mesloo,mento, ou uma colocação em uma posição que não È normalmente encontrada na natureza (por exemplo, colocação de uma sequíncia de •cido nucleico em uma posição que não È a mesma posição como a sequíncia de •cido nucleico È encontrada em um camundongo do tipo selvagem). O termo, em várias modalidades, È usado no sentido de seu objeto sendo fora da sua posição normal, eu aprepriaUa. Per exemple, a frase “uma sequência Ue nucleetíUee ectópico que ceUifica...” refere-se a uma sequíncia de nucleotídeo que aparece em uma posição na qual a mesma não È normalmente encontrada no camundongo. Por exemplo, no caso de uma sequíncia de nucleotídeo ectópico que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo (ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento desta que fornece o mesmo beneficio de fertilidade ou similar nos camundongos machos), a sequíncia pode ser colocada em uma posição diferente no genoma do camundongo do que È normalmente encontrada em um camundongo do tipo selvagem. Em tais casos, juncies de sequíncia novas da sequíncia de camundongo ser„o criadas colocando-se a sequíncia em uma posicào diferente no genoma do camundongo do que em um camundongo do tipo selvagem. Um homólogo ou ortólogo funcionais de camundongo ADAM6 È uma sequíncia que confere um resgate da perda de fertilidade (por exemplo, a perda da capacidade de um camundongo macho para gerar descendíncia pelo acasalamento) que È observada em um camundongo ADAM6’/’. Homólogos ou ortólogos funcionais incluem proteínas que tím pelo menos cerca de 89% de identidade ou mais, por exemplo, atÈ 99% de identidade, para a sequíncia de aminoacick) de ADAM6a e/ou a sequíncia de aminoacido de ADAM6b, e que pode complementar, ou recuperar a capacidade para acasalar com íxito, de um camundongo que tem um genótipo que inclui uma supressão ou silenciamento de ADAM6a e/ou ADAM6b.

[00360] A posição ectópica pode estar em qualquer lugar (por exemplo, como com inserç„o aleatória de um transgene contendo uma sequíncia ADAM6 de camundongo), ou pode estar, por exemplo, em uma posição que se aproxima (mas não È precisamente a mesmo como) a sua localização em um camundongo do tipo selvagem (por exemplo, em um local de imunoglobulina endógena de camundongo modificado, mas a montante ou a jusante da sua posição natural, por exemplo, dentro de um local da imunoglobulina modificado mas entre segmentos de gene diferentes, ou em uma posição diferente em uma sequíncia intergínica V-D de camundongo). Um exemplo de uma colocação ectópica È mantendo a posição normalmente encontrada em camundongos do tipo selvagem dentro do local de cadeia pesada de imunoglobulina endógena enquanto que torna aos segmentos de gene de cadeia pesada endógeno circundantes capazes de rearranjar para codificar uma cadeia pesada funcional contendo uma região constante da cadeia pesada endógena. Neste exemplo, isto pode ser realizado pela inversão do fragmento cromossômico contendo os locais da cadeia pesada de imunoglobulina endógena variável, por exemp /o. usando SÍIÍOS de recombinação específicos de sítio engenheirados colocados nas posiÁies que flanqueiam o local de região variável. Assim, na recombinação os locais da região variável da cadeia pesada endógena são colocados em uma distância maior dos genes da região constante da cadeia pesada endógenos impedindo deste modo o reagrupamento para codificar uma cadeia pesada funcional contendo uma região constante de cadeia pesada endógena. Outros mÈtodos exemplares para se obter o silenciamento funcional do local de gene variável da cadeia pesada de imunoglobulina endógena enquanto mantendo um local ADAM6 funcional estará evidente para as pessoas de habilidade na leitura desta descrição e/ou em combinação com mÈtodos conhecidos na tÈcnica. Com uma tal colocação do local de cadeia pesada endógeno, os genes ADAM6 endógenos são mantidos e o local de cadeia pesada de imunoglobulina endógena È funcionalmente silenciada.

[00361] Um outro exemplo de uma colocação ectópica È a colocação dentro de um local de cadeia pesada de imunoglobulina humanizado. Por exemplo, um camundongo compreendendo uma substituição de um ou mais segmentos de gene VH endógeno com um uma) segmento de gene VH humano, em que a substituição remove uma sequíncia de ADAM6 endógena, pode ser engenheirado para ter uma sequíncia ADAM6 de camundongo localizada dentro de uma sequíncia intergínica que reside entre o UÍIÍCO segmento de gene VH humano e um segmento de gene DH humano. Um outro exemplo de uma colocação ectópica È a colocação da sequíncia ADAM6 de camundongo em uma posição 5’ (em relação à direção de transcrição do segmento de gene VH humano único) ao segmento cie gene VH humano. Uma posição 5’ em relação ao segmento de gene VH humano único pode estar em proximidade imediata, por exemplo, umas poucas centenas de pares de base a uns poucos kb, ou distante, por exemplo, vários kb a centenas de kb ou mesmo uma megabase ou maior, em relação ao segmento de gene VH humano. A modificação resultante geraria uma sequíncia de ADAM6 de camundongo (ectópica) dentro ou contígua, ou ainda no mesmo cromossomo, com uma sequíncia de gene humano, e a colocação (ectópica) da sequíncia ADAM6 de camundongo dentro da sequíncia de gene humano pode aproximar-se da posição da sequíncia ADAM6 de camundongo (isto È, dentro da região intergínica V-D). As juiicies de sequíncia resultantes criadas pela uni„o de uma sequíncia ADAM6 de camundongo (ectópico) dentro ou adjacente a uma sequíncia de gene humano (por exemplo, uma sequíncia de gene da imunoglobulina) dentro da linha germinativa do camundongo seria nova quando comparada à mesma posição ou similar no genoma de um camundongo do tipo selvagem.

[00362] Em varias modalidades, animais não humanos são fornecidos que carecem de um ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste, em que a caríncia torna o animal não humano infÈrtil, ou substancialmente reduz a fertilidade do animal não humano. Em varias modalidades, a caríncia de ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste È devida a uma modificação de um local de cadeia pesada de imunoglobulina endógena. Uma redução substancial em fertilidade È, por exemplo, uma redução em fertilidade (por exemplo, frequíncia de cruzamento, filhotes por ninhada, ninhadas por ano, etc.) de cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% ou mais. Em varias modalidades, os animais não humanos são suplementados com um gene ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste que È funcional em um macho do animal não humano, em que o gene ADAM6 suplementado ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste resgata a redução em fertilidade no todo ou em parte substancial. Um resgate de fertilidade em parte substancial È, por exemplo, uma restauração de fertilidade tal que o animal não humano exibe uma fertilidade que È pelo menos 70%, 80%, ou 90% ou mais quando comparada com um local de cadeia pesada não modificado (isto È, um animal sem uma modificação para o gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste).

[00363] A sequíncia que confere no animal geneticamente modificado (isto È, o animal que carece de um ADAM6 funcional ou ortólogo ou homólogo deste, devido, por exemplo, a uma modificação de um local de cadeia pesada de imunoglobulina) È, em várias modalidades, selecionada de um gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo deste. Por exemplo, em um camundongo, a perda da íunçào de ADAM6 È resgatada pela adição, em uma modalidade, de um gene ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, a perda da função de ADAM6 no camundongo È resgatada pela adição de um ortólogo ou homólogo de uma espÈcie intimamente relacionada em relação ao camundongo, por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo de uma cepa ou espÈcie diferentes, um rato de qualquer espÈcie, um roedor; em que a adição do ortólogo ou homólogo ao camundongo resgata a perda de fertilidade devido à perda da íunçào de ADAM6 ou perda de um gene ADAM6. Ortólogos e homólogos de outras espÈcies, em varias modalidades, são selecionados de uma espÈcie filogeneticamente relacionada e, em várias modalidades, exibem uma identidade percentual com o ADAM6 endógeno (ou ortólogo) que È de cerca de 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, ou 97% ou mais; e que resgatam a perda de fertilidade relacionada com ADAM6 ou (em um não camundongo) relacionada com ortólogo de ADAM6. Por exemplo, em um rato macho geneticamente modificado que carece da funçào de ADAM6 (por exemplo, um rato com uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno substituído com uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina humana, ou um silenciamento na região de cadeia pesada de imunoglobulina do rato), a perda de fertilidade no rato È resgatada pela adição de um ADAM6 de rato ou, em algumas modalidades, um ortólogo de um ADAM6 de rato (por exemplo, um ortólogo de ADAM6 de uma outra cepa ou espÈcie de rato, ou, em uma modalidade, de um camundongo).

[00364] Assim, em várias modalidades, animais geneticamente modificados que não exibem nenhuma fertilidade ou uma redução em fertilidade devido à modificação de uma sequíncia de ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM6 (ou ortólogo ou homólogo deste) ou uma região reguladora operavelmente ligada com a sequíncia de ácido nuclÈico, compreendem uma sequíncia de ácido nucleico que complementa, ou restaura, a perda em fertilidade onde a sequíncia de ácido nucleico que complementa ou restaura a perda em fertilidade È de uma cepa diferente da mesma espÈcie ou de uma espÈcie filogeneticamente relacionada. Em varias modalidades, a sequÍncia de ácido nucleico complementar È um ortólogo ou homólogo de ADAM6 ou fragmento funcional deste. Em varias modalidades, a complementação com ortólogo ou homólogo de ADAM6 ou funcional fragmento destes È de um animal não humano que está intimamente relacionado com o animal geneticamente modificado tendo o defeito na fertilidade. Por exemplo, onde o animal geneticamente modificado È um camundongo de uma cepa particular, um ortólogo ou homólogo de ADAM6 ou fragmento funcional destes podem ser obtidos de um camundongo de uma outra cepa, ou um camundongo de uma espÈcie relacionada. Em uma modalidade, onde o animal geneticamente modificado compreendendo o defeito de fertilidade È da ordem dooedoiea, o ortolgo) ou homólgoo de ADAM6 ou fragmento funcional destes È de um outro animal da ordem Roedoria. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado compreendendo o defeito de fertilidade È de uma subordem Myrmoropha (por exemplo, gerbos, camundongos saltadores, hamsters como camundongo, hamsters, ratos New World e camundongos, arganazes, camundongos e ratos verdadeiros, gerbilos, camundongos espinhudos, ratos encrespados, camundongos escaladores, camundongos das rochas, ratos de cauda branca, ratos e camundongos de Madascar, rato silvestre espinhudo, ratos mol, ratos do bambu, zokors), e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 ou fragmento funcional deste È selecionado de um animal da ordem doddoeia, uu da subordem Myrmorpha.

[00365] Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È da superfamília Dipoddidea, e o oi'tologo ou hmmoiogo de DAAM6 ou fragmento funcional deste È da superfamília Muroidea. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È da superfamília Muroidea, e o ottók)go ou homólogo ADAA6 ou fragmento funcional deste È da superfamília Dipodoidoa.

[00366] Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È um roedor. Em uma modalidade, o roedor È selecionado da superfamília Muroidea, e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 È de uma espÈcie diferente dentro da superfamília UUoroidea. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È de uma família selecionada de ColomysoidCie (por exemplo, hamster como camundongo), Csiceiidae (per mpemplo, hamster, ratos New World e camundongos, arganazes), MuriCae (camundongos e ratos verdadeiros, gerbilos, camundongos espinhudos, ratos encrespados), Nosomoideie (camiindong,°s aí5caladls)res,can^^i^(^<^i^go$> das rochas, ratos com cauda, ratos e camundongos da Malásia), PldCdsanChomyiOde (por exempio. nato silvestre espinliudo). e Pcaiacidae (por exemplo, ratos mol, ratos do bambu, e zokors); e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 È selecionado de uma espÈcie diferente da mesma família. Em uma modalidade específica, o roedor geneticamente modificado È selecionado de um camundongo ou rato verdadeiros (família MuoiCa<?), e o orkogoo uu homólogo de ADAM6 È de uma espÈcie selecionada de um gerbilo, camundongo espinhudo, ou rato encrespado. Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado È de um membro da família MurOCce, e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 È de uma espÈcie diferente da família Muuidce. Em uma modalidade específica, o roedor geneticamente modificado È um camundongo da família Muridae, e o ortooogo oui llomoiogo de ADAM6 È de um rato, gerbilo, camundongo espinhudo, ou rato encrespado da família Muuidce.

[00367] Em várias modalidades, um ou mais ortólogos ou homólogos de ADAM6 de roedor ou fragmentos funcionais destes de um roedor em uma família restaura a fertilidade para um roedor geneticamente modificado da mesma família que carece de um ortólogo ou homólogo de ADAM6 (por exemplo, Csicriidaie opoe ememplo, Iiamrtcrr. catoe enamundgngos Wew World, arganazes); MuriCcepooe eanmplo,aE:nnndonoos crams veriladeiros. gerbilos, camundongos espinhudo, ratos encrespados)).

