JP2023139148A - ネコMcDonough肉腫(FMS)様チロシンキナーゼ3受容体リガンド(FLT3L)に対する抗体並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するためのそれらの使用 - Google Patents
ネコMcDonough肉腫(FMS)様チロシンキナーゼ3受容体リガンド(FLT3L)に対する抗体並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するためのそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】抗FLT3L抗体、並びに自己免疫疾患及び他の炎症性疾患を治療するために、該抗体を使用する方法を提供する。【解決手段】FLT3Lに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域(CDR)の組:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、各々特定のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。【選択図】なし
Description
ネコMcDonough肉腫(FMS)様チロシンキナーゼ3受容体リガンド(FLT3L)に対する抗体並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するためのそれらの使用に関連する技術が提供される。
身体の免疫系が自己抗体を産生した場合に発生する自己免疫疾患は、残念ながら一般的である。例えば、2,300万人を超える米国人が自己免疫疾患に罹患していると推定されている。現在、80種を超える自己免疫疾患が認識されている。自己免疫疾患の特定の例としては、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬及び関節リウマチが挙げられる。
全身性エリテマトーデス(SLE)は、関節の痛み、リンパ節の腫れ及び頬の蝶型紅斑を特徴とする。SLEでは、健常組織に対する自己抗体が患者の免疫系を攻撃し、炎症を生じさせる。細胞レベルでは、SLE患者は、樹状細胞によって駆動される自己反応性T細胞及びB細胞を有する(Palucka A.K.et al.Immunology
and Cell Biology(2002)80:484-488)。シェーグレン症候群は、外分泌器官の全身性慢性炎症を特徴とし、最終的に臓器機能不全を生じさせる(Holdgate N.and St.Clair E.W.,F1000 Research.1412 10.12688/f1000 research.8352.1)。
and Cell Biology(2002)80:484-488)。シェーグレン症候群は、外分泌器官の全身性慢性炎症を特徴とし、最終的に臓器機能不全を生じさせる(Holdgate N.and St.Clair E.W.,F1000 Research.1412 10.12688/f1000 research.8352.1)。
多発性硬化症(MS)は、脳及び脊髄内の神経細胞の脱髄並びに中枢神経系(CNS)の炎症を特徴とする。乾癬は、赤い斑点、敏感肌として出現する自己免疫疾患である。関節リウマチ(RA)は、持続性滑膜炎並びに関節内の軟骨及び骨の破壊を特徴とする関節滑膜組織の炎症性障害である。損傷は、進行して多くの身体系に衝撃を与え得る。ループス腎炎は、全身性エリテマトーデスに関連しており、腎臓の炎症を生じさせる。炎症が発生すると、腎臓は、タンパク質を漏出し、最終的に腎不全に至り得る。ブドウ膜炎は、目の組織を攻撃し、破壊して失明を引き起こし得る炎症性疾患の群である。
更に、急性及び慢性の前炎症状態は、個体における無数の疾患と関連付けられており、それらの原因となり得る。特定の疾患の例は、1型及び2型糖尿病、例えば糖尿病、糖尿病性腎症及び高血圧によって誘発されたCKDを含む慢性腎疾患(CKD)を含む慢性炎症;動脈硬化症、アルツハイマー病、癌並びに心疾患、高血圧、貧血症、心膜炎、腎性骨ジストロフィー等を含むそのような疾患の関連合併症と関連すると考えられている。自己免疫疾患と同様に、慢性炎症に関連している疾患では、身体は、衰弱及び頻回に致死的併存疾患をもたらし得る過度の継続的前炎症反応を高めていくと思われる。
自己免疫疾患の原因は、明確には理解されていない。メカニズム的に、基礎にある各自己免疫疾患は、自己反応性免疫細胞に継続的に活力を与える複雑な調節系によって促進される(且つ/又は阻害されない)進行中の自己免疫反応である。類似の機構が非自己免疫性慢性炎症性疾患においても機能すると思われる。このため、自己免疫疾患における且つ慢性炎症のための治療的介入は、無数の調節系、シグナル伝達カスケード及びそれらの構成成分を標的としてきた。
1つのクラスの推定治療標的としては、別個の成長因子とタンパク質とを結合して細胞恒常性を調節する膜貫通受容体であるチロシンキナーゼ受容体(TKR)が挙げられる。50種を超える公知のヒトTKRは、それらの遺伝系統によって定義される20の別個のクラスに分類される(Robins D.R.,et al.Oncogene.(2000)19:5548-5557;Lemmon M.A.及びSchlessinger J.Cell.(2010)141:1117-1134)。TKRクラスIIIは、70~100個の親水性残基を含有する細胞外区域内の5~7個の免疫グロブリン様ドメインの存在を特徴とする。クラスIIIのTKR内では、ネコMcDonough肉腫(FMS)様チロシンキナーゼ3受容体(FLT3)は、ヒト幹細胞、造血細胞前駆体、樹状細胞、活性化T細胞及びB細胞、単核白血球並びにミクログリア上で発現する膜結合受容体である。FLT3は、活性化T細胞、活性化内皮及び骨髄間質細胞を含む複数の細胞型によって発現する造血サイトカインであるFLT3リガンド(FLT3L)に結合する。FLT3Lは、細胞表面及び分泌ホモダイマーの両方として発現し、その同族受容体であるFLT3を通してシグナル伝達する。FLT3は、モノマーとして細胞表面上で発現し、FLT3Lとライゲーションすると活性化される。FLT3Lのライゲーション後、FLT3は、二量化し、自己リン酸化し、RAS/細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)、ホスファチジルイノシチド3-キナーゼ(PI3K)及びシグナル伝達物質並びに転写活性化因子(STAT)3及び5を含むシグナル伝達経路を活性化する。自己リン酸化後、二量化FLT3は、内在化及び分解される。
FLT3Lは、炎症シグナル、特に□-鎖サイトカイン:IL-2、IL-7及びIL-15に反応して生成され、FLT3との相互作用は、主としてDCの分化、増殖及び生存におけるその役割を通して炎症プロセスを駆動する。更に、受容体を一過性でアップレギュレートすると報告された両方の細胞型を用いると、活性化後のT細胞及びB細胞生存にFLT3シグナル伝達が役割を果たすことも推定されている(Astier AL et al.,J.Immunology.2010 v184:685-93及びTobon et al.Arthritis&Rheumatism.2010;62(11):3447-56)。更に、NK細胞生存は、DCに由来するIL-15に対する要求を介してFLT3Lに間接的に依存すると考えられるが、この観察所見は、マウスのデータ(Guimond M et al.,J.Immunology 2010;184:2769-75)に基づくものであり、ヒトでは依然として証明されていない。
DCは、それらが炎症部位からリンパ節に移動し、最終的に自己免疫疾患を生成するために必要とされる適応的免疫反応を開始する免疫系の前哨であるため、炎症では特に重要である。概して、DCには2つのサブセット:骨髄/古典的樹状細胞(cDC)及び形質細胞様樹状細胞(pDC)がある。cDCは、炎症性サイトカイン(例えば、IFNI-III、IL-23、IL-12、IL-6及びIL-1□)を産生し、共刺激に関連してT細胞に抗原を提示し、炎症部位に細胞を動員するケモカインを分泌し、臨界的細胞-細胞相互作用の必要に応じてそれらが共局在化することを保証する。これらのメカニズムを通して、cDCは、好中球、B細胞、T細胞及びNK細胞を刺激して、結果としてNETosis、自己抗体産生、IL-17産生及び追加の炎症性サイトカイン産生を生じさせる。pDCは、免疫系の全アームの活性化を増強する生得的反応における重要なサイトカインであるI型IFNの主要な起源である。
シェーグレン症候群患者由来の唾液腺は、浸潤性B細胞上でFLT3及びFLT3Lの発現を示す(Tobon et al.Arthritis&Rheumatism.(2010)62(11):3447-3456)。更に、シェーグレン症候群患者は、循環中のFLT3を発現するB細胞の頻度上昇を示し、それらの生存率は、FLT3Lを発現するヒト唾液腺細胞と共培養した場合に増強される。MSを有する個体は、慢性及び活性病変並びに灰白質及び白質においてFLT3タンパク質を発現する(DeBoy C.
A.et al.Exp Mol Pathol.(2010);89(2):109-116)。更に、FLT3は、MSを有する個体の脳内へのFLT3陽性DCの浸潤を示している血管周囲脳内で未熟DCと共局在化している(Deboy et al.)。RAでは、滑液中FLT3Lレベルは、健常個体と比較して増大する。更に、RA患者由来の単核白血球、NK細胞及びDCは、高レベルのFLT3Lを発現する(Ramos M.et al.Arthritis Res Ther.(2013)15(6):R209)。
A.et al.Exp Mol Pathol.(2010);89(2):109-116)。更に、FLT3は、MSを有する個体の脳内へのFLT3陽性DCの浸潤を示している血管周囲脳内で未熟DCと共局在化している(Deboy et al.)。RAでは、滑液中FLT3Lレベルは、健常個体と比較して増大する。更に、RA患者由来の単核白血球、NK細胞及びDCは、高レベルのFLT3Lを発現する(Ramos M.et al.Arthritis Res Ther.(2013)15(6):R209)。
更に、血清中及び炎症部位中FLT3Lのレベルの増加は、SLE、筋炎、原発性シェーグレン症候群、MS、ブドウ膜炎及びRAについて報告されている(Andersson et al.PLoS One(2012)7:e47668;DeBoy et al.Exp and Mol Path(2010)89:109-16)。
このため、(例えば、pDC及びmDCを介する)FLT3媒介性前炎症生存は、健常個体における有益な生理学的反応であるが、これは、自己免疫疾患において有害な作用を有する可能性が高い。従って、FLT3/FLT3Lシグナル伝達経路の崩壊及び減衰は、自己免疫疾患及び他の炎症性疾患に対処し、且つ炎症を低減させるための重要なツールであることを証明することができた。
本明細書では、自己免疫疾患並びに他の急性及び/又は慢性炎症性疾患を制御するための新規なFLT3L結合抗体が提供される。
第1の態様では、本開示は、相補性決定領域(CDR)の組:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、FLT3Lに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38のアミノ酸配列を含む。
第1の態様の1つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む。別実施形態では、VH及びVLは、(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6を含む。別の実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、(a)配列番号61を含む重鎖領域及び配列番号62を含む軽鎖領域;又は(b)配列番号65を含む重鎖領域及び配列番号66を含む軽鎖領域;又は(c)配列番号69を含む重鎖領域及び配列番号70を含む軽鎖領域を含む。1つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、FLT3のFLT3L媒介性活性化を阻害する。別の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、構造的に類似のTKRリガンド分子と交差反応しない。1つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、huSCF及びhuCSF1の少なくとも1つと交差反応しない。更なる実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、huSCF又はhuCSF1の何れとも交差反応しない。1つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。1つの実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、(a)IgA定常ドメイン;(b)IgD定常ドメイン;(c)IgE定常ドメイン;(d)IgG1定常ドメイン;(e)IgG2
定常ドメイン;(f)IgG3定常ドメイン;(g)IgG4定常ドメイン;及び(h)IgM定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。1つの実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、IgG1定常ドメインを含む。別の実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、(a)Igκ定常ドメイン;及び(b)Igλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。1つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトIgG1定常ドメイン及びヒトλ定常ドメインを含む。1つの実施形態では、IgG1定常ドメインは、KabatのEUナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたL234F、L235E及びP331Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む(Edelman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,63:78-85(1969))。
定常ドメイン;(f)IgG3定常ドメイン;(g)IgG4定常ドメイン;及び(h)IgM定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。1つの実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、IgG1定常ドメインを含む。別の実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、(a)Igκ定常ドメイン;及び(b)Igλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。1つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトIgG1定常ドメイン及びヒトλ定常ドメインを含む。1つの実施形態では、IgG1定常ドメインは、KabatのEUナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたL234F、L235E及びP331Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む(Edelman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,63:78-85(1969))。
第2の態様では、本開示は、第1の態様及び/又はその実施形態に従った単離抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子を提供する。第2の態様の1つの実施形態では、核酸分子は、制御配列に操作可能に連結されている。
第3の態様では、本開示は、第2の態様及び/又はその実施形態に従った核酸分子を含むベクターを提供する。
第4の態様では、本開示は、第2の態様及び/若しくはその実施形態に従った核酸分子又は第3の態様に従ったベクターを用いて形質転換された宿主細胞を提供する。1つの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、HEK293細胞、NS0マウス骨髄腫細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。
第5の態様では、本開示は、第1~第4の態様の何れか又はそれらの実施形態の抗体又は抗原結合断片を産生するハイブリドーマを提供する。
第6の態様では、本開示は、第1~第5の態様及び/又はそれらの実施形態の抗体又は抗原結合断片を産生する単離宿主細胞を提供する。
第7の態様では、本開示は、第1~第6の態様又はそれらの実施形態の何れかに従った抗体又はその抗原結合断片を作成する方法であって、(a)前記抗体又は抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養するステップ或いは第3の態様若しくはその実施形態の宿主細胞又は第4の態様に従ったハイブリドーマを培養するステップ;及び(b)前記培養された宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを含む方法を提供する。
第8の態様では、本開示は、第6の態様の方法に従って生成された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
第9の態様では、本開示は、第1~第8の態様の何れか又はそれらの実施形態の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。1つの実施形態では、本医薬組成物は、医薬品として使用するために提供される。
第10の態様では、本開示は、急性又は慢性炎症性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、第1~第9の態様の何れか又はそれらの実施形態に従った単離抗体又はその断片を投与するステップを含む方法を提供する。1つの実施形態では、炎症性疾患は、例えば、糖尿病、糖尿病性腎症及び高血圧によって誘発されたCKDを含む慢性腎疾患(CKD)を含む。
第11の態様では、本開示は、自己免疫疾患を治療するための方法であって、それを必
要とする対象に、薬学的有効量の、第1~第10の態様の何れか又はそれらの実施形態に従った単離抗体又はその断片を投与するステップを含む方法を提供する。1つの実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬又は関節リウマチを含む。
要とする対象に、薬学的有効量の、第1~第10の態様の何れか又はそれらの実施形態に従った単離抗体又はその断片を投与するステップを含む方法を提供する。1つの実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬又は関節リウマチを含む。
本開示のこれら及び他の特徴及び利点は、添付の請求項と一緒に本開示の下記の詳細な説明からより詳細に理解されるであろう。請求項の範囲は、その中の詳述によって定義されており、本明細書に記載した特徴及び利点に関する特定の考察によって定義されるものではないことに留意されたい。
本発明は、FLT3Lに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。一部の態様では、そのような分子は、FLT3Lに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片である。1つの実施形態では、本明細書に開示した抗FLT3L抗体は、炎症性シグナル伝達経路の活性化を阻害するために、FLT3/FLT3L結合を阻害又は減少させるために使用され得る。そのようなアプローチは、シグナル伝達源で炎症を攻撃して、より強固な抗炎症治療作用を許容するために有益である。抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む、関連するポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物も提供される。更に、本明細書に開示した抗FLT3L抗体及び抗原結合断片を生成する方法並びにそれらを使用する方法、例えば対象における自己免疫疾患及び/又は慢性炎症性疾患を治療する方法(直接療法、アジュバント療法として又は併用療法において)も企図されている。
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語について最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明を通して規定する。
定義
本発明について詳細に説明する前に、特定の組成物又はプロセスステップは、変動し得るため、本発明は、特定の組成物又はプロセスステップに限定されないことを理解すべきである。他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。下記の参考文献は、当業者に本開示において使用する多数の用語の一般的定義を提供する:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);及びHale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書で使用するように、下記の用語は、他に特に規定しない限り、以下でそれらに与えられた意味を有する。
本発明について詳細に説明する前に、特定の組成物又はプロセスステップは、変動し得るため、本発明は、特定の組成物又はプロセスステップに限定されないことを理解すべきである。他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。下記の参考文献は、当業者に本開示において使用する多数の用語の一般的定義を提供する:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);及びHale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書で使用するように、下記の用語は、他に特に規定しない限り、以下でそれらに与えられた意味を有する。
本開示において使用する用語「抗体」(又はその断片、変異体若しくは誘導体)は、例えば、B細胞によって生成された典型的な抗体に関連して、抗原、例えば少なくとも1本の重鎖(VH)の可変ドメイン及び1本の軽鎖(VL)の可変ドメインに結合することが
できる抗体の少なくとも最小部分を意味する。脊椎動物系における基本的な抗体構造は、比較的明確に理解されている。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.,1988)を参照されたい。抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、エピトープ結合断片(例えば、Fab、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、VL又はVHドメインの何れかを含有する断片(Fd)、Fab発現ライブラリーによって生成された断片及び抗原結合機能、即ち例えばFLT3Lに特異的に結合する能力を保持している他の抗体断片及びそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
できる抗体の少なくとも最小部分を意味する。脊椎動物系における基本的な抗体構造は、比較的明確に理解されている。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.,1988)を参照されたい。抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、エピトープ結合断片(例えば、Fab、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、VL又はVHドメインの何れかを含有する断片(Fd)、Fab発現ライブラリーによって生成された断片及び抗原結合機能、即ち例えばFLT3Lに特異的に結合する能力を保持している他の抗体断片及びそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2本の重(H)鎖及び2本の軽(L)鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVH又はVHと略記する)及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメインであるCH1、CH2及びCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVL又はVLと略記する)及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインであるCLから構成される。VH及びVL領域は、より保存された、フレームワーク領域(FW)と称される領域を間に挟んで、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性領域に更に細分され得る。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4で配列された3つのCDR及び4つのFWから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第1成分(Clq)を含む宿主組織又は因子への結合を媒介し得る。本開示の典型的な抗体としては、抗FLT3L抗体(原抗体及び生殖細胞系抗体)、親和性最適化クローン、ADCCが欠如する最適化抗体、複合体化抗体(例えば、ADC)及び他の最適化抗体(例えば、YTE突然変異を含む血清半減期最適化抗体)が挙げられる(それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるDall’Acqua et al.,J.Biol.Chem.281:23514-24(2006)及び米国特許第7,083,784号明細書を参照されたい)。
特定の実施形態では、VHのCDR(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)並びにVLのCDR(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)は、(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38のアミノ酸配列からなる。
抗体は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づき、5つの主要クラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM又はそれらのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)の何れかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体は、裸抗体であり得るか、又はADCを形成するために毒素、放射性同位体等の他の分子に複合体化され得る。
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、FLT3L等のそれが結合する抗原の生物活性を阻害又は減少させる抗体である。特定の態様では、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的又は完全に阻害する。例えば、FLT3のFLT3L媒介性活性化は、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少な
くとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%,少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は更に100%減少させることができる。
くとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%,少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は更に100%減少させることができる。
用語「FLT3L抗体」、「FLT3Lに結合する抗体」又は「抗FLT3L抗体」は、その分子がFLT3Lを標的とする際の治療薬又は診断用試薬として有用であるように十分な親和性でFLT3Lに結合することができる抗体又はその抗原結合断片を指す。用語「抗FLT3L」には、例えば、スカフォールド内に組み込まれた本明細書に開示した抗体のCDRを含む分子も広範囲に含まれる。
用語「生殖系列化」は、抗体内の特定位置のアミノ酸が生殖細胞系内の抗体に突然変異により戻されることを意味する。
抗体の「可変領域」は、単独で又は組み合わせての何れかで抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖各々の可変領域は、3つのCDR領域によって連結された4つのFW領域からなる。各鎖内のCDRは、他の鎖からのCDRと共にFW領域によって極めて密接に一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するために少なくとも2種の技術がある:(1)異種間配列可変性に基づくアプローチ(即ちKabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.));及び(2)抗原-抗体複合体に関する結晶学的研究に基づくアプローチ(Al-lazikani et al.(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。更に、当技術分野では、CDRを決定するためにこれらの2種のアプローチの組合せがときに使用される。
