MX2014015261A

MX2014015261A - Animales no humanos humanizados con loci de cadena pesada de inmunoglobulina restringidos.

Info

Publication number: MX2014015261A
Application number: MX2014015261A
Authority: MX
Inventors: Andrew J Murphy; Lynn Macdonald; Sean Stevens; John Mcwhirther; Naxin Tu
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2015-06-23
Also published as: AU2020202185B2; JP2020110187A; KR20200074271A; RU2014153673A; AU2016201612A1; EP3597037A1; PT2858487T; IL235892A; CY1122482T1; SG10201913429WA; KR20240042174A; RU2656155C2; CA2876172A1; JP2018029623A; HRP20200093T1; DK3597037T3; AU2022291579A1; US20200093106A1; BR112014030852A2; MX364449B

Abstract

La presente invención se refiere a ratones, embriones, células y tejidos que tienen un Iocus de cadena pesada de inmunoglobulina restringido y una secuencia ectópica que codifica para una o más proteínas ADAM6; en varias modalidades, se describen ratones que tienen Ioci endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada y son capaces de expresar una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma, que es funcional en ratones macho. También se proporcionan ratones, embriones, células y tejidos que tienen un locus de cadena pesada de inmunoglobulina caracterizado por un solo segmento génico VH humano, una pluralidad de segmentos génicos DH humanos y una pluralidad de segmentos génicos JH humanos y son capaces de expresar una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma.

Description

ANIMALES NO HUMANOS HUMANIZADOS CON LOCI DE CADENA PESADA DE INMUNOGLOBULINA RESTRINGIDOS Campo de la Invención La presente invención proporciona animales no humanos manipulados por ingeniería genetica, que comprenden un gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de complejidad reducida, en donde los animales no humanos son capaces de expresar una proteína ADAM6 ó un fragmento funcional de la misma. Se describen animales no humanos manipulados por ingeniería genética, que expresan anticuerpos a partir de un número restringido de segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina y/o variantes de los mismos, en donde los animales no humanos carecen de un gen ADAM6 endógeno funcional, pero retienen la función ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una modificación de un locus endógeno de región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina que vuelve al ratón incapaz de producir una proteína ADAM6 funcional y da como resultado una pérdida de fertilidad. Se describen ratones genéticamente modificados que comprenden un locus VH de inmunoglobulina, caracterizado por un número restringido de segmentos génicos VH, por ejemplo un solo segmento VH de inmunoglobulina, por ejemplo un segmento génico VH 1 -69 humano o un segmento génico VH1 -2 humano, y que además comprenden una función ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópico que restaura la fertilidad en un ratón macho.

Se describen ratones, celulas, embriones y tejidos genéticamente modificados, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para un locus ADAM6 funcional, en donde los ratones, células, embriones y tejidos expresan una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de un solo segmento génico VH humano. Además, los ratones, células, embriones y tejidos carecen de un gen ADAM6 endógeno funcional, pero retienen la función ADAM6, caracterizada por la presencia de una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica para una proteína ADAM6. Se proporcionan métodos para producir secuencias de anticuerpo en animales no humanos fértiles, que son útiles para unirse a patógenos, incluyendo patógenos de seres humanos.

Antecedentes de la Invención Animales no humanos, por ejemplo ratones, se han manipulado por ingeniería genética para ser herramientas útiles en métodos para producir secuencias de anticuerpo para ser utilizadas en agentes terapéuticos humanos a base de anticuerpos. Se utilizan ratones con loci de región variable humanizados (por ejemplo, genes VH, DH y JH, y genes VL y JL), para generar dominios variables de cadena pesada y ligera cognados para utilizarse en agentes terapéuticos que contienen anticuerpos. Los ratones que generan anticuerpos completamente humanos con cadenas pesadas y ligeras cognadas, son conocidos en este campo. Para la creación de estos ratones, fue necesario deshabilitar los genes endógenos de inmunoglobulina murina para que los transgenes completamente humanos integrados aleatoriamente pudieran funcionar como el repertorio expresado de inmunoglobulinas en el ratón. Tales ratones pueden producir anticuerpos humanos adecuados para utilizarse como agentes terapeuticos en seres humanos, pero estos ratones muestran problemas sustanciales con sus sistemas inmunitarios. Estos problemas han causado varios obstáculos experimentales, por ejemplo, los ratones no son prácticos para generar repertorios de anticuerpos suficientemente diversos, requieren el uso de una cantidad excesiva de preparaciones sometidas a reingeniería genética, proporcionan un proceso de selección clonal subóptimo, posiblemente debido a una incompatibilidad entre los elementos humanos y murinos, y una fuente no confiable de poblaciones grandes y diversas de secuencias variables humanas que necesitan ser verdaderamente útiles para la producción de agentes terapéuticos humanos.

Los agentes terapéuticos de anticuerpos humanos son manipulados por ingeniería genética con base en las características deseadas con respecto a los antígenos seleccionados. Ratones humanizados se inmunizan con los antígenos seleccionados, y los ratones inmunizados se utilizan para generar poblaciones de anticuerpos a partir de las cuales identificar dominios variables de cadena pesada y ligera cognados de alta afinidad, con las características de unión deseadas. Algunos ratones humanizados, tales como aquéllos que tienen una humanización de sólo regiones variables en loci endógenos murinos, generan poblaciones de celulas B que son similares en carácter y número a las poblaciones de células B de tipo silvestre murinas. Como resultado, se dispone de una población de células B extremadamente grande y diversa en estos ratones, a partir de la cual seleccionar los anticuerpos, reflejando un gran número de diferentes rearreglos de inmunoglobulina, para identificar dominios variables de cadena pesada y ligera con las características más deseables.

Sin embargo, no todos los antígenos provocan una respuesta inmunitaria que exhiba un número muy grande de rearreglos a partir de una amplia selección de segmentos variables (V). Es decir, la respuesta inmunitaria humoral humana contra ciertos antígenos aparentemente está restringida. La restricción se refleja en la selección clonal de células B que expresan únicamente ciertos segmentos V que se unen a ese antígeno particular, con una afinidad y especificidad suficientemente altas. Algunos de tales antígenos son clínicamente significativos; es decir, un número de ellos son patógenos conocidos para seres humanos. Surge la suposición de que el segmento V expresado en la respuesta humanitaria humana es un segmento V que, en combinación con un segmento D humano y un segmento J humano, es más probable que genere un anticuerpo de alta afinidad más útil que un segmento V seleccionado aleatoriamente que no se haya observado en una respuesta de anticuerpos humanos contra ese antígeno.

Se ha formulado la hipótesis de que la selección natural, a lo largo de milenios de experiencia entre los seres humanos y el patógeno, ha seleccionado la base más eficiente a partir de la cual diseñar el arma más efectiva para neutralizar al patógeno -el segmento genico V seleccionado. Existe la necesidad en este campo de anticuerpos superiores, que se unan y/o que neutralicen antígenos como los patógenos anteriormente descritos. Existe la necesidad de generar con más rapidez secuencias útiles a partir de segmentos génicos V seleccionados, incluyendo segmentos génicos V seleccionados polimórficos y/o somáticamente mutados y generar con más rapidez poblaciones útiles de células B que tengan rearreglos de los segmentos génicos V con varios segmentos génicos D y J, incluyendo versiones somáticamente mutadas de los mismos, y en particular rearreglos con regiones CDR3 únicas y útiles. Existe la necesidad de mejores sistemas biológicos, por ejemplo animales no humanos (tales como por ejemplo ratones, ratas, conejos, etc.) que puedan generar secuencias de región variable de anticuerpo terapéuticamente útiles a partir de segmentos génicos V seleccionados, en mayor número y diversidad que, por ejemplo, se puedan lograr en animales modificados existentes, mientras que al mismo tiempo se reduzcan o eliminen los cambios dañinos que pudieran ser el resultado de las modificaciones genéticas. Existe la necesidad de mejores sistemas biológicos manipulados por ingeniería genética, para que tengan un sistema inmunitario humoral comprometido para la selección clonal de secuencias variables de anticuerpo derivadas de segmentos génicos V restringidos, seleccionados, incluyendo, pero no limitándose a dominios variables de cadena pesada y ligera humana cognados, útiles en la producción de agentes terapeuticos a base de anticuerpos humanos contra antígenos seleccionados, incluyendo ciertos patógenos humanos. Todavía existe la necesidad en este campo, de producir ratones genéticamente modificados mejorados, que sean útiles para generar secuencias de inmunoglobulina, incluyendo secuencias de anticuerpos humanos, dirigidos a la eliminación de patógenos que representan una carga para la población humana.

En la téenica existe la necesidad de anticuerpos terapéuticos que sean capaces de neutralizar antígenos virales, por ejemplo V1H y VHC, incluyendo anticuerpos específicos contra antígenos que contengan cadenas pesadas derivadas de un solo segmento génico variable humano. También existe la necesidad de otros métodos y animales no humanos para producir anticuerpos útiles, incluyendo anticuerpos que comprendan un repertorio de cadenas pesadas derivadas de un solo segmento VH humano y que tengan un conjunto diverso de secuencias CDR, incluyendo cadenas pesadas que se expresen con cadenas ligeras humanas cognadas, e incluyendo la restauración de los efectos desfavorables que son el resultado de la inserción de secuencias genómicas humanas en el genoma de los animales no humanos. Se necesitan métodos para seleccionar CDRs de proteínas de unión a base de inmunoglobulina, que proporcionen una mayor diversidad de proteínas de unión a partir de las cuales elegir, y una mayor diversidad de dominios variables de inmunoglobulina, incluyendo composiciones y metodos para generar dominios variables de inmunoglobulina somáticamente mutados y clonalmente seleccionados para utilizarse, por ejemplo, en la producción de agentes terapéuticos para seres humanos.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan loci de inmunoglobulina genéticamente modificados, que comprenden un número restringido de diferentes segmentos génicos de región variable de cadena pesada (es decir, genes V, genes VH, segmentos de genes VH, o segmentos de genes V), por ejemplo no más de uno, dos o tres diferentes genes V, o no más de un miembro de la familia de segmentos génicos V presente, por ejemplo, en una sola copia o en múltiples copias y/o que comprenda uno o más polimorfismos, y en varias modalidades, los loci carecen de una secuencia que codifique para una proteína ADAM6 funcional endógena.

Se proporcionan loci que son capaces de rearreglarse y formar un gen que codifica para un dominio variable de cadena pesada que se deriva de un repertorio génico V de cadena pesada que está restringido, por ejemplo que es un solo segmento génico VH o se selecciona de una pluralidad de variantes polimórficas de un solo segmento génico VH, en donde en varias modalidades, los loci carecen de un gen ADAM6 funcional endógeno o un fragmento funcional del mismo.

Se proporcionan loci de inmunoglobulina modificados que incluyen loci que carecen de un gen ADAM6 funcional endógeno y que comprenden secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo un segmento V humano ligado de manera operable a una secuencia constante de inmunoglobulina humana (o quimerica humana/no humana) o no humana (y ligada de manera operable con, por ejemplo, un segmento D y/o J). Se proporcionan loci modificados que comprenden múltiples copias de un solo segmento génico VH, incluyendo casos en donde una o más de las copias comprenden una variante polimórfica, y una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para una proteína ADAM6 ó un fragmento de la misma, que es funcional en el animal no humano. También se proporcionan loci modificados que comprenden múltiples copias de un solo segmento VH, ligado de manera operable con uno o más segmentos D y uno o más segmentos J, ligados de manera operable a una secuencia constante de inmunoglobulina no humana, por ejemplo una secuencia murina o de rata o humana. También se proporcionan animales no humanos que comprenden tales loci humanizados, en donde los animales no humanos tienen una fertilidad de tipo silvestre.

Se proporcionan animales no humanos que comprenden un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, un transgén o como una inserción o reemplazo en un locus endógeno variable de cadena pesada del animal no humano), que comprende un solo segmento VH ligado de manera operable a un segmento génico D y/o J. En varias modalidades, el único segmento génico VH está ligado de manera operable a uno o más segmentos génicos D y/o uno o más segmentos génicos J en el locus endógeno del gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano. En varias modalidades, los animales no humanos además comprenden una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para una proteína ADAM6 ó una homologa u ortóloga de la misma, que es funcional en el animal no humano macho que comprende el locus de cadena pesada modificado. En varias modalidades, la secuencia nucleotídica ectópica es contigua al único segmento VH, un segmento genico D, o un segmento génico J. En varias modalidades, la secuencia nucleotídica ectópica es contigua a una secuencia que no es de inmunoglobulina en el genoma del animal no humano. En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica está en el mismo cromosoma que el locus de cadena pesada modificado. En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica está en un cromosoma diferente al del locus de la cadena pesada modificada.

Se proporcionan animales no humanos que son modificados en sus loci de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina para eliminar la totalidad o sustancialmente la totalidad (por ejemplo, todos los segmentos funcionales, o casi todos los segmentos funcionales) segmentos VH de inmunoglobulina endógena y que comprende un segmento VH1 -69 humano (o un segmento VH1 -2 humano) ligado de manera operable a un segmento D y J, o un segmento J en el locus endógeno de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano. También se proporcionan animales no humanos que comprenden tales loci y que carecen de uno o más genes ADAM6 endógenos.

Se proporcionan metodos para producir secuencias de inmunoglobulina humana en animales no humanos. En varias modalidades, las secuencias de inmunoglobulina humana se derivan de un repertorio de secuencias V de inmunoglobulina que consiste esencialmente de un solo segmento V humano, por ejemplo un segmento VH1 -69 ó VH1 -2, y uno o más segmentos D y J, o uno o más segmentos J. Se proporcionan métodos para producir secuencias de inmunoglobulina humana en animales, tejidos y células no humanos, en donde las secuencias de inmunoglobulina humana se unen a un patógeno.

En un aspecto, se proporcionan ácidos nucleicos y construcciones, células, embriones, ratones y métodos para producir ratones que comprenden una modificación que da como resultado una proteína ADAM6 murina endógena no funcional o un gen ADAM6 murino endógeno no funcional (por ejemplo, un knockout o una deleción en un gen ADAM6 endógeno), en donde los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, los ratones comprenden una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para una proteína ADAM6 de roedor o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma; en una modalidad específica, la proteína ADAM6 de roedor es una proteína ADAM6 murina.

En un aspecto, se proporcionan ácidos nucleicos y construcciones, células, embriones, ratones y métodos para producir ratones que comprenden una modificación de un locus de inmunoglobulina murina endógena, en donde el ratón comprende una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, el locus endógeno de inmunoglobulina murina es un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, y la modificación reduce o elimina la actividad ADAM6 de una celula o tejido de un ratón macho. En una modalidad, el locus endógeno de inmunoglobulina murina es un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, y la modificación mantiene o sostiene la actividad ADAM6 de una célula o tejido de un ratón macho.

En un aspecto, se proporciona un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado, que comprende un repertorio de segmento V de cadena pesada que está restringido con respecto a la identidad del segmento V, y que comprende uno o más segmentos D y uno o más segmentos J; o uno o más segmentos J. En una modalidad, el segmento V de cadena pesada es un segmento humano. En una modalidad, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado carece de un gen ADAM6 endógeno. En una modalidad, el locus de cadena pesada modificado además comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína ADAM6. En una modalidad específica, la secuencia nucleotídica es contigua al segmento génico V, D y/o J, en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado.

En una modalidad, el locus modificado es un locus no humano.

En una modalidad, el locus no humano se modifica con al menos una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el locus no humano es modificado con al menos una secuencia de inmunoglobulina humana y una secuencia que codifica para una proteína ADAM6.

En una modalidad, la restricción es a un solo miembro de la familia de segmentos V. En una modalidad, el un solo miembro de la familia de segmentos V está presente en dos o más copias. En una modalidad, el un solo miembro de la familia de segmentos V está presente en forma de dos o más variantes (por ejemplo, dos o más formas polimórficas del miembro de la familia de segmentos V). En una modalidad, el un segmento V es un miembro de la familia de segmentos V humanos. En una modalidad, el un solo miembro de la familia de segmentos V está presente en un número de variantes, tal como se observa en la población humana, con respecto a esa variante. En una modalidad, el miembro de la familia de segmentos V se selecciona de entre aquellos de la Tabla 1 . En una modalidad, el miembro de la familia de segmentos V está presente en un número de variantes tal como se muestra, por cada segmento V, en un número de alelos desde 1 alelo hasta el número de alelos mostrado en la columna derecha de la Tabla 1.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma; también se proporcionan ratones que comprenden una secuencia nucleotídica endógena que codifica para una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, y al menos una modificación genetica de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia nucleotídica endógena que codifica para una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, está localizada en una posición ectópica en comparación con un gen ADAM6 endógeno de un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, se proporcionan métodos para producir ratones que comprenden una modificación de un locus endógeno de inmunoglobulina murina, en donde el ratón comprende una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan métodos para producir ratones que comprenden una modificación genética de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la aplicación de los métodos da como resultado ratones macho que comprenden un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado (o la deleción del mismo), y los ratones macho son capaces de generar descendencia mediante cruza. En una modalidad, los ratones macho son capaces de producir espermatozoides que pueden transitar del útero de un ratón hembra a través de un oviducto murino, para fertilizar un óvulo murino.

En un aspecto, se proporcionan métodos para producir ratones que comprenden una modificación genética de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la aplicación de los métodos da como resultado ratones macho que comprenden un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado (o la deleción del mismo) y los ratones macho exhiben una reducción de fertilidad, y los ratones comprenden una modificación genetica que restaura en su totalidad o en parte la reducción de fertilidad. En varias modalidades, la reducción de fertilidad está caracterizada por una incapacidad de los espermatozoides del ratón macho, para migrar desde el útero de un ratón hembra a través del oviducto murino para fertilizar un óvulo murino. En varias modalidades, la reducción de fertilidad está caracterizada por espermatozoides que exhiben un defecto de migración in vivo. En varias modalidades, la modificación genética que restaura en su totalidad o en parte la reducción de fertilidad, es una secuencia de ácido nucleico que codifica para un gen ADAM6 murino o un ortólogo u homólogo o un fragmento del mismo, que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, la modificación genética comprende reemplazar loci endógenos variables de cadena pesada de inmunoglobulina en un número restringido, por ejemplo, no más de uno, dos o tres diferentes segmentos génicos variables (VH) de cadena pesada, uno o más segmentos génicos de diversidad (DH) de cadena pesada y uno o más segmentos génicos de unión (JH) de cadena pesada de otra especie (por ejemplo, una especie no murina). En una modalidad, la modificación genética comprende la inserción de un solo segmento génico VH de inmunoglobulina ortólogo, al menos un segmento génico DH y al menos un segmento génico JH, en loci variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos. En una modalidad específica, la especie es humana. En una modalidad específica, la modificación genetica comprende la deleción de un locus endógeno variable de cadena pesada de inmunoglobulina en su totalidad o en parte, en donde la deleción da como resultado la pérdida de la función ADAM6 endógena. En una modalidad específica, la pérdida de la función ADAM6 endógena está asociada con una reducción en la fertilidad en ratones macho. En una modalidad, la modificación genética comprende la inactivación de un locus endógeno variable de cadena pesada de inmunoglobulina en su totalidad o en parte, en donde la deleción no da como resultado una pérdida de función ADAM6 endógena. La inactivación puede incluir el reemplazo o la deleción de uno o más segmentos génicos endógenos, dando como resultado un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina que es sustancialmente incapaz de rearreglarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo que comprende segmentos génicos endógenos. La inactivación puede incluir otras modificaciones que vuelven al locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina incapaz de rearreglarse para codificar la cadena pesada de un anticuerpo, en donde la modificación no incluye el reemplazo o la deleción de segmentos génicos endógenos. Algunas modificaciones de ejemplo incluyen inversiones cromosómicas y/o traslocaciones cromosómicas mediadas por téenicas de biología molecular; por ejemplo, utilizando una colocación precisa de sitios de recombinación específicos de sitio (por ejemplo, la teenología Cre-lox).

En una modalidad, la modificación genetica comprende insertar en el genoma del ratón, un fragmento de ADN que contiene un número restringido, por ejemplo no más de uno, dos o tres diferentes segmentos génicos variables (DH) de cadena pesada, uno o más segmentos génicos de diversidad (DH) de cadena pesada y uno o más segmentos génicos de unión (JH) de cadena pesada de otra especie (por ejemplo, una especie no murina) ligados de manera operable a una o más secuencias de región constante (por ejemplo, un gen de IgM y/o de IgG). En una modalidad, el fragmento de ADN es capaz de sufrir un rearreglo para formar una secuencia que codifique para una cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad, la modificación genética comprende la inserción de un solo segmento génico VH de inmunoglobulina ortólogo, al menos un segmento génico DH , y al menos un segmento génico JH, en el genoma del ratón. En una modalidad específica, la especie es humana. En una modalidad, la modificación genética comprende la deleción de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina en su totalidad o en parte, para volver no funcional al locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la deleción además da como resultado la pérdida de la función ADAM6 endógena. En una modalidad específica, la pérdida de función ADAM6 endógena está asociada con una reducción en la fertilidad de ratones macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 murina a partir de un alelo ADAM6 endógeno, de tal modo que un ratón macho que tiene la modificación exhibe una reducida fertilidad (por ejemplo, una capacidad altamente reducida para generar descendencia mediante apareamiento), o es esencialmente infertil, debido a la reducción o eliminación de la función ADAM6 endógena, en donde el ratón además comprende una secuencia ADAM6 ectópica u homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma. En un aspecto, la modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 murina es una modificación (por ejemplo, una inserción, una deleción, un reemplazo, etc.) en un locus de inmunoglobulina murino. En una modalidad, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada de inmunoglobulina.

En una modalidad, la reducción o pérdida de función ADAM6 comprende una incapacidad o sustancial incapacidad del ratón para producir espermatozoides que puedan viajar desde el útero de un ratón hembra hasta un oviducto murino para fertilizar un óvulo murino. En una modalidad específica, al menos el 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de las células espermatozoides producidas en un volumen de cyaculación del ratón, son incapaces de viajar a través del oviducto in vivo después de la cópula, y fertilizar un óvulo murino.

En una modalidad, la reducción o pérdida de función ADAM6 comprende la incapacidad de formar o una sustancial incapacidad de formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 en una superficie de una célula espermática del ratón. En una modalidad, la pérdida de función ADAM6 comprende una sustancial incapacidad de fertilizar un óvulo murino mediante una cópula con un ratón hembra.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, y comprende una proteína (o una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para una proteína) que confiere funcionalidad ADAM6 en el ratón. En una modalidad, el ratón es un ratón macho, y la funcionalidad comprende una mejor fertilidad en comparación con un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional.

En una modalidad, la proteína es codificada por una secuencia genómica localizada en un locus de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad especifica, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En otra modalidad específica, el locus de cadena pesada comprende un solo segmento genico VH humano, al menos un segmento génico DH humano y al menos un segmento génico JH humano. En otra modalidad especifica, el locus de cadena pesada comprende un segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos. En una modalidad, la proteína ectópica es codificada por una secuencia genómica localizada en un locus que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad, el locus que no es de inmunoglobulina es un locus transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el locus transcripcionalmente activo es el locus ROSA26. En una modalidad específica, el locus transcripcionalmente activo está asociado con una expresión específica de tejido. En una modalidad, la expresión específica de tejido está presente en los tejidos reproductivos. En una modalidad, la proteína es codificada por una secuencia genómica aleatoriamente insertada en la línea germinal del ratón.

En una modalidad, el ratón comprende una cadena ligera humana o quimerica humana/murina, o quimérica humana/de rata (por ejemplo, región variable humana, región constante murina o de rata) y una cadena pesada quimérica de región variable humana/región constante murina o de rata. En una modalidad específica, el ratón comprende un transgén que comprende un gen de cadena ligera quimérico de región variable humana/región constante de rata o murina ligado de manera operable a un promotor transcripcionalmente activo, por ejemplo un promotor ROSA26. En otra modalidad específica, el transgén de cadena ligera quimérica humana/murina o de rata comprende una secuencia de región variable de cadena ligera humana rearreglada en la línea germinal del ratón.

En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica está localizada en un locus de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En una modalidad, el locus de cadena pesada comprende un solo segmento génico VH humano, al menos un segmento génico DH humano, y al menos un segmento génico JH humano. En una modalidad específica, el locus de cadena pesada comprende un solo segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos. En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica está localizada en un locus que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad, el locus que no es de inmunoglobulina es un locus transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el locus transcripcionalmente activo es el locus ROSA26. En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica está posicionada aleatoriamente insertada en la línea germinal del ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen ADAM6 endógeno funcional, en donde el ratón comprende una secuencia nucleotídica ectópica que complementa la perdida de una función ADAM6 murina. En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica le confiere al ratón la capacidad de producir descendencia que es comparable a la correspondiente capacidad de un ratón de tipo silvestre, que contiene un gen ADAM6 endógeno funcional. En una modalidad, la secuencia le confiere al ratón la capacidad de formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 en la superficie de la célula espermática de dicho ratón. En una modalidad, la secuencia le confiere a los espermatozoides del ratón la capacidad de viajar desde el útero del ratón hembra, a través del oviducto murino, hasta un óvulo murino para fertilizarlo.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia nucleotídica ectópica, produce al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% del número de camadas que un ratón de tipo silvestre de la misma edad y raza, en un periodo de tiempo de seis meses.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia nucleotídica ectópica, produce al menos aproximadamente 1 .5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2.5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, o aproximadamente 10 veces más progenie, cuando es criado por un periodo de seis meses, que un ratón de la misma edad y la misma raza o una similar, que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia nucleotídica ectópica, que es criado durante sustancialmente el mismo periodo de tiempo y bajo sustancialmente las mismas condiciones.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia nucleotídica ectópica, produce un promedio de al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, ó 4 veces más crías por camada, en un periodo de crianza de 4 ó 6 meses, en comparación con un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia nucleotídica ectópica, y que es criado durante el mismo periodo de tiempo.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia nucleotídica ectópica, es un ratón macho, y el ratón macho produce espermatozoides que, cuando son recuperados del oviducto aproximadamente a las 5-6 horas despues de la cópula, refleja una migración en el oviducto que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, 100 veces, 1 10 veces ó 120 veces mayor que la que presenta un ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que carece de la secuencia nucleotídica ectópica.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia nucleotídica ectópica, cuando copula con un ratón hembra, genera espermatozoides que son capaces de viajar a través del útero e ingresar y atravesar el oviducto, dentro de un periodo de aproximadamente 6 horas, a una eficiencia que es aproximadamente igual a la de los espermatozoides provenientes de un ratón de tipo silvestre.

En una modalidad, el ratón que carece del gen ADAM6 endógeno funcional y que comprende la secuencia nucleotídica ectópica, produce aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces ó aproximadamente 4 veces o más camadas en un periodo de tiempo comparable, que un ratón que carece del gen ADAM6 funcional y que carece de la secuencia nucleotídica ectópica.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende en su línea germinal una secuencia de ácido nucleico no murino que codifica para una proteína inmunoglobulina, en donde la secuencia de inmunoglobulina no murina comprende una inserción de un gen ADAM6 murino o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina no murina comprende una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende un solo segmento genico VH, uno o más segmentos génicos DH, y uno o más segmentos génicos JH; en una modalidad, la secuencia comprende uno o más segmentos génicos VL y uno o más segmentos génicos JL. En una modalidad, el único segmento génico VH, uno o más segmentos génicos DH, y uno o más segmentos génicos JH, o uno o más segmentos génicos VL y JL, no están rearreglados. En una modalidad, el único segmento génico VH, uno o más segmentos génicos DH, y uno o más segmentos génicos JH, o el uno o más segmentos génicos VL y JL, están rearreglados. En una modalidad, después del rearreglo del único segmento génico VH, uno o más segmentos génicos DH, y uno o más segmentos génicos JH, o del uno o más segmentos génicos VL y JL, el ratón comprende en su genoma, al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para un gen ADAM6 murino o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, después del rearreglo, el ratón comprende en su genoma al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican para un gen ADAM6 murino o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, despues del rearreglo el ratón comprende en su genoma, al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para un gen ADAM6 murino o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, el ratón comprende el gen ADAM6 ó un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo, en una célula B. En una modalidad, el ratón comprende el gen ADAM6 ó un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo, en una célula no B.

En un aspecto, se proporcionan ratones que expresan una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o un fragmento funcional de la misma, a partir de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el ratón comprende una actividad ADAM6 que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento génico VH humano polimórfico. En una modalidad, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento génico humano VH1 -69. En una modalidad, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento génico humano VH1 -2.

En una modalidad, los ratones macho comprenden un solo alelo ADAM6 endógeno no modificado o un ortólogo u homólogo o un fragmento funcional del mismo, en un locus endógeno ADAM6.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 murina ectópica o una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, que codifica para una proteína que confiere la función ADAM6.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 ó una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, en una ubicación en el genoma murino que se aproxima a la ubicación del alelo ADAM6 murino endógeno, por ejemplo en dirección 3’ de una secuencia de segmento genico V y en dirección 5’ de un segmento génico D inicial. En una modalidad específica, el ratón macho comprende una secuencia ADAM6 ó una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, en dirección 3’ de un segmento génico VH humano y en dirección 5’ de un segmento génico DH humano. En otra modalidad específica, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 ó una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, en dirección 5’ de un segmento génico VH humano. En otra modalidad específica, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 ó una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, en dirección 5’ de un locus de cadena pesada quimérico que comprende un segmento génico VH humano, uno o más segmentos génicos DH, y uno o más segmentos génicos JH- En una modalidad, el locus de cadena pesada quimérica comprende un segmento génico humano VH1 -69, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos. En una modalidad, el locus de cadena pesada quimérica comprende un segmento génico humano VH1 -2, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 ó una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, flanqueada en dirección 5’, en dirección 3’, o en dirección 5’ y en dirección 3’ (con respecto a la dirección de la transcripción de la secuencia ADAM6), por una secuencia de ácido nucleico que codifica para un segmento genico variable de inmunoglobulina o un segmento génico de diversidad de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el segmento génico variable de inmunoglobulina es un segmento génico humano. En una modalidad, el segmento génico variable de inmunoglobulina es un segmento génico humano, y la secuencia que codifica para la proteína ADAM6 murina o una ortóloga u homologa o un fragmento funcional de la misma en un ratón, está entre los segmentos génicos VH humanos; en una modalidad, el ratón comprende un segmento génico VH humano, y la secuencia está en una posición en dirección 5’ del segmento génico VH; en una modalidad, la secuencia está en una posición en dirección 3’ del segmento génico VH; en una modalidad, la secuencia está en una posición entre el segmento génico VH y el primer segmento génico DH. En una modalidad específica, el segmento génico DH es el primer segmento génico DH. En una modalidad, el ratón comprende dos segmentos génicos VH, y la secuencia está en una posición entre los dos segmentos génicos VH; en una modalidad, la secuencia está en una posición entre un segmento génico VH y un segmento génico DH- En una modalidad específica, el segmento génico DH es el primer segmento génico DH.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 ó una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, que está localizada en una posición en un locus de inmunoglobulina endógeno, que es la misma o sustancialmente la misma que en un ratón macho de tipo silvestre. En una modalidad específica, el locus endógeno es incapaz de codificar la cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad específica, el locus endógeno está posicionado en un lugar en el genoma del ratón macho, que lo vuelve incapaz de codificar la cadena pesada de un anticuerpo. En varias modalidades, los ratones macho comprenden una secuencia ADAM6 localizada en el mismo cromosoma que los segmentos genicos de inmunoglobulina humanos, y la secuencia ADAM6 codifica para una proteína ADAM6 funcional.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho que comprende un gen ADAM6 endógeno no funcional, o una deleción de un gen ADAM6 endógeno, en su línea germinal; en donde las células espermáticas del ratón son capaces de transitar por el oviducto de un ratón hembra y fertilizar un óvulo. En una modalidad, los ratones comprenden una copia extracromosómica de un gen ADAM6 murino o un ortólogo u homólogo o un fragmento funcional del mismo, que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, los ratones comprenden un gen ADAM6 murino ectópico o un ortólogo u homólogo o un fragmento funcional del mismo, que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una modificación genetica que reduce la función ADAM6 murina endógena, en donde el ratón comprende al menos parte de la funcionalidad ADAM6 proveniente ya sea de un alelo no modificado endógeno que es funcional en su totalidad o en parte (por ejemplo, un heterocigoto), o bien, mediante la expresión de una secuencia ectópica que codifica para una proteína ADAM6 ó una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma, que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, los ratones comprenden una función ADAM6 suficiente para conferirle a los ratones la capacidad de generar descendencia por apareamiento, en comparación con los ratones macho que carecen de una proteína ADAM6 funcional. En una modalidad, la función ADAM6 es conferida por la presencia de una secuencia nucleotídica ectópica, que codifica para una proteína ADAM6 murina o una homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la función ADAM6 es conferida por un gen ADAM6 endógeno presente en un locus de inmunoglobulina endógeno, en donde el locus de inmunoglobulina endógeno es incapaz de codificar la cadena pesada de un anticuerpo. Los homólogos u ortólogos o fragmentos de ADAM6 que son funcionales en un ratón macho, incluyen aquéllos que restauran, en su totalidad o en parte, la pérdida de capacidad para generar descendencia observada en ratones macho que carecen de una cantidad suficiente de actividad ADAM6 murina endógena; por ejemplo, la pérdida de capacidad observada en un ratón con ADAM6 noqueado (knockout).

En este sentido, los ratones ADAM6 noqueados incluyen ratones que comprenden un locus endógeno o un fragmento del mismo, pero que no es funcional; es decir, que no expresa proteínas ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b), o que expresa proteínas ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b) a una concentración que es insuficiente para respaldar una capacidad esencialmente normal de generar descendencia de un ratón macho de tipo silvestre. La perdida de función puede deberse, por ejemplo, a una modificación en un gen estructural del locus (es decir, en una región codificadora ADAM6a ó ADAM6b), o en una región reguladora del locus (por ejemplo, en una secuencia 5’ con respecto al gen ADAM6a, o en dirección 3’ con respecto a la región codificadora ADAM6a ó ADAM6b, en donde la secuencia controla, en su totalidad o en parte, la transcripción de un gen ADAM6, la expresión del ARN de ADAM6, o la expresión de una proteína ADAM6). En varias modalidades, las proteínas ortólogas u homologas o fragmentos de las mismas que son funcionales en un ratón macho, son aquéllas que hacen posible que un espermatozoide de un ratón macho (o la mayoría de espermatozoides en una cyeculación del ratón macho), transite por un oviducto murino y fertilice un óvulo murino.

En una modalidad, los ratones macho que expresan la región variable de inmunoglobulina humana o un fragmento funcional de la misma, comprenden una actividad ADAM6 suficiente como para conferirle a los ratones macho la capacidad de generar descendencia mediante apareamiento con ratones hembra y, en una modalidad, los ratones macho exhiben la capacidad de generar descendencia cuando se aparean con ratones hembra que en una modalidad es de al menos 25%, en una modalidad de al menos 30%, en una modalidad de al menos 40%, en una modalidad de al menos 50%, en una modalidad de al menos 60%, en una modalidad de al menos 70%, en una modalidad de al menos 80%, en una modalidad de al menos 90%, y en una modalidad aproximadamente la misma que, aquella de ratones con uno o dos alelos ADAM6 endógenos no modificados.

En una modalidad, los ratones macho expresan una actividad ADAM6 suficiente (o un ortólogo u homólogo o un fragmento funcional del mismo) como para hacer posible que un espermatozoide de los ratones macho atraviese el oviducto de ratones hembra y fertilice un óvulo murino.

En una modalidad, la funcionalidad ADAM6 es conferida por una secuencia de ácido nucleico que es contigua a una secuencia cromosómica murina (por ejemplo, el ácido nucleico está aleatoriamente integrado en un cromosoma murino; o está colocado en un lugar específico, por ejemplo mediante el direccionamiento del ácido nucleico hacia un lugar específico, por ejemplo mediante una inserción mediada por recombinasa específica de sitio (por ejemplo, Cre-mediada) o recombinación homologa). En una modalidad, la secuencia ADAM6 está presente en un ácido nucleico que es distinto de un cromosoma del ratón (por ejemplo, la secuencia ADAM6 está presente en un episoma; es decir, extracromosómicamente, por ejemplo en una construcción de expresión, en un vector de expresión, en un YAC, en un transcromosoma, etcetera).