[00368] Em várias modalidades, ortólogos, homólogos de ADAM6, e fragmentos destes são avaliados quanto a funcionalidade pela averiguação de se o ortólogo, homólogo, ou fragmento restauram a fertilidade para um animal não humano macho geneticamente modificado que carece da atividade de ADAM6 (por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo ou rato, que compreende um silenciamento de ADAM6 ou seu ortólogo). Em várias modalidades, a funcionalidade È definida como a capacidade de um esperma de um animal geneticamente modificado que carece de um ADAM6 endógeno ou ortólogo ou homólogo deste para migrar em um oviduto e fertilizar um óvulo da mesma espÈcie de animal geneticamente modificado.

[00369] Em vários aspectos, camundongos que compreendem supressles ou substituiÁies do local da região variável da cadeia pesada endógena ou porçles deste podem ser fabricados que contím uma sequíncia de nucleotídeo ectópico que codifica uma proteína que confere benefícios de fertilidade similares ao camundongo ADAM6 (por exemplo, um ortólogo ou um homólogo ou um fragmento deste que È funcional em um camundongo macho). A sequíncia de nucleotídeo ectópica pode incluir uma sequíncia de nucleotídeo que codifica uma proteína que È um homólogo ou ortólogo de ADAM6 (ou fragmento deste) de uma cepa diferente ou uma espÈcie diferente de camundongo, por exemplo, uma espÈcie de roedor diferente, e que confere um benefício em fertilidade, por exemplo, número aumentado de ninhadas em um período de tempo especificado, e/ou número aumentado de filhotes por ninhada, e/ou a capacidade de uma cÈlula de esperma de um camundongo macho atravessar atravÈs de um oviduto de camundongo para fertilizar um óvulo de camundongo.

[00370] Em uma modalidade, o ADAM6 È um homólogo ou ortólogo que È pelo menos 89% a 99% idíntico a uma proteína ADAM6 de camundongo (por exemplo, pelo menos 89% a 99% idíntico ao ADAM6a de camundongo ou ADAM6b de camundongo). Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo ectópica codifica uma ou mais proteínas independentemente selecionadas de uma proteína pelo menos 89% idíntica ao ADAM6a de camundongo, uma proteína pelo menos 89% idíntica ao ADAM6b de camundongo, e uma combinação destes. Em uma modalidade, o homólogo ou ortólogo È uma proteína de rato, hamster, camundongo, ou porquinho da Õndia que È ou È modificada para ser de cerca de 89% ou mais idíntica ao ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b de camundongo. Em uma modalidade, o homólogo ou ortólogo È idíntico ou È pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idíntico a um ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b camundongo. Ectópico ADAM6 em Humanizado Cadeia pesada Camundongos

[00371] Desenvolvimentos no alvejamento de gene, por exemplo, o desenvolvimento de cromossomos bacterianos artificiais (BACs), agora permitem a recombinação de fragmentos genômicos relativamente grandes. A engenharia de BAC tem levado em consideração a capacidade de fazer grandes inibiÁies, e grandes inserçles, em cÈlulas ES de camundongo.

[00372] Os camundongos que produzem os anticorpos humanos estiveram disponíveis por algum tempo agora. Embora estes representem um avanÁo importante no desenvolvimento dos anticorpos terapíuticos humanos, estes camundongos apresentam um número de anormalidades significantes que limitam sua utilidade. Por exemplo, estes apresentam um desenvolvimento de cÈlula B comprometido. O desenvolvimento comprometido pode ser devido a uma variedade de diferenÁas entre os camundongos transgínicos e camundongos do tipo selvagem.

[00373] Os anticorpos humanos podem não interagir otimamente com a prÈ-cÈlula B de camundongo ou receptores da cÈlula B nas superfícies das cÈlulas dos camundongos que avisam a maturação, proliferação, ou sobrevivíncia durante a seleção de clonagem. Os anticorpos completamente humanos podem não interagir otimamente com um sistema receptor Fc de camundongo; os camundongos expressam os receptores Fc que não apresentam uma correspondÍncia um-a-um com os receptores Fc humanos. Finalmente, vários camundongos que produzem os anticorpos completamente humanos não incluem todas as sequíncias genuínas de camundongo, por exemplo, elementos intensificadores a jusante e outros elementos de controle local, que podem ser necessários para o desenvolvimento de cÈlula B tipo selvagem.

[00374] Os camundongos que produzem os anticorpos completamente humanos geralmente compreendem os locais de imunoglobulina endógena que são incapacitados de alguma maneira, e transgenes humanos que compreendem segmentos de gene de imunoglobulina variáveis e constantes são introduzidos em um local aleatório no genoma do camundongo. Enquanto o local endógeno È suficientemente incapacitado de modo a não rearranjar os segmentos de gene para formar um gene de imunoglobulina funcional, o objetivo de produzir anticorpos completamente humanos em tal camundongo pode ser obtido embora com desenvolvimento de cÈlula B comprometido.

[00375] Embora compelido a produzir os anticorpos completamente humanos do local de transgene humano, gerar anticorpos humanos em um camundongo È evidentemente um processo desvantajoso. Em alguns camundongos, o processo È t„o desvantajoso quanto o resultado na formação das cadeias pesadas quimÈricas humanas vartáveis/constantes de camundongo (mas não cadeia leves) atravÈs do mecanismo de transcomutação. AtravÈs deste mecanismo, as transcriÁies que codificam os anticorpos completamente humanos sofrem a comutação de isótipo em trans do isótipo humano para um isótipo de camundongo. O processo È em trans, porque o transgene completamente humano está localizado alÈm do endógeno local o qual retÈm uma cópia não danificada de um gene de região constante de cadeia pesada de camundongo. Embora em tais camundongos a transcomutação È prontamente evidente, o fenômeno ainda È insuficiente para resgatar o desenvolvimento da cÈlula B, que permanece claramente prejudicada. Em qualquer evento, os anticorpos transcomutados feitos em tais camundongos retÈm completamente as cadeias leves humanas, visto que o fenômeno de transcomutação evidentemente não ocorre com relação às cadeias leves; a transcomutação presumivelmente conta com as sequíncias de comutação em locais endógenos usados (embora de maneira diferente) em isótipo normal comutando em cis. Desta forma, mesmo quando os camundongos engenheirados para produzir anticorpos completamente humanos selecionam um mecanismo de transcomutação para produzir os anticorpos com regiles constantes de camundongo, a estratÈgia ainda È insuficiente para resgatar o desenvolvimento normal da cÈlula B. Uma preocupação primária em produzir os produtos terapíuticos com base em anticorpos humanos, por exemplo, anticorpos antipatógeno, È identificar os domínios variáveis úteis ceie especificamente reconhecem os epítopos particulares e os ligam com uma afinidade desejável, geralmente - mas não sempre - com uma alta afinidade. Os camundongos como aqui descritos, que contím uma substituição precisa das regiles variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo com um número restrito de imunoglobulina segmentos de gene variáveis de cadeia pesada humanos no local do camundongo endógeno, apresenta um desenvolvimento de cÈlula B próxima ao tipo selvagem e as regiles variáveis geradas em resposta à imunização são completamente humanas, em que as cadeias pesadas são derivadas de um segmento de gene VH único humano. Assim, tais camundongos fornecem uma plataforma para gerar um painel de regiles determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs) que são especificamente dirigidas para ligar um dado antígeno, por exemplo, um vírus patogínico.

[00376] Os camundongos como aqui descritos contím uma substituição em larga escala precisa dos locais de cadeia pesada da linha germinativa da imunoglobulina de camundongo de gene variável (IgH) com um local de cadeia pesada variável de imunoglobulina humana restrita, e cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, cadeia leve K, Ig)) omm um local de cadeia leve de gene variável de imunoglobulina humana K equivalente, nos endógenos locais. Esta substituição precisa resulta em um camundongo com locais híbridos de imunoglobulina que produzem as cadeias pesadas e leves que possuem regiles variáveis humanas e uma região constante de camundongo. A substituição precisa dos segmentos VH-DH-JH e Vg-Jg cie camundongo deixa as sequências de camundongo de fljmquenento intacto e funcional nos locais híbridos de imunoglobulina. O sistema imunológico humoral das íunçies do camundongo como aquele de um camundongo do tipo selvagem. O desenvolvimento de cÈlula B È desimpedido em qualquer relação significante e um painel somaticamente submetido à mutação das CDRs de cadeia pesada humana são gerados no camundongo na inoculação do antígeno.

[00377] Os camundongos como aqui descritos são possíveis porque os segmentos de gene de imunoglobulina para as cadeias pesadas e cadeias leves g marranam simiiamranSe em seres luimanos e amnundongos, isto para não dizer que seus locais são os mesmos ou ainda muito próximos -claramente não são. Entretanto, os locais são similares o suficiente para que a humanização da cadeia pesada local de gene variável possa ser realizada substituindo-se cerca de tris milhles de pares de base de sequíncia contígua de camundongo que contÈm todos os segmentos de gene VH, DH, e JH com uma sequíncia genômica humana contígua contendo um local de cadeia pesada humano restrito.

[00378] Em algumas modalidades, outra substituição de algumas sequíncias de gene de região constante de camundongo com sequíncias de gene humano (por exemplo, substituição de sequíncia CH1 de camundongo com sequíncia CH1 humana, e substituição da sequíncia CL de camundongo com sequíncia CL humana) resulta em camundongos com locais híbridos de imunoglobulina que produzem anticorpos que possuem regiles variáveis humanas e regiles constantes parcialmente humanas, adequadas para, por exemplo, produzir fragmentos de anticorpo completamente humanos, por exemplo, Fab’s completamente humanos. Os camundongos com locais híbridos de imunoglobulina apresentam reagrupamentos dos segmentos de gene variáveis normais, frequíncias de hipermutação somática normais, e comutação de classe normal. Estes camundongos apresentam um sistema imunológico humoral que È indistinguível dos camundongos do tipo selvagem, e apresentam populaÁies celulares normais em todos os estágios de desenvolvimento da cÈlula B e estruturas org,nicas linfoides normais - mesmo onde os camundongos carecem de um repertório completo de segmentos de gene humanos de região vartável. A imunização destes camundongos resulta em respostas humorais robustas que apresentam uma ampla diversidade de CDRs de cadeia pesada e uso de segmentos de gene de cadeia leve vartável.

[00379] A substituição precisa da linha germinativa de segmentos de gene de camundongo de região vartável permite fabricar camundongos que possuem locais de imunoglobulina parcialmente humana. Devido ao local de imunoglobulina parcialmente humana rearranjar, hipermutar, e comutar de classe normalmente, os locais de imunoglobulina parcialmente humana geram anticorpos em um camundongo que compreendem as regiles variáveis humanas. A sequíncia de nucleotídeos que codificam as regiles variáveis pode ser identificada e clonada, depois fundida (por exemplo, em um sistema in vitro) com qualquer sequíncia de escolha, por exemplo, qualquer isótipo de imunoglobulina adequado para um uso particular, resultando em um derivado proteico que liga ao anticorpo ou antígeno completamente das sequíncias humanas.

[00380] A humanização em grande escala atravÈs dos mÈtodos de engenheiragem foi usada para modificar as cÈlulas tronco embriônicas (ES) de camundongo para substituir precisamente atÈ tris megabases do local de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo que incluíram essencialmente todos dos segmentos de gene VH, DH, e JH de camundongo com uma sequíncia genômica humana contendo um local de cadeia pesada humano restrito incluindo um segmento de gene VH humano miico, 77 segmentos de gene DH humanos, e seis segmentos de gene JH humanos. AtÈ um segmento de meia megabase do genoma humano compreendendo uma de duas repetiÁies que codificam essencialmente todos segmentos de gene VK e JK lunuanos foi usado para substituir um segmento cie três megabases oo oocal de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo K contecdoessencialmente todos dos segmentos de gene VK e J i< decmunnOogoo.

[00381] Os camundongos com tais locais substituídos de imunoglobulina podem compreender uma interrupção ou inibição do local ADAM6 endógeno de camundongo, que È normalmente encontrado entre o segmento de gene VH mais à 3’ e o segmento de gene DH mais à 5’ na imunoglobulina de camundongo local de cadeia pesada. A interrupção nesta região pode levar à redução ou eliminação da funcionalidade do local ADAM6 endógeno de camundongo. Se um ou ambos dos segmentos de gene VH mais à 3’ do repertório de cadeia pesada humano são usados na formação do local de cadeia pesada humano restrito, uma região intergínica contendo um pseudogene que parece ser um pseudogene ADAM6 humano está presente entre estes segmentos de gene VH, isto È, entre VH1-2 e VH1 - 6 humano. Entretanto, os camundongos machos que compreendem esta sequíncia intergínica humana apresentam uma redução na fertilidade (ver a USSN 13/404.075).