Kabatのナンバリングシステムは、一般に可変ドメイン内の残基(およそ軽鎖の1~107個の残基及び重鎖の1~113個の残基)について言及する場合に使用される(例えば、Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
語句「Kabatにおけるアミノ酸位置のナンバリング」又は「Kabat位置」等は、Kabat et al.,1991において抗体の集積の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対して使用されたナンバリングシステムを指す。
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」及び「結合断片」は、抗体と抗原との間の特異的結合に責任を有するアミノ酸を含む抗体分子の一部を意味する。可変領域は、抗体又は抗原結合断片が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能にする。即ち、抗体のVHドメイン及びVLドメイン又は相補性決定領域(CDR)のサブセットは、結合して三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。より詳細には、抗原結合ドメインは、VH鎖及びVL鎖各々の上の3つのCDRによって定義される。本明細書で使用する抗原結合ドメインとの特異的相互作用に責任を有する抗原分子の一部分は、「エピトープ」と呼ばれる。抗原結合ドメインは、典型的には抗体軽鎖可変領域及び抗体重鎖可変領域を含むが、しかしながら、必ずしも両方を含んではいない。例えば、いわゆる「Fd」抗体断片は、VHドメインのみからなるが、依然としてインタクト抗体の一部の抗原結合機能を維持している。
抗体の結合断片は、組換えDNA技術又はインタクト抗体の酵素的開裂若しくは化学的
開裂によって生成される。結合断片としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv及び一本鎖抗体が挙げられる。酵素であるパパインによる抗体の消化は、「Fab」断片としても公知である2つの同一抗原結合断片と、抗原結合活性を有していないが、結晶化する能力を有する「Fc」断片とを生じさせる。酵素であるペプシンによる抗体の消化は、その抗体分子の2本のアームが結合したままであり、2つの抗原結合部位を含むF(ab’)2断片を生じさせる。F(ab’)2断片は、抗原に架橋結合する能力を有する。本明細書で使用する場合の「Fv」は、抗原認識部位及び抗原結合部位の両方を維持する抗体の最小断片を指す。本明細書で使用する場合の「Fab」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のCH1ドメインを含む抗体の断片を指す。
開裂によって生成される。結合断片としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv及び一本鎖抗体が挙げられる。酵素であるパパインによる抗体の消化は、「Fab」断片としても公知である2つの同一抗原結合断片と、抗原結合活性を有していないが、結晶化する能力を有する「Fc」断片とを生じさせる。酵素であるペプシンによる抗体の消化は、その抗体分子の2本のアームが結合したままであり、2つの抗原結合部位を含むF(ab’)2断片を生じさせる。F(ab’)2断片は、抗原に架橋結合する能力を有する。本明細書で使用する場合の「Fv」は、抗原認識部位及び抗原結合部位の両方を維持する抗体の最小断片を指す。本明細書で使用する場合の「Fab」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のCH1ドメインを含む抗体の断片を指す。
本明細書で使用するFc領域としては、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドが挙げられる。従って、Fcは、IgA、IgD及びIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン並びにIgE及びIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインへの可撓性ヒンジN末端とを指す。IgA及びIgMについて、Fcは、J鎖を含み得る。IgGについて、Fcは、免疫グロブリンドメインであるCガンマ2及びCガンマ3(Cy2及びCy3)並びにCガンマ1(Cy1)とCガンマ2(Cy2)との間のヒンジを含む。Fc領域の境界は、変動し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、そのカルボキシル末端への残基C226又はP230を含むと定義されており、ここで、ナンバリングは、Kabat et al.,1991に規定されているEUインデックスに従っている。
「モノクローナル抗体」は、単一抗原決定因子又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関係している均質な抗体集団を指す。これは、典型的には、異なる抗原決定因子に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。
用語の「モノクローナル抗体」には、インタクト及び全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等)、一本鎖可変断片(scFv)、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子が含まれる。更に、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現及びトランスジェニック動物を含むが、それらに限定されない多数の方法で作成されたそのような抗体を指す(例えば、トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の発現)。
用語「ヒト化抗体」は、ヒトにおいて生成される抗体変異体との類似性を増加させるために遺伝子組換えされている非ヒト(例えば、マウス)免疫グロブリンに由来する抗体を指す。
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生成された抗体又は当技術分野において公知の任意の技術(例えば、培養物細胞内での組換え発現又はトランスジェニック動物における発現)を使用して作成されたヒトによって生成された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。従って、用語「ヒト抗体」は、最初にヒトによって生成された抗体に対応するアミノ酸配列を有するが、非ヒト系中で発現させた(例えば、化学合成によって生成された;微生物、哺乳動物又は昆虫細胞中で組換え的に発現された;又は動物対象において発現された)抗体(又はその遺伝子組換え変異体若しくは誘導体)も含む。従って、ヒト対象又はヒト細胞(例えば、組換え抗体又はその断片を発現するハイブリドーマ又は細胞系)から得られ、引き続いて動物、例えばマウスにおいて発現された抗体は、ヒト抗体と見なされる。ヒト抗体についてのこの定義には、インタクト抗体若しくは全長抗体、それらの断片、及び/又は少なくとも1つのヒト重鎖、及び/又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えばマウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2種以上の動物種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、及び/又は親和性、及び/又は能力を備える1種の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ等)に由来する抗体の可変領域に対応する一方、定常領域は、その種における免疫反応を引き出すことを回避するために別の種(通常、ヒト)に由来する抗体内の配列と相同である。
用語「ポリヌクレオチド」は、単一核酸及び複数の核酸を含み、単離核酸分子又は構築物、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)又はプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合又は非従来型結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)において見出されるようなアミド結合)を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド内に存在する任意の1つ以上の核酸セグメント、例えばDNA又はRNA断片を指す。「単離」核酸又はポリヌクレオチドは、その自然環境から除去されている核酸分子、DNA又はRNAであることが意図されている。例えば、ベクター内に含有されるポリペプチドサブユニットをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示したように単離されたと見なされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞内で維持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中で(部分的若しくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離RNA分子としては、ポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロRNA転写産物が挙げられる。単離ポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生成されたそのような分子を更に含む。更に、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターであり得るか又はそれらを含み得る。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、DNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1つ以上のコーディング領域と操作可能に関連しているプロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。操作可能な関連又は連結は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのためのコーディング領域に調節配列の影響下又は制御下でその遺伝子産物の発現を配置できるような方法で1つ以上の調節配列が関連している場合である。2つのDNA断片(ポリペプチドコーディング領域及びそれと関連しているプロモーター等)は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写を生じさせる場合及び2つのDNA断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害しない場合又はDNA鋳型が転写される能力を妨害しない場合、「操作可能に関連している」又は「操作可能に連結している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を実行できる場合、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に関連されるであろう。プロモーターは、事前に決定された細胞においてのみDNAの実質的転写を指令する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するためにポリヌクレオチドと操作可能に関連付けることができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示されている。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形態であるRNAであり得る。
「ベクター」は、宿主細胞内に導入され、それにより形質転換宿主細胞を生成する核酸分子である。ベクターは、複製起源等の宿主細胞内で複製することを許容する核酸配列を含み得る。ベクターは、1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子及び当技術分野において公知の他の遺伝要素も含み得る。
「形質転換」細胞又は「宿主」細胞は、その中に分子生物学技術によって核酸分子が導
入されている細胞である。本明細書で使用する用語「形質転換」は、それによって核酸分子がそのような細胞内に導入され得る、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換並びにエレクトロポレーション、リポフェクション及び粒子銃加速法による裸のDNAの導入を含む全ての技術を含んでいる。形質転換細胞又は宿主細胞は、細菌細胞又は真核細胞であり得る。
入されている細胞である。本明細書で使用する用語「形質転換」は、それによって核酸分子がそのような細胞内に導入され得る、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換並びにエレクトロポレーション、リポフェクション及び粒子銃加速法による裸のDNAの導入を含む全ての技術を含んでいる。形質転換細胞又は宿主細胞は、細菌細胞又は真核細胞であり得る。
本明細書で使用する用語「FLT3L」は、FMS様チロシンキナーゼ3受容体(FLT3)受容体に結合する造血サイトカインであるポリペプチドである、ネコMcDonough肉腫(FMS)様チロシンキナーゼ3受容体リガンドを指す。FLT3Lは、最初に膜結合タンパク質として発現され、その後、酵素を使用して可溶性形態に開裂される。膜結合(mFLT3L)及び分泌(sFLT3L)の両方は、FLT3Lの定義内に含まれる。
本開示では、「含む」、「含んでいる」、「含有している」及び「有する」等は、米国特許法においてそれらに帰せられている意味を有することができ、「包含する」、「包含している」等を意味することができる。「~から本質的になっている」又は「~から本質的になる」も、同様に、米国特許法においてそれらに帰せられている意味を有し、非限定的であり、言及されているものを超える存在は、言及されているものの基本的又は新規な特徴が、列挙されているものを超える存在によって変化されない限り許容されるが、先行技術の実施形態を除外する。
本明細書で使用する用語「決定する」、「評価する」、「アッセイする」、「測定する」及び「検出する」は、定量的及び定性的の両方の決定を意味しており、従って、用語「決定する」は、「アッセイする」、「測定する」等と同義的に使用される。定量的決定が意図される場合、被分析物等の「量を決定する」という語句が使用され得る。定性的及び/又は定量的決定が意図される場合、被分析物の「レベルを決定する」又は被分析物を「検出する」という語句が使用される。
2種以上の核酸又はポリペプチドに関連して、用語「同一である」又は「パーセント同一性」は、配列同一性の一部として任意の保存的アミノ酸置換を考察せずに最高一致について比較及び(必要に応じてギャップを導入して)アラインメントした場合、同一であるか、又は規定のパーセンテージのヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する2つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウエア若しくはアルゴリズムを使用して又は目視検査によって測定され得る。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用できる様々なアルゴリズム及びソフトウエアは、当技術分野において公知である(例えば、Karlin et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877において改良され、NBLASTプログラム及びXBLASTプログラム(Altschul et al.,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)に組み込まれたKarlin et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268を参照されたい)。特定の実施形態では、Gapped BLASTは、Altschul et al.,1997,Nucleic Acids
Res. 25:3389-3402、BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul et al.,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)又はMegalign(DNASTAR)に記載されたように使用することができる。
Res. 25:3389-3402、BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul et al.,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)又はMegalign(DNASTAR)に記載されたように使用することができる。
用語「単離された」は、その自然環境に存在しない分子を指す。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離抗体は、その天然又は自然環境では生成されないか又は位
置していない抗体である。組換え生成された生物学的物質は、例えば、ハイブリドーマなどの非天然細胞中で生成される物質であるため、本明細書で開示したように単離されていると見なされる。例えば、抗体等の単離タンパク質である物質も、任意の好適な技術によって分離、分別又は部分的若しくは実質的に精製されている場合、「単離された」と見なされる。例えば、抗体は、それが、細胞物質又はそれが由来する細胞若しくは組織起源の他のタンパク質を実質的に含んでいなければ、「単離された」と見なされる。
置していない抗体である。組換え生成された生物学的物質は、例えば、ハイブリドーマなどの非天然細胞中で生成される物質であるため、本明細書で開示したように単離されていると見なされる。例えば、抗体等の単離タンパク質である物質も、任意の好適な技術によって分離、分別又は部分的若しくは実質的に精製されている場合、「単離された」と見なされる。例えば、抗体は、それが、細胞物質又はそれが由来する細胞若しくは組織起源の他のタンパク質を実質的に含んでいなければ、「単離された」と見なされる。
用語「特異的に結合する」は、分子(例えば、受容体又はエピトープ)を認識して結合し、且つ結合することが作用物質(例えば、抗体)と分子(例えば、リガンド)との間の何らかの相補性を引き起こす作用物質(例えば、リガンド若しくは抗体)を指す。この定義により、抗体は、無作為の関連していない分子に結合する場合より容易にそのリガンドに結合する場合に「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、それにより特定のリガンドに特定の抗体が結合する相対的親和性を認定するために使用される。例えば、抗体「A」は、所定のリガンド(例えば、FLT3L)に対して抗体「B」よりも高い特異性を有すると推定され得る。
本明細書で使用する用語「親和性」は、個別エピトープと抗体のCDRとの結合の強度の尺度を指す。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2nd ed.1988)の第27~28頁を参照されたい。本明細書で使用する用語「アビディティ」は、抗体及び抗原の集団間の複合体の総合的安定性、即ち抗体混合物と抗原との機能的結合強度を指す。例えば、Harlowの第39~34頁を参照されたい。アビディティは、集団内の個々の抗体と特定のエピトープとの親和性並びにまた抗体及び抗原の原子価の両方に関連する。
本明細書で同義的に使用される用語「阻害する」又は「遮断する」は、活性の完全な遮断を含む、生物活性における何らかの統計的有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物活性における約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%の減少を指すことができる。
用語「エフェクター機能」は、結果としてそれらのFc成分とFc受容体又は補体の成分との相互作用を生じる抗体の活性を指す。これらの活性としては、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)及び抗体依存性細胞食作用(ADCP)が挙げられる。従って、変化したエフェクター機能を備える抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその抗原結合断片)は、少なくとも1つのエフェクター機能(例えば、ADCC、CDC及び/又はADCP)の活性を変化させるFc領域における変化(例えば、アミノ酸の置換、欠失若しくは付加又はオリゴ糖の変化)を含有する抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその抗原結合断片)を指す。改良されたエフェクター機能を備える抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその抗原結合断片)は、少なくとも1つのエフェクター機能(例えば、ADCC、CDC及び/又はADCP)の活性を増加させるFc領域における変化(例えば、アミノ酸の置換、欠失若しくは付加又はオリゴ糖の変化)を含有する抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその抗原結合断片)を指す。
用語「対象」は、特別な治療のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、齧歯類等を含むが、それらに限定されない任意の動物(例えば、哺乳動物)を指す。典型的には、用語「対象」、及び「患者」、及び「個体」は、本明細書では同義的に使用される。対象の追加の例としては、非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコが挙げられる。
用語「医薬組成物」は、有効成分(例えば、本明細書に開示した抗FLT3L抗体)の生物活性が有効であることを許容できる形態であり、及びその組成物が投与されるであろう対象にとって許容できない程傷害性である追加の成分を含有していない製剤を指す。そのような組成物は、無菌であり得る。
本明細書に開示した抗FLT3L抗体の「有効量」は、詳細に明記した目的を実施するために十分な量である。「有効量」は、経験により且つ本明細書に記載した目的に関連があるルーチン法で決定することができる。
用語「治療有効量」及び「薬学的有効量」は、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又は対象における疾患若しくは障害を「治療する」ために有効な他の薬物の量を指す。
「治療する」、若しくは「治療」、若しくは「治療するため」又は「緩和する」若しくは「緩和するため」等の用語は、(1)診断された病理学的状態又は障害の進行を治癒させ、その進行を緩徐化し、症状を減少させ、且つ/又は停止させる治療的手段、並びに(2)標的となる病理学的状態又は障害の発生を防止及び/又は緩徐化する予防的又は防止的手段の両方を指す。従って、治療を必要とする対象としては、既に障害を有する対象;障害を有する傾向がある対象;及び障害が防止されなければならない対象が挙げられる。特定の態様では、対象は、患者が、例えば自己免疫疾患又は炎症性疾患と関連する症状の完全な、部分的な又は一過性の減少を示した場合、本開示の方法に従って自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して好結果で「治療される」。
本明細書に提供される範囲は、範囲内の全数値についての省略表現であると理解される。例えば、1~50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50からなる群からの任意の数、数の組合せ又は部分範囲を含むと理解される。
本明細書で使用する用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は、障害及び/又はそれに関連する症状を減少又は緩和することを指す。除外されないが、疾患又は状態を治療することは、その疾患、それに関連する状態又は症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。例えば、本明細書で企図されるように、障害の治療は、その障害の症状の悪化を予防することを含む。
本明細書で使用する用語「又は」は、詳細に明記されていない限り又は文脈からその反対のことが明白でない限り、包括的であると理解すべきである。本明細書で使用する用語「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その」は、詳細に規定しない限り又は文脈からその反対のことが明白でない限り、単数又は複数であると理解すべきである。
更に、本明細書で使用する場合の「及び/又は」は、2つ以上の規定した特徴又は他方を伴うか若しくは伴わない成分の各々の特定の開示であると見なすべきである。従って、本明細書の「A及び/又はB」等の語句において使用される用語「及び/又は」は、「A及びB」、「A又はB」、「A」(単独)及び「B」(単独)を含むことが意図されている。同様に、「A、B及び/又はC」等の語句において使用される用語「及び/又は」は、以下の実施形態:A、B及びC;A、B又はC;A又はC;A又はB;B又はC;A及びC;A及びB;B及びC;及びA(単独);B(単独);及びC(単独)の各々を含むことが意図されている。
詳細に規定しない限り又は文脈から明白でない限り、本明細書で使用する用語「約」は
、当技術分野における通常の容認範囲内、例えば平均値の2つの標準偏差内であると理解される。「約」は、表示値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%又は0.01%超又はそれ未満以内であると理解することができる。他のことが指示されない限り、本明細書に提供した全ての数値は、用語「約」によって黙示的に修飾されていると見なされる。
、当技術分野における通常の容認範囲内、例えば平均値の2つの標準偏差内であると理解される。「約」は、表示値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%又は0.01%超又はそれ未満以内であると理解することができる。他のことが指示されない限り、本明細書に提供した全ての数値は、用語「約」によって黙示的に修飾されていると見なされる。
FLT3Lは、酵素的に可溶性形態に開裂される前に最初に膜結合タンパク質として発現される。膜結合(mFLT3L)及び分泌(sFLT3L)の両方は、機能的に活性である。FLT3L結合領域は、ヒト、齧歯類及びカニクイザルのリガンド/受容体の組合せ間で異種間反応性が存在するため、観察される種を超えて高度に保存されている。しかしながら、結合部位の周囲の重要な突然変異は、FLT3Lに対して生成された中和抗体の異種間反応性の欠如を説明すると考えられる。FLT3Lに対する中和抗体は、古典的及び形質細胞様DC集団に免疫系が長期間の炎症応答を誘導して持続する能力を減少させて影響を及ぼし得る。副次的作用は、循環中NK細胞の減少並びにT細胞及びB細胞活性化の低下を含み、両方の細胞型の生存減少をもたらし得る。これらをまとめると、これらの経路のダウンレギュレーションは、自己免疫性炎症を低下させ得る。
1つの実施形態では、中和抗FLT3L抗体は、FLT3LがFLT3に結合することを阻害することによって免疫恒常性を促進することが企図されている。抗FLT3L抗体戦略は、予想外の受容体二量化又はシグナル伝達のリスクを回避するために、受容体を超えてリガンドを標的とする。その受容体と異なり、膜結合FLT3Lと関連しているシグナル伝達ドメインは存在しない。
抗FLT3L抗体
本開示は、好ましい実施形態では、単離FLT3L結合分子、例えばFLT3L、例えばヒトFLT3Lに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。FLT3Lについての全長アミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である(例えば、ヒトFLT3LについてUniProtアクセッション番号P36888又はマウスFLT3LについてUniProtアクセッション番号Q00342を参照されたい)。本開示の抗FLT3L抗体は、FLT3のFLT3L媒介性活性化を阻害し、それにより前炎症性シグナル伝達を低下させ、対象における炎症を減少させる。
本開示は、好ましい実施形態では、単離FLT3L結合分子、例えばFLT3L、例えばヒトFLT3Lに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。FLT3Lについての全長アミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である(例えば、ヒトFLT3LについてUniProtアクセッション番号P36888又はマウスFLT3LについてUniProtアクセッション番号Q00342を参照されたい)。本開示の抗FLT3L抗体は、FLT3のFLT3L媒介性活性化を阻害し、それにより前炎症性シグナル伝達を低下させ、対象における炎症を減少させる。