En un aspecto, se proporcionan ratones y células genéticamente modificados que comprenden una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde los ratones expresan al menos una porción de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, al menos una porción de una secuencia humana, en donde los ratones comprenden una actividad ADAM6 que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la modificación reduce o erradica la actividad ADAM6 del ratón. En una modalidad, el ratón es modificado de tal modo que ambos alelos que codifican actividad ADAM6, están ausentes o expresan un ADAM6 que no funciona sustancialmente para soportar el apareamiento normal en un ratón macho. En una modalidad, el ratón además comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica para una proteína ADAM6 murina o una ortóloga u homóloga o un fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la modificación mantiene la actividad ADAM6 del ratón y vuelve al locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno incapaz de codificar una cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad específica, la modificación incluye inversiones y/o translocaciones cromosómicas, que hacen que el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina sea incapaz de codificar una cadena pesada de un anticuerpo.

En un aspecto, se proporcionan ratones y células genéticamente modificados que comprenden una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde la modificación reduce o elimina la actividad ADAM6 expresada a partir de una secuencia ADAM6 del locus, y en donde los ratones comprenden una proteína ADA 6 ó una ortóloga u homologa o un fragmento funcional de la misma. En varias modalidades, la proteína ADAM6 ó un fragmento de la misma, es codificada por una secuencia ADAM6 ectópica. En varias modalidades, la proteína ADAM6 ó un fragmento de la misma se expresa a partir de un alelo ADAM6 endógeno. En varias modalidades, el ratón comprende un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una primera modificación que reduce o elimina la expresión de una proteína ADAM6 funcional a partir del primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina, y el ratón comprende un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una segunda modificación, que sustancialmente no reduce o no elimina la expresión de una proteína ADAM6 funcional a partir del segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina.

En una modalidad, la segunda modificación está ubicada en dirección 3’ (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento genico V murino) de un segmento génico V murino final y está ubicada en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción de la secuencia de la región constante) de un gen murino de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (o quimérico humano/murino), o un fragmento del mismo (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región CH1 y/o región de bisagra y/o CH2 y/o CH3 humana y/o murina).

En una modalidad, la modificación es en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus, que codifica para un primer alelo ADAM6, y la función ADAM6 es el resultado de la expresión de un ADAM6 endógeno en un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus que codifica para un ADAM6 funcional, en donde el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una modificación de un segmento genico V, D y/o J. En una modalidad específica, la al menos una modificación del segmento génico V, D y/o J es una deleción, un reemplazo por un segmento génico VH humano o uno o más segmentos génicos DH, y/o uno o más segmentos génicos JH, un reemplazo por un segmento génico VH de camélido (o VHH). un segmento génico DH y/o un segmento génico JH, un reemplazo por un segmento génico VH humanizado o camelizado (o VHH,) , un segmento génico DH y/o un segmento génico JH, un reemplazo de una secuencia de cadena pesada por una secuencia de cadena ligera, y combinaciones de los mismos. En una modalidad, la al menos una modificación es la deleción de uno o más segmentos génicos VH, DH y/o JH y un reemplazo por uno o más segmentos génicos VL y/o JL (por ejemplo, un segmento génico VL y/o JL humano), en el locus de la cadena pesada.

En una modalidad, la modificación es en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus, y la función ADAM6 es el resultado de la expresión de una secuencia ADAM6 ectópica en un locus que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el locus que no es de inmunoglobulina es el locus ROSA26. En una modalidad específica, el locus que no es de inmunoglobulina es transcripcionalmente activo en tejido reproductor.

En una modalidad, la modificación es en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus, y la función ADAM6 es el resultado de la expresión de una secuencia ADAM6 ectópica en el primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la modificación es en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus, y la función ADAM6 es el resultado de la expresión de una secuencia ADAM6 ectópica en el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un noqueo (knockout) de ADAM6 heterocigoto u homocigoto. En una modalidad, el ratón además comprende una secuencia de inmunoglobulina modificada que es una secuencia de inmunoglobulina humana o humanizada, o una secuencia de inmunoglobulina de camelido o camelizada, humana o murina. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina modificada está presente en el locus endógeno de inmunoglobulina de cadena pesada murina. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina modificada comprende una secuencia genica variable de cadena pesada humana en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina murina. En una modalidad, la secuencia génica variable de cadena pesada humana reemplaza a una secuencia génica variable de cadena pesada murina endógena, en el locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina murina.

En un aspecto, se proporciona un ratón incapaz de expresar una protema ADAM6 murina endógena funcional a partir de un locus ADAM6 murino endógeno. En una modalidad, el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica para una proteína ADAM6, o un fragmento funcional de la misma, que es funcional en el ratón. En una modalidad específica, la secuencia de ácido nucleico ectópica codifica para una proteína que rescata la pérdida de capacidad de generar descendencia exhibida por un ratón macho que es homocigoto para un gen ADAM6 knockout (noqueado). En una modalidad específica, la secuencia de ácido nucleico ectópica codifica para una proteína ADAM6 murina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un locus ADAM6 endógeno funcional, y que comprende una secuencia de ácido nucleico ectópica que le confiere al ratón una función ADAM6. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia ADAM6 murina endógena o un fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la secuencia ADAM6 murina endógena comprende la secuencia codificadora ADAM6a y ADAM6b, localizada en un ratón de tipo silvestre entre el segmento genico V (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina murina más hacia 3’ y el segmento génico D (DH) de cadena pesada de inmunoglobulina murina más hacia 5’.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica para una proteína ADAM6a murina o un fragmento funcional de la misma y/o una secuencia que codifica para una ADAM6b murina o un fragmento funcional de la misma, en donde ADAM6a y/o ADAM6b ó fragmentos funcionales de las mismas, están ligadas de manera operable a un promotor. En una modalidad, el promotor es un promotor humano. En una modalidad, el promotor es un promotor ADAM6 murino. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 comprende una secuencia localizada entre el primer codón del primer gen ADAM6 más cercano al segmento DH más hacia el extremo 5’ murino, y la secuencia de señal de recombinación del segmento génico DH más hacia 5’, en donde el extremo 5’ está indicado con respecto a la dirección de la transcripción de los genes de inmunoglobulina murina. En una modalidad, el promotor es un promotor viral. En una modalidad específica, el promotor viral es un promotor de citomegalovirus (CMV). En una modalidad, el promotor es un promotor de ubiquitina.

En una modalidad, el promotor es un promotor inducible. En una modalidad, el promotor inducible regula la expresión en tejidos no reproductores. En una modalidad, el promotor inducible regula la expresión en tejidos reproductores. En una modalidad específica, la expresión de las secuencias ADAM6a y/o ADA 6b murinas o fragmentos funcionales de las mismas, está regulada por el promotor inducible en tejidos reproductores.

En una modalidad, las secuencias ADAM6a y/o ADAM6b murinas se seleccionan del grupo que consiste de ADAM6a de la SEQ ID NO: 1 y/o ADAM6b de la SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, el promotor ADAM6 murino es un promotor de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 murino comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 directamente en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 3 en dirección 5’ de la región codificadora ADAM6. En otra modalidad específica, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde dentro de aproximadamente 5 a 20 nucleótidos en dirección 5’ del codón de inicio de la secuencia ADAM6a, hasta aproximadamente 0.5 kb, 1 kb, 2 kb, ó 3 kb, o más en dirección 5’ del codón de inicio de ADAM6a.

En una modalidad, el promotor ADAM6 murino es un promotor de la SEQ ID NO: 73. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 murino comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 73 directamente en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción del gen ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 73 en dirección 5’ de la región codificadora ADAM6. En otra modalidad específica, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde dentro de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos en dirección 5’ del codón de inicio del gen ADAM6a, hasta aproximadamente 0.5 kb, 1 kb, 2 kb ó 3 kb o más, en dirección 5' del codón de inicio del gen ADAM6a.

En una modalidad, el promotor ADAM6 murino es un promotor de la SEQ ID NO: 77. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 murino comprende la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 77 directamente en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción del gen ADAM6a) del primer codón del gen ADAM6a y se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 77 en dirección 5’ de la región codificadora ADAM6. En otra modalidad específica, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde dentro de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos en dirección 5’ del codón de inicio del gen ADAM6a, hasta aproximadamente 0.5 kb, 1 kb, 2 kb, ó 3 kb o más, en dirección 5’ del codón de inicio del gen ADAM6a.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 3 ó un fragmento de la misma, que cuando se coloca en un ratón que es infertil o que tiene una baja fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o la restaura hasta aproximadamente la fertilidad de un animal de tipo silvestre. En una modalidad, la SEQ ID NO: 3 ó un fragmento de la misma le confiere a un ratón macho la capacidad de producir espermatozoides que son capaces de viajar a través del oviducto de un ratón hembra, con el fin de fertilizar un óvulo murino.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 73 ó un fragmento de la misma, que cuando se coloca en un ratón que es infertil o que tiene una baja fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o la restaura hasta aproximadamente la misma que la de un animal de tipo silvestre. En una modalidad, la SEQ ID NO: 73 ó un fragmento de la misma le confiere a un ratón macho la capacidad de producir espermatozoides que son capaces de viajar a través del oviducto de un ratón hembra, con el fin de fertilizar un óvulo murino.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 77 ó un fragmento de la misma, que cuando se coloca en un ratón que es infértil o que tiene una baja fertilidad a causa de la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o la restaura hasta aproximadamente la de un animal de tipo silvestre. En una modalidad, la SEQ ID NO: 77 ó un fragmento de la misma, le confiere a un ratón macho la capacidad de producir espermatozoides que son capaces de viajar a través del oviducto de un ratón hembra, con el fin de fertilizar un óvulo murino.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una deleción de una secuencia nucleotídica endógena que codifica para una proteína ADAM6, un reemplazo de un segmento génico VH murino endógeno por un segmento génico VH humano, y una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, el ratón comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una deleción de una secuencia nucleotídica de un locus de inmunoglobulina endógeno, que comprende un gen ADAM6 endógeno, que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para uno o más segmentos genicos de inmunoglobulina humana, y en donde la secuencia nucleotídica ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina, está dentro de o directamente adyacente a la secuencia nucleotídica que codifica para el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos VH endógenos, por una secuencia nucleotídica que codifica para un solo segmento génico VH humano, y la secuencia nucleotídica ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina está dentro de, o directamente adyacente a, la secuencia nucleotídica que codifica para un solo segmento génico VH humano. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos DH endógenos, por uno o más segmentos génicos DH humanos en el locus endógeno del gen DH. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos JH endógenos por uno o más segmentos génicos JH humanos en el locus endógeno del gen JH. En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH y un reemplazo en los loci endógenos VH, DH y JH, por un solo segmento VH humano, uno o más segmentos genicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos, en donde el ratón comprende una secuencia ectópica que codifica para una proteína ADAM6 murina. En una modalidad específica, la secuencia ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina está colocada en dirección 5’ del único segmento génico VH humano. En otra modalidad específica, la secuencia ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina, está colocada en dirección 3’ del único segmento génico VH humano. En otra modalidad específica, la secuencia ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina, está colocada entre el único segmento génico VH humano y el primer segmento génico DH humano presente. En otra modalidad específica, el ratón comprende una deleción de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos VH murinos, y un reemplazo por un solo segmento génico VH humano, y la secuencia nucleotídica ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina, está colocada en dirección 3’ del segmento génico humano VH1 -69 y en dirección 5’ del segmento génico humano DH1 -1 . En otra modalidad específica, el ratón comprende una deleción de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos VH murinos, y un reemplazo por un solo segmento génico VH humano, y la secuencia nucleotídica ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina, está colocada en dirección 3’ del segmento génico humano VH 1 -2 y en dirección 5’ del segmento génico humano DH1 -1.

En una modalidad específica, el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos genicos VH endógenos, por una secuencia nucleotídica que codifica para un solo segmento génico VH, y la secuencia nucleotídica ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina está dentro de, o directamente adyacente a, la secuencia nucleotídica que codifica para el único segmento génico VH humano.

En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina, está presente en un transgén en el genoma del ratón. En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica que codifica para la proteína ADAM6 murina, está presente extracromosómicamente en el ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el ratón expresa una célula B que comprende una secuencia de inmunoglobulina rearreglada ligada de manera operable a una secuencia génica de región constante de cadena pesada, y la célula B comprende en su genoma (por ejemplo, en un cromosoma de la célula B) un gen que codifica para una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina rearreglada que está ligada de manera operable a la secuencia génica de región constante de cadena pesada, comprende una secuencia génica V, D y/o J de cadena pesada humana; una secuencia génica V, D y/o J de cadena pesada murina; una secuencia génica V y/o J de cadena ligera humana o murina. En una modalidad, la secuencia genica de región constante de cadena pesada comprende una secuencia de cadena pesada humana o murina que se selecciona del grupo que consiste de una región CH1 , una región de bisagra, una región CH2, una región CH3, y combinaciones de las mismas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina funcionalmente silenciado, en donde la función ADAM6 es mantenida en el ratón, y además comprende una inserción de uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana, en donde el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana incluye un solo segmento génico VH humano, uno o más segmentos génicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana incluye un segmento génico humano VH1 -69, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana incluyen un segmento génico humano VH1 -2, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un gen de cadena ligera de inmunoglobulina funcionalmente silente y además comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos endógenos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, por un solo segmento génico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde el ratón carece de un locus ADAM6 endógeno funcional, y en donde el ratón comprende una secuencia nucleotídica ectópica que expresa una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un locus ADAM6 murino endógeno funcional o una secuencia, y que comprende una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para un locus ADAM6 murino o un fragmento funcional de un locus o una secuencia ADAM6 murina, en donde el ratón es capaz de aparearse con un ratón del sexo opuesto, para producir una progenie que comprenda un locus o secuencia ADAM6 ectópica. En una modalidad, el ratón es macho. En una modalidad, el ratón es hembra.

En un aspecto, se proporciona un ratón geneticamente modificado, en donde el ratón comprende un segmento génico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana en un locus endógeno del gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina murina, en donde el ratón carece de una secuencia ADAM6 funcional endógena en el locus endógeno del gen de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina murina, y en donde el ratón comprende una secuencia nucleotídica ectópica que expresa una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica que expresa la proteína ADAM6 murina es extracromosómica. En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica que expresa la proteína ADAM6 murina se integra en uno o más loci en un genoma del ratón. En una modalidad específica, el uno o más loci incluyen un locus de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina a partir de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina murina modificado, en donde la cadena pesada se deriva de un segmento genico V humano, de un segmento génico D humano, y de un segmento génico J humano, en donde el ratón comprende una actividad ADAM6 que es funcional en él.

En una modalidad, el ratón comprende un solo segmento génico V humano, una pluralidad de segmentos génicos D humanos, y una pluralidad de segmentos génicos J humanos. En una modalidad, los segmentos génicos D son segmentos génicos D humanos. En una modalidad, los segmentos génicos J son segmentos génicos J humanos. En una modalidad, el ratón además comprende una secuencia de región constante de cadena pesada humanizada, en donde la humanización comprende el reemplazo de una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de la región CH1 , región de bisagra, región CH2 , región CH3, y combinaciones de las mismas. En una modalidad específica, la cadena pesada se deriva del segmento génico V humano, de un segmento génico D humano, de un segmento génico J humano, de una secuencia CH1 humana, de una secuencia de bisagra humana o murina, de una secuencia CH2 murina, y de una secuencia CH3 murina. En otra modalidad específica, el ratón además comprende una secuencia constante de cadena ligera humana.

En una modalidad, el ratón comprende un gen ADAM6 que está flanqueado en dirección 5’ y 3’ por segmentos genicos de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, los segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina endógena son incapaces de codificar una cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad específica, el gen ADAM6 del ratón está en una posición que es la misma que en un ratón de tipo silvestre, y los loci endógenos del gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina del ratón, son incapaces de rearreglarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo.

En una modalidad, el segmento génico V está flanqueado en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico V), por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, el segmento génico V está flanqueado en dirección 3’ con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico V) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, el segmento génico D está flanqueado en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico D) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, el segmento genico J está flanqueado en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico J) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón, es el resultado de la expresión de una secuencia nucleotídica localizada en dirección 5’ del segmento génico D más hacia 5’ y en dirección 3’ del único segmento génico V (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico V) del locus endógeno modificado de la cadena pesada de inmunoglobulina murina.

En una modalidad, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón, es el resultado de la expresión de una secuencia nucleotídica localizada en dirección 5’ del segmento génico J que está más hacia 5’, y en dirección 3’ del segmento génico D que está más hacia 3’ (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico D) del locus endógeno modificado de la cadena pesada de inmunoglobulina murina.

En una modalidad, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón es el resultado de la expresión de una secuencia nucleotídica localizada en dirección 5’ del único segmento génico V humano (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico V) del locus endógeno modificado de la cadena pesada de inmunoglobulina murina.

En una modalidad, la secuencia nucleotídica comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de una secuencia ADAM6b murina o un fragmento funcional de la misma, una secuencia ADAM6a murina o un fragmento funcional de la misma, y combinaciones de las mismas.

En una modalidad, la secuencia nucleotídica posicionada en dirección 5’ o en dirección 3’ del único segmento genico V humano, está colocada en orientación de transcripción opuesta con respecto al segmento génico V humano. En una modalidad específica, la secuencia nucleotídica codifica, de 5’ a 3’ con respecto a la dirección de la transcripción de los genes ADAM6, y la secuencia ADAM6a seguida por una secuencia ADAM6b.

En una modalidad, el ratón comprende un solo segmento VH humano yuxtapuesto o contiguo a la secuencia ADAM6 murina o un fragmento funcional de la misma.

En una modalidad, el ratón comprende un segmento génico humano VH1 -69 yuxtapuesto o contiguo a la secuencia ADAM6 murina o un fragmento funcional de la misma.

En una modalidad, el ratón comprende un segmento génico humano VH 1 -2 yuxtapuesto o contiguo a una secuencia ADAM6 murina o un fragmento funcional de la misma.

En una modalidad, el ratón comprende un solo segmento génico VH humano y la secuencia ADAM6 murina o un fragmento funcional de la misma está yuxtapuesta o contigua a los segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde los segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina son incapaces de rearreglarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo.

En una modalidad, la secuencia que codifica la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón, es una secuencia ADAM6 murina o un fragmento funcional de la misma.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una actividad ADAM6 murina (o una homologa u ortóloga o fragmento funcional de la misma) en una celula portadora de ADN de una línea de células B no rearregladas, pero que no comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para la actividad ADAM6 murina (u homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma) en una célula B que comprende loci de inmunoglobulina rearreglados, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica para la actividad ADAM6 murina (u homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma), está presente en el genoma en una posición que es diferente de la posición en la cual aparece el gen ADAM6 murino en un ratón de tipo silvestre. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la actividad ADAM6 murina (u homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma), está presente en la totalidad o sustancialmente la totalidad de células portadoras de ADN que no son de la línea de células B rearregladas; en una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está presente en células de línea germinal del ratón, pero no en un cromosoma de una célula B rearreglada.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una actividad ADAM6 murina (u homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma) en la totalidad o sustancialmente la totalidad de celulas portadoras de ADN, incluyendo células B que comprenden loci de inmunoglobulina rearreglados, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la actividad ADAM6 murina (u homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma), está presente en el genoma en una posición que es diferente de la posición en la cual aparece el gen ADAM6 murino en un ratón de tipo silvestre. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la actividad ADAM6 murina (u homologa u ortóloga o un fragmento funcional de la misma), está en un ácido nucleico que es contiguo al locus de inmunoglobulina rearreglado. En una modalidad, el ácido nucleico que es contiguo al locus de inmunoglobulina rearreglado, es un cromosoma. En una modalidad, el cromosoma es un cromosoma que se encuentra en un ratón de tipo silvestre, y el cromosoma comprende una modificación de un locus de inmunoglobulina murina.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende una célula B que comprende en su genoma una secuencia ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma. En una modalidad, la secuencia ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el locus de cadena pesada comprende segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina que son incapaces de rearreglarse para codificar la cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad, la secuencia ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma está en un locus que no es un locus de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia ADAM6 está en un transgen dirigido por un promotor heterólogo. En una modalidad específica, el promotor heterólogo es un promotor que no es de inmunoglobulina. En una modalidad específica, la célula B expresa una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma.

En una modalidad, el 90% o más de las células B del ratón comprenden un gen que codifica para una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma, o un fragmento de la misma que es funcional en el ratón. En una modalidad específica, el ratón es un ratón macho.

En una modalidad, el genoma de la célula B comprende un primer alelo y un segundo alelo que comprende la secuencia ADAM6 o un ortólogo u homólogo de la misma. En una modalidad, el genoma de la célula B comprende un primer alelo, pero no un segundo alelo que comprende la secuencia ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación mantiene uno o más alelos ADAM6 endógenos.

En una modalidad, la modificación vuelve al ratón incapaz de expresar una cadena pesada funcional que comprenda segmentos genicos de cadena pesada endógenos rearreglados a partir de al menos un alelo de cadena pesada, y mantiene un alelo ADAM6 endógeno localizado dentro de al menos un alelo endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

En una modalidad, el ratón es incapaz de expresar una cadena pesada funcional que comprenda segmentos génicos endógenos de cadena pesada rearreglados, a partir de al menos uno de los alelos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, y los ratones expresan una proteína ADAM6 a partir de un alelo endógeno ADAM6. En una modalidad específica, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional que comprenda segmentos génicos endógenos de cadena pesada rearreglados, a partir de dos alelos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina, y los ratones expresan una proteína ADAM6 a partir de uno o más alelos ADAM6 endógenos.

En una modalidad, los ratones son incapaces de expresar una cadena pesada funcional a partir de cada alelo de cadena pesada endógeno, y los ratones comprenden un alelo ADAM6 funcional localizado dentro de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10 ó 120 ó más megapares de bases (Mpb) en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción del locus de la cadena pesada murina) de una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina murina. En una modalidad específica, el alelo ADAM6 funcional está en el locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, en una región intergenica V-D, entre dos segmentos génicos V, entre un segmento génico V y uno D, entre un segmento génico D y uno J, etcétera). En una modalidad específica, el alelo ADAM6 funcional está localizado dentro de 90 a 100 kilobases (kb) de secuencia intergénica, entre el segmento génico V murino final y el primer segmento génico D murino.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos ADAM6 endógenos.

En una modalidad, la modificación torna al ratón incapaz de expresar una proteína ADAM6 funcional a partir de al menos uno de los uno o más alelos ADAM6 endógenos. En una modalidad específica, el ratón es incapaz de expresar una proteína ADAM6 funcional a partir de cada uno de los alelos ADAM6 endógenos.

En una modalidad, el ratón es incapaz de expresar una proteína ADAM6 funcional a partir de cada uno de los alelos ADAM6 endógenos, y el ratón comprende una secuencia ADAM6 ectópica.

En una modalidad, los ratones son incapaces de expresar una proteína ADAM6 funcional a partir de cada uno de los alelos ADAM6 endógenos, y los ratones comprenden una secuencia ADAM6 ectópica localizada dentro de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10 ó 120 ó más kb en dirección 5’ (con respecto a la dirección de la transcripción del locus de la cadena pesada murina) de una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina murina. En una modalidad específica, la secuencia ADAM6 ectópica está en el locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, en una región intergenica V-D, entre dos segmentos génicos V, entre un segmento génico V y uno D, entre un segmento génico D y uno J, etcétera). En una modalidad específica, la secuencia ADAM6 ectópica está localizada dentro de 90 a 100 kb de una secuencia intergénica entre el segmento génico V murino final y el primer segmento génico D murino. En otra modalidad específica, la secuencia de 90 a 100 kb endógena intergénica V-D es removida, y la secuencia ADAM6 ectópica es colocada entre el único segmento génico V humano y un primer segmento génico D humano. En otra modalidad específica, la secuencia endógena de 90 a 100 kb intergénica V-D es removida, y la secuencia ADAM6 ectópica es colocada en dirección 5’ del único segmento génico V humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho infértil, en donde el ratón comprende una deleción de dos o más alelos ADAM6 endógenos. En un aspecto, se proporciona un ratón hembra que es portador de un rasgo de infertilidad de macho, en donde el ratón hembra comprende en su línea germinal un alelo ADAM6 no funcional o un alelo ADAM6 endógeno noquedado (knockout).

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un segmento génico V, D y/o J endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina que es incapaz de rearreglarse para codificar una cadena pesada de un anticuerpo, en donde la mayoría de las células B del ratón comprenden un gen ADAM6 funcional.

En una modalidad, el ratón comprende segmentos genicos V, D y J endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina intactos, que son incapaces de rearreglarse para codificar una cadena pesada funcional de un anticuerpo. En una modalidad, el ratón comprende al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J, y combinaciones de los mismos; en donde los al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V, los al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D, los al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J, son incapaces de rearreglarse para codificar una región variable de cadena pesada de un anticuerpo. En una modalidad específica, el ratón comprende un gen ADAM6 funcional localizado dentro de los segmentos génicos V, D y J endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina intactos. En una modalidad, el ratón comprende un locus endógeno de cadena pesada que incluye un locus ADAM6 endógeno, en donde el locus endógeno de cadena pesada comprende 89 segmentos génicos V, 13 segmentos génicos D, y cuatro segmentos génicos J, en donde los segmentos génicos de cadena pesada endógenos son incapaces de rearreglarse para codificar la región variable de cadena pesada de un anticuerpo, y el locus ADAM6 codifica para una proteína ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un segmento génico endógeno V, D, y J de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la mayoría de las células B del ratón comprenden una secuencia ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma.

En una modalidad, el ratón carece de segmentos genicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina que se seleccionan del grupo que consiste de dos o más segmentos génicos V, dos o más segmentos génicos D, dos o más segmentos génicos J, y combinaciones de los mismos. En una modalidad, el ratón carece de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina que se seleccionan del grupo que consiste de al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J, y combinaciones de los mismos. En una modalidad, el ratón carece de un fragmento de ADN genómico del cromosoma 12 que comprende aproximadamente tres megabases del locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el ratón carece de todos los segmentos génicos endógenos V, D y J de cadena pesada funcionales. En una modalidad específica, el ratón carece de 89 segmentos génicos VH, de 13 segmentos génicos DH y de cuatro segmentos génicos JH.

En un aspecto, se proporciona un ratón en donde dicho ratón tiene un genoma en la línea germinal que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación al locus de cadena pesada de inmunoglobulina comprende el reemplazo de una o más secuencias de región variable de inmunoglobulina murina por una secuencia de región variable de inmunoglobulina no murina, y en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ADAM6 murina. En una modalidad preferida, las secuencias DH y JH y al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, ó al menos 80 secuencias VH del locus endógeno de la cadena pesada de inmunoglobulina, son reemplazadas por secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina no murinas. En otra modalidad preferida, las secuencias DH, JH y todas las secuencias VH del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, son reemplazadas por un solo segmento genico V de inmunoglobulina no murina, uno o más segmentos génicos D, y uno o más segmentos génicos J. Las secuencias de inmunoglobulina no murina pueden estar no rearregladas. En una modalidad preferida, las secuencias de inmunoglobulina no murina comprenden regiones DH y JH no rearregladas completas y una sola secuencia VH no rearreglada de la especie no murina. En otra modalidad preferida, las secuencias de inmunoglobulina no murina son capaces de formar una región variable completa; es decir, una región variable rearreglada que contenga segmentos VH, DH y H unidos juntos para formar una secuencia que codifique para una región variable de cadena pesada, de la especie no murina. La especie no murina puede ser Homo sapiens y las secuencias de inmunoglobulina no murina pueden ser secuencias humanas.

En un aspecto, se proporciona un locus de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende un solo segmento V humano funcional. En una modalidad, el único segmento V humano funcional se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2, VH1 -3, VH1 -8, VH1 -18, VH1 -24, VH 1 -45, VH1 -46, VH1 -58, VH1 -69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11 , VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21 , VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38 , VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66 , VH3-72 , VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1 , VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61 , VH5-51 , VH6-1 , VH7-4-1 y VH7-81 . En una modalidad, el único segmento V humano funcional es un segmento VH1 -69; en una modalidad específica, el único segmento V humano funcional está presente en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 ó 13 formas polimórficas encontradas en la población humana. En una modalidad, el único segmento V humano funcional es un segmento VH1 -2; en una modalidad específica, el único segmento V humano funcional está presente en 1 , 2, 3, 4 ó 5 formas polimórficas encontradas en la población humana.

En una modalidad, el locus de inmunoglobulina de cadena pesada es un locus modificado de un animal no humano. En una modalidad, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana modificado está presente en el animal no humano en una posición en el genoma en la cual el correspondiente locus no humano no modificado se encuentra en el animal no humano de tipo silvestre. En una modalidad, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humano modificado está presente en un transgen, en un animal no humano.

En una modalidad, el único segmento genico V humano funcional es un segmento génico VH1 -69. En una modalidad, el segmento génico VH1 -69 comprende la SEQ ID NO: 37. En una modalidad, el segmento génico VH1 -69 se deriva de la SEQ ID NO: 37. En una modalidad, el segmento génico VH1 -69 tiene una identidad de al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% con la SEQ ID NO: 37.

En una modalidad, el único segmento génico V humano funcional es codificado por la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 37.

En una modalidad, el único segmento génico V humano funcional es un segmento génico VH1 -2. En una modalidad, el segmento génico VH1 -2 comprende la SEQ ID NO: 63. En una modalidad, el segmento génico VH1 -2 se deriva de la SEQ ID NO: 63. En una modalidad, el segmento génico VH1 -2 tiene una identidad de al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% con la SEQ ID NO: 63.

En una modalidad, el único segmento génico V humano funcional es codificado por una secuencia nucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 63.

En una modalidad, el único segmento V humano funcional está ligado de manera operable a uno o más segmentos D y a uno o más segmentos J. En una modalidad, el segmento V y uno o más segmentos D y/o J están ligados de manera operable a una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste de las secuencias CH1 , de bisagra, CH2, CH3, y combinaciones de las mismas. En una modalidad, las regiones CH1 , de bisagra, CH2, CH3, o combinaciones de las mismas, cada una son secuencias constantes endógenas no humanas. En una modalidad, al menos una de entre las secuencias CH1 , de bisagra, CH2, CH3, o combinaciones de las mismas, es una secuencia humana. En una modalidad específica, las secuencias CH1 y/o de bisagra son humanas.

En un aspecto, se proporciona un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, que comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos V funcionales por un solo segmento V humano, en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana es incapaz de rearreglarse para formar un gen variable de cadena pesada que se derive de un segmento V diferente del único segmento V humano.

En una modalidad, el único segmento V humano es el VH1 -69. En una modalidad, el único segmento V humano es el VH1 -2.

En una modalidad, el locus comprende al menos un segmento DH humano o no humano y un segmento JH humano o no humano. En una modalidad específica, el locus comprende un segmento DH humano y un segmento JH humano. En una modalidad específica, el locus comprende un segmento JH humano. En otra modalidad específica, el locus comprende un segmento VH1 -69 humano, la totalidad de segmentos DH humanos funcionales, y la totalidad de segmentos JH humanos funcionales. En una modalidad, los segmentos V, D y J humanos (o los segmentos V y J), están ligados de manera operable a un gen de región constante murino en un locus endógeno de la cadena pesada murina. En una modalidad específica, el locus de cadena pesada murina comprende un repertorio de tipo silvestre de secuencias de región constante de inmunoglobulina murina.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, en donde el único segmento génico V de cadena pesada de inmunoglobulina funcional del animal no humano, se selecciona del grupo que consiste de segmentos génicos humanos VH1 -2, VH1 -3, VH1 -8, VH1 -18, VH1 -24, VH1 -45, VH1 -46, VH1-58, VH1 -69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-1 1 , VH3-13, VH3-1 5, VH3-16, VH3-20, VH3-21 , VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1 , VH4-30-2 , VH4-30-4, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61 , VH5-51 , VH6-1 , VH7-4-1 y VH7-81 . En una modalidad, el segmento V de cadena pesada es un segmento génico VH 1 -69 humano. En una modalidad, el segmento génico V de cadena pesada es un segmento génico VH1 -2 humano.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, en donde el animal no humano comprende un único segmento VH humano funcional, y en donde el animal no humano es sustancialmente incapaz de formar un gen de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina rearreglado, que carece del único segmento VH humano funcional.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano geneticamente modificado, en donde la única región variable de cadena pesada de inmunoglobulina expresada en el animal no humano, se deriva de un segmento humano que se selecciona del grupo que consiste de segmentos génicos humanos VH1 -2, VH1 -3, VH1 -8, VH1 -18, VH1 -24, VH1 -45, VH1 -46, VH1 -58, VH1 -69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-1 1 , VH3-1 3, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21 , VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28 , VH4-30-1 , VH4-30-2 , VH4-30-4, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61 , VH5-51 , VH6-1 , VH7-4-1 y VH7-81 . En una modalidad, el segmento humano es un segmento VH1 -69. En una modalidad, el segmento humano es un segmento VH1 -2. En una modalidad, la única región variable de cadena pesada de inmunoglobulina expresada por el ratón, se deriva de un solo miembro de la familia de segmentos génicos V, y en una modalidad, la única región variable de cadena pesada de inmunoglobulina se deriva de una variante polimórfica del único miembro de la familia de segmentos génicos V.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos génicos V de cadena pesada de inmunoglobulina restringido, en donde el animal no humano además comprende uno o más segmentos variables de cadena ligera k (VK) de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el uno o más segmentos VK están ligados de manera operable a uno o más segmentos J humanos. En una modalidad específica, los segmentos J son segmentos JK humanos. En otra modalidad específica, el animal no humano no expresa una cadena ligera l de inmunoglobulina. En otra modalidad específica, el animal no humano no comprende un locus endógeno variable de cadena ligera l de inmunoglobulina funcional o humano funcional.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón.

En una modalidad, el animal no humano comprende un reemplazo en el locus VK de inmunoglobulina no humano endógeno, de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos endógenos VK funcionales, por uno o más segmentos VK humanos funcionales. En otra modalidad específica, el reemplazo es por la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos VK de inmunoglobulina humana funcionales.

En una modalidad, el animal no humano comprende un reemplazo en el locus endógeno JK de inmunoglobulina no humana, de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos JK de inmunoglobulina no humana endógenos funcionales, por uno o más segmentos JK de inmunoglobulina humanos funcionales. En otra modalidad específica, el reemplazo es por la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos JK de inmunoglobulina humanos funcionales.

En una modalidad específica, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende un repertorio de segmentos V que consiste esencialmente de un solo segmento V y/o variantes polimórficas del mismo. En una modalidad, el único segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina es un segmento VH1 -69 humano, y el animal no humano además comprende un reemplazo de la totalidad de segmentos DH no humanos funcionales, por la totalidad de segmentos DH humanos funcionales, y además comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos JH no humanos funcionales, por la totalidad de segmentos JH humanos funcionales, y en donde el locus de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina, está ligado de manera operable a una secuencia genica de región constante humana o no humana. En una modalidad específica, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana endógena. En una modalidad específica, el animal no humano rearregla segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, para formar un gen que codifique para una región variable de cadena pesada que comprenda una secuencia VH1 -69 humana, una secuencia DH humana, una secuencia JH humana, y una secuencia de región constante murina.