[00382] Os camundongos são descritos os quais compreendem os locais de cadeia pesada humanos restritos e locais de cadeia leve lununnos K equivalentes como descrito acima, e que tambÈm compreendem uma sequíncia de •cido nucleico ectópica que codifica um ADAM6 de camundongo, onde os camundongos apresentam fertilidade essencialmente normal. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nucleico ectópico compreende uma sequíncia ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b de camundongo ou fragmentos funcionais destes, colocados entre um VH1-69 humano e um DH1-1 humano em um local de cadeia pesada endógeno modificado. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nucleico ectópica È a SEQ ID NO: 77, colocada entre um VH1-69 humano e um DH1-1 humano em um local de cadeia pesada endógeno modificado. A direção da transcrição dos genes ADAM6 da SEQ ID NO: 77 são opostos com relação à direção da transcrição dos segmentos de gene humanos adjacentes. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nucleico ectópica compreende um ADAM6a de camundongo e/ou uma sequíncia ADAM6b de camundongo ou fragmentos funcionais destes colocada a montante (ou 5’) de um segmento de gene VH1-2 humano em um local de cadeia pesada endógeno modificado. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nucleico ectópica È a SEQ ID NO: 73, colocada a montante (ou 5’) de um segmento de gene VH1-2 humano em um local de cadeia pesada modificado endógeno. A direção da transcrição dos genes ADAM6 da SEQ ID NO: 73 são opostos com relação à direção da transcrição dos segmentos de gene humanos adjacentes (por exemplo, um segmento de gene VH1-2 humano).

[00383] Embora os exemplos aqui mostrem o resgate da fertilidade colocando-se a sequíncia ectópica entre os segmentos de gene humano indicados, tÈcnicos habilitados reconhecer„o que a substituição da sequíncia ectópica em qualquer local transcricionalmente permissivo adequado no genoma do camundongo (ou ainda extracromossomicamente) sera esperado resgatar similarmente a fertilidade em um camundongo macho.

[00384] O fenômeno de complementar um camundongo que carece de um local ADAM6 funcional com uma sequíncia ectópica que compreende um gene ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional destes È um mÈtodo geral que È aplicável para resgatar qualquer camundongo sem nenhum local ADAM6 endógeno funcional ou minimamente funcional. Deste modo, uma grande quantidade de camundongos que compreendem uma modificação de interrupção de ADAM6 do local de cadeia pesada de imunoglobulina pode ser resgatada com as composiÁies e mÈtodos da invenção. Consequentemente, a invenção compreende os camundongos com uma ampla variedade de modificaÁies de locais de cadeia pesada de imunoglobulina que compromete a função do ADAM6 endógeno. Alguns exemplos (não limitantes) são fornecidos neste relatório descritivo. AlÈm de dos camundongos descritos, as composiÁies e mÈtodos relacionados a ADAM6 podem ser usados em uma grande quantidade de aplicaÁies, por exemplo, quando modificando um local de cadeia pesada em uma ampla variedade de modos.

[00385] Em um aspecto, um camundongo È fornecido o qual compreende uma sequíncia de ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo), uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo com um segmento de gene VH humano únicos, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene DH de camundongo e segmentos de gene JH com DH humano e segmentos de gene JH humanos; em que o camundongo carece um CH1 e/ou região de dobradiÁa. Em uma modalidade, o camundongo faz uma proteína de ligação de domínio variável úmca que é um dmeero das cadeias de imunoglobulina selecionadas de: (a) VH humano - camundongo CH1 - camundongo CH2 - camundongo CH3; (b) VH humano - Coecadicade ccmunclonoo - munuodgogo CH2 -ccmnuodnoo CH3; e, (c) VH humano -acmnuodnoo CH2 cmnduCdnoo CH3.

[00386] Em um aspecto, a sequíncia de nucleotídeo que resgata a fertilidade é colocada a montante (ou 5’) de uma sequência da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana (por exemplo, a montante de um VH1-2 humana ou segmento de gene VH1-69) em um camundongo que tem uma substituÍção de um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina de camundongo (mVH’s, mD^s, e/ou mJH’s) com um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina humana (hVH’s, hDH’s, e/ou hJH’s), e o camundongo compreende ainda uma substituição de um ou mais segmentos de gene K dacadaia leve variável de imunoglobulina de camundongo (mVK’s e/ou mJK’s) com um ou mais segmentos de gene K dc cedeia leve vrrievel dim imunoglobnlina humana (hVK’s e/ou hJK's).

[00387] Em um aspecto, a sequíncia de nucleotídeo que resgata a fertilidade È colocada dentro de uma sequíncia da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana (por exemplo, entre VH1-69 humana ou VH1-2 humana e um segmento de gene DH humano1-1) em um camundongo que tem uma substituição de um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina de camundongo (mVH’s, mDás, e/ou mJH’s) com um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina humana (hVH’s, hDH’s, e/ou hJH’s), e o camundongo compreende ainda uma substituição de um ou mais segmentos de gene K dc cadail leve virlável de imunoglobulina de camundongo (mVK’s e/ou mJK’s) com um ou mais segmentos de gene K dc cedeia leve vrrievel de imunoolobniina mumana (hVK’s e/ou hJK’s).

[00388] Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina de camundongo compreende cerca de trís megabases do camundongo local da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina de camundongo compreende pelo menos 89 segmentos de gene VH, pelo menos 13 segmentos de gene DH, pelo menos quatro segmentos de gene JH ou uma combinação do mesmo do camundongo local da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina humana compreende um número restrito de (por exemplo, um, dois ou tris) segmentos de gene VH, pelo menos 27 segmentos de gene DH, pelo menos seis segmentos de gene JH ou uma combinação do mesmo de um local da cadeia pesada da imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, o número restrito de segmentos de gene VH humano È um.

[00389] Em uma modalidade, o um ou mais eggmcntos de gene K da cadeia leve variável de imunoglobulina de camundongo compreende cerca de trêi megabaiei do local de cadeia leve de imunoglobulina K decamnndongo. Em uma modalidade, o um ou maii iegmeotoi de gene n da nealeia leve variável de imunoglobulina de camundongo compreende pelo menos 137 iegmentoi de gene Ve, pelo menoi ainao iegmentoi de gene Je ou mma combinação do meimo do local de cadeia leve de imunoglobulina d de camundongo. Em uma modalidade, o um ou maii iegmentoi de gene K da cadeia leve variável de imunoglobulina humana compreende cerca de meia megabaie de um local de cadeia leve de imunoglobulina K InimanaE Em mma modalidade esdccffica, o mm uu mais dnamontos de dnee da da cadeia leve variável de imunoglobulina humana compreende a repetição próxima (com relação à região conitante da imunoglobulina K) d um focal de cadeia leve de imunoglobulina K UamonaE EHI mma modalidade, o um ou mais segmentos de gene K dc cadaialeve viriavel di imunoolobulina umnana cmmpreende |lolo menos 40 segmentoi de gene Ve, pelo menoi cinco iegmentoi de gene Je oui uma combinação doi meimoi de um local de cadeia leve de imunoglobulina K humana.

[00390] Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo È colocada entre dois segmentos de gene da imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, os dois segmentos de gene da imunoglobulina humana são segmentos de gene de cadeia pesada. Em uma modalidade, a sequíncia de nucleotídeo È colocada entre um segmento de gene VH1-69 humano e um segmento de gene DH humano 1-1. Em uma modalidade, a sequÍncia de nucleotídeo È colocada entre um segmento de gene VH humano 12 e um segmento de gene DH humano 1-1. Em uma modalidade, o camundongo assim modificado compreende uma substituição de segmentos de gene da cadeia pesada variável de imunoglobulina de camundongo com um segmento de gene VH humano nnico, 77 segmentos de genes de hmnaoos DH e seis segmentos de genes humanos JH, e uma substituição de segmentos de gene K da cadeia leve variável de imunoglobulina de camundongo com pelo menos 40 segmentos de gene VK himomos e cinco segmentos de gene JK Uumano.

[00391] Em um aspecto, um ADAM6 funcional de camundongo local (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo) está presente no meio dos segmentos de gene de camundongo que est„o presentes at the local de região variável de cadeia pesada de camundongo endógeno, o dito local incapaz de rearranjar para codificar uma cadeia pesada funcional contendo uma região constante da cadeia pesada endógena. Em uma modalidade, o local da cadeia pesada de camundongo endógeno compreende pelo menos um e atÈ 89 segmentos de gene VH, pelo menos um e atÈ 13 segmentos de gene DH, pelo menos um e atÈ quatro segmentos de gene JH e uma combinação do mesmo. Em várias modalidades, um local de ADAM6 funcional de camundongo (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo) codifica uma ou mais proteínas ADAM6 que são funcionais no camundongo, em que a uma ou mais proteínas ADAM6 compreendem a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou uma combinação das mesmas.

[00392] Em um aspecto, um local de ADAM6 funcional de camundongo (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo) está presente no meio dos segmentos de genes humanos que substituem os segmentos de gene de camundongo endógenos. Em uma modalidade, pelo menos 89 segmentos de gene de camundongo VH são removidos e substituídos com um, dois ou trÍs segmentos de genes VH humano, e o local de ADAM6 de camundongo esta presente imediatamente adjacente à terminação 3’ dos segmentos de genes VH humanos, ou entre dois segmentos de genes VH humanos. Em uma modalidade, pelo menos 89 segmentos de gene de camundongo VH são removidos e substituídos com um segmento de gene VH humano único, e o local de ADAM6 de camundongo está presente imediatamente adjacente à terminação 3’ do segmento de gene VH humano. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo esta presente na terminação 3’ do segmento de gene VH dentro cerca de 20 quilobases (kb) a cerca de 40 quilobases (kb) do terminal 3’ do segmento de gene VH humano inserido. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo está presente 3’ do segmento de gene VH dentro de cerca de 29 bb a cerca de 31 kb do tcrmiaal 3’ do segmento de gene VH humano inserido. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo está presente dentro de cerca de 30 kb do terminal 3’ do segmento de gene VH humano inserido. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo está presente dentro cerca de 30.184 pares de base do terminal 3’ do segmento de gene VH humano inserido.

[00393] Em uma modalidade específica, a substituição inclui os segmentos de gene humano VH1-69 e DH1-1, e o local ADAM6 de camundongo está presente a jusante do segmento de gene VH1-69 e a montante do segmento de gene DH1-1. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo esta presente entre um segmento de gene VH1-69 humano e um segmento de gene DH 1-3 humano, em que a terminação 5’ do local ADAM6 de camundongo está cerca de 25K pares de base do eeminial 3’ do segmento de gene VH1-69 humano e a terminação 3’ do local ADAM6 está cerca de 3.263 pares de base 5’ do segmento de gene DH1-1 humano. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo compreende a SEQ ID NO: 3 ou um fragmento do mesmo que confere a função de ADAM6 dentro das cÈlulas do camundongo. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo compreende a SEQ ID NO: 73 ou um fragmento do mesmo que confere função de ADAM6 dentro das cÈlulas do camundongo. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo compreende a SEQ ID NO: 77 ou um fragmento do mesmo que confere a função de ADAM6 dentro das cÈlulas do camundongo. Em uma modalidade específica, o arranjo do segmento de genes humanos È depois do seguinte (de a montante atÈ a jusante com relação à direção de transcrição do segmento de genes humanos): VH1-69 humano-local ADAM6 de camundongo-humano DH1-1. Em uma modalidade, a orientação de um ou mais de ADAM6a de camundongo e ADAM6b de camundongo do local ADAM6 de camundongo È oposto com relação à direção de transcrição quando comparado com a orientação dos segmentos de genes humanos. Alternativamente, o local ADAM6 de camundongo está presente 5’ a, ou a montante doo segmento de gene VH humano único.

[00394] Em uma modalidade específica, a substituição inclui segmentos de gene humano VH1-2 e DH1-1, e o local ADAM6 de camundongo esta presente a montante do segmento de gene VH1-2 e a montante do segmento de gene DH1-1. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo está presente a montante, ou 5’, de um segmento de gene VH1-2 humano e um segmento de gene DH1-1 humano, em que a terminação 5’ do local ADAM6 de camundongo está cerca de 32.K33 pares de base do terminal 5’ do segmento de gene VH1-2 humano e a terminação 3’ do local ADAM6 está cerca de 18.078 pares de base da terminação 5’ do segmento de gene VH1-2 humano. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo compreende a SEQ ID NO: 3 ou um fragmento do mesmo que confere função de ADAM6 dentro das cÈlulas do camundongo. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo compreende a SEQ ID NO: 73 ou um fragmento do mesmo que confere função de ADAM6 dentro das cÈlulas do camundongo. Em uma modalidade específica, o local ADAM6 de camundongo compreende a SEQ ID NO: 77 ou um fragmento do mesmo que confere função de ADAM6 dentro das cÈlulas do camundongo. Em uma modalidade específica, o arranjo do segmento de genes humanos È ent„o o seguinte (de a montante atÈ a jusante com relação à direção de transcrição do segmento de genes humanos): local ADAM6 de camundongo-human VH1-2-humano-DH 1-1. Em uma modalidade, a orientação de um ou mais de ADAM6a de camundongo e ADAM6b de camundongo do local ADAM6 de camundongo È oposta com relação à direção de transcrição quando comparada com à orientação do segmento de genes humanos. Alternativamente, o local ADAM6 de camundongo esta presente de 3’ até, ou a jusante do segmento de gene VH humano único.