好ましい実施形態では、抗FLT3L抗体は、構造的に類似のTKR同族ヒト幹細胞因子(huSCF)又はヒトコロニー刺激因子(huCSF1)と交差反応しない。当業者であれば、SCF及びCSFがチロシンキナーゼ受容体にも結合するリガンドであることを認識するであろう。追加のチロシンキナーゼファミリーメンバーに結合する非特異的FLT3阻害剤は、チロシンキナーゼシグナル伝達の包括的阻害から傷害性を誘発する。従って、抗FLT3L抗体は、FLT3Lのみに結合し、構造的類似のホモログに結合しないことが極めて重要である。多数の抗FLT3L抗体及び阻害剤は、特異性を欠如しており、広範囲のチロシンキナーゼ受容体に結合する。従って、抗FLT3L抗体の好ましい実施形態は、FLT3Lに対する高親和性及びFLT3Lの特異的結合を証明しなければならない。
1つの実施形態では、本開示の抗FLT3L抗体は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及び/又はキメラ抗体である。
一部の態様では、FLT3L結合分子は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、一本鎖Fv若しくはscFv、ジスルフィド結合Fv、V-NARドメイン、IgNar、イントラボディ、IgG CH2、ミニボディ、F(ab’)3、テトラボディ、トリアボディ、ディアボディ、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(s
cFv)2又はscFv-Fcを含む。一部の態様では、抗FLT3L抗体は、IgGタイプ、例えばIgG1タイプ(IgG1重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む)の抗体である。他の実施形態では、抗FLT3L抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3、IgG4又はIgM重鎖免疫グロブリン定常ドメインを有する。
cFv)2又はscFv-Fcを含む。一部の態様では、抗FLT3L抗体は、IgGタイプ、例えばIgG1タイプ(IgG1重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む)の抗体である。他の実施形態では、抗FLT3L抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG2、IgG3、IgG4又はIgM重鎖免疫グロブリン定常ドメインを有する。
一部の実施形態では、IgG定常領域は、Igκ定常ドメイン(領域)及びIgλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖定常領域を含み得る。1つの特定の実施形態では、抗FLT3L抗体は、ヒトIgG1定常ドメイン及びヒトλ定常ドメインを含む。別の特定の実施形態では、抗FLT3L抗体は、Fc領域内の標的突然変異が243位のロイシンをフェニルアラニン(L243F)に、235位のロイシンをグルタミン酸(L235E)に、且つ331位のプロリンをセリン(P331S)に変化させるようなIgG1-TMフォーマットを有する。アミノ酸のナンバリングは、EUインデックスに従っている。標的突然変異は、FcR結合及びADCCエフェクター機能を減少させる(例えば、参照により組み込まれるOrganesyan et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2008 Jun 1;64(Pt 6):700-4;及び国際公開第2009100309(A2)号パンフレットを参照されたい)。
一部の態様では、抗FLT3L抗体は、ヒト抗体(例えば、CAT5D9、SC4017、AM40、CAT8、CAT26、DTAX3及びDYAX5抗体)である。
CAT5D9抗体
1つの実施形態では、CAT5D9抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、CAT5D9抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、CAT5D9抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVLドメイン及び配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、CAT5D9抗体は、配列番号6のアミノ酸配列を有する2つのVLドメイン及び配列番号5のアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、CAT5D9抗体は、配列番号20の核酸配列によってコードされた2つのVLドメイン及び配列番号19の核酸配列によってコードされた2つのVHドメインを含む抗体を指す。
1つの実施形態では、CAT5D9抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号70のアミノ酸配列を有する1本の軽鎖及び配列番号69のアミノ酸配列を有する1本の重鎖を含むIgG1抗体を指す。
別の実施形態では、CAT5D9抗体は、配列番号72の核酸配列によってコードされた1本の軽鎖及び配列番号71の核酸配列によってコードされた1本の重鎖を含む抗体を指す。
SC4017抗体
1つの実施形態では、SC4017抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、SC4017抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、SC4017抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVLドメイン及び配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、SC4017抗体は、配列番号4のアミノ酸配列を有する2つのVLドメイン及び配列番号3のアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、SC4017抗体は、配列番号18の核酸配列によってコードされた2つのVLドメイン及び配列番号17の核酸配列によってコードされた2つのVHドメインを含む抗体を指す。
1つの実施形態では、SC4017抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号66のアミノ酸配列を有する1本の軽鎖及び配列番号65のアミノ酸配列を有する1本の重鎖を含むIgG1抗体を指す。
別の実施形態では、SC4017抗体は、配列番号68の核酸配列によってコードされた1本の軽鎖及び配列番号67の核酸配列によってコードされた1本の重鎖を含む抗体を指す。
AM40(MEDI1116)抗体
1つの実施形態では、AM40抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、AM40抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、AM40抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVLドメイン及び配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、AM40抗体は、配列番号2のアミノ酸配列を有する2つのVLドメイン及び配列番号1のアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、AM40抗体は、配列番号16の核酸配列によってコードされた2つのVLドメイン及び配列番号15の核酸配列によってコードされた2つのVHドメインを含む抗体を指す。
1つの実施形態では、AM40抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号62のアミノ酸配列を有する1本の軽鎖及び配列番号61のアミノ酸配列を有する1本の重
鎖を含むIgG1抗体を指す。
鎖を含むIgG1抗体を指す。
別の実施形態では、AM40抗体は、配列番号64の核酸配列によってコードされた1本の軽鎖及び配列番号63の核酸配列によってコードされた1本の重鎖を含む抗体を指す。
CAT8抗体
1つの実施形態では、CAT8抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号39、40、41、42、43及び44のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、CAT8抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号39、40、41、42、43及び44のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、CAT8抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVLドメイン及び配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、CAT8抗体は、配列番号8のアミノ酸配列を有する2つのVLドメイン及び配列番号7のアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、CAT8抗体は、配列番号22の核酸配列によってコードされた2つのVLドメイン及び配列番号21の核酸配列によってコードされた2つのVHドメインを含む抗体を指す。
1つの実施形態では、CAT8抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号74のアミノ酸配列を有する1本の軽鎖及び配列番号73のアミノ酸配列を有する1本の重鎖を含むIgG1抗体を指す。
別の実施形態では、CAT8抗体は、配列番号76の核酸配列によってコードされた1本の軽鎖及び配列番号75の核酸配列によってコードされた1本の重鎖を含む抗体を指す。
CAT26抗体
1つの実施形態では、CAT26抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号45、40、46、47、48及び49のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、CAT26抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号45、40、46、47、48及び49のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、CAT26抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVLドメイン及び配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、CAT26抗体は、配列番号10のアミノ酸配列を有する2つのVLドメイン及び配列番号9のアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、CAT26抗体は、配列番号24の核酸配列によってコードされた2つのVLドメイン及び配列番号23の核酸配列によってコードされた2つのVHドメインを含む抗体を指す。
1つの実施形態では、CAT26抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号78のアミノ酸配列を有する1本の軽鎖及び配列番号77のアミノ酸配列を有する1本の重鎖を含むIgG1抗体を指す。
別の実施形態では、CAT26抗体は、配列番号80の核酸配列によってコードされた1本の軽鎖及び配列番号79の核酸配列によってコードされた1本の重鎖を含む抗体を指す。
DYAX3抗体
1つの実施形態では、Dyax3抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号50、51、52、53、54及び55のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、Dyax3抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号50、51、52、53、54及び55のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、Dyax3抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号82のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVLドメイン及び配列番号81のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、Dyax3抗体は、配列番号12のアミノ酸配列を有する2つのVLドメイン及び配列番号11のアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、Dyax3抗体は、配列番号26の核酸配列によってコードされた2つのVLドメイン及び配列番号25の核酸配列によってコードされた2つのVHドメインを含む抗体を指す。
1つの実施形態では、Dyax3抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号82のアミノ酸配列を有する1本の軽鎖及び配列番号81のアミノ酸配列を有する1本の重鎖を含むIgG1抗体を指す。
別の実施形態では、Dyax3抗体は、配列番号84の核酸配列によってコードされた1本の軽鎖及び配列番号83の核酸配列によってコードされた1本の重鎖を含む抗体を指す。
DYAX5抗体
1つの実施形態では、Dyax5抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号56、57、52、58、59及び60のアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態では、Dyax5抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ相補性決定領域(CDR):HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む抗体を指す。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号56、57、52、58、59及び60のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、Dyax5抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号86のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性
を有する2つのVLドメイン及び配列番号85のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
を有する2つのVLドメイン及び配列番号85のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、Dyax5抗体は、配列番号14のアミノ酸配列を有する2つのVLドメイン及び配列番号13のアミノ酸配列を有する2つのVHドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、Dyax5抗体は、配列番号28の核酸配列によってコードされた2つのVLドメイン及び配列番号27の核酸配列によってコードされた2つのVHドメインを含む抗体を指す。
1つの実施形態では、Dyax5抗体は、FLT3Lに特異的に結合し、且つ配列番号86のアミノ酸配列を有する1本の軽鎖及び配列番号85のアミノ酸配列を有する1本の重鎖を含むIgG1抗体を指す。
別の実施形態では、Dyax5抗体は、配列番号88の核酸配列によってコードされた1本の軽鎖及び配列番号87の核酸配列によってコードされた1本の重鎖を含む抗体を指す。
特定の実施形態では、相補性決定領域(CDR)の組:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むFLT3Lに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供が提供され、ここで、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3及びFW4で配列された3つのCDR及び4つのフレームワーク領域(FW)を含む。
特定の態様では、VH領域及びVL領域は、(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
特定の態様では、VHのCDR(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)並びにVLのCDR(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)は、(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38のアミノ酸配列からなる。
抗FLT3L抗体配列の概要表は、下記の表1に提示した。
誘導体
本開示の抗FLT3L抗体は、FLT3Lに特異的に結合する能力を保持していることを前提に配列の変異体を含み得る。そのような変異体は、当業者であれば、当技術分野において周知である技術を使用してこれらの抗体の配列から引き出すことができる。例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加は、抗体のそれらのエピトープへの結合を妨害する抗FLT3L抗体のFR領域内及び/又はCDR内で作成することができる。FR内の変化は、通常、抗原結合ドメインの安定性及び免疫原性を改善するために設計されるが、CDR内の変化は、典型的には抗原結合ドメインのその標的への親和性を高めるために設計される。FRの変異体には、天然型免疫グロブリンアロタイプも挙げられる。そのような親和性を高める変化は、CDRを変化させること及び抗原結合ドメインのその標的への親和性を試験することを含むルーチン技術によって経験的に決定することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、本明細書に開示したCDRの何れか1つ内で作成することができる。様々な変化は、Antibody Engineering,2nd ed.,Oxford University Press,ed.Borrebaeck,1995に記載された方法に従って作成できる。これらの変化には、配列内で機能的に均等なアミノ酸残基をコードし、従って「サイレント」変化を生成する様々なコドンの置換によって変化されるヌクレオチド配列が含まれるが、それらに限定されない。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正荷電(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負荷電(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
本開示の抗FLT3L抗体は、FLT3Lに特異的に結合する能力を保持していることを前提に配列の変異体を含み得る。そのような変異体は、当業者であれば、当技術分野において周知である技術を使用してこれらの抗体の配列から引き出すことができる。例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加は、抗体のそれらのエピトープへの結合を妨害する抗FLT3L抗体のFR領域内及び/又はCDR内で作成することができる。FR内の変化は、通常、抗原結合ドメインの安定性及び免疫原性を改善するために設計されるが、CDR内の変化は、典型的には抗原結合ドメインのその標的への親和性を高めるために設計される。FRの変異体には、天然型免疫グロブリンアロタイプも挙げられる。そのような親和性を高める変化は、CDRを変化させること及び抗原結合ドメインのその標的への親和性を試験することを含むルーチン技術によって経験的に決定することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、本明細書に開示したCDRの何れか1つ内で作成することができる。様々な変化は、Antibody Engineering,2nd ed.,Oxford University Press,ed.Borrebaeck,1995に記載された方法に従って作成できる。これらの変化には、配列内で機能的に均等なアミノ酸残基をコードし、従って「サイレント」変化を生成する様々なコドンの置換によって変化されるヌクレオチド配列が含まれるが、それらに限定されない。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正荷電(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負荷電(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
本開示の抗体の誘導体及びアナログは、組換え法及び合成法(Maniatis(1990)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.及びBodansky et al.(1995)The Practice of Peptide Synthesis,2nd ed.,Spring Verlag,Berlin,Germany)を含む、当技術分野において周知である様々な技術によって作成できる。
1つの実施形態では、本開示のVHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインを作成するための方法は、本明細書に開示したVHドメインのアミノ酸配列内に1つ以上のアミノ酸を付加するか、欠失させるか、置換するか又は挿入するステップ、任意選択的にこのように提供されたVHドメインを1つ以上のVLドメインと結合するステップ及びVHドメイン又はVH/VLの1つ以上の組合せを抗原への特異的結合について試験するステップを含む。本明細書に開示したVLドメインの1つ以上の配列変異体が1つ以上の
VHドメインと結合される類似の方法を使用できる。
VHドメインと結合される類似の方法を使用できる。
類似のシャッフリング又はコンビナトリアル技術は、β-ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術について記載しているが、そのアプローチが抗体生成のために使用できることを観察しているStemmer(Nature(1994)370:389-391)によっても開示されている。
更なる実施形態では、1つ以上の選択されたVH及び/又はVL遺伝子のランダム突然変異誘発法を使用して、本明細書に開示した配列に由来する1つ以上の配列を有する新規なVH又はVL領域を生成することができる。1つのそのような技術、error-prone(変異性)PCRは、Gram et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89:3576-3580)によって記載されている。
使用できる別の方法は、VH又はVL遺伝子のCDRに突然変異誘発を方向付けることである。そのような技術は、Barbas et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)91:3809-3813)及びSchier et al.(J.Mol.Biol.(1996)263:551-567)によって開示されている。
同様に、抗原結合ドメインの1つ、2つ又は3つ全てのCDRは、VH又はVLドメインのレパートリー内に移植することができ、それらは、その後、FLT3Lに対して特異的である抗原結合断片に対してスクリーニングされる。
本明細書で有用である免疫グロブリン可変ドメインの一部分は、本明細書に実質的に規定した少なくとも1つのCDR及び任意選択的に本明細書に規定したscFv断片由来の介在性フレームワーク領域を含み得る。その部分は、FR1及びFR4の何れか又は両方の少なくとも約50%を含むことができ、その50%は、FR1のC末端50%及びFR4のN末端50%である。可変ドメインの実質的部分のN末端又はC末端にある追加の残基は、通常、天然型可変ドメイン領域と関連していない残基であり得る。例えば、組換えDNA技術による抗体の構築は、クローニング又は他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによってコードされたN末端又はC末端残基の導入を生じさせ得る。他の操作ステップには、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン(例えば、ダイアボディの生成における)又は下記でより詳細に考察するタンパク性標識を含む、更なるタンパク質配列に可変ドメインを結合するためのリンカーの導入が含まれる。
本明細書に記載した本開示の抗原結合ドメインは、他の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質(アルブミン、別の抗体等)に結合させることができる。例えば、抗原結合ドメインは、化学的架橋結合又は組換え法によって結合させることができる。抗原結合ドメインは、様々な非タンパク性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンの1つに、米国特許第4,640,835号明細書;同第4,496,689号明細書;同第4,301,144号明細書;同第4,670,417号明細書;同第4,791,192号明細書;又は同第4,179,337号明細書に規定した方法で結合させることもできる。抗原結合ドメインは、例えば、それらの循環中半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾することができる。典型的なポリマー及びそれらに付着させるための方法は、米国特許第4,766,106号明細書;同第4,179,337号明細書;同第4,495,285号明細書及び同第4,609,546号明細書にも示されている。
本明細書に開示した抗体は、自然パターンと異なるグリコシル化パターンを有するように変化させることもできる。例えば、1つ以上の炭水化物部位を欠失させることができ、
且つ/又は1つ以上のグリコシル化部位を付加することができる。本明細書に開示した抗体断片へのグリコシル化部位の付加は、当技術分野において公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって実施することができる。抗体断片上の炭水化物部位の数を増加させる別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによる。そのような方法は、国際公開第87/05330号パンフレット及びAplin et al.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.,22:259-306に記載されている。抗体からの任意の炭水化物部分の除去は、例えば、Hakimuddin et al.(1987)Arch.Biochem.Biophys.,259:52;Edge et al.(1981)Anal.Biochem.,118:131及びThotakura et al.(1987)Meth.Enzymol.,138:350に記載されているように、科学的又は酵素的に実施することができる。抗体断片は、検出可能な標識又は機能的標識を用いて標識することもできる。検出可能な標識には、従来型化学を使用して更に抗体断片に付着させることもできる放射性標識、例えば131I又は99Tcが含まれる。検出可能な標識には、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等も含まれる。検出可能な標識には、化学的部分、例えば特異的同族検出可能部分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出できるビオチンが更に含まれる。
且つ/又は1つ以上のグリコシル化部位を付加することができる。本明細書に開示した抗体断片へのグリコシル化部位の付加は、当技術分野において公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって実施することができる。抗体断片上の炭水化物部位の数を増加させる別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによる。そのような方法は、国際公開第87/05330号パンフレット及びAplin et al.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.,22:259-306に記載されている。抗体からの任意の炭水化物部分の除去は、例えば、Hakimuddin et al.(1987)Arch.Biochem.Biophys.,259:52;Edge et al.(1981)Anal.Biochem.,118:131及びThotakura et al.(1987)Meth.Enzymol.,138:350に記載されているように、科学的又は酵素的に実施することができる。抗体断片は、検出可能な標識又は機能的標識を用いて標識することもできる。検出可能な標識には、従来型化学を使用して更に抗体断片に付着させることもできる放射性標識、例えば131I又は99Tcが含まれる。検出可能な標識には、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等も含まれる。検出可能な標識には、化学的部分、例えば特異的同族検出可能部分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出できるビオチンが更に含まれる。