En una modalidad específica, el animal no humano comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende un repertorio de segmentos V que consiste esencialmente de un único segmento V y/o variantes polimórficas del mismo. En una modalidad, el único segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina es un segmento VH1 -2 humano, y el animal no humano además comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos DH no humanos funcionales, por la totalidad de segmentos DH humanos funcionales, y además comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos JH no humanos funcionales, por la totalidad de segmentos JH humanos funcionales, y en donde el locus de región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina, está ligado de manera operable a una secuencia genica de región constante humana o no humana. En una modalidad específica, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana endógena. En una modalidad específica, el animal no humano rearregla segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, para formar un gen que codifique para una región variable de cadena pesada que comprenda una secuencia VH1 -2 humana, una secuencia DH humana, una secuencia JH humana, y una secuencia de región constante murina.

En una modalidad, se proporciona una célula 6 que comprende el gen rearreglado. En una modalidad específica, la célula B proviene de un ratón como el descrito que ha sido inmunizado con un antígeno de interés, y la célula B codifica para un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés. En una modalidad, el antígeno de interés es un patógeno. En una modalidad específica, el patógeno se selecciona del grupo que consiste de virus de la influenza, un virus de la hepatitis (por ejemplo, un virus de la hepatitis B o de la hepatitis C), y un virus de la inmunodeficiencia humana. En una modalidad específica, la celula B codifica para un anticuerpo de alta afinidad (por ejemplo, de aproximadamente 10 9 KD o menor), somáticamente mutado, que comprende una región variable de cadena ligera humana (por ejemplo, una región variable de cadena ligera k humana) que se une específicamente al antígeno de interés.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos V de cadena pesada de inmunoglobulina restringido, en donde el animal no humano comprende uno o más segmentos variables (\/l) de cadena ligera l humana. En una modalidad, el uno o más segmentos nl humanos están ligados de manera operable a uno o más segmentos J humanos. En una modalidad específica, los segmentos J son segmentos ?l humanos. En otra modalidad específica, el animal no humano no expresa una cadena ligera K. En otra modalidad específica, el animal no humano no comprende un locus variable de cadena ligera k humano o no humano funcional.

En una modalidad, el animal no humano comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos \ l de inmunoglobulina no humana funcionales, por uno o más segmentos \/l de inmunoglobulina humana funcionales. En otra modalidad específica, el reemplazo es por la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos \/l de inmunoglobulina humana funcionales.

En una modalidad, el animal no humano comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos ?l de inmunoglobulina no humana funcionales, por uno o más segmentos l de inmunoglobulina humana funcionales. En otra modalidad específica, el reemplazo es por la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos J de inmunoglobulina humana funcionales.

En una modalidad específica, el animal no humano comprende un locus de región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende sólo un único segmento VH, en donde el único segmento VH es un segmento VH1 -69 humano o un segmento VH1 -2 humano, y además comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos DH no humanos funcionales por la totalidad de segmentos DH humanos funcionales, y además comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos JH no humanos funcionales, por la totalidad de segmentos JH humanos funcionales, y en donde el locus de región VH está ligado de manera operable a un secuencia genica de región constante humana o no humana. En una modalidad específica, la secuencia génica de región constante es una secuencia génica de región constante no humana, por ejemplo una secuencia génica no humana endógena. En una modalidad específica, el animal no humano rearregla segmentos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana para formar un gen que codifica para una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende una secuencia VH1 -69 humana (o una secuencia VH1 -2 humana), una secuencia DH humana, una secuencia JH humana, y una secuencia de región constante no humana endógena.

En una modalidad, se proporciona una celula B que comprende el gen rearreglado. En una modalidad específica, la célula B proviene de un animal no humano como el descrito, que ha sido inmunizado con un antígeno de interés, y la célula B codifica para un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés. En una modalidad, el antígeno es una proteína humana que se selecciona del grupo que consiste de un ligando, un receptor de superficie celular, y una proteína intracelular. En una modalidad, el antígeno de interés es un patógeno. En una modalidad específica, el patógeno se selecciona del grupo que consiste de un virus de la influenza, un virus de la hepatitis (por ejemplo, un virus de la hepatitis B o de la hepatitis C), y un virus de la inmunodeficiencia humana. En una modalidad específica, la célula B codifica para un anticuerpo de alta afinidad (por ejemplo, de aproximadamente 10 9 KD o menor), somáticamente mutado, que comprende una región variable de cadena ligera humana (por ejemplo, una región variable de cadena ligera l humana) que se une específicamente al antígeno de interés.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende un segmento génico V de cadena pesada de inmunoglobulina restringido, en donde el animal no humano comprende un segmento VH1 -69 humano (o un segmento VH1 -2 humano) en un transgén, en donde el segmento VH1 -69 humano está ligado de manera operable en el transgén a un segmento DH humano o no humano, y/o a un segmento J humano o no humano, y el transgén además comprende un gen de región constante humano o no humano, o una región constante quimérica humana/no humana (por ejemplo, una región CH1 , región de bisagra, región CH2, región CH3 Ó combinaciones de las mismas, en donde al menos una secuencia es no humana, por ejemplo que se selecciona del grupo que consiste de las regiones CH2 y CH3 y/o la región de bisagra). En una modalidad, el animal no humano es un ratón o una rata, y el gen D, J no humano y/o el gen de región constante es un gen murino o de rata, o un gen quimérico humano/murino o un gen de rata.

En una modalidad, el animal no humano comprende un transgén que comprende un locus de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, que comprende uno o más segmentos \/l y segmentos ?l de inmunoglobulina humana, o uno o más segmentos VK y segmentos JK de inmunoglobulina humana, y un gen de región constante de cadena ligera k ó l de inmunoglobulina humana, de tal modo que el transgén se rearregla en el animal no humano, para formar un gen de cadena ligera k ó l de inmunoglobulina rearreglado.

En una modalidad específica, el animal no humano comprende un transgén que tiene un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende un solo segmento V que es un segmento VH1 -69 humano (o un segmento VH1 -2 humano), uno o más segmentos D humanos, uno o más segmentos J humanos, y un gen de cadena constante humana ligado de manera operable al locus variable de cadena pesada, de tal modo que el ratón exprese desde el transgen, un anticuerpo completamente humano derivado del segmento VH1 -69 (o del segmento VH1 -2). En una modalidad, el animal no humano no comprende un locus endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina funcional. En una modalidad específica, el animal no humano comprende un locus endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no funcional, que comprende una deleción de un segmento DH no humano endógeno y/o de un segmento JH no humano endógeno, de tal modo que el animal no humano es incapaz de rearreglar el locus endógeno de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, para formar un gen de anticuerpo no humano rearreglado. En una modalidad específica, el animal no humano comprende una deleción de una secuencia de conmutación ligada de manera operable a una región constante de cadena pesada murina endógena. En una modalidad específica, la secuencia de conmutación es una secuencia de conmutación m (por ejemplo, murina) no humana. En otra modalidad, el animal no humano además comprende la falta de un locus variable endógeno de cadena ligera funcional, que se selecciona del grupo que consiste de un locus k de inmunoglobulina y un locus l de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el animal no humano comprende la deleción de una secuencia JK y/o ?l, de tal modo que el animal no humano es incapaz de rearreglar una región variable de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana endógena y/o una región variable de cadena ligera l de inmunoglobulina no humana endógena, para formar un gen endógeno de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana rearreglado y/o un gen endógeno de cadena ligera l de inmunoglobulina no humano rearreglado.

En una modalidad, el animal no humano comprende la deleción de una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana endógena, que da como resultado el noqueo (knockout) funcional de la cadena ligera k de inmunoglobulina no humana endógena. En una modalidad, el animal no humano comprende la deleción de una secuencia de cadena ligera l de inmunoglobulina no humana endógena, que es el resultado de un noqueo funcional de la cadena ligera l de inmunoglobulina no humana endógena.

En un aspecto, se proporciona un roedor que comprende un repertorio variable de cadena pesada de inmunoglobulina derivado de no más de un segmento VH humano o una o más formas polimórficas del mismo, de un segmento D que se selecciona del grupo que consiste de un repertorio de uno o más segmentos D, y de un segmento J que se selecciona del grupo que consiste de un repertorio de uno o más segmentos J; en donde el roedor comprende una secuencia ADAM6 ectópica o un ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma, que es funcional en un roedor macho.

En una modalidad, el segmento VH humano está presente en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más variantes polimórficas, en donde cada variante polimórfica está ligada de manera operable a un segmento D y/o J, de tal modo que cada variante polimórfica es capaz de rearreglarse y formar un dominio variable de cadena pesada rearreglado con cualquiera de los uno o más segmentos D y cualquiera de los uno o más segmentos J. En una modalidad, el roedor es un ratón o una rata. En una modalidad, el repertorio de segmentos D comprende dos o más segmentos D. En una modalidad, el repertorio de segmentos J comprende dos o más segmentos J. En una modalidad, los segmentos D y/o J son segmentos humanos. En una modalidad, la secuencia ADAM6 ectópica es una secuencia ADAM6 de un roedor de tipo silvestre de la misma especie. En una modalidad, el roedor es un ratón o una rata. En una modalidad, la secuencia ADAM6 ectópica o un ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma, que es funcional en el roedor macho, está en el mismo cromosoma que el repertorio variable de cadena pesada de inmunoglobulina modificado; en una modalidad, dicha secuencia está en un cromosoma diferente.

En un aspecto, se proporciona una construcción nucleotídica que comprende una secuencia que codifica para un solo segmento VH de cadena pesada de inmunoglobulina humana y/o variantes polimórficas del mismo, y una o más secuencias DH y una o más secuencias J, en donde la construcción comprende al menos un brazo de homología que es homólogo a un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o un sitio de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, un sitio lox). En una modalidad, el segmento V es un segmento VH1 -69 ó un segmento VH1 -2.

En un aspecto, se proporciona una construcción nucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un solo segmento V de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde el único segmento VH es un segmento VH1 -69 (o un segmento VH1 -2). En una modalidad, la construcción comprende un sitio de reconocimiento de recombinasa específica de sitio. En una modalidad, la construcción comprende un primer brazo de homología murino en dirección 5’ del segmento VH1 -69 (o VH1 -2) y un segundo brazo de homología en dirección 3’ del segmento VH1 -69 (o VH1 -2), y en donde el primer brazo de homología es homólogo a una región de un cromosoma murino inmediatamente en dirección 5’ de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina murina, pero que no incluye un segmento variable de cadena pesada de inmunoglobulina murina funcional. En una modalidad, la construcción comprende la SEQ ID NO: 6. En una modalidad, la construcción comprende la SEQ ID NO: 74. En una modalidad, la construcción comprende la SEQ ID NO: 75. En una modalidad, la construcción comprende la SEQ ID NO: 76.

En un aspecto, el único segmento VH restringido está en un animal no humano, o el segmento VH restringido está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, in situ o en un transgen), y el animal no humano o el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana se selecciona del grupo que consiste de un ratón, una rata, un conejo, un cerdo, un bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), un venado, una oveja, una cabra, un pollo, un gato, un perro, un hurón, un primate (por ejemplo un tití, un mono rhesus). En una modalidad específica, el animal o locus no humano es un locus murino o de rata.

En un aspecto, se proporciona un vector objetivo que comprende: (a) una secuencia nucleotídica que es identica o sustancialmente idéntica a una secuencia nucleotídica de un segmento génico de región variable humana; y (b) una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón.

En una modalidad, el vector objetivo además comprende un promotor ligado de manera operable a la secuencia que codifica la proteína ADAM6 murina. En una modalidad específica, el promotor es un promotor ADAM6 murino.

En un aspecto, se proporciona una construcción nucleotídica para modificar un locus variable de cadena pesada de inmunogiobulina murina, en donde la construcción comprende al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa específica de sitio y una secuencia que codifica para una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un brazo de homología en dirección 5’ y un brazo de homología en dirección 3’, en donde el brazo de homología en dirección 5’ comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica, a una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunogiobulina humana, el brazo de homología en dirección 3’ comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente identica a una secuencia de región variable de inmunoglobulina humana o murina, y entre los brazos de homología en dirección 5’ y 3' hay dispuesta una secuencia que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína ADAM6. En una modalidad específica, la secuencia que codifica para el gen ADAM6 murino está ligada de manera operable a un promotor murino con el cual está ligada la secuencia ADAM6 murina, en un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, se proporciona una célula aislada de un ratón genéticamente modificado de la manera aquí descrita. En una modalidad, la célula es un linfocito. En una modalidad, el linfocito es una célula B. En una modalidad específica, la célula B comprende una secuencia ADAM6 ectópica o un ortólogo u homólogo o una secuencia que codifica para un fragmento funcional de la misma, en donde la célula B expresa un dominio variable de cadena pesada derivado de un segmento génico VH humano.

En un aspecto, se proporciona una célula o tejido, en donde la célula o tejido se deriva de un animal no humano como el descrito en la presente, y comprende un repertorio de segmentos VH restringido. En una modalidad, el repertorio de segmentos VH está restringido a un solo miembro de la familia de segmentos VH y/o a variantes polimórficas del mismo. En una modalidad específica, el único segmento VH es un segmento VH1 -69 humano o un segmento VH1 -2 humano. En una modalidad, la célula o tejido se deriva del bazo, de ganglios linfáticos o de médula ósea del animal no humano.

En una modalidad, la celula es una célula ES. En una modalidad, la célula es una célula B. En una modalidad, la célula es una célula germinal.

En una modalidad, el tejido se selecciona del grupo que consiste de tejido conectivo, muscular, nervioso y epitelial. En una modalidad específica, el tejido es tejido reproductor.

En una modalidad, la célula y/o tejido derivado de un ratón como el descrito en la presente, se aísla para utilizarse en uno o más ensayos ex vivo. En varias modalidades, el uno o más ensayos ex vivo incluye la medición de propiedades físicas, térmicas, eléctricas, mecánicas u ópticas, un procedimiento quirúrgico, la medición de interacciones de diferentes tipos de tejidos, el desarrollo de téenicas de imágenes, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, se proporciona un embrión no humano que comprende segmentos VH de cadena pesada restringidos tal como se describe en la presente. En una modalidad, el embrión comprende una célula donadora ES que comprende el segmento VH restringido, y células del embrión huésped.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, se proporciona una célula no humana que comprende un cromosoma o un fragmento del mismo de un animal no humano tal como se describe en la presente. En una modalidad, la célula no humana comprende un núcleo de un animal no humano tal como el descrito en la presente. En una modalidad, la célula no humana comprende el cromosoma o un fragmento del mismo como resultado de una transferencia nuclear.

En un aspecto, se proporciona un núcleo derivado de un animal no humano como el que se describe en la presente. En una modalidad, el núcleo proviene de una celula diploide que no es una célula B.

En un aspecto, se proporciona una célula pluripotencial, pluripotencial inducida, o totipotencial, derivada de un animal no humano como el descrito en la presente. En una modalidad específica, la célula es una célula madre (ES) embrionaria murina.

En un aspecto, se proporciona una célula pluripotencial inducida no humana que comprende un repertorio de segmentos VH restringido. En una modalidad, la célula pluripotencial inducida se deriva de un animal no humano como el que se describe en la presente.

En un aspecto, se proporciona un hibridoma que comprende una secuencia de un linfocito de un ratón como el descrito en la presente. En una modalidad, el linfocito es una célula B.

En un aspecto, se proporciona un hibridoma o un cuadroma, derivado de una célula de un animal no humano como el aquí descrito. En una modalidad, el animal no humano es un ratón o una rata.

En un aspecto, se proporcionan células murinas o embriones murinos, incluyendo pero no limitándose a células ES, células pluripotenciales y células pluripotenciales inducidas, que comprenden modificaciones geneticas como las descritas en la presente. Se proporcionan células que son XX y células que son XY. También se proporcionan células que comprenden un núcleo que contiene una modificación como la descrita en la presente, por ejemplo una modificación introducida en una célula mediante inyección pronuclear. También se proporcionan células, embriones y ratones que comprenden un gen ADAM6 viralmente introducido, por ejemplo células, embriones y ratones que comprenden una construcción de transducción que comprende un gen ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, se proporciona una célula de ratón genéticamente modificada, en donde la célula es incapaz de expresar una cadena pesada que comprende segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina rearreglados, y la célula comprende un gen ADAM6 funcional que codifica para una proteína ADAM6 murina o un fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la célula además comprende la inserción de segmentos génicos de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, los segmentos génicos de inmunoglobulina humana son segmentos génicos de cadena pesada que están ligados de manera operable a regiones constantes de cadena pesada murina, de tal modo que luego del rearreglo, codifican para una cadena pesada funcional de un anticuerpo que comprende una región variable humana.

En un aspecto, se proporciona una célula de ratón genéticamente modificada, en donde la célula carece de un locus ADAM6 murino endógeno funcional, y la célula comprende una secuencia nucleotídica ectópica que codifica para una proteína ADAM6 murina o un fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la célula además comprende una modificación de una secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, la modificación de la secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, comprende una deleción que se selecciona del grupo que consiste de una deleción de un segmento génico VH murino, una deleción de un segmento génico DH murino, una deleción de un segmento génico JH murino, y combinaciones de las mismas. En una modalidad específica, el ratón comprende un reemplazo de una o más secuencias VH, DH y/o JH de inmunoglobulina murina, por una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana se selecciona del grupo que consiste de una secuencia VH humana, VL humana, DH humana, JH humana, JL humana, y combinaciones de las mismas.

En una modalidad, la célula es una célula totipotencial, una célula pluripotencial, o una célula pluripotencial inducida. En una modalidad específica, la célula es una célula ES murina.

En un aspecto, se proporciona una célula B murina, en donde dicha célula comprende un gen de cadena pesada de inmunoglobulina rearreglado, en donde la célula B comprende en un cromosoma, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho. En una modalidad, la celula B murina comprende dos alelos de la secuencia de ácido nucleico.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, en un cromosoma de célula B) que es contigua al locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina rearreglado.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de célula B) que es distinta a la molécula de ácido nucleico que comprende el locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina rearreglado.

En una modalidad, la célula B murina comprende una secuencia génica variable de inmunoglobulina no murina rearreglada, ligada de manera operable a un gen de región constante de inmunoglobulina murina o humana, en donde la célula B comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, en un cromosoma de una célula B) que está ubicada en o dentro del locus génico más cercano con respecto a la secuencia génica variable de inmunoglobulina no humana rearreglada.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, el cromosoma de una célula B) que es contigua a la secuencia de región variable de inmunoglobulina no humana rearreglada.

En un aspecto, se proporciona una celula murina somática que comprende un cromosoma que contiene un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado, y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ADAM6 murina o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en el mismo cromosoma que el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina modificado. En una modalidad, el ácido nucleico está en un cromosoma diferente al del locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado. En una modalidad, la célula somática comprende una sola copia de la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad, la célula somática comprende al menos dos copias de la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad específica, la célula somática es una célula B. En una modalidad específica, la célula es una célula germinal. En una modalidad específica, la célula es una célula madre.

En un aspecto, se proporciona una célula germinal murina que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína ADAM6 murina (o una homologa u ortóloga o fragmento funcional de la misma) en un cromosoma de la célula germinal, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína ADAM6 murina (o una homologa u ortóloga o fragmento funcional de la misma), está en una posición en el cromosoma que es diferente de la posición en un cromosoma de una célula germinal de un ratón de tipo silvestre. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un locus de inmunoglobulina murina. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en el mismo cromosoma de la celula germinal que el locus de inmunoglobulina murina. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un cromosoma diferente de la célula germinal, que el locus de inmunoglobulina murina. En una modalidad, el locus de inmunoglobulina murina comprende un reemplazo de al menos una secuencia de inmunoglobulina murina por al menos una secuencia de inmunoglobulina no murina. En una modalidad específica, la al menos una secuencia de inmunoglobulina no murina es una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana es una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de dominio variable de anticuerpo producida en un animal no humano como el descrito en la presente.

En un aspecto, se proporciona un agente terapéutico humano que comprende un dominio variable de anticuerpo que contiene una secuencia derivada de un animal no humano como el aquí descrito.

En un aspecto, se proporciona un método para obtener una secuencia de región variable de anticuerpo proveniente de un animal no humano, en donde la secuencia de región variable de anticuerpo se deriva de un segmento VH1 -69 humano o un segmento VH1 -2 humano, en donde el método comprende: (a) inmunizar un animal no humano con un antígeno de interés, en donde el animal no humano comprende un reemplazo de al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos variables no humanos, por un solo segmento variable humano, en donde el único segmento variable humano es un segmento VH1 -69 ó un segmento VH1 -2, y en donde el animal no humano es sustancialmente incapaz de formar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que no se derive de un segmento VH1 -69 humano o un segmento VH1 -2 humano; (b) permitir que el animal no humano produzca una respuesta inmunitaria contra al antígeno de interes; y (c) identificar o aislar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano, en donde el anticuerpo se una al antígeno de interés.

En una modalidad, el único segmento variable humano es un segmento VH1 -69.

En una modalidad, la secuencia de región variable de anticuerpo se deriva de la SEQ ID NO: 37. En una modalidad, la secuencia de región variable de anticuerpo tiene al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 98% de identidad con la SEQ ID NO: 37. En una modalidad, la secuencia de región variable del anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 37.

En una modalidad, el único segmento variable humano es un segmento VH1 -2.

En una modalidad, la secuencia de región variable de anticuerpo se deriva de la SEQ ID NO: 63. En una modalidad, la secuencia de región variable de anticuerpo tiene al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 98% de identidad con la SEQ ID NO: 63. En una modalidad, la secuencia de región variable del anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 63.

En un aspecto, se proporciona un metodo para generar un repertorio de regiones variables de anticuerpo humano en un animal no humano, en donde las regiones variables de la cadena pesada humana del repertorio se derivan del mismo miembro de la familia génica VH y uno de una pluralidad de segmentos DH y uno de una pluralidad de segmentos JH, en donde el repertorio está caracterizado porque tiene secuencias FR1 (de marco estructural 1 ), CDR1 , FR2, CDR2, y FR3 de inmunoglobulina de un solo miembro de la familia génica VH- En una modalidad, el repertorio está caracterizado además porque tiene una pluralidad de diferentes secuencias CDR3 + FR4.

En una modalidad, la única familia génica VH se selecciona del grupo que consiste de la familia VH 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 7. En una modalidad específica, la única familia génica VH es la familia VH 1. En una modalidad, el único miembro de la familia génica VH se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2, VH1 -69, VH2-26, VH2-70 y VH3-23. En una modalidad específica, el único miembro de la familia génica VH es el VH1 -69.

En una modalidad, el repertorio comprende las secuencias FR1 , CDR1 , FR2, CDR2 y FR3 de la cadena pesada derivadas de un segmento VH1 -69. En una modalidad específica, el repertorio comprende las secuencias FR1 , CDR1 , FR2, CDR2 y FR3 de la cadena pesada, derivadas de la SEQ ID NO: 38. En una modalidad específica, el repertorio comprende las secuencias FR1 , CDR1 , FR2, CDR2 y FR3 de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 38.

En una modalidad, el repertorio comprende las secuencias FR1 , CDR1 , FR2, CDR2 y FR3 de la cadena pesada derivadas de un segmento VH1 -2. En una modalidad específica, el repertorio comprende las secuencias FR1 , CDR1 , FR2, CDR2 y FR3 de la cadena pesada, derivadas de la SEQ ID NO: 64. En una modalidad específica, el repertorio comprende las secuencias FR1 , CDR1 , FR2, CDR2 y FR3 de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.

En un aspecto, se proporciona un metodo para generar una pluralidad de diferentes secuencias CDR3 y FR4 en un animal no humano, que comprende exponer al animal no humano que contiene un locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina con un repertorio de segmentos VH restringido a un solo miembro de la familia de segmentos VH, a un antígeno de interés, permitiendo de esta manera que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria contra el antígeno, en donde la respuesta inmunitaria genera un repertorio de células B cuyos dominios variables de cadena pesada se derivan del único miembro de la familia de segmentos VH y que comprende una pluralidad de diferentes secuencias CDR3 y FR4.

En una modalidad, el único miembro de la familia de segmentos VH es humano. En una modalidad, el animal no humano se selecciona del grupo que consiste de un ratón, una rata y un conejo. En una modalidad, el antígeno de interes se selecciona del grupo que consiste de un ligando, un receptor, una proteína intracelular y una proteína secretada. En una modalidad, el antígeno de interés es un patógeno humano.

En un aspecto, se proporciona una secuencia nucleotídica que codifica para una región variable de inmunoglobulina producida en un animal no humano, de la manera aquí descrita.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o de cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo producido en un animal no humano como el aquí descrito.

En un aspecto, se proporciona una secuencia nucleotídica de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o de cadena ligera de inmunoglobulina que codifica para una región variable de un anticuerpo producido en un animal no humano como el aquí descrito.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento FAb, F(ab)2, scFv), producido en un animal no humano como el aquí descrito.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un animal no humano genéticamente modificado, que comprende reemplazar uno o más segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina en dirección 3’ (con respecto a la transcripción de los segmentos genicos de cadena pesada de inmunoglobulina) de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano, por uno o más segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y reemplazar uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina en dirección 3’ (con respecto a la transcripción de los segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina) del locus ADAM6 del animal no humano, por uno o más segmentos génicos de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana reemplazan a uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena en dirección 5’ de un locus ADAM6 endógeno del animal no humano, incluyendo los segmentos génicos V. En una modalidad, los segmentos génicos de inmunoglobulina humana que reemplazan al uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena en dirección 5’ del locus ADAM6 endógeno del animal no humano, incluyen los segmentos génicos V y D. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana que reemplazan al uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena en dirección 3’ del locus ADAM6 endógeno del animal no humano, incluye los segmentos génicos J. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana que reemplazan al uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena en dirección 3’ del locus ADAM6 endógeno del animal no humano, incluyen los segmentos génicos D y J. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana que reemplazan al uno o más segmentos genicos de inmunoglobulina endógena en dirección 3’ del locus ADAM6 endógeno del animal no humano, incluyen los segmentos V, D y J. En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos que reemplazan al uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena en dirección 3’ del locus ADAM6 endógeno del animal no humano, incluyen un solo segmento génico V, uno o más segmentos génicos D y uno o más segmentos génicos J.

En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina en dirección 5’ y/o en dirección 3’ del gen ADAM6, son reemplazados en una célula pluripotencial, pluripotencial inducida, o totipotencial, para formar una célula progenitora genéticamente modificada; en donde la célula progenitora genéticamente modificada es introducida en un huésped; y en donde el huésped que comprende la célula progenitora genéticamente modificada es gestado para formar un animal no humano que comprenda un genoma derivado de la célula progenitora genéticamente modificada. En una modalidad, el huésped es un embrión. En una modalidad específica, el huésped se selecciona del grupo que consiste de una premórula murina (por ejemplo, en una etapa de 8 ó 4 células), un embrión tetraploide, un agregado de células embrionarias, o un blastocisto.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano, en donde el animal no humano tiene un repertorio de células B que expresan dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina derivados de un solo miembro de la familia de segmentos V. En una modalidad, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, o al menos el 95% del repertorio de la celula B del dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano expresado en el repertorio de la célula B, se deriva del mismo miembro de la familia de segmentos V. En una modalidad específica, el porcentaje es de al menos el 90%. En una modalidad, el repertorio de la célula B consiste esencialmente de células B de sangre periférica. En una modalidad, el repertorio de células B consiste esencialmente de células B esplénicas. En una modalidad, el repertorio de células B consiste esencialmente de células B de médula ósea. En una modalidad, el repertorio de células B consiste esencialmente de células B periféricas, células B esplénicas, y células B de médula ósea.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, en donde más del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó más del 90% de las células B del animal no humano que expresa un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina derivado de un solo miembro de la familia de segmentos génicos VH. En una modalidad, al menos el 75% de las células B del animal no humano que expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina derivado de un solo miembro de la familia de segmentos genicos VH. En una modalidad específica, el porcentaje es de al menos 90%, En una modalidad, la totalidad de las células B que expresan un dominio de cadena pesada, éste se deriva del único miembro de la familia génica VH.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado que produce una población de células B específicas contra un antígeno, en respuesta a la inmunización con un antígeno de interés, en donde al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60, 70%, 80% o más del 90% de la población de células B específicas contra el antígeno, expresan cadenas pesadas de inmunoglobulina que se derivan en su totalidad del mismo segmento génico VH. En una modalidad, al menos el 75% de la población de células B específicas contra el antígeno, expresan cadenas pesadas de inmunoglobulina derivadas del mismo segmento génico VH- En una modalidad, la totalidad de las células B específicas contra el antígeno expresa una cadena pesada que se deriva del mismo segmento génico VH.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos génicos VH restringido, en donde la restricción es a un segmento génico humano VH1 -69 ó un segmento génico VH1 -69 que tiene al menos aproximadamente 75.5%, 76.5%, 86.7%, 87.8%, 94.9%, 96.9%, 98% ó 99% de identidad con un segmento génico VH1 -69*01 . En una modalidad específica, el repertorio restringido se selecciona del grupo que consiste de una o más de las variantes VH1-69 de la FIG. 7.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos genicos VH restringido, en donde la restricción es a un segmento génico humano VH1 -2 ó un segmento génico VH1 -2 que tenga al menos aproximadamente 94.9%, 95.9%, 96.9%, 98% ó 99% de identidad con un segmento génico VH1 -2. En una modalidad específica, el repertorio restringido se selecciona del grupo que consiste de una o más de las variantes de VH1 -2 de la FIG. 10.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende un repertorio de segmentos VH humanos restringido, que además comprende un locus de segmento variable de cadena ligera de inmunoglobulina humanizado, en donde la relación de cadenas ligeras l con respecto a las k expresada en el ratón, es aproximadamente la misma que en un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringido, caracterizado por la presencia de un solo segmento génico VH, uno o más segmentos génicos DH, y uno o más segmentos génicos JH, en donde el único segmento génico VH es un segmento génico VH polimórfico.

En una modalidad, el segmento génico VH polimórfico es un segmento génico VH humano que está asociado con un alto número de copias en poblaciones humanas. En una modalidad, el segmento genico VH humano se selecciona del grupo que consiste de segmentos VH1-2, VH1 -69, VH2-26, VH2-70, VH3-23, o variantes polimórficas de los mismos. En una modalidad específica, el segmento génico VH humano es un segmento génico VH1 -69. En otra modalidad específica, el segmento génico VH humano es un segmento génico VH1 -2.

En una modalidad, el único segmento génico VH está ligado de manera operable a un gen de región constante de inmunoglobulina humana, murina, o quimérica humana/murina. En una modalidad específica, el gen de región constante de inmunoglobulina es un gen de región constante murino. En una modalidad, el gen de región constante de inmunoglobulina comprende una secuencia humana que se selecciona del grupo que consiste de las regiones CH1 humana, región de bisagra humana, CH2 humana, CH3 humana, y combinaciones de las mismas. En una modalidad, el gen de cadena constante murina está en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

En una modalidad, el animal no humano además comprende un segmento génico VL de inmunoglobulina humana ligado de manera operable a un segmento génico J y a un gen constante de cadena ligera. En una modalidad específica, el segmento génico VL y/o el segmento génico J se seleccionan del grupo que consiste de segmentos génicos k humanos y segmentos génicos l humanos. En una modalidad, los segmentos génicos VL y/o J son segmentos génicos k humanos.

En varias modalidades, el animal no humano comprende la deleción de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos genicos VH endógenos.

En varias modalidades, el animal no humano comprende un locus génico endógeno variable de cadena pesada inactivado. En varias modalidades, el locus génico endógeno variable de cadena pesada inactivado no está ligado de manera operable a un gen endógeno de región constante de cadena pesada.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano en donde dicho animal no humano está caracterizado por la expresión de una inmunoglobulina sérica, en donde más del 80% de la inmunoglobulina sérica comprende un dominio variable de cadena pesada humano y un dominio variable de cadena ligera humana cognado, en donde el dominio variable de cadena pesada humano se deriva de un repertorio de segmentos génicos VH que consiste esencialmente de un solo segmento génico VH humano y/o variantes polimórficas del mismo.

En una modalidad, el único segmento génico VH humano es un segmento génico humano VH1 -69 y/o variantes polimórficas del mismo. En una modalidad, el único segmento génico VH humano es un segmento génico VH1 -2 humano y/o variantes polimórficas del mismo.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que comprende, en su línea germinal, un reemplazo en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos genicos VH endógenos, por un solo segmento génico VH humano y/o variantes polimórficas del mismo.

En una modalidad, el animal no humano además comprende un reemplazo, en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina, de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos VL endógenos, por uno o más segmentos génicos VL humanos. En una modalidad específica, el ratón además comprende uno o más segmentos génicos JL humanos ligados de manera operable a los segmentos génicos VL humanos.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que expresa un anticuerpo que comprende al menos un polipéptido de inmunoglobulina que tiene un dominio variable humano/dominio constante no humano, en donde el animal no humano expresa una proteína ADAM6 no humana o un ortólogo u homólogo de la misma a partir de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina es incapaz de rearreglarse para codificar una cadena pesada funcional de un anticuerpo.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano que expresa un anticuerpo que comprende al menos un polipéptido de inmunoglobulina con dominio variable humano/dominio constante no humano, en donde el animal no humano expresa una proteína ADAM6 no humana o un ortólogo u homólogo de la misma, a partir de un locus diferente del locus de una inmunoglobulina.

En una modalidad, la proteína ADAM6 ó un ortólogo u homólogo de la misma, se expresa en una celula B del animal no humano, en donde la célula B comprende una secuencia de ¡nmunoglobulina rearreglada que comprende una secuencia variable humana y una secuencia constante no humana.

En una modalidad, la secuencia constante no humana es una secuencia de roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona del grupo que consiste de un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un animal no humano macho infértil, que comprende tornar no funcional un alelo ADAM6 endógeno de una célula ES donadora (o noquear dicho alelo), introducir la célula ES donadora en un embrión huésped, gestar el embrión huésped en una madre sustituta, y permitir que la madre sustituta dé a luz a progenie derivada en su totalidad o en parte de la célula ES donadora. En una modalidad, el método además comprende aparear a la progenie para obtener un animal no humano macho infértil.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un animal no humano con una modificación genética de interés, en donde el animal no humano es infértil, en donde el método comprende los pasos de (a) producir una modificación genética de interés en un genoma; (b) modificar el genoma para noquear (knockout) al alelo ADAM6 endógeno, o para tornar no funcional al alelo ADAM6 endógeno; y (c) emplear el genoma para producir un animal no humano. En varias modalidades, el genoma proviene de una celula ES o se utiliza en un experimento de transferencia nuclear.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano producido utilizando un vector dirigido, una construcción nucleotídica o una célula, de la manera aquí descrita.

En un aspecto, se proporciona la progenie del apareamiento de un animal no humano como el aquí descrito, con un segundo animal no humano que es un animal no humano de tipo silvestre, o genéticamente modificado.

En un aspecto, se proporciona un método para mantener una cepa de un animal no humano, en donde la cepa del animal no humano comprende el reemplazo de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina no humana por una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogas. En una modalidad, la una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogas son secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina humanas.

En una modalidad, la cepa del animal no humano comprende la deleción de uno o más segmentos génicos VH, DH y/o JH no humanos. En una modalidad, el animal no humano además comprende un solo segmento génico VH humano, uno o más segmentos génicos DH humanos, y/o uno o más segmentos génicos JH humanos. En una modalidad, el animal no humano comprende un solo segmento génico VH humano, al menos 27 segmentos génicos DH, y al menos seis segmentos génicos JH. En una modalidad específica, el animal no humano comprende un solo segmento VH humano, 27 segmentos genicos DH, y seis segmentos génicos JH humanos, en donde dicho único segmento génico VH humano, los 27 segmentos génicos DH humanos y los seis segmentos génicos JH humanos, están ligados de manera operable a un gen de región constante. En una modalidad, el gen de región constante es un gen de región constante no humano. En una modalidad, el gen de región constante comprende una secuencia génica de región constante murina o de rata que se selecciona del grupo que consiste de las regiones CH1 , de bisagra, CH2 , CH3, y/o CH4, O combinaciones de las mismas. En varias modalidades, el único segmento génico VH humano es un segmento génico VH1 -69 ó VH1 -2 humano.