[00395] Similarmente, um camundongo modificado com um ou mais segmentos de gene humano VL (por exemplo, segmentos VK OU V)) uee substituem todos ou substancialmente todos segmentos de gene de camundongo VH endógenos podem ser modificados de modo a manter o local ADAM6 de camundongo endógeno, como descrito acima, por exemplo, utilizando-se um vetor de alvejamento tendo um ramo de homologia a jusante que inclui um local ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional do mesmo, ou para substituir um local ADAM6 de camundongo danificado com uma sequíncia ectópica posicionada entre dois segmentos de gene VL humano ou entre os segmentos de gene humano VL e um segmento de gene DH (se humano ou de camundongo, por exemplo, VÀ+ + m/hDH), ou um segmento de gene J (se humano ou de camundongo, por exemplo, VK + JH). Em uma modalidade, a substituição inclui dois ou mais segmentos de gene humano VL, e o local ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional do mesmo esta presente entre os dois segmentos de gene mais à 3’ VL. Em uma modalidade específica, o arranjo dos segmentos de gene humano VL È ent„o o seguinte (de a montante atÈ a jusante com relação à direção de transcrÍção dos segmentos de genes humanos): human VL3’-1 - locaA DDAM6 dccamundongo -VL3’ humano. Em uma modalidade, a orientação de um ou mais de DDDA6a de camundongo e DDDA6b de camundongo do local DDDA6 de camundongo È oposto com relação à direção de transcrÍção quando comparada com a orientação dos segmentos de gene VL humano. Dlternativamente, o local DDDA6 de camundongo esta presente na região intergínica entre o segmento de gene VL humano mais à 3’ e o segmento de gene DH mais a 5’. Este pode ser o caso se o segmento DH mais a 5’ é camundongo ou humano.

[00396] Em um aspecto, um camundongo È fornecido com uma substituição de um ou mais segmentos de gene de camundongo VH endógeno, e que compreende pelo menos um segmento de gene D do camundongo H endógeno. Em tal camundongo, a modificação dos segmentos de gene de camundongo VH endógeno pode compreender uma modificação de um ou mais dos segmentos de gene VH mais à 3’, mas não o segmento de gene DH mais a 5’, onde cuidado é tomado de modo que a modificação do um ou mais segmentos de gene VH mais a 3’ não rompe ou confere o local ADAM6 de camundongo endógeno não funcional. Por exemplo, em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene de camundongo VH endógenos com um segmento de gene VH humano úmeo, e o camundongo compreende um ou mais segmentos de gene DH endógenos e um local de DDDA6 de camundongo endógeno funcional.

[00397] Em uma outra modalidade, o camundongo compreende a modificação de segmentos de gene VH de camundongo endógenos mais à 3’, e uma modificação de um ou mais segmentos de gene de camundongo DH endógenos, e a modificação È realizada de modo a manter a integridade do local DDDA6 de camundongo endógeno atÈ o grau em que o local DDDA6 endógeno permanece funcional. Em um exemplo, tal modificação È feita em duas etapas: (1) que substituem os segmentos de gene de camundongo VH endógenos mais à 3’ com um segmento de gene VH humano único utilizando um vetor de alvejamento com um ramo de homologia a montante e um ramo de homologia a jusante em que o ramo de homologia a jusante inclui todo ou um porç„o de um local ADAM6 funcional de camundongo; (2) depois substituindo o segmento de gene DH do camundongo endógeno com um vetor de alvejamento tendo um ramo de homologia a montante que inclui toda ou uma porç„o funcional de um local ADAM6 de camundongo.

[00398] Em vários aspectos, a utilização de camundongos que contím uma sequíncia ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo ou funcional homólogo do mesmo È útil onde as modificaÁies rompem a função de ADAM6 de camundongo endógeno. A probabilidade de interromper a função de ADAM6 de camundongo endógena È alta quando fabricando modificaÁies aos locais de imunoglobulina de camundongo, em particular, quando modificando as regiles variáveis de cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo e sequíncias adjacentes. Portanto, tais camundongos fornecem benefício particular quando produzindo camundongos com locais de cadeia pesada da imunoglobulina que são excluídos no todo ou em parte, são humanizados no todo ou em parte, ou são substituídos (por exemplo, com sequências VK ou VÀ) no todo ou em parte. Os mÈtodos para produzir as modificaÁies genÈticas descritas para os camundongos são descritos abaixo e conhecidos àqueles versados na tÈcnica.

[00399] Os camundongos contendo uma sequíncia ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo, ou uma proteína substancialmente idíntica ou similar que confere os benefícios de fertilidade de uma proteína ADAM6 de camundongo, são particularmente úteis em conjunção com as modificaÁies a um local de gene variável da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo que interrompe ou exclui a sequíncia de ADAM6 de camundongo endógena. Embora principalmente descritos em conex„o com os camundongos que expressam anticorpos com regiles variáveis humanas e regiles constantes de camundongo, tais camundongos são tácis em oonexoo com qualquer modfficÁção genética que interrompe o gene ADAM6 endógeno de camundongos. Pessoas habilitadas reconhecerço que isto abrange uma ampla variedade de camundongos geneticamente modificados que contím modificaçles de locais de gene variável da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. Estes incluem, por exemplo, camundongos com uma exclusço ou uma substituiçço de todos ou uma porçço de segmentos de gene de camundongo da cadeia pesada da imunoglobulina, sem levar em consideraçço outras modificaçles. Os exemplos não limitantes são descritos abaixo.

[00400] Em alguns aspectos, os camundongos geneticamente modificados são fornecidos os quais compreendem um camundongo ectópico, roedor, ou outro gene ADAM6 (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento) funcional em um camundongo, e um ou mais segmentos de gene da regiço variável e/ou constante de imunoglobulina humana. Em várias modalidades, outros genes ADAM6 ortólogos ou homólogos ou fragmentos funcionais em um camundongo podem incluir as sequíncias de bovinos, caninos, primatas, coelhos ou outras sequíncias não humanas.

[00401] Em um aspecto, um camundongo é fornecido o qual compreende uma sequíncia de ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional, uma substituiçço de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo com um segmento de gene VH humano úmco; mma substiiuição de todos ou subce<cialelmente lodos segmentos de gene de camundongo DH com um ou mais segmentos de gene DH humano; e uma substituiçço de todos ou substancialmente todos segmentos de gene de camundongo JH com um ou mais segmentos de gene JH humanos.

[00402] Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituÍção de uma sequíncia de nucleotídeo de camundongo CH1 com uma sequíncia de nucleotídeo humana CH1. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituÍção de uma sequíncia de nucleotídeo de dobradiÁa de camundongo com uma sequíncia de nucleotídeo de dobradiÁa humana. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituição de um local variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL e JL) com um local variável da cadeia leve de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituição de uma sequíncia de cadeia leve da região constante de nucleotídeo da imunoglobulina de camundongo com uma sequíncia de cadeia leve da região constante de nucleotídeo da imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, VL, JL, e CL são sequências de cadeia leve de imunoglobulina K. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende um camundongo CH2 e uma sequíncia da região constante de imunoglobulina CH3 de camundongo fundida com uma dobradiÁa humana e uma sequíncia CH1 humana, tal que os locais de imunoglobulina de camundongo rearranjam para formar um gene que codifica uma ligação proteica compreendendo (a) uma cadeia pesada que tem uma região variável humana, uma região CH1 humana, uma região de dobradiÁa humana, e uma camundongo região CH2 e CH3 de camundongo; e (b) um gene que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende um domínio variável humano e uma região constante humana.

[00403] Em um aspecto, um camundongo È fornecido o qual compreende uma sequíncia de ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo com um ou mais segmentos de gene VL humanos, e opcionalmente uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene DH e/ou segmentos de gene JH com um ou mais segmentos de gene DH humano e/ou segmentos de gene JH humanos, ou opcionalmente uma substituÍção de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene DH e segmentos de gene JH com um ou mais segmentos de gene JL humano.

[00404] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene de camundongo VH, DH, e JH com um ou mais VL, um ou mais DH, e um ou mais segmentos de gene J (por exemplo, JK OU JÀ), em que os eegmentos de gnue são operavelmente ligados a uma região de dobradiÁa de camundongo endógena, em que o camundongo forma uma cadeia gene de imunoglobulina rearranjada que contém, de 5’ a 3’ na direção de transcrição, VL humano-ÜH humano ou de camundongo - J Imano o ou clccaaiuaclongo - dobradiça de camundongo C CH2 de camundongo CDR3 de camundongo. Em uma modalidade, a região J é uma região JK Uumana. ma uma modalidade, a região J È uma região JH humana. Em uma modalidade, a região J È uma região JJ humana. Em uma madaiiOade, aeegioo VL humana È selecionada de uma região VJ liumana e uma região VK Umama.

[00405] Nas modalidades específicas, o camundongo expressa um anticorpo de domínio variável íuuco ndido mma gegião conana^ de camundongo ou humana e uma região variável derivada de um VK humano, um humano DH e um JK lumanio.): uai VK ]lumaaO] aai DH humano, e um JH humano; um VJ liuiaaao. um DH humano, e um JJ humano; um VJh Umnano, um DH humano, e um JH humano; um VK humano, um DH humano, e um JJ humano; um VJ umano^o, n DH humano, e um JK Uumano. Em maa modalidade específica, as sequíncias de reconhecimento de recombinario são modificadas de modo a permitir que rearranjos produtivos ocorram entre os segmentos de gene V, D, e J citados ou entre os segmentos de gene V e J citados.

[00406] Em um aspecto, um camundongo È fornecido o qual compreende uma sequíncia de ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo), uma substituÍção de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo com um ou mais segmentos de gene VL humano, uma substituição de todos ou substancialmente todos segmento de gene DH do camundongo e segmentos de gene JH com segmentos de gene JL humano; em que o camundongo carece de um CH1 e/ou região de dobradiÁa.

[00407] Em uma modalidade, o camundongo carece de uma sequíncia que codifica um domínio CH1. Em uma modalidade, o camundongo carece de uma sequíncia que codifica uma região de dobradiÁa. Em uma modalidade, o camundongo carece de uma sequíncia que codifica um domínio CH1 e uma região de dobradiÁa.

[00408] Em uma modalidade específica, o camundongo expressa uma ligação proteica que compreende um domínio de cadeia leve variável de imunoglobulina humana (À ou KffuddiOo u um OomínOo CH2 de camundongo que È ligado a um domínio CH3 de camundongo.

[00409] Em um aspecto, um camundongo È fornecido o qual compreende uma sequíncia de ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional do mesmo), uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VH de camundongo com um ou mais segmentos de gene VL humano, uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene DH e JH de camundongo com segmentos de gene JL humano.

[00410] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma exclusão de uma sequíncia de gene de cadeia pesada da região constante da imunoglobulina que codifica uma região CH1, uma região de dobradiÁa, um CH1 e uma região de dobradiÁa, ou uma região CH1 e uma região de dobradiÁa e uma região CH2.

[00411] Em uma modalidade, o camundongo produz uma proteína de ligação de domínio variável única compreendendo um liomoclímcro selecionado do seguinte: (a) VL humano - CR1 de camundongo - CH2 de camundongo - CH3 de camundongo; (b) VL humano - dot>i^a^.ça de camundongo - CH2 de camundongo - CH3 de camundongo; (c) VL humano - -H2 de camundongo -CH3 de camundongo.

[00412] Em um aspecto, um camundongo È fornecido com um local da cadeia pesada endógeno da imunoglobulina desabilitado, compreendendo um local ADAM6 de camundongo endógeno desabilitado ou excluído, em que o camundongo compreende uma sequíncia de •cido nuclÈico que expressa um anticorpo quimÈrico humano ou de camundongo ou humano/camundongo ou outro. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico está presente em um transgene integrado que È aleatoriamente integrado dentro do genoma do camundongo. Em uma modalidade, a sequíncia de •cido nuclÈico está em um epissoma (por exemplo, um cromossomo) não encontrado em um camundongo do tipo selvagem.