CDR配列が、本明細書に規定したCDR配列と非実質的にのみ相違する抗原結合ドメインは、本開示の範囲内に含まれる。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性又は立体化学的特徴を有する関連アミノ酸によって置換される。そのような置換は、当業者の技術の範囲内に含まれるであろう。CDRと異なり、抗体の結合特性に有害な影響を及ぼさずにFR内でより実質的な変化を加えることができる。FRへの変化には、非ヒト由来をヒト化するか、又は抗原接触若しくは結合部位を安定化するために重要である特定のフレームワーク残基を操作すること、例えば定常領域のクラス又はサブクラスを変化させること、例えば米国特許第5,624,821号明細書及び同第5,648,260号明細書並びにLund et al.(1991)J.Immun.147:2657-2662及びMorgan et al.(1995)Immunology 86:319-324に記載されているように、Fc受容体結合等のエフェクター機能を変化させる可能性がある特異的アミノ酸残基を変化させること又は定常領域がそれに由来する種を変化させることが含まれるが、それらに限定されない。
当業者であれば、上記に記載した修飾が完全に排他的ではないこと、本明細書に記載したタンパク質サブユニットに適用できること及び多数の他の修飾が本開示の教示に照らせば当業者に可能であろうことを理解するであろう。
抗FLT3L抗体の親和性及び特異性
当業者は、自己免疫疾患において使用するための抗FLT3L抗体が、高親和性の結合を必要とするが、それでもヒトにおけるそれらの使用を妨害する傷害性が欠如していなければならないことを認識するであろう。FLT3Lの構造的類似のホモログとしては、幹細胞因子(KIT-リガンドとしても公知であるSCF)及びコロニー刺激因子1(マクロファージコロニー刺激因子「M-CSF」としても公知であるCSF1)が挙げられる。FLT3Lに結合し、且つSCF及びCSF1にも結合する非特異的抗FLT3L抗体は、非特異的な傷害性を生じさせ得る。従って、本開示の抗FLT3L抗体は、FLT3Lのみに対する結合特異性を保持しているが、SCF及びCSF1等の構造的に類似のサイトカインには特異的に結合しない。当業者であれば、結合特異性の尺度としてのKon、Koff及びKDを含むが、それには限定されない結合動態を使用することを知っているであろう。
当業者は、自己免疫疾患において使用するための抗FLT3L抗体が、高親和性の結合を必要とするが、それでもヒトにおけるそれらの使用を妨害する傷害性が欠如していなければならないことを認識するであろう。FLT3Lの構造的類似のホモログとしては、幹細胞因子(KIT-リガンドとしても公知であるSCF)及びコロニー刺激因子1(マクロファージコロニー刺激因子「M-CSF」としても公知であるCSF1)が挙げられる。FLT3Lに結合し、且つSCF及びCSF1にも結合する非特異的抗FLT3L抗体は、非特異的な傷害性を生じさせ得る。従って、本開示の抗FLT3L抗体は、FLT3Lのみに対する結合特異性を保持しているが、SCF及びCSF1等の構造的に類似のサイトカインには特異的に結合しない。当業者であれば、結合特異性の尺度としてのKon、Koff及びKDを含むが、それには限定されない結合動態を使用することを知っているであろう。
血清中FLT3L及び循環中pDCは、抗FLT3L抗体リードクローンと関連してい
る傷害性の指標として使用できるバイオマーカーである。FLT3Lが中和された場合のpDCの急激な低下は、免疫反応を強化するFLT3L媒介性細胞シグナル伝達の抑制を示している。FLT3Lの存在下でのpDCの頻度の急激な回復は、抗FLT3L抗体における傷害性の欠如を反映する可能性がある。好ましい実施形態では、抗FLT3L抗体は、FLT3Lを中和し、遊離FLT3Lが回復する場合にcDC及びpDCの可逆性枯渇を許容する。当業者であれば、ベースラインへの回復が続くFLT3Lの中和後の樹状細胞の低下がリードクローンの低傷害性の指標であることを認識するであろう。
る傷害性の指標として使用できるバイオマーカーである。FLT3Lが中和された場合のpDCの急激な低下は、免疫反応を強化するFLT3L媒介性細胞シグナル伝達の抑制を示している。FLT3Lの存在下でのpDCの頻度の急激な回復は、抗FLT3L抗体における傷害性の欠如を反映する可能性がある。好ましい実施形態では、抗FLT3L抗体は、FLT3Lを中和し、遊離FLT3Lが回復する場合にcDC及びpDCの可逆性枯渇を許容する。当業者であれば、ベースラインへの回復が続くFLT3Lの中和後の樹状細胞の低下がリードクローンの低傷害性の指標であることを認識するであろう。
抗FLT3L抗体の生成
本開示の実施は、他に特に指示しない限り、当業者の知識の範囲内に明確に含まれる分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の技術を使用する。そのような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、second edition(Sambrook,1989);「Oligonucleotide Synthesis」(Gait,1984);「Animal Cell Culture」(Freshney,1987);「Methods in Enzymology」、「Handbook of Experimental Immunology」(Weir,1996);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」;(Miller and Calos,1987)「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel,1987);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullis,1994);「Current Protocols in Immunology」(Coligan,1991)等の文献において十分に説明されている。これらの技術は、本開示のポリペプチドの生成に適用することができ、従って本開示を生成及び実施する際に考慮に入れることができる。特定の実施形態のために特に有用な技術について、下記の実施例のセクションにおいて考察する。
本開示の実施は、他に特に指示しない限り、当業者の知識の範囲内に明確に含まれる分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の技術を使用する。そのような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、second edition(Sambrook,1989);「Oligonucleotide Synthesis」(Gait,1984);「Animal Cell Culture」(Freshney,1987);「Methods in Enzymology」、「Handbook of Experimental Immunology」(Weir,1996);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」;(Miller and Calos,1987)「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel,1987);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullis,1994);「Current Protocols in Immunology」(Coligan,1991)等の文献において十分に説明されている。これらの技術は、本開示のポリペプチドの生成に適用することができ、従って本開示を生成及び実施する際に考慮に入れることができる。特定の実施形態のために特に有用な技術について、下記の実施例のセクションにおいて考察する。
1つの実施形態では、抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子は、宿主細胞内での発現のための1つ以上の制御配列に操作可能に連結している。単離核酸は、ベクター内に組換え的に組み込むことができ、これは、次に、公知の技術を使用して宿主細胞内にトランスフェクトされる。
1つの実施形態では、1つ以上の制御配列に操作可能に連結されている抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞は、本明細書で企図されている。企図された宿主細胞の実施例としては、HEK293細胞、NS0マウス骨髄腫細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳動物細胞が挙げられる。
1つの実施形態では、抗FLT3Lモノクローナル抗体(例えば、CAT5D9、SC4017又はAM40)及びその抗原結合断片は、Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495によって記載されるもの等のハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物は、免疫抗原に特異的に結合するであろう抗体のリンパ球による産生を引き出すために、上述したように免疫される。
別の実施形態では、リンパ球は、インビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球は、単離され、例えばポリエチレングリコールを使用して、その後、未融合リンパ球及び骨髄腫細胞から選択して除去できるハイブリドーマ細胞を形成するために、好適な骨髄腫細胞系と融合される。免疫沈降法、免疫ブロッティング法又はインビトロ結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA);酵素結合免疫吸着検定法(ELISA))
によって決定される選択された抗原に対して特異的に立てられたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その後、標準法(Coding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)を使用してインビトロ培養中又は動物における腹水腫瘍としてインビボでの何れかで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、その後、上記のポリクローナル抗体について記載したように培養培地又は腹水液から精製することができる。
によって決定される選択された抗原に対して特異的に立てられたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その後、標準法(Coding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)を使用してインビトロ培養中又は動物における腹水腫瘍としてインビボでの何れかで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、その後、上記のポリクローナル抗体について記載したように培養培地又は腹水液から精製することができる。
代わりに、抗FLT3Lモノクローナル抗体(例えば、CAT5D9、SC4017又はAM40)及びその抗原結合断片は、例えば、米国特許第4,816,567号明細書に記載された組換えDNA法を使用して作成することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドプライマーを使用するRT-PCR等によって成熟B細胞又はハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は、従来型手技を使用して決定される。重鎖及び軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドは、次に、好適な発現ベクター内にクローン化され、これらは、さもなければ宿主細胞によって生成される免疫グロブリンタンパク質、モノクローナル抗体を生成しない大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は骨髄腫細胞等の宿主細胞内にトランスフェクトされる。更に、所望の種の組換え抗FLT3Lモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、(McCafferty et al.,1990,Nature,348:552-554;Clarkson et al.,1991,Nature,352:624-628;及びMarks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)に記載されたように所望の種のCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから単離され得る。
抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、交互抗体を生成するために組換えDNAテクノロジーを使用して多数の異なる方法で更に修飾することができる。一部の態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインは、(1)例えば、キメラ抗体を生成するためにヒト抗体のそれらの領域、又は(2)融合抗体を生成するために非免疫グロブリンポリペプチドと置換され得る。一部の態様では、定常領域は、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成するために切断又は除去される。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異誘発を使用すると、モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
特定の態様では、抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して直接的に調製され得る。インビトロで免疫されたか、又は標的抗原に対して立てられた抗体を生成する免疫した個体から単離された不死化ヒトBリンパ球を生成することができる(例えば、Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boemer et al.,1991,J.Immunol.,147(l):86-95;及び米国特許第5,750,373号明細書を参照されたい)。
更に、抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片は、ファージライブラリーから選択することができ、ここで、そのファージライブラリーは、例えば、Vaughan et al.,1996,Nat.Biotech.14:309-314,Sheets et
al.1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.95:6157-6162,Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381及びMarks et al.1991,J.Mol.Biol.222:581)に記載されているようにヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリーを生
成及び使用するための技術は、米国特許第5,969,108号明細書、同第6,172,197号明細書、同第5,885,793号明細書、同第6,521,404号明細書;同第6,544,731号明細書;同第6,555,313号明細書;同第6,582,915号明細書;同第6,593,081号明細書;同第6,300,064号明細書;同第6,653,068号明細書;同第6,706,484号明細書及び同第7,264,963号明細書;並びにRothe et al.,2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(これらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み込まれる)にも記載されている。
al.1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.95:6157-6162,Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381及びMarks et al.1991,J.Mol.Biol.222:581)に記載されているようにヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリーを生
成及び使用するための技術は、米国特許第5,969,108号明細書、同第6,172,197号明細書、同第5,885,793号明細書、同第6,521,404号明細書;同第6,544,731号明細書;同第6,555,313号明細書;同第6,582,915号明細書;同第6,593,081号明細書;同第6,300,064号明細書;同第6,653,068号明細書;同第6,706,484号明細書及び同第7,264,963号明細書;並びにRothe et al.,2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(これらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み込まれる)にも記載されている。
親和性成熟戦略及び鎖シャッフリング戦略(参照によりその全体として組み込まれるMarks et al.,1992,Bio/Technology 10:779-783)は、当技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片を生成するために使用することができる。
一部の態様では、抗FLT3Lモノクローナル抗体は、ヒト化抗体であり得る。非ヒト又はヒト抗体を遺伝子操作、ヒト化又は表面再構成するための方法も使用することができ、当技術分野において周知である。ヒト化、表面再構成又は類似に遺伝子操作された抗体は、非ヒト、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物であるが、それらに限定されない起源由来の1つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には、公知のヒト配列の「輸入」可変ドメイン、定常ドメイン又は他のドメインから取り出される「輸入」残基と言われることが多い残基と置換される。そのような輸入配列は、免疫原性を減少させるか、又は結合、親和性、オンレート(on-rate)、オフレート(off-rate)、アビディティ、半減期若しくは当技術分野において公知である任意の他の好適な特徴を減少、増強又は修飾するために使用することができる。一般に、CDR残基は、FLT3Lの結合に影響を及ぼすことに直接的且つ最も実質的に関与している。従って、非ヒト又はヒトCDR配列の一部又は全部は、可変領域及び定常領域の非ヒト配列がヒトアミノ酸又は他のアミノ酸と置換され得る間に維持される。
抗体は、任意選択的に、ヒト化、表面再構成、遺伝子組み換えされ得るか、又はFLT3L抗原に対する高親和性及び他の好都合な生物学的特性を保持しながら遺伝子組換えされたヒト抗体でもあり得る。この目標を達成するために、ヒト化(若しくはヒト)又は遺伝子組換え抗FLT3L抗体及び表面再構成抗体は、任意選択的に、親配列並びに遺伝子組換え配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列並びに様々な概念的ヒト化及び遺伝子組換え産物を分析するプロセスによって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルは、市販で入手可能であり、当業者であれば習熟している。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体配座構造を例示及び提示するコンピュータープログラムは、利用可能である。これらの提示に関する検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割に関する分析、即ちFLT3L等の候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を許容する。この方法でフレームワーク(FW)残基を選択し、標的抗原に対する親和性の増加等の所望の抗体特徴が達成されるように、コンセンサス配列及び輸入配列から組み合わせることができる。
抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片のヒト化、表面再構成又は遺伝子操作は、Jones et al.,Nature 321:522(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323(1988);Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988)),Sims et al,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987),Carter et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)
;Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993)、米国特許第5,639,641号明細書、同第5,723,323号明細書;同第5,976,862号明細書;同第5,824,514号明細書;同第5,817,483号明細書;同第5,814,476号明細書;同第5,763,192号明細書;同第5,723,323号明細書;同第5,766,886号明細書;同第5,714,352号明細書;同第5,9,55,358号明細書;同第6,204,023号明細書;同第6,180,370号明細書;同第6,331,431号明細書;同第5,693,762号明細書;同第5,530,101号明細書;同第5,585,089号明細書;同第5,225,539号明細書;同第4,816,567号明細書;同第5,969,108号明細書;同第7,635,666号明細書;同第7,723,270号明細書;同第7,557,189号明細書;同第7,538,195号明細書;及び同第7,342,110号明細書;国際出願公開PCT/米国特許第S98/16280号明細書;PCT/米国特許第91/05939号明細書;PCT/米国特許第94/01234号明細書;PCT/英国特許第92/01755号明細書;国際特許出願公開国際公開第90/14443号パンフレット;同第90/14424号パンフレット;同第90/14430号パンフレット;及び欧州特許公開欧州特許第229246号明細書(これらのそれぞれは、それらの中に言及された文献を含めて、参照により全体として本明細書に組み込まれる)に記載されている方法等であるが、それらに限定されない任意の公知の方法によって実施することができる。
;Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993)、米国特許第5,639,641号明細書、同第5,723,323号明細書;同第5,976,862号明細書;同第5,824,514号明細書;同第5,817,483号明細書;同第5,814,476号明細書;同第5,763,192号明細書;同第5,723,323号明細書;同第5,766,886号明細書;同第5,714,352号明細書;同第5,9,55,358号明細書;同第6,204,023号明細書;同第6,180,370号明細書;同第6,331,431号明細書;同第5,693,762号明細書;同第5,530,101号明細書;同第5,585,089号明細書;同第5,225,539号明細書;同第4,816,567号明細書;同第5,969,108号明細書;同第7,635,666号明細書;同第7,723,270号明細書;同第7,557,189号明細書;同第7,538,195号明細書;及び同第7,342,110号明細書;国際出願公開PCT/米国特許第S98/16280号明細書;PCT/米国特許第91/05939号明細書;PCT/米国特許第94/01234号明細書;PCT/英国特許第92/01755号明細書;国際特許出願公開国際公開第90/14443号パンフレット;同第90/14424号パンフレット;同第90/14430号パンフレット;及び欧州特許公開欧州特許第229246号明細書(これらのそれぞれは、それらの中に言及された文献を含めて、参照により全体として本明細書に組み込まれる)に記載されている方法等であるが、それらに限定されない任意の公知の方法によって実施することができる。
抗FLT3Lヒト化抗体及びその抗原結合断片は、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを生成する免疫後に可能であるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作成することもできる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号明細書;同第5,545,806号明細書;同第5,569,825号明細書;同第5,625,126号明細書;同第5,633,425号明細書;及び同第5,661,016号明細書に記載されている。
特定の態様では、抗FLT3L抗体断片が提供される。抗体断片を生成するために様々な技術が公知である。従来、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク分解性消化によって引き出される(例えば、Morimoto et al,1993,Journal
of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117;Brennan et al,1985,Science,229:81)。特定の態様では、抗FLT3L抗体断片は、組換え的に生成される。Fab、Fv及びscFv抗体断片は、全てが大腸菌(E.coli)又は他の宿主細胞内で発現及び分泌され得るため、従って大量のこれらの断片の生成を可能にする。そのような抗FLT3L抗体断片は、上記で考察した抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗FLT3L抗体断片は、米国特許第5,641,870号明細書に記載されたように線状抗体でもあり得る。抗体断片を生成するための他の技術、例えば化学合成は、当業者に明白であろう。
of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117;Brennan et al,1985,Science,229:81)。特定の態様では、抗FLT3L抗体断片は、組換え的に生成される。Fab、Fv及びscFv抗体断片は、全てが大腸菌(E.coli)又は他の宿主細胞内で発現及び分泌され得るため、従って大量のこれらの断片の生成を可能にする。そのような抗FLT3L抗体断片は、上記で考察した抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗FLT3L抗体断片は、米国特許第5,641,870号明細書に記載されたように線状抗体でもあり得る。抗体断片を生成するための他の技術、例えば化学合成は、当業者に明白であろう。
本開示によると、FLT3Lに特異的である一本鎖抗体を生成するための技術を適用することができる(例えば、米国特許第4,946,778号明細書を参照されたい)。更に、FLT3L又はその誘導体、断片、アナログ若しくはホモログに対する所望の特異性を備えるモノクローナルFab断片の迅速且つ効果的な同定を許容するためのFab発現ライブラリー(例えば、Huse et al.,Science 246:1275-1281(1989)を参照されたい)を構築するための方法を適合させることができる。抗体断片は、(a)抗体分子のペプシン消化によって生成されるF(ab’)2断片;(b)F(ab’)2断片のジスルフィド架橋を減少させることによって生成されるFab断片、(c)パパイン及び還元剤を用いた抗体分子の処理によって生成されるFab断片、及び(d)Fv断片を含むが、それらに限定されない当技術分野の技術によって生成
することができる。
することができる。
本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片は、その血清中半減期を増加させるために修飾することができる。これは、例えば、抗体若しくは抗体断片における適切な領域の突然変異による抗体若しくは抗体断片内へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、又はその後、何れかの端部若しくは中央部での抗体若しくは抗体断片に(例えば、DNA若しくはペプチド合成によって)、若しくはYTE突然変異によって融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより達成され得る。抗体又はその抗原結合断片の血清中半減期を増加させるための他の方法、例えばPEG等の異種分子へのコンジュゲート化は、当技術分野において公知である。
医薬組成物
本発明は、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物にも向けられる。特定の実施形態では、本開示は、対象を治療するための医薬品の製造における、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