En una modalidad, el método comprende generar un animal no humano macho heterocigoto para el reemplazo de la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina no humana y aparear al animal no humano macho heterocigoto con un animal no humano hembra de tipo silvestre, o con un animal no humano hembra que sea homocigoto o heterocigoto para la secuencia de cadena pesada humana. En una modalidad, el método comprende mantener a la cepa del animal no humano mediante el apareamiento repetido de machos heterocigotos con hembras que sean de tipo silvestre o que sean homocigotas o heterocigotas para la secuencia de cadena pesada humana.

En una modalidad, el método comprende obtener células de los animales no humanos machos o hembras homocigotos o heterocigotos para la secuencia de cadena pesada humana, y emplear esas células como células donadoras o los núcleos de las mismas como núcleos donadores, y utilizar las celulas o los núcleos para producir animales no humanos genéticamente modificados, utilizando las células huésped y/o gestando las células y/o los núcleos en madres sustitutas.

En una modalidad, solamente animales no humanos macho que son heterocigotos para el reemplazo en el locus de cadena pesada, son apareados con animales no humanos hembra. En una modalidad específica, los animales no humanos hembra son homocigotos, heterocigotos, o de tipo silvestre con respecto al locus de cadena pesada reemplazado.

En una modalidad, los animales no humanos además comprenden el reemplazo de secuencias variables de cadena ligera l y/o k en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina, por secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina heterólogas. En una modalidad, las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina heterólogas son secuencias variables de cadena ligera l y/o k de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, el animal no humano además comprende un transgén en un locus diferente del locus endógeno de inmunoglobulina, en donde el transgén comprende una secuencia codificadora o rearreglada, o una secuencia de cadena ligera l ó k heteróloga no rearreglada (por ejemplo, una secuencia VL no rearreglada y JL no rearreglada, o VLJL rearreglada), ligada de manera operable (para las secuencias no rearregladas) o fusionada con (para las secuencias rearregladas) una secuencia de región gg constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera l ó k heteróloga es humana. En una modalidad, la secuencia de región constante se selecciona del grupo que consiste de una secuencia de roedor, humana y de un primate no humano. En una modalidad, la secuencia de región constante se selecciona del grupo que consiste de un ratón, una rata y un hámster. En una modalidad, el transgen comprende un promotor que no es de inmunoglobulina, que dirige la expresión de las secuencias de cadena ligera. En una modalidad específica, el promotor es un promotor transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el promotor es un promotor ROSA26.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un animal no humano genéticamente modificado, que comprende insertar una secuencia nucleotídica no humana que contiene un segmento génico de inmunoglobulina no humano en el genoma del animal, para una primera modificación, en donde la inserción mantiene un gen ADAM6 endógeno, después se torna no funcional al locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano, para una segunda modificación. En una modalidad, la primera modificación se realiza en dirección 5’ del gen de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, y la segunda modificación se realiza para invertir, traslocar, o poner fuera de ligamiento operable al locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, de tal modo que dicho locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina sea incapaz de rearreglarse para codificar una región variable de cadena pesada funcional.

En un aspecto, se proporciona un metodo para producir un animal no humano genéticamente modificado, que comprende reemplazar una secuencia nucleotídica no humana que comprende un segmento génico de inmunoglobulina no humano y una secuencia nucleotídica ADAM6 no humana (o una ortóloga u homóloga o un fragmento funcional de la misma, en un animal no humano macho), por una secuencia que comprende un segmento génico de inmunoglobulina humana, para formar un primer locus quimérico; después, se inserta una secuencia que comprende una secuencia codificadora de ADAM6 (o una secuencia codificadora de una ortóloga u homóloga o un fragmento funcional de la misma) en la secuencia, que comprende el segmento génico de inmunoglobulina humana, para formar un segundo locus quimérico.

En una modalidad, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico variable (VL) de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico VH humano o un segmento génico VL humano ligado de manera operable a un segmento génico DH y a un segmento génico JH humanos. En una modalidad específica adicional, el segundo locus quimérico está ligado de manera operable a un tercer locus quimérico, que comprende una secuencia CH1 humana, o una secuencia CH1 humana y una secuencia de bisagra humana, fusionada con una secuencia CH2 + CH3 murina.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón que comprende una secuencia nucleotídica ectópica que comprende un locus ADAM6 murino o una secuencia para producir un ratón macho fertil, en donde el uso comprende aparear al ratón que comprende la secuencia nucleotídica ectópica que comprende el locus o secuencia ADAM6 murina, con un ratón que carezca de un locus o una secuencia ADAM6 murina endógena funcional, y obtener una progenie que sea una hembra capaz de producir progenie que tenga el locus o secuencia ADAM6 ectópico o que sea un macho que comprenda el locus o secuencia ADA 6 ectópico, y que el macho exhiba una fertilidad que sea aproximadamente la misma que la fertilidad exhibida por un ratón macho de tipo silvestre.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como el descrito en la presente, para producir una secuencia nucleotídica de región variable de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como el que se describe en la presente, para producir un fragmento Fab completamente humano o un fragmento F(ab)2 completamente humano.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como el descrito en la presente, para producir una línea celular inmortalizada.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como el descrito en la presente para producir un hibridoma o un cuadroma.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como el aquí descrito, para producir una biblioteca en fagos que contenga regiones variables de cadena pesada humana y regiones variables de cadena ligera humana.

En una modalidad, las regiones variables de cadena pesada humana se derivan del segmento genico VH1 -69 humano que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 59.

En una modalidad, las regiones variables de cadena pesada humana se derivan de un segmento génico VH1 -69 humano que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 62.

En una modalidad, las regiones variables de cadena pesada humana, todas ellas se derivan de un segmento génico VH1 -2 humano que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 71.

En una modalidad, las regiones variables de cadena pesada humana se derivan de un segmento génico VH1 -2 humano que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 72.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como el aquí descrito, para generar una secuencia de región variable para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como el aquí descrito, con un antígeno de interés, (b) aislar un linfocito del ratón inmunizado del inciso (a), (c) exponer al linfocito a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de región variable del linfocito, generando de este modo una secuencia de región variable.

En una modalidad, el linfocito se deriva del bazo del ratón. En una modalidad, el linfocito se deriva de un ganglio linfático del ratón. En una modalidad, el linfocito se deriva de la médula ósea del ratón.

En una modalidad, el anticuerpo marcado es un anticuerpo conjugado con un fluoróforo. En una modalidad, el uno o más anticuerpos conjugados con un fluoróforo se seleccionan del grupo que consiste de IgM, IgG y/o combinaciones de los mismos.

En una modalidad, el linfocito es una célula B.

En una modalidad, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprende una secuencia de región variable de cadena pesada. En una modalidad, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera. En una modalidad específica, la secuencia de región variable de cadena ligera es una secuencia de región variable de cadena ligera k de inmunoglobulina. En una modalidad, la una o más secuencias de ácido nucleico de región variable comprenden una secuencia de cadena pesada y una secuencia de región variable de cadena ligera K.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como el descrito en la presente, para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y de cadena ligera k para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como el aquí descrito con un antígeno de interes, (b) aislar el bazo del ratón inmunizado del inciso (a), (c) exponer linfocitos B del bazo a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B del inciso (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B, generando de esta manera las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera K.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como el aquí descrito, para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y una secuencia de región variable de cadena ligera k para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como el aquí descrito con un antígeno de interés, (b) aislar uno o más ganglios linfáticos del ratón inmunizado del inciso (a), (c) exponer linfocitos B del uno o más ganglios linfáticos, a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B del inciso (c) que sea capaz de unirse al antigeno de interes, y (e) amplificar la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada y la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera k del linfocito B, generando de este modo secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera K.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como el aquí descrito, para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y una secuencia de región variable de cadena ligera para producir un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como el aquí descrito con un antígeno de interés, (b) aislar la médula ósea del ratón inmunizado del inciso (a), (c) exponer linfocitos B provenientes de la médula ósea, a uno o más anticuerpos marcados, (d) identificar un linfocito B del inciso (c) que sea capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada y la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera k del linfocito B, generando de esta manera secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera K. En varias modalidades, el uno o más anticuerpos marcados se seleccionan del grupo que consiste de IgM, IgG y/o combinaciones de los mismos.

En varias modalidades, el antígeno de interés es un patógeno que afecta a los seres humanos, incluyendo por ejemplo un antígeno viral. Algunos patógenos virales de ejemplo incluyen, por ejemplo, principalmente aquéllos de las familias Adenoviridae, Picornaviridae de bacterias, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae, y Togaviridae. Tales virus de ejemplo típicamente varían dentro de un rango de 20 a 300 nanómetros de longitud. En varias modalidades, el antígeno de interes es un antígeno viral que se selecciona del grupo que consiste de un virus de la hepatitis (por ejemplo, VHC, VHB, etc.), un virus de la inmunodeficiencia humana (V1H), o un virus de la influenza.

En varias modalidades, se proporciona el uso de un ratón como el aquí descrito, para generar una secuencia de región variable de cadena pesada y de cadena ligera K, para producir un anticuerpo humano, que además comprende fusionar las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera con secuencias de región constante de cadena pesada y de cadena ligera humanas, expresar las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera fusionadas en una célula, y recuperar las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera expresadas, generando de esta manera un anticuerpo humano.

En varias modalidades, las regiones constantes de cadena pesada humana se seleccionan del grupo que consiste de IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. En varias modalidades específicas, la IgG se selecciona del grupo que consiste de I g G 1 , lgG2, lgG3 e lgG4. En varias modalidades, la región constante de cadena pesada humana comprende una región CH1 , de bisagra, CH2, CH3, CH4, o combinaciones de las mismas. En varias modalidades, la región constante de cadena ligera es una región constante k de inmunoglobulina. En varias modalidades, la celula se selecciona del grupo que consiste de células HeLa, células DU145, células Lncap, células MCF-7, células MDA-MB-438, células PC3, células T47D, células THP-1 , células U87, células SHSY5Y (de neuroblastoma humano), células Saos-2, células Vero, células CHO, células GH3, células PC12, células retínales humanas (por ejemplo, una célula PER.C6™), y células MC3T3. En una modalidad específica, la célula es una célula CHO.

En un aspecto, se proporciona un método para generar un anticuerpo inverso-quimérico de roedor-humano contra un antígeno de interés, que comprende los pasos de inmunizar un ratón como el aquí descrito con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón que produzca un anticuerpo inverso-quimérico murino-humano específico contra el antígeno, cultivar al menos una célula productora del anticuerpo inverso-quimérico murino-humano específico contra el antígeno, y obtener dicho anticuerpo.

En una modalidad, el anticuerpo inverso-quimérico murino-humano comprende un dominio variable de cadena pesada humano fusionado con un gen de región constante de cadena pesada murina o de rata, y un dominio variable de cadena ligera humana fusionado con un gen de región constante de cadena ligera murino o de rata o humano. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada humano contiene un segmento génico VH1 -69 humano rearreglado o VH1 -2 humano rearreglado.

En una modalidad, el cultivo de al menos una célula productora del anticuerpo inverso-quimerico de roedor-humano específico contra el antígeno, se realiza en al menos una célula de hibridoma generada a partir de la al menos una célula aislada del ratón.

En un aspecto, se proporciona un método para generar un anticuerpo completamente humano específico contra un antígeno de interés, que comprende los pasos de inmunizar un ratón como el descrito en la presente con un antígeno, aislar al menos una célula del ratón productora de un anticuerpo inverso-quimérico de roedor-humano específico contra el antígeno, generar al menos una célula productora de un anticuerpo completamente humano derivado del anticuerpo inverso-quimérico de roedor-humano específico contra el antígeno, y cultivar al menos una célula productora del anticuerpo completamente humano, y obtener dicho anticuerpo completamente humano.

En varias modalidades, la al menos una célula aislada del ratón que produce un anticuerpo inverso-quimérico de roedor-humano específico contra el antígeno, es un esplenocito o una célula B.

En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En varias modalidades, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene un segmento génico VH1 -69 humano rearreglado o un segmento génico VH1 -2 humano rearreglado.

En varias modalidades, la inmunización con el antígeno de interés se lleva a cabo con una proteína, con ADN, con una combinación de ADN y una proteína, o con celulas que expresan el antígeno.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como el aquí descrito, para producir una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región variable de inmunoglobulina o un fragmento de la misma. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se utiliza para producir un anticuerpo humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En una modalidad, el ratón se utiliza para preparar una proteína de unión al antígeno que se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), un fragmento scFv, un fragmento scFv biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, una DVD (es decir, proteína de unión al antígeno de dominio variable dual), una SVD (es decir, una proteína de unión al antígeno de un solo dominio variable), o un captador biespecífico de células T (BiTE).

En un aspecto, se proporciona un método para producir una proteína de unión al antígeno humana, que comprende exponer a un animal no humano manipulado por ingeniería genética como el descrito en la presente, a un antígeno de interés, permitir que el animal no humano monte una respuesta inmunitaria contra el antígeno, obtener a partir del animal no humano una secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada que codifique para un dominio variable de cadena pesada humana que se una específicamente al antígeno de interés, fusionar la secuencia de ácido nucleico de dominio variable de cadena pesada con una secuencia de región constante humana, y expresar en una celula de mamífero un anticuerpo que comprenda la secuencia de dominio variable de cadena pesada humana y la secuencia de región constante humana. En una modalidad, la célula de mamífero es una célula CHO. En una modalidad, el animal no humano comprende un repertorio de segmentos génicos VH humanos que consiste esencialmente de un solo segmento génico VH humano, opcionalmente presente en dos o más variantes polimórficas del mismo, ligado de manera operable a uno o más segmentos génicos D y/o J humanos. En una modalidad, el repertorio de segmentos génicos VH humanos está en un locus endógeno de segmentos génicos VH no humanos. En una modalidad, el repertorio de segmentos génicos VH humanos está en un locus que no es un locus de segmentos génicos VH endógeno. En una modalidad, el segmento génico VH humano se rearregla con un segmento génico D humano y con un segmento génico J humano, para formar un gen VDJ humano rearreglado ligado de manera operable a una secuencia de región constante, en donde la secuencia de región constante se selecciona del grupo que consiste de una secuencia humana y una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia murina o de rata o de hámster). En una modalidad, la secuencia de región constante comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de una región CH1 , una región de bisagra, una región CH2, una región CH3, y combinaciones de las mismas; en una modalidad específica, la secuencia de región constante comprende una región CH1 , una región de bisagra, una región CH2, y una región CH3. En una modalidad, el dominio variable humano y la secuencia constante son expresados en la celula de mamífero con un dominio variable de cadena ligera humana cognado, obtenido del mismo ratón (por ejemplo, una secuencia obtenida a partir de la misma célula 6 que la secuencia de dominio variable humana); en una modalidad, la secuencia codificadora del dominio variable de cadena ligera humana obtenida del ratón, posteriormente es fusionada con una secuencia codificadora de una región constante de cadena ligera humana, y la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada son expresadas en la célula de mamífero.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, que se une a un antígeno de interés, que comprende expresar en una sola célula: (a) una primera secuencia VH de un animal no humano inmunizado como se describe aquí, en donde la primera secuencia VH está fusionada con una secuencia génica CH; y (b) una secuencia génica VL de un animal no humano inmunizado como se describe en la presente, en donde la secuencia génica VL está fusionada con una secuencia génica CL humana; mantener la célula bajo condiciones suficientes para expresar un anticuerpo; y aislar el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo. En una modalidad, la secuencia génica VL es cognada con la primera secuencia VH.

En una modalidad, la célula comprende una segunda secuencia genica VH de un animal no humano inmunizado como se describe en la presente, en donde la segunda secuencia génica VH está fusionada con una secuencia génica CH, en donde la primera secuencia génica VH codifica para un dominio VH que se une específicamente a un primer epítopo, y la segunda secuencia génica VH codifica para un dominio VH que se une específicamente a un segundo epítopo, en donde el primer epítopo y el segundo epítopo no son idénticos.

En una modalidad, las secuencias de región constante en su totalidad son secuencias de región constante humanas.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico humano, que comprende producir el anticuerpo biespecífico utilizando secuencias génicas de región variable humanas de células B de un animal no humano tal como el que se describe en la presente.

En una modalidad, el método comprende (a) identificar un linfocito clonalmente seleccionado del animal no humano, en donde el animal no humano ha sido expuesto a un antígeno de interés y se le ha permitido desarrollar una respuesta inmunitaria contra dicho antígeno de interés, y en donde el linfocito expresa un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés, (b) obtener del linfocito o del anticuerpo, una secuencia nucleotídica que codifique para una región variable de cadena pesada humana que se una específicamente al antígeno de interés y (c) empleando la secuencia nucleotídica que codifica para la región variable de cadena pesada humana que se une específicamente al antígeno de interés, preparar un anticuerpo biespecífico. En una modalidad específica, la región variable de cadena pesada humana comprende un segmento genico VH 1 -2 Ó VH1 -69 rearreglado.

En una modalidad, se llevan a cabo los pasos de los incisos (a) al (c) una primera vez para un primer antígeno de interés, para generar una primera secuencia de región variable de cadena pesada humana, y se llevan a cabo los pasos de los incisos (a) al (c) una segunda vez, para un segundo antígeno de interés, para generar una segunda secuencia de región variable de cadena pesada humana, y en donde la primera secuencia de región variable de cadena pesada humana se expresa fusionada con una primera región constante de cadena pesada humana, para formar una primera cadena pesada humana; la segunda secuencia de región variable de cadena pesada humana se expresa fusionada con una segunda región constante de cadena pesada humana, para formar una segunda cadena pesada humana, en donde las primera y segunda cadenas pesadas humanas son expresadas en presencia de una sola cadena ligera humana expresada a partir de un segmento génico VK1 -39 humano o un segmento génico VK3-20 humano rearreglado. En una modalidad específica, la única cadena ligera humana comprende una secuencia de línea germinal.

En una modalidad, el método comprende (a) clonar las regiones variables de cadena pesada de las células B de un animal no humano tal como se describe en el presente documento que se ha expuesto a un primer antígeno de interés, y del mismo animal no humano, o de un diferente animal no humano que sea geneticamente igual y se haya expuesto a un segundo antígeno de interés; y (b) expresar en una célula las regiones variables de cadena pesada de (a) con la misma región constante de cadena pesada y la misma cadena ligera para generar un anticuerpo biespecífico.

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano tal como se describe en el presente documento, para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada humano. En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2 y de VH1 -69.

En un aspecto, se proporciona un uso de un animal no humano tal como se describe en el presente documento, para obtener una célula que codifica un dominio variable de cadena pesada humano. En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2 y de VH1 -69.

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano tal como se describe en el presente documento para generar un dominio variable de anticuerpo humano. En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano tal como se describe en el presente documento para generar un anticuerpo humano. En una modalidad, el anticuerpo humano es un anticuerpo biespecífico humano. En varías modalidades, el dominio variable y/o el anticuerpo comprenden un segmento genico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2 y de VH1 -69.

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano tal como se describe en el presente documento para seleccionar un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humano. En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2 y de VH1 -69.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón tal como se describe en el presente documento para introducir una secuencia ectópica de gen ADAM6 en un ratón que carece de una secuencia endógena funcional del gen ADAM6 murino, donde el uso comprende el apareamiento de un ratón tal como se describe en el presente documento con un ratón que carece de la secuencia endógena funcional del gen ADAM6 murino.

En un aspecto, se proporciona el uso del material genético de un ratón tal como se describe en el presente documento, para generar un ratón que tiene una secuencia ectópica del gen ADAM6. En una modalidad, el uso comprende la transferencia nuclear usando un núcleo de una célula de un ratón tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, el uso comprende clonar una célula de un ratón tal como se describe en el presente documento, para producir un animal derivado de la célula. En una modalidad, el uso comprende el empleo de espermatozoides o de un óvulo de un ratón tal como se describe en el presente documento, en un proceso para generar un ratón que comprenda la secuencia ectópica del gen ADAM6.

En un aspecto, se proporciona un metodo para generar un ratón macho fértil que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado, en donde el método que comprende fertilizar una primera célula germinal del ratón que comprende una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, con una segunda célula germinal del ratón que comprende un gen ADAM6 o un ortólogo o un homólogo o un fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho; formar una célula fertilizada; permitir que la célula fertilizada se convierta en un embrión; y, gestar el embrión en un sustituto para obtener un ratón.

En una modalidad, la fertilización se logra mediante el apareamiento de un ratón macho y un ratón hembra. En una modalidad, el ratón hembra comprende el gen ADAM6 o el ortólogo o el homólogo o el fragmento del mismo. En una modalidad, el ratón macho comprende el gen ADAM6 o el ortólogo o el homólogo o el fragmento del mismo.

En un aspecto, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de ADAM6 murino o un ortólogo o un homólogo de la misma o un fragmento funcional de la proteína de ADAM6 correspondiente para restaurar o mejorar la fertilidad de un ratón que tiene un genoma que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, donde la modificación reduce o elimina la función de ADAM6 endógeno.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma murino en una posición ectópica. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma murino en un locus endógeno de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el locus endógeno de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma murino en una posición distinta de un locus endógeno de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona el uso del ratón tal como se describe en el presente documento, para la fabricación de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión al antígeno) o para la fabricación de una secuencia que codifica una secuencia variable de un medicamento (por ejemplo, una proteína de unión al antígeno), para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno humano. En una modalidad, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento genico VH humano polimórfico. En una modalidad, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico VH1 -69 humano. En una modalidad, la secuencia variable de un medicamento comprende un segmento génico VH1 -2 humano.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina producido en un ratón tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento genico VH humano que se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2, de VH1-69, de VH2-26, de VH2-70, o de VH3-23. En otra modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH1 -2 humano. En otra modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH1 -69 humano.

En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En una modalidad específica, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que está cognado con un dominio variable de cadena pesada humano que comprende un segmento génico VH1 -69 rearreglado. En una modalidad específica, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que está cognado con un dominio variable de cadena pesada humano que comprende un segmento génico VH1 -2 humano rearreglado.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón tal como se describe en el presente documento para generar una construcción de ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina humano. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera k que comprende un segmento génico VK humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VK4-1 , VK5-2 , VK7-3, VK2-4, VK1 -5, VK1 -6, VK3-7 , VK1 -8, VK1 -9, VK2-10, VK3-1 1 , VK1 -12, VK1 -1 3, VK2-14, VK3- 15, VK1 -16, VK1 -17, VK2-18, VK2-19, VK3-20, VK6-21 , VK1 -22 , VK1 -23, VK2-24, VK3-25, VK2-26, VK1-27, VK2-28, VK2-29, VK2-30, VK3-31, VK1-32, VK1 -33, VK3-34, VK1-35, VK2-36, VK1-37, VK2-38, VK1-39, y VK2-40.

En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento genico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH1-2, de VH1-69, de VH2-26, de VH2-70, o de VH3-23. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH1-69 humano rearreglado. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH1-2 humano rearreglado.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón tal como se describe en el presente documento para generar un dominio variable de inmunoglobulina humano. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera. En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera k es un dominio variable que comprende un segmento génico VK humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VK4-1, VK5-2, VK7-3, VK2-4, VK1 -5, VK1 -6, VK3-7, VK1-8, VK1-9, VK2-10, VK3-11, VK1-12, VK1-13, VK2-14, VK3-15, VK1-16, VK1-17, VK2-18, VK2-19, VK3-20, VK6-21, VK1 -22, VK1 -23, VK2-24, VK3-25, VK2-26, VK1-27, VK2-28, VK2-29, VK2-30, VK3-31 , VK1-32, VK1-33, VK3-34, VK1-35, VK2-36, VK1-37, VK2-38, VK1-39 y VK2-4.

En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento genico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, O VH3-23. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH1 -69 humano rearreglado. En una modalidad específica, el dominio variable de cadena pesada comprende un segmento génico VH 1 -2 humano rearreglado.

Varios aspectos y modalidades son capaces de usarse juntos, a menos que se indique expresamente lo contrario o el contexto prohíba claramente el uso conjunto.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento e ingeniería molecular empleadas para generar un vector dirigido para la construcción de un locus de cadena pesada modificado que contiene un solo segmento génico VH1 -69 humano, veintisiete segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos, en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La figura 2 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento e ingeniería molecular empleadas para generar un vector dirigido para la construcción de un locus de cadena pesada modificado que contiene un solo segmento génico VH1 -2 humano, veintisiete segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos, en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La figura 3 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento e ingeniería molecular empleadas para generar un vector dirigido para la construcción de un locus de cadena pesada modificado que contiene a un solo segmento genico VH1 -69 humano, veintisiete segmentos génicos DH humanos, seis segmentos génicos JH humanos y un fragmento genómico ectópico que codifica la proteína ADAM6 murina en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La figura 4 muestra una ilustración general, no a escala, de una serie de etapas de direccionamiento e ingeniería molecular empleadas para generar un vector dirigido para la construcción de un locus de cadena pesada modificado que contiene un solo segmento génico VH1 -2 humano, veintisiete segmentos génicos DH humanos, seis segmentos génicos JH humanos y un fragmento genómico ectópico que codifica la proteína ADAM6 murina en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

La figura 5 muestra la alineación de nucleótidos del segundo exón para cada uno de los trece alelos reportados para el gen VH1 -69 humano. Las bases que están en letra minúscula indican las diferencias de nucleótido de línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) se indican con los recuadros alrededor de la secuencia. Las líneas discontinuas indican los huecos artificiales para la alineación apropiada de la secuencia. VH1 -69*01 (SEQ ID NO: 37); VH1 -69*02 (SEQ ID NO: 39); VH1 -69*03 (SEQ ID NO: 41 ); VH1-69*04 (SEQ ID NO: 43); VH1 -69*05 (SEQ ID NO: 45); VH1 -69*06 (SEQ ID NO: 47); VH1 -69*07 (SEQ ID NO: 49); VH1 -69*08 (SEQ ID NO: 51 ); VH1 -69*09 (SEQ ID NO: 53); VH1 -69*10 (SEQ ID NO: 55); VH1 -69*1 1 (SEQ ID NO: 57); VH1 -69*12 (SEQ ID NO: 59); VH1 -69*13 (SEQ ID NO: 61 ).

La figura 6 muestra la alineación de proteína de la secuencia genica variable de cadena pesada madura para cada uno de los trece alelos reportados para el gen VH1 -69 humano. Los aminoácidos en letra minúscula indican las diferencias de línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) se indican con los recuadros alrededor de la secuencia. Las líneas discontinuas indican los huecos artificiales para la alineación de secuencia apropiada. VH1 -69*01 (SEQ ID NO: 38); VH1 -69*02 (SEQ ID NO: 40); VH1 -69*03 (SEQ ID NO: 42); VH1 -69*04 (SEQ ID NO: 44); VH1 -69*05 (SEQ ID NO: 46); VH1 -69*06 (SEQ ID NO: 48); VH1 -69*07 (SEQ ID NO: 50); VH1 -69*08 (SEQ ID NO: 52); VH1 -69*09 (SEQ ID NO: 54); VH1 -69*10 (SEQ ID NO: 56); VH1 -69*1 1 (SEQ ID NO: 58); VH1 -69*12 (SEQ ID NO: 60); VH1 -69*1 3 (SEQ ID NO: 62).

La figura 7 muestra una matriz de porcentaje de identidad/similitud para las secuencias de proteína alineadas del gene variable maduro para cada uno de los trece alelos reportados para el gen VH1 -69 humano. El porcentaje de identidad entre los alelos de VH1-69 se indica sobre los recuadros sombreados y porcentaje de similitud se indica debajo de los recuadros sombreados. Los valores de porcentaje de identidad y porcentaje de similitud se determinaron por medio de una herramienta de alineación ClustalW (v1.83) usando el software MacVector (MacVector, Inc., North Carolina).

La figura 8 muestra la alineación de nucleótido del segundo exón para cada uno de los cinco alelos reportados para el gen VH1 -2 humano. Las bases que están en letra minúscula indican las diferencias de nucleótido de línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles) se indican con los recuadros alrededor de la secuencia. Las líneas discontinuas indican los huecos artificiales para la alineación de secuencia apropiada. VH1 -2*01 (SEQ ID NO: 63); VH1 -2*02 (SEQ ID NO: 65); VH1 -2*03 (SEQ ID NO: 67); VH1 -2*04 (SEQ ID NO: 69); VH1 -2*05 (SEQ ID NO: 71 ).

La figura 9 muestra la alineación de proteína de la secuencia génica variable de cadena pesada madura para cada uno de los cinco alelos reportados para el gen VH1 -2 humano. Los aminoácidos que están letra minúscula indican las diferencias de línea germinal entre los alelos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) se indican con los recuadros alrededor de la secuencia. Las líneas discontinuas indican los huecos artificiales para la alineación de secuencia apropiada. VH1 -2*01 (SEQ ID NO: 64); VH1 -2*02 (SEQ ID NO: 66); VH1 -2*03 (SEQ ID NO: 68); VH1 -2*04 (SEQ ID NO: 70); VH1 -2*05 (SEQ ID NO: 72).

La figura 10 muestra un porcentaje de identidad/similitud para las secuencias de proteína alineadas del gene variable maduro para cada uno de los cinco alelos reportados para el gen VH1 -2 humano. El porcentaje de identidad entre los alelos de VH1 -2 se indica sobre los recuadros sombreados y el porcentaje de similitud se indica debajo de los recuadros sombreados. Los conteos para el porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud se contaron por medio de una herramienta de alineación CiustalW (v1 .83) usando el software MacVector (MacVector, Inc., North Carolina).

Descripción Detallada de la Invención Esta invención no se limita a los metodos particulares, y a las condiciones experimentales descritas, puesto que tales métodos y condiciones pueden variar. Debe también entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene la finalidad de describir las modalidades particulares solamente, y no se propone como una limitante, puesto que el alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos y frases usados en el presente documento incluyen los significados que los términos y las frases han obtenido en la téenica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el cual se usa el término o la frase. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento puede usarse en la práctica o la prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y los materiales particulares.

La frase “sustancial” o “sustancialmente” cuando se usa para referirse a una cantidad de segmentos genicos (por ejemplo, “sustancialmente todos” los segmentos génicos V) incluye los segmentos génicos funcionales y no funcionales e incluye, en varias modalidades, por ejemplo, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más de todos los segmentos génicos; en varias modalidades, “sustancialmente todos” los segmentos génicos incluye, por ejemplo, por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de los segmentos génicos funcionales (es decir, no pseudogénicos).

El término “reemplazo” incluye donde una secuencia de ADN se coloca en un genoma de una célula con el fin de reemplazar una secuencia dentro del genoma por una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia humana en un ratón), en el locus de la secuencia genómica. La secuencia de ADN colocada de tal manera puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte del ADN de fuente usado para obtener la secuencia colocada de tal manera (por ejemplo, promotores, intensificadores, regiones sin traducir 5’ o 3’, secuencias de señal de recombinación apropiadas, etcétera). Por ejemplo, en varias modalidades, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena por una secuencia heteróloga que da lugar a la producción de un producto génico de la secuencia de ADN colocada de tal manera (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una función similar como proteína codificada por la secuencia genómica endógena (por ejemplo, la secuencia endógena genómica codifica un gen o un dominio de inmunoglobulina, y el fragmento de ADN codifica uno o más genes o dominios de inmunoglobulina humanos). En varias modalidades, un gen endógeno o fragmento del mismo se sustituye por un gen humano correspondiente o un fragmento del mismo. Un gen humano correspondiente o un fragmento del mismo es un gen humano o un fragmento del mismo que es un ortólogo de, un homólogo de, o es sustancialmente identico o igual en estructura y/o función, como el gen endógeno o fragmento del mismo que se sustituye.

El ratón como modelo genético se ha mejorado ampliamente por medio de las teenologías transgénicas y de noqueo (knockout), que han permitido el estudio de los efectos de la sobreexpresión dirigida o de la deleción de los genes específicos. A pesar de todas sus ventajas, el ratón todavía presenta los obstáculos genéticos que lo hacen un modelo imperfecto para las enfermedades humanas y una plataforma imperfecta para probar los terapéuticos humanos o para producirlos. Primero, aunque aproximadamente 99% de genes humanos tengan un homólogo murino (Waterston et al. 2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 420:520-562), los terapéuticos potenciales a menudo no pueden reaccionar de manera cruzada, o son inadecuado para la reacción cruzada, con los ortólogos murinos de los objetivos humanos previstos. Para evitar este problema, los genes objeto seleccionados pueden “humanizarse”, es decir, el gen murino puede eliminarse y reemplazarse por la secuencia genica ortóloga humana correspondiente (por ejemplo, US 6,586,251 , US 6,596,541 y US 7,105,348). Inicialmente, los esfuerzos para humanizar los genes murinos por una estrategia de “noqueo (knockout) más humanización trangénica” requirió aparear un ratón portador de una deleción (es decir, noqueo (knockout)) del gene endógeno con un ratón portador de un transgén humano aleatoriamente integrado (consultar, por ejemplo, Bril et al. , 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341 -347; Homanics et al., 2006, Production and characterization of murine models of classic and intermedíate maple syrup uriñe disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al., 2006, A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al., 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the detective preTCR function in CD3gamma-and CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunot 43:1741 -1750). Pero esos esfuerzos fueron obstaculizados por las limitaciones de tamaño; las teenologías de noqueo (knockout) convencionales no fueron suficientes para reemplazar directamente los genes murinos grandes por sus contrapartes genómicas humanas grandes. Un método de reemplazo homólogo directo, en el cual un gen endógeno murino es reemplazado directamente por el gen de contraparte humano en la misma ubicación genetica exacta del gen murino (es decir, en el locus endógeno murino), se intenta raramente debido a las dificultades téenicas. Hasta ahora, los esfuerzos en el reemplazo directo implicaron los procedimientos elaborados y complicados, limitando así la longitud del material genético que podría tratarse y la precisión con la cual podría manipularse.

Los transgenes de inmunoglobulina humanos exógenamente introducidos se reordenan en las células B precursoras en los ratones (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1 :231 -236). Este hallazgo fue aprovechado al modificar los ratones usando el método de noqueo (knockout) más transgénico para expresar los anticuerpos humanos (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21 ; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25: 1134-1143). Los loci de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina murinos se desactivaron en estos ratones por la deleción dirigida de las porciones pequeñas pero críticas de cada locus endógeno, seguida por la introducción de los loci génicos de inmunoglobulina humanos como los transgenes grandes aleatoriamente integrados, tal como se describió anteriormente, o minicromosomas (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS EE.UU. 97:722-727). Tales ratones representaron un avance importante en la ingeniería genetica; los anticuerpos monoclonales completamente humanos aislados de ellos produjeron el potencial terapéutico prometedor para tratar una variedad de enfermedades humanas (Gibson et al., 2006, Randomized phase I II trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cáncer, Clin Colorectal Cáncer 6:29-31 ; Jakobovits et al., 2007; Kim at al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase I I studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(1 1 ):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animáis, Nat Biotechnol 23:1 1 17-1 125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic I lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase l/ll study, Ann Surg Oncot 12: 1005-1016; McCIung etal., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl Med 354:821 -831 ). Pero, según lo discutido anteriormente, estos ratones exhibieron el desarrollo de célula B comprometido y las deficiencias inmunológicas cuando se compararon con los ratones de tipo silvestre. Tales problemas limitan potencialmente la capacidad de los ratones de soportar una respuesta humoral vigorosa y, por lo tanto, de generar los anticuerpos completamente humanos contra algunos antígenos. Las deficiencias pueden ser debido a la funcionalidad ineficaz debido a la introducción aleatoria de los transgenes de inmunoglobulina humanos y a la expresión incorrecta resultante debido a una carencia de los elementos de control hacia 5’ y hacia 3’ (Garrett et al., 2005, Chromatin architecture near a potential 3' end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mot Cell Biol 25: 1511 -1525; Manís et al., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory región, Mol. Immunol 39:753-760; Pawlitzky at al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking región of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1 , Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851 ), las interacciones interespecies ineficaces entre los dominios constantes humanos y los componentes murinos del complejo de señalización del receptor de celula B en la superficie celular, que puede deteriorar los procesos de señalización requeridos para la maduración, la proliferación, y la supervivencia normal de las células B (Hombach at al., 1990, Molecular componente of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762), y las interacciones interespecies ineficaces entre las ¡nmunoglobulinas humanas y los receptores Fe murinos que pudieron reducir la selección de afinidad (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fe receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) y las concentraciones sericas de inmunoglobulina (Brambell at al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203: 1352-1354; Junghans and Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS EE UU. 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J immunol 64: 177-184; Nimmerjahn and Ravetch, 2007, Fc-receptors as regulators of ¡mmunity, Adv Immunot 96: 179-204). Estas deficiencias pueden corregirse por la humanización in situ de solamente las regiones variables de los loci de inmunoglobulina murinos dentro de sus ubicaciones naturales en los loci endógenos de cadena pesada y ligera. Esto daría lugar con eficacia a los ratones que producen los anticuerpos “quiméricos invertidos” (es decir, V humano:C murino) que serían capaces de las interacciones y la selección normal con el ambiente murino con base en la retención de las regiones constantes murinas. Adoptando este método, una versión particular de un locus humanizado puede construirse con base en la complejidad del locus quimérico que se desea. Además, tales anticuerpos quiméricos invertidos pueden cambiar de formato fácilmente en los anticuerpos completamente humanos para los propósitos terapéuticos.