[00413] Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda um local de cadeia leve da imunoglobulina endógena desabilitado. Em uma modalidade específica, o local de cadeia leve da imunoglobulina endógena È selecionado de um local de cadeia leve capa (K) e um lambda (À). Em uma modalidade esjee<ífii<aa, o camundongo compreende im local cie cadeia hc^.eK K endógena desabilitado e um local de cadeia leve d clasaliiato(.k).oii que o camundongo expressa um anticorpo que compreende um domínio vartável de cadeia pesada da imunoglobulina humana e um domínio de cadeia leve da imunoglobulina humana. Em uma modalidade, the domínio de cadeia leve de imunoglobulina humana é selecionado de um domínio de cadeia leve K humano e um domínio de cadeia leve h uumaoo.

[00414] Em um aspecto, um animal geneticamente modificado È fornecido o qual expressa um anticorpo quimÈrico e expressa uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo da mesma, que seja funcional no animal geneticamente modificado.

[00415] Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È selecionado de um camundongo e um rato. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È um camundongo, e a proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo da mesma È de uma cepa de camundongo que È uma cepa diferente do que o animal geneticamente modificado. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È um roedor da família Cricetidae (por exemplo, um hmnster, um rato New World ou camundongo, um rato silvestre), e a proteína ADAM6, ortólogo ou homólogo È de um roedor da família Mrriaa( (por exemplo, camundongo verdadelro ou into, gerbo, camundongo espinhoso, rato cristado). Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado È um roedor da família MuriOa,, e o ortoiogo ou homólogo da proteína ADAM6 È de um roedor da família Cricetidae.

[00416] Em uma modalidade, o anticorpo quimÈrico compreende um domínio variável humano e uma sequíncia da região constante de um roedor. Em uma modalidade, o roedor È selecionado de um roedor da família Cricetidae e um roedor da íairnlia Ulndar.min mma modalidade cspccifiam o roedor da família Ccicrticaee d dfamm^M Muridae C um camundongx. Em uma modalidade específica, o roedor da família Ccicriidae d daCamália Muridae é um mU). Em uma modaUdadc. o aniicorpo quimérico compeeende um domínio variável humano e um domínio constante de um animal selecionado de um camundongo ou rato; em uma modalidade específica, o camundongo ou rato È selecionado da família ('cicriidae d daXamília Muridae. Em uma modalidade, o anticorpo quimÈrico compreende um domínio variável de cadeia pesada humano, um variável domínio de cadeia leve humano e uma sequíncia da região constante derivada de um roedor selecionado de camundongo e rato, em que o domínio variável de cadeia pesada humana e a da cadeia leve humana são cognatos. Em uma modalidade específica, cognato inclui que os domínios variáveis de cadeia pesada humana e a cadeia leve humana são de uma cÈlula B úmaa que expess^ o vrriwel domínio de cadeia leve humana e o domínio variável de cadeia pesada humana juntos e apresentam os domínios variáveis juntos na superfície de uma cÈlula B individual.

[00417] Em uma modalidade, o anticorpo quimÈrico È expressado de um local da imunoglobulina. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo quimÈrico È expressado de um local da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno rearranjado. Em uma modalidade, o domínio de cadeia leve variável do anticorpo quimÈrico È expressado de um local de cadeia leve da imunoglobulina endógena rearranjado. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo quimÈrico e/ou o domínio de cadeia leve variável do anticorpo quimÈrico È expressado de um transgene rearranjado (por exemplo, uma sequíncia de •cido nuclÈico rearranjada derivada de uma sequíncia de •cido nuclÈico não rearranjado integrado dentro do genoma do animal em um local outro que não um local endógeno da imunoglobulina). Em uma modalidade, o domínio de cadeia leve variável do anticorpo quimÈrico È expressado de um transgene rearranjado (por exemplo, uma sequíncia de ácido nuclÈico rearranjada derivada de uma sequíncia de ácido nuclÈico não rearranjado integrado dentro do genoma do animal em um local outro que não um local endógeno da imunoglobulina).

[00418] Em uma modalidade específica, o transgene È expressado de um local transcricionalmente ativo, por exemplo, um local ROSA26, por exemplo, um local ROSA26 de murino (por exemplo, camundongo).

[00419] Em um aspecto, um animal não humano È fornecido, compreendendo um local da cadeia pesada da imunoglobulina humanizado, em que o local da cadeia pesada da imunoglobulina humanizado compreende uma sequíncia de ADAM6 não humana ou ortólogo ou homólogo da mesma.

[00420] Em uma modalidade, o ortólogo ou homólogo da ADAM6 não humanos são uma sequíncia que È ortóloga e/ou homóloga a uma sequíncia de ADAM6 de camundongo, em que o ortólogo ou homólogo È funcional no animal não humano.

[00421] Em uma modalidade, o animal não humano È um roedor selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[00422] Em uma modalidade, o animal não humano È selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 È de um animal não humano selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster. Em uma modalidade específica, o animal não humano È um camundongo e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 È de um animal que È selecionado de uma espÈcie de camundongo diferente, um rato, e um hamster. Em uma modalidade específica, o animal não humano È um rato, e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 È de um roedor que È selecionado de uma espÈcie de rato, camundongo, e hamster diferentes. Em uma modalidade específica, o animal não humano È um hamster, e o ortólogo ou homólogo de ADAM6 È a forma de um roedor que È selecionado de uma espÈcie de hamster diferente, um camundongo, e um rato.

[00423] Em uma modalidade específica, o animal não humano È da subordemMyomrrpha, e a sequência de DDDM6 é cie um animal selecionado de um roedor da superfamília Diooddèdea e um roedor da superfamília Muroidea. Em uma modalidade específica, o roedor È um camundongo da superfamília Moro'idea, e o ortooooo uu hmnólggo ee ADAM6 é ee mn camundongo ou um rato ou um hamster da superfamília Mordèaea.

[00424] Em uma modalidade, o local de cadeia pesada humanizada compreende um segmento de gene VH humano único, um on mais eegmentos de gene DH humano e um ou mais segmentos de gene JH humanos. Em uma modalidade específica, o segmento de gene VH humano, um ou mais segmentos de gene DH humano e um ou mais segmentos de gene JH humanos são operavelmente ligados a um ou mais genes de região constante humanos, quimÈricos e/ou de roedores (por exemplo, camundongo ou rato). Em uma modalidade, os genes da região constante são de camundongo. Em uma modalidade, os genes da região constante são de rato. Em uma modalidade, os genes da região constante são de hamster. Em uma modalidade, os genes da região constante compreendem uma sequÍncia selecionada de uma dobradiÁa, um CH2, um CH3, e uma combinação dos mesmos. Nas modalidades específicas, os genes da região constante compreendem uma sequíncia de dobradiÁa, um CH2, e um CH3.

[00425] Em uma modalidade, a sequíncia ADAM6 não humana È contígua com uma sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina humana. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 não humana È posicionada dentro de uma sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, a sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina humana compreende um segmento de gene V, D e/ou J.

[00426] Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 não humana È justaposta com um segmento de gene V. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 não humana È posicionada entre dois segmentos de gene V. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 não humana È justaposta entre um segmento de gene V e D. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 de camundongo È posicionada entre um segmento de gene V e J. Em uma modalidade, a sequíncia de ADAM6 de camundongo È justaposta entre um segmento de gene D e J.

[00427] Em um aspecto, um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, compreendendo uma cÈlula B que expressa um cognato do domínio VH humano com um domínio VL humano de um local da imunoglobulina, em que o animal não humano expressa uma proteína que não imunoglobulina não humana do local da imunoglobulina. Em uma modalidade, a proteína que não imunoglobulina não humana È uma proteína ADAM. Em uma modalidade específica, a proteína ADAM È uma proteína ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional da mesma.

[00428] Em uma modalidade, o animal não humano È um roedor (por exemplo, camundongo ou rato). Em uma modalidade, o roedor È da família Muridae. Em uma modalidade, o roedor È da subfamília Minimae. hm uma modalidade específica, o roedor da subfamília MuriíaaÈ é selecionada de um camundongo e um rato.

[00429] Em uma modalidade, a proteína humana que não imunoglobulina não È uma proteína de roedor. Em uma modalidade, o roedor È da famíliaMuridae. Imi uma ucaallaaae^, o 1'ocdor é chi sufíamília lUrirnae. Em uma modalidade específica, o roedor È selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[00430] Em uma modalidade, os domínios VH e VL humanos são ligados diretamente ou atravÈs de um ligador a uma sequíncia de domínio constante de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a sequíncia de domínio constante compreende uma sequíncia selecionada de uma dobradiÁa, um CH2 um CH3, e uma combinação do mesmo. Em uma modalidade específica, o domínio de VL humano é selecionado de um domínio VK OU um VÀ.

[00431] Em um aspecto, um animal não humano geneticamente modificado È fornecido, compreendendo na sua linha germinativa uma sequíncia da imunoglobulina humana, em que o esperma de um macho animal não humano È caracterizado por um defeito de migração m vioo. hm uma modalidade, o defeito de migração m imo cumpreeadeuma incapaciddde do esperma do animal macho não humano de migrar de um útero afiavés de um oviduto de um animal não humano fímea da mesma espÈcie. Em uma modalidade, o animal não humano carece de uma sequíncia de nucleotídeo que codifica a proteína ADAM6 ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade específica, a proteína ADAM6 ou fragmento funcional do mesmo inclui uma proteína ADAM6a e/ou uma proteína ADAM6b ou fragmentos funcionais das mesmas. Em uma modalidade, o animal não humano È um roedor. Em uma modalidade específica, o roedor È selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[00432] Em um aspecto, um animal não humano È fornecido, compreendendo uma sequÍncia da imunoglobulina humana contígua com uma sequíncia não humana que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional da mesma. Em uma modalidade, o animal não humano È um roedor. Em uma modalidade específica, o roedor È selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.

[00433] Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina humana È uma sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina compreende um línio) segmento de gene VH. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina humana compreende um ou mais segmentos de gene DH. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina humana compreende um ou mais segmentos de gene JH. Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina humana compreende um único segmento de gene VH, um ou mais de gene DH e um ou mais segmentos de gene JH.

[00434] Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina compreende um nnnoo segnlento de enee VH que está associado com polimorfismo em repertórios humanos naturais. Em uma modalidade específica, o único segmento ee guie VH È selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ou VH3-23 humano. Em uma outra modalidade específica o único segmento de gene VH È VH1-2. Em uma outra modalidade específica, o único segmento de gene VH È VH1-69.

[00435] Em uma modalidade, a sequíncia da imunoglobulina compreende um nmoo segmento ee enee VH que esta associado com um número de cópias múltiplas em repertórios humanos naturais. Em uma modalidade específica, o único segmento cie gt<cm VH È selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, ou VH3-23 humano. Em uma outra modalidade específica o úmeo segmento de gene VH È VH1-2. Em uma outra modalidade específica, o único segmento die gene VH È VH1-69.

[00436] Em várias modalidades, o segmento de gene VH È selecionado de VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4- 28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4- 61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 e VH3-74.

[00437] Em várias modalidades, o segmento de gene VH È selecionado da Tabela 1 e È representado em repertórios humanos naturais por cinco ou mais alelos. Em uma modalidade específica, o gene VH È selecionado de VH1- 2, VH1-69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3- 64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51 e VH7-4-1.

[00438] Em uma modalidade, o animal não humano È um camundongo, e o camundongo compreende uma substituição de segmentos endógenos de gene de camundongo VH com um segmento de gene VH humano úmco, em que o segmento de gene VH humano È operavelmente ligado a um gene de região CH de camundongo, tal que o camundongo rearranja o segmento de gene VH humano e expressa uma cadeia pesada de imunoglobulina reversa que compreende um domínio de VH humano e um CH de camundongo. Em uma modalidade, 90 a 100% dos segmentos de gene de camundongo VH não rearranjados são substituídos com um segmento de gene VH humano não rearranjado. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos dos segmentos de gene de camundongo VH endógenos são substituídos com um segmento de gene VH humano não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição È com um segmento de gene VH1-69 humano não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição È com um segmento de gene VH1-2 humano não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição È com um segmento de gene VH2-26 não rearranjado humano. Em uma modalidade, a substituÍção È com um segmento de gene não rearranjado VH2-70 humano. Em uma modalidade, a substituição È com um segmento de gene não rearranjado VH 3-23 humano.

[00439] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos os segmentos de DH e JH de camundongo com pelo menos um segmento de DH humano não rearranjado e pelo menos um segmento JH não rearranjado humano. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento não rearranjado DH humano È selecionado de 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 215, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento JH não rearranjado humano È selecionado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, e uma combinação do mesmo.