本発明は、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物にも向けられる。特定の実施形態では、本開示は、対象を治療するための医薬品の製造における、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
有効量の本開示の医薬組成物が投与されなければならず、ここで、「有効量」は、対象における所望の予防的、治療的又は緩和的反応を生成するために十分な量であると定義されいている。有効量は、投与される対象の種及び体重に依存して変動するであろうが、標準技術を使用して確定することができる。
特定の態様では、本開示は、限定なく、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬又は関節リウマチを含む自己免疫疾患の治療又は(その可能性を低下させる)予防において、それを必要とする対象において使用するための治療用及び予防用組成物を提供する。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片及び1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む。これに関連して、「薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤」には、ヒト又は家畜において使用するために許容されると米合衆国食品医薬品局によって承認されているか又は承認されていない可能性がある任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存料、色素/着色料、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶剤又は乳化剤が含まれるが、それらに限定されない。例えば、適切な担体は、当業者に公知であり、安定剤、希釈剤及び緩衝剤が含まれる。好適な安定剤としては、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン及びグルコース並びにアルブミン又はカゼイン等のタンパク質が挙げられる。好適な希釈剤としては、食塩液、ハンクス平衡食塩液及びリンゲル液が挙げられる。好適な緩衝剤としては、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩又はアルカリ土類金属炭酸塩が挙げられる。
特定の態様では、本開示の医薬組成物は、1種以上の補助物質、例えば1種以上の脂質、リン脂質、炭水化物及びリポポリ多糖を更に含有することができる。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、任意選択的に1種以上の追加の活性物質を含む。
特定の場合、本開示の医薬組成物は、当業者に公知の技術によって調製することができる。医薬組成物の製剤及び/又は製造における一般的考察は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005(参照により全体として本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。一般に、本開
示の抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片は、液剤、懸濁液又は乳剤を形成するために担体と混合される。本明細書で考察した1種以上の添加物は、担体中に添加され得るか又は引き続いて添加され得る。本開示の医薬組成物は、水溶液、乳剤若しくは懸濁液であり得るか又は乾燥製剤であり得る。特定の態様では、本開示の医薬組成物は、例えば、保管又は製剤の目的でフリーズドライ若しくはスプレードライによって乾燥させるか又は凍結乾燥させることができる。それらは、引き続いて、適切な液体担体の添加によって液体組成物に再構成することができるか、又は当業者であれば公知の方法を使用して乾燥製剤で投与され得る。
示の抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片は、液剤、懸濁液又は乳剤を形成するために担体と混合される。本明細書で考察した1種以上の添加物は、担体中に添加され得るか又は引き続いて添加され得る。本開示の医薬組成物は、水溶液、乳剤若しくは懸濁液であり得るか又は乾燥製剤であり得る。特定の態様では、本開示の医薬組成物は、例えば、保管又は製剤の目的でフリーズドライ若しくはスプレードライによって乾燥させるか又は凍結乾燥させることができる。それらは、引き続いて、適切な液体担体の添加によって液体組成物に再構成することができるか、又は当業者であれば公知の方法を使用して乾燥製剤で投与され得る。
本開示の医薬組成物は、当技術分野において公知の様々な経路によって対象に投与され得る。そのような医薬組成物を投与する典型的な経路としては、経口、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、経口腔、経直腸、経膣及び鼻腔内が挙げられる。従って、特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、経口腔、経直腸、経膣及び鼻腔内経路からなる群から選択される経路によって投与されるように調製される。本明細書で使用する用語非経口には、皮下注射、静脈内、筋肉内、皮内注射又は注入技術が含まれる。特定の態様では、本開示の医薬組成物は、その中に含有された本開示の抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片が対象への投与後に生体内利用可能となることを許容するように調製される。
医薬組成物の投与の選択は、選択される製剤に依存するであろう。本開示の医薬組成物は、処方物と適合する方法及び治療的に有効であるような量で投与される。特定の態様では、本開示の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射液、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェア及びエアロゾルを含むが、それらに限定されない固体、半固体、液体又は気体形態の製剤に調製される。
特定の例では、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、固体又は液体の形態であり得る。一部の態様では、担体は、例えば、組成物が錠剤又は散剤形態であるように粒子状物質である。他の態様では、担体は、液体であり、組成物は、例えば、吸入投与のために有用である経口シロップ、注射液又はエアロゾルである。経口投与が意図される場合、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、固体形又は液体形の何れかであり、ここで、半固体、半液体、懸濁液及びゲル形は、固体又は液体の何れかとして本明細書で考察された形態に含まれる。
特定の態様では、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、散剤、顆粒剤、圧縮錠剤、ピル剤、カプセル剤、チューインガム、ウエファー等の形態に調製され得る。一部の例では、そのような固体組成物は、典型的には1種以上の不活性希釈剤又は食用担体を含有するであろう。特定の実施形態では、結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガントガム又はゼラチン;賦形剤、例えばデンプン、ラクトース又はデキストリン;崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンスターチ等;潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はSterotex;流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素;甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン;香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香味料;及び着色剤の1種以上が追加的に存在し得る。
これらの組成物は、ミクロスフェア、液剤、懸濁剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放性製剤又は散剤の形態を取ることができ、約0.001~95%の本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含有する。一部の剤形は、50μg~250μgの抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含有し得る。
一部の態様では、本開示の医薬組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態である場合、本明細書に開示した物質に加えて、ポリエチレングリコール又は油等の液体担体を含有し得る。経口製剤は、通常使用される賦形剤、例えば医薬等級のサッカリン、セルロース及び炭酸マグネシウムも含み得る。
他の態様では、本開示の医薬組成物は、液体、例えばエリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤又は懸濁剤の形態である。特定の実施形態では、液体は、経口投与のため又は注射による送達のためであり得る。特定の実施形態では、経口投与のために意図された場合、本開示の医薬組成物は、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片に加えて、1種以上の甘味剤、保存剤、色素/着色剤及び風味増強剤を含有する。特定の態様では、注射によって投与されることが意図される医薬組成物では、1種以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤及び等張剤を含めることができる。
特定の場合、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む液体医薬組成物は、それらが液剤、懸濁剤又は他の同様の形態であってもなくても、以下の成分:無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩液、例えば生理学的食塩液、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、固定油、例えば溶媒又は懸濁媒体として機能できる合成モノグリセリド若しくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の溶媒;抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム;キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸;緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び等張性を調整するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースの1種以上を含み得る。一部の場合、製剤は、アンプル、ディスポーザブルのシリンジ又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与バイアル内に封入することができる。一部の実施形態では、注射用医薬組成物は、好ましくは、無菌である。
他の実施形態では、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、局所投与を目的とすることができ、その場合、担体は、好適には溶液、乳剤、軟膏又はゲル基剤を含み得る。特定の態様では、その基剤は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱油、希釈剤、例えば水及びアルコール並びに乳化剤及び安定剤の1種以上を含み得る。他の態様では、増粘剤が局所投与のための医薬組成物中に存在し得る。特定の実施形態では、経皮投与が意図される場合、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片は、経皮パッチ又はイオントフォレーシス器具と共に含めることができる。
更に他の実施形態では、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、例えば、坐剤の形態において、直腸投与のために意図されている。坐剤のために、結合剤及び担体は、例えば、ポリアルカレングリコール(polyalkalene glycols)又はトリグリセリドを含み得る。特定の例では、直腸投与のための組成物は、好適な非刺激性賦形剤として脂肪性基剤を含有する。そのような基剤としては、限定なく、ラノリン、カカオ脂又はポリエチレングリコールが挙げられる。
他の態様では、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、エアロゾルとして投与され得る用量単位を含む。用語エアロゾルは、コロイド的性質のシステムから、加圧式パッケージからなるシステムの範囲に及ぶ様々なシステムを意味するために使用される。特定の実施形態では、送達は、液化ガス若しくは圧縮ガスにより、又は有効成分を定量吐出する好適なポンプシステムにより実施される。一部の実施形態では、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片のエアロゾルは、有効成分を送達するために単相系、二相系又は三相系で送達され得る。他の実施形態では、エアロゾルの送達は、一緒にキットを形成し得る必要な容器、アクチベーター、バル
ブ、小分け容器等を含む。当業者であれば、特定のエアロゾル製剤及び送達様式を容易に決定することができる。
ブ、小分け容器等を含む。当業者であれば、特定のエアロゾル製剤及び送達様式を容易に決定することができる。
本開示の医薬組成物は、好適な非毒性医薬担体で投与され得、マイクロカプセル、マイクロビーズに含まれ得、且つ/又は徐放性インプラントに含まれ得る。
他の態様では、本開示の医薬組成物は、有効成分の周囲でコーティングシェルを形成する物質を含む。一部の例では、コーティングシェルを形成する物質は、典型的には不活性であり、例えば糖、セラック及び他の腸溶コーティング剤から選択され得る。
更に他の実施形態では、固体又は液体形態における本開示の医薬組成物としては、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片に結合し、それにより抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片の送達を支援する作用物質が挙げられる。特定の例では、この能力において作用する好適な作用物質には、タンパク質又はリポソームが含まれる。
特定の態様では、対象に投与されるであろう医薬組成物は、1種以上の用量単位の形態を取り、ここで、例えば、錠剤は、単一用量単位であり得、本明細書に開示したエアロゾル形態である抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片の容器は、複数の用量単位を保持することができる。そのような剤形を調製するための実際的な方法は、公知であるか、又は当業者に明白であり、例えばRemington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)を参照されたい。投与されるべき組成物は、いかなる場合でも、本明細書の教示に従って対象の疾患又は状態の治療に役立つように、治療有効量の、本明細書に開示した抗FLT3L抗体若しくはその抗原結合断片又はそれらの薬学的に許容される塩を含有するであろう。
特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、1種以上の追加の治療的活性物質を含む。他の実施形態では、治療有効量の本開示の医薬組成物は、それを必要とする対象に、1種以上の追加の治療的活性物質と併用して投与される。本明細書で使用する「併用」は、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片及び1種以上の追加の治療的活性物質を含む併用を指すが、それらの各々は、逐次的(連続的)に、一緒に又は同時に投与され得る。
本開示の医薬組成物は、望ましくは、治療レベルを維持するために数回の間隔を空けて投与され得る。本開示の医薬組成物は、他の殺菌法又は静菌法と結び付けて使用され得る。
本明細書に提供した医薬組成物についての説明は、主としてヒトに投与するために好適である医薬組成物に向けられるが、当業者であれば、そのような組成物が概して全ての種類の対象に投与するために好適であることを理解するであろう。特定の態様では、対象は、哺乳動物である。特定の態様では、哺乳動物としては、ヒト、サル及び類人猿等の霊長類並びに研究室用動物及び身近なペット類を含む家畜動物及び農耕動物(例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ)等の非霊長類並びに野生動物、鳥類等の非家畜動物が挙げられる。
自己免疫/抗炎症性療法
本開示は、自己免疫疾患及び/又は他の炎症性疾患(即ち過剰反応性及び/又は異常機能免疫系を包含する疾患)を治療するために有用である、例えば上記のもの等の抗FLT3L抗体を含む組成物及び方法も特徴とする。様々な実施形態では、抗FLT3L抗体は
、対象の免疫系又は特定の抗原若しくは一連の抗原への特異的免疫反応を阻害するか又は減弱させ、それにより自己免疫疾患又は他の炎症性疾患を減少又は予防するために設計された他の免疫調節薬と併用して投与することができる。
本開示は、自己免疫疾患及び/又は他の炎症性疾患(即ち過剰反応性及び/又は異常機能免疫系を包含する疾患)を治療するために有用である、例えば上記のもの等の抗FLT3L抗体を含む組成物及び方法も特徴とする。様々な実施形態では、抗FLT3L抗体は
、対象の免疫系又は特定の抗原若しくは一連の抗原への特異的免疫反応を阻害するか又は減弱させ、それにより自己免疫疾患又は他の炎症性疾患を減少又は予防するために設計された他の免疫調節薬と併用して投与することができる。
更に、本明細書では、1種以上の抗FLT3L抗体の投与を含む、自己免疫疾患及び/又は他の炎症性疾患を治療するための方法が提供される。本明細書で示したように、抗FLT3L抗体の投与は、免疫反応の減少、1つ以上の免疫学的シグナル伝達カスケードの発現又は免疫細胞集団の減少の少なくとも1つを生じさせ得る。特定の態様では、自己免疫疾患又は他の炎症性疾患を提示している患者又は対象に抗FLT3L抗体が投与される。
抗FLT3L抗体を含む自己免疫疾患及び/又は他の炎症性疾患療法の治療は、例えば、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の進行速度の減少、免疫細胞増殖の遅延若しくは安定化、病変の収縮(例えば、MS患者における等)及び/又は疾患の退行を引き起こす。一部の態様では、自己免疫疾患又は炎症性疾患の減少又は遅延(例えば、炎症、炎症性サイトカインのレベル、免疫細胞集団及び/又は組織病変等の関連性損傷の減少)を測定する測定基準は、統計的に有意であり得る。自己免疫疾患又は炎症性疾患の測定基準における減少は、個体の疾患進行の予想レベルに対する、大きい患者集団に基づく疾患進行の予想レベルに対する又はコントロール集団の疾患進行の予想レベルに対する、ベースライン時(治療前)の患者の測定基準のレベルとの比較によって測定することができる。
1つの実施形態では、本明細書で企図した治療方法は、本開示の抗FLT3L結合分子、抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体の、対象又は患者への適用又は投与或いは抗FLT3L結合分子の、対象又は患者由来の単離組織又は細胞系への適用又は投与を含み、ここで、対象又は患者は、疾患、疾患の症状又は疾患に向かう素因を有する。
企図される疾患の例としては、1型及び2型糖尿病を含む急性又は慢性炎症性疾患、例えば糖尿病、糖尿病性腎症及び高血圧によって誘発されたCKDを含むCKD、動脈硬化症、アルツハイマー病、癌並びに心疾患、高血圧、貧血症、心膜炎、腎性骨ジストロフィー等を含むそのような疾患の関連合併症が挙げられる。追加の企図される疾患の例としては、限定なく、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬及び関節リウマチを含む自己免疫疾患が挙げられる。
別の実施形態では、抗FLT3L結合分子、例えば、本開示の抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体を含む医薬組成物の、対象又は患者への適用又は投与或いは抗FLT3L結合分子を含む医薬組成物の、対象又は患者に由来する単離組織又は細胞系への適用又は投与を含む治療も企図されており、ここで、対象又は患者は、疾患、疾患の症状又は疾患に向かう素因を有する。
本開示の方法によると、本明細書の何れかの箇所で定義した少なくとも1つの抗FLT3L抗体は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に関する肯定的な治療反応を促進するために使用される。用語「肯定的な治療反応」は、自己免疫疾患又は炎症性疾患と関連している症状の減少を指す。従って、例えば、疾患の改良は、完全な反応であると特徴付けることができる。「完全な反応」は、任意の以前の試験結果の正常化を伴う臨床的に検出可能な疾患の非存在であることが意図されている。代わりに、疾患の改良は、部分的反応であると分類することができる。「肯定的な治療反応」は、本明細書に開示した抗FLT3L結合分子の投与の結果として生じた、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の進行及び/又は期間の減少若しくは阻害、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の重症度の減少若しくは緩和及び/又はそれらの1つ以上の症状の緩和を含む。
特定の実施形態では、原発性シェーグレン症候群を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
他の実施形態では、筋炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
特定の実施形態では、全身性エリテマトーデス(SLE)を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。一部の態様では、対象は、健常対象と比較して、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度によって測定されるFLT3Lの増加した血清中レベルを有する。
一部の実施形態では、対象における全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するための方法であって、(a)FLT3Lの血清中レベルを測定するステップ、又は(b)FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度を測定するステップを含み、健常ドナーと比較して対象におけるFLT3Lの増加した血清中レベル又はFLT3Lを発現するCD4+
T細胞の素増加した頻度は、対象がSLEを有することを示す、方法が提供される。特定の態様では、CD4+ T細胞は、エフェクターメモリー細胞(TEM)である。
T細胞の素増加した頻度は、対象がSLEを有することを示す、方法が提供される。特定の態様では、CD4+ T細胞は、エフェクターメモリー細胞(TEM)である。
一部の実施形態では、膜結合FLT3Lの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が提供される。特定の態様では、FLT3Lは、膜結合FLT3Lの活性が「投与前」レベルに戻ることができるように可逆的に中和される。
他の実施形態では、可溶性FLT3Lの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が提供される。特定の態様では、FLT3Lは、可溶性FLT3Lのレベルが投与前レベルに戻ることができるように可逆的に中和される。
特定の実施形態では、可溶性FLT3Lを中和する方法は、対象に抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を週1回、約0.03mg/kg~約30mg/kgの範囲で皮下投与するステップを更に含む。他の実施形態では、本方法は、対象に抗FLT3L抗体又はその抗原結合断片を4週間毎に1回、約150mg/kgの用量で皮下投与するステップを更に含む。
他の実施形態では、循環している古典的樹状細胞(cDC)及び形質細胞様樹状細胞(pDC)の集団の減少を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が提供される。特定の態様では、cDC及びpDCの集団は、cDC及びpDCの集団が投与前レベルに戻ることができるように可逆的に減少される。
特定の実施形態では、CD4+ T細胞上のFLT3Lの発現を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
他の実施形態では、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞のパーセンテージを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体
又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
他の実施形態では、リンパ芽球におけるERKシグナル伝達を減少させる方法であって、リンパ芽球を、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法が提供される。
特定の実施形態では、一次CD133+ヒト幹細胞におけるMEK 1/2リン酸化を減少させる方法であって、幹細胞を、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法が提供される。
下記の実施例は、本開示のアッセイ、スクリーニング及び治療方法を作成及び使用する方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供できるように提示するものであり、本発明者らがそれらの開示と見なすものの範囲を限定することを意図されていない。
本開示について下記の実施例を参照しながら説明する。実施例は、例示に過ぎず、本開示は、決してこれらの実施例に限定されると見なすべきではなく、むしろ本明細書に提供した教示の結果として明白になるあらゆる変形形態を含むと見なすべきである。
実施例1.抗FLT3L抗体の生成
概説:
FLT3Lは、65kDaの非ジスルフィド結合ホモ二量体である糖タンパク質である。ヒト、非ヒト霊長類及びマウスについてのリガンド及び受容体の配列相同性を下記の表2に示した。
概説:
FLT3Lは、65kDaの非ジスルフィド結合ホモ二量体である糖タンパク質である。ヒト、非ヒト霊長類及びマウスについてのリガンド及び受容体の配列相同性を下記の表2に示した。
完全マウスFLT3Lタンパク質の相同性は、73%に過ぎないが、それのFLT3との結合部位は、種間で高度に保存されている。実際に、ヒトFLT3Lは、マウスFLT3に結合して活性化するが、その逆も同様である。FLT3Lは、幹細胞因子(SCF又はKIT-リガンド)及びコロニー刺激因子(CSF1)との構造的相同性を有するが、他のヒトサイトカインとの有意な配列相同性を有していない。これらの2種のリガンドに対する受容体であるc-KIT及びCSF1Rは、それぞれ通例FLT3の阻害剤と相互作用するクラスIIIのTKRでもあり、臨床使用において望ましくないオフターゲット傷害性を生じさせる。これらを考察して、FLT3/FLT3L経路の高度に特異的な阻害を提供する、SCF又はCSF1と交差反応しないであろう、FLT3Lに対する抗体が探求された。
リード抗体は、可溶性ヒト及びマウスFLT3-Lに関する二者択一の選択を使用して、選択及び試験した。一次生化学的ハイスループットスクリーニングは、ヒトFLT3/FLT3L競合完全均一系時間分解蛍光(HTRF)アッセイを使用して実施した。全ての一本鎖可変断片-断片結晶領域(scFv-Fc)のヒットをIgG1 TMフォーマットに変換させ、その後、標的細胞表面上のFLT3のダウンレギュレーションを使用する機能的スクリーニングアッセイを使用してリード抗体の阻害活性を確証した。マウス及びカニクイザルのFLT3Lに対する交差反応性及び選択性並びに例えば幹細胞因子(scf)等の他のファミリーメンバーの排除は、ELISA及び機能的アッセイを使用して確証した。
リード化合物は、RS4;11細胞系及び一次ヒトCD133+幹細胞におけるFLT3シグナル伝達アッセイを使用して更に評価した。内在性FLT3Lへの結合は、一次ヒトT細胞を使用して確証した。特異的な結合部位及び結合親和性は、Octet及びBIAcoreのそれぞれによって決定した。下記に記載するように、結果として生じたリード抗体クローンを更なる最適化のために選択した。
リード抗体候補の識別活動(C5、B10~11)