Los animales manipulados por ingeniería genética que comprenden una inserción o un reemplazo en el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina con las secuencias de inmunoglobulina heterólogas (por ejemplo, de otra especie) pueden realizarse en combinación con las inserciones o los reemplazos en los loci endógenos de cadena ligera de inmunoglobulina o en combinación con los transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina quimericos o completamente humanos-completamente murinos, etcétera). Las especies de las cuales se derivan las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogas pueden variar ampliamente; como con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina empleadas en los reemplazos de la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina o de los transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina. Las secuencias heterólogas de cadena pesada de inmunoglobulina ejemplares incluyen las secuencias humanas.

Las secuencias de ácido nucleico de región variable de inmunoglobulina, por ejemplo, los segmentos V, D, y/o J, están en varias modalidades obtenidas de un humano o de un animal no humano. Los animales no humanos convenientes para proporcionar los segmentos V, D, y/o J incluyen, por ejemplo, peces vertebrados, peces cartilaginosos como tiburones y mantarrayas, anfibios, reptiles, mamíferos, aves (por ejemplo, pollos). Los animales no humanos incluyen, por ejemplo, mamíferos. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, primates no humanos, las cabras, ovejas, cerdos, perros, bovinos (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervos, camellos, hurones y roedores y primates no humanos (por ejemplo, chimpancés, orangutanes, gorilas, mono tití, macacos de la India, babumos). Los animales no humanos convenientes se seleccionan de la familia de roedores que incluye ratas, ratones, y hámsteres. En una modalidad, los animales no humanos son ratones. Tal como se indica claramente en el contexto, varios animales no humanos pueden usarse como fuentes de dominios variables o de segmentos genicos de región variable (por ejemplo, tiburones, mantarrayas, mamíferos, por ejemplo, camellos, roedores como ratones y ratas).

De acuerdo con el contexto, los animales no humanos también se usan como fuentes de secuencias de región constante que se usarán con respecto a las secuencias variables o los segmentos, por ejemplo, las secuencias constantes de roedor pueden usarse en transgenes ligados de manera operable a las secuencias variables humanas o no humanas (por ejemplo, las secuencias variables humanas o de primate no humano ligada de manera operable a, por ejemplo, las secuencias constantes de roedor, por ejemplo, ratón o rata o hámster). Así, en varias modalidades, los segmentos V, D, y/o J humanos están ligados de manera operable a las secuencias génicas de región constante de roedor(por ejemplo, ratón o rata o hámster). En algunas modalidades, los segmentos V, D, y/o J humanos (o uno o más genes VDJ o VJ rearreglados) están ligados de manera operable o fusionados a una secuencia génica de región constante de ratón, rata, o hámster en, por ejemplo, un transgén integrado en un locus que no es un locus endógeno de inmunoglobulina.

En una modalidad específica, se proporciona un ratón que comprende un reemplazo de los segmentos genicos VH, DH, y JH en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina con un solo segmento VH humano, uno o más DH, y uno o más JH, donde un solo segmento VH humano, uno o más DH, y uno o más JH están ligados de manera operable a un gen endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina; donde el ratón comprende un transgén en un locus distinto de un locus endógeno de inmunoglobulina, donde el transgén comprende un segmento génico VL humano no rearreglado o rearreglado y un segmento génico JL humano ligados de manera operable a una región constante de ratón o de rata o de humano. En varias modalidades, un solo segmento génico VH humano es un segmento génico polimórfico. En una modalidad, un solo segmento génico VH humano es un segmento génico VH1 -69 humano o un segmento génico VH1 -2 humano.

Se describe un método para un reemplazo genético in situ del locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal murino con un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humano restringido y el reemplazo de los loci génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de linea germinal murinos con los loci génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina de línea germinal humanos, mientras se mantiene la capacidad de los ratones de generar descendientes. Específicamente, se describe el reemplazo exacto de seis megabases de tanto los loci génicos variables de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera k murinos con las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera k de inmunoglobulina humanas, mientras deja las regiones constantes murinas intactas. Consecuentemente, se han creado los ratones que tienen un reemplazo exacto de su repertorio variable de inmunoglobulina de línea germinal completo con las secuencias variables de inmunoglobulina de línea germinal humanas, mientras se mantienen las regiones constantes murinas. Las regiones variables humanas se ligan a las regiones constantes murinas para formar los loci de inmunoglobulina de humano-ratón quimericos que se reordenan y se expresan a los niveles fisiológicamente apropiados. Los anticuerpos expresados son “quimeras invertidas”, es decir, comprenden las secuencias de región variable humanas y las secuencias de región constante murinas.

Los ratones manipulados por ingeniería genética descritos en el presente documento exhiben un sistema inmunológico humoral completamente funcional y proporcionan una fuente abundante de secuencias de región variable de inmunoglobulina humanas naturalmente maduradas por afinidad para generar los anticuerpos farmacéuticamente aceptables y otras proteínas de unión al antígeno que son eficaces para combatir los antígenos patógenos, por ejemplo, antígenos virales.

La ingeniería de las secuencias de inmunoglobulina humanas en el genoma de un ratón, incluso en las ubicaciones exactas, por ejemplo, en los loci endógenos de inmunoglobulina murinos, puede presentar ciertos desafíos debido a la evolución divergente de los loci de inmunoglobulina entre el ratón y el humano. Por ejemplo, las secuencias intergenicas entremezcladas dentro de los loci de inmunoglobulina no son idénticas entre los ratones y los humanos y, en algunas circunstancias, pueden no ser funcionalmente equivalentes. Las diferencias entre los ratones y los humanos en sus loci de inmunoglobulina pueden aún dar lugar a anormalidades en ratones humanizados, particularmente al humanizar o manipular ciertas porciones de los loci endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina murinos. Algunas modificaciones en los loci de cadena pesada de inmunoglobulina murinos son dañinas. Las modificaciones dañinas pueden incluir, por ejemplo, pérdida de capacidad de los ratones modificados de aparearse y de producir descendientes. En varias modalidades, la alteración de las secuencias de inmunoglobulina humanas en el genoma de un ratón incluye los métodos que mantienen las secuencias endógenas que cuando están ausentes en las cepas murinas modificadas son dañinas. Los efectos dañinos ejemplares pueden incluir las inhabilidad de propagar las cepas modificadas, la pérdida de función de genes esenciales, la inhabilidad de expresar los polipéptidos, etcétera. Tales efectos dañinos pueden relacionarse de manera directa o indirecta con la modificación creada en el genoma murino.

A pesar de la función inmunológica humoral aproximada a la natural observada en los ratones con los loci de inmunoglobulina humanizados, existen otros desafíos encontrados al emplear un reemplazo directo de las secuencias de inmunoglobulina que no se encuentran en algunos métodos que empleen los transgenes aleatoriamente integrados. Las diferencias en la composición genetica de los loci de inmunoglobulina entre los ratones y los humanos ha llevado al descubrimiento de las secuencias beneficiosas para la propagación de los segmentos génicos de inmunoglobulina sustituidos en los ratones. Específicamente, los genes ADAM6 murinos ubicados dentro del locus endógeno de inmunoglobulina están óptimamente presentes en los ratones con los loci de inmunoglobulina reemplazados, debido a su función en la fertilidad.

Se realizó un reemplazo in situ exacto de seis megabases de las regiones variables de los loci de inmunoglobulina de cadena pesada murinos (VH-DH-JH) con un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humano restringido, mientras deja a las secuencias murinas de flanqueo intactas y funcionales dentro de los loci híbridos, que incluyen todos los genes de cadena constantes murinos y las regiones de control transcriptivo de locus (figura 1 y figura 8). Además, las de ingeniería se realizaron para mantener las secuencias murinas que confieren al ratón la capacidad de aparearse y de producir descendientes de una forma comparable con un ratón de tipo silvestre (figura 9 y figura 10). Específicamente, un solo segmento génico VH humano, 27 DH, y seis JH y los genes ADAM6 murinos se introdujeron a través de los vectores dirigidos BAC quiméricos en las células ES murinas usando la teenología de ingeniería genética VELOCIGENE® (consultar, por ejemplo, el Número de Patente Americana 6,586,251 y Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high- resolution expression analysis, Nat Blotectmol 21 :652-659).

Ratones con segmentos genicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina restringidos Se proporcionan los animales no humanos que comprenden los loci de inmunoglobulina que comprenden un número restringido de genes VH, y uno o más genes D y uno o más genes J, al igual que los métodos para generarlos y usarlos. Cuando se inmunizan con un antígeno de interés, los animales no humanos generan las poblaciones de células B con las regiones variables de anticuerpo derivadas solamente del gen VH restringido preseleccionado o del conjunto de genes VH (por ejemplo, un gen VH preseleccionado y las variantes del mismo). En varias modalidades, se proporcionan los animales no humanos que generan las poblaciones de células B que expresan los dominios variables de anticuerpo humanos que son los dominios variables de cadena pesada humanos, junto con los dominios variables de cadena ligera humanos cognados. En varias modalidades, los animales no humanos reordenan los segmentos génicos variables de cadena pesada humanos y los segmentos génicos variables de cadena ligera humanos de los loci endógenos de inmunoglobulina murinos modificados que comprenden un reemplazo o una inserción de las secuencias de región variable no rearregladas no humanas con las secuencias de región variable no rearregladas humanas.

Los primeros trabajos en la organización, la estructura, y la función de los genes de inmunoglobulina se realizaron en parte en los ratones con los loci endógenos desactivados y se alteraron para generar los loci transgenicos (colocados aleatoriamente) con los genes de inmunoglobulina parcialmente humanos, por ejemplo, un repertorio parcial de los genes de cadena pesada humanos ligados a un gen constante humano, insertado aleatoriamente en el genoma, en presencia o ausencia de un transgén humano de cadena ligera. Aunque estos ratones fueran algo menos que óptimos para generar los anticuerpos de alta afinidad útiles, facilitaron ciertos análisis funcionales de los loci de inmunoglobulina. Algunos de estos ratones tuvieron únicamente dos o tres, o incluso un solo gen variable de cadena pesada.

Se han reportado los ratones que expresan las cadenas pesadas de inmunoglobulina completamente humanas derivadas de un solo gen VH5-51 humano y 10 genes DH humanos y seis genes JH humanos, con los genes constantes m y y1 humanos, en un transgén aleatoriamente insertado (y los loci endógenos de inmunoglobulina desactivados) (Xu and Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Región of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37-45). Las cadenas pesadas de inmunoglobulina completamente humanas de estos ratones se expresan principalmente con una de solo dos cadenas ligeras A completamente murinas derivadas del locus endógeno de cadena ligera A murino (VA1 -JA1 o VA2-JA2 solamente), y no puede expresar ninguna cadena ligera k (los ratones son IgK ' ). Estos ratones exhiben la disfunción seriamente anormal en el desarrollo de células B y la expresión de anticuerpos. Los números de celulas B son según se informa 5-10% de tipo silvestre, niveles de IgM de 5-10% de tipo silvestre, y los niveles de I g G 1 son solamente de 0.1 -1 % de tipo silvestre. El repertorio de IgM observado reveló una diversidad confluente muy restringida. Las cadenas pesadas completamente humanas exhiben la longitud de CDR3 en gran parte idéntica a través de los antígenos, el mismo uso de JH (JH2) a través de los antígenos, y un residuo Q confluente inicial, así representa cierta carencia de la diversidad de CDR3. Casi todas las cadenas ligeras l completamente murinas tuvieron una sustitución de W96L en JA1 como residuo confluente inicial. Los ratones según se informa no pueden generar ningún anticuerpo contra el polisacárido bacteriano. Debido a que en el par de dominios variables humanos con las cadenas ligeras murinas, la utilidad de las regiones variables humanas es muy limitada.

Otros ratones que tienen apenas un solo gen VH3-23 humano, los genes DH y JH humanos, y los genes de cadena ligera murinos se han reportado, pero muestran una diversidad muy limitada (y así una utilidad limitada) debido en parte al potencial de apareamiento incorrecto entre el dominio VH humano y el VL murino (consultar, por ejemplo, Mageed et al., 2001 , Rearrangement of the human heavy Chain variable región gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy Chain variable región, Gila Exp. Immunol. 123: 1 -5). Similarmente, los ratones que portan dos genes VH (3-23 y 6-1 ) junto con los genes DH y JH humanos en un transgén que contiene el gen constante m humano (Bruggemann et al., 1991 , Human antibody production in transgenic mice: expression from 100kb of the human IgH locus, Eur. J. Immmunol. 21 : 1323-1326) y los expresan en las cadenas IgM humanas con las cadenas ligeras murinas, pueden mostrar un repertorio limitado debido al apareamiento incorrecto (Mackworth-Young et al., 2003, The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy Chain variable región gene, Clin. Exp. Immunol. 134:420-425).

Tambien se han reportado otros ratones transgénicos que expresan las cadenas pesadas completamente humanas restringidas a VH de un transgén humano insertado aleatoriamente en el genoma, con un repertorio l humano limitado expresado de un transgén insertado aleatoriamente completamente humano (consultar, por ejemplo, Taylor et al., 1992, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light Chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res. 20(23):6287-6295; Wagner at al. , 1994, Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic Acids Res. 22(8): 1389-1393). Sin embargo, los ratones transgénicos que expresan los anticuerpos completamente humanos de los transgenes integrados aleatoriamente en el genoma murino, y que comprenden los loci endógenos dañados, se conocen por exhibir las diferencias sustanciales en la respuesta inmunitaria con respecto los ratones de tipo silvestre que afectan a la diversidad de los dominios variables de anticuerpo obtenibles de tales ratones.

Los animales no humanos útiles que generan una población diversa de celulas B que expresan los dominios variables de anticuerpo humanos de un repertorio génico VH restringido y uno o más genes D y uno o más genes J, son capaces de generar, preferiblemente en algunas modalidades, los repertorios de los genes de región variable rearreglados que serán suficientemente diversos. En varias modalidades, la diversidad incluye la diversidad confluente, la hipermutación somática, y la diversidad polimórfica en la secuencia génica VH (para las modalidades donde están presentes los genes VH en las formas polimórficas). La diversidad combinatoria ocurre en el apareamiento del gen VH con uno de una pluralidad de dominios variables de cadena ligera humanos cognados (que, en varias modalidades, comprenden la diversidad confluente y/o las hipermutaciones somáticas).

Los animales no humanos que comprenden un repertorio génico VH humano restringido y un repertorio génico VL humano completo o sustancialmente completo, en varias modalidades generarán las poblaciones de células B que representan varias fuentes de diversidad, como la diversidad confluente (por ejemplo, VDJ, confluencia de VJ, adiciones de P, adiciones de N), la diversidad combinatoria (por ejemplo, pesada humana, ligera humana restringida a VH cognada), y las hipermutaciones somáticas. En las modalidades que comprenden una restricción del repertorio de VH a un gen VH humano, un gen VH humano puede estar presente en dos o más variantes. En varias modalidades, la presencia de dos o más formas polimórficas de un gen VH enriquecerán la diversidad de los dominios variables de la población de celulas B.

Las variaciones en las secuencias de línea germinal de los segmentos génicos (por ejemplo, genes V) contribuyen a la diversidad de la respuesta de anticuerpo en los humanos. La contribución relativa a la diversidad debido a las diferencias de la secuencia génica V varía entre los genes V. El grado de polimorfismo varía a través de las familias génicas, y se muestra en una pluralidad de haplotipos (tramos de la secuencia con polimorfismos coheredados) capaces de generar la diversidad adicional según lo observado en las diferencias de haplotipo de VH entre los individuos emparentados y no emparentados en la población humana (consultar, por ejemplo, Souroujon et al., 1989, Polymorphisms in Human H Chain V Región Genes from the VHIII Gene Family, J. Immunol. 143(2):706-71 1 ). Algunos han sugerido, con base en los datos de las familias génicas VH humanas particularmente polimórficas, que la diversidad de haplotipos en la línea germinal es un contribuyente importante para la heterogeneidad génica VH en la población humana, que se muestra en la diversidad grande de diferentes genes VH de línea germinal a través de la población humana (consultar, Sasso et al., 1990, Prevalence and Polymorphism of Human VH3 Genes, J. Immunol. 145(8)2751 -2757).

Aunque la población humana muestre una diversidad grande de haplotipos con respecto al repertorio génico VH debido al polimorfismo extenso, ciertos polimorfismos se muestran en los alelos prevalecientes (es decir, conservados) observados en la población humana (Sasso et al., 990). El polimorfismo VH se puede describir en dos formas principales. La primera es la variación que se presenta a partir de la variación alelica asociada con las diferencias entre la secuencia nucleotídica entre los alelos del mismo segmento génico. La segunda se presenta a partir de las duplicaciones, de las inserciones, y/o de las deleciones numerosas que han ocurrido en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina. Esto ha dado lugar a la situación única en la cual los genes VH derivados por la duplicación de genes idénticos son diferentes de sus alelos respectivos en una o más sustituciones de nucleótido. Esto también afecta directamente el número de copias de los genes VH en el locus de cadena pesada.

Los alelos polimórficos de los segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanos (genes VH) han sido en gran parte el resultado de la inserción/deleción de los segmentos génicos y de la diferencias de nucleótido individuales dentro de las regiones de codificación, que tienen el potencial para tener consecuencias funcionales en la molécula de inmunoglobulina. La tabla 1 establece los genes VH funcionales enumerados por la familia génica VH humana y el número de alelos identificados para cada gen VH en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina humano. Existen algunos resultados que sugieren que los genes VH polimórficos se han implicado en la susceptibilidad a ciertas enfermedades como, por ejemplo, artritis reumatoide, mientras en otros casos un enlace entre VH y la enfermedad ha estado menos claro. Esta ambigüedad se ha atribuido al número de copias y a la presencia de varios alelos en diferentes poblaciones humanas. De hecho, varios genes VH humanos muestran la variación del número de copias (por ejemplo, VH1 -2, VH1 -69, VH2-26, VH2-70, y VH3-23). En varias modalidades, los ratones humanizados tal como se describe en el presente documento con repertorios VH restringidos comprenden las múltiples variantes polimórficas de un miembro de familia VH individual (por ejemplo, dos o más variantes polimórficas de VH1 -2, VH1 -69, VH2-26, VH2-70, o VH3-23, reemplazando todos o sustancialmente todos los segmentos VH murinos funcionales en un locus endógeno murino). En una modalidad específica, dos o más variantes polimórficas de los ratones descritos en el presente documento son mayoría e incluyen el número indicado para el miembro de familia VH correspondiente en la tabla 1 (por ejemplo, para VH1 -69, 13 variantes; para VH1 -2, cinco variantes; etcetera).

Las variantes comúnmente observadas de los genes VH humanos particulares se conocen en la téenica. Por ejemplo, uno de los polimorfismos más complejos en el locus VH pertenece al gen VH1 -69.

El gen VH1 -69 humano tiene 13 alelos reportados (Sasso et al. , 1993, A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set of alíeles, Journal of Clinical Investigation 91 :2358-2367; Sasso et al. , 1996, Expression of the immunoglobulin VH gene 51 p 1 is proportional to its germline gene copy number, Journal of Clinical Investigation 97(9)2074-2080) y existe en por lo menos tres haplotipos que tienen las duplicaciones del gen VH1 -69, que da lugar a las múltiples copias del gen VH en un locus dado. Estos alelos polimórficos incluyen las diferencias en las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles), que pueden afectar dramáticamente la especificidad del antígeno. La tabla 2 establece los alelos reportados para el gen VH1 -69 humano y VH1 -2 humano y las SEC ID NO para las secuencias de ADN y de proteína de las regiones variable de cadena pesada maduras.

El ADN genómico representativo y las secuencias de proteína integrales de un gen VH1 -69 se establecen en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. La figura 5 y la figura 6 establecen las alineaciones de ADN y de proteína de trece alelos VH1 -69 reportados, respectivamente. Las secuencias de ADN y de proteína representativas de un gen VH1 -2 se establecen en SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, respectivamente. La figura 8 y la figura 9 establecen las alineaciones de ADN y de proteína de cinco alelos VH1 -2 reportados, respectivamente. La figura 7 y la figura 10 establecen una matriz de porcentaje de identidad/similitud para las secuencias de proteína alineadas que corresponden a trece alelos VH1 -69 humanos reportados y cinco alelos VH1 -2 humanos reportados, respectivamente. En varias modalidades, el locus modificado de la invención comprende un gen VH seleccionado de la tabla 1 , presente en dos o más números de copias, donde el número de copia incluye hasta e incluye el número de alelos mostrado en la tabla 1. En una modalidad, el locus modificado de la invención comprende un gen VH1 -69 o VH1 -2 seleccionados de la tabla 2, presentes en dos o más números de copias, donde el número de copia incluye hasta e incluye el número de alelos mostrado en la tabla 1.

Tabla 1 Familia VH Gen VH Alelos 1-2 5 1-3 2 1-8 2 1-18 3 Familia VH 1 1-24 1 1-45 3 1-46 3 1-58 2 1-69 13 2-5 10 2-26 1 Familia VH 2 2-70 13 3-7 3 3-9 2 3-11 4 3-13 4 3-15 8 3-16 2 3-20 1 3-21 4 3-23 5 3-30 19 ??? Familia VH Gen VH Alelos 3-30-3 2 Familia VH 3 3-30-5 1 3-33 6 3-35 1 3-38 2 3-43 2 3-48 4 3-49 5 3-53 4 3-64 5 3-66 4 3-72 2 3-73 2 3-74 3 4-4 7 Familia VH 4 4-28 6 4-30-1 1 4-30-2 5 4-30-4 6 4-31 10 4-34 13 4-39 7 Familia VH Gen VH Alelos 4-59 10 4-61 8 Familia VH 5 5-51 5 Familia VH 6 6-1 2 Familia VH 7 7-4-1 5 7-81 1 Tabla 2 Número de SEQ ID NO: Alelo IgHVI -69 Acceso (ADN/Proteína) IgHVI -69*01 L22582 37/38 IgHVI -69*02 Z27506 39/40 IgHVI -69*03 X92340 41 /42 IgHVI -69*04 M83132 43/44 IgHVI -69*05 X67905 45/46 IgHVI -69*06 L22583 47/48 IgHVI -69*07 Z29978 49/50 IgHVI -69*08 Z14309 51/52 IgHVI -69*09 Z14307 53/54 IgHVI -69*10 Z14300 55/56 IgHVI -69*11 Z14296 57/58 Número de SEQ ID NO: Alelo IgHVI -69 Acceso (ADN/Proteina) lgHV1-69*12 Z14301 59760 IgHVI -69*13 Z14214 61 /62 Número de SEQ ID NO: Alelo IgHVI -2 Acceso (ADN/Proteina) lg H V 1 -2*01 X07448 63764 IgHVI -2*02 X62106 65/66 IgHVI -2*03 X92208 67/68 IgHVI -2*04 Z12310 69/70 IgHVI -2*05 H M855674 71 /72 Uso del gen variable de cadena pesada dependiente del antígeno El uso preferido dependiente del antígeno de los genes VH puede aprovecharse en el desarrollo de terapeuticos humanos que se dirigen a los antígenos clínicamente significativos. La capacidad de generar un repertorio de dominios variables de anticuerpo usando un gen VH particular puede proporcionar una ventaja significativa en la búsqueda de los dominios variables de anticuerpo de alta afinidad para usar en los terapéuticos humanos. Los estudios en el gen VH murino y humano indiferenciado en los dominios variables de anticuerpo revelan que la mayoría de los dominios variables de cadena pesada no se derivan de ningún gen VH particularmente único o usado dominantemente. Por otra parte, los estudios de la respuesta del anticuerpo a ciertos antígenos revelan que en algunos casos una respuesta de anticuerpo particular exhibe un uso polarizado de un gen VH particular en el repertorio de celulas B después de la inmunización.

Aunque el repertorio de VH humano es absolutamente diverso, por algunas estimaciones, la frecuencia prevista del uso de cualquier gen VH dado, asumiendo la selección aleatoria de los genes VH, es de aproximadamente 2% (Brezinschek at al., 1995, Analysis of the Heavy Chain Repertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, J. Immunal 155: 190-202). Pero el uso de VH en las células B periféricas en humanos está desequilibrado. En un estudio, la abundancia del gen V funcional siguió el patrón VH3 > VH4 > VH1 > VH 2 > VH5 > VH6 (Davidkova at al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand J. Immunol. 45:62-73). Un estudio temprano estimó que la frecuencia de uso de la familia VH3 fue de aproximadamente 0.65, mientras la frecuencia de uso de la familia VH1 fue de aproximadamente 0.5; éstas y otras observaciones sugieren que la complejidad de línea germinal del repertorio de VH humano no se muestra de manera exacta en el compartimiento de células B periféricas en humanos que tienen un repertorio de VH normal de línea germinal, una situación que es similar a aquella observada en el ratón, es decir, la expresión del gen VH es no estocástica (Zouall y These, 1991 , Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization, J. Immunol. 146(8)2855-2864). De acuerdo con un reporte, el uso del gen VH en humanos, del más grande al menor, es VH3 > VH4 > VH1 > VH5 > VH2 > VH6; los reordenamientos en las celulas B periféricas revelan que el uso de la familia VH3 es más alto que el esperado con base en el número relativo de genes VH3 de línea germinal (Brezinschek et al., 1995). De acuerdo con otro reporte, el uso de VH en humanos sigue el patrón VH3 > VH5 > VH2 > VH1 > VH4 > VH6, con base en el análisis de las pequeñas células B ¡nmunocompetentes periféricas activadas por mitógeno de hierba carmín (Davidkova at al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol, 45:62-73). Un reporte afirma que aquellos entre los miembros de familia VH3 más frecuentemente usados son 3-23, 3-30 y 3-54 (Brezinschek et al., 1995). En la familia VH4, los miembros 4-59 y 4-4b se encontraron relativamente con más frecuencia (Id.), así como 4-39 y 4-34 (Brezinscheck et al., 1997, Analysis of the Human VH Gene Repertoire, J. Clin. Invest. 99(10):2488-2501 ). Otros postulan que el repertorio de cadena pesada activado está desequilibrado a favor de la alta expresión de VH5 y de la baja expresión de VH3 (Van Dijk-Hard y Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Immunology 107: 136-144). Otros estudios afirman que el gen VH más comúnmente usado en el repertorio humano adulto es VH4-59, seguido por VH3-23 y VH3-48 (Arnaout et al., 2001 , High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans, PLoS ONE 6(8): 108). Aunque los estudios de uso se basan en los números de muestra relativamente pequeños y exhiben así la alta variación, considerados juntos los estudios sugieren que la expresión del gen V no es puramente estocástica. De hecho, los estudios con los antígenos particulares han establecido que — en ciertos casos— la situación está completamente en contra de ciertos usos y a favor de otros.

En un cierto plazo, llegó a ser evidente que el repertorio observado de dominios variables de cadena pesada humanos generados en respuesta a ciertos antígenos está muy restringido. Algunos antígenos se asocian casi exclusivamente con los anticuerpos de neutralización que tienen solamente ciertos genes VH particulares, en el sentido que los anticuerpos de neutralización eficaces se derivan esencialmente solo de un gen VH. Tal es el caso para un número de patógenos humanos clínicamente importantes.

Las cadenas pesadas derivadas de VH1-69 se han observado en una variedad de repertorios de anticuerpo específicos para el antígeno de importancia terapeutica. Por ejemplo, VH1 -69 se observó con frecuencia en las transcripciones de cadena pesada de un repertorio de I g E de los linfocitos sanguíneos periféricos en niños con enfermedad atópica (Bando et al., 2004, Characterization of VHE gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous VH1 -69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94:99-106). Las cadenas pesadas derivadas de VH1 -69 con un alto nivel de hipermutación somática también ocurren en los linfomas de células B (Perez et al., 2009, Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of VH1 -69 and VH4-59 segmente, British Journal of Dermatology 162:61 1 -618), mientras algunas cadenas pesadas derivadas de VH1 -69 con esencialmente las secuencias de línea germinal (es decir, poca a ninguna hipermutación somática) se han observado entre los autoanticuerpos en los pacientes con trastornos sanguíneos (Pos et al., 2008, VH1 -69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis and Haemostasis 7:421 -428).

Además, se ha encontrado que los anticuerpos de neutralización contra los antígenos virales como V1H, influenza y hepatitis C (HCV, por sus siglas en ingles) usan las secuencias derivadas de VH1 -69 de línea germinal y/o somáticamente mutadas (Miklos et al., 2000, Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent use of 1 /1 -69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12):3878-3884; Kunert et al. , 2004, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variante of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retro viruses 20(7):755-762; Chan et al., 2001 , VH1 -69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4): 1023-1026; Carbonari et al., 2005, Hepatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansión of VH1 -69-expressing memory B cells in type cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174:6532-6539; Wang y Palese, 2009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural & Molecular Biology 16(3):233- 234; Sui et al., 2009, Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural & Molecular Biology 16(3)265-273; Marasca et al., 2001 , Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VH1 -69 and VH4-34 Segmente in Hepatitis C Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159(1 )253-261 ).

La polarización del uso de VH tambien se observa en la respuesta inmunitaria humoral a Hemophilus influenzae tipo b (Hib PS) en humanos. Los estudios sugieren que la familia VHIII (la subfamilia VHlllb particularmente, VH9.1 ) caracteriza exclusivamente la respuesta humoral humana a Hib PS, con los diversos genes D y J (Adderson et al., 1991 , Restricted IgH Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Immunol. 147(5): 1667-1674; Adderson et al., 1993, Restricted Immunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Clin. Invest. 91 :2734-2743).Los genes JH humanos también exhiben el uso polarizado; JH4 y JH6 se observan aproximadamente 38-41 % en las células B periféricas en los humanos (Brezinschek et al., 1995).

El uso de VH en los humanos infectados con V1H-1 está polarizado contra el uso de VH3 y a favor de las familias de genes VH1 y VH4 (Wisnewski et al., 1996, Human Antibody Variable Región Gene Usage in V1H-1 Infection, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes & Human Retroviology 11 (1 )31 -38). Sin embargo, el análisis de ADNc de la medula ósea de los pacientes afectados reveló el uso significativo de VH3 no expresado en el repertorio de células B funcional, donde Fab que muestra el uso de VH3 exhibió la neutralización in vitro eficaz de V1H-1 (Id.). Puede postularse que la respuesta inmunitaria humoral a la infección de VIH-1 es posiblemente atenuada debido a la restricción de VH; los animales no humanos modificados tal como se describe en el presente documento (no infectables por VIH-1 ) pudieron así ser útiles para generar los dominios de anticuerpo de neutralización derivados de los genes VH particulares presentes en los animales manipulados por ingeniería genética descritos en el presente documento, pero derivados de diversos genes VH que aquellos observados en el repertorio restringido de humanos afectados.

Así, la capacidad de generar los dominios variables de anticuerpo humanos de alta afinidad en los ratones restringidos en VH, por ejemplo, (restringidos, por ejemplo, a un miembro de la familia VH3 y polimorfos del mismo) inmunizados con VIH-1 , pudo proporcionar un recurso rico para diseñar terapéuticos humanos de neutralización de VIH-1 eficaces al extraer el repertorio restringido (por ejemplo, restringido a un miembro de la familia VH3 o una variante del mismo) de tal ratón inmunizado.

La restricción de la respuesta de anticuerpo humano a ciertos patógenos puede reducir la probabilidad de obtener las regiones variables de anticuerpo de los humanos afectados que pueden servir como punto inicial para diseñar los anticuerpos de neutralización de alta afinidad contra el patógeno. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria humana a la infección de V1H-1 está restringida por clonación a traves de la infección de V1H-1 y en la progresión del SIDA (Muller et al. , 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Scand. J. Immunol. 38:327-334; Wisnewski et al., 1996). Además, los genes VH en el general no están presentes en todas las formas polimórficas en los individuos; ciertos individuos en ciertas poblaciones poseen una variante, mientras los individuos en otras poblaciones poseen una diferente variante. Así, la disponibilidad de un sistema biológico que está restringido a un solo gen VH y a sus variantes en varias modalidades proporcionará una fuente no aprovechada hasta ahora de la diversidad para generar las regiones variables de anticuerpo (por ejemplo, dominios cognados pesados y ligeros humanos) con base en un gen VH restringido.

Los ratones manipulados por ingeniería genética que expresan las regiones variables de cadena pesada humanas con uso de segmento génico VH restringido son útiles para generar un repertorio relativamente grande de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanas de alta afinidad diversas de manera confluente, diversas de manera combinatoria, y mutadas de manera somática de un repertorio de otra manera restringido. Un repertorio restringido, en este caso, se refiere a una limitación predeterminada en los genes de línea germinal que dan lugar a que el ratón que no pueda formar un gen de cadena pesada rearreglado que se deriva de cualquier gen V distinto de un gen V preseleccionado. En las modalidades que emplean un gen V preseleccionado pero no un gen D y/o J preseleccionado, el repertorio está restringido con respecto a la identidad del gen V pero no del gen D y/o J. La identidad del gen V preseleccionado (y cualquier gen D y/o J preseleccionado) no se limita a ningún gen V particular.

El diseño de un ratón de modo que reordene un solo gen VH (presente como un solo segmento o un conjunto de variantes) con una variedad de segmentos génicos D y J humanos (por ejemplo, los segmentos DH y JH) proporciona una diversidad confluente in v/vo/diversidad combinatoria/máquma de permutación de hipermutación somática que puede usarse para iterar las mutaciones en las secuencias de región variables de cadena pesada rearregladas resultantes (por ejemplo, V/D/J o V/J, de acuerdo con las circunstancias). En tal ratón, el proceso de selección clónica opera para seleccionar las regiones variables convenientes que unen a un antígeno de interés que se basan en un solo gen VH preseleccionado (o variantes del mismo). Debido a que los componentes de selección clónica del ratón se dedican a la selección con base en un solo segmento génico VH preseleccionado, la interferencia de fondo se suprime en gran parte. Con la selección juiciosa del segmento génico VH, un número relativamente más grande de anticuerpos seleccionados por clonación específicos para el antígeno puede cribarse en un periodo de tiempo más corto que con un ratón con una diversidad grande de los segmentos V.

La preselección y la restricción de un ratón a un solo segmento V proporciona un sistema para permutar las confluencias V/D/J a un índice que en varias modalidades es mayor que aquel observado en los ratones que tienen de otra manera hasta 40 o más segmentos V para recombinar con las regiones D y J. La eliminación de otros segmentos V libera el locus para formar más combinaciones V/D/J para el segmento V preseleccionado que aquellas observadas de otra manera. El número creciente de transcripciones que resultan de la recombinación de V preseleccionado con uno de una pluralidad de D y uno de una pluralidad de segmentos J alimentará esas transcripciones en el sistema de selección clónico en forma de celulas pre-B, y el sistema de selección clónico se dedica así a cielizar las células B que expresan la región V preseleccionada. De esta manera, más regiones V únicas derivadas del segmento V preseleccionado pueden cribarse por el organismo de otra manera posible en una cantidad de tiempo dada.