[00440] Em varias modalidades, a sequíncia da imunoglobulina humana está em ligação operável com uma região constante na linha germinativa do animal não humano (por exemplo, o roedor, por exemplo, o camundongo, rato, ou hamster). Em uma modalidade, a região constante È uma região constante humana, humana/camundongo quimÈrica ou human/rato quimÈrica ou humana/hamster quimÈrica, um camundongo, um rato, ou um hamster. Em uma modalidade, a região constante È uma região constante de roedor (por exemplo, camundongo ou rato ou hamster). Em uma modalidade específica, o roedor È um camundongo ou rato. Em várias modalidades, a região constante compreende pelo menos um domínio CH2 e um domínio CH3.

[00441] Em uma modalidade, a sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina humana está localizada em um local da cadeia pesada da imunoglobulina na linha germinativa do animal não humano (por exemplo, o roedor, por exemplo, o camundongo ou rato ou hamster). Em uma modalidade, a sequíncia da cadeia pesada da imunoglobulina humana está localizada em um local da cadeia pesada da não imunoglobulina na linha germinativa do animal não humano, em que o local de cadeia não pesada È um local transcricionalmente ativo. Em uma modalidade específica, o local de cadeia não pesada È um local ROSA26.

[00442] Em vários aspectos, o animal não humano compreende ainda uma sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana (por exemplo, uma ou mais sequíncias V e J de cadeia leve não rearranjadas, ou uma ou mais sequíncias VJ rearranjadas) na linha germinativa do animal não humano. Em uma modalidade específica, a sequíncia de cadeia leve de imunoglobulina È uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina K. hm uma modalidade, a sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana compreende um ou mais segmentos de gene VL. Em uma modalidade, a sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana compreende um ou mais segmentos de gene JL. Em uma modalidade, a sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana compreende um ou mais segmentos de gene VL e um ou mais segmentos de gene JL. Em uma modalidade específica, a sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana compreende pelo menos 16 segmentos de gene VK e cinco segmentos de gene JK. Em uma modaiidade espccífica, a sequência da cadeia leve da imunoglobulina humana compreende pelo menos 30 segmentos de gene VK e cinco segmentos de gene JK. Em uma modaUdade específica, a sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana compreende pelo menos 40 segmentos de gene VK e cmeo e^emmciUos de gene JK. mi varias modalidades, a sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana está em ligação operável com uma região constante na linha germinativa do animal não humano (por exemplo, roedor, por exemplo, camundongo ou rato ou hamster). Em uma modalidade, a região constante È uma região constante humana, quimÈrica humana/roedor, camundongo, rato, ou hamster. Em uma modalidade específica, a região constante È uma região constante de camundongo ou rato. Em uma modalidade específica, a região constante È uma região constante de camundongo K (mCi<) ou uma regtãoconsiante de rato K(CCK).

[00443] Em uma modalidade, o animal não humano È um camundongo e o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VK e JK omm pelo mnnos seis semmnntod ee enne VK luminuos e pilo memos um segmnnlo de gnne KK. Imi uma modalidade, todos cu substancialmente todos segmentos de gene VK e JK sCo substituídos com pelo menos 16 segmentos de gene VK Uumannss (VK liumauo) e pelo menos um segmento de gene JK. Em uma modahdade, todos ou substancialmente todos segmentos de gene VK e JK scosubstituídos mm pdo menos 30 segmentos de gene VK h^immanoss e plOo menoss mm semmnnto ee gene JK. Em uma modalidade, todos ou sibssUuciuime^^uk.' todos segmentos de gene VK e Ks oàs uubstitmdoscom polo meno4 4() gemeneotod dg gene VK humanos e pelo menos um segmento de gene JK. Em uma modaiídade, o pelo menos um segmento de gene JK omirteend^ Ooõs, tiòs. uatitoo. ou cmoo segmentos de gene JK humamo.

[00444] Em uma modalidade, os segmentos de gene VK umnaoss compreendem VK4-1, VK5-2, VK7-3, VK2-4, VK1-5, e VK1-6. Em uma modalidade, os segmentos de gene VK compsenndem VK3-7, ('K1-8. VK1-9, VK2-10, VK3-11, VK1-12, VK1-13, VK2-14, VK3-15 e VK1-16. Em uma modalidade, os segmentos de gene VK humímos compeeendem (Kl — -!?. VK2- -8, VK2-19, VK3-20, VK6-21, VK1-22, VK1-23, VK2-24, VK3-25, VK2-26, VK1-27, VK2-28, VK2-29, e VK2-30. Em uma modalidade, os segmentos de gene VK humanos compeeendem VK3-31, VK1-32, VK1-33, VK3-34, VK1-35, VK2-36, VK1-37, VK2-38, VK1-39, e VK2-40.

[00445] Em uma modalidade sseccífica, ss semmnntos ee enee VK compreendem segmentos de gene de imunoglobulina K colttís^ua Uomnca uee transpõem o local de cadeia leve de imunoglobulina h liumaiid de V—4-1 através de VK2-40, e os segmentos de gene JK compsenlídem segmnntos ee gene contíguos que transpõem o local de cadeia leve de imunoglobulina K humana de JK- até JK5.

[00446] Em uma modalidade, a sequíncia da cadeia leve da imunoglobulina humana está localizada em um local de cadeia leve de imunoglobulina na linha germinativa do animal não humano. Em uma modalidade específica, o local de cadeia leve de imunoglobulina na linha germinativa do animal não humano È um local de cadeia leve de imunoglobulina K. Em mma modalidade, asequênctá cciceia^in leve da imunoglobulina humana está localizada em um local de cadeia leve que não imunoglobulina na linha germinativa do animal não humano que È transcricionalmente ativa. Em uma modalidade específica, o local que não imunoglobulina È um local ROSA26.

[00447] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um anticorpo humano È fornecido, em que o anticorpo humano compreende domínios vartáveis derivados de uma ou mais sequíncias de •cido nuclÈico de região vartável codificadas em uma cÈlula de um animal não humano como aqui descrito.

[00448] Em um aspecto, um mÈtodo para fabricar um anticorpo anti- idiotipo È fornecido, em que o anticorpo anti-idiotipo compreende os domínios vartáveis derivados de uma ou mais sequíncias de •cido nuclÈico de região vartável codificadas em uma cÈlula de um animal não humano como aqui descrito, o mÈtodo compreendendo expor um animal não humano como aqui descrito a um anticorpo compreendendo domínios vartáveis humanos. Em uma modalidade, o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio vartável de cadeia pesada humano. Em uma modalidade, o anticorpo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio de cadeia leve vartável humano.

[00449] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio vartável de cadeia pesada humano, em que o domínio vartável de cadeia pesada humano compreende segmentos de gene VH humano rearranjados selecionados de VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1- 18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3- 48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 e VH3-74.

[00450] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio variável de cadeia pesada humano, em que o domínio variável de cadeia pesada humano compreende um segmento de gene VH humano rearranjado selecionado de VH1-2, VH1-69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3-64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51 e VH7-4-1.

[00451] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio variável de cadeia leve humano, em que o domínio variável de cadeia leve humano compreende segmentos de gene VK eearmjados humanos selecOonados cie VK4-1, VK5-2, VK7-3, VK2-4, VK1-5I VK1-6, VK3-7, VK1-K, VK1-9, VK2-10, VK3-11, VK1- 12, VK1-13, VK2-14, VK3-15, VK1-16, VK1-17, VK2-1K, VK2-19, VK3-20, VK6-21, VK1-22, VK1-23, VK2-24, VK3-25, VK2-26, VK1-27, VK2-2K, VK2- 29, VK2-30, VK3-31, VK1-32, VK1-33, VK3-34, VK1-35, VK2-36, VK1-37, VK2-3K, VK1-39, e VK2-40.

[00452] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio variável de cadeia leve humano, em que o domínio variável de cadeia leve humano compreende segmentos de gene VK1-39 rearranjados humanos.

[00453] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio variável de cadeia leve humano, em que o domínio variável de cadeia leve humano compreende um segmento de gene VÀ ecaiaarijao') Uumano selccOonaOo de V33-1, V4—--3. VÀ2-8, VÀ3-9, VÀ3-10, VÀ2-11, VX3-12, VÀ2-14, VÀ3-16, VX2-18, VÀ3-19, VÀ3-21, VÀ3-22, VÀ2-23, VÀ3-25, VÀ3-27, VÀ3-32, VÀ2-33, VÀ2-34, VÀ.1- 36, VÀ.1-40, VÀ7-43, VM-44, VÀ5-45, VÀ7-46, VM-47, VÀ5-4K, VÀ9-49, VÀ1-50, VÀ.1-51, VÀ5-52, VM0-54, VM1-55, VÀ6-57, VÀ4-60, V^ól, e VÀ4-69.

[00454] Em uma modalidade, um mÈtodo para fabricar um anticorpo anti-idiotipo È fornecido, em que o anticorpo anti-idiotipo compreende os domínios variáveis derivados de uma ou mais sequíncias de •cido nuclÈico de região variável codificada em uma cÈlula de um animal não humano que compreende um local da cadeia pesada da imunoglobulina restrito compreendendo um segmento de gene VH humano único, 227 segnenatos de gene DH, e seis segmentos de gene JH, e em que o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio variável de cadeia pesada humano compreendendo um segmento de gene VH1-69 rearranjado humano, o mÈtodo compreendendo expor o animal não humano a um anticorpo compreendendo o segmento de gene VH1-69 humano rearranjado e isolar o anticorpo anti-idiotipo do animal não humano. Em uma modalidade específica, o segmento de gene VH humano úmeo é seSectonado de um VH1-2 humano e um segmento de gene VH1-69 humano.

[00455] Em uma modalidade, um mÈtodo para fabricar um anticorpo anti-idiotipo È fornecido, em que o anticorpo anti-idiotipo compreende os domínios variáveis derivados de uma ou mais sequíncias de ácido nuclÈico codificada de regiles variáveis em uma cÈlula de um animal não humano que compreende um local da cadeia pesada da imunoglobulina restrito compreendendo um segmento de gene VH humano úmoo, 227 segmentos ee gene DH, e seis segmentos de gene JH, e em que o anticorpo anti-idiotipo È específico para ou È capaz de ligar a um domínio variável de cadeia leve humano compreendendo um semeieotos de gene VK1-39 rearranjados humanos, o mÈtodo compreendendo expor o animal não humano a um anticorpo compreendendo o segmento de gene VK1-39 humano e isolar o anticorpo do animal não humano. Em uma modalidade específica, o segmento de gene VH humano único é selecionada de um VH1-2 humano e um segmento de gene VH1-69 humano.

[00456] Em um aspecto, uma composição farmacíutica È fornecida, compreendendo um polipeptídeo que compreende anticorpo ou fragmento de anticorpo que È derivado de uma ou mais sequíncias de •cido nuclÈico de região variável isoladas de um animal não humano como aqui descrito. Em uma modalidade, o polipeptídeo È um anticorpo. Em uma modalidade, o polipeptídeo È um anticorpo apenas de cadeia pesada. Em uma modalidade, o polipeptídeo È um fragmento de cadeia variável uníco (por xxemplo, mn scFv).

[00457] Em um aspecto, o uso de um animal não humano como aqui descrito para fabricar um anticorpo È fornecido. Em várias modalidades, o anticorpo compreende um ou mais domínios variáveis que são derivados de uma ou mais sequíncias de ácido nuclÈico de região variável isoladas do animal não humano. Em uma modalidade específica, as sequíncias de ácido nuclÈico de região variável compreendem segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, as sequíncias de ácido nuclÈico de região variável compreendem os segmentos de gene de imunoglobulina de cadeia leve.

EXEMPLOS

[00458] Os seguintes exemplos são fornecidos de modo a descrever para aqueles versados na tÈcnica como fabricar e usar os mÈtodos e composiÁies da invenção, e não são intencionados limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. A menos que de outro modo indicado, a temperatura È indicada em Celsius, e a pressão È na ou próxima à atmosfÈrica.

Exemplo 1 Construção de um Local de IgH Humanizado Restrito

[00459] Um local de cadeia pesada humana unicamente engenheirado contendo um segmento de gene VH humano único loaaizzado a montante de todos os segmentos de gene DH e JH humanos pode ser construído atravÈs da recombinação homóloga usando DNA de Cromossoma Artificial de Camundongo (BAC). Os segmentos de gene VH humanos utilizados para a construção de tal local da cadeia pesada da imunoglobulina incluem segmentos polimórficos de gene VH e/ou segmentos de gene VH associados com uma variação no número de cópias, tal como, por exemplo VH1-2, VH1- 69, VH2-26, VH2-70, e VH3-23. A tecnologia de engenharia genÈtica VELOCAISGENE® pode ser utilizada para a criação de um iiní^') VH contendo o local de cadeia pesada usando várias construÁies alvo (ver a, por exemplo, a Pat. US No 6.586.251 e Valenzuela, D.M. et a/., 2003, High- throughput deput engineering of the mouse genoma coupled with high- resolution expression analysis. Nature Biotecnology 2((6): 652-659).