抗FLT3L結合研究のためのリード抗体は、図1に示したように、ファージライブラリーを最初にスクリーニングすることによって生成した。ファージディスプレイライブラリーである骨髄Vaughan(BMV)、結合脾臓(CS)、DP47ライブラリー(DP47)及びDyaxヒト抗体ライブラリーは、ヒトFLT3L(huFLT3L)及び/又はマウスFLT3L(muFLT3L)に対してパニング(交互パニング又は競合パニング)した。手短には、社内生成FLT3Lは、パニング抗原としてEZ-Linkスルホ-NHS-LC-ビオチン標識化キット(Thermo Scientific)を使用するビオチンで標識化した。パニングは、(Xiao X et al.,2017 mAbs 542 9,996-1006(2017))に記載されたように、社内scFvライブラリーを用いて2~3ラウンドにわたり実施した。ヒト/cyno交差反応性を増強するために、一部の選択プロセスでは、交互法でパニング抗原としてヒト及びcyno組換えFLT3Lを使用した。FLT3L/FLT3相互作用を阻害する抗体を選択するために、一部の実験について競合パニングを使用した。競合パニングのためにパニング抗原としてヒトFLT3Lを使用したが、従来型トリプシンの代わりにファージ溶出剤として過剰(>100倍)のFLT3-Fcを使用した(Xiao X et al.mAbs 542 9,996-1006(2017))。
抗FLT3L結合研究のためのリード抗体は、図1に示したように、ファージライブラリーを最初にスクリーニングすることによって生成した。ファージディスプレイライブラリーである骨髄Vaughan(BMV)、結合脾臓(CS)、DP47ライブラリー(DP47)及びDyaxヒト抗体ライブラリーは、ヒトFLT3L(huFLT3L)及び/又はマウスFLT3L(muFLT3L)に対してパニング(交互パニング又は競合パニング)した。手短には、社内生成FLT3Lは、パニング抗原としてEZ-Linkスルホ-NHS-LC-ビオチン標識化キット(Thermo Scientific)を使用するビオチンで標識化した。パニングは、(Xiao X et al.,2017 mAbs 542 9,996-1006(2017))に記載されたように、社内scFvライブラリーを用いて2~3ラウンドにわたり実施した。ヒト/cyno交差反応性を増強するために、一部の選択プロセスでは、交互法でパニング抗原としてヒト及びcyno組換えFLT3Lを使用した。FLT3L/FLT3相互作用を阻害する抗体を選択するために、一部の実験について競合パニングを使用した。競合パニングのためにパニング抗原としてヒトFLT3Lを使用したが、従来型トリプシンの代わりにファージ溶出剤として過剰(>100倍)のFLT3-Fcを使用した(Xiao X et al.mAbs 542 9,996-1006(2017))。
BMVライブラリーは、100倍、CSライブラリーは3、50倍及びDP47ライブラリーは、250倍に濃縮した。Dyaxライブラリーは、濃縮しなかった。BMV及びDyaxファージライブラリーのみは、3回パニングすると、第2ラウンドのパニングと比較して、BMVファージライブラリーの100倍濃縮及びDyaxライブラリーの50倍濃縮が生じた(図1A)。
モノクローナルファージELISAを実施して、各選択ラウンド後の抗原特異的ファージのパーセンテージを推定した。ハイスループットスクリーニングのために、少なくとも20%の陽性率を達成した選択のみを処理した。この基準セットを用いて、第3アウトプットのBMVパニングを第2アウトプットのCS及びDP47パニングと一緒にpSplice V4及びpdLG又はpmLGベクター内にクローン化し、競合HTRFによる機能的スクリーニングのためにscFv-Fcフォーマット(Xiao X,et al.,PLoS One,2015 Oct 15;10(10):e0140691.doi:10.1371/journal.pone.0140691)又はIgGフォーマット(Xiao X,et al.mAbs 542 9,996-1006(2017))の何れかに変換させた。
機能的スクリーニングのために、293 freestyle細胞(Thermo Scientific)は、最初に、パニングアウトプットから変換させたscFv-Fc構築物又はIgG構築物の何れかを用いてトランスフェクトさせた。生じた上清は、HTRFをベースとするFLT3L/FLT3相互作用阻害アッセイにおいて直接的に使用した。HTRFアッセイのために、10nMのビオチン標識FLT3L、20nMのストレプトアビジン-ユーロピウムクリプテート(Cisbio)、10nMのFLT3-mFc及び20nMの抗mFc-A647(Cisbio)を384ウェルのGreinerプレート内の総量20μL/ウェル中の10μLのトランスフェクション上清と混合した。665nm及び620nmの示度を混合の5分後及びその後、示度が安定するまで1時間間隔で入手した。その後、665nm/620nmの比率を計算した。比率の減少は、FLT3L/FLT3相互作用の阻害を示した。
直接又は交互抗原パニングからのパニングのアウトプットをscFv-Fcに変換させ、HTRF FLT3L/FLT3-Fc相互作用阻害アッセイにおけるハイスループットスクリーニング(HTS)のために4,000コロニー超を選択した。10種のリード抗体を同定し、IgG TM変換させ、発現させた。これらの抗体を第2回HTRF相互作用阻害アッセイにおいて再試験し、10個のリードを同定した。これと並行して、競合パニングからの700を超えるヒットをPmIgG変換させ、哺乳動物細胞中で発現させた。変換したクローンを同一のHTRF FLT3L/FLT3-Fc相互作用阻害アッセイにかけると、2個のリードが同定された(図1B)。
交互抗原パニングからの10個のリード及び競合パニングからの2個のリードを発現させ、その後の試験のためにミリグラム量で精製した。追加の試験は、HTRF FLT3L/FLT3-Fc相互作用阻害、受容体ダウンモジュレーション及びシグナル伝達阻害アッセイを含んでいた。これらのリードは、エピトープビニング及び親和性決定法も受けた。スクリーニング活動は、5つのリード抗体Dyax3、Dyax5、CAT8、CAT26及びCAT5D9を同定したため、これらを更に試験した。リード抗体についての競合HTRF分析からの結果は、図1Cに示した。
実施例2.FLT3のダウンレギュレーションのスクリーニングアッセイ
FLT3Lのライゲーション後、FLT3受容体は、二量化し、自己リン酸化し、下流シグナル伝達経路を活性化する。このプロセスにおいて、表面FLT3は、内在化して分解される。この内在化の特徴を有効に利用して、リード抗FLT3L候補クローンをスクリーニングするためのアッセイを開発した。細胞表面FLT3発現は、フローサイトメトリーによって測定することができ、受容体-リガンド結合の阻害は、細胞表面FLT3発現レベルへの変化を定量することによって決定できる。
FLT3Lのライゲーション後、FLT3受容体は、二量化し、自己リン酸化し、下流シグナル伝達経路を活性化する。このプロセスにおいて、表面FLT3は、内在化して分解される。この内在化の特徴を有効に利用して、リード抗FLT3L候補クローンをスクリーニングするためのアッセイを開発した。細胞表面FLT3発現は、フローサイトメトリーによって測定することができ、受容体-リガンド結合の阻害は、細胞表面FLT3発現レベルへの変化を定量することによって決定できる。
細胞系RS4;11、EOL-1、MOLM13及びMV4-11は、FLT3を構成的に発現する。細胞を通常の条件下で培養し、培養の2~24時間後のFLT3の相対発現についてスクリーニングした。フローサイトメトリーを使用して、FLT3の発現を測定した。手短には、市販で入手できる抗CD135(抗FLT3)クローンであるBV10A4H2(Biolegend)をフローサイトメトリー実験において使用し、平均蛍光強度(MFI)をFLT3L発現の尺度として報告した。全アッセイにおいて、市販で入手できるマウス抗ヒトFLT3Lモノクローナル抗体(R&D)又は社内huFLT3-Fc構築物をFLT3L活性の効果的中和についての陽性コントロールとして使用した。
急性白血病(pro-B)細胞系であるRS4;11は、FLT3を発現すると報告された他の市販で入手できる細胞系と比較して、培養中でFLT3の一貫した高い発現を示
した(図2A)。FLT3Lの細胞表面FLT3への直接結合は、ビオチン化組換えhuFLT3L(rhuFLT3L)の連続希釈物を使用して確証し、ここで、この連続希釈物は、4℃でのRS4;11細胞との30分間のインキュベーション後にBV421-ストレプトアビジンを使用して細胞表面への物理的結合を検出することができ、その後、フローサイトメトリー分析を実施して平均蛍光強度を決定した(図2B)。
した(図2A)。FLT3Lの細胞表面FLT3への直接結合は、ビオチン化組換えhuFLT3L(rhuFLT3L)の連続希釈物を使用して確証し、ここで、この連続希釈物は、4℃でのRS4;11細胞との30分間のインキュベーション後にBV421-ストレプトアビジンを使用して細胞表面への物理的結合を検出することができ、その後、フローサイトメトリー分析を実施して平均蛍光強度を決定した(図2B)。
最後に、rhuFLT3LがRS4;11細胞上の細胞表面FLT3の検出可能なダウンレギュレーションを誘導する能力は、RS4;11細胞を37℃で2時間にわたりFLT3Lの連続希釈物と共にインキュベーションすることによって確証した。状態の安定性は、2種の異なる濃度のRS4;11細胞(細胞50,000(50K)個及び100,000(100K)個)を使用して評価した。細胞表面FLT3のダウンレギュレーションは、蛍光標識抗CD135抗体(クローンBV10A4H2)を使用して決定した。両方の細胞密度は、huFLT3Lとのインキュベーション2時間後に細胞表面FLT3の用量依存性ダウンレギュレーションを示した。FLT3発現のインジケーターであるアロフィコシアニン(APC)MFIは、本アッセイで使用したhuFLT3Lの範囲にわたって25分の1に減少した(図2C)。これらの結果は、スクリーニングアッセイが生体利用可能性FLT3Lの用量依存性反応を測定する際に有効であり、候補クローンがFLT3Lを機能的に中和する能力を試験するために好適であろうことを証明した。この反応は、1ウェル当たり細胞50,000個又は100,000個の何れを使用しても有意に相違しなかった。
スクリーニングアッセイの最適化
抗FLT3L候補クローンを評価するために理想的な細胞培養条件を決定するために、スクリーニングアッセイ条件を更に精密化した。最終条件は、37℃、5%CO2に設定した加湿インキュベーター内で2時間にわたり、1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含む完全ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地中で抗FLT3L mAb候補クローンを含めて又は含めずに96pMのrhuFLT3Lと共にインキュベートした、1ウェル当たり50,000個のRS4;11細胞であった。FLT3発現のその後のダウンレギュレーションは、生MFI又はダウンレギュレーション率(%)の何れかとして測定するフローサイトメトリーによって決定した。96pMのrhuFLT3L(EC80)を選択したのは、用量反応曲線の対数期が始まり、従ってrhuFLT3Lの何らかの機能的阻害が細胞RS4;11細胞表面上のFLT3のダウンレギュレーションのレベルへの変化によって直ちに反映されることが保証されるポイントであるからであった(図3A)。アッセイの有効性は、市販で入手できるマウス抗huFLT3L抗体コントロール(MAB608、R&D Systems)を使用して確証した(図3B)。FLT3とそのリガンドとの種間反応性に起因して、このアッセイは、ヒト細胞系であるにもかかわらず、ヒト、cyno及び齧歯類FLT3Lに対するクローンについて試験するために有効であった。マウスFLT3Lについて、EC80は、36pMであった。
抗FLT3L候補クローンを評価するために理想的な細胞培養条件を決定するために、スクリーニングアッセイ条件を更に精密化した。最終条件は、37℃、5%CO2に設定した加湿インキュベーター内で2時間にわたり、1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含む完全ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地中で抗FLT3L mAb候補クローンを含めて又は含めずに96pMのrhuFLT3Lと共にインキュベートした、1ウェル当たり50,000個のRS4;11細胞であった。FLT3発現のその後のダウンレギュレーションは、生MFI又はダウンレギュレーション率(%)の何れかとして測定するフローサイトメトリーによって決定した。96pMのrhuFLT3L(EC80)を選択したのは、用量反応曲線の対数期が始まり、従ってrhuFLT3Lの何らかの機能的阻害が細胞RS4;11細胞表面上のFLT3のダウンレギュレーションのレベルへの変化によって直ちに反映されることが保証されるポイントであるからであった(図3A)。アッセイの有効性は、市販で入手できるマウス抗huFLT3L抗体コントロール(MAB608、R&D Systems)を使用して確証した(図3B)。FLT3とそのリガンドとの種間反応性に起因して、このアッセイは、ヒト細胞系であるにもかかわらず、ヒト、cyno及び齧歯類FLT3Lに対するクローンについて試験するために有効であった。マウスFLT3Lについて、EC80は、36pMであった。
実施例3.可溶性FLT3Lに対するリード抗体候補の中和活性
FLT3LからFLT3へのライゲーション後、受容体は、二量化し、自己リン酸化し、且つ内在化するとシグナル伝達カスケードを伝播させる。FLT3のダウンレギュレーションによって測定されるこのプロセスは、FLT3Lに結合する抗体によって阻害され得る。従って、リード候補について、それらがヒト、マウス又はカニクイザル(cyno)可溶性FLT3L(sFLT3L)に結合することによってRS4;11細胞上のFLT3のダウンレギュレーションを阻害する能力について試験した。最適化スクリーニングアッセイを使用して、リード候補の中和能力を試験した。上述したように、RS4;11細胞(1ウェル当たり細胞50,000個)を2時間にわたり、ヒト若しくはcyno FLT3L(96pM)又はマウスsFLT3L(36pM)の何れかの存在下で1%のBSAを含む完全RPMI中でインキュベートした。各クローンの連続希釈物を添加し、
陽性コントロールとして可溶性FLT3-Fc構築物又は市販で入手できるヒト抗FLT3L抗体を使用した。RS4;11細胞上でのFLT3の発現は、フローサイトメトリーを使用して決定し、MFIとして報告した。
FLT3LからFLT3へのライゲーション後、受容体は、二量化し、自己リン酸化し、且つ内在化するとシグナル伝達カスケードを伝播させる。FLT3のダウンレギュレーションによって測定されるこのプロセスは、FLT3Lに結合する抗体によって阻害され得る。従って、リード候補について、それらがヒト、マウス又はカニクイザル(cyno)可溶性FLT3L(sFLT3L)に結合することによってRS4;11細胞上のFLT3のダウンレギュレーションを阻害する能力について試験した。最適化スクリーニングアッセイを使用して、リード候補の中和能力を試験した。上述したように、RS4;11細胞(1ウェル当たり細胞50,000個)を2時間にわたり、ヒト若しくはcyno FLT3L(96pM)又はマウスsFLT3L(36pM)の何れかの存在下で1%のBSAを含む完全RPMI中でインキュベートした。各クローンの連続希釈物を添加し、
陽性コントロールとして可溶性FLT3-Fc構築物又は市販で入手できるヒト抗FLT3L抗体を使用した。RS4;11細胞上でのFLT3の発現は、フローサイトメトリーを使用して決定し、MFIとして報告した。
図4A及び4Bに示したように、全てのリードクローン候補は、ヒト及びcyno sFLT3Lの両方をある程度阻害する能力を証明した。CAT8、CAT26、Dyax3及びDyax5の全部は、ヒトsFLT3L及びcyno sFLT3Lの類似の阻害を示した。下記の表3に示したが、CAT8、CAT26、Dyax3及びDyax5についてのIC50値は、ICMAXに一度も到達しなかったため、妥当性が欠如している。
これとは対照的に、CAT5D9は、ICMAXを達成し、FLT3L阻害から予測されるS字形曲線を生成した(図4A及び4B)。表3に提示したCAT5D9についてのIC50値は、ヒト及びcynoとの交差反応性を示しているが、マウスFLT3Lとの交差反応性を示していない(図4C)。
実施例4.リード抗体候補の細胞表面FLT3Lに対する結合活性
FLT3Lは、細胞膜タンパク質として発現し、開裂すると可溶性タンパク質として循環する。膜結合形態及び可溶性形態の両方は、生物学的に活性である。FLT3媒介性シグナル伝達経路を効果的に遮断するために、リード抗体候補は、FLT3Lの可溶性形態及び膜結合形態の両方に結合しなければならない。
FLT3Lは、細胞膜タンパク質として発現し、開裂すると可溶性タンパク質として循環する。膜結合形態及び可溶性形態の両方は、生物学的に活性である。FLT3媒介性シグナル伝達経路を効果的に遮断するために、リード抗体候補は、FLT3Lの可溶性形態及び膜結合形態の両方に結合しなければならない。
これに一致して、ヒト、cyno及びマウスFLT3Lへの細胞表面結合は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を各種について各全長タンパク質によってトランスフェクトすることによって評価した。候補クローンは、1時間にわたり4℃において、FLT3Lを発現する細胞系と共にインキュベートし、その後、未結合抗体を除去するために2回洗浄した。次に、結合抗体を定量するために細胞をPE標識ヤギ抗hu IgG二次検出pAbと共にインキュベートし、これをPEシグナルのフローサイトメトリー分析によって測定した。hu IgG主鎖上のhuFLT3-Fc構築物は、ヒトリガンドに加えて、cyno及びマウスと交差反応するため、FLT3L発現についての陽性コントロール試薬として使用した。
全リード候補は、ヒトFLT3Lに結合し(図5A)、DYAX5を除く全部がcyno FLT3Lに結合した(図5B)。これとは対照的に、Dyax5のみ及び少ない程度でDyax3は、マウスFLT3Lとの交差反応性を示した(図5C)。
従って、全リード候補は、有効性に相違があるものの、異種間FLT3Lに結合する能力を示した。各クローンについての受容体占有度における差が明白であったため、EC50及び最大占有度(FLT3-Fcと比較した%として表示)を記録し、最終評価に取り込んだ。結果は、CHO細胞において発現したヒト、cyno及びマウスFLT3Lについて表4に示した。
実施例5.リード抗体候補の内在性ヒトFLT3Lへの結合
FLT3Lは、鎖サイトカイン、即ちTCRエンゲージメントから独立して、IL-2、IL-7又はIL-15により刺激されると一次T細胞の表面上で発現する。実施例4では、リード抗体候補は、ヒトFLT3Lタンパク質を用いてトランスフェクトしたCHO細胞に結合する能力を証明した。次のステップは、それらが一次ヒト細胞系由来の内在性FLT3Lに結合し得ることを確証することであった。従って、リード抗体候補を、それらがヒトドナーから獲得した一次T細胞により刺激したIL-2上のhuFlt3Lに結合する能力を試験した。
FLT3Lは、鎖サイトカイン、即ちTCRエンゲージメントから独立して、IL-2、IL-7又はIL-15により刺激されると一次T細胞の表面上で発現する。実施例4では、リード抗体候補は、ヒトFLT3Lタンパク質を用いてトランスフェクトしたCHO細胞に結合する能力を証明した。次のステップは、それらが一次ヒト細胞系由来の内在性FLT3Lに結合し得ることを確証することであった。従って、リード抗体候補を、それらがヒトドナーから獲得した一次T細胞により刺激したIL-2上のhuFlt3Lに結合する能力を試験した。
細胞表面上でのFLT3L発現を誘導するために、新しく単離したヒトT細胞を、5日間にわたり抗CD3の非存在下(抗CD3によるT細胞の活性化は、細胞表面からのFLT3Lの脱落を引き起こすであろう)で50ng/mLのIL-2を用いて刺激した。この後、T細胞上の発現は、ヒトFLT3L-Fc構築物を使用して確証した(図6A)。次に、各クローンの連続希釈物を4℃で30分間、IL-2刺激T細胞(100K/ウェル)と共にインキュベートした。過剰の抗体は、緩衝剤を用いた洗浄によって除去し、表面結合抗体をAPC標識抗ヒトIgGにより検出した。CAT5D9を除く全リードクローンは、ヒト一次T細胞上の内在性FLT3Lに結合した(図6B)。内在性FLT3LへのCAT5D9の結合は、結合親和性が低いため、最初に検出することができなかった。しかし、T細胞とのインキュベーション前に、CAT5D9を、抗IgG(APC標識化)を用いて二量化すると、そのアビディティは、内在性FLT3Lへの用量依存性結合を確証するために十分に増強された(図6C)。
実施例6.細胞表面FLT3Lのリード抗体候補による阻害
リード候補が細胞表面FLT3Lに結合する能力は、リガンドの機能的阻害に関する限定された洞察を提供した。理想的には、リード候補の細胞表面FLT3Lへの結合は、リガンド-受容体複合体のシグナル伝達活性を減少させるはずである。
リード候補が細胞表面FLT3Lに結合する能力は、リガンドの機能的阻害に関する限定された洞察を提供した。理想的には、リード候補の細胞表面FLT3Lへの結合は、リガンド-受容体複合体のシグナル伝達活性を減少させるはずである。
これを試験するために、1ウェル当たり1,000個のhuFLT3Lを発現するCHO細胞を付着させるために一晩プレーティングした。翌日、CHO培養培地を取り除き、細胞をRPMIにより静かに洗浄し、抗体の連続希釈物を30分間にわたり添加し、その後、FLT3+RS4;11(100K/ウェル)を添加した。36℃での2時間のインキュベーション後、FLT3のダウンレギュレーションを検出するために、RS4;11細胞を染色するために氷上の新鮮96ウェルプレート内に移した。本発明者らの標準RS4;11 FLT3のダウンレギュレーションアッセイのために使用した染料に加えて、何れの汚染CHO細胞も排除するために抗CD19を含めた。FLT3のダウンレギュレーションは、フローサイトメトリーによって測定した。
リード抗体候補遮断アッセイは、全リード候補がある程度まで細胞表面FLT3Lを阻害する能力を有することを証明したが、全候補は、低親和性を反映して、市販のコントロール抗体と比較して比較的低い活性を示した(図7)。
実施例7.リードクローンのFLT3L誘導性FLT3シグナル伝達の阻害
FLT3の自己リン酸化は、主としてPI3K及びRASカスケードを通してシグナル伝達ネットワークの活性化をもたらし、これは、順に、AKT(プロテインキナーゼB、PKB)、MEK及びERKを活性化する。シグナル伝達カスケードは、最終的に細胞の生存及び増殖を促進する遺伝子の転写をもたらす。リード抗体候補が一次ヒト細胞におけるFLT3LによるFLT3の下流シグナル伝達を遮断したかどうかを確証するために、CD133+幹細胞内のERK及びMEKのリン酸化は、Mesoscale MSDホスホ-ERK1/2及び蛍光体MEK1/2全細胞溶解液を用いて測定した。
FLT3の自己リン酸化は、主としてPI3K及びRASカスケードを通してシグナル伝達ネットワークの活性化をもたらし、これは、順に、AKT(プロテインキナーゼB、PKB)、MEK及びERKを活性化する。シグナル伝達カスケードは、最終的に細胞の生存及び増殖を促進する遺伝子の転写をもたらす。リード抗体候補が一次ヒト細胞におけるFLT3LによるFLT3の下流シグナル伝達を遮断したかどうかを確証するために、CD133+幹細胞内のERK及びMEKのリン酸化は、Mesoscale MSDホスホ-ERK1/2及び蛍光体MEK1/2全細胞溶解液を用いて測定した。
アッセイの妥当性は、用量依存法でFLT3Lによって誘導されたERKの活性化に関して、RS4;11細胞系を使用して確証した(図8A)。FLT3Lの連続希釈物を36℃で8分間にわたり、1ウェル当たり300,000個のRS4;11細胞と共にインキュベートした。次に、細胞を採取し、溶解させ、リン酸化ERKについて製造業者の取扱説明書に従ってアッセイした。以前のアッセイと同様に、ERKのFLT3L活性化についてのEC80を決定し(476pM)、これを使用して候補抗FLT3L抗体クローンの阻害活性を試験した。アッセイの有用性は、効果的中和についての陽性コントロールとして市販で入手できるマウス抗ヒトFLT3L抗体を使用して確証した(図8B)。
これらの確定されたパラメーターを使用して、リードクローンについて、使用前にFLT3発現について妥当性が確認されたインビトロ増殖一次CD133+幹細胞を使用して試験した。リードクローンは、476pMのFLT3Lと共に30分間にわたりプレインキュベートし、次にCD133+幹細胞に添加した。36℃での8分間にわたるインキュベーション後、細胞を採取し、溶解させ、MSDアッセイを製造業者の取扱説明書に従って使用してリン酸化ERK及びMEKについてアッセイした。市販で入手できるマウス抗ヒトFLT3Lを陽性コントロールとして使用した。
全候補クローンは、FLT3LによるMEK(図9A)及びERK(図9B)の誘導を阻害すると思われた。しかし、CAT5D9のみがICMAXに到達し、予想S字形用量反応曲線を示した(表5)。これらをまとめると、実施例に提示した結果は、CAT5D9が最善のリード候補のクローンであり、親和性及びエピトープ結合部位の生物物理学的評価の条件としての最適化に進行すべきであることを示唆した。
実施例8.標的特異性の確証
CAT5D9は、生物学的アッセイにおける機能的評価により、最善のリード候補であると思われた。Octetエピトープビニング法を使用して、受容体FLT3に比したCAT5D9結合領域を決定した。
CAT5D9は、生物学的アッセイにおける機能的評価により、最善のリード候補であると思われた。Octetエピトープビニング法を使用して、受容体FLT3に比したCAT5D9結合領域を決定した。
エピトープビニング法を使用して、FLT3L上のFLT3受容体と同一結合領域を共有するリード抗体を決定した。ビニングは、3期で実施した。第I期では、アビジンプローブへのビオチン-FLT3L結合を実施した。第II期では、個々の抗体をビオチン-FLT3Lに結合させた。第III期では、試験抗体の各々を第II期抗体に添加した。検出された何らかの追加の結合は、2つの抗体が標的FLT3Lへの非競合結合部位を有することの指標であった。第III期で抗体が添加されていない緩衝剤単独及びFLT3-Fcをそれぞれ陰性コントロール及び陽性コントロールとして使用した。第III期で緩衝剤単独を添加した場合、結果として生じるFLT3Lに対する抗体の解離動態は、標的に対するクローンの固有の親和性を反映する。
1倍及び2倍の濃度で添加されたCAT5D9のみがFLT3L-Fcによる結合を阻害したが、これは、CAT5D9がFLT3L上の所望の標的部位にヒットしている(即ちFLT3-Fcと同一又は重複エピトープを共有している)ことを示唆した(図10A)。重要なことに、これとは対照的に、残り4個の候補クローンは、CAT5D9によって阻害されなかったため、それらが異なるFLT3エピトープに結合したことを示唆している(図10A)。更に、緩衝剤単独が添加された場合の急激なオフレートは、CAT5D9の親和性が低い(最適化による性能が改良される可能性が高いことを意味している)ことを示唆している以前の実験を支持している。これと一致して、残りの4個のクローンの各々が第II期で結合した場合(図10Bに提示した代表的チャートに示したようなCAT8)、CAT5D9及びFLT3-Fcの追加の結合は、第III期で検出することができ、これは、それらの結合部位が異なることを反映している。更に、他の4個のクローンのそれぞれが一緒にビニングされること及び緩衝剤単独が添加された場合にそれらの解離速度が相当低いことも観察された。
まとめると、これらのデータは、CAT5D9のみがFLT3L結合領域でFLT3と直接的に競合し、低親和性結合でそのようにすると思われたことを確証しており、これは
、CAT5D9に最適化の可能性があることを示唆している。他方、残りのクローンの全部は、機能的データに基づくと、FLT3と直接的に競合しない部位にヒットしていた。それらの緩徐な解離速度は、それらが既にFLT3Lに合理的な親和性で結合しており、最適化の可能性をほとんど有していないことを示唆した。最初のスクリーニングアッセイにおいて最初に存在した阻害は、立体障害又は受容体結合部位の部分的遮断に起因する可能性が高かった。
、CAT5D9に最適化の可能性があることを示唆している。他方、残りのクローンの全部は、機能的データに基づくと、FLT3と直接的に競合しない部位にヒットしていた。それらの緩徐な解離速度は、それらが既にFLT3Lに合理的な親和性で結合しており、最適化の可能性をほとんど有していないことを示唆した。最初のスクリーニングアッセイにおいて最初に存在した阻害は、立体障害又は受容体結合部位の部分的遮断に起因する可能性が高かった。
実施例9.BIACORE結合動態(C9)
Biacore分析を使用して抗体リードの結合動態を決定し、CAT5D9がFLT3Lに対して不良な親和性を有することを示唆したOctetデータを確証した。抗FLT3L断片抗原結合並びにヒト及びカニクイザルFLT3Lの動態をヒトCAT8、CAT26、Dyax3及びDyax5において決定した。更に、CAT5D9断片抗原の結合動態をヒト及びカニクイザルの両方のFLT3Lについて決定した。
Biacore分析を使用して抗体リードの結合動態を決定し、CAT5D9がFLT3Lに対して不良な親和性を有することを示唆したOctetデータを確証した。抗FLT3L断片抗原結合並びにヒト及びカニクイザルFLT3Lの動態をヒトCAT8、CAT26、Dyax3及びDyax5において決定した。更に、CAT5D9断片抗原の結合動態をヒト及びカニクイザルの両方のFLT3Lについて決定した。
結果は、表6に示した。平衡解離定数(KD)は、残りのリード抗体と比較して、CAT5D9ヒト及びカニクイザルで50倍超高かった。CAT5D9は、低品質の迅速なオフ動態を示した(hu=70.72、cyno=70.66)。結果として、定常状態結合データは、動態データKD上のチェックとして得た。定常状態結合は、類似の数値を示している動態結合の結果を支持した(表3)。これらのデータは、CAT5D9の低親和性及び最適化によりその性能が改良される可能性を確証している。