En varios aspectos, se describen los ratones que mejoran la diversidad confluente de las recombinaciones V/D para la región V preseleccionada, debido a que todas o sustancialmente todas las recombinaciones del locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina serán del segmento V preseleccionado y de los segmentos D y J que se ubican en tales ratones. Por lo tanto, los ratones proporcionan un metodo para generar una diversidad de los segmentos CDR3 usando una base, o un repertorio de gen VH restringido.

Localización genómica y función de ADA 6 murino Los ratones machos que carecen de la capacidad de expresar cualquier proteína ADAM6 funcional asombrosamente muestran un defecto en la capacidad de los ratones de aparearse y de generar descendientes. Los ratones carecen de la capacidad de expresar una proteína ADAM6 funcional en virtud de un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina murinos con los segmentos génicos de región variable humanos. La pérdida de la función de ADAM6 se presenta debido a que el locus ADAM6 se ubica dentro de una región del locus endógeno génico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina murino, próximo al extremo 3’ del locus de segmento génico VH que está hacia 5’ de los segmentos génicos DH. Reproducir a los ratones que son homocigóticos para un reemplazo de todas o sustancialmente todas las secuencias endógenas variables de cadena pesada murinas con una secuencia de cadena pesada humana restringida, es generalmente un método incómodo para acondicionar a los machos y a las hembras que son homocigóticos para la secuencia de cadena pesada humana restringida y para esperar un apareamiento productivo. Las camadas exitosas son bajas en frecuencia y en tamaño. En cambio, los machos heterozigóticos empleados para la secuencia de cadena pesada humana restringida para aparearse con las hembras homocigóticas para que el reemplazo genere una progenie que es heterozigótica para la secuencia de cadena pesada humana restringida, entonces un ratón homocigótico se reproduce del mismo. Los inventores han determinado que la causa probable de la perdida de fertilidad en los ratones machos es la ausencia en ratones machos homocigóticos de una proteína ADAM6 funcional.

En varios aspectos, los ratones machos que comprenden un gen ADAM6 dañado (es decir, no funcional o marginalmente funcional) no muestran una reducción o una eliminación de la fertilidad. Debido a que en los ratones (y otros roedores) el gen ADAM6 se ubica en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina, los inventores han determinado que para reproducir a los ratones, o crear y mantener una cepa de ratones, que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado, se emplean varios esquemas de procreación o reproducción modificados. La poca fertilidad, o la infertilidad, de los ratones machos homocigóticos para un locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado se produce manteniendo tal modificación en una cepa de ratón difícil. En varias modalidades, mantener la cepa comprende evitar los problemas de infertilidad mostrados por los ratones macho homocigóticos para el locus de cadena pesada humanizado.

En un aspecto, se proporciona un método para mantener una cepa de ratón tal como se describe en el presente documento. La cepa de ratón no necesita comprender una secuencia ADAM6 ectópica, y en varias modalidades la cepa de ratón es homocigótica o heterozigótica para un noqueo (knockout) (por ejemplo, un noqueo (knockout) funcional) de ADAM6.

La cepa de ratón comprende una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina que da lugar a una reducción o a una perdida de la fertilidad en un ratón macho. En una modalidad, la modificación comprende una deleción de una región reguladora y/o de una región de codificación de un gen ADAM6, en una modalidad específica, la modificación comprende una modificación de un gene ADAM6 endógeno (región reguladora y/o de codificación) que reduce o elimina la fertilidad de un ratón macho que comprende la modificación; en una modalidad específica, la modificación reduce o elimina la fertilidad de un ratón macho que es homocigótico para la modificación.

En una modalidad, la cepa de ratón es homocigótica o heterozigótica para un noqueo (knockout) (por ejemplo, un noqueo (knockout) funcional) o una deleción de un gen ADAM6.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida aislando de un ratón que es homocigótico o heterozigótico para la modificación una célula, y empleando la célula donadora en el embrión anfitrión, y gestando el embrión anfitrión y la célula donadora en una madre sustituta, y obteniendo de la madre sustituta una progenie que comprende la modificación genética. En una modalidad, la célula donadora es una célula ES. En una modalidad, la célula donadora es una célula pluripotente, por ejemplo, una célula pluripotente inducida.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al aislar de un ratón que sea homocigótico o heterozigótico para la modificación una secuencia de ácido nucleico que comprende la modificación, y al introducir la secuencia de ácido nucleico en un núcleo anfitrión, y al gestar una celula que comprende la secuencia de ácido nucleico y el núcleo anfitrión en un animal conveniente. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se introduce en un embrión de oocito anfitrión.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al aislar de un ratón que es homocigótico o heterozigótico para la modificación un núcleo, y al introducir el núcleo en una célula hospedadora, y al gestar el núcleo y la célula hospedadora en un animal conveniente para obtener una progenie que sea homocigótica o heterozigótica para la modificación.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al emplear la fertilización in vitro (IVF, por sus siglas en inglés) de un ratón hembra (de tipo silvestre, homocigótico para la modificación, o heterozigótico para la modificación) al emplear una esperma de un ratón macho que comprende la modificación genética. En una modalidad, el ratón macho es heterozigótico para la modificación genética. En una modalidad, el ratón macho es homocigótico para la modificación genética.

En una modalidad, la cepa de ratón es mantenida al criar un ratón macho que es heterozigótico para la modificación genética con un ratón hembra para obtener la progenie que comprende la modificación genetica, al identificar una progenie macho y hembra que comprenden la modificación genética, y al emplear un macho que es heterozigótico para la modificación genética en una reproducción con una hembra que es de tipo silvestre, homocigótica, o heterozigótica para la modificación genética para obtener la progenie que comprende la modificación genética. En una modalidad, la etapa de reproducir un macho heterozigótico para la modificación genética con una hembra de tipo silvestre, una hembra heterozigótica para la modificación genética, o una hembra homocigótica para la modificación genética se repite para mantener la modificación genética en la cepa de ratón.

En un aspecto, un método se proporciona para mantener una cepa de ratón que comprende un reemplazo de un locus endógeno génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina con una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina humanas, que comprende reproducir la cepa de ratón para generar los ratones machos heterozigóticos, donde los ratones machos heterozigóticos se reproducen para mantener la modificación genética en la cepa. En una modalidad específica, la cepa no es mantenida por ninguna reproducción de un macho homocigótico con una hembra de tipo silvestre, o una hembra homocigótica o heterozigótica para la modificación genética.

La proteína ADAM6 es un miembro de la familia de Disintegrina y Metaloproteasa (ADAM, por sus siglas en inglés) de proteínas, que es una familia grande de proteínas que tienen funciones diversas que incluyen la adherencia celular. Algunos miembros de la familia ADAM están implicados en la espermatogénesis y la fertilización. Por ejemplo, ADAM2 codifica una subunidad de la proteína fertilina, que está implicada en las interacciones del esperma-óvulo. ADAM3, o ciritestina, parecen necesarios para la unión del esperma a la zona pelúcida. La ausencia de ADAM2 o de ADAM3 da lugar a la infertilidad. Se ha postulado que ADAM2, ADAM3, y ADAM6 forman un complejo en la superficie de las células del esperma murino. El gen contraparte humano (ADAM6 humano), encontrado normalmente entre los segmentos génicos VH humanos VH1 -2 y VH6-1 en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina humano, parece ser un pseudogén. En los ratones, hay dos genes ADAM6 ADAM6a y ADAM6b — que se encuentran en una región intergénica entre los segmentos génicos VH y DH murinos, y en el ratón los genes ADAM6a y ADAM6b se orientan en la orientación transcriptiva opuesta a aquellas de los segmentos génicos de inmunoglobulina circundantes. En los ratones, un locus ADAM6 funcional se requiere al parecer para la fertilización normal. Un locus o una secuencia ADAM6 funcional, entonces, se refiere a un locus o una secuencia ADAM6 que pueden complementar, o rescatar, la fertilización drásticamente reducida mostrada en los ratones machos con los loci ADAM6 endógenos ausentes o no funcionales.

La posición de la secuencia intergénica en los ratones que codifica ADAM6a y ADAM6b hace a la secuencia intergénica susceptible a la modificación al modificar una cadena pesada endógena murina. Cuando se eliminan o se reemplazan los segmentos genicos VH, o cuando se eliminan o se reemplazan los segmentos génicos DH, hay una alta probabilidad de que un ratón resultante muestre un déficit severo en la fertilidad, para compensar el déficit, el ratón se modifica para incluir una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que complementará la pérdida en la actividad de ADAM6 debido a una modificación del locus endógeno génico ADAM6 murino. En varias modalidades, la secuencia nucleotídica de complementación es una que codifica un ADAM6 murino, un ADAM6b murino, o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que rescata el déficit de fertilidad. Alternativamente, los métodos convenientes para preservar el locus ADAM6 endógeno pueden emplearse, mientras la producción de la secuencia endógena de cadena pesada de inmunoglobulina que flanquea el locus ADAM6 murino incapaz de reordenarse para codificar una región variable de cadena pesada endógena funcional. Los métodos alternativos ejemplares incluyen la manipulación de las porciones grandes de cromosomas murinos que colocan los loci endógenos de región variables de cadena pesada de inmunoglobulina de una manera que son incapaces de reordenarse para codificar una región variable de cadena pesada funcional que está ligada de manera operable a un gen endógeno constante de cadena pesada. En varias modalidades, los métodos incluyen las inversiones y/o los desplazamientos de los fragmentos cromosómicos murinos que contienen los segmentos génicos endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina.

La secuencia nucleotídica que rescata la fertilidad puede colocarse en cualquier posición conveniente. Puede colocarse en la región intergenica, o en cualquier posición conveniente en el genoma (es decir, de manera ectópica). En una modalidad, la secuencia nucleotídica puede introducirse en un transgén que se integra aleatoriamente en el genoma murino. En una modalidad, la secuencia puede mantenerse de manera episómica, es decir, en un ácido nucleico separado en lugar de en un cromosoma murino. Las posiciones convenientes incluyen las posiciones que son permisivas o activas de manera transcriptiva, por ejemplo, un locus ROSA26 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS EE.UU. 94:3789-3794), un locus BT-5 (Michael et al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), o un locus Oct4 (Wallace etal. , 2000, Nucleic Acids Res. 28: 1455-1464). Se describe el direccionamiento de las secuencias de nucleótido a los loci activos de manera transcriptiva, por ejemplo, en US 7,473,557.

Alternativamente, la secuencia nucleotídica que rescata la fertilidad puede unirse con un promotor inducible para facilitar la expresión óptima en las células y/o los tejidos apropiados, por ejemplo, los tejidos reproductivos. Los promotores inducibles ejemplares incluyen los promotores activados por medios físicos (por ejemplo, promotor de choque térmico) y/o químicos (por ejemplo, IPTG o tetracielina).

Además, la expresión de la secuencia nucleotídica puede ligarse a otros genes para obtener la expresión en las etapas específicas del desarrollo o dentro de los tejidos específicos. Tal expresión puede obtenerse al colocar la secuencia nucleotídica en ligadura operable con el promotor de un gen expresado en una etapa de desarrollo específica. Por ejemplo, las secuencias de inmunoglobulina de una especie alterada en el genoma de una especie anfitrión se colocan en ligadura operable con una secuencia promotora de un gen CD19 (un gene específico para la celula B) de la especie anfitrión. La expresión específica para la célula B en las etapas de desarrollo exactas se obtiene cuando se expresan las inmunoglobulinas.

Otro método más para obtener la expresión robusta de una secuencia nucleotídica insertada es emplear a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK y CAGG. En una manera similar, la secuencia nucleotídica deseada se coloca en ligadura operable con un promotor constitutivo seleccionado, que proporciona el alto nivel de expresión de las proteínas codificadas por la secuencia nucleotídica.

El término “ectópico” se propone para incluir una desplazamiento, o una colocación en una posición que no se encuentra normalmente en la naturaleza (por ejemplo, la colocación de una secuencia de ácido nucleico en una posición que no es la misma posición que la secuencia de ácido nucleico que se encuentra en un ratón de tipo silvestre). El término, en varias modalidades, se usa en el sentido de su objetivo que está fuera de su posición normal, o apropiada. Por ejemplo, la frase “una secuencia nucleotídica ectópica que codifica...” se refiere a una secuencia nucleotídica que aparece en una posición la cual no se encuentra normalmente en el ratón. Por ejemplo, en el caso de una secuencia nucleotídica ectópica que codifica una proteína ADAM6 murina (o un ortólogo o un homólogo o fragmento de la misma que proporciona el mismo o similar beneficio de fertilidad en los ratones machos), la secuencia puede colocarse en una diferente posición en el genoma murino a aquella que se encuentra normalmente en un ratón de tipo silvestre. En tales casos, las nuevas uniones de secuencia de la secuencia murina se crearan al colocar la secuencia en una diferente posición en el genoma murino que en un ratón de tipo silvestre. Un homólogo o un ortólogo funcional de ADAM6 murino es una secuencia que confiere un rescate de la fertilidad perdida (por ejemplo, la pérdida de la capacidad de un ratón macho de generar descendiente por apareamiento) que se observa en el ratón ADAM6 ' . Los homólogos o los ortólogos funcionales incluyen las proteínas que tienen por lo menos 89% de identidad o más, por ejemplo, hasta 99% de identidad, a la secuencia de aminoácido de ADAM6a y/o a la secuencia de aminoácido de ADAM6b, y que pueden complementar, o rescatar la capacidad de apareamiento con éxito, de un ratón que tiene un genotipo que incluye una deleción o un noqueo (knockout) de ADAM6a y/o de ADAM6b.

La posición ectópica puede ser dondequiera (por ejemplo, como con la inserción aleatoria de un transgén que contiene una secuencia ADAM6 murina), o puede estar, por ejemplo, en una posición que se aproxime (pero no está exactamente igual que) su ubicación en un ratón de tipo silvestre (por ejemplo, en un locus endógeno de inmunoglobulina murino modificado, pero ya sea hacia 5’ o hacia 3’ de su posición natural, por ejemplo, dentro de un locus de inmunoglobulina modificado pero entre diferentes segmentos genicos, o en una diferente posición en una secuencia intergénica V-D murina). Un ejemplo de una colocación ectópica es mantener la posición encontrada normalmente en los ratones de tipo silvestre dentro del locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina mientras se producen los segmentos génicos endógenos de cadena pesada circundantes incapaces de reordenarse para codificar una cadena pesada funcional que contiene una región endógena constante de cadena pesada. En este ejemplo, esto se puede lograrse por la inversión del fragmento cromosómico que contiene los loci endógenos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, usando los sitios de recombinación específicos para el sitio de alteración ubicados en las posiciones que flanquean el locus de región variable. Así, tras la recombinación, los loci endógenos de región variable de cadena pesada se colocan a una gran distancia lejos de los genes endógenos de región constante de cadena pesada para de tal modo prevenir el reordenamiento para codificar una cadena pesada funcional que contiene una región endógena constante de cadena pesada. Otros métodos ejemplares para obtener el silencio funcional del locus endógeno génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina mientras se mantiene un locus ADAM6 funcional, serán evidentes para los expertos en la teenica tras la lectura de esta descripción y/o en combinación con los métodos conocidos en la técnica. Con tal colocación del locus endógeno de cadena pesada, se mantienen los genes ADAM6 endógenos y el locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina se silencia funcionalmente.

Otro ejemplo de una colocación ectópica es la colocación dentro de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado. Por ejemplo, un ratón que comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos VH endógenos con un solo segmento génico VH humano, donde el reemplazo elimina una secuencia ADAM6 endógena, puede crearse para tener una secuencia ADAM6 murina ubicada dentro de una secuencia intergénica que se ubica entre un solo segmento génico VH humano y un segmento génico DH humano. Otro ejemplo de una colocación ectópica es la colocación de la secuencia ADA 6 murina en una posición 5’ (con respecto a la dirección de transcripción de un solo segmento génico VH humano) al segmento génico VH humano. Una posición 5’ en un solo segmento génico VH humano puede estar en gran proximidad, por ejemplo, algunos cientos de pares de bases a algunos kb, o distante, por ejemplo, vario kb a cientos de kb o incluso una megabase o mayor, con relación al segmento génico VH humano. La modificación resultante generaría una secuencia ADAM6 murina (ectópica) dentro o contigua, o incluso en el mismo cromosoma, con una secuencia génica humana, y la colocación (ectópica) de la secuencia ADAM6 rnurina dentro de la secuencia genica humana puede aproximarse a la posición de la secuencia ADAM6 rnurina (es decir, dentro de la región intergénica V-D). Las uniones de secuencia resultantes creadas al unir una secuencia ADAM6 rnurina (ectópica) dentro o adyacente a una secuencia génica humana (por ejemplo, una secuencia génica de inmunoglobulina) dentro del línea germinal del ratón serían nuevas con respecto la misma o similar posición en el genoma de un ratón de tipo silvestre.

En varias modalidades, se proporcionan los animales no humanos que carecen de ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo, donde la carencia hace estéril al animal no humano, o reduce sustancialmente la fertilidad del animal no humano. En varias modalidades, la carencia de ADAM6 u ortólogo o homólogo del mismo se debe a una modificación de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina. Una reducción sustancial de la fertilidad es, por ejemplo, una reducción de la fertilidad (por ejemplo, frecuencia reproductiva, crías por camada, crías por año, etcétera) de aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% o más. En varias modalidades, los animales no humanos se complementan con un gen ADAM6 murino o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional del mismo que es funcional en un animal no humano macho, donde el gen ADAM6 complementado u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo rescata la reducción de la fertilidad por completo o en una parte sustancial. Un rescate de la fertilidad en una parte sustancial es, por ejemplo, una restauración de la fertilidad de tal manera que el animal no humano muestre una fertilidad que sea de por lo menos 70%, 80%, o 90% o más con respecto a un locus de cadena pesada no modificado (es decir, un animal sin una modificación al gen ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo).

La secuencia que confiere en el animal manipulado por ingeniería genetica (es decir, el animal que carece de un ADAM6 funcional u ortólogo u homólogo del mismo, debido a, por ejemplo, una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina), en varias modalidades, se selecciona de un gen ADAM6 o un ortólogo o un homólogo del mismo. Por ejemplo, en un ratón, la pérdida de la función de ADAM6 se rescata al agregar, en una modalidad, un gen ADAM6 murino. En una modalidad, la pérdida de la función de ADAM6 en el ratón se rescata al agregar un ortólogo o un homólogo de una especie estrechamente vinculada con respecto al ratón, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón de una diferente cepa o especie, una rata de cualquier especie, un roedor; donde la adición del ortólogo o del homólogo al ratón rescata la pérdida de fertilidad debido a la pérdida de la función de ADAM6 o a la pérdida de un gen ADAM6. Los ortólogos y los homólogos de otras especies, en varias modalidades, se seleccionan de una especie relacionada de manera filogenética y, en varias modalidades, muestran un porcentaje de identidad con ADAM6 endógeno (u ortólogo) que es de aproximadamente 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, o 97% o más; y recatan la pérdida de la fertilidad relacionada con ADAM6 o (en un animal distinto al ratón) relacionada con el ortólogo de ADAM6. Por ejemplo, en una rata macho geneticamente modificada que carece de la función de ADAM6 (por ejemplo, una rata con una región variable endógena de cadena pesada de inmunoglobulina reemplazada por una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o un noqueo (knockout) en la región de cadena pesada de inmunoglobulina de rata), la pérdida de fertilidad en la rata se rescata por la adición de un ADAM6 de rata o, en algunas modalidades, un ortólogo de un ADAM6 de rata (por ejemplo, un ortólogo de ADAM6 de otra cepa o especie de rata, o, en una modalidad, de un ratón).

Así, en varias modalidades, los animales manipulados por ingeniería genética que no exhiben ninguna fertilidad o una reducción en la fertilidad debido a la modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 (u ortólogo u homólogo de la misma) o una región reguladora liga de manera operable a la secuencia de ácido nucleico, comprenden una secuencia de ácido nucleico que complementa, o restaura, la pérdida de la fertilidad donde la secuencia de ácido nucleico que complementa o restaura la pérdida de la fertilidad es de una diferente cepa de la misma especie o de una especie relacionada de manera filogenética. En varias modalidades, la secuencia de ácido nucleico de complementación es un ortólogo o un homólogo de ADAM6 o un fragmento funcional del mismo. En varias modalidades, el ortólogo o el homólogo de ADAM6 de complementación o el fragmento funcional del mismo es de un animal no humano que está estrechamente relacionado con el animal manipulado por ingeniería genetica que tiene el defecto de la fertilidad. Por ejemplo, donde el animal manipulado por ingeniería genética es un ratón de una cepa particular, un ortólogo o un homólogo de ADAM6 o un fragmento funcional del mismo puede obtenerse de un ratón de otra cepa, o de un ratón de una especie relacionada. En una modalidad, donde el animal manipulado por ingeniería genética que comprende el defecto de la fertilidad es del orden Rodentia, el ortólogo o el homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de otro animal del orden Rodentia. En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética que comprende el defecto de la fertilidad es de un suborden Myomoropha (por ejemplo, jerbos, ratones saltadores, hámsteres similares al ratón, hámsteres, ratas y ratones New World, campañoles, ratones y ratas verdaderas, ratones espinosos, ratas de crin, ratones escaladores, ratones de rocas, ratas de cola blanca, ratas y ratones malgaches, lirones espinosos, ratas marsupiales, ratas de bambú, zokor), y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo se selecciona de un animal del orden Rodentia, o del suborden Myomorpha.

En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética es de la superfamilia Dipodoidea, y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia Muroidea. En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética es de la superfamilia Muroidea, y el el ortólogo o el homólogo de ADAM6 o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia Dipodoidea.

En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genetica es un roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de una diferente especie dentro de la superfamilia Muroidea. En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares al ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones New World, campañoles), Muridae (ratones y ratas verdaderas, jerbos, ratones espinosos, ratas de crin), Nesomyidae (ratones escaladores, ratones de rocas, ratas de cola blanca, ratas y ratones malgaches), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas marsupiales, ratas de bambú, y zokor); y el ortólogo o el homólogo ADAM6 se selecciona de una diferente especie de la misma familia. En una modalidad específica, el roedor manipulado por ingeniería genética se selecciona de un ratón o de una rata verdadera (familia Muridae), y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de una especie seleccionada de un jerbo, de un ratón espinoso, o de una rata de crin. En una modalidad, el ratón manipulado por ingeniería genética es un miembro de la familia Muridae, y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de una diferente especie de la familia Muridae. En una modalidad específica, el roedor manipulado por ingeniería genética es un ratón de la familia Muridae, y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de una rata, de un jerbo, de un ratón espinoso, o de la rata de crin de la familia Muridae.

En varias modalidades, uno o más ortólogos u homólogos ADAM6 de roedor o fragmentos funcionales del mismo de un roedor en una familia restauran la fertilidad para un roedor manipulado por ingeniería genetica de la misma familia que carece de un ortólogo o un homólogo de ADAM6 (por ejemplo, Cricetidae (por ejemplo, hámsteres, ratas y ratones New World, campañoles); Muridae (por ejemplo, ratones y ratas verdaderas, jerbos, ratones espinosos, ratas de crin)).

En varias modalidades, los ortólogos, los homólogos de ADAM6, y los fragmentos del mismo son evaluados por la funcionalidad al comprobar si el ortólogo, homólogo, o el fragmento restaura la fertilidad para un animal no humano macho manipulado por ingeniería genética que carece de la actividad de ADAM6 (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata, que comprende un noqueo (knockout) de ADAM6 o de su ortólogo). En varias modalidades, la funcionalidad se define como la capacidad de una esperma de un animal manipulado por ingeniería genética que carece de un ADAM6 endógeno o un ortólogo o un homólogo del mismo para emigrar a un oviducto y para fertilizar un ovulo de la misma especie del animal manipulado por ingeniería genética.

En varios aspectos, pueden generarse los ratones que comprenden las deleciones o los reemplazos del locus de región variable endógeno de cadena pesada o las porciones del mismo los cuales contienen una secuencia nucleotídica ectópica que codifica una proteína que confiere los beneficios de fertilidad similares al ADAM6 murino (por ejemplo, un ortólogo o un homólogo o un fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho). La secuencia nucleotídica ectópica puede incluir una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que es un homólogo o un ortólogo de ADAM6 (o fragmento del mismo) de una diferente cepa de ratón o de una diferente especie, por ejemplo, una diferente especie de roedor, y que confiere un beneficio de fertilidad, por ejemplo, un número creciente de crías durante un periodo especificado, y/o un número creciente de crías por camada, y/o la capacidad de una celula de esperma de un ratón macho de cruzar a través de un oviducto de ratón para fertilizar un ovulo de ratón.

En una modalidad, el ADAM6 es un homólogo o un ortólogo que es por lo menos 89% a 99% idéntico a una proteína ADAM6 murina (por ejemplo, por lo menos 89% a 99% idéntico a ADAM6a murina o ADAM6b murina). En una modalidad, la secuencia nucleotídica ectópica codifica una o más proteínas seleccionadas independientemente de una proteína por lo menos 89% idéntica a ADAM6a murina, de una proteína por lo menos 89% idéntica a ADAM6b murina, y de una combinación de las mismas. En una modalidad, el homólogo o el ortólogo es una proteína de rata, hámster, ratón, o cobayo que se modifica para que sea aproximadamente 89% o más idéntica a ADAM6a murina y/o ADAM6b murina. En una modalidad, el homólogo o el ortólogo por lo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una ADAM6a murina y/o una ADAM6b murina.

ADAM6 ectópico en ratones de cadena pesada humanizados Los progresos en el direccionamiento genico, por ejemplo, el desarrollo de cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés), ahora permiten la recombinación de fragmentos genómicos relativamente grandes. La ingeniería de BAC ha permitido la capacidad de hacer deleciones grandes, e inserciones grandes, en las células ES murinas.

Los ratones que generan los anticuerpos humanos han estado disponibles desde hace algún tiempo. Aunque representan un avance importante en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos, estos ratones muestran un número de anormalidades significativas que limitan su utilidad. Por ejemplo, muestran el desarrollo de células B comprometido. El desarrollo comprometido puede ser debido a una variedad de diferencias entre los ratones transgénicos y los ratones de tipo silvestre.

Los anticuerpos humanos no pudieron interactuar de manera óptima con los receptores de células pre-B o de células B en la superficie de las células murinas que se señalan para la maduración, la proliferación, o la supervivencia durante la selección clónica. Los anticuerpos completamente humanos no pudieron interactuar de manera óptima con un sistema de receptor Fe murino; los ratones expresan los receptores Fe que no muestran una correspondencia individual con los receptores Fe humanos. Finalmente, varios ratones que general los anticuerpos completamente humanos no incluyen todas las secuencias murinas genumas, por ejemplo, los elementos intensificadores hacia 5’ y otros elementos de control de locus, que pueden requerirse para el desarrollo de células B naturales.

Los ratones que generan los anticuerpos completamente humanos generalmente comprenden los loci endógenos de inmunoglobulina que se inhabilitan de cierta manera, y los transgenes humanos que comprenden los segmentos génicos de inmunoglobulina variables y constantes se introducen en una ubicación aleatoria en el genoma murino. Mientras el locus endógeno esté suficientemente inhabilitado para no reordenar los segmentos génicos para formar un gen de inmunoglobulina funcional, el objetivo de generar los anticuerpos completamente humanos en tal ratón puede lograrse, no obstante, con el desarrollo de células B comprometido.

Aunque no se requiere generar los anticuerpos completamente humanos del locus transgénico humano, generar los anticuerpos humanos en un ratón es al parecer un proceso no favorecido. En algunos ratones, el proceso es tan no favorecido que resulta en la formación de cadenas pesadas variables humanas/constantes murinas quiméricas (pero no cadenas ligeras) a través del mecanismo de transconmutación. Por medio de este mecanismo, las transcripciones que codifican los anticuerpos completamente humanos experimentan la conmutación isotípica en trans del isotipo humano a un isotipo murino. El proceso está en trans, debido a que el transgén completamente humano se ubica separado del locus endógeno que conserva una copia indemne de un gen de región constante de cadena pesada murino. Aunque en tales ratones la transconmutación es fácilmente evidente, el fenómeno es todavía escaso para rescatar el desarrollo de celulas B, que permanece francamente deteriorado. En cualquier caso, los anticuerpos transconmutados generados en tales ratones conservan las cadenas ligeras completamente humanas, puesto que el fenómeno de la transconmutación no ocurre al parecer con respecto a las cadenas ligeras; la transconmutación se basa probablemente en las secuencias de conmutación en los loci endógenos usados (no obstante de manera diferente) en la conmutación isotípica normal en cis. Así, incluso cuando los ratones alterados para generar los anticuerpos completamente humanos seleccionan un mecanismo de transconmutación para generar los anticuerpos con regiones constantes murinas, la estrategia es aún insuficiente para rescatar el desarrollo de células B normal.

Una preocupación primaria en la generación de los terapéuticos humanos a base de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti patógeno, es identificar los los dominios variables útiles que reconocen específicamente los epítopos particulares y unirlos con una afinidad deseable, generalmente — pero no siempre— con alta afinidad. Los ratones tal como se describe en el presente documento, que contienen un reemplazo exacto de las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinas con un número restringido de segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanos en los loci endógenos murinos, muestran casi el desarrollo de células B natural y las regiones variables generadas en respuesta a la inmunización son completamente humanos, donde las cadenas pesadas se derivan de un solo segmento genico VH humano. Así, tales ratones proporcionan una plataforma para generar un panel de regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de cadena pesada que se dirigen específicamente para unir un antígeno dado, por ejemplo, un virus patógeno.

Los ratones tal como se describe en el presente documento contienen un reemplazo a gran escala exacto de los loci génicos variables de línea germinal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina ( I g H ) con un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humano restringido, y de la cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, la cadena ligera K) con un locus génico variable de cadena ligera k de inmunoglobulina humano equivalente, en los loci endógenos. Este reemplazo exacto da lugar a un ratón con los loci de inmunoglobulina híbridos que generan las cadenas pesadas y ligeras que tienen las regiones variables humanas y una región constante murina. El reemplazo exacto de los segmentos VH-DH-JH y VK-JK murinos dejan las secuencias murinas de flanqueo intactas y funcionales en los loci de inmunoglobulina híbridos. El sistema inmunológico humoral del ratón funciona como aquel de un ratón de tipo silvestre. El desarrollo de células B no está obstruido en cualquier aspecto significativo y un panel mutado de manera somática de las CDR de cadena pesada humanas se genera en el ratón tras la exposición al antígeno.

Los ratones tal como se describe en el presente documento son posibles debido a que los segmentos genicos de inmunoglobulina para las cadenas pesadas y ligeras k se reordenan de manera similar en humanos y en ratones, que no es decir que sus loci son iguales o incluso casi iguales — claramente no lo son. Sin embargo, los loci son bastante similares que la humanización del locus génico variable de cadena pesada puede obtenerse al reemplazar aproximadamente tres millones de pares bases de la secuencia murina contigua que contiene todos los segmentos génicos VH, DH, y JH con una secuencia genómica humana contigua que contiene un locus de cadena pesada humano restringido.

En algunas modalidades, el reemplazo adicional de ciertas secuencias génicas de región constante murinas con la secuencias génicas humanas (por ejemplo, el reemplazo de la secuencia CH1 murina con la secuencia CH1 humana, y el reemplazo de la secuencia CL murina con la secuencia CL humana) resulta en los ratones con los loci de inmunoglobulina híbridos que generan los anticuerpos que tienen las regiones variables humanas y las regiones constantes parcialmente humanas, convenientes, por ejemplo, que generan los fragmentos de anticuerpo completamente humanos, por ejemplo, Fab completamente humano. Los ratones con loci de inmunoglobulina híbridos muestran el reordenamiento de segmento génico variable normal, frecuencias de hipermutación somática normales, y conmutación de clase normal. Estos ratones exhiben un sistema inmunológico humoral que es indistinguible de los ratones de tipo silvestre, y muestran las poblaciones de celulas normales en todas las etapas de desarrollo de células B y las estructuras orgánicas linfoides normales — incluso donde los ratones carecen de un repertorio completo de los segmentos génicos de región variable humanos. La inmunización de estos ratones da lugar a las respuestas humorales robustas que muestran una diversidad amplia de las CDR de cadena pesada y del uso de segmento génico variable de cadena ligera.

El reemplazo exacto de los segmentos génicos de región variable de línea germinal murinos permite generar los ratones que tienen los loci de inmunoglobulina parcialmente humanos. Debido a que los loci de inmunoglobulina parcialmente humanos se reordenan, hipermutan, y conmutan de clase normalmente, los loci de inmunoglobulina parcialmente humanos generan los anticuerpos en un ratón que comprende las regiones variables humanas. Las secuencias de nucleótido que codifican las regiones variables pueden identificarse y clonarse, después fusionarse (por ejemplo, en un sistema in vitro) con cualquier secuencia de elección, por ejemplo, cualquier isotipo de inmunoglobulina conveniente para un uso particular, dando por resultado una proteína de unión al anticuerpo o al antígeno derivada completamente de las secuencias humanas.

La humanización a gran escala mediante los métodos de recombinación se usó para modificar los embriocitoblastos (ES, por sus siglas en inglés) murinos para reemplazar de manera exacta hasta tres megabases de locus de inmunoglobulina de cadena pesada murino que incluyen esencialmente todos los segmentos genicos VH, DH, y JH murinos con una secuencia genómica humana que contiene un locus de cadena pesada humano restringido que incluye un solo segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos. Hasta medio segmento de megabase del genoma humano que comprende una de dos repeticiones que codifican esencialmente todos los segmentos génicos VK y JK humanos fue usado para reemplazar un tercio de segmento megabase del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina murino que contiene esencialmente todos los segmentos génicos VK y JK murinos.

Los ratones con tales loci de inmunoglobulina reemplazados pueden comprender una interrupción o una deleción del locus ADAM6 endógeno murino, que se encuentra normalmente entre el segmento génico VH más cercano a 3' y segmento génico de DH más cercano a 5’ en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina murino. La interrupción en esta región puede llevar a la reducción o a la eliminación de la funcionalidad del locus ADAM6 endógeno murino. Si uno, o ambos, de los segmentos génicos VH más cercanos a 3' del repertorio de cadena pesada humano se usan en la construcción del locus de cadena pesada humano restringido, una región intergénica que contiene un pseudogén que parece ser un pseudogén ADAM6 humano está presente entre estos segmentos génicos VH, es decir, entre VH1 -2 y VH1 -6 humano. Sin embargo, los ratones machos que comprenden esta secuencia intergénica humana muestra una reducción en la fertilidad (consultar USSN 13/404.075).

Se describen los ratones que comprenden la cadena pesada humana restringida y los loci de cadena ligera k humanos equivalentes como se describió anteriormente, y que tambien comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica un ADAM6 murino, donde los ratones muestran la fertilidad esencialmente normal. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico ectópica comprende una secuencia ADAM6a y/o ADAM6b murina o los fragmentos funcionales de la misma colocada entre un VH1 -69 humano y un DH1 -1 humano en un locus endógeno de cadena pesada modificado. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico ectópica es SEQ ID NO: 77, colocada entre un VH1 -69 humano y un DH1 -1 humano en un locus endógeno de cadena pesada modificado. La dirección de transcripción de los genes ADAM6 de SEQ ID NO: 77 es opuesta con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos circundantes. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico ectópica comprende una secuencia ADAM6a murina y/o ADAM6b murina o fragmentos funcionales de la misma colocada secuencia arriba (o 5') de un segmento génico VH1 -2 humano en un locus endógeno de cadena pesada modificado. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico ectópica es SEQ ID NO: 73, colocada secuencia arriba (o 5') de un segmento génico VH1 -2 humano en un locus endógeno modificado de cadena pesada. La dirección de transcripción de los genes ADAM6 de SEQ ID NO: 73 es opuesta con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos genicos humanos circundantes (por ejemplo, un segmento génico VH1 -2 humano).