[00460] EstrEtégioExemplar paraUcmstrução Le um Eocgl de IgH Restrito Humano VH1-69 (FIG. 1). Na primeira etapa,, um segmento cee gene VH humanos distal múltiplo (5’) contendo BAC humano modificado, incluindo VH1-69, um cassete de seleção a montante (por exemplo, higromicina) e um ramo de homologia de arnuundonoo 5’ íóaam alvejados pela recombinação homóloga com um segundo cassete de seleção (por exemplo, espectinomicina), que tambÈm continha uma sequíncia de sinal de recombinação modificada (Etapa 1, FIG. 1). Esta sequíncia de sinal de recombinação modificada (RSS) introduziu duas mutaÁies de ponto (T a A e G a A) na região RSS 3’ do gene humano VH1-69 mudando o nonâmero RSS atÈ a sequíncia de consenso ótima. Deste modo, a Etapa 1 resultou em um fragmento genômico humano contendo o segmento de gene VH1-69 humano com um RSS 3’ modificado, um local de restrição AoiSI único de cerca de 180 pares de base a jusante do RSS e um cassete de espectinomicina.

[00461] A Etapa 2 incluiu o uso de um cassete de neomicina (Neo) flanqueado pelos locais Frt para excluir o cassete de seleção (higromicina) e segmentos de gene VH humano a montante adicional (5’). Esta modificação foi alvejada, através da recombinação homóloga, 5’ até o segmento de gene VH1-69 humano para deixar intactos cerca de 8,2 kb da região promotora de VH1-69 hunamo e o ramo de homologia 5 ’ de camundongo.

[00462] A Etapa 3 incluiu um outro cassete de seleção (espectinomicina) flanqueado pelos locais de restrição unicamente engenheirados (por exemplo, PI-SceI e AsiSI) alvejados pela recombinação homóloga a um fragmento genômico humano contendo os tris primeiros segmentos de gene VH humano funcionais e todos os segmentos de gene DH e JH humano (FIG. 1). O fragmento genômico humano foi previamente alvejado atravÈs da recombinação homóloga com um cassete de neomicina e continha os ramos de homologia 5’ e 3’ contendo a sequência genômica de camundongo 5’ e 3’ do local da cadeia pesada endógeno incluindo o intensificado mtrônico 3’ e o gene IgMl. Esta modificação excluiu asequência genômica de camundongo 5’ e eemnnnoos de gnne VH humano, deixando cerca de 3,3 da regiço intergínica VH-DH a montante do segmento de gene humano DH1-1, todos os segmentos de gene humano DH e JH, e o fragmento genômico de camundongo 3’ contendo o intensificador intrônico 3’ e o gene IgM (FIG. 1).

[00463] A etapa 4 foi efetuada usando-se os locais de restria„o únicos (descritos acima) para cortar após a ligaa„o dos dois BACs modificados da Etapa 2 e Etapa 3, que produziu a construa„o alvo final. A construa„o alvo final para a criaa„o de uma cadeia pesada local modificada contendo um segmento de gene VH1-69 humano, todo o DH humano, e todos os segmentos de gene JH humanos nas células ES continham de 5’ a 3’, um ramo de homologia 5’ contendo cerca de 20 kb de sequência genômica de camundongo a montante do local da cadeia pesada endógena, um local 5’ Frt, um cassete de neomicina, um local 3’ Frt, cerca de 8,2 bb Oo roomotor humano VH1-69, o segmento de gene VH1-69 Uumaoo omi mi RSS 3’ modificado, 27 segmentos de gene DH humanos, seis segmentos JH humanos, e um 3 ’ ramo de homologia contendo cerca de Kk bb dasqqêancia gaôôimca de camundongo a jusante dos segmentos de gene de camundongo JH incluindo o intensificador intrônico 3’ e gene IgM (FIG. 1).

[00464] Eitratxeio Exemplar pcraa Uonotduçuo dL cm Local de IgH Human VH1-2 Restrito (FIG. 2). lee uma maneiaa similar, ouoos segmentos de gene VH polimórficos no contexto das regiles constantes de cadeia pesada de camundongo são utilizados para construir uma sÈrie de camundongos tendo um número restrito de segmento de imunoglobulina V das cadeias pesadas (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5), em que os segmentos V são variantes polimórficas de um membro da família do gene V. Os segmentos de gene VH polimórficos exemplares são derivados de segmentos de gene VH humano incluindo, por exemplo, VH1-2, VH2-26, VH2-70 e VH3- 23. Tais segmentos de gene VH humanos são obtidos, por exemplo, pela nova síntese (por exemplo, Blue Heron Biotecnologia, Bothell, WA) usando sequíncias disponíveis nas bases de dados publicadas. Deste modo, os fragmentos de DNA que codificam cada gene VH são, em algumas modalidades, gerados independentemente para a incorporação no vetor de alvejamentos, como aqui descrito. Deste modo, os locais modificados múltiplos de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo um número restrito de segmentos de gene VH são engenheirados no contexto das regiles constantes de cadeia pesada de camundongo. Uma estratÈgia de alvejamento exemplar para criar um local de cadeia pesada humanizada restrita contendo um segmento de gene VH1-2 humano, 27 segmentos de gene DH humano, e seis segmentos de gene JH humano È mostrado na FIG. 2.

[00465] Em resumo, um clone de BAC modificado humano contendo trís segmentos de gene VH humano (VH6-1, VH1-2, VH1-3), 27 segmentos de gene DH humano, e seis segmentos de gene JH humanos (ver a USSN 13/404.075; depositada em 24 de fevereiro de 2012) È usado para criar um local de cadeia pesada humanizado restrito contendo um segmento de gene VH1-2 humano. Este clone de BAC modificado liga de maneira funcional os segmentos de gene de cadeia pesada humanos acima mencionados com o intensificador intrônico de camundongo e a região constante IgM. O VH1-2 humano restrito com a cadeia pesada local de base È obtido atravÈs de duas recombinaÁies homólogas usando o clone de BAC humano modificado descrito acima. Na primeira recombinação homóloga, 205 pares de base do segmento de gene VH6-1 humano (de cerca de 10 pares de base a montante de (5’) do VH6-1 inicia o códon em Èxon 1 atÈ cerca de 63 pares de base a jusante de (3’) cio início cio exoii 2) no clone cie BAC humano modificado são excluídos pela recombinação homóloga bacteriana usando um cassete de espectinomicina (aadA) flanqueado pelos locais de restrição PI-SceI úmcos (FIG. 2, BHR 1). Isto permite a remoção subsequente do cassete de aadA sem interromper outro segmento de genes humanos dentro da pesada local de cadeia restrita. Na segunda recombinação homóloga, a terminação 5’ do clone de BAC humano modificado incluindo o segmento de gene VH1-3 humano e cerca de 60 pares de base a jusante 35 9 do segmento de gene ãão excluídos atravÈs da recombinação homóloga usando um cassete de higromicina contendo sítios de restrição que flanqueiam 5’ AsiSI e 3’ AscI (FIG. 2, BHR 2). Como descrito acima, o cassete de espectinomicina È opcionalmente removido depois da confirmação do vetor de alvejamento final incluindo a exclusão dos dois segmentos de gene VH humanos flanqueando o segmento de gene VH1-2 humano (FIG. 2, fundo). Um vetor de alvejamento VH1-2 humano exemplar È apresentado na SEQ ID NO: 75.

[00466] Os segmentos de gene VH polimórficos em um local da cadeia pesada da imunoglobulina restrito representa um novo mÈtodo para gerar anticorpos, populaÁies de anticorpos, e populaÁies de cÈlulas B que expressam os anticorpos tendo cadeia pesadas com CDRs diversas derivadas de um segmento de gene VH humano nnico. E'Aploannclo a mquuinaria de hipermutação somática do animal hospedeiro junto com a associação combinatória com domínios variáveis de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjados resulta na engenheiragem das cadeias pesadas únicas e pares VH/VL únicos que expandem o repertório imune dos animais geneticamente modificados e aumentam sua utilizada como uma plataforma da próxima geração para fabricar produtos terapíuticos humanos, especialmente útil moo uma ptátáforma para falancar anticorsos neutralizantes específicos para patógenos humanos.

[00467] Com base na estrutura local final desejada, um dos outros segmentos de gene VH humano pode ser substituído de uma maneira similar usando clones de BAC humano contendo o segmento de gene VH humano desejado. Deste modo, usando a estratÈgia delineada acima para a incorporação de adicionais e/ou outros segmentos de gene VH polimórficos dentro do local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo permite a geração de novos repertórios de anticorpos para o uso na neutralização de patógenos humanos que podem de outro modo evadir de maneira eficaz o sistema imunológico do hospedeiro.

[00468] As cÈlulas ES alvejadas descritas acima são usadas como cÈlulas ES doadoras e introduzidas em um embri„o de camundongo DE estágio de 8 cÈlulas de atravÈs do mÈtodo VELOCISMOUSE® (supra). Os camundongos que carregam um local de cadeia pesada humanizado contendo um segmento de gene VH humano úmco, kKks> os segmentos cie gene DH e JH humanos operavelmente ligados aos genes da região constante da imunoglobulina de camundongo são identificados pela genotipagem usando uma modificação de ensaio de alelo (Valenzuela tt al., uupra) qee deteotou a presenÁa do cassete de neomicina, o segmento de gene VH humano e uma região dentro dos segmentos de gene DH e JH humano assim como as sequíncias endógenas de cadeia pesada. A Tabela 3 apresenta os prímeros e sondas que são usados para confirmar os camundongos que possuem um local de cadeia pesada restrito contendo um unico segmento de enee VH1-69 humano, 27 segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene JH humano.

[00469] Os 030^00^08 qug dumam uni eocal de cadeia pesada engenheirado que contím um segmento de gene VH humano uuíco podem ser cruzados com uma cepa de camundongo deletora FLPe (ver, por exemplo, Rodriguez, C.I. tt al.(000)) Hig-l-efficsency deSeSer mosee show taatFLee is an alternative to Cre-loxL. Nature Genetics 55: 19-1-100) ee mdoo aimoioerer qualquer cassete de neomicina Frt’ed introduzido pelo vetor de alvejamento que não È removido, por exemplo, no estágio celular ES ou no embri„o. Opcionalmente, o cassete de neomicina È retido nos camundongos.

[00470] Filhotes são genotipados e um heterozigoto de filhote para um local de cadeia pesada humanizada contendo um segmento de gene VH humano úntáo, lodos os segmentos DH e JH humanos operavelmente ligados atÈ o gene de camundongo constantes de imunoglobulina endógena são selecionados para caracterizar o repertório de cadeia pesada da imunoglobulina. Tabela 3

Exemplo 2 Reengenheiramento dos Genes ADAM em um Local de IgH Humanizado Restrito

[00471] Os camundongos com locais humanizados de cadeia pesada da imunoglobulina em que os segmentos de gene de região variável endógena (VDJ) foram substituídos e/ou excluídos carecem da expressão de genes ADAM6 endógenos. Em particular, os camundongos machos compreendendo tais locais humanizados de cadeia pesada da imunoglobulina demonstram uma reduç„o na fertilidade. Deste modo, a capacidade para expressar ADAM6 foi reengenheirada em camundongos com locais de cadeia pesada humanizados, ainda restritos, para perpetuar as cepas de camundongos modificados usando mÈtodos de procriaç„o normais.

[00472] Reengenheiramento dos Aenes ADAM6 em um Local de IgH VH1-69 Humano Restrito (FIG. 3). UJm local da cadeia pesada da imunoglobulina restrito contendo um único segmento de eniic VH1-69 humano localizado a montante de todos os segmentos de gene DH e JH humano foi reengenheirado para conter um fragmento genômico que codifica ADAM6 de camundongos e ADAM6b (SEQ ID NO: 77) atravÈs da recombinaç„o homóloga usando DNA BAC. Isto foi efetuado pela tecnologia de engenharia genÈtico VELOCISGENE® (supra) em uma sÈrie de seis etapas que incluem a modificaç„o de DNA BAC contendo sequências de camundongo e humanas que produziram um vetor de alvejamento final contendo um local de cadeia pesada humanizado restrito contíguo com regiles constantes de cadeia pesada de camundongo e gene ADAM6 de camundongos.