実施例10.CAT5D9の交差反応性の非存在
正しいFLT3Lエピトープに結合したCAT5D9を確証することに加えて、それが、FLT3Lの密接な構造的ホモログである幹細胞因子(SCF)及びコロニー刺激因子(CSF1)に結合しないであろうことを確証することも重要であった。両方の因子は、構成的に活性化されたFLT3-IT9D突然変異から発生する悪性腫瘍を管理するために腫瘍学に関連して現在使用されている低分子FLT3阻害剤に対する主要オフターゲッ
トヒットであるタンパク質チロシンキナーゼ受容体(それぞれc-Kit及びCSFR1)に対するリガンドである。
正しいFLT3Lエピトープに結合したCAT5D9を確証することに加えて、それが、FLT3Lの密接な構造的ホモログである幹細胞因子(SCF)及びコロニー刺激因子(CSF1)に結合しないであろうことを確証することも重要であった。両方の因子は、構成的に活性化されたFLT3-IT9D突然変異から発生する悪性腫瘍を管理するために腫瘍学に関連して現在使用されている低分子FLT3阻害剤に対する主要オフターゲッ
トヒットであるタンパク質チロシンキナーゼ受容体(それぞれc-Kit及びCSFR1)に対するリガンドである。
これを試験するために、ELISAプレートを2□gの組換えヒトSCF又はCSF1でコーティングした。洗浄後、プレートを、トリスリン酸緩衝食塩液(TPBS)中の3%の乳汁を用いて遮断し、50□□g/mLから開始した連続(2倍)希釈で添加した。インキュベーション後、未結合抗体は、洗浄によって除去し、結合抗体は、着色のためにTMB基質と組み合わせて抗ヒトIgG-HRPを使用して検出した。市販で入手できるヤギ抗SCF pAb及びマウス抗CSF1 mAbを陽性結合コントロールとして使用した。
何れのリード候補もhuSCF(図11A)又はhuCSF1(図11B)と交差反応しなかった。重要なことに、これらの結果は、FLT3Lのみに結合し、構造的に類似のTKRリガンド分子に結合しないCAT5D9の選択性を証明している。
実施例11.CAT5D9の親和性の最適化
上記で考察したように、CAT5D9は、FLT3Lに低親和性で結合し、このため、親和性の最適化により性能を改良できる可能性があることを証明した。所望の300pMのKDは、PKモデリングに基づいて設定した。最適化活動は、10,000倍までのKDの改善を達成するために設計された。
上記で考察したように、CAT5D9は、FLT3Lに低親和性で結合し、このため、親和性の最適化により性能を改良できる可能性があることを証明した。所望の300pMのKDは、PKモデリングに基づいて設定した。最適化活動は、10,000倍までのKDの改善を達成するために設計された。
フレームワークの生殖細胞系列化後、2つの並列戦略である節約(parsimonious)突然変異誘発及びブロック突然変異誘発を使用した。節約突然変異誘発は、全6個のCDRにおける各位置で全20個のアミノ酸に1度に1回ずつ突然変異させる。クローンは、ハイスループット法を使用してスクリーニングし、個々の有益な突然変異は、一緒に結合される。ブロック突然変異誘発は、重複パターンにおいてCDRにおける5~6位置の連続ストレッチを突然変異させ、結果として生じる約1E6~1E7個のクローンのライブラリーは、ファージディスプレイパニング法を使用して最初に濃縮され、後にハイスループット法を使用してスクリーニングされる。
初回の最適化ラウンド後、節約突然変異誘発からの30個のクローン及びブロック突然変異からの24個のクローンをIgGフォーマットで試験した。分子モデリング技術を用いて、本発明者らは、1610nMのKD(Biacoreによって測定)、親5D9に比して700倍の親和性の改良を達成したクローン5D9-クローン6を生じさせた最良の突然変異を同定及び結合した(図7を参照されたい)。リードクローンSC4017及びAM40の親和性は、CDTP基準(<300pM)を超えた。更に、両方の最適化クローンは、内在性細胞表面FLTLに結合及び中和し、ヒト血清中で内在性可溶性FLT3Lに結合し、cyno FLT3Lに結合及び中和する。
親和性におけるこの増加は、初期のクローン選択について記載した方法を使用してRS4;11細胞上のFLT3のダウンレギュレーション(図12A)によって測定された機能的活性における1000倍超の改良に変換された。
300pMの親和性を達成するために、第2ラウンドの親和性の最適化を実施した。クローン6(C06)を突然変異させ、生じた突然変異体は、初回最適化ラウンドにおけると同様の方法でスクリーニングした。ブロック突然変異におけるファージパニングの一部として、クローン6は、IgGフォーマットにおいて実質的により高い親和性を備えるクローンを濃縮させるための競合相手として使用した。ブロック突然変異からの最善のクローンは、KD=170pMを備えるクローンAM40であった。AM40の数個のコンビナトリアルクローン及び第2ラウンドの節約突然変異誘発からの突然変異を結合し、KD=37pMを備える1つの優れたクローン、SC4017を生成した。このより高い親和性は、RS4;11細胞上のFLT3のダウンレギュレーションによって証明されたように、FLT3Lの改良された機能的阻害を再び反映していた(図12B)。しかし、その後の分析は、SC4017の優れた性能の原因が、結合領域に隣接する組み込まれた単一の追加のトリプトファンにあると解明した。これは、酸化に曝露されたトリプトファン残基の脆弱性を前提にすると、開発リスクを表していた。この理由から、AM40がリードIgGクローンとして選択された。SC4017(37pM)と比較して僅かに親和性が低い(170pM)にもかかわらず、それでも、AM40は、300pMという最初の目標を超えたため、より低い開発リスクを有すると決定された。
最後に、本発明者らは、FLT3+RS4;11との共培養において、7日間にわたり20ng/mLのIL-7を用いて刺激した一次T細胞を使用する(一次T細胞上で細胞表面FLT3Lの発現を誘導するために最も有効なプロトコルであることが見出された)アッセイを開発することにより、両方のクローンが細胞表面上の内在性FLT3Lを中和できることを確証した。手短には、IL-7刺激CD4+ T細胞をRS4;11細胞と共に一晩、15:1の比(図13Aに示した用量比反応)において、単独で又は候補クローンであるSC4017及びAM40の連続希釈物の存在下でインキュベートした。FL
T3のダウンレギュレーションは、以前に記載したようにフローサイトメトリー法によって測定した。両方のクローンは、1nMを超える濃度(図13B)において、RS4;11細胞上のFLT3のダウンレギュレーションを類似の有効性を備えて完全に防止することが証明された。
T3のダウンレギュレーションは、以前に記載したようにフローサイトメトリー法によって測定した。両方のクローンは、1nMを超える濃度(図13B)において、RS4;11細胞上のFLT3のダウンレギュレーションを類似の有効性を備えて完全に防止することが証明された。
実施例12.健常非ヒト霊長類におけるFLT3Lの中和
FLT3Lを中和することにおけるAM40の安全性及び持続性を決定するために、週1回の反復投与を使用して1カ月間にわたり毒性試験を実施した。動物の成長を追跡するために、8週間の治療フォローアップ期間を含めた。試験の概要は、図14に図示した。図15Aに示したように、遊離可溶性FLT3Lレベルは、全用量においてAM40の初回投与後に急激に落下したが、0.3mg/kgは、丸1週間にわたりターゲットエンゲージメントを維持するには不十分であった。高用量群(1mg/kg及び30mg/kg)は、1.0mg/kg群では、その時点で可溶性FLT3Lのレベルがベースラインに戻った第57日までを通して、一貫して完全なターゲットエンゲージメント(BLQ未満の遊離可溶性FLT3Lとして反映された)を示した。
FLT3Lを中和することにおけるAM40の安全性及び持続性を決定するために、週1回の反復投与を使用して1カ月間にわたり毒性試験を実施した。動物の成長を追跡するために、8週間の治療フォローアップ期間を含めた。試験の概要は、図14に図示した。図15Aに示したように、遊離可溶性FLT3Lレベルは、全用量においてAM40の初回投与後に急激に落下したが、0.3mg/kgは、丸1週間にわたりターゲットエンゲージメントを維持するには不十分であった。高用量群(1mg/kg及び30mg/kg)は、1.0mg/kg群では、その時点で可溶性FLT3Lのレベルがベースラインに戻った第57日までを通して、一貫して完全なターゲットエンゲージメント(BLQ未満の遊離可溶性FLT3Lとして反映された)を示した。
同様に、循環中DCの頻度(フローサイトメトリーによって検出され、試験前ベースラインレベルの%として表示した全CD45+細胞の%)の測定は、1.0及び30mg/kg群における第22日までのCD1c+(古典的)DC及び形質細胞様DCの頻度における着実な低下を明らかにした(図15B)。1mg/kg群及び30mg/kg群のそれぞれについて、循環中CD1c+DCの頻度は、第50日及び第85日まで抑制されたままであった。1mg/kg群及び30mg/kg群のそれぞれについて、循環中pDCの頻度は、第71日及び第85日まで減少したままであった。1.0mg/kg群におけるDC集団の回復は、第57~第85日のある時点で発生した遊離血清中FLT3Lの回復と相関していた。これらの結果は、DC集団が、AM40によってFLT3Lが中和されると低下するが、遊離FLT3Lが利用可能になると急速にベースラインに回復することを示している。
実施例13.FLT3Lの発現は、全身性エリテマトーデス(SLE)の重症度と相関する
SLEは、慢性炎症を特徴とする自己免疫疾患であり、身体内のほぼ全ての臓器及び全ての年齢群に影響を及ぼす。SLEは、一般に、関節、皮膚、腎臓、肺、心臓及び脳に影響を及ぼす。前炎症性シグナル伝達においてそれが果たす役割を前提にして、FLT3Lレベルと疾患重症度との相関について探索するために、SLEを有する個体におけるFLT3Lの発現を調査した。現在までに公表された研究は、疾患との相関を引き出す場合、そのほとんどが血清中FLT3Lレベルに依存しており、血清中FLT3Lレベルが臨床状況では最も実際的な測定であるが、DC及び他の活性化FLT3L消費細胞によって利用される生産マイナスを反映しているという固有の短所を有する。炎症の状況では、FLT3を発現する細胞の数及びそれらのFLT3Lの消費が極めて大きく変動するため、これは、研究間の観察所見における変動及び何れも血清中FLT3Lと疾患進行の臨床スコアとの間の直接的相関を示さない理由を説明する可能性が高い。T細胞が炎症状況におけるFLT3Lの最重要スコアの1つであることが分かったため、本発明者らは、新しく単離された末梢血単核球(PBMC)を使用して、T細胞表面上でFLT3Lの発現を直接的に測定するためのアッセイを開発した。
SLEは、慢性炎症を特徴とする自己免疫疾患であり、身体内のほぼ全ての臓器及び全ての年齢群に影響を及ぼす。SLEは、一般に、関節、皮膚、腎臓、肺、心臓及び脳に影響を及ぼす。前炎症性シグナル伝達においてそれが果たす役割を前提にして、FLT3Lレベルと疾患重症度との相関について探索するために、SLEを有する個体におけるFLT3Lの発現を調査した。現在までに公表された研究は、疾患との相関を引き出す場合、そのほとんどが血清中FLT3Lレベルに依存しており、血清中FLT3Lレベルが臨床状況では最も実際的な測定であるが、DC及び他の活性化FLT3L消費細胞によって利用される生産マイナスを反映しているという固有の短所を有する。炎症の状況では、FLT3を発現する細胞の数及びそれらのFLT3Lの消費が極めて大きく変動するため、これは、研究間の観察所見における変動及び何れも血清中FLT3Lと疾患進行の臨床スコアとの間の直接的相関を示さない理由を説明する可能性が高い。T細胞が炎症状況におけるFLT3Lの最重要スコアの1つであることが分かったため、本発明者らは、新しく単離された末梢血単核球(PBMC)を使用して、T細胞表面上でFLT3Lの発現を直接的に測定するためのアッセイを開発した。
血清及びPBMCは、SLEを有する個体(n=24)及び健常ドナー(HD;n=15)から単離した。血清中FLT3Lは、ELISA(R&D Systems)を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定し、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞は、社内で開発したフローサイトメトリー分析を使用して決定し、FLT3Lは、蛍光標識抗FLT3LクローンであるMAB608(R&D Systems)を用いて検出した。同
一個体におけるループスの活性を決定するために、SLE疾患活性指数(SLEDAI)を使用した。有意性は、健常コホート対疾患コホートの比較及びそれぞれSLEDAIとの相関についてマン・ホイットニー及びスピアマン相関を使用して決定した。
一個体におけるループスの活性を決定するために、SLE疾患活性指数(SLEDAI)を使用した。有意性は、健常コホート対疾患コホートの比較及びそれぞれSLEDAIとの相関についてマン・ホイットニー及びスピアマン相関を使用して決定した。
以前の文献と一致して、SLEドナーでは、HDと比較して血清中FLT3Lレベルが上昇したが(p<0.05;図16A)、疾患活性(SLEDAI)との有意な相関は見出されなかった(p<0.07;図16B)。それに反して、FLT3L産生を、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度によって測定すると、HDと比較してSLEドナーにおける高度に有意な増加(p<0.0001;図16C)及びSLEDAIスコアとの強力な相関(r=0.7045;p<0.0001;図16D)が見られた。このデータは、T細胞上のFLT3Lの発現を測定することが疾患状況では特に重要な可能性があることを示唆している。
SLEDAIスコアとFLT3Lを発現するCD4+ T細胞との間の相関を見出したため、(1)SLE患者由来のCD4+ T細胞サブセットにわたるFLT3Lの発現が公知の生物学と一致したかどうか、及び(2)サブセットの発現がSLEDAIスコアと相関するかどうかを決定するために、CD4+細胞のサブセットを試験した。試験したCD4+サブセットは、naive T細胞(Tnaive)、エフェクターメモリー細胞(TEM)及びセントラルメモリー(TCM)細胞であった。発現及び相関を試験するために、上述したものと同一のプロトコル及び有意性レベルを使用した。
CD4+ T細胞サブセットにわたるFLT3Lの発現は、FLT3Lの発現の公知の生物学と一致していた。詳細には、FLT3Lの発現は、一般にHDにおけるTnaive細胞上では観察されなかったが、SLEドナーでは小さいが、有意な上昇が見られた(図17A、上方)。SLEドナー由来のTnaive細胞上のFLT3Lの発現は、SLEDAIスコアと有意に相関していた(図17A、下方;r=0.6629;p=0.0004)。重要なことに、FLT3Lの発現は、FLT3Lの発現を誘導することが公知である□-鎖サイトカインに曝露されていたであろう最近活性化されたT細胞を捕捉するこの集団において予測されたように、HD及びSLE CD4+TEMの両方で観察された。この反応は、HD及びSLEドナーの両方において見られたが、後者の場合には有意に上昇し、更に、SLEドナーにおける発現は、SLEDAIと相関していた(図17B、下方;r=0.6201;p=0.0012)。最後に、FLT3Lの発現は、健常CD4+ T細胞ではそれらがTEMからTCMに分化するために低下するが、SLEドナーのPBMC中では維持される(図17C、上方;p<0.0001)。更に、FLT3L+ T細胞の頻度とSLEDAIとの間に有意な相関が存在し、これは、この群における発現が慢性炎症状態の反映であることを示唆している。
まとめると、これらの研究は、SLE患者のCD4+ T細胞上でのFLT3Lの発現がHDのFLT3Lの発現と比較して有意に増加することを証明している。更に、FLT3Lの発現の増加は、SLEDAIスコアと高度に相関している。従って、SLE患者への抗FLT3L抗体の投与は、SLE患者における炎症を減少させるためのFLT3Lを発現するT細胞集団を減少させるための合理的な治療戦略である。
上記で使用した方法は、IC FLT3L RNAのPrimeFlow in situ検出を使用して妥当性を確認し、APCコンジュゲート化AM40を使用して確証した。
実施例14.筋炎におけるFLT3Lの発現
筋炎は、衰弱、腫脹及び筋肉痛を特徴とする慢性の筋肉の炎症である。細胞レベルでは、筋炎は、インターフェロン1型タンパク質及びpDCのレベル上昇を特徴とする。筋炎
には、SLE及び他の前炎症状態が関連し得る。このため、FLT3Lレベルと疾患重症度との相関について探索するために、筋炎を有する個体におけるFLT3Lの発現を調査した。
筋炎は、衰弱、腫脹及び筋肉痛を特徴とする慢性の筋肉の炎症である。細胞レベルでは、筋炎は、インターフェロン1型タンパク質及びpDCのレベル上昇を特徴とする。筋炎
には、SLE及び他の前炎症状態が関連し得る。このため、FLT3Lレベルと疾患重症度との相関について探索するために、筋炎を有する個体におけるFLT3Lの発現を調査した。
筋炎及びHDを有する個体由来のPBMCは、FACSを使用して、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞について試験した。CD4+ T細胞をTnaiveサブセット、TEMサブセット及びTCMサブセットに分けた。筋炎及びHDサンプル間の有意性は、マン・ホイットニー分析を使用して決定した。
図18A及び18Bから明らかなように、筋炎を有する個体由来のPBMC中のFLT3Lの発現は、それらがFLT3L(Tnaive(p<0.05;図18A)、TEM(p<0.0001;図18B)及びTCM(p<0.0001;図18C))に対して陽性であるCD4+ T細胞のパーセンテージの有意な増加を特徴としていたため、SLE患者からの観察所見と匹敵している。これらの結果に照らすと、筋炎患者への抗FLT3L抗体の投与は、筋炎患者における炎症を減少させるためのFLT3Lを発現するT細胞集団を減少させるための合理的な治療戦略である。
実施例15.腎炎におけるFLT3Lの発現
腎炎は、腎臓に影響を及ぼす免疫障害であり、腎臓の構造と関連している。この状態は、SLE、特定の毒素又は特定の感染症から起こり得る。腎炎は、致死的であり得る、腎臓機能の永久的消失を生じ得る。樹状細胞は、ループス腎炎では腎臓に浸潤することが証明されており(Fiore et al.,(2008)Mol Immunology
v45:259-265)、腎臓において炎症を駆動することに役割を果たすと考えられているため、FLT3Lの遮断は、DCを抑制することができ、腎機能の進行性消失を予防できるのではないかという仮説が立てられた。
腎炎は、腎臓に影響を及ぼす免疫障害であり、腎臓の構造と関連している。この状態は、SLE、特定の毒素又は特定の感染症から起こり得る。腎炎は、致死的であり得る、腎臓機能の永久的消失を生じ得る。樹状細胞は、ループス腎炎では腎臓に浸潤することが証明されており(Fiore et al.,(2008)Mol Immunology
v45:259-265)、腎臓において炎症を駆動することに役割を果たすと考えられているため、FLT3Lの遮断は、DCを抑制することができ、腎機能の進行性消失を予防できるのではないかという仮説が立てられた。
Murphy Roths Large/リンパ組織増殖性(MRL.lpr)腎炎のマウスモデル及びマウスサロゲート抗FLT3L抗体(LFC-1)を使用して、タンパク尿レベル及び腎炎スコアにFLT3Lの遮断が及ぼす作用を試験した。アイソタイプコントロール及び抗IFNAR抗体治療群を含めた。抗FLT3L抗体が投与されたマウスは、投与17週間後にタンパク尿の有意な減少を示した(図19A)。更に、18週間後の腎炎スコアは、抗FLT3L抗体が投与されたマウスでは、アイソタイプコントロールと比較して減少した(図19B)。重要なことに、抗FLT3L抗体が投与されたマウスにおけるタンパク尿及び腎炎のスコアは、投与されたマウスと比較して減少した。これらの結果は、腎炎においてFLT3L媒介性炎症が役割を果たすことを支持している。これらの結果に照らすと、腎炎患者への抗FLT3L抗体の投与は、腎炎患者における炎症を減少させるためのFLT3Lを発現するT細胞集団を減少させるための合理的な治療戦略である。
腎炎における白血球集団のFLT3L関連性変化に関する洞察を提供するために、脾臓DC集団についても試験した。脾臓は、18週齢でMRLマウスから採取し、脾臓DC集団の変化を試験した。抗FLT3L抗体による治療は、MRLマウスにおける循環中DCを有意に減少させた(図20A~C)。詳細には、Siglec-H+-pDCは、抗FLT3L抗体の投与後にアイソタイプコントロールと比較して有意に減少した(図20A)。同様に、CD11b+cDC(ヒトCD1c+DCと均等)及びCD8+cDC(ヒトCD141+DCと均等)においても有意な減少が観察された(図20B及び20C)。更に、抗FLT3L治療マウスにおける皮膚炎の発生率は、治療を受けていないマウスにおける通常の30~40%の発生率と比較して観察されなかった。このため、抗FLT3L抗体による治療は、腎炎モデルにおいて、循環中DC集団を減少させ、二次的病理(皮膚炎)を改善した。これらの結果に照らすと、腎炎患者への抗FLT3L抗体の投与は
、DC集団を抑制することによって炎症及び組織損傷を減少させ得る。
、DC集団を抑制することによって炎症及び組織損傷を減少させ得る。
実施例16.シェーグレン症候群におけるFLT3Lの発現
原発性シェーグレン症候群(pSS)は、眼及び唾液腺の広範な乾燥を特徴とする自己免疫状態である。更に、この状態は、多臓器不全を誘発し得る。この症候群は、単独で又はループス若しくは関節リウマチ等の追加の自己免疫疾患の存在下において発生し得る。pSSを有する個体におけるFLT3Lの血清中レベルは、増加し、炎症を起こした唾液腺においてFLT3L及びその受容体の両方が局所的に発現するというエビデンスが存在する(Tobon et al.,(2010)Arthritis and Rheumatism v62:344)。
原発性シェーグレン症候群(pSS)は、眼及び唾液腺の広範な乾燥を特徴とする自己免疫状態である。更に、この状態は、多臓器不全を誘発し得る。この症候群は、単独で又はループス若しくは関節リウマチ等の追加の自己免疫疾患の存在下において発生し得る。pSSを有する個体におけるFLT3Lの血清中レベルは、増加し、炎症を起こした唾液腺においてFLT3L及びその受容体の両方が局所的に発現するというエビデンスが存在する(Tobon et al.,(2010)Arthritis and Rheumatism v62:344)。
NOD.H2h4シェーグレン症候群マウスモデルを使用して、長期の抗FLT3L抗体(LFC-1)治療後の唾液腺の病理を試験した。16週齢までにこれらのマウスは、唾液腺(SG)において、ヒトにおいて見られる病理学的変化に密接に似た方法で、主としてDC、B220+B細胞及びCD3+ T細胞を含む三次リンパ様構造(TLS)を発生する。この組織損傷には、自己抗体の発達及び脾臓内での特発性胚中心の形成が先行する(Mahmoud et al.,2016 Science Translational Medicine,v8 361ra137)。マウスは、アイソタイプIgGコントロール(5mg/kg)、抗FLT3L抗体(5mg/kg)を用いる予防的(5週齢で開始する)又は治療的(17週齢で開始する)プロトコルの何れかで治療した。両方のプロトコルについて、治療は、試験(26週間)終了時まで週2回の投与で継続した。抗FLT3Lモノクローナル抗体(LFC-1)は、治療の経過を通してFLT3Lを効果的に中和し(図25A)、循環中薬物/リガンド複合体の蓄積を生じさせた(図25B)。
末梢免疫細胞集団への変化を評価するためにリンパ様器官を収集し、唾液腺(SG)を採取して組織病理(TLSの頻度)について評価した。以前に予防的治療が疾患の開始を防止できることが報告されていたが、組織損傷が疾患開始後の治療的介入によって遅延又は防止され得ることについての以前の報告は限られていた。抗FLT3Lモノクローナル抗体(LFC-1)は、脾臓及び唾液腺流入領域LNにおけるCD44HI CD4+及びCD8+ T細胞の頻度を経験した抗原を減少させ(試験終了時に24~26週齢)(図26A~26D)、且つコラーゲンIV及び血小板抽出物に対する特異的自己抗体を選択的に減少させた(図27)。
予想されたように、アイソタイプコントロールIgGを用いて治療された動物は、26週齢までに唾液腺において唾液腺損傷の指標であるTLS形成を増加させた(組織1mm2当たりの頻度として測定)。抗FLT3Lにより治療されたマウスは、治療的に投与された場合でも、組織SG損傷の有意な減少を示し(図21A)、予防的に投与された場合、疾患は、完全に防止された(図21B)。脾臓中で測定したDC集団は、有意に抑制されたが、完全に欠失してはいなかった(図22A~D)。それでもなお、これは、唾液腺内への炎症性浸潤を減少させることによって疾患の開始及び進行に有意な影響を及ぼすのに十分であった。これらの結果は、pSSにおける炎症がFLT3L媒介性メカニズムによって駆動されることを支持している。これらの結果に照らすと、抗FLT3L抗体の投与は、ヒト対象におけるpSSを治療するための合理的な治療戦略である。
上記の説明から、本明細書に記載した本開示に対して、それを様々な使用及び条件に採用するために変更形態及び修飾形態がなされ得ることは明白であろう。そのような実施形態も添付の請求項の範囲内に含まれる。本明細書の変量の何れかの定義における要素のリストの列挙は、任意の単一要素又は列挙した要素の組合せ(若しくは部分組合せ)としてのその変量の定義を含んでいる。本明細書での1つの実施形態の列挙は、任意の単一実施
形態としての又は任意の他の実施形態若しくはそれらの部分と組み合わせた実施形態を含んでいる。本明細書において言及した全ての特許及び刊行物は、各独立特許及び刊行物が明確に且つ個別に参照により組み込まれていると指示されたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
形態としての又は任意の他の実施形態若しくはそれらの部分と組み合わせた実施形態を含んでいる。本明細書において言及した全ての特許及び刊行物は、各独立特許及び刊行物が明確に且つ個別に参照により組み込まれていると指示されたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、一次CD133+ヒト幹細胞におけるMEK 1/2リン酸化を減少させる方法であって、幹細胞を、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法が提供される。
本開示は、次の態様を包含する。
[項1]
FLT3Lに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域(CDR)の組:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、
(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は
(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は
(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38
のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合断片。
[項2]
重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3及びFW4で配列された3個のCDR及び4個のフレームワーク領域(FW)を含み、前記VH及びVL領域は、
(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は
(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は
(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6
と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する、項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項3]
前記VHの前記CDR(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)並びに前記VLの前記CDR(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)は、
(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は
(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は
(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38
のアミノ酸配列からなる、項2に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項4]
前記VH及びVLは、
(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は
(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は
(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6