Aunque los ejemplos en el presente documento muestran el rescate de la fertilidad al colocar la secuencia ectópica entre los segmentos génicos humanos indicados, los expertos reconocerán que la colocación de la secuencia ectópica en cualquier locus permisivo conveniente de manera transcriptiva en el genoma murino (o incluso de manera extracromosómica) se esperará la fertilidad similarmente rescatada en un ratón macho.

El fenómeno de complementar un ratón que carece de un locus ADAM6 funcional con una secuencia ectópica que comprende un gen ADAM6 murino u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo es un método general que es aplicable para rescatar cualquier ratón con los loci ADAM6 endógenos no funcionales o mínimamente funcionales. Así, muchos ratones que comprenden una modificación por interrupción de ADAM6 del locus de cadena pesada de inmunoglobulina pueden rescatarse con las composiciones y los métodos de la invención. Por consiguiente, la invención comprende ratones con una gran variedad de modificaciones de los loci de cadena pesada de inmunoglobulina que comprometen la función de ADAM6 endógeno. Algunos ejemplos (no limitantes) se proporcionan en esta descripción. Además de los ratones descritos, las composiciones y los métodos relacionados con ADAM6 pueden usarse en muchas aplicaciones, por ejemplo, al modificar un locus de cadena pesada en una gran variedad de maneras.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la mismo), un reemplazo todos o sustancialmente todos los segmentos genicos VH murinos con un solo segmento génico VH humano, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y los segmentos génicos JH murinos con los segmentos génicos DH y JH humanos; donde el ratón carece de una región CH1 y/o bisagra. En una modalidad, el ratón produce un solo dominio variable que une a la proteína que es un dímero de las cadenas de inmunoglobulina seleccionadas: (a) VH humano-CH1 murino-CH2 murino-CH3 murino, (b) VH humano-bisagra murina-CH2 murino-CH3 murino; y, (c) VH humano-CH2 murino-CH3 murino.

En un aspecto, la secuencia nucleotídica que rescata la fertilidad se coloca secuencia arriba (o 5') de una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana (por ejemplo, hacia 5’ desde un segmento génico VH1 -2 o VH1 -69 humano) en un ratón que tiene un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinos (mVH, mDH, y/o mJH) con uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanos (hVH, hDH, y/o hJH), y el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina murinos (mWx y/o ITIJK) con uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humanos (h /k y/o hJK).

En un aspecto, la secuencia nucleotídica que rescata la fertilidad se coloca dentro de una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana (por ejemplo, entre VH1 -69 humano o VH1 -2 humano y un segmento genico DH1 -1 humano) en un ratón que tiene un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinos (mVH, mDH, y/o mJH) con uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanos (hVH, hDH, y/o hJH), y el ratón además comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera de inmunoglobulina murinos (m / y/o mJK) con uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera de inmunoglobulina humanos (h /k y/o hÜK).

En una modalidad, uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinos comprenden aproximadamente tres megabases del locus de cadena pesada de inmunoglobulina murino. En una modalidad, uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinos comprenden por lo menos 89 segmentos génicos VH, por lo menos 13 segmentos génicos DH, por lo menos cuatro segmentos génicos JH o una combinación de los mismos del locus de cadena pesada de inmunoglobulina murino. En la modalidad, uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanos comprenden un número restringido (por ejemplo, uno, dos o tres) de los segmentos génicos VH, por lo menos 27 segmentos génicos DH, por lo menos seis segmentos génicos JH O una combinación de los mismos de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humano. En una modalidad específica, el número restringido de segmentos genicos VH humanos es uno.

En una modalidad, uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina murinos comprenden aproximadamente tres megabases del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina murino. En una modalidad, uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina murinos comprenden por lo menos 137 segmentos génicos VK, por lo menos cinco segmentos génicos J K O una combinación de los mismos del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina murino. En una modalidad, uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humanos comprenden aproximadamente media megabase de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humano. En una modalidad específica, uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humanos comprenden la repetición próxima (con respecto a la región constante de inmunoglobulina K) de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humano. En una modalidad, uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina humanos comprenden por lo menos 40 segmentos génicos VK, por lo menos cinco segmentos génicos J K O una combinación de los mismos de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humano.

En una modalidad, la secuencia nucleotídica se ubica entre dos segmentos génicos de inmunoglobulina humanos. En una modalidad específica, los dos segmentos genicos de inmunoglobulina humanos son los segmentos génicos de cadena pesada. En una modalidad, la secuencia nucleotídica se ubica entre un segmento génico VH1 -69 humano y un segmento génico DH1 -1 humano. En una modalidad, la secuencia nucleotídica se ubica entre un segmento génico VH1 -2 humano y un segmento génico DH1 -1 humano. En una modalidad, el ratón modificado de tal manera comprende un reemplazo de los segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinos con un solo segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos, y un reemplazo de los segmentos génicos variables de cadena ligera k de inmunoglobulina murinos con por lo menos 40 segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos J humanos.

En un aspecto, un locus ADAM6 murino funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en el medio de los segmentos génicos murinos que están presentes en el locus endógeno de región variable de cadena pesada murino, dicho locus es incapaz de reordenarse para codificar una cadena pesada funcional que contiene una región constante endógena de cadena pesada. En una modalidad, el locus endógeno de cadena pesada murino comprende por lo menos uno y hasta 89 segmentos génicos VH, por lo menos uno y hasta 13 segmentos génicos DH, por lo menos uno y hasta cuatro segmentos génicos JH y una combinación de los mismos. En varias modalidades, un locus ADAM6 murino funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) codifica una o más proteínas ADAM6 que son funcionales en el ratón, donde una o más proteínas ADAM6 comprenden la SEQ ID NO: 1 , SEC ID NO; 2 y/o una combinación de las mismas.

En un aspecto, un locus ADAM6 murino funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en el medio de los segmentos génicos humanos que reemplazan los segmentos génicos endógenos murinos. En una modalidad, por lo menos 89 segmentos génicos VH murinos se eliminan y se reemplazan por uno, dos o tres segmentos génicos VH humanos, y el locus ADAM6 murino está presente inmediatamente adyacente al extremo 3’ de los segmentos génicos VH humanos, o entre dos segmentos génicos VH humanos. En una modalidad, por lo menos 89 segmentos génicos VH murinos se eliminan y se reemplazan por un solo segmento génico VH humano, y el locus ADAM6 murino está presente inmediatamente adyacente el extremo 3’ del segmento génico VH humano. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino está presente en 3' del segmento génico VH en aproximadamente 20 kilobases (kb, por sus siglas en inglés) a aproximadamente 40 kilobases (kb, por sus siglas en inglés) del extremo 3’ del segmento génico VH humano insertado. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino está presente en 3' del segmento génico VH en aproximadamente 29 kb a aproximadamente 31 kb del extremo 3’ del segmento génico VH humano insertado. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino está presente en aproximadamente 30 kb del extremo 3’ del segmento génico VH humano insertado. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino está presente en aproximadamente 30, 184 bp del extremo 3' del segmento genico VH humano insertado.

En una modalidad específica, el reemplazo incluye los segmentos génicos VH1-69 y DH1 -1 humanos, y el locus ADAM6 murino está presente hacia 3’ del segmento génico VH1 -69 y hacia 5’ desde el segmento génico DH 1 - 1 - En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino está presente entre un segmento génico VH1 -69 humano y un segmento génico DH1 -1 humano, donde el extremo 5' del locus ADAM6 murino es de aproximadamente 258 pb desde el extremo 3' del segmento génico VH1 -69 humano y el extremo 3' del locus ADAM6 es de aproximadamente 3,263 bp desde el extremo 5' del segmento génico DH1 -1 humano. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino comprende la SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma que confiere la función de ADAM6 dentro de las células del ratón. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino comprende la SEQ ID NO: 73 o un fragmento de la misma que confiere la función de ADAM6 dentro de los células del ratón. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino comprende la SEQ ID NO: 77 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En una modalidad específica, el reordenamiento de los segmentos génicos humanos es entonces el siguiente (desde 5’ hasta 3’ con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos): VH1 -69 humano— locus ADAM6 murino— DH1 -1 humano. En una modalidad, la orientación de uno o más de ADAM6a murino y de ADAM6b murino del locus ADAM6 murino es opuesta con respecto a la dirección de transcripción con respecto a la orientación de los segmentos genicos humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 murino está presente en 5\ o secuencia abajo de, un solo segmento génico VH humano.

En una modalidad específica, el reemplazo incluye los segmentos génicos VH1 -2 y DH1 -1 humanos, y el locus ADAM6 murino está presente hacia 5’ desde el segmento génico VH1 -2 y hacia 5’ desde el segmento génico DH1 -1. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino está presente secuencia arriba, o 5', de un segmento génico VH1 -2 humano y de un segmento génico DH1 -1 humano, donde el extremo 5’ del locus ADAM6 murino es de aproximadamente 32,833 bp desde el extremo 5' del segmento génico VH 1 -2 humano y el extremo 3' del locus ADAM6 es de aproximadamente 18,078 bp desde el extremo 5' del segmento génico VH 1 -2 humano. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino comprende la SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma que confiere la función de ADAM6 dentro de las células del ratón. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino comprende la SEQ ID NO: 73 o un fragmento de la misma que confiere la función de ADAM6 dentro de los células del ratón. En una modalidad específica, el locus ADAM6 murino comprende la SEQ ID NO: 77 o un fragmento de la misma que confiere la función de ADAM6 dentro de las células del ratón. En una modalidad específica, el reordenamiento de los segmentos génicos humanos es entonces el siguiente (desde 5’ a 3’ con respecto a la dirección de transcripción de los segmentos genicos humanos): locus ADAM6 murino-VH1 -2 humano-DH1 -1 humano. En una modalidad, la orientación de uno o más de ADAM6a murino y de ADAM6b murino del locus ADAM6 murino es opuesta con respecto a la dirección de transcripción con respecto a la orientación de los segmentos génicos humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 murino está presente en 3', o secuencia abajo, de un solo segmento génico VH humano.

Similarmente, un ratón modificado con uno o más segmentos génicos VL humanos (por ejemplo, los segmentos VK O VA) reemplazando todos o sustancialmente todos los segmento génicos VH endógenos murinos puede modificarse para ya sea mantener el locus ADAM6 endógeno murino, tal como se describió anteriormente, por ejemplo, al emplear un vector dirigido que tiene una ramificación de homología hacia 3’ que incluye un locus ADAM6 murino o un fragmento funcional del mismo, o reemplazar un locus ADAM6 murino dañado por una secuencia ectópica ubicada entre dos segmentos génicos VL humanos o entre los segmentos génicos VL humanos y un segmento génico DH (si A es humano o murino, por ejemplo, VA + m/hDH), o un segmento génico J (ya sea humano o murino, por ejemplo, VK + JH). En una modalidad, el reemplazo incluye dos o más segmentos génicos VL humanos, y el locus ADAM6 murino o el fragmento funcional del mismo está presente entre los dos segmentos génicos VL más cercanos a 3’. En una modalidad específica, el reordenamiento de los segmentos génicos VL humanos es entonces el siguiente (de 5’ a 3’ con respecto a ia dirección de transcripción de los segmentos génicos humanos): VL3'-1 humano— locus ADAM6 murino— VL3' humano. En una modalidad, la orientación de uno o más de ADAM6a murino y de ADAM6b murino del locus ADAM6 murino es opuesta con respecto a la dirección de transcripción con respecto a la orientación de los segmentos génicos VL humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 murino está presente en la región intergénica entre el segmento génico VL más cercano a 3’ y el segmento génico DH más cercano a 5’. Éste puede ser el caso si el segmento génico DH más cercano a 5’ es murino o humano.

En un aspecto, un ratón se proporciona con un reemplazo de uno o más segmentos génicos VH endógenos murinos, y que comprende por lo menos un segmento génico DH endógeno murino. En tal ratón, la modificación de los segmentos génicos VH endógenos murinos puede comprender una modificación de uno o más de los segmentos génicos de VH más cercanos a 3', pero no el segmento génico DH más cercano a 5’, donde se tiene cuidado para que la modificación de uno o más segmentos génicos de VH cercanos a 3' no interrumpa ni haga al locus ADAM6 endógeno murino no funcional. Por ejemplo, en una modalidad el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos murinos con un solo segmento génico VH humano, y el ratón comprende uno o más segmentos génicos DH endógenos y un locus ADAM6 endógeno murino funcional.

En otra modalidad, el ratón comprende la modificación del ratón endógeno los segmentos génicos de VH más cercanos a 3' endógenos murinos, y una modificación de uno o más segmentos génicos DH endógenos murinos, y la modificación se realiza para mantener la integridad del locus ADAM6 endógeno murino hasta el punto de que el locus endógeno ADAM6 siga siendo funcional. En un ejemplo, tal modificación se realiza en dos etapas: (1 ) reemplazar los segmentos génicos de VH endógenos murinos más cercanos a 3' con un solo segmento génico VH empleando un vector dirigido con una ramificación de homología hacia 5’ y una ramificación de homología hacia 3’ donde la ramificación de homología incluye todo o una porción de un locus ADAM6 murino funcional; (2) después reemplazar el segmento génico DH endógeno murino con un vector dirigido que tiene una ramificación de homología hacia 5' que incluye todo o una porción funcional de un locus ADAM6 murino.

En varios aspectos, emplear los ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 murina u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma es útil donde las modificaciones interrumpen la función de ADAM6 endógeno murino. La probabilidad de interrumpir la función de ADAM6 endógeno murino es alta al realizar la modificaciones a los loci de inmunoglobulina murinos, particularmente al modificar las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinas y las secuencias circundantes. Por lo tanto, tales ratones proporcionan el beneficio particular de al generar los ratones con los loci de cadena pesada de inmunoglobulina que se eliminan en su totalidad o parcialmente, se humanizan de manera completa o parcial, o se reemplazan (por ejemplo, con las secuencias VK O VA) de manera completa o parcial. Los metodos para generar las modificaciones genéticas descritas para los ratones descritos más adelante son conocidos para los expertos en la téenica.

Los ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 murina, o una proteína sustancíalmente idéntica o similar que confiere los beneficios de fertilidad de una proteína ADAM6 murina, son particularmente útiles en combinación con las modificaciones a un locus génico variable de cadena pesada de inmunoglobulina murino que interrumpen o eliminan la secuencia ADAM6 endógena murina. Aunque se describen principalmente con respecto a los ratones que expresan los anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes murinas, tales ratones son útiles con respecto a cualquier modificación genética que interrumpa los genes ADAM6 endógenos murinos. Los expertos reconocerán que estos comprenden una gran variedad de ratones manipulados por ingeniería genética que contienen las modificaciones de los loci génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina murinos. Éstos incluyen, por ejemplo, ratones con una deleción o un reemplazo de todos o de una porción de los segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina murinos, sin importar otras modificaciones. Los ejemplos no limitantes se describen posteriormente.

En algunos aspectos, se proporcionan los ratones manipulados por ingeniería genetica que comprenden un gen ADAM6 ectópico de ratón, roedor, u otro (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) en un ratón, y uno o más segmentos génicos de región variable y/o constante de inmunoglobulina humanos. En varias modalidades, otros ortólogos o homólogos o fragmentos funcionales del gen ADAM6 en un ratón pueden incluir las secuencias de bovinos, canino, primates, conejos o de otros animales no humanos.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ADAM6 ectópica que codifica una proteína ADAM6 funcional, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH murinos con un solo segmento génico VH humano; un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos DH murinos con uno o más segmentos génicos DH humanos; y un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos JH murinos con uno o más segmentos génicos JH humanos.

En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de una secuencia nucleotídica CH1 murina con una secuencia nucleotídica CH1 humana. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de una secuencia nucleotídica bisagra murina con una secuencia nucleotídica bisagra humana. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL y JL) con un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina humano. En una modalidad, el ratón además comprende un reemplazo de una secuencia nucleotídica de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina murina con una secuencia nucleotídica de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, VL, JL, y CL son las secuencias de cadena ligera k de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el ratón comprende una secuencia de región constante de inmunoglobulina CH2 murina y CH3 murina fusionadas con una secuencia bisagra humana y CH1 humana, de tal manera que los loci de inmunoglobulina murinos se reordenen para formar un gen que codifica una proteína de unión que comprende (a) una cadena pesada que tiene una región variable humana, una región CH1 humana, una región bisagra humana, y una región CH2 murina y CH3 murina; y (b) un gen que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable humano y una región constante humana.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica ADAM6 que codifica una proteína ADAM6 funcional, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos genicos VH murinos con uno o más segmentos génicos VL humanos, y opcionalmente un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y/o los segmentos génicos JH con uno o más segmentos génicos DH humanos y/o segmentos génicos JH humanos, u opcionalmente un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad los segmentos génicos DH y los segmentos génicos JH con uno o más segmentos génicos JL humanos.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad los segmentos genicos VH, DH , y JH murinos con uno o más segmentos génicos VL, DH, y J (por ejemplo, J K O JA), donde los segmentos génicos se ligan de manera operable a una región bisagra endógena murina, donde el ratón forma un gen de cadena de inmunoglobulina rearreglado que contiene, desde 5' a 3' en la dirección de transcripción, VL humano-DH humano o murino-J humano o murino-bisagra murina-CH2 murino-CH3 murino. En una modalidad, la región J es una región JK humana. En una modalidad, la región J es una región JH humana. En una modalidad, la región J es una región JA humana. En una modalidad, la región VL humana se selecciona de una región VA humana y de una región VK humana.

En las modalidades específicas, el ratón expresa un solo anticuerpo de dominio variable que tiene una región constante murina o humana y una región variable derivada de un VK humano, un DH humano y un JK humano; un VK humano, un DH humano, y un JH humano; un VK humano, un DH humano, y un JA humano; un VA humano, un DH humano, y un JH humano; un VK humano, un DH humano, y un JAhumano; un VA humano, un DH humano, y un JK humano. En la modalidad específica, las secuencias de reconocimiento de recombinación se modifican para permitir que los reordenamientos productivos ocurran entre los segmentos génicos V, D, y J citados o entre los segmentos génicos V y J citados.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica ADAM6 que codifica una proteína ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad los segmentos genicos VH murinos con uno o más segmentos génicos VL humanos, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmento génicos DH y los segmentos génicos JH murinos con los segmentos génicos JL humanos; donde el ratón carece de una región CH1 y/o bisagra.

En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio CH1 - En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica una región bisagra. En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio CH1 y una región bisagra.

En una modalidad específica, el ratón expresa una proteína de unión que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humano (l o K) fusionado a un dominio CH2 murino que se une a un dominio CH3 murino.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica ADAM6 que codifica una proteína ADAM6 funcional (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma), un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH murinos con uno o más segmentos génicos VL humanos, un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y JH murinos con los segmentos génicos JL humanos.

En una modalidad, el ratón comprende una deleción de una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que codifica una región CH1 , una región bisagra, una región CH1 y una región bisagra, o una región CH1 y una región bisagra y una región CH2.

En una modalidad, el ratón genera una sola proteína de unión al dominio variable que comprende un homodímero seleccionado de los siguientes: (a) VL humano— CH1 murino— CH2 murino— CH3 murino; (b) VL humano— bisagra murina— CH2 murino— CH3 murino; (c) VL humano — CH2 murino— CH3 murino.

En un aspecto, se proporciona un ratón con un locus endógeno de inmunoglobulina de cadena pesada desactivado, que comprende un locus ADAM6 endógeno desactivado o eliminado, donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa el anticuerpo humano o murino o humano/murino u otro anticuerpo quimerico. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está presente en un transgén integrado que se integra aleatoriamente en el genoma murino. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un episoma (por ejemplo, un cromosoma) no encontrado en un ratón de tipo silvestre.

En una modalidad, el ratón además comprende un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina desactivado. En una modalidad específica, el locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina se selecciona de un locus de cadena ligera kappa (K) y lambda (l). En una modalidad específica, el ratón comprende un locus endógeno de cadena ligera k desactivado y un locus de cadena ligera k desactivado, donde el ratón expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humano y un dominio de cadena ligera de inmunoglobulina humano. En una modalidad, el dominio de cadena ligera de inmunoglobulina humano se selecciona de un dominio de cadena ligera k humano y de un dominio de cadena ligera l humano.

En un aspecto, se proporciona un animal manipulado por ingeniería genetica que expresa un anticuerpo quimérico y expresa una proteína ADAM6 o un ortólogo o un homólogo de la misma que es funcional en el animal manipulado por ingeniería genética.

En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética se selecciona de un ratón y de una rata. En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética es un ratón, y la proteína ADAM6 o el ortólogo o el homólogo de la misma es de una cepa de ratón que es una cepa diferente que el animal manipulado por ingeniería genética. En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética es un roedor de la familia Cricetidae (por ejemplo, un hámster, una rata o ratón New World, un campañol), y el ortólogo o el homólogo de la proteína ADAM6 es de un roedor de la familia Muridae (por ejemplo, ratón o rata verdadera, jerbo, ratón espinoso, rata de crin). En una modalidad, el animal manipulado por ingeniería genética es un roedor de la familia Muridae, y el ortólogo o el homólogo de la proteína ADAM6 es de un roedor de la familia Cricetidae.

En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable humano y una secuencia de región constante de un roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona de un roedor de la familia Cricetidae y de un roedor de la familia Muridae. En una modalidad específica, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es un ratón. En una modalidad específica, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es una rata en una modalidad, el anticuerpo quimerico comprende un dominio variable humano y un dominio constante de un animal que se selecciona del grupo que consiste de un ratón o de una rata; en una modalidad específica, el ratón o la rata se selecciona de la familia Cricetidae y de la familia Muridae. En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable de cadena pesada humano, un dominio variable de cadena ligera humano y una secuencia de región constante derivada de un roedor que se selecciona del grupo que consiste de ratón y de rata, donde el dominio variable de cadena pesada humano y de cadena ligera humano están cognados. En una modalidad específica, el cognado incluye que los dominios variables de cadena pesada humanos y de cadena ligera humanos son de una sola célula B que expresa el dominio variable de cadena ligera humano y el dominio variable de cadena pesada humano juntos y presenta los dominios variables juntos en la superficie de una célula B individual.

En una modalidad, el anticuerpo quimérico se expresa de un locus de inmunoglobulina. En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico se expresa de un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina rearreglado. En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimerico se expresa de un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina rearreglado. En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico y/o el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresan de un transgén rearreglado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico rearreglada derivada de una secuencia de ácido nucleico no rearreglada integrada en el genoma del animal en un locus distinto de un locus endógeno de inmunoglobulina). En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa de un transgén rearreglado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico rearreglada derivada de una secuencia de ácido nucleico no rearreglada integrada en el genoma del animal en un locus distinto de un locus endógeno de inmunoglobulina).

En una modalidad específica, el transgén se expresa de un locus activo de manera transcriptiva, por ejemplo, un locus ROSA26, por ejemplo, un locus ROSA26 murino (por ejemplo, de ratón).

En un aspecto, se proporciona un animal no humano, que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado, donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado comprende una secuencia ADAM6 no humana o un ortólogo o un homólogo de la misma.

En una modalidad, el ortólogo o el homólogo de ADAM6 no humano es una secuencia que es ortólogo y/u homologa a una secuencia ADAM6 murina, donde el ortólogo o el homólogo es funcional en el animal no humano.

En una modalidad, el animal no humano es un roedor que se selecciona del grupo que consiste de un ratón, de una rata, y de un hámster.

En una modalidad, el animal no humano se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de un animal no humano que se selecciona del grupo que consiste de un ratón, una rata, y un hámster. En una modalidad específica, el animal no humano es un ratón y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de un animal que se selecciona de una diferente especie murina, una rata, y un hámster. En la modalidad específica, el animal no humano es una rata, y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de un roedor que se selecciona de una diferente especie a la rata, un ratón, y un hámster. En una modalidad específica, el animal no humano es un hámster, y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de un roedor que se selecciona de una diferente especie al hámster, un ratón, y una rata.

En una modalidad específica, el animal no humano es del suborden Myomorpha, y la secuencia ADAM6 es de un animal que se selecciona del grupo que consiste de un roedor de la superfamilia Dipodoidea y de un roedor de la superfamilia Muroidea. En una modalidad específica, el roedor es un ratón de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo o el homólogo de ADAM6 es de un ratón o de una rata o de un hámster de la superfamilia Muroidea.

En una modalidad, el locus de cadena pesada humanizado comprende un solo segmento génico VH humano, uno o más segmentos genicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH humanos. En una modalidad específica, el segmento génico VH humano, uno o más segmentos génicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH humanos se ligaran de manera operable a uno o más genes de región constante humanos, quiméricos y/o de roedor (por ejemplo, ratón o rata). En una modalidad, los genes de región constante son de ratón. En una modalidad, los genes de región constante son de rata. En una modalidad, los genes de región constante son de hámster. En una modalidad, los genes de región constante comprenden una secuencia seleccionada de una bisagra, de un CH2 , de un CH3, y de una combinación de los mismos. En la modalidad específica, los genes de región constante comprenden una secuencia bisagra, CH2, y CH3.

En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana es contigua a una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana se ubica dentro de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende un segmento génico V, D y/o J.

En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana se yuxtapone con un segmento génico V. En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana se ubica entre dos segmentos génicos V. En una modalidad, la secuencia ADAM6 no humana se yuxtapone entre un segmento génico V y D. En una modalidad, la secuencia ADAM6 murina se ubica entre un segmento génico V y J. En una modalidad, la secuencia ADAM6 murina se yuxtapone entre un segmento genico D y J.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano manipulado por ingeniería genética, que comprende una célula B que expresa un dominio VH humano cognado con un dominio VL humano de un locus de inmunoglobulina, donde el animal no humano expresa una proteína no humana distinta a la inmunoglobulina del locus de inmunoglobulina. En una modalidad, la proteína no humana distinta a la inmunoglobulina es una proteína ADAM. En una modalidad específica, la proteína ADAM es una proteína ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma.

En una modalidad, el animal no humano es un roedor (por ejemplo, ratón o rata). En una modalidad, el roedor es de la familia Muridae. En una modalidad, el roedor es de la subfamilia Murinae. En una modalidad específica, el roedor de la subfamilia Murinae se selecciona de un ratón y de una rata.

En una modalidad, la proteína no humana distinta a la inmunoglobulina es una proteína de roedor. En una modalidad, el roedor es de la familia Muridae. En una modalidad, el roedor es de la subfamilia Murinae. En una modalidad específica, el roedor se selecciona de un ratón, de una rata, y de un hámster.

En una modalidad, los dominios VH y VL humanos se unen directamente o a través de un enlace para generar una secuencia de domino constante de inmunoglobulina. En una modalidad específica, la secuencia de dominio constante comprende una secuencia seleccionada de una bisagra, de una CH2, de una CH3, y de una combinación de las mismas. En una modalidad específica, el dominio VL humano se selecciona de un dominio VK O VA.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano manipulado por ingeniería genetica, que comprende en su línea germinal una secuencia de inmunoglobulina humana, donde el esperma de un animal no humano macho se caracteriza por un defecto in vivo de migración. En una modalidad, el defecto in vivo de migración comprende la incapacidad del esperma del animal no humano macho de emigrar desde un útero a través de un oviducto de un animal no humano hembra de la misma especie. En una modalidad, el animal no humano carece de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma. En una modalidad específica, la proteína ADAM6 o el fragmento funcional de la misma incluye una proteína ADAM6a y/o ADAM6b o fragmento funcional de las mismas. En una modalidad, el animal no humano es un roedor. En una modalidad específica, el roedor se selecciona de un ratón, de una rata, y de un hámster.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano, que comprende una secuencia de inmunoglobulina humana contigua a una secuencia no humana que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo o un homólogo o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, el animal no humano es un roedor. En una modalidad específica, el roedor se selecciona de un ratón, de una rata, y de un hámster.

En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana es una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina comprende un solo segmento genico VH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos DH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos JH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende un solo segmento génico VH, uno o más segmentos génicos DH y uno o más segmentos génicos JH.

En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina comprende un solo segmento génico VH que se asocie con el polimorfismo en los repertorios humanos naturales. En una modalidad específica, un solo segmento génico VH se selecciona de VH1 -2, de VH1 -69, de VH2-26, de VH2-70, O de VH3-23 humano. En otra modalidad específica, un solo segmento génico VH es VH1-2. En otra modalidad específica, un solo segmento génico VH es VH1 -69.

En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina comprende un solo segmento génico VH que se asocie con múltiples números de copias en los repertorios humanos naturales. En una modalidad específica, un solo segmento génico VH se selecciona de VH1 -2, de VH1 -69, de VH2-26, de VH2-70, o de VH3-23 humano. En otra modalidad específica, un solo segmento génico VH es VH1 -2. En otra modalidad específica, un solo segmento génico VH es VH 1 -69.

En varias modalidades, el segmento génico VH se selecciona de VH6-1 , VH1 -2, VH1 -3, VH2-5, VH3-7, VH1 -8, VH3-9, VH3-1 1 , VH3-13, VH3- 15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21 , VH3-23, VH1 -24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31 , VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1 -45, VH1 -46, VH3-48, VH3-49, VH5-51 , VH3-53, VH 1 -58, VH4-59, VH4-61 , VH3-64, VH3-66, VH 1 -69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 y VH3- 74.

En varias modalidades, el segmento genico VH se selecciona de la tabla 1 y se representa en los repertorios humanos naturales por cinco o más alelos. En una modalidad específica el gen VH se selecciona de VH1 -2, VH1 -69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3-64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2 , VH4-30-4, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61 , VH5-51 y VH7-4-1.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón, y el ratón comprende un reemplazo de segmentos génicos VH endógenos murinos con un solo segmento génico VH humano, donde el segmento génico VH humano se liga de manera operable a un gen de región CH murino, de tal manera que el ratón reordene el segmento génico VH humano y exprese una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica invertida que comprende un dominio VH humano y un CH murino. En una modalidad, 90-100% de segmentos génicos VH murinos no rearreglados se reemplazan por un segmento génico VH no rearreglado. En una modalidad específica, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos murinos se reemplazan por un segmento génico VH humano. En una modalidad, el reemplazo es con un segmento génico VH1 -69 humano no rearreglado. En una modalidad, el reemplazo es con un segmento génico VH1 -2 humano no rearreglado. En una modalidad, el reemplazo es con un segmento genico VH2-26 humano no rearreglado. En una modalidad, el reemplazo es con un segmento génico VH2-70 humano no rearreglado. En una modalidad, el reemplazo es con un segmento génico VH3-23 humano no rearreglado.

En una modalidad, el ratón comprende un reemplazo de todos los segmentos DH y JH murinos con por lo menos un segmento génico DH humano no rearreglado y por lo menos un segmento génico JH humano no rearreglado. En una modalidad, por lo menos un segmento génico DH humano no rearreglado se selecciona de 1 -1 , 1 -7, 1 -26, 2-8, 2-15, 3-3, 3 -10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, de 7-27, y una combinación de los mismos. En una modalidad, por lo menos un segmento génico JH humano no rearreglado se selecciona de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, y una combinación de los mismos.

En varias modalidades, la secuencia de inmunoglobulina humana está en ligadura operable con una región constante en el línea germinal del animal no humano (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón, rata, o hámster). En una modalidad, la región constante es una región constante de humano, quimérica de humano/ratón o quimérica de humano/rata o quimérica de humano/hámster, de ratón, de rata, o de hámster. En una modalidad, la región constante es una región constante de roedor (por ejemplo, ratón o rata o hámster). En una modalidad específica, el roedor es un ratón o una rata. En varias modalidades, la región constante comprende por lo menos un dominio CH2 y un dominio CH3.

En una modalidad, la secuencia humana de cadena pesada de inmunoglobulina se ubica en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina en el línea germinal del animal no humano (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata o hámster). En una modalidad, la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana se ubica en un locus de cadena pesada sin inmunoglobulina en el línea germinal del animal no humano, donde el locus sin cadena pesada es un locus activo de manera transcriptiva. En una modalidad específica, el locus sin cadena pesada es un locus ROSA26.

En varios aspectos, el animal no humano además comprende una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana (por ejemplo, una o más secuencias V y J de cadena ligera no rearregladas o una o más secuencias VJ rearregladas) en el línea germinal del animal no humano. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos genicos VL. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos JL. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos VL y uno o más segmentos génicos JL- En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende por lo menos 16 segmentos génicos VK y cinco segmentos génicos JK. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende por lo menos 30 segmentos genicos VK y cinco segmentos génicos JK. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende por lo menos 40 segmentos génicos VK y cinco segmentos génicos JK. En varias modalidades, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana está ligada de manera operable con una región constante en el línea germinal del animal no humano (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata o hámster). En una modalidad, la región constante es una región constante de humano, quimérica de humano/roedor, de ratón, de rata, o de hámster. En una modalidad específica, la región constante es una región constante de ratón o de rata. En una modalidad específica, la región constante es una región constante k de ratón (mCK, por sus siglas en inglés) o una región constante de rata.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón y el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad los segmentos génicos VK y JK con por lo menos seis segmentos génicos VK humanos y por lo menos un segmento génico JK. En una modalidad, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VK y JK se sustituyen con por lo menos 16 segmentos génicos VK humanos (VK humano) y por lo menos un segmento génico JK. En una modalidad, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VK y JK se reemplazan con por lo menos 30 segmentos génicos VK humanos y por lo menos un segmento génico JK. En una modalidad, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VK y JK se reemplazan con por lo menos 40 segmentos génicos humanos VK y por lo menos un segmento genico JK. En una modalidad, por lo menos un segmento génico JK comprende dos, tres, cuatro, o cinco segmentos génicos JK humanos.

En una modalidad, los segmentos génicos VK humanos comprenden VK4-1 , VK5-2 , VK7-3, VK2-4, VK1 -5, y VK1 -6. En una modalidad, los segmentos génicos VK comprende VK3-7, VK1 -8, VK1 -9, 2-10, VK3-1 1 , 1 -12, 1 -13, 2-14, VK3-5 y VK1 -16. En una modalidad, los segmentos génicos VK humanos comprenden VK1 -17, VK2-18, VK2-19, VK3-20, 6-21 , 1 -22, VK1 -23, VK2-24, VK3-25, VK2-26, VK1 -27, 2-28, VK2-29, y VK2-30. En una modalidad, los segmentos génicos VK humanos comprenden VK3-31 , VK1 -32 , VK1 -33, VK3-34, VK1 -35, VK2-36, VK1 -37, VK2-38, VK1 -39, y VK2-40.

En una modalidad específica, los segmentos génicos VK comprenden los segmentos génicos k de inmunoglobulina humanos que abarcan el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humano de VK4-1 a 2-40, y los segmentos génicos JK comprenden los segmentos génicos contiguos que abarcan el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humano de JK1 a JK5.

En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana se ubica en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina en el línea germinal del animal no humano. En una modalidad específica, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina en el línea germinal del animal no humano es un locus de cadena ligera de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana se ubica en un locus sin cadena ligera de inmunoglobulina en el línea germinal del animal no humano que es activo de manera transcriptiva. En una modalidad específica, el locus sin inmunoglobulina es un locus ROSA26.

En un aspecto, se proporciona un metodo para generar un anticuerpo humano, donde el anticuerpo humano comprende los dominios variables derivados de una o más secuencias de región variables de ácido nucleico codificadas en una célula de un animal no humano tal como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se proporciona un método para generar un anticuerpo anti-idiotipo, donde el anticuerpo anti-idiotipo comprende los dominios variables derivados de una o más secuencias de región variable de ácido nucleico codificadas en una célula de un animal no humano tal como se describe en el presente documento, el método que comprende exponer un animal no humano tal como se describe en el presente documento a un anticuerpo que comprende los dominios variables humanos. En una modalidad, el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena pesada humano. En una modalidad, el anticuerpo es específico para o es capaz de unir a un dominio de variable de cadena ligera humano.