[00473] Primeiro, um camundongo genômico fragmento que codificou ADAM6a e ADAM6b de camundongo foi preparado para a inserç„o em um local de cadeia pesada humanizada contendo um único eegmento de gene VH para uma sÈrie de tris recombinaÁies bacterianas homólogas envolvendo diferentes cassetes de seleção para os locais de restrÍção unicamente posicionados em todo do gene ADAM6 de camundongos (FIG. 3, as Etapas 1 a 3). Na primeira etapa, o DNA de camundongo BAC contendo uma porç„o do camundongo local da cadeia pesada da imunoglobulina foi alvejado com um cassete de neomicina flanqueado pelos locais de recombinação, que foram engenheirados para conter locais de restrição de AsiSI únicos. Na segunda etapa, o fragmento contendo gene ADAM6 de camundongo modificado e o cassete de neomicina foram depois alvejados para excluir os segmentos de gene DH e JH de camundongo e substituir estes com um cassete de espectinomicina que continham um local de restrição AscI imo posicionado à 5’ do gene de seleção. Na terceira etapa, o faggmento de aarunnoonoo modificado duplo contendo um cassete de neomicina posicionado entre os genes ADAM6 de camundongo e um cassete de espectinomicina foi alvejado para trocar o cassete de neomicina por um cassete de higromicina. Isto foi realizado de modo que o fragmento de camundongo genômico modificado contendo os genes ADAM6 pôde ser inserido pela ligação de fragmentos genômico compatíveis em um local de cadeia pesada humanizada contendo o único segmento de gene VH.

[00474] Na cuapa qumo, um lecal ei cas.lein pesada humanizada contendo um segmento de gene VH1-69 humano, 27 segmentos de gene DH humano, e seis segmentos de gene JH humano foi separadamente alvejado atravÈs da recombinação homóloga bacteriana com um cassete de espectinomicina contendo locais de restrição I-CeuI e AscI úmeos nos oocais 5’ e 3’ no cassete, respectivamente (FIG. 3, esquerda topo). Depois desta etapa, o fragmento genômico modificado contendo um local de cadeia pesada humanizado restrito, os cassetes de neomicina e espectinomicina e o fragmento de camundongo modificado contendo os genes ADAM6, os cassetes de higromicina e espectinomicina foram separadamente digeridos com enzimas de restrÍção I-CeuI e AscI para criar fragmentos genômicos modificados para ligação (FIG. 3, meio). Na etapa cinco, os fragmentos genômicos digeridos apropriados foram purificados e ligados juntos para render um local de cadeia pesada humanizada reengenheirado contendo um segmento de gene VH humano único, 227 segmentos cie gene DH humano, seis segmentos de gene JH humano e um fragmento de camundongo genômico integrado que codifica ADAM6a e ADAM6b com resistíncia de neomicina e higromicina. Na etapa final (Etapa 6), o cassete de higromicina foi excluído pela digest„o de AsiSI seguido pela relegação das terminaÁies compatíveis.

[00475] Esta etapa produziu o vetor de alvejamento final para a reinserç„o de sequíncias de ADAM6a e ADAM6b de camundongo em um local de cadeia pesada humanizada restrito, que continha de 5’ a 3’, um ramo de homologia a 5’ contendo cerca de 20 kb de eequência geôôrmca de camundongos a montante do local da cadeia pesada endógeno, um local 5’ Frt, um cassete de neomicina, um local de 3’ Frt, cerca de 8,2 kb do promotor de VH1-69 humano, o segmento de gene VH1-69 Inimaiio oom um RSS 3’ modificado, um fragmento genômico de camundongo contendo cerca de 17711 pares de base de sequíncia genômica de camundongo incluindo os genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo (SEQ ID NO: 77), um fragmento genômico humano contendo 27 DH humanos e seis segmentos de gene JH humanos, e um ramo de homologia 3’ contendo cerca de 8 kb de sequíncia genômica de camundongo a jusante do local da cadeia pesada endógeno incluindo o intensificados intrônico e o gene IgM da região constante (Vetor de Alvejamento VH1-69/A6 Humano, SEQ ID NO: 74; FIG. 3, fundo). Reengenheiramento dos Genes ADAM6 em um Local de IgH VH1-2 Humano Restrito (FIG. 4).

[00476] Um local da cadeia pesada da imunoglobulina restrito contendo um úmco eegmento de gnne VR1-2 humano localizada a montante de todos os segmentos de gene DH e JH humano È reengenheirado para conter um fragmento genômico que codifica ADAM6a e ADAM6b de camundongo (SEQ ID NO: 73) atravÈs da recombinação homóloga usando DNA de BAC. Isto foi efetuado atravÈs da tecnologia de engenharia genÈtica VELOCISGENE® (supra) em uma sÈrie de etapas que incluem a modificação de DNA de BAC contendo sequíncia humana e de camundongo e que produziu um vetor de alvejamento final contendo um local de cadeia pesada humanizado restrito contíguo com regiles constantes de cadeia pesada de camundongo e genes ADAM6 de camundongo.

[00477] Um clone de BAC humano modificado contendo um nnico segmento de gene VH1-2 humano flanqueado por cassetes de higromicina 5’ e espectinomicina 3’, 27 segmentos de gene DH humanos, seis segmentos de gene JH humanos, uma cadeia pesada intrônico intensificada de camundongo, e uma região constante IgM de camundongo (descrita acima no Exemplo 1) foi modificado para conter um fragmento genômico que codifica o gene ADAM6 de camundongo. Isto È efetuado por um mÈtodo de montagem de DNA isotÈrmico modificado aqui indicado como montagem isotÈrmica oligomediada, que tem base no mÈtodo descrito em Gibson tt a(. (2909, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods 5)5): 343-345). Este motodo modificado não requer identidade de sequíncia entre os fragmentos ligados. Ao invÈs disso, a identidade de sequíncia È prejudicada por um oligo que serve para unir os dois fragmentos. AlÈm disso, o oligo serve como um modelo que adiciona a identidade de sequíncia atÈ a extremidade de um dos fragmentos. Os fragmentos estendidos possibilitam a hibridização com o segundo fragmento. Especificamente, a montagem isotÈrmica oligo-mediada foi utilizada para substituir o cassete de higromicina com um fragmento de NotI-AscI contendo um ramo de homologia IgH 22 kb distal de camundongo, o gene ADAM6a de camundongo, um cassete de neomicina flanqueado por locais de Frt, e o gene ADAM6b de camundongo.

[00478] Em ,esumo, oelone Ch BAC humdio moOificado coutendo um local de cadeia pesada VH1-2 humano restrito (FIG. 4, topo esquerda) È digerido com AsiSI e AscI para remover o cassete de higromicina, e um BAC de camundongo modificado contendo o gene ADAM6 de camundongo (FIG. 4, topo direita) È digerido com NotI e AscI para remover o fragmento contendo a ramificação 5’ de camundongo e libera o gene ADAM6 de camundongo flanqueando o cassete de neomicina. Os dois fragmentos BAC digeridos são subsequentemente misturados juntos com os oligonucleotídeos de união 5’ e 3’ e incubados por 1 loom a 50o Cmm mna mistura clercaçòo ee montagem (exonuclease T5, Phusion DNA polimerase, Taq DNA ligase, 10mM DTT, 5% PEG8000 (p/v), 1 mM de NAD, 0,2 mM de dNTPs, 10 mM de MgCl2, e 100 mM de Tris-HCl). O oligo de união 5’ contém uma superposiç„o 38 pares de base com sequência 5’ do local AsiSI do clone BAC humano modificado contendo VH1-2 humano, e uma superposiç„o de 30 pares de base com o local de NotI e sequência 3’ adjacente do clone de BAC modificado de camundongo contendo genes ADAM6. O oligo de união 3’ contém uma superposição de 26 pares de base com sequência 5 ’ do local de AscI do clone de BAC modificado de camundongo contendo os genes ADAM6, um local AscI, e uma superposiç„o 35 pares de base com sequíncia 3’ do local AscI do clone de BAC humano modificoOo OOII1:OO^) VR1-2 humano. A reaç„o de montagem È transformada em E. ooe o o produto correto È selecionado com seleç„o de canamicina e espectinomicina. Para criar o vetor de alvejamento final, o cassete de espectinomicina È removido pela digest„o de PI-SceI seguido pela religaç„o.

[00479] O vetov da alnejamentofinal contém, d3 5’ a 3’, um ramo de homologia IgH de 20 kb distal de camundongo, um gene camundongo ADAM6a, um local 5’ Frt, um cassete de neomicina, um local 3’ Frt, um gene ADAM6b de camundongo, um fragmento genômico humano ~18 kb, um segmento de gene VH(-2 humano, um fragmento genômico ~46,6 kb humano, um segmento de gene VH6-1 humano inativado, 27 segmentos de gene DH humano, seis segmentos de gene JH humano, e um ramo de homologia a 8 kb do 3’ do camundongo contendo um IgH de camundongo intensificado intrônico e região constante de IgM (SEQ ID NO: 76).

[00480] Cada um dos vetores de alvejamento finais (descritos acima) foram usados para eletroporar as cÈlulas de camundongo ES que contím um local da cadeia pesada endógeno excluído às cÈlulas ES modificadas que compreendem uma sequíncia genômica de camundongo ectopicamente colocada compreendendo sequíncias ADAM6a e ADAM6b de camundongo dentro de um local de cadeia pesada humanizado restrito. As cÈlulas ES positivas contendo o fragmento genômico ectópica de camundongo dentro do local de cadeia pesada humanizado foram identificadas por um ensaio PCR quantitativo usando sondas TAQMAN® (Lie and Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: ensaios 5’uccSasse,rwro Opin Biotechnol 9(f): 433-^^8).

[00481] As cÈlulas ES alvejadas descritas acima foram usadas como cÈlulas ES doadoras e introduzidas em um embri„o de camundongo de estágio de 8 cÈlulas de camundongo pelo mÈtodo de engenharia de camundongo VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, as Pat US. Nos 7.6598.442, 7.576.259, 7.294.754). Os camundongos que carregam um local de cadeia pesada humanizada contendo um número restrito de segmento de genes humanos e uma sequíncia genômica ectópica de camundongo compreendendo as sequíncias ADAM6a e ADAM6b de camundongo foram identificados atravÈs da genotipagem usando uma modificação de ensaio de alelo (Valenzuela et al., 2003) que detectou a presenÁa dos genes da ADAM6a e ADAM6b de camundongo dentro do local de cadeia pesada humanizado restrito assim como as sequíncias de cadeia pesada humanas.

[00482] Os filhotes são genotipados e um filhote heterozigoto para um local de cadeia pesada humanizado restrito contendo um fragmento genômico ectópico de camundongo que compreende as sequíncias ADAM6a e ADAM6b de camundongo sequíncias são selecionados para caracterizar o a expressão e fertilidade do gene ADAM6 de camundongo.

Claims

1. Método ex vivo para modificar um locus die cadeia pesada de imunoglobulina de uma célula de camundongo, caracterizado pelo fato de que compreende: inserir no locus da cadeia pesada da imunoglobulina da célula de camundongo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAM6a de camundongo e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAM6b de camundongo, em que a proteína ADAM6a de camundongo e a proteína ADAM6b de camundongo são expressas; e em que a sequência que codifica a proteína ADAM6a de camundongo e a sequência que codifica a proteína ADAM6b de camundongo estão ambas localizadas em uma posição diferente do que um local de ADAM6 endogeno; em que a célula de camundongo compreende uma sequência genômica humana não rearranjada compreendendo um único segmento gênico VH humano, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que o único segmento gênico VH humano, um ou mais segmentos gênicos DH, e um ou mais segmentos gênicos JH estão operacionalmente ligados a um gene da região constante de imunoglobulina de camundongo no locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena, e em que o único segmento gênico VH humano é um VH1-2, VH1-69 ou variante polimórfica dos mesmos; em que, se o camundongo for macho, uma função de uma proteína ADAM6 endógena foi interrompida pela sequência genômica humana não rearranjada e a interrupção da função da proteína ADAM6 endógena está associada a uma redução na fertilidade.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segmento de gene VH humano único é uma variante de um segmento de gene VH1-69 polimórfico.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segmento de gene VH humano único é uma variante polimórfica de um segmento de gene VH1-2.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência genômica humana não rearranjada compreende um segmento de gene VH1-69 humano, 27 segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene JH humano.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência genômica humana não rearranjada compreende um segmento de gene VH1-2 humano, 27 segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene JH humano.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende uma deleção de todos os segmentos de gene VH endógenos funcionais.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais segmentos de gene VK humanos e um ou mais segmentos de gene JK humano na linha germinativa do camundongo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos de gene VK humanos e um ou mais segmentos de gene JK humano estão presentes em um local de cadeia leve da imunoglobulina endógena.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o locus da cadeia leve da imunoglobulina endógena é um locus kappa (K).

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos do gene VK humano e um ou mais segmentos do gene JK humano estão operacionalmente ligados a uma região constante da cadeia leve da imunoglobulina CK.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a região constante da cadeia leve da imunoglobulina CK é uma região constante da cadeia leve da imunoglobulina CK de camundongo.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica uma proteína ADAM6a de camundongo codifica a SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica que codifica uma proteína ADAM6b de camundongo codifica a SEQ ID NO: 2.