のアミノ酸配列を含む、項2に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項5]
(a)配列番号61を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号62を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域;又は
(b)配列番号65を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号66を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域;又は
(c)配列番号69を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号70を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域
を含む、項4に記載の抗体又は抗原結合断片。
[項6]
ヒト幹細胞、造血細胞前駆体、樹状細胞、活性化T細胞及びB細胞、単核白血球又はミクログリア上の膜結合FLT3のFLT3L媒介性活性化を阻害する、項1~5の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項7]
ヒト幹細胞因子(huSCF)及びヒトコロニー刺激因子(huCSF1)の少なくとも1つに特異的に結合しない、項6に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項8]
huSCF又はhuCSF1の何れかに特異的に結合しない、項6に記載の抗体又はその断片。
[項9]
モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、項1~8の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項10]
(a)IgA定常ドメイン;
(b)IgD定常ドメイン;
(c)IgE定常ドメイン;
(d)IgG1定常ドメイン;
(e)IgG2定常ドメイン;
(f)IgG3定常ドメイン;
(g)IgG4定常ドメイン;及び
(h)IgM定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、項1~9の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項11]
IgG1定常ドメインを含む、項10に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項12]
(a)Igκ定常ドメイン;及び
(b)Igλ定常ドメイン
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、項1~11の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項13]
抗原結合タンパク質は、ヒトIgG1重鎖定常ドメイン及びヒトλ軽鎖定常ドメインを含む、項1~12の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項14]
前記IgG1定常ドメインは、KabatのEUナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたL234F、L235E及びP331Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項11に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項15]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子。
[項16]
制御配列に操作可能に連結されている、項15に記載の核酸分子。
[項17]
項15又は16に記載の核酸分子を含むベクター。
[項18]
項15若しくは16に記載の核酸分子又は項17に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
[項19]
哺乳動物宿主細胞である、項18に記載の宿主細胞。
[項20]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成するハイブリドーマ。
[項21]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成する単離宿主細胞。
[項22]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作成する方法であって、(a)前記抗体又はその抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養するステップ;及び(b)前記培養された宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを含む方法。
[項23]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
[項24]
医薬品として使用するための、項23に記載の医薬組成物。
[項25]
腎炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項26]
原発性シェーグレン症候群を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項27]
筋炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項28]
全身性エリテマトーデス(SLE)を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項29]
前記対象は、健常対象と比較して、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度によって測定されるFLT3Lの増加した血清中レベルを有する、項28に記載の方法。
[項30]
対象における全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するための方法であって、
a.FLT3Lの血清中レベルを測定するステップ;又は
b.FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度を測定するステップ
を含み、前記対象における健常ドナーと比較したFLT3Lの増加した血清中レベル又はFLT3Lを発現するCD4+ T細胞の増加した頻度は、前記対象がSLEを有することを示す、方法。
[項31]
前記CD4+ T細胞は、エフェクターメモリー細胞(T EM )である、項30に記載の方法。
[項32]
膜結合FLT3Lの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
[項33]
前記FLT3Lは、可逆的に中和される、項23に記載の方法。
[項34]
循環している古典的樹状細胞(cDC)及び形質細胞様樹状細胞(pDC)の集団の減少を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
[項35]
cDC及びpDCの前記集団は、cDC及びpDCの前記集団が投与前レベルに戻ることができるように可逆的に減少される、項34に記載の方法。
[項36]
CD4+ T細胞上のFLT3Lの発現を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項37]
FLT3Lを発現するCD4+ T細胞のパーセンテージを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項38]
リンパ芽球におけるERKシグナル伝達を減少させる方法であって、前記リンパ芽球を、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
[項39]
一次CD133+ヒト幹細胞におけるMEK 1/2リン酸化を減少させる方法であって、前記幹細胞を、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
本開示は、次の態様を包含する。
[項1]
FLT3Lに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域(CDR)の組:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、
(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は
(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は
(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38
のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合断片。
[項2]
重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3及びFW4で配列された3個のCDR及び4個のフレームワーク領域(FW)を含み、前記VH及びVL領域は、
(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は
(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は
(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6
と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する、項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項3]
前記VHの前記CDR(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)並びに前記VLの前記CDR(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)は、
(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は
(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は
(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38
のアミノ酸配列からなる、項2に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項4]
前記VH及びVLは、
(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は
(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は
(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6
のアミノ酸配列を含む、項2に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項5]
(a)配列番号61を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号62を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域;又は
(b)配列番号65を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号66を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域;又は
(c)配列番号69を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号70を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域
を含む、項4に記載の抗体又は抗原結合断片。
[項6]
ヒト幹細胞、造血細胞前駆体、樹状細胞、活性化T細胞及びB細胞、単核白血球又はミクログリア上の膜結合FLT3のFLT3L媒介性活性化を阻害する、項1~5の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項7]
ヒト幹細胞因子(huSCF)及びヒトコロニー刺激因子(huCSF1)の少なくとも1つに特異的に結合しない、項6に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項8]
huSCF又はhuCSF1の何れかに特異的に結合しない、項6に記載の抗体又はその断片。
[項9]
モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、項1~8の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項10]
(a)IgA定常ドメイン;
(b)IgD定常ドメイン;
(c)IgE定常ドメイン;
(d)IgG1定常ドメイン;
(e)IgG2定常ドメイン;
(f)IgG3定常ドメイン;
(g)IgG4定常ドメイン;及び
(h)IgM定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、項1~9の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項11]
IgG1定常ドメインを含む、項10に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項12]
(a)Igκ定常ドメイン;及び
(b)Igλ定常ドメイン
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、項1~11の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項13]
抗原結合タンパク質は、ヒトIgG1重鎖定常ドメイン及びヒトλ軽鎖定常ドメインを含む、項1~12の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項14]
前記IgG1定常ドメインは、KabatのEUナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたL234F、L235E及びP331Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項11に記載の抗体又はその抗原結合断片。
[項15]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子。
[項16]
制御配列に操作可能に連結されている、項15に記載の核酸分子。
[項17]
項15又は16に記載の核酸分子を含むベクター。
[項18]
項15若しくは16に記載の核酸分子又は項17に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
[項19]
哺乳動物宿主細胞である、項18に記載の宿主細胞。
[項20]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成するハイブリドーマ。
[項21]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成する単離宿主細胞。
[項22]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作成する方法であって、(a)前記抗体又はその抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養するステップ;及び(b)前記培養された宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを含む方法。
[項23]
項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
[項24]
医薬品として使用するための、項23に記載の医薬組成物。
[項25]
腎炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項26]
原発性シェーグレン症候群を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項27]
筋炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項28]
全身性エリテマトーデス(SLE)を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項29]
前記対象は、健常対象と比較して、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度によって測定されるFLT3Lの増加した血清中レベルを有する、項28に記載の方法。
[項30]
対象における全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するための方法であって、
a.FLT3Lの血清中レベルを測定するステップ;又は
b.FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度を測定するステップ
を含み、前記対象における健常ドナーと比較したFLT3Lの増加した血清中レベル又はFLT3Lを発現するCD4+ T細胞の増加した頻度は、前記対象がSLEを有することを示す、方法。
[項31]
前記CD4+ T細胞は、エフェクターメモリー細胞(T EM )である、項30に記載の方法。
[項32]
膜結合FLT3Lの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
[項33]
前記FLT3Lは、可逆的に中和される、項23に記載の方法。
[項34]
循環している古典的樹状細胞(cDC)及び形質細胞様樹状細胞(pDC)の集団の減少を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
[項35]
cDC及びpDCの前記集団は、cDC及びpDCの前記集団が投与前レベルに戻ることができるように可逆的に減少される、項34に記載の方法。
[項36]
CD4+ T細胞上のFLT3Lの発現を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項37]
FLT3Lを発現するCD4+ T細胞のパーセンテージを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
[項38]
リンパ芽球におけるERKシグナル伝達を減少させる方法であって、前記リンパ芽球を、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
[項39]
一次CD133+ヒト幹細胞におけるMEK 1/2リン酸化を減少させる方法であって、前記幹細胞を、項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
Claims (39)
- FLT3Lに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域(CDR)の組:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、
(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は
(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は
(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38
のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合断片。 - 重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3及びFW4で配列された3個のCDR及び4個のフレームワーク領域(FW)を含み、前記VH及びVL領域は、
(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は
(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は
(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6
と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記VHの前記CDR(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)並びに前記VLの前記CDR(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)は、
(a)それぞれ配列番号29、30、31、32、33及び34;又は
(b)それぞれ配列番号29、30、31、35、33及び34;又は
(c)それぞれ配列番号29、36、37、32、33及び38
のアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記VH及びVLは、
(a)それぞれ配列番号1及び配列番号2;又は
(b)それぞれ配列番号3及び配列番号4;又は
(c)それぞれ配列番号5及び配列番号6
のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - (a)配列番号61を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号62を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域;又は
(b)配列番号65を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号66を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域;又は
(c)配列番号69を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号70を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域
を含む、請求項4に記載の抗体又は抗原結合断片。 - ヒト幹細胞、造血細胞前駆体、樹状細胞、活性化T細胞及びB細胞、単核白血球又はミクログリア上の膜結合FLT3のFLT3L媒介性活性化を阻害する、請求項1~5の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- ヒト幹細胞因子(huSCF)及びヒトコロニー刺激因子(huCSF1)の少なくとも1つに特異的に結合しない、請求項6に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- huSCF又はhuCSF1の何れかに特異的に結合しない、請求項6に記載の抗体又
はその断片。 - モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項1~8の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- (a)IgA定常ドメイン;
(b)IgD定常ドメイン;
(c)IgE定常ドメイン;
(d)IgG1定常ドメイン;
(e)IgG2定常ドメイン;
(f)IgG3定常ドメイン;
(g)IgG4定常ドメイン;及び
(h)IgM定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、請求項1~9の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - IgG1定常ドメインを含む、請求項10に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- (a)Igκ定常ドメイン;及び
(b)Igλ定常ドメイン
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、請求項1~11の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 抗原結合タンパク質は、ヒトIgG1重鎖定常ドメイン及びヒトλ軽鎖定常ドメインを含む、請求項1~12の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記IgG1定常ドメインは、KabatのEUナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたL234F、L235E及びP331Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項11に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子。
- 制御配列に操作可能に連結されている、請求項15に記載の核酸分子。
- 請求項15又は16に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項15若しくは16に記載の核酸分子又は請求項17に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
- 哺乳動物宿主細胞である、請求項18に記載の宿主細胞。
- 請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成するハイブリドーマ。
- 請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成する単離宿主細胞。
- 請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作成する方法であって、(a)前記抗体又はその抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養するステップ;及び(b)前記培養された宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを
含む方法。 - 請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- 医薬品として使用するための、請求項23に記載の医薬組成物。
- 腎炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
- 原発性シェーグレン症候群を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
- 筋炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
- 全身性エリテマトーデス(SLE)を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
- 前記対象は、健常対象と比較して、FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度によって測定されるFLT3Lの増加した血清中レベルを有する、請求項28に記載の方法。
- 対象における全身性エリテマトーデス(SLE)を診断するための方法であって、
a.FLT3Lの血清中レベルを測定するステップ;又は
b.FLT3Lを発現するCD4+ T細胞の頻度を測定するステップ
を含み、前記対象における健常ドナーと比較したFLT3Lの増加した血清中レベル又はFLT3Lを発現するCD4+ T細胞の増加した頻度は、前記対象がSLEを有することを示す、方法。 - 前記CD4+ T細胞は、エフェクターメモリー細胞(TEM)である、請求項30に記載の方法。
- 膜結合FLT3Lの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 前記FLT3Lは、可逆的に中和される、請求項23に記載の方法。
- 循環している古典的樹状細胞(cDC)及び形質細胞様樹状細胞(pDC)の集団の減少を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
- cDC及びpDCの前記集団は、cDC及びpDCの前記集団が投与前レベルに戻ることができるように可逆的に減少される、請求項34に記載の方法。
- CD4+ T細胞上のFLT3Lの発現を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
- FLT3Lを発現するCD4+ T細胞のパーセンテージを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
- リンパ芽球におけるERKシグナル伝達を減少させる方法であって、前記リンパ芽球を、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
- 一次CD133+ヒト幹細胞におけるMEK 1/2リン酸化を減少させる方法であって、前記幹細胞を、請求項1~14の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
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