En una modalidad específica, el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena pesada humano, donde el dominio variable de cadena pesada humano comprende un segmento génico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH6-1 , VH1 -2, VH1 -3, VH2-5, VH3- 7, VH1 -8, VH3-9, VH3-1 1 , VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1 -18, VH3-20, VH3-21 , VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51 , VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1 -69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 y VH3-74.

En una modalidad específica, el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena pesada humano, donde el dominio variable de cadena pesada humano comprende un segmento genico VH humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VH1-2, VH1-69, VH2-5, VH2-70, VH3-15, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-49, VH3-64, VH4-4, VH4-28, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51 y VH7-4-1.

En una modalidad específica, el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena ligera humano, donde el dominio variable de cadena ligera humano comprende un segmento génico VK humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de V 4-1, VK5-2, 7-3, VK2-4, VK1-5, VK1 -6, VK3-7, VK1 -8, VK1-9, VK2-10, VK3-11, VK1-12, VK1-13, VK2-14, VK3-15, VK1 -16, VK1 -17, VK2-18, VK2-19, VK3-20, VK6-21, VK1-22, VK1 -23, VK2-24, 3-25, VK2-26, VK1-27, VK2-28, VK2-29, VK2-30, VK3-31, VK1 -32, VK1-33, VK3-34, VK1-35, VK2-36, VK1-37, VK2-38, VK1-39, y VK2-40.

En una modalidad específica, el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena ligera humano, donde el dominio variable de cadena ligera humano comprende un segmento genico VK1 -39 humano rearreglado.

En una modalidad especifica, el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena ligera humano, donde el dominio variable de cadena ligera humano comprende un segmento génico VA humano rearreglado que se selecciona del grupo que consiste de VA3-1 , VA4-3, VA2-8, VA3-9, VA3-10, VA2-1 1 , VA3-12, VA2-14, VA3-16, VA2-18, VA3-19, VA3-21 , VA3-22, VA2-23, VA3-25, VA3-27, VA3-32, VA2-33, VA2-34, VA1 -36, VA1 -40, VA7-43, VA1 -44, VA, 5-45, VA7-46, VA1 -47, VA5-48, VA9-49, VA1 -50, VA1 -51 , VA5-52, VA10-54, VA1 1-55, VA6-57, VA4-60, VA8-61 , y VA4-69.

En una modalidad, se proporciona un método para generar un anticuerpo anti-idiotipo, donde el anticuerpo anti-idiotipo comprende los dominios variables derivados de una o más secuencias de región variable de ácido nucleico codificadas en una célula de un animal no humano que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringido que comprende un solo segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH, y seis segmentos génicos JH, y donde el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena pesada humano que comprende un segmento génico VH1 -69 humano rearreglado, el método comprende exponer al animal no humano a un anticuerpo que comprende el segmento génico VH1-69 rearreglado y aislar el anticuerpo anti-idiotipo del animal no humano. En una modalidad específica, un solo segmento génico VH humano se selecciona de un segmento genico VH1 -2 humano y VH1 -69.

En una modalidad, se proporciona un método para generar un anticuerpo anti-id iotipo, donde el anticuerpo anti-idiotipo comprende los dominios variables derivados de una o más secuencias de región variable de ácido nucleico codificadas en una célula de un animal no humano que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringido que comprende un solo segmento génico VH humano, 27 segmentos génicos DH, y seis segmentos génicos JH, y donde el anticuerpo anti-idiotipo es específico para o es capaz de unir a un dominio variable de cadena ligera humano que comprende un segmento génico VK1 -39 humano, el método comprende exponer el animal no humano a un anticuerpo que comprende el segmento génico VK1 -39 humano y aislar el anticuerpo de animal no humano. En una modalidad específica, un solo segmento génico VH humano se selecciona de un segmento génico VH1 -2 humano y VH1 -69 humano.

En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido que comprende el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que se deriva de una o más secuencias de región variable de ácido nucleico aisladas de un animal no humano tal como se describe en el presente documento. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo de una sola cadena pesada. En una modalidad el polipéptido es un fragmento variable de una sola cadena (por ejemplo, un scFv).

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano tal como se describe en el presente documento para generar un anticuerpo. En varias modalidades, el anticuerpo comprende uno o más dominios variables que se derivan de una o más secuencias de región variable de ácido nucleico aisladas del animal no humano. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico de región variable comprenden los segmentos genicos de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad específica, las secuencias de región variable de ácido nucleico comprenden los segmentos génicos de cadena ligera de inmunoglobulina.

Ejemplos Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la téenica cómo hacer y usar los métodos y las composiciones de la invención, y no se proponen para limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A menos que se indique los contrario, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presión es atmosférica o aproximadamente atmosférica.

Ejemplo 1 Construcción de un locus IgH restringido humanizado Un locus humano de cadena pesada modificado de manera única que contiene un solo segmento génico VH humano ubicado hacia 5’ desde todos los segmentos génicos DH y JH humanos, puede construirse por medio de la recombinación homologa usando el ADN del cromosoma artificial bacteriano (BAC, por sus siglas en inglés). Los segmentos génicos VH humanos ejemplares empleados para la construcción de tal locus de cadena pesada de inmunoglobulina incluyen los segmentos genico VH polimórficos y/o los segmentos génicos VH asociados con una variación en el número de copia, como por ejemplo VH1 -2, VH1 -69, VH2-26, VH2-70, y VH3-23. La teenología de ingeniería genética VELOCIGENE® puede emplearse para la creación de un solo locus de cadena pesada que contiene VH usando varios constructos de direccionamiento (consultar, por ejemplo, el Número de Patente Americana 6,586,251 y Valenzuela, D.M. et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotechnology 21 (6): 652-659).

Estrategia ejemplar para la construcción de un locus IgH restringido a VH-69 humano (figura 1 ). En la primera etapa, un BAC humano modificado que contiene los segmentos génicos VH humanos distales (5’), incluyendo VH1 -69, un casete de selección hacia 5’ (por ejemplo, higromicina) y la ramificación de homología murina en 5’ se dirigió por medio de la recombinación homologa con un segundo casete de selección (por ejemplo, espectinomicina), que también contiene una secuencia de señal de recombinación modificada (etapa 1 , figura 1 ). Esta secuencia de señal de recombinación modificada (RSS, por sus siglas en inglés) introdujo dos mutaciones puntuales (T a A y G a A) en la región en 3’ del gen VH1 -69 humano que cambia el nonémero RSS a la secuencia de consenso óptima. Así, la etapa 1 dio lugar a un fragmento genómico humano que contiene el segmento génico VH1 -69 humano con RSS en 3’ modificada, un sitio de restricción AsiSI único aproximadamente 180 bp hacia 3’ de la RSS y un casete de espectinomicina.

La etapa 2 incluyó el uso de un casete de neomicina (Neo, por sus siglas en ingles) flanqueado por los sitios Frt para eliminar el casete de selección (higromicina) y los segmentos génicos VH humanos secuencia arriba (5’) adicionales. Esta modificación se dirigió, por medio de la recombinación homologa, 5' al segmento génico VH1 -69 humano para dejar intacto aproximadamente 8.2 kb de la región promotora de VH1 -69 humano y la ramificación de homología en 5'.

La etapa 3 incluye otro casete de selección (espectinomicina) flanqueado por los sitios de restricción modificados de manera única (por ejemplo, Pl-Scel y AsiSI) dirigidos por medio de la recombinación homologa a un fragmento genómico humano que contiene los primeros tres segmentos génicos VH humanos funcionales y todos los segmentos génicos DH y JH humanos (figura 1 ). El fragmento genómico humano se dirigió previamente por medio de la recombinación homologa con un casete de neomicina y contuvo intensificador las ramificaciones de homología en 5’ y 3' que contienen la secuencia genómica murina en 5’ y 3' del locus endógeno de cadena pesada que incluye 3 el intensificador intrónico y el gen IgM. Esta modificación eliminó suprimió la secuencia genómica murina en 5’ y los segmentos génicos VH humanos, dejando aproximadamente 3.3 kb de la región intergénica VH-DH hacia 5’ desde el segmento génico DH1 -1 humano, todos los segmentos DH y JH humanos, y el fragmento genómico murino en 3’ que contiene el intensificador intrónico en 3' y el gen IgM (figura 1 ).

La etapa 4 se logró al usar los sitios de restricción únicos (descritos anteriormente) para el corte seguido por la ligadura de los dos BAC modificados de la etapa 2 y de la etapa 3, lo cual produce el constructo de direccionamiento. El constructo de direccionamiento para la creación de un locus de cadena pesada modificado que contiene un segmento genico VH1 -69 humano, todos los segmentos génicos DH humanos, y todos los segmentos génicos JH humanos en las células ES contenidas, desde 5' a 3', ramificación de homología en 5’ que contiene aproximadamente 20 kb de la secuencia genómica murina secuencia arriba desde el locus endógeno de cadena pesada, un sitio Frt en 5’, un casete de neomicina, un sitio Frt en 3’, aproximadamente 8.2 kb del promotor VH1 -69 humano, el segmento génico VH1 -69 humano con RSS en 3’ modificada, 27 segmentos génicos DH humanos, seis segmentos JH humanos y una ramificación de homología en 3’ que contiene aproximadamente 8 kb de la secuencia genómica murina secuencia abajo desde los segmentos génicos JH murinos que incluyen el intensificador intrónico en 3' y el gen IgM (figura 1 ).

Estrategia ejemplar para la construcción de un locus IgH restringido a VH1 -2 humano (figura 2). En una manera similar, otros segmentos génicos VH polimórficos en el contexto de las regiones constantes de cadena pesada murinas se emplean para construir una serie de ratones que tienen los segmentos V de cadena pesada de inmunoglobulina de número restringido (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, o 5), donde los segmentos V son variantes polimórficas de un miembro de la familia del gen V. Los segmentos genicos VH polimórficos ejemplares se derivan de los segmentos génicos VH humanos que incluyen, por ejemplo, VH1 -2, VH2-26, VH2-70 y VH3-23. Tales segmentos génicos VH humanos se obtienen, por ejemplo, por medio de la síntesis de novo (por ejemplo, Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA) usando las secuencias disponibles en las bases de datos publicadas. Así, los fragmentos de ADN que codifican cada gen VH, en algunas modalidades, se generan independientemente para la incorporación en los vectores dirigidos, tal como se describe en el presente documento. De esta manera, los múltiples loci de cadena pesada de inmunoglobulina modificados que comprenden un número restringido de segmentos génicos VH se modifican en el contexto de las regiones constantes de cadena pesada murinas. Una estrategia de direccionamiento ejemplar para crear un locus de cadena pesada humanizado restringido que contiene un segmento génico VH1 -2 humano, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos, se muestra en la figura 2.

Brevemente, un clon BAC humano modificado que contiene tres segmentos génicos VH humanos (VH6-1 , VH1 -2, VH1 -3), 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos (consultar USSN 13/404,075; presentado el 24 de febrero de 2012) se usa para crear un locus de cadena pesada humanizado restringido que contiene un segmento génico VH1 -2 humano. Este clon BAC modificado liga funcionalmente los segmentos genicos de cadena pesada humanos antes mencionados con el intensificador intrónico murino y la región constante IgM. El locus de cadena pesada a base de VH 1 -2 restringido se logra por dos recombinaciones homologas usando el clon BAC humano modificado descrito anteriormente. En la primera recombinación homóloga, 205 bp del segmento génico VH6-1 humano (de aproximadamente 10 secuencia arriba (5') del codón inicial VH6-1 en el exón 1 a aproximadamente 63 bp secuencia abajo (3') del principio del exón 2) en el clon BAC humano modificado se eliminan por medio de la recombinación homóloga bacteriana usando un casete de espectinomicina (aadA, por sus siglas en inglés) flanqueado por los sitios de restricción Pl-Scel únicos (figura 2, BHR 1 ). Esto permite la eliminación subsecuente del casete de aadA sin la interrupción de otros segmentos génicos humanos dentro del locus de cadena pesada restringido. En la segunda recombinación homologa, el extremo 5’ del clon BAC humano modificado que incluye el segmento génico VH1 -3 humano completo y aproximadamente 60 secuencia abajo (3’) del segmento génico se elimina por medio de la recombinación homóloga usando un casete de higromicina que contiene los sitios de restricción 5’ AsiSI y 3’ Ascl de flanqueo (figura 2, BHR 2). Tal como se describió anteriormente, el casete de espectinomicina se elimina opcionalmente después de la confirmación del vector dirigido final que incluyendo la deleción de los dos segmentos génicos VH humanos que flanquean el segmento génico VH 1 -2 humano (figura 2, parte inferior). Un vector dirigido VH 1 -2 humano ejemplar se establece en la SEC ID NO; 75.

El empleo de los segmentos genicos VH polimórficos en un locus de cadena pesada de ¡nmunoglobulina restringido representa un nuevo método para generar los anticuerpos, las poblaciones de anticuerpos, y las poblaciones de células B que expresan los anticuerpos que tienen las cadenas pesadas con diferentes CDR derivadas de un solo segmento génico VH humano. El aprovechamiento del mecanismo de hipermutación somática del animal anfitrión junto con la asociación combinatoria con los dominios variables de cadena ligera de ¡nmunoglobulina humanos rearreglados, da lugar a la ingeniería de las cadenas pesadas únicas y de los pares VH/VL únicos que expanden el repertorio inmunológico de los animales manipulados por ingeniería genética y mejora su utilidad como una plataforma de siguiente generación para generar los terapéuticos humanos, especialmente útil como una plataforma para generar los anticuerpos de neutralización específicos para los patógeno humanos.

Con base en la estructura de locus deseada final, uno de los otros segmentos génicos VH humanos puede sustituirse de una manera similar usando los clones BAC humanos que contienen el segmento génico VH humano deseado. Así, usar la estrategia descrita anteriormente para la incorporación de los segmentos génicos VH polimórficos adicionales y/o distintos en el locus de cadena pesada de ¡nmunoglobulina murino permite la generación de nuevos repertorios de anticuerpos para el uso en la neutralización de los patógeno humanos que pudieron evadir de otra manera con eficacia el sistema inmunológico anfitrión.

Las celulas ES dirigidas descritas anteriormente se usan como células ES donadoras y se introducen en un embrión murino de etapa de 8 células por medio del método VELOCIMOUSE® ( supra ). Los ratones portadores de un locus de cadena pesada humanizado que contiene un solo segmento génico VH humano, todos los segmentos génicos DH y JH humanos ligados de manera operable a los genes de región constante de ¡nmunoglobulina murinos se identifican por medio de genotipaje usando una modificación del análisis de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia del casete de neomicina, del segmento génico VH humano y de una región dentro de los segmentos génicos DH y JH humanos así como de las secuencias endógenas de cadena pesada. La tabla 3 establece los cebadores y las sondas que se usan para confirmar los ratones que albergan un locus de cadena pesada restringido que contiene un solo segmento génico VH1 -69 humano, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos.

Los ratones portadores de un locus de cadena pesada modificado que contiene un solo segmento génico VH humano pueden reproducirse en una cepa murina de eliminación FLPe (consultar, por ejemplo, Rodríguez, C.l. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-ioxP. Nature Genetics 25: 139-140) para eliminar cualquier casete de neomicina Frt'ed introducido por medio del vector dirigido que no se elimina, por ejemplo, en la etapa de la celula ES o en el embrión. Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Las crías se someten al genotipaje y una cría heterozigótica para un locus de cadena pesada humanizado que contiene un solo segmento génico VH humano, todos los segmentos DH y JH humanos ligados de manera operable a los genes endógenos constantes de inmunoglobulina murinos, se selecciona para caracterizar el repertorio de cadena pesada de inmunoglobulina.

Tabla 3 Nombre SEQ ID (Región Secuencia (5’-3') NO: Eliminada) hyg Delantero: TGCGGCCGAT CTTAGCC 7 (casete Trasero: TTGACCGATT CCTTGCGG 8 higromicina) Sonda: ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C 9 neo Delantero: GGTGGAGAGG CTATTCGGC 10 (casete Trasero: GAACACGGCG G CATC AG 1 1 neomicina) Sonda: TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG 12 hlgH9T Nombre SEQ ID (Región Secuencia (5’-3') NO: Eliminada) (secuencia Delantero: TCCTCCAACG ACAGGTCCC 13 genómica Trasero: GATGAACTGA CGGGCACAGG 14 DH-JH humana) Sonda: TCCCTGGAAC TCTGCCCCGA CACA 15 77h3 Delantero: CTCTGTGGAA AATGGTATGG AGATT (segmento Trasero: GGTAAGCATA GAAGGTGGGT 16 genico human VH1 -69) ATCTTT 17 Sonda: ATAGAACTGT CATTTGGTCC 18 AGCAATCCCA mlgHA7 Delantero: TGGTCACCTC CAGGAGCCTC 19 (secuen Xcia — Trasero: GCTGCAGGGT GTATCAGGTG C ge Wn Xómica Sonda: AGTCTCTGCT TCCCCCTTGT murina) GGCTATGAGC 21 88710T Delantero: GATGGGAAGA GACTGGTAAC (secuencia ATTTGTAC 22 genómica Trasero: TTCCTCTATT TCACTCTTTG VH en 5’ AGGCTC murina) Sonda: CCTCCACTGT GTTAATGGCT 23 GCCACAA Nombre SEQ ID (Región Secuencia (5’-3') NO: Eliminada) Delantero: GGTGTGCGAT GTACCCTCTG mlgHdl O 25 AAC Trasero: TGTGGCAGTT TAATCCAGCT (secuencia 26 TTATC genómica Sonda: CTAAAAATGC TACACCTGGG 27 VH en 5 GCAAAACACC TG murina) mlgHp2 Delantero: GCCATGCAAG GCCAAGC 28 Trasero: AGTTCTTGAG CCTTAGGGTG (secuencia 29 CTAG genómica Sonda: CCAGGAAAAT GCTGCCAGAG 30 JH murina) CCTG Ejemplo 2 Reingeniería de los genes ADAM en un locus IgH humanizado restringido Los ratones con los loci de cadena pesada de inmunoglobulina humanizados en los cuales los segmentos genicos endógenos de región variable (VDJ) se han reemplazado y/o eliminan la expresión carente de los genes ADAM6 endógenos. Particularmente, los ratones machos que comprenden tales loci de cadena pesada de inmunoglobulina humanizados demuestran una reducción en la fertilidad. Así, la capacidad de expresar ADAM6 se modificó nuevamente en los ratones con los loci de cadena humanizados, pero restringidos, para perpetuar las cepas murinas usando los metodos de reproducción normales.

Reingeniería de los genes ADAM6 en un locus IgH restringido a VH1 -69 humano (figura 3). Un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringido que contiene un solo segmento génico VH1 -69 humano ubicado hacia 5’ desde todos los segmentos génicos DH y JH humanos se modificó nuevamente para contener un fragmento genómico que codifica ADAM6a y ADAM6b murinos (SEQ ID NO: 77) por medio de la recombinación homologa usando el ADN del BAC. Esto se logró por la teenología de ingeniería genética VELOCIGENE® ( supra ) en una serie de seis etapas que incluyen la modificación del ADN del BAC que contiene las secuencias murinas y humanas que produjeron un vector dirigido final que contiene un locus de cadena pesada humanizado restringido contiguo con las regiones constantes de cadena pesada murinas y los genes ADAM6 murinos.

Primero, un fragmento genómico murino que codificó ADAM6a y ADAM6b murinos se preparó para la inserción en un locus de cadena pesada humanizado que contiene un solo segmento génico VH por medio de una serie de tres recombinaciones homologas bacterianas que implican diferentes casetes de selección para colocar de manera única los sitios de restricción alrededor de los genes ADAM6 murinos (figura 3, etapas 1 -3). En la primera etapa, el ADN de BAC murino que contiene una porción del locus de cadena pesada de ínmunoglobulina murino se dirigió con un casete de neomicina flanqueado por los sitios de recombinación, que se modificó para contener los sitios de restricción AsiSI únicos. En la segunda etapa, el fragmento murino modificado que contiene los genes ADAM6 murinos y el casete de neomicina entonces se dirigió para eliminar los segmentos genicos DH y JH murinos y para reemplazar un casete de espectinomicina que contuvo un sitio de restricción Ascl único colocado en 5’ del gene de selección. En la tercera etapa, el doble fragmento murino modificado que contiene un casete de neomicina colocado entre los genes ADAM6 murinos y un casete de espectinomicina se dirigió para intercambiar el casete de neomicina por un casete de higromicina. Esto se realizó de modo que el fragmento genómico murino modificado que contiene los genes ADAM6 se pudiera insertar por medio de la ligadura de los fragmentos genómicos compatibles en un locus de cadena pesada humanizado que contiene un solo segmento génico VH- En la etapa cuatro, un locus de cadena pesada humanizado que contiene un segmento génico VH 1 -69 humano, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos se dirigieron por separado por medio de la recombinación homologa bacteriana con un casete de que contiene los sitios de restricción l-Ceul y Ascl únicos en las ubicaciones 5' y 3' en el casete, respectivamente (figura 3, izquierda superior). Después de esta etapa, el fragmento genómico modificado que contiene un locus de cadena pesada humanizado restringido, los casetes de neomicina y de espectinomicina y el fragmento murino modificado que contiene los genes ADAM6, los casetes de higromicina y espectinomicina se digirieron por separado con las enzimas de restricción l-Ceul y Ascl para crear los fragmentos genómicos modificados para la ligadura (figura 3, media). En la etapa cinco, los fragmentos genómicos digeridos apropiados se purificaron y se ligaron juntos para producir un locus de cadena pesada humanizado modificado nuevamente que contiene un solo segmento genico VH humano, 27 segmentos génicos DH humanos, seis segmentos génicos JH humanos y un fragmento genómico murino integrado que codifica ADAM6a y ADAM6b con resistencia a neomicina y a higromicina. En la etapa final (etapa 6), el casete de higromicina se eliminó por medio de la digestión de AsiSI seguida por el descenso de los extremos compatibles.

Esta etapa produjo el vector dirigido final para la reinserción de las secuencias ADAM6a y ADAM6b murinas en un locus de cadena pesada humanizado restringido, que contiene, de 5' a 3', una ramificación de homología en 5’ que contiene aproximadamente 20 kb de la secuencia genómica murina hacia 5’ desde el locus endógeno de cadena pesada, un sitio Frt en 5’, un casete de neomicina, un sitio Frt en 3’, aproximadamente 8.2 kb del promotor VH1 -69 humano, el segmento génico VH1 -69 humano con RSS en 3’ modificada, un fragmento genómico murino que contiene aproximadamente 1771 1 bp de la secuencia genómica murina que incluye los genes ADAM6a y ADAM6b murinos (SEQ ID NO: 77), un fragmento genómico humano que contiene 27 segmentos génicos DH humanos y seis JH humanos, y la ramificación de homología en 3’ que contiene aproximadamente 8 kb de la secuencia genómica murina hacia 3’ desde el locus endógeno de cadena pesada que incluye el intensificador intrónico y el gen de región constante IgM (vector dirigido VH1 -69/A6 humano, SEQ ID NO: 74; figura 3, parte inferior).

Reingeniería de los genes ADAM6 en un locus IgH restringido a VH1 -2 humano (figura 4).

Un locus de cadena pesada de inmunoglobulina restringido que contiene un solo segmento genico VH1 -2 humano ubicado hacia 5’ desde todos los segmentos génicos DH y JH humanos se modifica nuevamente para contener un fragmento genómico que codifica ADAM6a y ADAM6b murinos (SEQ ID NO: 73) por la recombinación homologa usando la ADN del BAC. Esto se logró por la teenología de ingeniería genética VELOCIGENE® ( supra ) en una serie de etapas que incluyen la modificación del ADN del BAC que contiene las secuencias murinas y humanas que producen un vector dirigido final que contiene un locus de cadena pesada humanizado restringido contiguo con regiones constantes de cadena pesada murinas y los genes ADAM6 murinos.

Un clon BAC humano modificado que contiene un solo segmento génico VH1 -2 humano flanqueado por los casetes de higromicina en 5’ y espectinomicina en 3’, 27 segmentos génicos DH humanos, seis segmentos génicos JH humanos, un intensificador intrónico de cadena pesada murino, y una región constante IgM murina (descrita anteriormente en el ejemplo 1 ), se modificó para contener fragmento genico que codifica los genes ADAM6 murinos. Esto se logra por medio de un método de ensamblaje de ADN isotérmico modificado denominado en el presente documento como ensamblaje isotérmico mediado por oligo, que se basa en el método descrito en Gibson et al. (2009, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods 6(5):343-345). Este método modificado no requiere la identidad de secuencia entre los fragmentos ligados. En cambio, la identidad de secuencia se imparte por un oligo que sirve para unir los dos fragmentos. Además, el otigo sirve como plantilla que agrega la identidad de secuencia al final de uno de los fragmentos. El fragmento extendido permite la hibridación con el segundo fragmento. Específicamente, el ensamblaje isotérmico mediado por oligo se empleó para reemplazar el casete de higromicina por un fragmento Notl-Ascl que contiene una ramificación de homología IgH murina distal de 20 kb, el gen ADA 6a murino, un casete de neomicina flanqueado por los sitios Frt, y el gen ADAM6b murino.

Brevemente, el clon BAC humano modificado que contiene a un locus de cadena pesada VH1 -2 humano restringido (figura 4, izquierda superior) se digiere con AsiSI y Ascl para eliminar el casete de higromicina, y un BAC murino modificado que contiene los genes ADAM6 murinos (figura 4, derecha superior) se digiere con Notl y Ascl para eliminar el fragmento que contiene la ramificación murina en 5’ y para liberar los genes ADAM6 murinos que flanquean el casete de neomicina. Los dos fragmentos BAC digeridos se mezclan posteriormente juntos con oligonucleótidos ensambladores en 5' y 3' y se incuban durante 1 hora a 50°C en una mezcla de reacción de ensamblaje (exonucleasa T5, polimerasa de ADN Phusion, ligasa de ADN Taq, 10 mM de DTT, 5% de PEG8000 (p/v), 1 mM de NAD, 0.2 mM de dNTPs, 10 mM de MgCI2, y 100 mM de Tris-HCI). Los oligo ensambladores en 5’ contienen un traslapo de 38 bp con la secuencia en 5' del sitio de AsiSI del clon BAC humano modificado que contiene VH 1 -2 humano, y un traslapo de 30 bp con el sitio Notl la secuencia en 3’ adyacente del clon BAC murino modificado que contiene los genes ADAM6. El oligo ensamblador en 3’ contiene un traslapo de 26 bp con la secuencia en 5' del sitio Ascl del clon BAC murino modificado que contiene los genes ADAM6, un sitio Ascl, y un traslapo de 35 bp con la secuencia en 3' del sitio Ascl del clon BAC humano modificado que contiene VH1 -2 humano. La reacción de ensamblaje se transforma en E. coli y el producto correcto se selecciona con la selección de kanamicina y de espectinomicina. Para crear el vector dirigido final, el casete de espectinomicina se elimina por digestión con Pl-Scel seguida por la ligadura repetida.

El vector dirigido final contiene, de 5' a 3', una ramificación de homología IgH murina distal de 20 kb, un gen ADAM6a murino, un sitio Frt en 5', un casete de neomicina, un sitio Frt en 3', un gen ADAM6b murino, un fragmento genómico humano de ~18 kb, un segmento genico VH1 -2 humano, un fragmento genómico humano de -46.6 kb, un segmento génico VH6-1 humano desactivado, 27 segmentos génicos DH humanos, seis segmentos génicos JH humanos, y una ramificación de homología murina en 3’ de 8 kb que contiene un intensificador intrónico I g H murino y la región constante IgM (SEQ ID NO: 76).

Cada uno de los vectores dirigidos finales (descritos anteriormente) se usaron para electroporar las celulas ES murinas que contuvieron un locus endógeno de cadena pesada eliminado para crear las células ES modificadas que comprenden una secuencia genómica murina colocada de manera ectópica que comprende las secuencias ADAM6a y ADAM6b murinas dentro de un locus de cadena pesada humanizado restringido. Las células ES positivas que contienen el fragmento genómico ectópico murino dentro del locus de cadena pesada humanizado se identificaron por medio de un análisis PCR cuantitativo usando las sondas TAQMAN™ (Lie and Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5'nuclease assays, Curr Opin Blotechnol 9(1 ):43-48).

Las células ES dirigidas descritas anteriormente se usaron como células ES donadoras y se introdujeron en un embrión murino en la etapa de 8 células por medio del método de ingeniería murina VELOCIMOUSE® (consultar, por ejemplo, los Números de Patente Americana 7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754). Los ratones portadores de un locus de cadena pesada humanizado que contiene un número restringido de segmentos génicos humanos y una secuencia genómica murina ectópica que comprende las secuencias ADAMSa y ADAM6b murinas, se identificaron por medio de genotipaje usando una modificación del análisis de alelos (Valenzuela et al., 2003) que detectó la presencia de los genes ADAM6a y ADAM6b murinos dentro del locus de cadena pesada humanizado restringido así como las secuencias humanas de cadena pesada.

Las crías se someten a genotipaje y una cría heterozigótico para un locus de cadena pesada humanizado restringido que contiene un fragmento genómico murino ectópico que comprende las secuencias ADAM6a y ADAM6b murinas se selecciona para caracterizar la expresión del gen ADAM6 murino y la fertilidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ratón caracterizado porque tiene en su línea germinal (a) una secuencia genómica humana que comprende un solo segmento genico VH, uno o más segmentos génicos DH, y uno o más segmentos génicos JH humanos; y (b) una secuencia que codifica una proteína ADAM6 que es funcional en un ratón macho, en donde la secuencia que codifica ADAM6 se ubica en una posición diferente que un locus ADAM6 de un ratón de tipo silvestre.

2. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el un solo segmento génico VH humano es un segmento génico VH polimórfico.

3. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia que codifica ADAM6 es una secuencia murina.

4. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia genómica murina está yuxtapuesta o es contigua a la secuencia genómica humana.

5. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia genómica humana y la secuencia genómica murina, están presentes en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

6. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia genómica humana está presente en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina y la secuencia genómica murina está presente en una posición del genoma murino distinta al locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

7. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el ratón comprende una deleción de todos o sustancialmente todos los segmentos genicos VH endógenos.

8. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el un solo segmento génico VH humano se selecciona del grupo que consiste de VH1 -2, VH1 -69, VH2-26, VH2-70, VH3-23, O de una variante polimórfica de los mismos.

9. El ratón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el segmento génico VH humano es VH1 -69,

10. El ratón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el segmento génico VH humano es VH1 -2.

11 . El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque un solo segmento génico VH se liga de manera operable a un gen de región constante de inmunoglobulina humano, murino, o quimérico humano/murino.

12. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el gen de región constante de inmunoglobulina es un gen de región constante murino.

13. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el gen constante de inmunoglobulina comprende una secuencia humana seleccionada de una CH1 humana, bisagra humana, CH2 humana, CH3 humana, y una combinación de las mismas.

14. El ratón de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el gen constante murino está en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina.

15. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia genómica humana comprende un segmento genico VH1 -69 humano, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos.

16. El ratón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia genómica humana comprende un segmento génico VH1 -2 humano, 27 segmentos génicos DH humanos, y seis segmentos génicos JH humanos.

17. El ratón de la reivindicación 1 , 15, o 16, que adicionalmente comprende uno o más segmentos génicos VK humanos y uno o más segmentos génicos JK.

18. El ratón de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque uno o más segmentos génicos VK humanos y uno o más segmentos génicos JK están presentes en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina.

19. Un ratón que comprende por lo menos un segmento génico VH humano ligado de manera operable a por lo menos un segmento génico DH humano y por lo menos un segmento génico JH humano, caracterizado porque el ratón comprende una secuencia ADAM6 murina ectópica.

20. El ratón de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico está presente en una posición ectópica.

21 . El ratón de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico está presente en un locus endógeno de inmunoglobulina.

22. El ratón de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico está presente en el genoma murino en una posición distinta a un locus endógeno de inmunoglobulina.

23. Un ratón que expresa inmunoglobulina serica, caracterizado porque más del 80% de la inmunoglobulina sérica del ratón comprende un dominio variable de cadena pesada humano y un dominio variable de cadena ligera humano cognado, en donde el dominio variable de cadena pesada humano se deriva de un repertorio de segmentos génicos VH que consiste esencialmente de un solo segmento génico VH humano y/o variantes polimórficas del mismo.

24. Un ratón caracterizado porque comprende en su línea germinal el reemplazo en un locus endógeno de cadena pesada de inmunoglobulina, de la totalidad o de sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos VH endógenos, por un solo segmento génico VH humano y/o variantes polimórficas del mismo.

25. El ratón de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque adicionalmente comprende el reemplazo en un locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina, de la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos genicos V endógenos de cadena ligera, por uno o más segmentos génicos V de cadena ligera humanos.

26. El ratón de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque adicionalmente comprende uno o más segmentos génicos J de cadena ligera humanos, ligados de manera operable a los segmentos génicos V de cadena ligera humanos.

27. Una célula o un tejido derivado del ratón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 19, 23, ó 24.

28. Un método para producir una población de anticuerpos humanos que comprenden cadenas pesadas derivadas de un solo segmento génico VH humano, caracterizado porque el método comprende: (a) inmunizar un ratón de conformidad con la reivindicación 1 con un antígeno de interés; (b) permitir que el ratón produzca una respuesta inmunitaria contra el antígeno de interés; e, (c) identificar o aislar una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano, en donde el anticuerpo una al antígeno de interés.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina es por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 98% identica a la SEQ ID NO: 5.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la secuencia de región variable de cadena pesada de ¡nmunoglobulina comprende la SEQ ID NO: 5.

31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la secuencia de región variable de cadena pesada de ¡nmunoglobulina es por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 98% idéntica a la SEQ ID NO: 64.

32. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la secuencia de región variable de cadena pesada de ¡nmunoglobulina comprende la SEQ ID NO: 64.

33. Un método para modificar un locus de cadena pesada de ¡nmunoglobulina murino, caracterizado porque comprende: (a) generar una primera modificación del locus de cadena pesada de ¡nmunoglobulina murino, que produzca una reducción o eliminación de la actividad de ADAM6 endógena murina en un ratón macho; y, (b) generar una segunda modificación del ratón para restaurar la actividad de ADAM6 en el ratón.

34. El método de la reivindicación 33, donde la secuencia de ácido nucleico del paso del inciso (b) está presente en una posición ectópica.

35. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque la primera modificación comprende la presencia de una o más secuencias genicas de inmunoglobulina humanas.

36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la primera modificación comprende el reemplazo de una o más secuencias en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina murino, por una o más secuencias génicas de inmunoglobulina humanas en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina murino.

37. El método de la reivindicación 36, donde la primera modificación comprende el reemplazo de uno o más segmentos génicos VH endógenos con un solo segmento génico VH humano en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina murino.

38. El método de la reivindicación 33, donde la primera modificación comprende el reemplazo de una secuencia génica endógena variable de cadena pesada con una secuencia génica variable de cadena pesada humana en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina murino.

39. El método de la reivindicación 33, donde la primera y la segunda modificación se realizan simultáneamente.

40. Un método para generar un anticuerpo específico contra un antígeno que comprende las etapas de: (a) inmunizar un ratón de conformidad con la reivindicación 1 con el antígeno; (b) aislar por lo menos una célula del ratón que produce un anticuerpo específico contra el antígeno; y (c) cultivar por lo menos una célula que produzca un anticuerpo del paso del inciso b), y obtener dicho anticuerpo.

41 . El metodo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el cultivo en el paso del inciso (c) se realiza en por lo menos una célula de hibridoma generada por lo menos de una célula obtenida en la etapa del inciso (b).

42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque por lo menos una célula obtenida en el paso del inciso (b) se deriva del bazo, de un ganglio linfático o de la médula ósea del ratón del paso del inciso (a).

43. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la inmunización con el antígeno del paso del inciso (a) se realiza con la proteína, el ADN, una combinación del ADN y de la proteína, o con las células que expresan el antígeno.